RESSALVA Atendendo solicitação da autora, o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 8/1/2026 1 Kelly Cristine Borsatto Análise da Interação Parasito-Vetor da Doença de Chagas – Perfil Metabólico – São José do Rio Preto 2024 1 Kelly Cristine Borsatto Análise da Interação Parasito-Vetor da Doença de Chagas – Perfil Metabólico – Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – UNESP, Campus de São José do Rio Preto, como requisito para a obtenção do título de Doutora em Microbiologia. Orientador: Prof. Dr. Raghuvir Krishnaswamy Arni Coorientador: Prof. Dr. Kaio Cesar Chaboli Alevi Coorientadora: Dra. Mônika Aparecida Coronado Agência financiadora: CAPES e FAPESP (2018/25458-3) São José do Rio Preto 2024 B738a Borsatto, Kelly Cristine Análise da Interação Parasito-Vetor da Doença de Chagas – Perfil Metabólico – / Kelly Cristine Borsatto. -- São José do Rio Preto, 2024 118 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni Coorientador: Kaio Cesar Chaboli Alevi 1. Triatominae. 2. Metabolômica. 3. Doença de Chagas. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas, São José do Rio Preto. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. 1 Kelly Cristine Borsatto Análise da Interação Parasito-Vetor da Doença de Chagas – Perfil Metabólico – Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Microbiologia, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas – UNESP, Campus de São José do Rio Preto, como requisito para a obtenção do título de Doutora em Microbiologia. Comissão examinadora Prof. Dr. Kaio Cesar Chaboli Alevi IOC/FIOCRUZ Coorientador Prof. Dr. Danilo Grunig Humberto da Silva UFMS Prof. Dr. Cleber Galvão Ferreira IOC/FIOCRUZ Prof. Dr. Jader de Oliveira FSP/USP Profa. Dra. Silvana Aparecida Rocco , LNBio, CNPEM São José do Rio Preto 08 de janeiro de 2024 1 Dedicatória Pelas inúmeras horas de trabalho duro, as noites sem dormir e a persistência que nunca me deixou, dedico esta tese a mim mesma. Agradeço os momentos em que poderia ter desistido, mas optei por seguir em frente. Aprecio a coragem que descobri ter, que me permitiu sair da zona de conforto e buscar a excelência. Esta dedicatória é um lembrete de que a busca dos meus sonhos e objetivos não envolve apenas o resultado final, mas toda a jornada que me levou até ele. Com esta dedicatória eu celebro a pessoa que me tornei e o crescimento que alcancei através de cada obstáculo durante essa jornada. Sigo acreditando que sou merecedora de todo sucesso, de cada conquista e de cada momento de alegria que meu trabalho trouxe/trará. Nunca desistirei de buscar meus sonhos, ser minha maior defensora, inspiração e, sobretudo, meu apoio inabalável. Que essa dedicatória não mostre apenas a mim, mas a todos, que podemos ser sempre inspirados pela nossa própria força e, principalmente, que ela nos impulsione para os mais belos caminhos que o destino nos reserva. 1 Agradecimentos Ao meu orientador Prof. Dr. Raghuvir Krishnaswamy Arni, e meus coorientadores, Prof. Dr. Kaio Cesar Chaboli Alevi e Dra. Mônika Aparecida Coronado, pelas manifestações de incondicional apoio e disponibilidade, pela compreensão, pelo aconselhamento assertivo e pelo estímulo permanente que muito contribuíram para essa etapa da minha formação. Gostaria de expressar minha profunda gratidão a Profa. Dra. Ljubica Tasic, por sua contribuição substancial ao meu projeto de doutorado. Sua generosidade ao ceder infraestrutura, tempo e equipe foi fundamental para o desenvolvimento do projeto. Sem o seu apoio dedicado, este trabalho não teria sido possível. Muito obrigado pela sua valiosa colaboração. Minha gratidão ao Prof. Dr. João Aristeu da Rosa por ceder a infraestrutura do insetário e do seu laboratório para o desenvolvimento do meu projeto. Sua colaboração foi fundamental e tornou possível a realização deste trabalho. Muito obrigado pelo seu apoio. Aos meus colaboradores Dr. Jader de Oliveira, Dr. Raphael Eberle, Erik Sobrinho Braga, Thyerre Santana da Costa, Gonzalo Garcia Delgado e Carolina Gismene, pela substancial contribuição com o projeto desenvolvido, por todo suporte técnico oferecido e por todo conhecimento agregado. A constribuição de vocês foi impressindível para a execução desse trabalho e para essa etapa da minha formação. Sem o apoio de vocês não seria possível. Quero expressar minha profunda gratidão ao meu colaborador, Lucas Gelain Martins, pela significativa contribuição no desenvolvimento do projeto. Seu tempo e conhecimento compartilhados foram essenciais para o sucesso desta empreitada. Um agradecimento especial à Rafaela dos Santos Peinado, cujo caminho cruzou o meu na graduação, mas foi no doutorado que nosso vínculo se estreitou. Juntas, enfrentamos essa etapa, sempre ajudando uma a outra, compartilhando conhecimentos e superando as angústias e dificuldades desta jornada desafiadora. Foi verdadeiramente um prazer ter você ao meu lado. Ao Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas (IBILCE/UNESP), seus docentes e funcionários, que desde 2014, quando ingressei no curso de graduação em Ciências Biológicas, me acompanham na minha jornada acadêmica e que contribuíram para me tornar a bióloga que sou hoje. Ao Instituto de Química da UNICAMP e ao Laboratório de Parasitologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP de Araraquara, por terem cedido infraestrutura, apoio técnico/científico e amparo metodológico para execução do projeto. O Presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de 1 Pessoal de Nivel Superior – Brasil – (CAPES) – Código de Financiamento 001 e da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), pela Bolsa de Doutoramento (Processo 2018/25458-3) concedida, que possibilitaram a realização desta tese. Agradeço aos meus pais que sempre priorizaram a minha educação. Obrigado Sr. Dejaime Borsatto e Dona Neiva Borsatto por, além de me oferecerem a oportunidade de estudar, sempre respeitaram minhas escolhas, me ensinaram amor, carinho, respeito e honestidade, e por sempre estarem ao meu lado. Ao meu irmão Matheus Borsatto por ser um ser humano tão incrível, acreditar em mim e estar ao meu lado sempre. Agradeço os meus amigos, Mayara G. Ferraz, Henrique M. M. Gimenes, Nicoli Rodrigues, Sara Lima, Vinícius Gobbe, Luiz Otávio Maia, Gabriela Faria, Gabriela Harano, Karina Guimarães, Pedro Henrique, Danilo Grünig e Joyce por estarem ao meu lado na vida. Eu acredito que os amigos são a família que escolhemos e vocês são os melhores. Essa etapa foi mais leve com vocês ao meu lado. Agradeço de forma especial ao Kaio Cesar Chaboli Alevi, que além de meu coorientador é um grande amigo. Foi ele quem me introduziu à ciência, conhece profundamente meu percurso, e, diante dos desafios encontrados, esteve ao meu lado, ajudando-me a manter firme e concluir essa etapa. Sua amizade e apoio foram inestimáveis. A saúde física e mental devem ser uma prioridade na vida de todos, assim as atividades que nos propomos a desenvolver podem ser desempenhadas com estabilidade e equilíbrio. Dessa forma, agradeço ao meu psiquiatra Dr. Marcos Uzelac, minhas psicólogas Dra. Thaissa e Marcela, minha neurologista Dra. Marina Pozzo e ao meu treinador pessoal Lucas Gonçalves, que me ajudaram nos momentos mais difíceis, que não foram raros nesses últimos anos, sempre me auxiliando e me ensinando a manter o equilíbrio para alcançar a estabilidade necessária para passar por essa etapa da minha vida. E, acima de tudo, quero dedicar um agradecimento especial ao meu marido Tomás Fialho e aos meus leais filhos de quatro patas, Theodoro e Bartolomeu. Especialmente ao meu marido, cuja presença é constante e incondicional, nos momentos mais desafiadores em que a tentação de desistir era intensa, ele não apenas me impediu de desistir, mas também cultivou em mim a crença de que alcançaria o término desta difícil, porém incrivelmente gratificante, jornada. Agradeço por cada demonstração de carinho, resiliência, respeito e compreensão ao longo destes últimos anos. “É preciso que eu suporte duas ou três larvas se quiser conhecer as borboletas.” Saint-Exupéry, A. 1966, p.34 Resumo Os organismos vivos possuem a capacidade de responder a vários sinais intra e extracelulares, o que, por sua vez, cria uma variedade de metabólitos na “sopa” celular. A metabolômica – ciência que lida com a identificação e quantificação de metabólitos num sistema biológico sob um conjunto de condições – está ganhando reconhecimento como uma ferramenta poderosa que ajuda a compreender o efeito de vários fatores de stress e condições ambientais sobre o metaboloma de um determinado sistema biológico. A metabolômica baseada em Ressonância Magnética Nuclear (RMN) está sendo usada em diferentes áreas, incluindo biologia de doenças, medicina, farmácia, toxicologia, alimentos, ciências ambientais, entre outras, contribuindo com uma melhor compreensão de conjuntos de metabólitos de interesse. Além disso, a RMN é aplicada para obter a impressão digital metabólica associada a diferentes sistemas biológicos. Dessa forma, o trabalho realizado neste doutorado se concentrou na análise metabólica do TG de Triatoma infestans, um dos mais importantes vetores do protozoário Trypanosoma cruzi, agente etiológico da doença de Chagas (DC). De forma geral, considera-se que este parasito não apresenta patogenicidade aos hospedeiros invertebrados (triatomíneos); no entanto, existem estudos que relatam efeitos negativos causados pela infecção. Assim, neste estudo, abordamos a importância de compreender a relação entre parasito e vetor na DC, por meio da análise comparada do metaboloma do sistema gastrointestinal de exemplares de T. infestans infectados e sem infecção pelo T. cruzi, por RMN. Identificamos 22 metabólitos, destacando sete (isoleucina, lisina, prolina, colina, betaina, acetato e glicose) como estatisticamente significantes na distinção entre os dois grupos (infectados e sem infecção). Discutimos as implicações fisiológicas desses metabólitos, considerando sua possível relação com fatores epidemiológicos e a interação entre o protozoário e o vetor. Embora nossos achados sugiram alterações no metabolismo do vetor induzidas pela presença do T. cruzi, ressaltamos a necessidade de estudos adicionais para determinar se essas mudanças afetam negativamente o inseto. A escassez de dados na literatura sobre o metabolismo do vetor e a interação parasito-vetor destaca a importância de uma compreensão mais aprofundada desses processos, fornecendo insights para o desenvolvimento de estratégias de controle de vetores e, por conseguinte, da transmissão da DC. Palavras-chave: Triatominae. Metabolômica. Doença de Chagas Summary Living organisms can respond to various intra- and extracellular signals, which, in turn, create a variety of metabolites in the cellular "soup". Metabolomics – the science that deals with the identification and quantification of metabolites in a biological system under a set of conditions – is gaining recognition as a powerful tool that helps understand the effect of various stress factors and environmental conditions on the metabolome of a given biological system. Metabolomics based on Nuclear Magnetic Resonance (NMR) is being used in different areas, including disease biology, medicine, pharmacy, toxicology, food, environmental sciences, among others, contributing to a better understanding of sets of metabolites of interest. Furthermore, NMR is applied to obtain the metabolic fingerprint associated with different biological systems. Therefore, the work carried out in this doctorate focused on the metabolic analysis of the TG of Triatoma infestans, one of the most important vectors of the protozoan Trypanosoma cruzi, the etiological agent of Chagas disease (CD). In general, it is considered that this parasite is not pathogenic to invertebrate hosts (triatomines); however, there are studies that report negative effects caused by the infection. Thus, in this study, we address the importance of understanding the relationship between parasite and vector in CD, through comparative analysis of the metabolome of the gastrointestinal system of specimens of T. infestans infected and without T. cruzi infection, by NMR. We identified 22 metabolites, highlighting seven (isoleucine, lysine, proline, choline, betaine, acetate and glucose) as statistically significant in distinguishing between the two groups (infected and without infection). We discuss the physiological implications of these metabolites, considering their possible relationship with epidemiological factors and the interaction between the protozoan and the vector. Although our findings suggest changes in the vector's metabolism induced by the presence of T. cruzi, we highlight the need for additional studies to determine whether these changes negatively affect the insect. The scarcity of data in the literature on vector metabolism and parasite-vector interaction highlights the importance of a more in-depth understanding of these processes, providing insights for the development of vector control strategies and, therefore, CD transmission. Keywords: Triatominae. Metabolomics. Chagas disease Sumário 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 12 1.1 Insetos .................................................................................................................... 13 1.2 Metabolômica: uma breve introdução ................................................................ 14 1.3 Fluxo de trabalho .................................................................................................. 16 1.4 Espectroscopia de 1H-RMN ................................................................................. 17 1.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear bidimensional (2D) ........ 20 1.5.1 COSY 1H-1H ................................................................................................... 22 1.5.2 TOCSY 1H-1H ................................................................................................. 23 1.5.3 HSQC 1H-13C .................................................................................................. 24 1.6 Ressonância Magnética Nuclear com sonda HR-MAS (High Resolution Magic Angle Spinning), para análise de semissólidos ................................................... 26 1.7 Quimiometria ........................................................................................................ 26 2. OBJETIVOS .................................................................................................................... 28 2.1 Objetivo Geral ....................................................................................................... 28 2.2 Objetivos específicos ............................................................................................. 28 3. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................................... 28 3.1 Obtenção e procedência dos insetos .................................................................... 28 3.2 Insetos sem infecção .............................................................................................. 28 3.3 Insetos infectados .................................................................................................. 30 3.4 Dissecação dos insetos ........................................................................................... 30 3.5 Preparação das amostras de T. cruzi para os estudos por RMN ...................... 30 3.6 Coleta de dados em RMN ..................................................................................... 31 3.7 Processamentos dos dados ................................................................................... 33 3.8 Análises Estatísticas e Quimiométricas .............................................................. 33 3.9 Identificação dos metabólitos .............................................................................. 34 4. RESULTADOS ............................................................................................................... 35 4.1. Perfil global de metabólitos usando espectroscopia de RMN ........................... 35 4.2. Análises Estatísticas e Quimiometricas .............................................................. 39 5. DISCUSSÃO .................................................................................................................... 45 6. CONCLUSÃO ................................................................................................................. 54 Referências .......................................................................................................................... 55 Apêndice .............................................................................................................................. 64 12 1. INTRODUÇÃO A doença de Chagas (DC) é uma das 20 Doenças Tropicais Negligenciadas (DTN) listadas pela Organização Mundial da Saúde (OMS) (WHO, 2023). Estima-se que sete milhões de pessoas estejam infectadas pelo Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909) (Kinetoplastida, Trypanosomatidae) em todo o mundo, principalmente na América Latina (WHO, 2023). Além disso, pressupõe-se que mais de 10 mil pessoas morram, todos os anos, de manifestações clínicas (WHO, 2023), e cerca de 70 milhões de pessoas vivam em área de risco (GUHL; RAMÍREZ, 2021; DE FUENTES-VICENTE et al., 2023; MARTÍN- ESCOLANO et al., 2022; WHO, 2023). Embora a DC seja endêmica de 21 países latino- americanos (DNDI, 2023), essa moléstia já foi relatada em áreas não endêmicas, como Canadá, Estados Unidos, Japão, Austrália, Nova Zelândia, Suíça, Itália e Espanha (SORIANO-ARANDES et al., 2016). O protozoário T. cruzi é o agente etiológico responsável por esta doença (HOTEZ et al., 2007; WHO, 2023), sendo a principal forma de transmissão por meio das fezes e/ou urina de triatomíneos, pois esses insetos possuem o hábito de defecar durante ou após o repasto sanguíneo e, uma vez infectados pelo T. cruzi, podem liberar o parasito sobre a pele do hospedeiro (ALEVI et al., 2021; GIL-SANTANA et al., 2022; OLIVEIRA CORREIA et al., 2022; TÉLLEZ-RENDÓN et al., 2023; ZHAO et al., 2023). Porém, a transmissão pode ocorrer por diversas outras vias, incluindo transmissão oral via alimentos contaminados com o parasito, transfusão de sangue de doadores infectados, transmissão vertical (transplacentária ou durante a amamentação), transplantes de órgãos de doadores chagásicos e, até mesmo, por acidentes laboratoriais (CENTERS FOR DISEASE CONTROL AND PREVENTION, 2006; JACKSON et al., 2010; BERN; MARTIN; GILMAN, 2011; SHIKANAI-YASUDA; CARVALHO, 2012). O ciclo de vida do T. cruzi é complexo e constituído por diferentes fases que acontecem ora nos triatomíneos (vetores), ora nos vertebrados que atuam como hospedeiros/reservatórios (de forma geral, mamíferos) (TYLER; ENGMAN, 2001; BERN, 2015; BARISÓN et al., 2017). Durante o repasto sanguíneo em mamíferos infectados, os insetos ingerem as formas tripomastigotas que passam por uma sequência de transformações ao longo do trato gastrointestinal (TG) do inseto: no estômago, a maioria dos tripomastigotas (forma presente no sangue dos vertebrados) se diferencia em epimastigotas (principal estágio de replicação) e esferomastigotas. Após a passagem para o intestino delgado e reto, os epimastigotas se dividem repetidas vezes e, na porção final do sistema digestório, se transformam em 13 tripomastigotas metacíclicos (forma infectante para os hospedeiros) que são eliminados nas fezes dos insetos durante o repasto sanguíneo (GARCIA et al., 2010). Os únicos tratamentos disponíveis para a doença são os antitripanosomatídeos Benznidazol e Nifurtimox, que só são eficazes na fase aguda da doença (HASSLOCHER- MORENO et al., 2012; CRESPILLO-ANDÚJAR et al., 2022). A criação de novas abordagens medicinais para o tratamento da DC tem enfrentado muitos desafios. A complexidade da biologia da infecção, a complexidade da patologia e a natureza de longo prazo da doença são as principais barreiras para o desenvolvimento de novos tratamentos (MILES et al., 1981; BERN, 2015; MESSENGER; MILES; BERN, 2015; MARTÍN- ESCOLANO et al., 2022). Consequentemente, o controle vetorial é considerado a estratégia mais eficiente para combater a DC (WHO, 2023). Entretanto, o controle dos vetores apresenta vários obstáculos, pois os triatomíneos apresentam ampla distribuição geográfica, alto grau de domiciliação de algumas espécies e variações significativas entre vetores em termos de morfologia, fisiologia e genética (o que reflete em diferenças na capacidade e competência vetorial e resulta em resistência à inceticidas) (MESSENGER; MILES; BERN, 2015; DE FUENTES-VICENTE et al., 2023). Além disso, os desafios de implantar uma vigilância epidemiológica eficaz, que possua uma cobertura espacial e populacional adequada e que atue na detecção de novos casos de incidência e reincidência dos triatomíneos são as principais barreiras ao controle desse vetor (DE ARIAS et al., 2022). 1.1 Insetos Atualmente, existem 160 espécies descritas na subfamília Triatominae (157 espécies existentes e três fósseis), agrupadas em 18 gêneros e cinco tribos (ALEVI et al., 2021; GIL- SANTANA et al., 2022; OLIVEIRA CORREIA et al., 2022; TÉLLEZ-RENDÓN et al., 2023; ZHAO et al., 2023). Triatoma infestans (Klug, 1834), T. brasiliensis Neiva, 1911, T. pseudomaculata Corrêa & Espínola, 1964, T. sordida (Stål, 1859) e Panstrongylus megistus (Burmeister, 1835), apresentam maiores competências vetoriais no Brasil (GALVÃO, 2014). No entanto, todos os triatomíneos, de ambos os sexos e em qualquer fase do desenvolvimento após a eclosão (N1, N2, N3, N4, N5 e adultos), são considerados como potenciais vetores da DC. Entre as espécies descritas, T. infestans é considerado um dos principais vetores, principalmente devido às suas características biológicas, tais como o alto grau de antropofilia, adaptação ao ambiente domiciliar, capacidade de suportar longos períodos em jejum e apresentar uma ampla distribuição, tornando-o um grande problema de saúde pública (DUJARDIN; SCHOFIELD; TIBAYRENC, 1998). 14 Após ações de controle realizadas pela Iniciativa do Cone Sul em que Argentina, Bolívia, Brasil, Chile, Paraguai e Uruguai uniram esforços para a eliminação do principal vetor na América do Sul, T. infestans teve sua distribuição reduzida (DIAS; SCHOFIELD, 1999). No entanto, essa espécie se tornou motivo de preocupação novamente devido aos relatos de reinfestação na Argentina, Bolívia e Paraguai (GÜRTLER et al., 2007) evidenciando a dificuldade do controle vetorial dessa espécie, principalmente devido a sua ampla extensão em áreas endêmicas e à dificuldade de implementar uma vigilância epidemiológica eficiente, a fim de evitar a recuperação de populações de insetos previamente tratados com inseticidas (PÉREZ DE ROSAS et al., 2013). Todavia, essa espécie ainda mantém sua importância epidemiológica devido à sua grande capacidade de adaptação ao meio domiciliar e peridomiciliar e, sendo deste modo, um importante vetor do protozoário T. cruzi (DUJARDIN; SCHOFIELD; TIBAYRENC, 1998). De maneira geral, considera-se que o protozoario T. cruzi não apresenta patogenicidade aos hospedeiros invertebrados (triatomíneos) (DE OLIVEIRA et al., 2018). No entanto existem estudos que relatam efeitos negativos causados pela infecção, como, por exemplo: menor taxa de oviposição (3,5 vezes menor que em fêmeas sem infecção), de fertilidade e de eclosão dos ovos em P. megistus contaminados com o T. cruzi (LIMA et al., 1992). Além disso, foram observados tanto prejuízos no desempenho reprodutivo de Rhodnius prolixus Stål, 1859 – os quais podem reduzir o fitness do inseto e trazer consequências para a sua sobrevivência (FELLET et al., 2014) –, como alterações nos aspectos comportamentais em Mepraia spinolai (Porter, 1934) – como a diminuição do tempo entre a alimentação e a defecação, podendo influenciar diretamente na capacidade vetorial (BOTTO-MAHAN; CATTAN; MEDEL, 2006). Nesse contexto, é importante ressaltar que os vetores são comumente explorados pelos parasitos, e conhecer a relação entre eles, é um passo importante para a epidemiologia da DC (ELLIOT et al., 2015). 1.2 Metabolômica: uma breve introdução A metabolômica é uma das ciências 'ômicas' que tem se expandido rapidamente na era pós genômica, possibilitando o estudo de perfis de metabólitos em um sistema (célula, tecido, organismo ou fluido biológico) em uma determinada condição (ROCHFORT, 2005). Os metabólitos não são apenas o produto da expressão gênica, eles são o resultado da interação do genoma de um determinado sistema biológico com o seu ambiente e servem como assinaturas diretas da atividade bioquímica de um organismo, sendo assim, são mais fáceis de correlacionar com o fenótipo (GOODACRE et al., 2004; ROCHFORT, 2005; SNART; 15 HARDY; BARRETT, 2015). Nesse contexto, a metabolômica tornou-se uma abordagem poderosa que tem sido amplamente adotada, uma vez que fornece informações do fenótipo metabólico funcional, detectando o metaboloma completo de um tecido ou organismo sob uma determinada condição (PATTI; YANES; SIUZDAK, 2012; SNART; HARDY; BARRETT, 2015). As estratégias para estudos com metabolômica foram divididas em duas abordagens distintas, metabolômica não direcionada e metabolômica direcionada (ALONSO; MARSAL; JULIÃ, 2015), cada uma com suas próprias vantagens e desvantagens, ambas muitas vezes utilizadas em combinação para obter informações mais precisas. A metabolômica não direcionada tem o objetivo de medir o maior número possível de metabólitos em uma amostra, permitindo uma análise abrangente de todos os metabólitos mensuráveis na amostra em estudo (PATTI; YANES; SIUZDAK, 2012; ROBERTS et al., 2012). Os metabólitos observados pela estratégia não direcionada requerem uma identificação minuciosa usando metodologias analíticas adequadas. Essa estratégia permite a descoberta de novos alvos como biomarcadores, pois a cobertura do metaboloma é ampla, entretanto, os principais desafios dessa abordagem estão nos protocolos para preparação das amostras, geração de grandes quantidades de dados, além das dificuldades em identificar e caracterizar os metabólitos encontrados (GOODACRE et al., 2004; ROBERTS et al., 2012; ALONSO; MARSAL; JULIÃ, 2015). A metabolômica direcionada tem como propósito a medição de conjuntos predefinidos de metabólitos com alto nível de precisão e exatidão, utilizando experimentos baseados em hipóteses bioquímicas específicas que visam identificar ou estudar uma ou mais vias em particular (GOODACRE et al., 2004; PUTRI et al., 2013). Com essa estratégia, a preparação de amostras pode ser otimizada, uma vez que todas as espécies analisadas estão claramente definidas, é possível reduzir a dominância de outras moléculas que poderiam estar presentes nas amostras (ROBERTS et al., 2012; PUTRI et al., 2013). Na entomologia, o uso das técnicas metabolômicas ainda é pouco difundida e tem sido utilizadas para trazer uma variedade de aspectos da biologia dos insetos, incluindo comportamento, infecção, respostas ao estrese térmico, simbiose, etc (SNART; HARDY; BARRETT, 2015). Entretanto, as informações sobre o papel dos metabólitos na regulação do comportamento e dos fenótipos dos insetos permanecem escassas (SNART; HARDY; BARRETT, 2015). Na subfamília Triatominae, os estudos metabolômicos são restritos. A análise do metaboloma fecal de R. prolixus, T. infestans e P. megistus foi realizada e revelou grupos de metabólitos constantes entre as espécies e outros que variam entre elas (ANTUNES 16 et al., 2013). Recentemente, Eberhard et al. (2021) realizaram um estudo metabolômico do intestino com a proposta de prever a infecção por T.cruzi. Os autores observaram uma grande proporção de lipídios e moléculas lipídicas que desempenham um papel importante na regulação do processo metabólico fundamental, e o modelo estatístico utilizado sugeriu que as diferenças observadas no metaboloma do inseto poderiam ser usadas para determinar se ele foi ou não exposto ao parasito (EBERHARD et al., 2021). 1.3 Fluxo de trabalho Independentemente do campo de aplicação, as investigações metabolômicas precisam seguir um fluxo de trabalho específico e sistemático para alcançar resultados apropriados e confiáveis. O fluxo de trabalho envolvido na obtenção da impressão digital (fingerprint) metabolômica do sistema biológico em estudo está apresentado na Figura 1. O primeiro e mais importante passo é a formulação de um hipótese ou problema biológico a ser resolvido pela metabolômica, seguido pela configuração do projeto experimental em que a amostra em questão é coletada e processada para extrair os metabólitos. Os métodos de extração precisam ser padronizados para cobrir o máximo de metabólitos que podem ser obtidos de uma amostra. Em sequência, os metabólitos extraídos serão analisados usando técnicas que os separam, identificam e quantificam. Isto, por sua vez, leva a geração de grandes conjuntos de dados, que são curados e depois analisados manualmente ou por pacotes de software pré- concebidos, seguidos de processamento rigoroso dos dados e análise. 17 Figura 1. Fluxo de trabalho envolvido na obtenção de dados metabolômicos de um sistema biológico. A: estruturação do projeto e formulação da hipótese; B: manutenção dos insetos e das cepas de T cruzi; C: Dissecção do T. infestans e extração do sistema gastrointestinal; D: armazenamento do material em nitrogênio liquido; E: coleta de dados em aparelho de RMN; F: processamento de dados; G: análise dos dados; H: análise estatística; I: análise dos metabólitos. Fonte: Autoria própria gerada pelo BioRender. 1.4 Espectroscopia de 1H-RMN A espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) desempenha um papel crucial nos estudos metabolômicos, oferecendo informações valiosas sobre a composição e estrutura das moléculas presentes nas amostras biológicas. Dentre as técnicas analíticas empregadas nos estudos metabolômicos, a RMN e a espectrometria de massa (EM) se destacam como as mais difundidas (EMWAS, 2015). Nos últimos anos, o uso da RMN nesses estudos tem crescido devido às suas vantagens em relação à EM. Quando comparada a EM, a RMN é uma técnica não destrutiva, permitindo a preservação das amostras durante a análise. Além disso, os metabólitos podem ser quantificados sem a necessidade de adicionar padrões, 18 e as amostras para análise por RMN requerem pouca ou nenhuma separação cromatográfica, reduzindo o tempo de preparação. A facilidade de identificação de novos compostos é outra vantagem significativa da RMN (EMWAS et al., 2019). Fundamentalmente, a RMN baseia-se na interação entre ondas de radiofrequência e spins nucleares na presença de um campo magnético externo (B0). O núcleo mais comumente observado é o do hidrogênio-1 (1H), devido à sua alta sensibilidade na detecção. Além do 1H, outros núcleos como 13C, 14N, 15N, 18º e 31P também são observáveis por RMN (MARTINS et al., 2015). Quando um campo magnético externo age sobre os núcleos, eles podem se orientar a favor ou contra o campo, gerando estados de energia diferentes. A diferença entre esses estados gera uma magnetização resultante, detectada como free induction decay (FID), que é processado através da Transformada de Fourier para gerar o espectro de RMN. Na metabolômica baseada em RMN, a supressão de solventes é um dos importantes aspectos que tem o maior impacto na qualidade do espectro em geral. Assim, a supressão de solvente é necessária durante a medição, devido ao grande sinal de água, evitando assim sobreposição de sinais e distorções de linha de base. Em amostras biológicas a água se encontra muito presente, isso faz com que um grande pico seja visto no espectro de RMN, por isso esse sinal precisa ser suprimido para que os componentes restantes possam ser observados, para isso; utiliza-se um experimento com uma sequência de pulso denominada noesygppr1d que vai suprimir o sinal da água no espectro e permitir que os metabólitos sejam observados (Figura 2). Os esquemas de supressão de água mais comumente usados em metabolômica baseada em RMN incluem: 1) pré-saturação simples, onde é usado radiofrequência fraca para saturar a ressonância da água durante o atraso de relaxamento; 2) espectroscopia de efeito overhauser nuclear 1-D (NOESY), pré-saturação com gradientes (noesygppr1d); 3) supressão de água por WATERGATE, que usa excitação adaptada ao gradiente (SINGH et al., 2023) e para supressão de água. Entre estes, noesygppr1d tem sido amplamente utilizado para suprimir o sinal de água de forma eficiente em caso de amostras biológicas. 19 Figura 2. A: Espectro de RMN de ¹H (600 MHz, D2O) de uma amostra de Corynebacterium pseudotuberculosis. Espectro adquirido utilizando a sequência de pulsos zg, B: Espectro de RMN de ¹H (600 MHz, D2O) de uma amostra de C. pseudotuberculosis. Espectro adquirido utilizando a sequência de pulsos noesygppr1d. Ambos os espectros foram obtidos no espectrômetro de RMN Bruker Avance III 600 MHz. Fonte: Autoria própria obtida com o software MestreNova. Outro importante experimento 1D comumente usado em metabolômica de RMN é editado por T2, o CPMG (Carr-Purcell-Meiboom-Gill Sequence) (CARR; PURCELL, 1954) que emprega um filto T2 para atenuar os sinais amplos de macromoléculas, principalmente proteínas e lipoproteínas, que possuem curto tempo de relaxamento T2 em comparação com metabólitos de massa molecular menor que 1,2 kDa. Além do sinal da água, compostos com alta massa molecular apresentam sinais alargados no espectro de RMN. Esses sinais muitas vezes sobrepõem sinais de menor 20 intensidade, para que esse problema não ocorra, utiliza-se o experimento CPMG. Esse experimento consiste basicamente na aplicação de uma sequência de pulsos que permite que os sinais das proteínas e lipídios aglomerados sejam filtrados virtualmente e, portanto, não irão aparecer no espectro (Figura 3) (CLARIDGE, 2016). Figura 3. A: Espectro de RMN de ¹H (600 MHz, D2O) de uma amostra de C. pseudotuberculosis. Espectro adquirido utilizando a sequência de pulsos noesygppr1d. B: Espectro de RMN de ¹H (600 MHz, D2O) de uma amostra de C. pseudotuberculosis. Observe que a região apontada pela seta em A possui sinais mais alargados e pouco definidos, enquanto em B os sinais são menos alargados e mais definidos devido a filtragem promovida pelo CPMG. Ambos os espectros foram obtidos no espectrômetro de RMN Bruker Avance III 600 MHz. Fonte: Autoria própria obtida com o software MestreNova. 1.5 Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear bidimensional (2D) A estrutura geral de um experimento bidimensional é sempre a mesma. Um experimento de RMN 2D consiste em preparação, evolução (t1), mistura e detecção (t2). A preparação refere-se à excitação dos spins com uma ou uma sequência de vários pulsos após o relaxamento térmico. Durante a evolução, o spin se desenvolve apenas sob a influência do campo magnético estático e possíveis interações entre si. O mixing period seguinte é tal que a magnetização transversal é observada no período de detecção final. Ao variar o tempo de mistura, a correlação entre os spins individuais pode ser estimulada, o que pode finalmente ser detectado. Dependendo da seleção da sequência de mistura, diferentes correlações entre os sinais individuais podem ocorrer através de diferentes mecanismos que levam a uma transferência de magnetização. Existem experimentos de correlação que conectam sinais 21 espacialmente adjacentes (NOESY), ligações químicas adjacentes (COSY) ou mesmo todos os sinais de um sistema de spin inteiro (TOCSY). Ao analisar espectros de RMN com estruturas químicas muito complexas se observa muitas sobreposições dos sinais dos 1H no espectro de RMN de 1H, tornando difícil o processo de identificação das moléculas presentes na amostra. Para driblar esse problema e auxiliar na interpretação dos espectros utilizamos técnicas de ressonância magnética bidimensionais (2D) para analisar as correlações e identificar corretamente as moléculas presentes no espectro de RMN. Essa técnica apresenta muitas vantagens, o que permite análises moleculares complexas, correlacionar informações entre diferentes núcleos e é extremamente útil nas mais diversas áreas que aplicam RMN (JANOVICK et al., 2020). Entretanto, sua principal desvantagem está na sua longa duração experimental, a depender do experimento a coleta dos dados pode levar mais de 30 horas. De uma forma bem simplista, a técnica de RMN 2D consiste em estabelecer uma correlação entre dois spins interconectados, através de uma série de aquisições de NMR 1D. Isso significa que um experimento 2D nada mais é do que uma série de vários experimentos unidimensionais que diferem na duração do tempo evolutivo t1. Você pode imaginar os FIDs registrados sucessivamente como uma matriz bidimensional (veja a Figura 10 à esquerda). Na primeira dimensão, todos os FIDs são alinhados de acordo com o seu tempo evolutivo. Cada um desses pontos t1 pode ser registrado com um certo número de transientes (número de varreduras/NS). A transformada de Fourier (TF) agora também pode ser aplicada uma após a outra. Se você primeiro transformar a segunda dimensão, obterá a sequência de espectros unidimensionais de acordo com o tempo evolutivo associado (ver Figura 10 no meio) e poderá ver que os sinais na primeira dimensão são modulados. Portanto, é possível também transformar os espectros ao longo da primeira dimensão. Isto resulta então num espectro que consiste em duas dimensões de frequência (Figura 10 à direita). Na técnica de RMN convencional o espectro é obtido após a TF, que depende de apenas uma variável de tempo. Na técnica de RMN 2D, duas variáveis de tempo são consideradas, o tempo de evolução e o tempo de detecção. Os sistemas de spins evoluem sobre a influência de variáveis de interação e assumem no final deste intervalo um estado particular que depende dessas variáveis e do tempo decorrido t1 (AUE; BARTHOLDI; ERNST, 1976; SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2019). Após esse tempo, os sistemas continuam a se desenvolver, durante esse período a magnetização é detectada em função do tempo t2. Um FID é obtido e passa pela transformada de Fourier dando origem a um espectro 2D (AUE; BARTHOLDI; ERNST, 1976; SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 22 2019). Para este trabalho vamos dar ênfase em três experimentos de correlação: COSY 1H-1H (Correlation Spectroscopy), TOCSY 1H-1H (Total correlation spectroscopy) e HSQC 1H-13C (Heteronuclear single quantum coherence). 1.5.1 COSY 1H-1H A espectroscopia de correlação 2D 1H-1H (COSY) é o experimento mais simples de todos os experimentos de RMN 2D usados para identificar correlações homonucleares entre núcleos 1H acoplados. Ao analisar o espectro COSY de uma amostra, é possível mapear as interações entre prótons de hidrogênio em diferentes metabólitos, facilitando a identificação e a atribuição de sinais específicos a compostos individuais (AUE; BARTHOLDI; ERNST, 1976; SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2019). Durante o experimento COSY, prótons com correlações mútuas (geralmente até três ligações) de acoplamento spin-spin são observados e exibidos na forma de picos cruzados no espectro de COSY (Figura 4). Em um espectro COSY os eixos F1(Y) e F2(X) representam os hidrogênios e a diagonal contém as informações 1D. Os picos cruzados que aparecem próximos as diagonais mostram os spins que são acoplados uns aos outros, produzindo um sinal na interseção dos dois valores de frequência (Figura 4). 23 Figura 4. Espectro de correlação COSY 1H-1H (400 MHz, D2O) de TG de T. infestans. Espectro obtido em equipamento Bruker AVANCE III operado a 400 MHz equipado com uma unidade Bruker MAS II (Magic Angle Spinning) e com sonda HR-MAS (High Resolution Magic Angle Spinning). Na imagem podemos observar os sinais dos hidrogênios presentes na valina que acoplam entre si. Fonte: Autoria própria obtida com o software MestreNova. 1.5.2 TOCSY 1H-1H Outra poderosa técnica de espectroscopia de correlação 1H-1H é a Espectroscopia de Correlação Total (TOCSY), também conhecida como experimento homonuclear Hartmann- Hahn (HOHAHA). O experimento TOCSY 1H-1H permite criar correlações entre todos os prótons dentro de um sistema de spin, não apenas entre prótons vizinhos, e são detectados e mostrados no modo 1D ou mais comumente na forma de picos cruzados em 2D. Em um estudo metabolômico, o experimento TOCSY é usado para fornecer a atribuição completa para ressonâncias de prótons de pequenas moléculas, já que todos os prótons correlacionados no mesmo resíduo de um único aminoácido, por exemplo, serão detectados. Essa técnica auxilia na elucidação de estruturas moleculares ao revelar as conexões entre átomos dentro de uma molécula o que é essencial para a identificação correta de compostos, pois muitos metabólitos têm estruturas complexas e, sem a elucidação adequada, a interpretação dos dados 24 pode ser ambígua (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2019). O aspecto do resultado de um experimento TOCSY é muito semelhante ao COSY, os eixos F1(Y) e F2(X) representam os hidrogênios e a diagonal contém as informações 1D. Entretanto, no COSY os picos cruzados mostram os spins diretamente acoplados, enquanto no TOCSY os picos cruzados não são apenas para spins que estão diretamente acoplados, mas para todos os spins que possuem acoplamento dentro de determinado sistema (Figura 5). Figura 5. Espectro de correlação TOCSY 1H-1H do TG de T. infestans. Espectro obtido em equipamento Bruker AVANCE III operado a 400 MHz equipado com uma unidade Bruker MAS II (Magic Angle Spinning) e com sonda HR-MAS (High Resolution Magic Angle Spinning). As correlações da valina são traçadas com duas linhas laranjas que se cruzam entre o sinal a 1,00 ppm e o sinal a 2,28 ppm (deslocamentos químicos atribuídos à valina). Fonte: Autoria própria gerada pelo software MestreNova. 1.5.3 HSQC 1H-13C A espectroscopia de RMN heteronuclear 2D HSQC 1H-13C em metabolômica representa uma ferramenta valiosa para resolver e atribuir picos de prótons sobrepostos, especialmente para sinais de metabólitos resultantes de amostras biológicas complexas(MAHROUS; FARAG, 2015). Ao correlacionar os sinais de 1H e 13C, a HSQC 25 facilita a distinção entre diferentes tipos de carbono em uma molécula, proporcionando uma visão detalhada da composição química dos metabólitos (SILVERSTEIN; WEBSTER; KIEMLE, 2019). O experimento HSQC fornece a resolução mais alta em comparação com outros experimentos 2D. No entanto, o aumento da resolução está associado a uma redução na sensibilidade, especialmente na abundância natural relativamente baixa de 13C. HSQC 1H-13C permite estabelecer as correlações entre os núcleos 1H-13C que estão distantes por uma ligação química (Figura 6). Em um espectro de HSQC 1H- 13C os carbonos estão ao longo do eixo F1 (Y) e os prótons estão ao longo do eixo F2 (X). Figura 6. Espectro de correlação HSQC 1H-13C do TG de T. infestans. Espectro obtido em equipamento Bruker AVANCE III operado a 400 MHz equipado com uma unidade Bruker MAS II (Magic Angle Spinning) e com sonda HR-MAS (High Resolution Magic Angle Spinning). Na imagem podemos observar os sinais dos núcleos de carbono da valina. Fonte: Autoria própria gerada pelo software TopSpin. 26 1.6 Ressonância Magnética Nuclear com sonda HR-MAS (High Resolution Magic Angle Spinning), para análise de semissólidos A rotação de ângulo mágico de alta resolução (HRMAS) é uma técnica estabelecida para análise de amostras não homogêneas e semissólidas. Com técnicas padrão de RMN em estado de solução, os espectros de tais amostras sofreriam ressonâncias amplas e não resolvidas. Em amostras no estado líquido, as moléculas estão se movimentando de forma rápida e aleatória. Já em amostras sólidas ou semissólidos as moléculas apresentam orientações espaciais muito bem definidas devido ao ambiente mais compacto. Essas moléculas, quando expostas a um campo magnético intenso irão se comportar de formas distintas, os núcleos de uma molécula de meio sólido ou semissólido não sofrerão reorientação molecular. Devido essa ausência total ou parcial de orientação os sinais obtidos nos espectros de amostras sólidas ou semissólidas são muito amplos (STANISIC et al., 2022) Após estudos realizados por Andrew et al. (1958) e Lowe (1959), uma metodologia que simula o efeito da reorientação molecular para spins nucleares foi estabelecida para melhorar a resolução dos espectros obtidos. Os estudos mostraram que quando o ângulo (θ) entre o eixo de rotação da amostra e o campo magnético externo (B0) é de 54,74° os resultados são melhores. O ângulo θ ficou conhecido como ângulo mágico e a técnica foi denominada Magic Angle Spinning (MAS) (ANDREW; BRADBURY; EADES, 1958; LOWE, 1959). Posteriormente, por volta de 1990 surgiu a técnica de RMN chamada rotação de ângulo mágico de alta resolução (HR-MAS), essa técnica estendeu as aplicações da RMN de alta resolução para amostras que possuem reorientação molecular limitada, como amostras de semissólidos. O HR-MAS resultou em espectros de RMN de semissólidos com uma resolução espectral tão boa quanto RMN de estado líquido (WONG; LUCAS-TORRES, 2018; STANISIC et al., 2022). 1.7 Quimiometria Os dados de RMN não são facilmente adequados para análise por métodos quimiométricos. Portanto, esses dados precisam ser transformados em um formato adequado à realização de análises multivariadas. Isso pode ser alcançado por meio de várias etapas: categorização, alinhamento, normalização e dimensionamento. Quimiometria é uma área da química que utiliza métodos matemáticos, estatísticos e computacionais para aplicar a conjuntos de dados de caráter químico (FERREIRA, 2015). Em 27 conjuntos de dados multivariados como os dados metabolômicos, se faz necessário o uso de métodos quimiométricos para extrair as informações relacionadas ao objetivo principal do estudo. Dentre esses métodos estão o pré-processamento de dados, análises uni e multivariadas e técnicas de reconhecimento de padrão. Sendo assim, o conjunto de dados metabolômicos passa inicialmente pela etapa de pré- processamento. Essa etapa pode ser realizada com auxílio de alguns softwares como MestreNova. O pré-processamento consiste em eliminar informações que não sejam relevantes quimicamente ou para o objetivo do estudo nessa etapa são feitos pequenos ajustes no espectro como ajuste de fase para promover uma simetria de todos os picos, ajuste da linha de base para remover artefatos espectrais que podem gerar distorções e referenciamento dos espectros para a identificação de compostos, alinhamento de pico e análises estatísticas (EMWAS et al., 2018). Além disso, uma técnica denominada binning também é aplicada a fim de solucionar algum desalinhamento existente e reduzir a dimensão da matriz de dados, com essa técnica os espectros são segmentados em regiões de mesma largura em ppm, denominadas bins (ENGELSEN; SAVORANI; RASMUSSEN, 2013). Uma das vantagens importantes do binning é que ele evita que as variações dos deslocamentos de RMN afetem o processamento estatístico, desde que tais deslocamentos permaneçam dentro dos limites dos compartimentos correspondentes. Outra técnica empregada nessa etapa é a normalização, onde os dados coletados são transformados em valores comparáveis (STANISIC et al., 2022). A normalização é utilizada para remover qualquer variação nas intensidades do sinal devido às diluições de cada amostra ou à quantidade de material analisado. Após o pré-processamento, métodos de análise univariada são realizados, esses métodos são os mais usados para análise exploratória de dados e fornecem uma visão geral preliminar sobre as características potencialmente significativas dentro das condições em estudo. Métodos de análise, como Fold Change, T test e Volcano plot, são alguns exemplos de análises que podem ser realizadas. Os métodos de análise multivariada são cruciais nos estudos metabolômicos, uma vez que todos os metabólitos são considerados simultaneamente, permitindo a detecção de tendências entre amostras e metabólitos. As técnicas multivariadas de reconhecimento de padrão são ferramentas que visam identificar, caracterizar e avaliar semelhanças e diferenças entre as amostras de um conjunto de dados. Para isso utiliza-se análises supervisionadas e não supervisionadas. Como método de análise supervisionada temos o Partial Least Squares - Discriminant Analysis (PLS-DA) em que o objetivo é discriminar duas ou mais classes nas 28 quais as amostras podem ser categorizadas (ENGELSEN; SAVORANI; RASMUSSEN, 2013). Como método de análise não supervisionada podemos citar o Principal Component Analysis (PCA) que identifica as direções das maiores variações que melhor explicam a variância em um conjunto de dados sem consultar a classe (STOYANOVA; BROWN, 2001). 54 6. CONCLUSÃO Aqui apresentamos o primeiro estudo metobolômico do TG de T. infestans, o que nos permitiu caracterizar 22 metabólitos (treonina, alanina, valina, isoleucina, lisina, prolina, glutamato, glutamina, aspartato, leucina, acetato, metionina, asparagina, betaína, colina, glicose, manitol, tirosina, serina, fumarato, fenilalanina e triptofano), sendo sete, a saber, isoleucina, lisina, prolina, colina, betaina, acetato e glicose, significativos para diferenciar os grupos infectados e sem infecção. Este estudo permitiu investigar as intrincadas adaptações metabólicas de T. infestans após a infecção pela cepa Y do T. cruzi, fornecendo dados importantes para melhor compreensão da interação parasito-vetor. Embora as nossas descobertas ofereçam um primeiro passo a compreensão da dinâmica metabólica desta relação entre T. infectans e T. cruzi, é importante ressaltar que a escassez de dados metabolômicos sobre esta interação mostra a necessidade de estudos mais abrangentes. A disponibilidade limitada de tais dados destaca uma lacuna crítica para a discussão dos resultados, enfatizando a necessidade de investigações adicionais empregando técnicas complementares. A complexidade das interações entre o vetor e o protozoário exige uma abordagem multidisciplinar para desvendar os caminhos completos das alterações metabólicas observadas. Dessa forma, a incorporação de metodologias adicionais, como genômica, proteômica e transcriptômica proporcionará uma compreensão mais abrangente dos mecanismos moleculares que direcionam essa interação. 55 Referências ALEVI, K. C. C. et al. Trends in Taxonomy of Chagas Disease Vectors (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae): From Linnaean to Integrative Taxonomy. Pathogens, v. 10, n. 12, p. 1627, 15 dez. 2021. ALONSO, A.; MARSAL, S.; JULIÃ, A. Analytical Methods in Untargeted Metabolomics: State of the Art in 2015. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, v. 3, 5 mar. 2015. ANDREW, E. R.; BRADBURY, A.; EADES, R. G. 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