UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA-UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL “USO DE PROBIÓTICO E ÓLEOS ESSENCIAIS NA RAÇÃO SOBRE A MICROBIOTA INTESTINAL, ATIVIDADE DE ENZIMAS DIGESTIVAS E A EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS AOS PROCESSOS DE DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE NUTRIENTES EM FRANGOS” Miguel Frederico Fernandez Alarcon Médico Veterinário 2015 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA-UNESP FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL “USO DE PROBIÓTICO E ÓLEOS ESSENCIAIS NA RAÇÃO SOBRE A MICROBIOTA INTESTINAL, ATIVIDADE DE ENZIMAS DIGESTIVAS E A EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS AOS PROCESSOS DE DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE NUTRIENTES EM FRANGOS” Miguel Frederico Fernandez Alarcon Orientador: Prof. Dr. Renato Luis Furlan Coorientador: Prof. Dr. Luiz Roberto Furlan Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Zootecnia 2015 Fernandez Alarcon, Miguel Frederico F363u Uso de probiótico e óleos essenciais na ração sobre a microbiota intestinal, atividade de enzimas digestivas e a expressão de genes relacionados aos processos de digestão e absorção de nutrientes em frangos / Miguel Frederico Fernandez Alarcon. – – Jaboticabal, 2015 xii, 107 p. : il. ; 28 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015 Orientador: Renato Luis Furlan Coorientador: Luiz Roberto Furlan Banca examinadora: João Martins Pizauro Júnior, Marcos Túlio Oliveira, Douglas Emygdio de Faria, Rafael Simone Saia Bibliografia 1. 16S DNAr 2. Antibiótico promotor de crescimento 3. Enzimas de membrana intestinal 4. Fisiologia intestinal 5. Probiótico Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 636.5:636.087 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR Miguel Frederico Fernandez Alarcon – nascido na cidade de Santo André - SP, aos 18 de setembro de 1984. É médico Veterinário formado na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, campus de Jaboticabal em dezembro de 2007. Durante a graduação desenvolveu dois projetos de iniciação científica, nas áreas de fisiologia e nutrição aviária. Em março de 2008, iniciou o curso de Mestrado pelo Programa de Pós-Graduação em Zootecnia na mesma universidade, com ênfase em fisiologia intestinal e imunologia de matrizes pesadas, obtendo o título de mestre em 04 de agosto de 20010. Em março de 2011, iniciou o curso de Doutorado pelo mesmo programa, sendo que de janeiro a outubro de 2014 realizou atividades de pesquisa, referentes ao seu projeto de Doutorado no exterior, no departamento de Zootecnia na Michigan State University. “Depois de plantada a semente deste incrível arbusto, não se vê nada, por aproximadamente 5 anos, exceto lento desabrochar de um diminuto broto, a partir do bulbo. Uma maciça e fibrosa estrutura de raiz, que se estende vertical e horizontalmente pela terra está sendo construída. Então, no final do 5o Ano, o bambu chinês, cresce até atingir a altura de 25 metros.” Provérbio chinês Muitas coisas na vida pessoal e profissional são iguais ao bambu chinês. Você trabalha, investe tempo, esforço, faz tudo o que pode para nutrir seu crescimento, e, às vezes não vê nada por semanas, meses, ou anos. Mas se tiver paciência para continuar trabalhando, persistindo e nutrindo, o seu 5o ano chegará, e, com ele, virão um crescimento e mudanças que você jamais esperava ... O bambu chinês nos ensina que não devemos facilmente desistir de nossos projetos, e de nossos sonhos... Em nosso trabalho, especialmente, que é um projeto fabuloso, que envolve mudanças... de comportamento, de pensamento, de cultura e de sensibilização, devemos sempre lembrar do bambu chinês, para não desistirmos facilmente diante das dificuldades que surgirão. Procure cultivar sempre dois bons hábitos em sua vida: a Persistência e Paciência, pois você merece alcançar todos os seus sonhos!!! É preciso muita fibra para chegar às alturas e, ao mesmo tempo, muita flexibilidade para se curvar ao chão. Stephen R. Covey DEDICATÓRIAS Aos meus grandes doutores, Andres Fernandez Alarcon e Olga Fernandez Sulis, minha eterna gratidão por compreenderem minha ausência em momentos que gostaria de estar junto, pelo amor, exemplo de dignidade e humildade, esforço, incentivo constantes. A minha amada esposa Caroline Della Nina Pistoni por todo amor, compreensão, incentivo, luta, paciência e por tornar minha vida mais feliz, sempre. As minhas irmãs Rosa Carina Fernandez Sulis e Vera Fernandez Sulis pelo amor, exemplos de vida e apoio. Aos meus amados sobrinhos Luisa Carina Fernandez Flurschütz, Marina Isabel Mateos Fernandez, Mirela Mateos Fernandez e Valentin Frederico Fernandez Flurschütz que, ainda que distantes, são grande fonte de inspiração. Aos meus segundos pais, Denise Costa Della Nina Pistoni e Domingos Pistoni Junior pelo amor, apoio, exemplos e compreensão. AGRADECIMENTOS Minha eterna gratidão ao professor Luiz Roberto Furlan (Cedral) pela amizade e pelo envolvimento ímpar neste trabalho e em minha formação profissional, através de discussões científicas, conselhos, apoio, exemplos de honra e conduta como professor e pesquisador. Fica aqui registrado meu respeito e admiração. Ao Professor Renato Luis Furlan, pela valiosa amizade, incentivo e ensinamentos durante todos os anos de convivência, bem como pela liberdade concedida durante meu doutorado, que possibilitaram o desenvolvimento de habilidades profissionais e pessoais que não seriam possíveis em um cenário distinto. Ao professor Marcos Macari pelo exemplo profissional e por ter me dado a oportunidade de trabalhar em alguns projetos sob sua supervisão, que muito contribuíram para a minha formação. Aos professores Angelo Berchieri Júnior, Douglas Emygdio de Faria, Euclides Braga Malheiros, Janete Desidério Sena, João Martins Pizauro Júnior, Marcos Túlio Oliveira, Rafael Simone Saia pelas correções e contribuições, quer seja na elaboração do projeto, ou nas bancas de qualificação ou defesa de doutorado. Aos demais professores que fizeram parte do meu processo de aprendizado e que colaboraram com a minha formação acadêmica. Aos meus amigos Felipe Jorge da Silva e Juliana Della Nina Pistoni minha eterna gratidão pela amizade, apoio e bondade demonstrados nas horas mais difíceis do meu Doutorado, especialmente nos meses que estive ausente e que nossa família passou por um momento muito delicado. Aos amigos pessoais e de UNESP “parceiros de estrada”, que em muitos casos se misturam, Adriano Marques Gonçalves, André Marcos Santana, Caroline Carla Santana, Daniel Mendes Borges Campos, Fabrício Hirota Hada, Fernando Augusto de Souza, Flávia Maria de Souza Carvalho, Gabriela Gomes de Freitas, Gabriella Cavazzini Pavarina, Guilherme Baldissera, Gustavo Henrique Squassoni, Ligia Subitoni Antonio, Luiz Flavio José dos Santos, Miryelle Freire Sarcinelli, Oliveiro Caetano de Freitas, Paulo Roberto de Oliveira Carneiro, Rafael Antonio Casarin Penha Filho, Raquel Lunedo, Wedson Carlos Lima Nogueira, e os demais que não citei (me perdoem), agradeço por toda a ajuda, seja ela profissional ou afetiva, sou honrado por ter conhecido e interagido com todos, certamente um pouco de vocês faz parte da minha pessoa.. Aos professores Juan Pedro Steibel e Nathalie Trottier pela oportunidade e ensinamentos durante os 9 meses que estive na Michigan State University, os quais serão levados para toda minha vida. Aos companheiros e amigos, feitos durante minha permanência no exterior, Andi Busch, Carolina Ferreira, Guilherme Fazan Rossi, João Paulo, Laura Bibiana Gualdrón Duarte, Lei Zhou, Lilian Oliveira, Marilia Kumi, Rodrigo Motta, Vinicius Martins, Yeni Bernal Rubio, entre outros que peço desculpas por não citar, minha gratidão pelos momentos vividos, que agora também fazem parte de mim. Aos funcionários, simbolicamente citados aqui como Andressa de Souza (Depto. de Preventiva) e Robson (aviário), pelo auxílio e por ter viabilizado a realização deste projeto. .A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP pela Bolsa de Estudos e Auxílio à Pesquisa concedidos (processos nos 2011/17378-0 e 2012/03927-5). i SUMÁRIO Página RESUMO ..................................................................................................................... v ABSTRACT ................................................................................................................ vi LISTA DE TABELAS .................................................................................................. x LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. xii CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS ............................................................ 1 I. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 1 II. REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 2 2.1. Antibióticos promotores de crescimento .................................................................. 2 Mecanismos de ação .................................................................................................. 2 Hipóteses para a ação dos APCs na promoção do crescimento animal ............ 2 Resistência bac’teriana a antibióticos ...................................................................... 3 Consequências da proibição da comercialização dos APCs em países europeus ................................................................................................................................... 4 2.2. Alternativas aos APCs ................................................................................................ 5 2.2.1. Probióticos .................................................................................................................... 6 2.2.1.1. Definição e características dos probióticos ....................................................... 6 2.2.1.2. Efeitos dos probióticos ......................................................................................... 7 2.2.2. Óleos essenciais .......................................................................................................... 8 2.2.2.1. Definição e características dos OEs .................................................................. 8 2.2.2.2. Efeitos dos OEs ..................................................................................................... 9 2.3. A microbiota intestinal ............................................................................................... 10 2.3.1. O estudo da microbiota intestinal ............................................................................ 11 2.3.2. A composição da microbiota de frangos em situações normais e em algumas situações específicas ............................................................................................................ 14 2.4. Alterações na mucosa intestinal .............................................................................. 15 III. OBJETIVOS ................................................................................................................ 17 3.1. Objetivo geral ............................................................................................................. 17 3.2. Objetivos específicos ................................................................................................ 18 IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................... 18 CAPÍTULO 2 − ALTERAÇÕES FISIOLÓGICAS INTESTINAIS EM FRANGOS DE CORTE SUPLEMENTADOS COM Bacillus subtilis E/OU ÓLEOS ESSENCIAIS: EXPRESSÃO GÊNICA, ATIVIDADE ENZIMÁTICA E ABSORÇÃO DE GLICOSE 27 RESUMO .................................................................................................................. 27 ABSTRACT .............................................................................................................. 28 ii I INTRODUÇÃO ............................................................................................... 29 II MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 31 2.1. Local............................................................................................................................. 31 2.2. Animais, dieta e manejo ........................................................................................... 31 2.3. Desempenho .............................................................................................................. 33 2.4. Coleta de amostras ................................................................................................... 33 2.5. Avaliação da expressão dos genes relacionados à digestão (APN, SI e MGA) e absorção dos nutrientes (SLC15A1, SLC2A2, SLC5A1 e ATP1A1) pela técnica de PCR em tempo real (qPCR) ................................................................................................ 34 2.5.1. Extração, quantificação e avaliação da qualidade do RNA total ....................... 34 2.5.2. Gene normalizador para PCR em tempo real ....................................................... 34 2.5.3. Reação de transcrição reversa e PCR quantitativo em tempo real .................. 37 2.6. Atividade de enzimas de membrana (fosfatase alcalina, aminopeptidase e maltase) ................................................................................................................................... 40 2.7. Ensaio de Absorção de glicose in vitro .................................................................. 40 2.8. Análise estatística ...................................................................................................... 41 III RESULTADOS .............................................................................................. 42 3.1. Desempenho zootécnico .......................................................................................... 42 3.2. Expressão Gênica ..................................................................................................... 44 3.3. Atividade enzimática ................................................................................................. 49 3.5. Ensaio de absorção ................................................................................................... 54 IV DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ................................................................ 54 4.1. Desempenho Zootécnico .......................................................................................... 54 4.2. Expressão Gênica e atividade enzimática ............................................................. 55 4.2.1. Influência da dieta ...................................................................................................... 55 4.2.2. Influência da idade .................................................................................................... 59 V CONCLUSÕES .............................................................................................. 63 VI REFERÊNCIAS ............................................................................................. 63 CAPÍTULO 3 – MORFOMETRIA E MICROBIOTA DA MUCOSA DO INTESTINO DELGADO DE FRANGOS SUPLEMENTADOS COM AVILAMICINA, Bacillus subtilis E ÓLEOS ESSENCIAIS ............................................................................. 68 RESUMO .................................................................................................................. 68 ABSTRACT .............................................................................................................. 69 I INTRODUÇÃO ............................................................................................... 70 iii II MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 72 2.1. Local, animais e dieta ............................................................................................... 72 2.2. Coleta de amostras ................................................................................................... 72 2.3. Morfometria da mucosa do intestino delgado ....................................................... 73 2.4. Análise da microbiota intestinal ............................................................................... 74 2.4.1. Preparo do “pellet” bacteriano ................................................................................. 74 2.4.2. Extração de DNA das amostras de microbiota intestinal .................................... 74 2.4.3. Oligonucleotídeos iniciadores utilizados e cobertura de estirpes ...................... 75 2.4.4. Amplificação das amostras de DNA genômico ..................................................... 77 2.4.5. Clonagem em vetor plasmídeo TOPOTA® ............................................................ 77 2.4.6. Cultivo de clones bacterianos e extração de DNA plasmidial ............................ 78 2.4.7. Sequenciamento dos clones e comprovação da especificidade dos “primers” 79 2.4.8. Purificação e linearização dos plasmídeos para a construção das curvas- padrão ..................................................................................................................................... 79 2.4.9. Construção da curva padrão e quantificação absoluta ....................................... 80 2.4.10. Reações de PCR em tempo real ........................................................................ 81 2.4.11. Análise de “threshold” e eficiência das curvas-padrão .................................... 81 2.5. Análise estatística ...................................................................................................... 82 III RESULTADOS .............................................................................................. 83 3.1. Morfometria intestinal ................................................................................................ 83 3.2. Microbiota presente na mucosa intestinal ............................................................. 85 IV DISCUSSÃO DOS RESULTADOS ................................................................ 90 4.1. Morfometria intestinal ................................................................................................ 90 4.2. Microbiota presente na mucosa intestinal ............................................................. 92 V CONCLUSÕES .............................................................................................. 98 VI REFERÊNCIAS ............................................................................................. 98 CAPÍTULO 4 - CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................... 105 iv v USO DE PROBIÓTICO E ÓLEOS ESSENCIAIS NA RAÇÃO SOBRE A MICROBIOTA INTESTINAL, ATIVIDADE DE ENZIMAS DIGESTIVAS E A EXPRESSÃO DE GENES RELACIONADOS AOS PROCESSOS DE DIGESTÃO E ABSORÇÃO DE NUTRIENTES EM FRANGOS RESUMO – A hipótese do trabalho se baseou em que a adição de avilamicina (antibiótico promotor de crescimento), Bacillus subtilis (probiótico) e óleos essenciais (carvacrol, cinamaldeído, cineol e extrato de pimenta), elevam o desempenho zootécnico de frangos a partir de benefícios na mucosa intestinal e na microbiota a ela associada. No Capítulo 1 apresentamos uma revisão bibliográfica sobre o assunto, a qual nos permitiu desenhar a referida hipótese. Os objetivos específicos do presente estudo foram avaliar o efeito destes aditivos alimentares aos 7, 21 e 42 dias de vida sobre: 1) o desempenho zootécnico; 2) os níveis de RNAm dos genes SLC15A1, SLC5A1, SLC2A2, ATP1A1, (respectivamente codificadores de PepT1, SGLT1, GLUT2 e Na-K-ATPase) na mucosa do jejuno; 3) atividades de fosfatase alcalina, maltase e aminopeptidase nas membranas da borda em escova no jejuno; 4) absorção de glicose intestinal “in-vitro”. 5) número de cópias do 16S DNAr de grupos bacterianos de maior predominância na mucosa do íleo; 6) morfometria das vilosidades intestinais; Todos os dados foram avaliados em função do tempo, exceto os dados de desempenho. Para tanto, 1320 frangos foram divididos entre cinco tratamentos de acordo com a suplementação [dieta basal como controle (CON); Bacillus subtilis (BS); Bacillus-subtilis + óleo essencial (BS + OEs); óleos essenciais (OEs); avilamicina como controle positivo (AVI)]. Os resultados do Capítulo 2 demonstraram que a suplementação de AVI e OEs na ração de frangos de 1 a 42 dias de idade promove maior atividade de fosfatase alcalina intestinal e aminopeptidase, enquanto a adição de Bacillus subtilis promove maior quantidade de RNAm do gene codificador do transportador de peptídeos 1 (SLC15A1). No Capítulo 3 evidenciou-se que a suplementação com BS ou OEs promove alterações momentâneas na morfometria intestinal dos frangos. Os Lactobacillus predominam na mucosa do íleo, e sua maior prevalência ocorre no dia 7, seguida pelo dia 42. A utilização de AVI ou OEs altera o padrão de sucessão dos Enterococcus, enquanto a dieta BS + OEs reduz os Lactobacillus. Conclui-se que as alterações encontradas não favoreceram o desempenho zootécnico dos frangos e que, durante o seu desenvolvimento, o intestino do frango sofre alterações específicas que podem ser levadas em conta para a formulação de dietas que se adequem melhor ao perfil de enzimas e transportadores de nutrientes expressados no intestino ao longo do tempo. Palavras-chave: 16S DNAr, antibiótico promotor de crescimento, enzimas de membrana intestinal, fisiologia intestinal, probiótico, transporte intestinal de nutrientes vi 6. USE OF PROBIOTICS AND ESSENTIAL OILS IN THE DIET ON THE INTESTINAL MICROBIOTA, DIGESTIVE ENZYME ACTIVITIES AND EXPRESSION OF GENES RELATED TO DIGESTION AND ABSORPTION OF NUTRIENTS IN BROILERS ABSTRACT − It was hypothesized that, when added to the feed, avilamycin (antibiotic growth promoter), Bacillus subtilis (probiotic) and essential oils (carvacrol, cinnamaldehyde, cineol and pepper extract) increase growth performance of broilers through benefits on intestinal mucosa and its microbiota. In Chapter 1 we present a literature review on the subject, which allowed us to draw such hypothesis. The specific objectives of this study were to evaluate the effect of these feed additives nat 7 21 and 42 days of life on: 1) the growth performance; 2) SLC15A1, SLC5A1, SLC2A2, ATP1A1 mRNA levels (respectively encoding PepT1, SGLT1, GLUT2 and Na-K-ATPase) in the jejunum; 3) activities of alkaline phosphatase, maltase and aminopeptidase from the brush border membranes of the jejunum; 4) intestinal glucose absorption of in vitro; 5) 16S rDNA copy numbers of the major bacterial groups in association with the ileum mucosa. 6) morphology of the intestinal villi; All data were also evaluated over the time course, except for the performance data. Therefore, 1320 broiler chickens were divided among five treatments, according to supplementation [basal diet as control (CON); Bacillus subtilis (BS); Bacillus subtilis + essential oils (BS + EOs); essential oils (EOs); avilamycin as positive control (AVI)]. The results of Chapter 2 demonstrated that supplementation of BS promoted greater expression of SLC15A1, while EOs and AVI increased the activities of both IAP and APN. Analysis over time revealed an increase in the amount of mRNA MGAM, SLC2A2, SLC15A1, SLC5A1 and SI from seven to 42 days. IAP was reduced after seven days, while MALT increased with age. Addition of Bacillus subtilis or essential oils in the diet induces changes in the expression of genes and activities of enzymes related to sugars and peptides utilization, but did not improve growth performance. In Chapter 3 it was shown that supplementation with BS or EOs supplementation promotes momentary changes in intestinal morphology of broilers. Lactobacilli predominate in the mucosa of the ileum, and their higher prevalence occur at day 7 and then at day 42. The use of AVI or EOs changes the pattern of succession of Enterococcus, while BS diet + EOs reduces Lactobacillus. We conclude that the changes found did not favor the growth performance of broilers and that, during its development, the chicken intestine undergoes specific changes that can be taken into account in the formulation of diets that best fits the profile of enzymes and nutrient transporters expressed in the intestine over time. Keywords: 16S rDNA, antibiotic growth promoter, brush border enzymes, intestinal physiology, intestinal transport, probiotic vii LISTA DE ABREVIATURAS ACTB: gene codificador da β-actina citoplasmática AGP: “antibiotic growth promoters” ANPEP: gene codificador da aminopeptidase N APCs: antibióticos promotores de crescimento APN: aminopeptidase-N ATP1A1: gene codificador do trasnportador ATPase, Na+/K+ ATPase: adenosina 5’ trifosfatase AVI: tratamento suplementado com avilamicina no presente estudo BS + OEs: tratamento suplementado com Bacillus subtilis e óleos essenciais no presente estudo BS: tratamento suplementado com Bacillus subtilis no presente estudo CA: conversão alimentar cDNA: DNA complementar CON: tratamento controle no presente estudo CR: consumo de ração Ct: ciclo de “threshold” DEPC: dietil pirocarbonato DNA: ácido desoxirribonucleico DNase: desoxirribonuclease RIN: índice de integridade do RNA EDTA: ácido etilenodiamino tetra-acético EOs: “essential oils” EPM: erro padrão da média FAI: fosfatase alcalina intestinal viii GAPDH: gene codificador da gliceraldeído 3 fosfato desidrogenase GLUT 2: transportador de glicose galactose e frutose independente de Na+ GP: ganho de peso HPRT1: gene codificador da hipoxantina fosforibosiltransferase 1 IAP: “intestinal alkaline phosphatase” LPS: lipopolissacarídeos MALT: maltase MGAM: gene codificador da maltase-glicoamilase OEs: óleos essenciais ou tratamento suplementado com óleos essenciais no presente estudo PAS: método de coloração pelo ácido periódico-Schiff (PAS) pb: pares de base PBS: tampão fosfato-salino PCR: reação em cadeia da polimerase PepT1: transportador de peptídeos 1 qPCR: PCR quantitativo em tempo real RNA: ácido ribonucleico RNAm: RNA mensageiro Rnase: ribonuclease RNase-free: livre de ribonuclease RT-qPCR: PCR quantitativo em tempo real envolvendo a transcrição reversa SGLT1: transportador de glicose e galactose dependente de Na+ SI: gene codificador da sacarase-isomaltase SLC15A1: gene codificador do transportador de oligopeptídeos 1 ix SLC2A2: gene codificador do transportador de glicose galactose e frutose independente de Na+ SLC5A1: gene codificador do transportador de glicose e galactose dependente de Na+ SPF: “specific pathogen free” TE: solução 10mM Tris-HCl, 1mM EDTA; pH8,0 UFC: unidades formadoras de colônia VMBE: vesículas de membrana da borda em escova x LISTA DE TABELAS Página CAPÍTULO 2 Tabela 1. Composição das dietas inicial e final............................................. 44 Tabela 2. Resultados da análise com modelo linear misto com os componentes de variância para cada gene aos 7, 21 e 42 dias de idade....... 48 Tabela 3. Sequências dos oligonucleotídeos utilizados na reação de RTq- PCR com os respectivos números de acesso no “Genbank” e descrição...... 51 Tabela 4. Médias observadas e resultados da análise de variância para consumo de ração (CR, g), ganho de peso (GP, g) e conversão alimentar (CA, g/g) de frangos de corte (N=6) nos períodos de 1 a 7, 8 a 21, 1 a 21, 22 a 42 e 1 a 42 dias de idade....................................................................... 55 Tabela 5. Resultados da análise de variância da expressão dos genes estudados através de um modelo linear misto.............................................. 56 Tabela 6. Resultados da análise com o modelo linear misto mostrando fatores que influenciam a atividade das enzimas de membrana intestinal estudadas..................................................................................................... 62 Tabela 7. Área abaixo da curva (média ± desvio padrão) para o decaimento de glicose intraluminal in vitro....................................................................... 66 CAPÍTULO 3 Tabela 1. “Primers” utilizados nas reações de qPCR.................................... 88 Tabela 2. Equações das curvas-padrão e valores de “slope”, r2 e eficiência dos grupos bacterianos estudados............................................................... 94 Tabela 3. Resultados da análise de variância das variáveis morfométricas estudadas através de um modelo linear misto.............................................. 95 Tabela 4. Morfometria da mucosa do jejuno de frangos de corte (N=6) aos 7, 21 e 42 dias de idade................................................................................. 96 Tabela 5. Resultados da análise de variância do número de cópias do gene 16S para os grupos bacterianos estudados através de um modelo linear misto............................................................................................................. 98 Tabela 6. Número de cópias1 bacterianas da família Enterobacteriaceae, do Gênero Enterococcus spp. e do Grupo Lactobacillus e relação xi Enterobacteriaceae /Lactobacillus na mucosa do íleo de frangos de corte (N=4) aos 7, 21 e 42 dias de idade................................................................ 99 xii LISTA DE FIGURAS Página CAPÍTULO 2 Figura 1. Estabilidade dos 3 genes candidatos a gene normalizador segundo o programa Genorm considerando todo o período experimental.... 47 Figura 2. Estabilidade dos 3 genes candidatos a gene normalizador segundo o programa Norfinder considerando todo o período experimental.. 47 Figura 3. Expressão do gene SLC15A1 nos diferentes tratamentos em relação ao controle (CON) durante todo período experimental..................... 57 Figura 4. Expressão dos genes ATP1A1 e MGAM nos diferentes tratamentos em relação ao controle (CON) aos 7, 21 e 42 dias de idade....... 58 Figura 5. Comparação dos níveis de expressão gênica entre idades para: A – ATP1A1 nos tratamentos BS e CON; B - MGAM em todos tratamentos; C - SLC2A2, SLC15A1, SLC5A1 e SI considerando a média de todos tratamentos................................................................................................... 60 Figura 6. Atividade enzimática de FAI (A), APN (B) e MALT (C) nos diferentes tratamentos em relação ao tratamento controle (CON) durante todo período experimental............................................................................ 63 Figura 7. Comparação da atividade enzimática de FAI (A), APN (B) e MALT (C) entre idades de coleta, considerando a média de todos os tratamentos................................................................................................... 65 CAPÍTULO 3 Figura 1. Valor total de cópias do gene 16 S rDNA genômico de cada um dos grupos estudados na mucosa do íleo de frangos de corte aos 7, 21 e 42 dias de idade............................................................................................ 100 Figura 2. Valor total de cópias do gene 16 S rDNA genômico de cada um dos grupos estudados na mucosa do íleo de frangos de corte de acordo com os tratamentos, aos 7, 21 e 42 dias de idade......................................... 101 1 CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS I. INTRODUÇÃO A introdução de aditivos na dieta, reconhecidamente, foi um dos fatores que contribuiu para o sucesso da avicultura moderna. O termo aditivo inclui as substâncias que, quando adicionadas à ração, trazem melhorias ao desempenho de aves saudáveis ou influenciam positivamente o meio ambiente. Os antibióticos promotores de crescimento (APCs) são os principais representantes desta classe de substâncias, sendo que seu uso na dieta de animais de produção trouxe melhorias de ganho de peso e eficiência alimentar, bem como queda nas taxas de mortalidade. Os benefícios dos APCs são atribuídos à sua ação inibitória sobre microorganismos indesejáveis do trato gastrintestinal, bem como sobre seus metabólitos (IMMERSEEL et al., 2004). Tais funções permitem que os nutrientes da dieta sejam aproveitados para o desenvolvimento muscular ao invés de serem utilizados para a formação da resposta imune (DE ARAUJO et al., 2007). A avilamicina destaca-se como um dos antibióticos mais empregados na nutrição animal, tendo sua utilização permitida pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento. Por outro lado, o uso dos APCs encontra-se sob severa investigação científica, porque tais substâncias têm sido associadas à emergência de cepas resistentes a antibióticos, o que representa ameaça para a saúde humana (SMITH et al., 2003), para animais silvestres e de companhia. Neste sentido, em 1997, a União Européia proibiu o emprego da avoparcina como promotor de crescimento e, em janeiro de 2006, baniu o uso dos APCs na nutrição animal (BURCH, 2006). Probióticos e mais recentemente óleos essenciais (OEs) têm sido considerados aditivos potencialmente alternativos aos APCs, no entanto a ação destas substâncias na mucosa intestinal e na microbiota das aves não é completamente esclarecida. De fato, resultados conflitantes no desempenho, mucosa intestinal e microbiota, em resposta a utilização destes aditivos foram reportados na literatura. Em virtude da falta de conhecimento sobre o efeito do Bacillus subtilis e dos OEs na microbiota intestinal e na expressão e atividade de enzimas e transportadores de membrana intestinal e considerando que tais informações poderiam ser úteis para 2 a compreensão do mecanismo de ação destes aditivos, elaborou-se o presente trabalho. II. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Antibióticos promotores de crescimento Os APCs são antibióticos que quando adicionados na ração em baixa concentração, ou seja em quantidade subterapêutica, são capazes de melhorar o desempenho do animal (NIEWOLD, 2007). O efeito benéfico dos APCs no crescimento foi descoberto na década de 40 do século passado, quando foi verificado que animais alimentados com Streptomyces aureofaciens desidratado contendo resíduo de clortetraciclina apresentaram desempenho superior (CASTANON, 2007). Desde então, diversos trabalhos relatam melhoria na eficiência produtiva com o uso dos APCs em animais destinados à alimentação (GASKINS et al., 2002; NIEWOLD, 2006; PAGE, 2006; NIEWOLD, 2007). Estima-se que a utilização de APCs na dieta de animais de produção, através de mecanismos inespecíficos e não completamente compreendidos, contribui para aumento de 5-6% no peso vivo e melhora de 3-4% na eficiência alimentar, com efeito mais pronunciado em animais jovens (BUTAYE et al., 2003). Mecanismos de ação O antibiótico pode ter efeito bactericida, quando destrói a bactéria, ou bacteriostático, quando inibe a sua proliferação. O bactericida pode atuar de três formas: i. Alterando a permeabilidade da membrana celular; ii. inibindo a síntese da parede celular; iii. inibindo a síntese de ácido nucléico. O antimicrobiano bacteriostático pode exercer sua função bloqueando vias metabólicas importantes ou através da inibição da síntese protéica (AMATO NETO et al., 2000). Hipóteses para a ação dos APCs na promoção do crescimento animal Pelo menos cinco mecanismos foram propostos para explicar o aumento no ganho de peso em resposta à suplementação com APCs (GASKINS et al., 2002; NIEWOLD, 2006; PAGE, 2006; NIEWOLD, 2007): i. inibição da infecção subclínica endêmica, reduzindo os custos metabólicos da resposta imune inata; ii. redução dos 3 metabólitos depressores do crescimento (como amônia e produtos de degradação da bile) produzidos por microrganismos Gram-positivos; iii. redução da utilização microbiana de nutrientes; iv. elevação da absorção e da utilização de nutrientes, porque a parede intestinal em animais alimentados com APC é mais fina; v. inibição da produção e da excreção de mediadores do catabolismo por células inflamatórias presentes no intestino, resultando em economia de energia para o crescimento. As quatro primeiras hipóteses compartilham a pressuposição de que a microbiota intestinal reduz o crescimento do animal, tanto diretamente, como indiretamente, e que o mecanismo de ação do APC é baseado na sua propriedade antimicrobiana. Enquanto isso, a quinta hipótese considera que as alterações na microbiota com o uso dos APCs são secundárias à redução da inflamação, ou seja os autores sugerem que os APCs agem essencialmente na mucosa controlando a inflamação. A base para esta quinta hipótese reside no fato dos APCs serem utilizados em doses abaixo da dose inibitória mínima, de forma que sua ação direta na microbiota seria pouco provável (NIEWOLD, 2007). Resistência bacteriana a antibióticos A resistência aos antibióticos pode ocorrer em bactérias patogênicas e comensais, tanto in vivo, como no meio ambiente, podendo ser classificada como intrínseca ou adquirida. A resistência intrínseca é aquela que faz parte das características fenotípicas naturais do micro-organismo e por isso é transmitida verticalmente. A resistência microbiana adquirida ocorre através de mutações espontâneas ou, mais comumente por aquisição de genes (transmissão horizontal). Acredita-se que os mecanismos de transformação e conjugação sejam responsáveis pela distribuição rápida dos genes de resistência a antibióticos nas bactérias (CHEN et al., 2005). Além disso, a transferência horizontal de elementos genéticos móveis também contribui para a evolução dos patógenos emergentes através da disseminação de genes de resistência. Variados tipos de material genético, como os plasmídeos, transposons e integrons podem participar desta evolução (CARATTOLI, 2013). Outra forma de transferência de genes entre espécies bacterianas de táxons distintos é a transdução (transferência gênica mediada por bacteriófago) (MUNIESA et al., 2013). A utilização de agentes antimicrobianos pode alterar a comunidade bacteriana em determinado local por eliminar cepas susceptíveis e permitir a multiplicação de 4 bactérias resistentes (O'BRIEN, 2002). Desta maneira, a utilização de APC na dieta pode alterar a microbiota intestinal e criar um ambiente favorável para o estabelecimento de bactérias resistentes e patogênicas. De fato, diversos estudos demonstraram a presença bactérias resistentes a antibióticos em frangos (E. coli, Salmonella serovars; Enterococcus spp, C perfringens) (DIARRA et al., 2007; DIARRASSOUBA et al., 2007; AGUNOS et al., 2012; ST. AMAND et al., 2013). Vários genes de resistência a antibiótico presentes nestas bactérias foram identificados em elementos genéticos móveis, como plasmídeos, transposons e integrons, permitindo sua disseminação entre bactérias tanto no intestino das aves, como no meio ambiente. A utilização disseminada de antibióticos na medicina humana, na veterinária e em atividades agrícolas tem sido responsabilizada pela propagação dos mecanismos de resistência a antibióticos, sendo associada ainda à redução nas opções de tratamento e queda na eficácia terapêutica em pacientes humanos (DIARRA e MALOUIN, 2014). Embora não se possa afirmar qual a parcela de responsabilidade do uso de APCs na difusão da resistência bacteriana, observa-se uma pressão social contrária a sua utilização. Na União Europeia, por exemplo, a comercialização e o uso de APCs foi banida oficialmente em 2007 (DIARRA e MALOUIN, 2014). Esta decisão política foi tomada com base no princípio da precaução: “Quando existe ameaça de sensível redução ou perda de diversidade biológica, a falta de plena certeza científica não deve ser usada como razão para postergar medidas para evitar ou minimizar esta ameaça” (Princípio 15 da declaração do rio de 1992), disponível no endereço eletrônico: http://www.unep.org/Documents.Multilingual/Default.asp?DocumentID=78andArticleI D=1163. Além disso, em outros países como os EUA existe uma forte pressão da opinião pública para a criação de animais livres de APCs (DIBNER e RICHARDS., 2005; CASTANON, 2007). Consequências da proibição da comercialização dos APCs em países europeus A proibição da comercialização dos APCs na Europa promoveu redução na presença de genes de resistência em cepas de Enterococcus coletadas de fezes de animais de produção (VAN DEN BOGAARD et al., 2000; HAMMERUM et al., 2007). Contudo, segundo alguns autores, essa diminuição ocorreu ao custo da deterioração do bem estar dos animais (CASEWELL et al., 2003). Queda na produtividade também 5 pode ser verificada após o fim do uso dos APCs. Na Suécia, por exemplo, 16 anos após a retirada dos APCs, a perda em produtividade em suínos ainda não havia sido recuperada (WIERUP, 2001). A Dinamarca foi um dos primeiros países a proibir o usos dos APCs, onde a medida foi acompanhada de piora da conversão alimentar na criação de frangos, evidenciada pelo aumento de 0,016 kg/kg na relação quantidade de ração utilizada até o abate / pelo peso vivo ao abate, entre 1995 a 1999 (EMBORG et al., 2002). Consequências ainda mais severas foram verificadas na indústria suína Dinamarquesa, onde houve queda no ganho de peso diário de 422 g em 1995 para 415 g por dia em 2001 e aumento de 2,7 para 3,5% na mortalidade no mesmo período (CALLESEN, 2003). O aumento da incidência de infecções na criação animal, com a queda dos APCs, levou a um aumento substancial da utilização de antibióticos com a finalidade terapêutica (MUIRHEAD, 2002), que são idênticos aos utilizados na medicina humana, constituindo risco para o homem. A grande preocupação é a possibilidade da veiculação de agentes patogênicos contendo genes de resistência ao homem, como Samonella, Campylobacter e cepas de E. coli causadoras de zoonose. Por outro lado, Wierup (2001) reportou que na Suécia, como resultado da retirada dos APCs, foco na prevenção de doenças e uso correto de antimicrobianos, o uso geral de antibióticos em animais reduziu 55% entre 1986 e 1999, bem como a prevalência de resistência a antibióticos foi relativamente baixa. Castanon (2007) sugeriu que a retirada dos APCs demanda melhora nas condições de higiene das fazendas, visto que foi demonstrado que sob condições adequadas de criação é possível obter bons índices de produção de frangos, sem a necessidade da administração contínua de antibiótico na ração (WIERUP, 2001; ENGSTER et al., 2002). Além disso, segundo os mesmo autores (Castanon, 2007), atualmente dispomos de aditivos alternativos aos APCs que atuam na microbiota e são considerados seguros, como enzimas, prebióticos, probióticos e acidificantes e que poderiam contribuir na obtenção de resultados produtivos semelhantes aos dos APCs. 2.2. Alternativas aos APCs Além de boas práticas de manejo visando a criação dos animais em condições de higiene adequada, a utilização de aditivos alternativos aos APCs pode contribuir 6 para a redução dos impactos advindos de sua descontinuidade (HUYGHEBAERT et al., 2011). Assim, ao longo das últimas décadas, a comunidade científica vem se mobilizando na busca por alternativas que possam assegurar os mesmos índices de desempenho e mortalidade da era dos APCs. Diversas estratégias alternativas aos APCs estão sob investigação na produção animal, como ácidos orgânicos com atividade antimicrobiana, bacteriófagos, enzimas exógenas, ervas, pimentas e extratos de plantas, peptídeos antimicrobianos, prebióticos, probióticos, vacinação e imuno-estimulação através de peptídeos catiônicos, citocinas e bacteriocinas, entre outros (HUYGHEBAERT et al., 2011; DIARRA e MALOUIN, 2014); No entanto, nenhuma destas novas abordagens foi sistematicamente implementada até o presente momento e o que mais se observa em criações comerciais é a utilização empírica das alternativas existentes. Na prática, a capacidade de melhorar o desempenho tem determinado a predileção dos produtores (HUYGHEBAERT et al., 2011), ainda que os mecanismos de ação destas substâncias não sejam totalmente compreendidos e que seus resultados careçam de reprodutibilidade. Dentre os potenciais substitutos aos APCs, probióticos e OEs atuam por meio da modulação da microbiota intestinal, sendo associados à melhora da fisiologia intestinal e aumento do ganho de peso de frangos (JANG et al., 2007; BASMACIOĞLU MALAYOĞLU et al., 2010; WANG, Y. e GU, Q., 2010). Contudo, estes aditivos também têm gerado resultados inconsistentes, de forma que a investigação de sua interação com a microbiota e a mucosa intestinal pode auxiliar na compreensão de sua ação biológica no animal, possibilitando sua melhor utilização. Além disso, segundo Brenes e Roura (2010) a associação de OEs com outra classe de aditivo, como ácidos orgânicos, probióticos, entre outros, deve ser encorajada na busca de eventuais efeitos sinérgicos. 2.2.1. Probióticos 2.2.1.1. Definição e características dos probióticos Probióticos são definidos como culturas individuais ou mistas de microrganismos viáveis usados como aditivos, que trazem benefícios ao hospedeiro por promover a melhoria do equilíbrio intestinal (FULLER, 1989). As espécies bacterianas dos probióticos podem ser classificadas em colonizadoras, como 7 Lactobacillus e Enterococcus spp, e não colonizadoras, como Bacillus spp (esporos) e Saccharomyces cerevisiae. O princípio de ação dos probióticos baseia-se em dois mecanismos básicos, a exclusão competitiva e a imunomodulação. A exclusão competitiva envolve a competição por substrato, a produção de metabólitos antimicrobianos que inibem patógenos, e a competição por sítios de ligação (YANG et al., 2009). O mecanismo de ação varia de acordo com a cepa de probiótico, podendo ocorrer pela produção de metabólitos específicos (ácidos graxos de cadeia curta, H2O2 ou metabólitos com propriedade antimicrobiana), interação com receptores, estimulação do sistema imune, e outros (MADSEN et al., 2001; SHERMAN et al., 2009). 2.2.1.2. Efeitos dos probióticos Alguns trabalhos relatam melhoria do desempenho e da saúde de frangos de corte alimentados com probiótico (KALAVATHY et al., 2008; AWAD et al., 2009). Estes resultados têm sido atribuídos à manipulação da microbiota intestinal, que inclusive pode levar a inibição de patógenos intestinais (ROLFE, 2000). De fato, aumento e manutenção da microbiota benéfica do intestino foi verificada com a utilização de Lactobacillus spp., Pediococcus penttosaceus e Bacillus spp como probiótico em frangos (TEO E TAN, 2005). No mesmo estudo, as cepas demonstraram atividade antimicrobiana contra C. perfringens (TEO e TAN, 2005). Estudos seguintes comprovaram a capacidade do Bacillus subtilis PB6, isolado do intestino de aves normais, controlar a enterite necrótica induzida experimentalmente, associada com melhora da saúde intestinal (DE SMET e VERLEYEN, 2010). Probióticos também podem atuar sobre o epitélio intestinal. Aumento na altura das vilosidades foi verificado no íleo de galos reprodutores pesados após a alimentação com dieta contendo Bacillus subtilis var. natto (SAMANYA e YAMAUCHI, 2002). Melhora na função digestiva de frangos alimentados com dieta contendo probióticos também foi reportada (WANG e GU, 2010). No estudo em questão, houve melhora na atividade de protease e de amilase presentes no conteúdo intestinal de frangos de corte alimentados com dieta contendo Bacillus coagulans (WANG e GU, 2010). Por outro lado, a suplementação com Enterococcus faecium não alterou a expressão e a atividade de enzimas digestivas da borda em escova de leitões (MARTIN et al., 2012). 8 Apesar de investigações do transporte epitelial em resposta a suplementação com probióticos em frangos não serem de nosso conhecimento, existem relatos de que a absorção de glicose no intestino pode ser favorecida com o uso de probióticos em mamíferos. O tratamento oral de ratos com Saccharomyces boulardii promoveu acentuada estimulação da absorção de D-glicose na membrana borda em escova de enterócitos, com aumento associado no co-transportador de Na+ D-glicose (SGLT-1), medido por triagem radiográfica da proteína (BUTS e BERNASCONI, 2005). Além disso, a administração de B. thetaiotaomicron em camundongos aumentou a expressão de algumas proteínas importantes para a absorção de nutrientes, incluindo o co-transportador Na+/glicose e a proteína de ligação de ácidos graxos (HOOPER e GORDON, 2001). 2.2.2. Óleos essenciais 2.2.2.1. Definição e características dos OEs Óleos essenciais (OEs) são substâncias extraídas de ervas e especiarias, que formam uma mistura complexa de vários compostos fitoquímicos, como carvacrol, timol, cinnamaldeído, entre outros, com propriedade seletiva sobre a microbiota (LEE et al., 2003) e com capacidade de melhorar o desempenho animal em sistemas intensivos de produção (WILLIAMS e LOSA, 2001). Os compostos ativos dos OEs são obtidos de partes de plantas por destilação por arraste de vapor d’água e ou por prensagem dos pericarpos de frutos cítricos (FERREIRA, 2010), sendo que sua nomenclatura é determinada pela planta que o originou. Os OEs são denominados como óleo devido a sua característica lipofílica, no entanto eles não possuem composição glicerídica como os verdadeiros óleos e gorduras (SIANI et al., 2000). Os compostos biologicamente ativos das plantas são na maioria metabólitos secundários, lipofílicos, líquidos ou voláteis, que pertencem aos grupos químicos dos terpenóides (monoterpenos e sesquiterpenos, esteróides, etc), fenóis (taninos), glicosídeos e alcalóides (álcoois, aldeídos cetonas, ésteres, éteres, lactonas, etc.). A composição pode variar devido a fatores biológicos (espécie de planta, local de plantio e condições de colheita), de produção (extração, destilação e estabilidade) e também pelas condições de armazenamento (luz, temperatura, tensão de oxigênio e tempo de estocagem) (HUYGHEBAERT et al., 2011). Assim, o grande desafio em se trabalhar 9 com esta classe de aditivos consiste na padronização, uma vez que muitos fatores podem interferir em sua composição e consequentemente na função do produto no organismo do animal. 2.2.2.2. Efeitos dos OEs Óleos essências podem ter mais de uma ação, incluindo aumento do consumo de ração e da palatabilidade, estimulação da secreção de enzimas digestivas, aumento das motilidades gástrica e intestinal, estimulação endócrina, atividade antibacteriana, atividade antiviral, atividade anti-helmíntica, atividade coccidiostática, estimulação da resposta imune, atividade antiinflamatória e antioxidante e ação pigmentante (BASMACIOĞLU MALAYOĞLU et al., 2010). Devido a um possível sinergismo entre os constituintes dos óleos essenciais, e por se tratar de uma classe de aditivos relativamente nova, muito ainda precisa ser estudado para se compreender o papel de cada constituinte no organismo dos animais. Ainda não se sabe com certeza, por exemplo, qual constituinte estimula as enzimas endógenas, atua como oxidante, é agente antimicrobino, ou imunodulador (HUYGHEBAERT et al., 2011). Acredita-se que os óleos essenciais melhoram o desempenho zootécnico dos frangos de corte (LEE et al., 2003; CIFTCI et al., 2005; ISABEL e SANTOS, 2009) atuando na microbiota intestinal. Timol e carvacrol, componentes principais dos óleos essenciais derivados do tomilho e do orégano, demonstraram propriedades antimicrobiana, antioxidante e anti-séptica in vitro (LEE e AHN, 1998). Efeitos similares foram demonstrados in vivo (JANG et al., 2007). Ademais, dados da literatura sobre a dose inibitória mínima dos OEs sugerem que sua ação antimicrobiana varia de acordo com a planta de origem (PENALVER et al., 2005; FU et al., 2007; BARBOSA et al., 2009). Adams (1999) classificou a atividade antimicrobiana de OEs extraídos de diversas plantas como fraca (gengibre e pimenta), média [cominho (p- cimeno), coentro (linalol), orégano (carvracol), alecrin (cineol), sálvia (cineol) e tomilho (timol)] e forte [cravo (eugenol), mostarda (alil-isotiocianato), canela (cinamaldeído) e alho (alicina)]. Além de influenciarem a microbiota intestinal óleos essências podem atuar sobre o epitélio intestinal. Melhora da morfometria intestinal com o uso de óleos essenciais foi relatada em aves (DEMIR et al., 2003). Estudos também relataram melhora na função digestiva de frangos alimentados com dieta contendo óleos 10 essenciais (LEE et al., 2003; JANG et al., 2007; BASMACIOĞLU MALAYOĞLU et al., 2010). A suplementação com uma mistura comercial de óleo essencial (50 mg OE/kg da dieta) aumentou a atividade de amilase pancreática e de maltase intestinal em relação à dieta basal (JANG et al., 2007). A inclusão de um produto comercial de óleo essencial, em dois níveis (250 mg OE/ kg e 500 mg OE/kg), elevou a atividade intestinal de quimiotripsina e a digestibilidade protéica (BASMACIOĞLU MALAYOĞLU et al., 2010). Resultados conflitantes do efeito de óleos essenciais no transporte de nutrientes na mucosa intestinal foram obtidos em modelos com infusão dos nutrientes in vitro. Kreydiyyeh et al. (2003) demonstraram, por modelo de perfusão intestinal in vitro com glicose marcada (14C), que a adição de 0,05% de óleo essencial de anis aumentou significativamente a absorção jejunal de glicose em ratos, o que coincidiu com a estimulação da atividade da ATPase Na+ K+. Por outro lado, observou-se por técnica eletrofisiológica in vitro, que timol e cinnamaldeido (1 mmol/L) reduziram a corrente de curto-circuito basal (ISC) em soluções contendo glicose ou L-alanina, indicando menor absorção destes nutrientes, o que foi atribuído à inibição da atividade da ATPase Na+ K+ (MICHIELS et al., 2010). 2.3. A microbiota intestinal A vida do homem e dos animais está estritamente relacionada com os microrganismos, sendo que a microbiota intestinal desempenha um papel fundamental na sua saúde e bem-estar, bem como na produtividade dos animais (CALLAWAY et al., 2008). Na produção animal, a busca por aditivos alternativos aos APCs tem focado naqueles com capacidade de alterar favoravelmente a microbiota intestinal. Tais estudos baseiam-se no papel fundamental exercido pela microbiota intestinal nas funções fisiológica, imunológica do hospedeiro que impactam diretamente em seu desempenho (VISPO e KARASOV, 1997) A colonização do trato gastrintestinal por bactérias comensais traz uma série de benefícios ao animal. Animais detentores de microbiota comensal possuem maior atividade de enzimas digestivas, geração de nutrientes (por exemplo, ácidos graxos de cadeia curta, aminoácidos e vitaminas), bem como menor colonização por bactérias indesejáveis do que os SPF (“specific pathogen free”) (WILLING e VAN KESSEL, 2009). Além disso, a microbiota pode afetar a morfometria da parede 11 intestinal e induzir as reações imunes adaptativa e inata, que podem afetar o gasto energético do animal (HUMPHREY e KLASING, 2004; TEIRLYNCK et al., 2009). Ácidos graxos de cadeia curta (lactato, proprionato e butirato) são produzidos por bactérias no intestino, a partir de carboidratos não digeridos ou fibra, podendo ser utilizados como fonte de energia. Essa produção é afetada pela dieta do animal (KARAKI et al., 2006). De maneira semelhante, a microbiota em associação com a dieta, afeta a produção de aminas bioativas no intestino (WILLING e VAN KESSEL, 2009). Estas substâncias, que são produzidas na luz intestinal por microorganismos a partir da descarboxilação de aminoácidos, podem ter ação mitogênica (ALLISON e MACFARLANE, 1989). Algumas bactérias da microbiota normal também podem exercer um efeito deletério no desempenho dos animais, principalmente pela competição de nutrientes com o hospedeiro e pela produção de enzimas que afetam a integridade da mucosa intestinal (OVIEDO-RONDÓN, 2009). Contudo tais efeitos deletérios podem ser compensados pelo controle que eles exercem na colonização de microrganismos patogênicos (ITO et al., 2004). De fato, a microbiota microbiana normal impede a colonização de patógenos através da competição por sítios de ligação na mucosa e pela produção de ácidos orgânicos e bacteriocinas (OVIEDO-RONDÓN, 2009). 2.3.1. O estudo da microbiota intestinal Tradicionalmente, a análise da microbiota intestinal foi realizada pela cultura de microrganismos in vitro. Apesar destes métodos terem contribuído para a maior parte do conhecimento da microbiota intestinal até aqui, apresentam limitações importantes. A principal delas é que a grande maioria das bactérias intestinais não pode ser cultivada em laboratório devido à falta de conhecimento dos métodos bioquímicos necessários para sua multiplicação in vitro. Além disso, as bactérias pertencentes a uma comunidade estão relacionadas entre si e com seu meio, de maneira que o cultivo dos microrganismos em meio artificial não reproduz seu habitat natural (APAJALAHTI et al., 2004). Portanto, a real diversidade da microbiota não pode ser estudada com acurácia com estes métodos tradicionais, uma vez que apenas 1% de toda a microbiota é capaz de crescer em meios bioquímicos (HUGENHOLTZ et al., 1998). As técnicas moleculares permitiram um conhecimento muito mais amplo da ecologia microbiana do que as estratégias baseadas no isolamento e multiplicação em meios de cultura (AMANN et al., 1995; APAJALAHTI et al., 2004; BJERRUM et al., 12 2006). Estas técnicas baseiam-se na comparação de sequências de ácidos nucléicos (DNA ou RNA), e permitem a formação de um esquema de classificação (OVIEDO- RONDÓN, 2009). A princípio, sequências iniciadoras de nucleotídeos podem ser desenhadas para hibridizar com uma sequência complementar alvo e gerar uma descrição completa da presença deste alvo no meio, sem a necessidade da multiplicação bacteriana (OVIEDO-RONDÓN, 2009). Assim, para se fazer estudos de identificação ou quantificação da comunidade microbiana em determinado meio, não se faz necessário o sequenciamento do DNA genômico total de uma bactéria, que é um processo demorado e complexo. Um importante avanço na área de ecologia microbiana foi o uso da subunidade 16S do DNA ribossomal (16S DNAr), que pode ser utilizada por diferentes técnicas moleculares para identificar e quantificar microrganismos (AMANN et al., 1995). O 16S DNAr está entre as moléculas mais conservadas em todos os sistemas vivos, já que não possui transferência entre espécies, e também possui regiões variáveis e tamanho apropriados para análises de filogenia (cerca de 1500 pares de base) (AMANN et al., 1995; PEREIRA, 2003). Atualmente existe um vasto banco de dados de sequências do gene 16S DNAr, de forma que este marcador é o mais utilizado em estudos metagenômicos 16S DNAr (HEILIG et al., 2002; BARTOSCH et al., 2004; RINTTILÄ et al., 2004). Os métodos moleculares para o estudo da ecologia microbiana podem ser classificados em duas classes gerais: análises baseadas em compilação e análises da comunidade total (HOLBEN et al., 2004). Os métodos baseados em compilação muitas vezes envolvem uma análise aleatória (“shotgun”), onde sequências de genes funcionais ou ribossomais de 100 a 300 indivíduos da população são amplificados por PCR e clonados para gerar perfis filogenéticos ou comparados com os bancos de dados existentes. Estas técnicas provaram ser bastante sensíveis, contudo possuem capacidade limitada para detectar com precisão a variabilidade total da comunidade microbiana, especialmente em sistemas complexos como o solo e o trato gastrintestinal, pois organismos pouco abundantes podem passar despercebidos (HOLBEN et al., 2004). Análises da comunidade total caracterizam a estrutura da população total através da análise direta do DNA total da população, gerando abundâncias relativas de bases de DNA. Diversos métodos foram desenvolvidos nesta classe, como o monitoramento da cinética de recombinação do DNA, análise de restrição de 13 fragmentos de PCR da comunidade total como o T-RFLP “Terminal Restriction Fragment Lenght Polymorphism”, eletroforese em gel desnaturante (DGGE) de “amplicons” da comunidade, e fracionamento do DNA total da comunidade com base no teor de G + C (OVIEDO-RONDÓN, 2009). O T-RFLP, por exemplo, baseia-se na fragmentação do DNA de uma comunidade por enzimas de restrição, gerando fragmentos de tamanho característicos para cada espécie presente, resultando na “impressão digital” desta comunidade (GONG et al., 2002). Bandas específicas de interesse que tenham diferido entre tratamentos, podem ser excisadas do gel, clonadas em vetor e sequenciadas para revelar informação do táxon, por exemplo (OVIEDO-RONDÓN, 2009). Embora essas abordagens analisem a comunidade total, incluindo populações minoritárias, elas geralmente não fornecem identificação de boa resolução das populações presentes no meio e também não analisam com exatidão populações pouco presentes (OVIEDO-RONDÓN, 2009). Até recentemente, todos dados de sequenciamento do 16S DNAr reportados eram obtidos através da tecnologia de sequenciamento Sanger. Devido a restrições de custo, a maioria dos estudo produziam poucas sequências, assim revelavam apenas uma pequena porção da diversidade total do meio estudado (WEI et al., 2013). As tecnologias de sequenciamento em larga escala “next generation sequencing” possibilitaram o sequenciamento de bilhões de bases em tempo reduzido e a custos viáveis , sendo que atualmente genomas múltiplos de bactérias podem ser sequenciados em questão de dias (KWON e RICKE, 2011); A introdução dessa tecnologia tem contribuído muito para a ampliação do conhecimento da diversidade bacteriana em diversos ecossistemas, inclusive da microbiota gastrintestinal de aves (WEI et al., 2013). Embora as técnicas de sequenciamento em larga escala sejam consideradas as melhores ferramentas para se avaliar a diversidade de comunidades bacterianas complexas atualmente, especialmente no que concerne a táxons raros, elas não são as ideais para a quantificação (KWON e RICKE, 2011). A melhor forma de se quantificar membros específicos da comunidade ao longo do tempo, espaço, ou diferentes condições ambientais (KWON e RICKE, 2011) consiste na técnica de PCR em tempo real (qPCR), a qual fornece valores absolutos, específicos, rápidos e altamente sensíveis do número de cópias do alvo desejado (YU et al., 2005; RITALAHTI et al., 2006). Além disso, atualmente existem nucleotídeos iniciadores universais para o gene 16S DNAr, validados biologicamente para amplificar o DNA de 14 grupos de bactérias, como Enterobacteriaceae, Enterococcus e Lactobacillus, entre outros (HEILIG et al., 2002; BARTOSCH et al., 2004; RINTTILÄ et al., 2004). 2.3.2. A composição da microbiota de frangos em situações normais e em algumas situações específicas O primeiro passo no estudo de um ecossistema consiste na identificação de seus membros, em seguida relaciona-se sua presença com sua atividade, e finalmente traça-se o papel que cada organismo desempenha no estabelecimento e na manutenção do equilíbrio naquele local (OVIEDO-RONDÓN, 2009). Atualmente, pesquisas relacionadas com a criação animal concentram seus esforços na identificação da microbiota intestinal normal e como ela é alterada em circunstâncias específicas. A microbiota do trato gastrintestinal das aves é extremamente complexa e dinâmica, contendo aproximadamente 1011 UFC/g de conteúdo intestinal, de um número desconhecido de espécies bacterianas (ITO et al., 2004). O desenvolvimento da microbiota inicia-se tão logo as aves eclodem. Entre 2 e 4 dias após a eclosão cepas de Enterobacteria e Streptococcus são predominantes no intestino delgado, perdendo esta condição para os Lactobacillus em seguida até a vida adulta. No ceco, microrganismos anaeróbios como Bacteroides, Bifidobacteria e Escherichia coli prevalescem (AMIT-ROMACH et al., 2004). Em animais adultos bactérias Gram- positivas predominam, sendo que 90% da microbiota é constituída de bactérias anaeróbias facultativas produtoras de ácido lático (Bifidobacterium spp.,Lactobacillus spp. e Streptococcus sp.), e os 10% restantes compostos por bactérias consideradas nocivas ao hospedeiro, como Blastomyces spp., Clostridium, Escherichia coli, Proteus spp, Pseudomonas spp., Staphylococcus spp., entre outros (LEE et al., 2002). A avaliação da microbiota associada à mucosa do intestino delgado de frangos por análise de sequencias do gene 16S DNAr revelou que o gênero Lactobacillus ocorre em superioridade, predominando as espécies de Lactobacillus aviarius e Lactobacillus salivarius (GONG et al., 2007). Dados recentes de nosso grupo de pesquisa demonstraram que a prevalência do grupo Enterococcus diminui em todo intestino delgado dos 7 aos 42 dias, enquanto a do grupo Lactobacillus aumenta (LUNEDO et al., 2014). No mesmo trabalho houve aumento do número de cópias de Enterobacteriaceae na mucosa do íleo entre 7 e 42 dias em animais alimentados com 15 milho, porém a contagem manteve-se em níveis mais baixos nas aves alimentadas com sorgo (LUNEDO et al., 2014). De acordo com Dibner e Richards (2005) muitos produtos são vendidos atualmente (APCs, ácidos orgânicos, probióticos, prebióticos, minerais, óleos essenciais, entre outros) com a finalidade de modular a microbiota para beneficiar a saúde e o desempenho dos animais, contudo a literatura carece de trabalhos de identificação e quantificação da microbiota nestas condições. Estudos moleculares recentes da avaliação microbiota intestinal de aves frente ao uso de aditivos na dieta são focados, em sua maioria, nas alterações induzidas pelos APCs. WISE e SIRAGUSA (2007) comparando animais alimentados com e sem APCs observaram que as populações de Lactobacillus e Enterobacteriaceae são as de maior ocorrência no íleo, seguidas por membros do grupo Enterococcus, sendo que o número de cópias de Lactobacillus e Enterobacteriaceae foi menor com a adição de APC. KIM et al. (2011), trabalhando com avilamicina e os prebióticos FOS e MOS, concluíram que o antibiótico foi mais efetivo na diminuição do número de cópias de Escherichia coli e Clostridium, mas proporcionou menor diversidade de cepas de Lactobacillus em comparação aos prebióticos. A partir destes resultados, é visível que estratégias nutricionais envolvendo aditivos possuem um grande potencial como modeladores da microbiota intestinal, e que mais estudos são necessários para que se possa otimizar sua utilização na nutrição animal. 2.4. Alterações na mucosa intestinal Aditivos alimentares como os óleos essenciais e os probióticos têm apresentado resultados favoráveis no epitélio intestinal, inclusive capacidade de promover a integridade da mucosa intestinal em situações de desafio, como a coccidiose (DALLOUL et al., 2003; OVIEDO-RONDON et al., 2006). Contudo, ainda não está estabelecido se tais achados envolve a modulação da microbiota intestinal ou os eventos que atuam na estimulação direta do crescimento dos vilos. A microbiota intestinal pode alterar diretamente o epitélio intestinal. Por exemplo, nutrientes produzidos pela microbiota intestinal, como ácidos graxos de cadeia curta e aminas biogênicas podem promover o desenvolvimento da mucosa intestinal da ave através da estimulação do processo mitótico que leva ao aumento dos vilos (MAIORKA et al., 2002; LOPES, 2008). Por outro lado, a amônia hidrolisada 16 por bactérias produtoras de urease a partir de ácido úrico no intestino demonstrou ser tóxica para as vilosidades intestinais, além de reduzir a síntese de DNA na mucosa gástrica (WARZECHA et al., 2000) e a proliferação celular (RABKIN et al., 1993). Aumento na altura das vilosidades promovem melhorias nas funções de digestão e absorção intestinal, devido a elevações na área de superfície absortiva e na expressão de enzimas e transportadores de membrana (PLUSKE et al., 1996). Por outro lado, criptas mais profundas indicam elevado “turnover” no epitélio intestinal e alta demanda para formação tecidual, sendo que tal elevação do “turnover” eleva o requerimento nutricional para a mantença (SAVAGE et al., 1997) e compromete parte da energia líquida de produção. Acredita-se que a atividade de enzimas de membrana esteja mais relacionada com a área superficial, do que ao aumento da eficiência de células individuais (GILBERT, 2008). A altura das vilosidades é determinada pelo equilíbrio entre dois eventos citológicos associados: renovação celular (proliferação e diferenciação das células localizadas na cripta e ao longo dos vilos) e perda celular (extrusão que ocorre normalmente no ápice dos vilos). Quando o intestino responde a algum agente que perturbe este “turnover”, ocorre uma modificação na altura dos vilos. Assim, se ocorrer um aumento na taxa de proliferação (mitose) com ausência, diminuição ou manutenção da taxa de extrusão, haverá aumento no número de células e, consequentemente, aumento na altura dos vilos. Caso o estímulo promova aumento na taxa de extrusão, havendo manutenção ou diminuição da taxa de proliferação, haverá redução na altura dos vilos (UNI et al., 1996). Além de sofrer influência das alterações inespecíficas, relacionadas com mudanças na área de mucosa intestinal, a fisiologia da digestão e absorção intestinal está sujeita a alterações específicas. As alterações específicas são particularmente importantes no processo absortivo. FERRARIS e DIAMOND (1989) propuseram a regulação específica da absorção de nutrientes como uma forma de igualar absorção aos requerimentos para o crescimento, sem que haja gasto de energia com outros transportadores. PÁCHA (2000) sugeriu várias explicações para alterações da atividade específica de transportadores com a idade. De acordo com os autores a redução no transporte pode ocorrer por diminuição na densidade de transportadores, alteração da isoforma predominante e alteração na taxa de “turnover”. Os mesmos autores concluíram que a queda de atividade com a idade está relacionada com o aumento de células imaturas e menos ativas ao longo dos vilos. 17 Ainda é desconhecido se a regulação de enzimas digestivas e transportadores de membrana ocorre pela indução de células imaturas, indiferenciadas, ou se células maduras são reprogramadas, mas aparentemente cada transportador pode ser regulado de forma particular (FERRARIS, 2001). Baseados nos achados de vários estudos, os autores propuseram um modelo para a regulação dos transportadores SGLT1 e GLUT5. Para SGLT1, a transcrição inicia-se nas células da cripta e durante a migração dos enterócitos ao longo do vilo ocorre a produção e migração da proteína para a membrana celular (FERRARIS, 2001). Enquanto isso, para GLUT5, evidências apontam que a célula madura pode ser reprogramada a transcrever RNAm e produzir a respectiva proteína (FERRARIS, 2001). Desta forma, a regulação por substrato para os dois transportadores leva tempos distintos, 4-8 horas para GLUT5 contra 12-24 horas para SGLT1 (FERRARIS, 2001). Além da regulação com a idade e em resposta ao substrato, a atividade de determinado transportador pode ser estimulada pela sua falta no organismo. Aumento na expressão e na atividade de transportadores de nutrientes por mg de tecido foi correlacionado a menor disponibilidade do substrato no lúmen intestinal (FERRARIS e CAREY, 2000). Os autores sugeriram que provavelmente o aumento do número de transportadores ocorreu pelo aumento na expressão gênica associado ao aumento de enterócitos maduros e mais ativos devido a mudanças na taxa de migração (FERRARIS e CAREY, 2000). Frente ao exposto, é evidente que os processos de digestão e absorção podem ser influenciados de muitas maneiras. Conforme discutido anteriormente, existem evidências de que os OEs e os probióticos podem afetar a mucosa intestinal e o aproveitamento de nutrientes. Uma alternativa para melhorar o entendimento de sua ação na fisiologia intestinal consiste no estudo da expressão de genes codificadores de enzimas e transportadores intestinais, bem como suas atividades enzimáticas. III. OBJETIVOS 3.1. Objetivo geral Avaliar o potencial de utilização do Bacillus subtilis (probiótico) e de uma mistura comercial de óleos essencias, isoladamente ou em conjunto, como 18 promotores de crescimento para frangos de corte e investigar a influência desses aditivos na mucosa e na microbiota intestinal. 3.2. Objetivos específicos Avaliar os efeitos da avilamicina e do uso isolado ou associado do Bacillus subtilis (probiótico) e uma mistura de óleos essências sobre: � O desempenho zootécnico [Consumo de ração (CR), ganho de peso (GP) e conversão alimentar (CA)] aos 7, 21 e 42 dias de vida; � A expressão de genes que codificam proteínas envolvidas na digestão e absorção de nutrientes (APN, SI, MGA, SLC15A1, SLC2A2, SLC5A1 e ATP1A1) no jejuno aos 7, 21 e 42 dias de vida; � A atividade de enzimas digestivas da fase de membrana (aminopeptidase e maltase) no jejuno aos 7, 21 e 42 dias de vida; � A absorção de glicose in vitro a partir de segmentos do jejuno coletados aos 7, 21 e 42 dias de vida; � A prevalência de grupos bacterianos específicos na mucosa do íleo (Enterobacteriaceae, Enterococcus e Lactobacillus) aos 7, 21 e 42 dias de vida; � A morfometria intestinal [atura de vilos (AV), profundidade de criptas (PC), relação vilo / cripta (AV/PC)] e contagem de células caliciformes (CCC) aos 7, 21 e 42 dias de vida. IV. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ADAMS, C. A. Nutricines: food components in health and nutrition. Nottingham University Press, 1999. AGUNOS, A.; LÉGER, D.; CARSON, C. Review of antimicrobial therapy of selected bacterial diseases in broiler chickens in Canada. The Canadian Veterinary Journal, v. 53, n. 12, p. 1289, 2012. ALLISON, C.; MACFARLANE, G. T. Influence of pH, nutrient availability, and growth rate on amine production by Bacteroides fragilis and Clostridium perfringens. Applied and environmental microbiology, v. 55, n. 11, p. 2894-2898, 1989. 19 AMANN, R. I.; LUDWIG, W.; SCHLEIFER, K.-H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiological reviews, v. 59, n. 1, p. 143-169, 1995. AMATO NETO, V. et al. Antibióticos na prática médica. In: (Ed.). Antibióticos na prática médica: Roca, 2000. AMIT-ROMACH, E.; SKLAN, D.; UNI, Z. Microflora ecology of the chicken intestine using 16S ribosomal DNA primers. 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No entanto, o assunto ainda carece de estudos, visto que os resultados descritos na literatura carecem de reprodutibilidade. O presente estudo investigou os efeitos da avilamicina ou da adição isolada ou combinada de Bacillus subtilis e de uma mistura de OEs (carvacrol, cinamaldeído, cineol e extrato de pimenta) no desempenho, bem como sobre aspectos celulares e moleculares no intestino ao longo do ciclo produtivo de frangos de corte criados em boas condições sanitárias. A expressão de genes e enzimas estudados e os dados do ensaio de absorção in vitro de glicose também foram avaliados em função do tempo. Para tanto, 1320 frangos foram distribuídos em cinco tratamentos, de acordo com a suplementação [dieta basal como controle (CON); Bacillus subtilis (BS); Bacillus-subtilis + óleos essenciais (BS + OEs); óleos essenciais (OEs); avilamicina como controle positivo (AVI)]. O desempenho foi avaliado no período de um a 42 dias, enquanto a quantidade de RNAm, as atividades enzimáticas e a absorção in vitro foram analisados aos 7, 21 e 42 dias. A quantidade de RNAm(s) de ANPEP, MGAM, SI, SLC15A1, SLC5A1, SLC2A2, ATP1A1 foi avaliada por RT- qPCR e as atividades de aminopeptidase-N (APN), maltase (MALT) e fosfatase alcalina intestinal (FAI) determinadas em termos específicos. O ensaio de absorção in vitro consistiu-se da análise da área abaixo da curva de concentração de glicose de amostras colhidas do interior do segmento em intervalos específicos a partir da injeção de uma solução de glicose 5 %. Os tratamentos não influenciaram o desempenho zootécnico das aves. BS promoveu maior expressão do gene SLC15A1, enquanto OEs e AVI aumentaram as atividades de FAI e APN. A análise ao longo do tempo revelou aumento na quantidade de RNAm de MGAM, SLC2A2, SLC15A1, SLC5A1 e SI de 7 para 42 dias. FAI sofreu redução após 7 dias, enquanto MALT aumentou com a idade. A adição de Bacillus subtilis ou óleos essenciais na ração induz alterações na expressão de genes e atividade de enzimas relacionados ao aproveitamento de açucares e peptídeos, porém não promove melhora no desempenho zootécnico. Durante o desenvolvimento, o intestino do frango sofre alterações específicas que podem ser levadas em conta para a formulação de dietas que melhor se adequem ao perfil de enzimas e transportadores de nutrientes expressados no intestino ao longo do tempo. Palavras-chave: aditivos alimentares, digestão, enzimas de membrana intestinal, fisiologia intestinal, nutrição, transporte intestinal de nutrientes 28 CHAPTER 2 − INTESTINAL PHYSIOLOGICAL CHANGES IN BROILERS FED Bacillus subtilis AND/OR ESSENTIAL OIL THROUGHOUT THE PRODUCTION CYCLE: MORPHOMETRY, GENE EXPRESSION AND ENZYME ACTIVITY ABSTRACT − Bacillus subtilis and essential oils (EOs) have been investigated as replacements for antibiotic growth promoters (AGPs) by improving the performance of chickens. Both feed additives have demonstrated favorable effects on nutrient digestibility, villus integrity, activity of digestive enzymes and absorption of nutrients. However, studies still required, since results described in the literature have scarce reproducibility. This research investigated the effects of avilamycin, or Bacillus subtilis DFM and an EO blend (carvacrol, cinnamaldehyde, cineol and pepper extract) alone or together on performance, as well as cellular and molecular changes in the small intestine over the time course