RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 04/10/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) Extrato da Cannabis sativa (Linnaeus, 1753): Estudo da ação acaricida em carrapatos Rhipicephalus linnaei (Audouin, 1826) e do potencial tóxico no fígado e nos rins de camundongos Mus musculus (modelos simulando hospedeiros) a ele expostos. MILENA DE LIMA RODRIGUES Rio Claro - SP 2024 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (BIOLOGIA CELULAR, MOLECULAR E MICROBIOLOGIA) Extrato da Cannabis sativa (Linnaeus, 1753): Estudo da ação acaricida em carrapatos Rhipicephalus linnaei (Audouin, 1826) e do potencial tóxico no fígado e nos rins de camundongos Mus musculus (modelos simulando hospedeiros) a ele expostos. MILENA DE LIMA RODRIGUES Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências do Campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia). Orientadora: Profa. Dra. Maria Izabel Souza Camargo Co-orientadora: Marina Rodrigues de Abreu Rio Claro - SP 2024 Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Dados fornecidos pelo autor(a). Rodrigues, Milena de Lima R696e Extrato da Cannabis sativa (Linnaeus, 1753): estudo da ação acaricida em carrapatos Rhipicephalus linnaei (Audouin, 1826) e do potencial tóxico no fígado e nos rins de camundongos Mus musculus (modelos simulando hospedeiros) a ele expostos / Milena de Lima Rodrigues. -- Rio Claro, 2024 71 p. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (UNESP), Instituto de Biociências, Rio Claro Orientadora: Maria Izabel Souza Camargo Coorientadora: Marina Rodrigues de Abreu 1. Histologia. 2. Carrapato marrom dos cães. 3. Cannabis sativa. 4. Glândulas salivares. 5. Tegumento. I. Título. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Rio Claro CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA DISSERTAÇÃO: Extrato da Cannabis sativa (Linnaeus, 1753): Estudo da ação acaricida em carrapatos Rhipicephalus linnaei (Audouin, 1826) e do potencial tóxico no fígado e nos rins de camundongos Mus musculus (modelos simulando hospedeiros) a ele expostos AUTORA: MILENA DE LIMA RODRIGUES ORIENTADORA: MARIA IZABEL SOUZA CAMARGO COORIENTADORA: MARINA RODRIGUES DE ABREU Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Mestra em Ciências Biológicas (Biologia Celular, Molecular e Microbiologia), área: Estrutura, Função e Produção de Biomoléculas pela Comissão Examinadora: Profa. Dra. MARIA IZABEL SOUZA CAMARGO (Participaçao Presencial) Departamento de Biologia Geral e Aplicada / Unesp - IB Rio Claro Profa. Dra. RUSLEYD MARIA MAGALHÃES DE ABREU (Participaçao Virtual) Centro de Ciências Biológicas e da Natureza / Universidade Federal do Acre Profa. Dra. ANDREA APARECIDA DE ARO (Participaçao Presencial) Departamento de Biologia Geral e Aplicada / Unesp - IB Rio Claro Rio Claro, 04 de outubro de 2024 Instituto de Biociências - Câmpus de Rio Claro - Avenida 24 A, 1515, 13506900 https://ib.rc.unesp.br/#!/pos-graduacao/secao-tecnica-de-pos/programas2546/ciencias-biologicas-biologia-celular-molecular-e-microbiologia/CNPJ: 48.031.918/0018-72. Dedico esse trabalho a todos os pesquisadores que foram pioneiros na Ciência Canábica. AGRADECIMENTOS À minha mãe, Margarida, pelo exemplo de mulher, por ser um porto seguro nos momentos mais desafiadores, por me ensinar a ter perseverança e fé, por me mostrar o respeito aos animais, à natureza e ao ser humano. Por lecionar a linguagem do amor, te amo, mãe, para sempre. Ao meu pai, Edenir, in memoriam, pelos momentos de companheirismo, de aventuras, por me ensinar o valor do trabalho e me incentivar sempre nos estudos. Às minhas avós, Etelvina e Marciana, por sempre estarem ao meu lado, por me ajudarem a compreender o mundo, por me apresentarem às plantas medicinais, por serem exemplos de amor ancestral. Ao meu companheiro de vida Dennis Anderson, pelo amor, dedicação e compreensão nos momentos de ausência. Por tantas vezes me ajudar, me incentivar e torcer por mim, te amo. Aos meus amigos do Madrigal Cor da Voz, de todas as horas e de muitas músicas, gratidão por me impulsionarem nesse projeto. Em especial à Lilian Marroni, Vera Lia Nalin e Vera Lígia Nalin, pela amizade e carinho. À minha orientadora Maria Izabel Souza Camargo, por acreditar nas pesquisas com a canabis, por ser uma profissional visionária e criativa, por toda dedicação e ensinamentos. À minha co-orientadora Marina Rodrigues de Abreu, por todo incentivo, paciência, disponibilidade e profissionalismo, agradeço cada conversa e cada café pois foram fundamentais para esse resultado. Aos membros do Brazilian Central of Studies in Ticks Morphology (BCSTM), em especial à Bruna Nascimento e Yousmel Alemán, que sempre me apoiaram, gratidão pela amizade. Agradeço ainda, a Odaiza Silva e ao Davy Sapatini, pela parceria, pelos cafés no departamento e infinitos momentos de ajuda para o desenvolvimento desse projeto. Obrigada, queridos. À Associação Canábica Maria Flor – Fernanda Peixoto e Pedro Mazzalli, agradeço pela parceria e colaboração. Ao Gerson de Mello Souza, técnico no Laboratório de Histologia do Departamento de Biologia Geral e Aplicada, pelas conversas e por toda ajuda nesses anos. A Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus de Rio Claro, ao Instituto de Biociências e aos professores da Pós-Graduação. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. “Seschat, a “Senhora da Casa dos Livros”, antiga deusa egípcia da escrita e do conhecimento, era usualmente representada como uma escriba com um braço estendido no ato de escrever. Sobre a cabeça, uma folha que se parece muito com uma folha de maconha.” (Ribeiro, 2023, p. 53). RESUMO Os carrapatos, são além de parasitas, transmissores de doenças, e são tradicionalmente controlados por químicos sintéticos que causam problemas ambientais e de resistência. Bioativos de plantas, como os da Cannabis sativa, emergem como alternativas promissoras. Neste estudo avaliou-se o efeito carrapaticida de extratos de C. sativa, em diferentes concentrações (2,5 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL) tanto sobre o carrapato Rhipicephalus linnaei, como em camundongos simulando hospedeiros (2,5 mg/mL, 7,0 mg/mL, 10 mg/mL, 14,5 mg/mL e 20 mg/mL) para trazer à luz informações sobre sua ação no tecido hepático e renal dos mesmos. Os dados mostraram que a CL50 e a CL90 do extrato alteraram severamente o integumento e as glândulas salivares dos carrapatos, órgãos fundamentais para sua sobrevivência, causando danos no epitélio cuticular, estratificando-o ou mesmo degenerando-o, trazendo prejuízos à barreira física/química entre o meio interno do ectoparasita e o ambiente. Nas glândulas salivares os danos alteraram os ácinos secretores, que perderam a morfologia original das células transformando essas estruturas em massas contendo apenas restos celulares, assemelhando-se a um processo de degeneração precoce. No tecido hepático dos camundongos ocorreram alterações como desorganização tecidual, perda de limites celulares, picnose nuclear, e nos rins desses animais houve aumento/diminuição do lumen dos túbulos contorcidos, hipertrofia das células dos túbulos, surgimento de espaços no parênquima renal, entre outras. Os danos morfohistológicos foram mais extensos nas exposições às concentrações mais altas (20 mg/mL e 40 mg/mL), porém em determinados intervalos de concentrações, pode-se perceber que aquelas menores foram mais agressivas (2,5 mg/mL). De forma geral, o desenvolvimento do presente trabalho revelou resultados inéditos, e trouxe à luz informações importantes sobre como o extrato de inflorescências da C. sativa atua como potencial carrapaticida sobre o carrapato do cão, alterando dois importantes órgãos que quando modificados trazem prejuízos ao ectoparasita, a saber, o integumento e as glândulas salivares. Já nos organismos não alvos (hospedeiros) os prejuízos da exposição ao extrato são hepáticos e renais, o que assim como nos ectoparasitas, também compromete a fisiologia dos mesmos. Palavras chave: Rhipicephalus linnaei; Cannabis sativa; integumento; glândulas salivares; Mus musculus ABSTRACT Ticks are parasites and transmitters of diseases, traditionally controlled by synthetic chemicals and practices that have directly caused negative outcomes, environmental problems, and resistance. Plant bioactives, such as those from Cannabis sativa, are emerging as promising alternatives. This study evaluated the acaricidal effects of C. sativa extracts at different concentrations (2,5 mg/mL, 5 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 40 mg/mL) on both the tick Rhipicephalus linnaei and mice, simulating hosts (2,5 mg/mL, 7,0 mg/mL, 10 mg/mL, 14,5 mg/mL e 20 mg/mL) to shed light on the extract's effects on their liver and kidney tissues. The data showed that the LC50 and LC90 of the extract severely and fundamentally altered the integument and salivary glands of the ticks, which are essential organs for their survival. The damage to the cuticular epithelium led to stratification or degeneration, compromising the physical/chemical barrier between the ectoparasite's internal environment and the surroundings. In the salivary glands, damage altered the secretory acini, causing the loss of their original cell morphology. These changes radically transformed the aesthetics of the structures into masses containing only cellular debris, resembling a process of early degeneration. In the liver tissue of the mice, alterations included tissue disorganization, loss of cellular boundaries, nuclear pyknosis, and in their kidneys, changes such as enlargement/reduction of the lumen of the convoluted tubules, hypertrophy of tubular cells, and the appearance of spaces in the renal parenchyma occurred. Morphohistological damage was more extensive at higher concentrations (20 mg/mL e 40 mg/mL), though lower doses (2,5 mg/mL) were more aggressive at certain concentration intervals. Overall, this study revealed unprecedented results and crucial information on how the extract from C. sativa inflorescences acts as a potential acaricide against dog ticks by altering two critical organs, the integument and salivary glands, which are vital for the ectoparasite's survival. In non-target organisms (hosts), the adverse effects of exposure to the extract are hepatic and renal, compromising the host's physiology similar to how it strongly affects the ectoparasites. Keywords: Rhipicephalus linnaei; Cannabis sativa; salivary glands, integument SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................... 9 1.1 A problemática das Infestações por Carrapatos .................................................... 9 1.2 Riphicephalus linnaei (Audouin, 1826) - O Carrapato do Cão ............................. 9 1.3 Métodos de Controle Químico (Sintético e Natural) dos Carrapatos .................... 10 1.4 A Cannabis sativa (Linnaeus, 1753) ..................................................................... 11 1.5 Os Canabinóides e seus Receptores ....................................................................... 13 1.6 Os Endocanabinóides e o Sistema Endocanabinóide (SEC) ................................. 15 1.7 A Legislação Canábica no Brasil ........................................................................... 16 1.8 O Uso de Produtos à base de Cannabis na Medicina Veterinária ......................... 17 1.9 O Fígado e o Metabolismo Hepático ..................................................................... 18 1.10 O Rim e sua Importância para o Organismo ......................................................... 18 2 OBJETIVOS ........................................................................................................ 20 2.1 Objetivo geral ........................................................................................................ 20 2.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 20 3 MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................... 21 3.1 Obtenção do extrato da Cannabis sativa ............................................................... 21 3.2 Composição química do extrato bruto da inflorescência da Cannabis sativa ....... 21 3.3 Preparação da diluição do extrato da C. sativa ...................................................... 21 3.4 Fêmeas semi-ingurgitadas de Rhipicephalus linnaei ............................................. 22 3.5 Teste de Imersão para Adultos – TIA .................................................................... 22 3.6 Análise morfológica .............................................................................................. 23 3.6.1 Histologia – coloração pela hematoxilina e eosina aquosa (HE) (Junqueira, Junqueira, 1983) .... 23 3.7 Análise estatística – cálculo da CL50 e CL90 .......................................................... 23 3.8 Aspersão do extrato de C. sativa nas fêmeas de camundongos Mus musculus ..... 24 3.9 Análise morfológica do fígado e dos rins dos camundongos ................................ 25 3.10 Análise histoquímica do fígado e dos rins dos camundongos ............................... 26 3.11 Contagem das células de Kupffer .......................................................................... 27 3.12 Fotodocumentação e confecção dos esquemas ...................................................... 27 4 RESULTADOS .................................................................................................... 28 CAPÍTULO 1 ........................................................................................................ 29 CAPÍTULO 2 ........................................................................................................ 36 5 DISCUSSÃO ....................................................................................................... 60 6 CONCLUSÕES .................................................................................................... 65 REFERÊNCIAS ................................................................................................... 66 9 1 INTRODUÇÃO GERAL 1.1 A problemática das Infestações por Carrapatos. Os carrapatos são ectoparasitas hematófagos que causam danos à pele dos seus hospedeiros em virtude de suas picadas. Simultaneamente os mesmos são importantes agentes transmissores de patógenos que são responsáveis por diversas doenças (Saleh et al., 2021). A infestação nos hospedeiros, preferenciais ou não, por esses ectoparasitas pode causar danos físicos significativos, principalmente e hoje em dia para os animais de estimação, não ficando aqui excluídos aqueles silvestres, gado, bem como os próprios humanos. No caso do gado, ou animais de produção, essas infestações podem levar a perdas econômicas consideráveis, impactando diretamente não só na saúde animal, mas também na economia da pecuária (Camargo-Mathias, 2018), com dados estimados da defasagem nesse setor de mais de 80%, levando-se em conta a pecuária mundial (Shanmuganath et al., 2021). Nas últimas décadas, as populações de carrapatos têm aumentado significativamente, com a expansão de sua distribuição geográfica. Essa rápida expansão deve-se também a fatores antropogênicos, como as alterações climáticas, fragmentação dos habitats naturais e maior disponibilidade de hospedeiros (Saleh et al., 2021). 1. 2. Riphicephalus linnaei (Audouin, 1826) - O Carrapato do Cão A estreita ligação entre cães e humanos, juntamente com o risco zoonótico representado pelos carrapatos, tem aumentado o interesse em pesquisas sobre estes em animais de companhia. Os cães são frequentemente infestados por esses ectoparasitas e infectados por patógenos por eles transmitidos no momento da ingurgitação. Dessa forma, os cães são considerados sentinelas para monitoração das populações de carrapatos que eles carregam, visto que a alta prevalência está relacionada a uma elevada taxa de doenças (Yan, Peng & Goni, 2024). A população global de cães domésticos está estimada em aproximadamente 700 milhões, dos quais 75% são classificados como cães de “vida livre ou vadios”. Estes causam problemas significativos à saúde pública, pois vivem próximos às populações humanas, interagindo em espaços comuns diretamente com os cães de estimação que vivem com seus tutores, podendo transmitir-lhes doenças (Otranto; Dantas-Torres & Breitschwerdt, 2009; Yan, Peng & Goni, 2024). A família Ixodidae engloba os carrapatos trioxenos, que ao realizarem seu repasto sanguíneo no hospedeiro, abrem portas para que os mesmos sejam infectados por ocasião de sua alimentação 10 em animal contaminado (Sonenshine; Roe, 2013; Kahl, 2018; Boulanger et al., 2019; Saleh et al., 2021). As fêmeas dos carrapatos ixodídeos, conhecidos pelo nome popular de “carrapatos duros”, possuem um único ciclo gonotrófico, durante o qual ovipõem de uma só vez (antes de morrerem) até milhares de ovos (Saleh et al., 2021). Um exemplo de carrapato trioxeno é o Rhipicephalus linnaei (Audouin, 1826), popularmente conhecido como carrapato-vermelho-do-cão, espécie que está distribuída nas Américas, África, Europa, Ásia e Austrália, detentora de enorme importância médico veterinária pela capacidade de transmitir doenças devastadoras incluindo a erliquiose canina, causada pela Erlichia canis, dentre outras piroplasmoses (Slapeta et al., 2022). Essa espécie de ectoparasita é uma das mais comuns encontrada em cães (Slapeta, Chandra, & Halliday, 2021). Em recente levantamento foram registrados mais de outros 30 tipos diferentes de carrapatos ixodídeos infestando humanos nos EUA, contribuindo com o crescimento do problema de transmissão zoonótica nesse país e também ao redor do mundo em lugares onde esses ectoparasitas são encontrados (Eisen, 2022). A maioria dos agentes patogênicos é transmitida aos cães pela saliva do carrapato durante sua alimentação, à exceção do Hepatozoon canis, uma vez que nesse caso o animal deve ingerir o carrapato para se contaminar. Rhipicephalus linnaei é a espécie responsável por contaminar cães com uma variedade de patógenos, como Babesia vogeli, E. canis, Rikettsia rickettsii dentre outros (Saleh et al., 2021). 1.3. Métodos de Controle Químico (Sintético e Natural) dos Carrapatos A profilaxia antiparasitária segura e eficaz em cães é de grande importância e interesse tanto dos veterinários quanto dos tutores de animais de companhia, pois busca-se a prevenção de doenças transmitidas por carrapatos e a manutenção da saúde e bem-estar desses “pets” (Riepl, 2024). Dotados de sabedoria ancestral, os povos antigos costumavam utilizar plantas medicinais para repelir artrópodes hematófagos, incluindo carrapatos e pragas domésticas. No entanto, há um século, os produtos sintéticos passaram a se sobressair e a dominar o mercado veterinário, consequência de sua maior eficácia, duração e ação, além de prazo de validade mais estável, comparados àqueles formulados com bases naturais (extratos, óleos e outros, obtidos a partir de bioativos de plantas) (McPartland & Sheikh, 2018). Ainda que os acaricidas sintéticos desempenhem papel crucial no manejo dos carrapatos, há uma preocupação com relação ao uso inadequado, excessivo e indiscriminado dessas bases químicas. Esse fato tem contribuído para a poluição ambiental, afetando negativamente o solo, a 11 água e a fauna, além dessa prática promover o surgimento de populações de carrapatos resistentes a múltiplos acaricidas, dificultando o controle desses parasitas (Camargo-Mathias et al., 2018; Shanmuganath et al., 2021). Especialmente na última década, têm sido desenvolvidas pesquisas que buscam formulações naturais para o combate de infestações de carrapatos, levando em conta a resistência desses ectoparasitas a múltiplos acaricidas sintéticos nas regiões tropicais e subtropicais do mundo, locais de alta incidência desses vetores (Shanmuganath et al., 2021). Sob essa perspectiva, vários estudos vêm sendo propostos cujos resultados vem demonstrando o potencial de muitas plantas no controle de carrapatos. Podem aqui ser citados os trabalhos de Pereira et al. (2023) que comprovaram em laboratório o potencial acaricida dos óleos essenciais de Egletes viscosa Less (macela) e Lippia schaueriana (lipia-da-serra) Mart. sobre fêmeas ingurgitadas de R. linnaei. Além disso, o óleo de neem (Azadirachta indica) (Lima-de-Souza et al., 2017), o extrato etanólico de Acmella oleracea (jambú) (L.) (Anholeto et al., 2017; Oliveira et al., 2016) e o carvacrol (Lima-de-Souza et al., 2022) demonstraram eficácia acaricida em testes com diferentes espécies de carrapatos. Em outros estudos Figueiredo et al., (2022) utilizaram nanoformulações que combinaram compostos sintéticos com naturais, resultando numa solução promissora de controle de populações de R. microplus (carrapato do boi). Em vista disso, os efeitos sinérgicos de agentes repelentes, como o butóxido de piperonila e o citronelal, potencializaram a eficácia das formulações antiparasitárias (Figueiredo et al., 2022). Assim, com esses estudos que fizeram uso de bioativos extraídos de plantas, tem início uma nova era na pesquisa que busca novas estratégias para o controle desses importantes ectoparasitas, que além de eficientes no controle dos mesmos, sejam menos agressivos ao meio ambiente, bem como aos organismos não alvos, incluindo-se aqui os hospedeiros. 1.4. A Cannabis sativa (Linnaeus, 1753) A Cannabis sativa (Fig. 1) é uma planta dióica pertencente à família Cannabaceae de grande valor por suas propriedades medicinais, sendo por si só considerada uma biofarmácia (LaVigne, et al., 2021). Análises arqueológicas encontraram braseiros de madeira em um cemitério na região da China ocidental que indicaram que a Cannabis era utilizada em rituais e/ou atividades religiosas há pelo menos 2.500 anos, e consumida via ingestão oral ou inalada por meio da fumaça, ou de vapores resultantes da sua queima/desidratação (Ren et al., 2019). Todavia, artefatos culturais 12 fossilizados com restos de Cannabis remontam de pelo menos 10.000 anos na Eurásia (Small, 2016). Há evidências de que os chineses também utilizavam frutos da Cannabis como alimento durante a dinastia Han (206 AC- 220 DC), sendo que até hoje suas sementes são a base para fabricação de óleo de cozinha no Nepal (Zuardi, 2006). A B Figura 1. Em A esquema mostrando a planta da Cannabis, (Araujo, 2023). Em B foto mostrando a inflorescência da C. sativa, (Seastock, 2022). No início do século XX no Ocidente, o uso medicinal da Cannabis regrediu, devido à dificuldade de obtenção de resultados consistentes a partir de material vegetal com potencial variado, no entanto, a partir de 1965 com a identificação da estrutura química dos componentes da Cannabis e a possibilidade de se obter seus constituintes puros, houve um aumento do interesse em pesquisas científicas relacionadas a essa espécie (Zuardi, 2006). Da família Cannabaceae, plantas da espécie C. sativa possuem “inflorescências", que se refere a um agrupamento ou cacho de flores em um ramo terminal e/ou a todo o sistema ramificado que contém flores (Small, 2016; Chandra, Lata & ElSohly, 2017). A C. sativa contém uma classe incomum de metabólitos secundários terpenofenólicos, que comprovadamente em estudos com modelos animais e humanos, demonstrou possuir propriedades analgésicas, antimicrobianas, anti-inflamatórias e terapêuticas (Mechoulam e Gaoni, 1967; Liktor- Busa, et. al., 2021; LaVigne, et al., 2021). Já foram catalogados 538 compostos e mais de 150 13 terpenos identificados em diferentes quimiovares de Cannabis (Liktor-Busa, et. al., 2021), presentes na resina secretada pelos tricomas glandulares das plantas femininas (em menor escala nas folhas masculinas), na maioria das partes aéreas das plantas, produzindo em pequenas quantidades, moléculas psicoativas. Ressalte-se ainda, que as sementes, raízes e pólen também podem produzir tais moléculas (Andre et al., 2016; Hanus et al., 2016). Os terpenos encontrados nos óleos essenciais da C. sativa, bem como no de muitas outras plantas, representam o maior grupo de fitoquímicos existentes na espécie, responsáveis pelo sabor e aroma dos derivados da planta, e detectados mesmo em baixas concentrações, sendo os mais comuns o alfa-pineno e o limoneno (LaVigne, et al., 2021; Small, 2016). Além desses o beta- mirceno, alfa-pineno, limoneno, linalol, beta-cariofileno e alfa-humuleno, tem um papel importante na caracterização das propriedades farmacológicas da Cannabis, incluindo efeitos anti- inflamatórios e antinociceptivos. Vale ressaltar que a diversidade nos perfis de terpenos tem também como base as variações genéticas dos materiais vegetais, influências ambientais variadas e diferentes métodos de cultivo e manejo dos espécimes (Liktor-Busa, et. al., 2021). 1.5 Os Canabinóides e seus Receptores O receptor CB1 foi identificado como estando acoplado à proteína G (GPCR) (Nidadavolu, et al., 2021; McPartland, Guy & Di Marzo, 2014), e que se expressa proeminentemente no Sistema Nervoso Central (substância cinzenta, globo pálido, hipocampo, córtex cerebral, putâmen, cerebelo, núcleo caudado e amídala), bem como no tecido adiposo, no fígado (células sinusoidais- LSECs), células estreladas hepáticas e hepatócitos), no Sistema Nervoso Periférico e músculo esquelético (Di Marzo, Bifulco & Petrocellis, 2004; McPartland, Guy & Di Marzo, 2014; Chen & Kim, 2024). O grande número de receptores CB1 e a abundância de endocanabinóides nos gânglios da base e no cerebelo fazem com que este sistema de sinalização seja ideal para modulação do movimento e da postura de humanos (Di Marzo, Bifulco & Petrocellis, 2004). Estudos desenvolvidos com ratos isolaram o CB1 inicialmente do cDNA do córtex cerebral (Martinez Naya et al, 2024) e, além dessa região, verificou-se que o mesmo seria expresso também nas membranas cerebrais e no cerebelo. O mRNA de CB1 foi detectado em úteros de camundongos prenhes ou ovariectomizados, no baço, no ducto deferente de ratos e de camundongos e, na bexiga urinária de camundongos. Os CB1 estão também envolvidos na regulação da percepção da dor, das funções cardiovasculares, gastrointestinal, respiratória, na liberação de hormônios através das 14 ações neuromodulatórias dos endocanabinóides nos sistemas nervoso sensorial e autônomo (Di Marzo, Bifulco & Petrocellis, 2004). Antagonicamente ao CB1, o CB2 é escassamente expresso no SN, mas está presente nas células do sistema imunológico (Nidadavolu et al., 2021), nas hematopoiéticas, (Martinez Naya et al, 2024), nas de Kupffer e nas estreladas hepáticas (Fig. 2); ademais, agonistas CB2 são capazes de induzir a diferenciação de células de Kupffer em fenótipos anti-inflamatórios M2, responsáveis pela reparação tecidual hepática. Atualmente os fenótipos anti-inflamatórios estão diretamente relacionados à importância fisiológica dos receptores CB2 na inflamação e dor crônica (Di Marzo, Bifulco & Petrocellis, 2004; Chen & Kim, 2024). Especificamente no fígado, o CB1 é um mediador chave da resistência à insulina e da lipogênese hepática. O canabidiol, quando presente, atua como um modulador alostérico negativo do CB1, demonstrando seu efeito terapêutico nas doenças hepáticas. Da mesma forma, a ativação do CB2 no fígado pode melhorar a fibrose e promover a regeneração hepática (Chen & Kim, 2024) Os canabinóides quando presentes no sistema dos organismos, são rapidamente distribuídos por todo o corpo, atingindo órgãos com muita vascularização como é o caso dos pulmões, coração, cérebro e fígado. Nessa caracterização deve-se também levar em conta o tamanho e a composição corporal do indivíduo, assim como suas condições de saúde, fatores que podem alterar a permeabilidade das barreiras entre o sangue e os tecidos. O tetrahidrocanabinol (THC), um dos principais canabinóides, é metabolizado no fígado pela família das isoenzimas do citocromo P-450 (CYP 450) que desempenham papel crucial nesse processo (Lucas, Galettis, & Schneider, 2018; Naya et al, 2024) e o canabidiol (CBD), altamente lipofílico, tem baixa biodisponibilidade e é metabolizado também no fígado principalmente pela família das isoenzimas CYP, levando à subsequente excreção fecal e, em menor grau, urinária de seus metabólitos (Bryine et al., 2021; Martinez Naya et al, 2024). Acredita-se que o canabidiol atue em receptores para canabinóides que são únicos e seletivos no cérebro, responsáveis pelos efeitos no SNC, como o aumento da produção de noradrenalina, dopamina e serotonina (Bryine et al., 2021). Os canabinóides, devido à sua natureza química lipofílica, apresentam baixa solubilidade em água e são suscetíveis ao metabolismo de primeira passagem (efeito sistêmico em que a droga antes de ir para a circulação, sofre ações metabólicas pelas células do epitélio intestinal e do fígado), resultando em baixa biodisponibilidade para compostos como CBD e THC (Christensen et al., 2023), que atuam não somente através de mecanismos canabinóides, mas também dos não canabinóides. O CBD é um dos canabinóides com relevante potencial terapêutico dentre os numerosos compostos psicoativos, pois tem expresso propriedades antioxidantes, neuro protetoras, 15 cardioprotetoras, ansiolíticas e anti-inflamatórias como já demonstrado em estudos pré-clínicos (LaVigne, et al., 2021; Chen & Kim, 2024). Figura 2. Localização dos receptores CB1 e CB2 no organismo de mamíferos: CB1 é significativamente expresso no SNC e pouco no fígado (células sinusoidais (LSECs), células estreladas hepáticas e hepatócitos); está presente no útero e no SNP entre outros órgãos. O CB2 é amplamente expresso no Sistema Imunológico, nas células de Kupffer e nas células estreladas hepáticas (Di Marzo, Bifulco & Petrocellis, 2004; McPartland, Guy & Di Marzo, 2014; Chen & Kim, 2024). Por serem altamente hidrofóbicos, a absorção transcutânea dos canabinóides fica dificultada pela epiderme e limitada pela taxa do processo de difusão, salientando-se ainda que a entrega de THC aos receptores do cérebro é lenta pela via tópica (Huestis, 2007). 1.6 Os Endocanabinóides e o Sistema Endocanabinóide (SEC) O sistema endocanabinóide (SEC) é filogeneticamente antigo – se manifesta em mamíferos, aves, anfíbios, peixes, ouriços-do-mar, sanguessugas e mexilhões, e desempenha papel neuromodulador em mamíferos (McPartland et al., 2004). O SEC está distribuído em todo o corpo, e auxilia na manutenção da homeostase, e de diversas funções fisiológicas, sendo caracterizado como um sistema de sinalização que compreende receptores canabinoides, ligantes endógenos e 16 enzimas para biossíntese e inativação de ligantes próprios, estando cada vez mais relacionado a um grande número de condições patológicas como por exemplo transtornos psiquiátricos, acidente vascular cerebral (AVC), condições neurodegenerativas como as doenças de Parkinson e Alzheimer, câncer, distúrbios reprodutivos, cardiovasculares e gastrointestinais e na esclerose múltipla (EM) (Di Marzo, Bifulco & Petrocellis, 2004; Christensen et al., 2023). O termo endocanabinóide foi adotado na década de 1990 quando surgiram os primeiros relatos científicos dos receptores de membrana para o THC e seus ligantes endógenos (Di Marzo, Bifulco & Petrocellis, 2004). O SEC é constituído pelos receptores canabinóides CB1 e CB2, por moléculas sinalizadoras de endocanabinóides, anandamida (AEA) e 2-araquidonoilglicerol (2-AG) e por enzimas empregadas no metabolismo e disponibilidade de endocanabinóides. Essas moléculas são derivadas de ácidos graxos e são capazes de modular ou regular uma variedade de processos fisiológicos, incluindo: apetite, sensação de dor, humor, memória, inflamação, controle dos níveis de insulina e metabolismo de gordura e energia (Andre et al., 2016; Small, 2016; Christensen et al., 2023). Também é sugerido que os endocanabinóides atuem como mediadores locais de forma autócrina e parácrina. Evidencias ainda apontam para o seu envolvimento no controle do metabolismo, diferenciação, proliferação e morte celular (Di Marzo, Bifulco & Petrocellis, 2004). 1.7 A Legislação Canábica no Brasil No Brasil, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) por meio da Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) N° 327/2019, definiu as condições para a concessão da autorização sanitária para fabricação e importação, bem como estabeleceu requisitos para a comercialização, prescrição, a dispensação, o monitoramento e a fiscalização de produtos à base de Cannabis para fins medicinais em humanos (ANVISA, 2019). Em 2021, essa mesma agência redefiniu os critérios para importação por pessoa física, sendo permitida mediante prescrição de profissional habilitado (ANVISA, 2021). Ambas as resoluções não regulamentavam o uso da planta no tratamento de enfermidades em animais. No entanto, no início de junho de 2021, foi aprovado no Brasil pela Câmara dos Deputados, o Projeto de Lei 399/2015 que fez alterações no artigo 2° da Lei 11.343 de 23 de agosto de 2006 (Lei Antidrogas), com o objetivo de viabilizar a comercialização de medicamentos que contenham extratos, substratos ou partes da planta C. sativa em sua formulação, assim como o cultivo da mesma em solo brasileiro, visando favorecer o uso da Cannabis para fins medicinais, veterinários, científicos e industriais, bem como implementou a rastreabilidade e 17 fiscalização da produção a partir da certificação das sementes, e do monitoramento do local de plantio (Congresso Nacional, 2015). O texto ainda contemplou o uso industrial da planta com a comercialização de produtos como fibra, celulose, resina, cosméticos, suplementos e gêneros alimentícios, vistos como seguros aos consumidores, uma vez que o cânhamo tem baixa concentração de THC, responsável pelo efeito alucinógeno (Congresso Nacional, 2015). Em 31 de janeiro de 2023 foi sancionada pelo governo do Estado de São Paulo a Lei nº 17.618, que instituiu a política estadual de fornecimento gratuito de medicamentos formulados a base de Cannabis (canabidiol e tetrahidrocanabidiol), em caráter de excepcionalidade pelo Poder Executivo nas Unidades de Saúde Pública estadual e privada conveniadas ao Sistema Único de Saúde – SUS (ALESP, 2023). A Resolução SS 107 foi aprovada em maio de 2024, objetivando regular o protocolo clínico estadual e as diretrizes terapêuticas para o tratamento de epilepsias farmacoresistentes, Síndrome de Dravet, Síndrome de Lennox-Gastaut e Complexo de Esclerose Tuberosa, fazendo uso do canabidiol (SES-SP, 2024). 1.8 O Uso de Produtos à Base de Cannabis na Medicina Veterinária As pesquisas atuais tem se voltado em avaliar os extratos vegetais da C. sativa para que seu uso possa ser aplicado a uma infinidade de situações tanto na medicina humana quanto na veterinária, enfatizando patologias como: osteoartrite crônica, epilepsia, dor neuropática e náusea/êmese por exemplo, uma vez que existem diferenças substanciais entre formulações de extratos da planta que obtiveram licença, daqueles sem licença (Chicoine et al., 2020). Os estudos de Alvarenga et al. (2023), tem mostrado que o canabidiol por ser um fitocanabinóide não psicotrópico, está sendo cada vez mais utilizado como uma alternativa farmacológica na medicina veterinária para tratar distúrbios de saúde em cães e gatos, devido a boa biodisponibilidade e segurança, e trazendo poucos efeitos colaterais. Estudos indicaram que seu uso melhoraria os sinais clínicos associados à osteoartrite, prurido e epilepsia idiopática, além de controlar o comportamento agressivo em cães (Lima et al., 2022). O uso da Cannabis para fins veterinários nos EUA foi permitido até 1937, tendo sido revogado após a aprovação da Lei do Imposto Sobre a Maconha — que cobrava taxas e imputava penalidades severas para veterinários, médicos e dentistas que descumprissem a legislação (Brutlag & Hommerding, 2018). O uso veterinário em escala mundial tem atendido enfermidades em pequenos animais, levando-se em conta sempre a necessidade de autorização dos órgãos 18 reguladores. Alemanha, França e Holanda já possuem registros de produtos homeopáticos ou de suplementos alimentícios que os veterinários podem receitar para seus pacientes animais (Bryine et al., 2021). E ainda ficou demonstrado que a C. sativa pode ser usada no controle de carrapatos da espécie R. microplus, visto que bovinos infestados com larvas, e expostos ao extrato da planta, tiveram redução significativa do número desses ectoparasitas após 96 horas da exposição (Nasreen et al., 2020). 1.9 O Fígado e o Metabolismo Hepático Classificado como a maior glândula do corpo dos mamíferos, o fígado possui a capacidade de secreção, excreção, estoque, desintoxicação, metabolização de substâncias endógenas e exógenas, esterificação, fagocitose, além de auxiliar na manutenção da homeostase de todo o organismo (Samuelson, 2007; Chen & Kim, 2024). Sua unidade funcional é o hepatócito, célula que desempenha a maioria das funções hepáticas e que constitui o parênquima do órgão. No fígado também são encontrados as células endoteliais, linfócitos, células de Kupffer (macrófagos do fígado) e as células estreladas. Externamente essa é uma glândula que está revestida por uma cápsula de tecido conjuntivo que também a divide em lobos, os quais por sua vez se subdividem em lóbulos hepáticos (Taub 2004; Samuelson, 2007). Dentre as funções do fígado estão a de metabolismo dos carboidratos, armazenamento de grandes quantidades de glicogênio, processamento e conversão de galactose e frutose em glicose e a gliconeogênese, imprescindível na manutenção da concentração normal de glicose sérica. Além disso, é no fígado que se dá o metabolismo lipídico, com a oxidação dos ácidos graxos, a síntese de colesterol, fosfolipídios e lipoproteínas, além de também realizar a síntese de lipídeos a partir de proteínas e carboidratos (Guyton e Hall, 2006). Enzimas do citocromo P-450 são altamente expressas no fígado e intestino e são importantes na metabolização de hormônios esteroides, colesterol e vitamina D. 1.10 O Rim e sua Importância para o Organismo O rim é um órgão imprescindível na manutenção da homeostase dos mamíferos e tem um conjunto de funções reguladoras no sistema urinário. Esse órgão excretor é revestido externamente por tecido conjuntivo, e internamente se subdivide em 2 regiões: a cortical (periférica) que abriga 19 os corpúsculos de Malpighi, bem como os túbulos contorcidos distais e proximais (formando os nefrons) e a medular (mais central ao órgão), que abriga as alças de Henle (Junqueira & Carneiro, 2023). Através da produção da urina, os rins eliminam resíduos do metabolismo, água, eletrólitos e outras substâncias em excesso, controla a pressão arterial, além de participar na ativação da vitamina D3 em associação com outros órgãos. É nesse órgão que são secretados hormônios como a renina, que regula a pressão do sangue e a eritropoetina responsável por estimular a produção de hemácias (Junqueira & Carneiro, 2023). 65 6. CONCLUSÕES Os dados encontrados no presente estudo, que avaliou o potencial acaricida do extrato de Cannabis sativa em diferentes concentrações contra carrapatos Rhipicephalus linnaei, mostraram que: 1- Os danos sobre o integumento dos carrapatos foram mais agressivos nas concentrações de 2,5 mg/mL, 10 mg/mL e 40 mg/mL, comprometendo o epitélio cuticular. 2- A concentração de 2,5 mg/mL foi a que causou os danos mais severos nas glândulas salivares dos carrapatos. 3- As CL50 e a CL90 respectivamente, não foram comportamentalmente toxicas aos camundongos. 4- A exposição dos camundongos às concentrações de 7 mg/mL e 14,5 mg/mL levaram a um aumento significativo das células de Kupffer no fígado dos animais, indicando toxicidade do extrato. 5- Houve um acúmulo de polissacarídeos nos hepatócitos do grupo exposto a 7 mg/mL. 6- O grupo Tratado 2 (exposição à 14,5 mg/mL) apresentou maiores danos hepáticos, incluindo comprometimento dos núcleos dos hepatócitos. 7- A dose mais baixa de exposição ao extrato (2,5 mg/mL) foi, nos rins, aquela melhor tolerada sem causar danos morfohistológicos. 8- As doses de 10 mg/mL e 20 mg/mL foram as mais agressivas ao tecido renal. 9- Extratos obtidos a partir da inflorescência da Cannabis sativa diluído em diferentes concentrações tem ação carrapaticida contra Rhipicephalus linnaei. 66 REFERÊNCIAS ABREU, M. 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