GRAZIELE CRISTINA STRADIOTTO Densidade e resistência a antimicrobianos de Enterococcus sp e Escherichia coli isoladas de águas , areias e algas do gênero Sargassum de praias recreacionais do Litoral Norte do Estado de São Paulo Orientadora: Ana Júlia Fernandes Cardoso de Oliveira Rio Claro 2013 Dissertação de Mestrado apresentada ao Instituto de Biociências do campus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada). Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP 576 S895d Stradiotto, Graziele Cristina Densidade e resistência a antimicrobianos de Enterococcus sp e Escherichia coli isoladas de águas , areias e algas do gênero Sargassum de praias recreacionais do Litoral Norte do Estado de São Paulo / Graziele Cristina Stradiotto. - Rio Claro, 2013 96 f.: il., figs., gráfs., tabs., fots., mapas Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Ana Julia Fernandes Cardodso de Oliveira 1. Microrganismos. 2. Contaminação em praias recreacionais. 3. Antibióticos. 4. Oceanos. 5. Bactérias. I. Título. Dedico este trabalho a minha mãe que não mediu forças para me ajudar a conquistar tudo o que agora sou, sei que está orgulhosa de mim e que ao lado Deus agora guia os meus passos e me da à luz necessária para que mesmo quando cair eu saiba me levantar e lutar. AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus por ter me guiado durante esta caminhada, por ter me dado forças para seguir em frente diante de tantos obstáculos que tive que se não fosse por tua luz em minha vida nada teria conquistado. Aos meus pais João e Maria Rita (in memoriam) por todo apoio que me deram durante estes anos, nos momentos felizes e tristes estiveram comigo e sempre me incentivaram para que eu lutasse a cada dia para alcançar meus objetivos. É por vocês que lutaram pela minha vitória que estou aqui, é para vocês que dedico tudo o que fiz até hoje e ainda farei. Os amo mais do que tudo!! Às minhas irmãs queridas que amo, Daiane e Mirele, que me apoiaram e estiveram ao meu lado, e que perto ou longe me deram forças para que eu não desistisse diante do momento mais triste de nossas vidas. Estaremos sempre unidas para que lá de cima a mãe veja nossos êxitos. À minha orientadora, a Prof.a Dra. Ana Julia Fernandes Cardoso de Oliveira, muito obrigada por ter me aceitado no projeto, por sua orientação, pelos conhecimentos adquiridos no laboratório, pelos conselhos, pelos momentos de descontração, pela amizade e pela aprendizagem para se desenvolver um trabalho cientifico durante meu mestrado. Às meninas do laboratório de Microbiologia Marinha da UNESP de São Vicente, Thais, Cris, Rapha, Bruna, Luana, Mirela, Érika, Van, obrigada pela ajuda no laboratório, nas coletas, pelas fofocas e risadas no Micromar, sem vocês eu não teria conseguido realizar este trabalho, obrigada de coração a todas. Ao Wagner Vilano que juntamente com a Prof.ª Ana Julia e a Prof.ª Célia me incluíram no projeto dos Costões Rochosos, obrigada pelo apoio nas coletas e pela ajuda com os dados do trabalho. A todos meus queridos amigos de Rio Claro, especialmente Juliana, Ana Carolina (Simpatia), Vinicius e Pedro, obrigada por estarem sempre ao meu lado, por nossas risadas de madrugada, mesmo que pela internet, vocês sempre me divertem! Adoro vocês!! Aos professores do programa de Pós-graduação em Microbiologia Aplicada da UNESP de Rio Claro. A Capes e a FAPESP pelo apoio financeiro ao meu trabalho de Mestrado e ao projeto todo dos Costões Rochosos de Ubatuba. Muito Obrigada!! “Tenho a impressão de ter sido uma criança brincando à beira-mar, divertindo-me em descobrir uma pedrinha mais lisa ou uma concha mais bonita que as outras, enquanto o imenso oceano da verdade continua misterioso diante de meus olhos”. (Isaac Newton) RESUMO O presente trabalho teve como objetivo avaliar a densidade e a resistência de Enterococcus sp e Escherichia coli, em águas e areias e Sargassum sp em três praias do município de Ubatuba- SP, bem como avaliar a relação da densidades com fatores abióticos, tais como temperatura, salinidade e precipitação. As amostras foram coletadas nas praias de Perequê Mirim e Enseada em dois pontos e em um único na praia da Fortaleza, a qual não é monitorada pela CETESB. Utilizou-se a técnica da membrana filtrante na filtração das amostras. Os resultados obtidos mostraram altas densidades de Escherichia coli e Enterococcus sp em areias e Sargassum sp, isto mostra que é necessário que sejam implantados programas de monitoramento para as areias das praias, já que estas estão mais contaminadas que as águas. As algas, que são utilizadas em diversos fins, estão altamente contaminadas indicando a poluição do ambiente. Nas águas o valor só ultrapassou o limite estabelecido na legislação na praia do Perequê Mirim para as densidades de E.coli em junho e outubro. Contudo ao se comparar com os resultados obtidos pela CETESB, verificou-se que a água da praia Perequê Mirim permaneceu imprópria de dezembro/2011 a agosto/2012 e que na praia da Enseada a água esteve imprópria nos meses de janeiro, fevereiro e junho de 2012. Houve correlação negativa das densidades com a salinidade, com a temperatura e a precipitação. A resistência antimicrobiana para as cepas isoladas da água, areias e Sargassum apresentaram em quase 100% destas, resistência a quase todos os antibióticos utilizados, o que sugere múltipla resistência para estas cepas. A estação de verão-outono foi a que apresentou maiores taxas de resistência para as cepas de Enterococcus sp, já para e Escherichia coli as taxas foram altas em todas as estações. Palavras chave: 1-Microrganismos. 2-Contaminação em praias recreacionais. 3- Antibióticos. 4-Oceanos. 5-Bactérias ABSTRACT This study aimed to evaluate the density and resistance of Escherichia coli and Enterococcus sp in sand and water and Sargassum sp in three beaches of Ubatuba-SP and evaluate the relationship of density and abiotic factors such as temperature, salinity and precipitation. The samples were collected at two points Perequê Mirim’s beach and Enseada’s beach and at one point Fortaleza’ beach, which is not monitored by CETESB. We used the membrane filter technique in filtering the samples. The results showed high densities of Escherichia coli and Enterococcus sp sands and Sargassum sp, it must be implemented monitoring programs for the sandy beaches, as these are more contaminated than water. These algae are used in various purposes are highly contaminated indicating environmental pollution. In the waters only the value exceeded the limit established by legislation at Perequê Mirim’s beach for E. coli densities in June and October. However when compared with the results obtained by CETESB, it was found that the water at Perequê Mirim’s beach remained improper December of 2011 the august of 2012 and at Enseada’s beach water was improper for the months of January, February and June 2012. There was a negative correlation with salinity, with temperature and precipitation. Antimicrobial resistance for strains isolated from water, sand and Sargassum showed almost 100% of these, resistance to almost all antibiotics, suggesting multiple resistance to these strains. The season of summer-autumn showed the highest rates of resistance to the strains of Enterococcus sp, and Escherichia coli to have rates were high in all seasons. Keywords: 1-Microorganisms. 2-Contamination in recreational beaches. 3- Antibiotics. 4-Oceans. 5-Bacteria II- Sumário Página 1. INTRODUÇÃO.............................................................................................9 1.1. Costões Rochosos e Sargassum..................................................................15 2. OBJETIVOS..................................................................................................17 3. MATERIAIS E MÉTODOS.........................................................................18 3.1.Área de estudo..............................................................................................18 3.2. Coleta e processamento das amostras.......................................................19 3.3. Determinação da densidade de Enterococcus sp......................................20 3.4. Determinação da Densidade de Escherichia coli......................................22 3.5. Meios de cultura..........................................................................................24 3.6. Salinidade, temperatura, precipitação......................................................25 3.7. Teste de sensibilidade a antimicrobianos..................................................26 3.8. Análise estatística.........................................................................................29 4. RESULTADOS...............................................................................................30 4.1. Densidade de Escherichia coli em água......................................................30 4.2. Densidade de Escherichia coli em areias.....................................................31 4.3. Densidade de Escherichia coli em Sargassum.............................................33 4.4. Densidade de Enterococcus sp em água.......................................................35 4.5. Densidade de Enterococcus sp em areias.....................................................36 4.6. Densidade de Enterococcus sp em Sargassum.............................................38 4.7. Relação entre a Densidade de Escherichia coli e fatores abióticos............39 4.8. Relação entre a Densidade de Enterococcus sp e fatores abióticos............47 4.9. Resistência a antimicrobianos de Escherichia coli......................................54 4.10. Resistência a antimicrobianos de Enterococcus sp....................................69 4.11. Análise estatística..........................................................................................82 5. DISCUSSÃO......................................................................................................85 6. CONCLUSÃO...................................................................................................90 7. REFERÊNCIAS................................................................................................91 9 1. Introdução Os oceanos oferecem muitos benefícios ao homem, como a obtenção de alimentos, novas drogas para o tratamento de doenças e atividades de recreação, e com isto uma grande parte da população mundial vive em regiões costeiras. O aumento populacional acarreta uma produção elevada de lixo e esgoto sendo que este crescimento nem sempre é acompanhado em melhorias na infraestrutura do saneamento básico. Este fato leva a uma grande preocupação em relação à qualidade tanto das águas recreacionais quanto das praias em si (OLIVEIRA et al., 2008). Com o crescente desenvolvimento do turismo em ambientes litorâneos, decorrente de atividades recreacionais, tais como natação, mergulho, esportes náuticos e pesca, diversos impactos ambientais têm sido gerados, sendo que apenas recentemente tem se lhes dado a devida atenção (CETESB, 2006). O principal impacto antropogênico ocasionado pelo aumento populacional em cidades litorâneas é o despejo de esgotos domésticos “in natura” diretamente no mar, levando uma variedade micro-organismos patogênicos como bactérias, vírus e protozoários. A presença desses micro-organismos pode ocasionar doenças de veiculação hídrica aos banhistas, como gastroenterites, hepatite A, cólera, febre tifóide e até outras não relacionadas ao trato gastroentestinal, como dermatoses, conjuntivite, otite e as da região da nasofaringe (WHO, 1998). A qualidade da água para fins de recreação de contato direto e prolongado com a água (contato primário) é denominada balneabilidade. No Estado de São Paulo a balneabilidade das praias é monitorada pela CETESB (Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental) e seu programa esta estruturado para atender a Resolução CONAMA n°274/2000, Segundo os critérios estabelecidos, as praias são classificadas em relação à balneabilidade, em duas categorias: Própria e Imprópria sendo que a primeira reúne três categorias distintas: Excelente, Muito Boa e Satisfatória. Essa classificação é feita de acordo com as densidades de bactérias fecais resultantes de análises feitas em cinco semanas consecutivas. A Legislação prevê o uso de três indicadores microbiológicos de poluição fecal: coliformes termotolerantes (antigamente denominados Coliformes fecais), Escherichia coli e Enterococcus sp (Figura 1). 10 Fig.1. Grupo de microrganismos indicadores de poluição fecal (CETESB, 2010) Os critérios adotados pela CETESB encontram-se na tabela 1, a saber: para águas marinhas é o seguinte: densidades de Enterococos superiores a 100 UFC/100 mL, em duas ou mais amostras de um conjunto de cinco semanas, ou valores superiores a 400 UFC/100 mL na última amostragem, caracterizam a impropriedade da praia para recreação de contato primário. Sua classificação, como Imprópria, indica um comprometimento na qualidade sanitária das águas, implicando em um aumento no risco de contaminação do banhista e tornando desaconselhável a sua utilização para o banho (CETESB, 2010). 11 Tabela 1: Limites de coliformes termotolerantes, Escherichia coli e Enterococcus sp por 100 mL de água, para cada categoria (CETESB,2010) A divulgação das condições de balneabilidade das praias é feita através da emissão de boletins informativos obtidos com base nas últimas cinco semanas de amostragem dos resultados de densidades de bactérias fecais. Além da divulgação dos resultados para a imprensa, prefeituras e outros órgãos, a divulgação também é realizada nas próprias praias, por meio de bandeiras. Essas bandeiras são colocadas em mastros fixados na areia, exatamente em frente ao local onde é colhida a amostra de água do mar. A bandeira de cor verde indica que a qualidade da água está adequada para o banho, sendo a praia classificada como Própria. A bandeira de cor vermelha é utilizada para praias Impróprias, indicando que o banho de mar deve ser evitado. A sinalização é mantida ou substituída no dia seguinte à emissão do boletim, de acordo com a nova classificação estabelecida para a praia. A partir de 2008, em nove praias a sinalização por bandeiras foi substituída por totens luminosos que sinalizam em vermelho as praias Impróprias e em verde as praias Próprias (CETESB, 2010) (Figura 2). 12 Fig.2. Os tipos de bandeiras e totem utilizados na sinalização das praias (CETESB, 2010) No município de Ubatuba, são monitorados 26 pontos em 23 praias e um ponto no Rio Itamambuca. As praias Itaguá e Lagoinha têm 2 pontos de amostragem. Em 2010, 57% das praias permaneceram Próprias durante todo o ano, apresentando uma pequena piora em relação ao ano de 2009, quando 62% das praias permaneceram Próprias o ano todo. Nos últimos10 anos, as praias do município ficaram, em média, 91% do tempo na condição Própria (Gráfico 1b). Os 15 pontos que permaneceram Próprios o ano todo receberam qualificação anual Boa e Ótima (Gráfico 1a). Apenas as praias Prumirim e Itamambuca receberam a qualificação anual Ótima. As praias que receberam qualificação anual Péssima foram Itaguá, no ponto 1 e Perequê Mirim. (CETESB, 2010). 13 Gráfico 1 – Classificação anual (a) e média das porcentagens de propriedade anual das praias (b). Fonte: CETESB (2010) Embora os programas de monitoramento das águas recreacionais marinhas já tenham sido implantados em vários estados brasileiros com escasso sucesso, pouca atenção tem sido dada as areias das praias as quais estão sendo desconsideradas do ponto de vista da saúde pública. Devido à potencialidade de conter altas densidades de patógenos, o contato prolongado com as areias de praias contaminadas talvez apresente mais risco à saúde das pessoas do que o contato com a própria água (GHINSBERG et al., 1994; PAPADAKIS et al., 1997). Vários estudos têm mostrado que as areias das praias podem conter maiores concentrações bacterianas do que a coluna d'água (GHINSBERG et al., 1994; OSHIRO & FUJIOKA, 1995) uma vez que as bactérias podem sobreviver neste ambiente por muito tempo (WHITMAN & NEVERS, 2003) por encontrarem condições favoráveis de nutrientes (BRUNKE & FISCHER, 1999; DAVIES et al., 1995; VILLAR et al., 1999), proteção contra a luz solar (DAVIES-COLLEY et al., 1999) e contra a predação por protozoários (DAVIES & BAVOR, 2000). A movimentação de barcos ou veículos nas praias e a ressuspensão de areias e/ou sedimentos por intempéries contribuem significativamente para que as bactérias contidas na areia sejam liberadas para a coluna de água, aumentando o número de bactérias na água (AN et al., 2002; CRABILL et al., 1999; LALIBERTE & GRIMES, 1982; OBIRI-DANSO et al., 1999; STEPHENSON & RYCHERT, 1982). A detecção e a quantificação de indicadores em areias recreacionais são de grande importância para verificar o risco da presença de 14 microrganismos patogênicos neste ambiente (CABELLI et al., 1982), as fontes de contaminação presentes e a influência que as altas densidades bacterianas verificadas na areia podem ter na qualidade da água adjacente. Algumas pesquisas realizadas com o objetivo de contribuir para o estudo da contaminação de areias de praia utilizaram como microrganismos indicadores a bactéria Escherichia coli e a levedura Candida albicans (MENDES et al., 1993), entretanto, estudos mais recentes indicam que as bactérias do gênero Enterococcus parecem se acumular mais na areia do que as da espécie Escherichia coli (ALM et al., 2003), sendo assim seriam melhores indicadoras também para este tipo de ambiente. As águas recreacionais marinhas que recebem esgotos domésticos, bem como as areias, podem contribuir para o estabelecimento de rotas de disseminação de microrganismos carreadores de genes de resistência a antimicrobianos (MEIRELLES-PEREIRA et al., 2002). O uso massivo de antibióticos leva a resistência bacteriana que é um problema crescente no mundo todo, gerado por processos de seleção (FRIEDEN et al., 1993). O despejo de efluentes provenientes de ambientes fortemente seletivos para cepas resistentes tais como hospitais, indústrias, atividades veterinárias, aquicultura, entre outros, tem levado a um aumento da distribuição e da frequência de genes bacterianos de resistência, inclusive em ambientes aquáticos (SCHWARTZ et al., 2003). Um dos gêneros mais importantes em relação à resistência a antimicrobianos é o Enterococcus (HUYCKE et al., 1998), que até pouco tempo era considerado um Estreptococo fecal. Os enterococos se diferenciam dos estreptococos porque podem crescer em pH 9,6, em meio de cultura com 6,5% de NaCl, a temperaturas de 10ºC a 45ºC e sobreviver por até 30 minutos a 60ºC (HARWOOD et al., 2000; HANCOCK & GILMORE, 2006). Recentemente, infecções por Enterococcus sp tornaram-se um grande desafio terapêutico devido ao aumento da incidência e da variabilidade de cepas resistentes (ARVANITIDOU et al., 2001), sendo os fenótipos de resistência mais importantes àqueles relacionados aos aminoglicosídeos (estreptomicina e gentamicina), betalactâmicos (amoxicilina e ampicilina) e glicopeptídeos (teicoplanina e vancomicina) (D'AZEVEDO et al., 2004). Estas bactérias, além de apresentarem resistência intrínseca a muitos antimicrobianos como penicilinas, cefalosporinas, aminoglicosídeos e clindamicina, podem também, através da conjugação, adquirir genes de resistência presentes em plasmídeos (HUYCKE et al., 1998) e disseminá-los a bactérias da mesma espécie ou de espécies diferentes (KUHN et al., 2000). 15 As principais espécies causadoras de infecção no homem são o Enterococcus faecalis e o Enterococcus faecium, as quais possuem pequena sensibilidade aos aminoglicosídeos e à penicilina G, moderada sensibilidade a ampicilina e ao cloranfenicol, mas são bastante sensíveis aos glicopeptídeos (MURRAY, 1990; TAVARES, 2000). Cerca de 85 a 90% dos Enterococcus isolados nas clínicas são E. faecalis e 5 a 10% são E. faecium, sendo este último intrinsecamente mais resistente às penicilinas que o primeiro, pois possui proteínas ligadoras a penicilina (HUYCKE et al., 1998; TAVARES, 2000). 1.1. Costões Rochosos e Sargassum O costão rochoso é considerado um dos mais importantes ecossistemas marinhos e o fital nele presente é primordial para a cadeia trófica, fornecendo energia e matéria orgânica para as comunidades residentes e não residentes deste ecossistema (PEREIRA et al., 2010) (Figura 3). Fig.3. Costão rochoso em Ubatuba-SP com áreas de Sargassum mostrando grande diversidade As algas marinhas apresentam importância, tanto sob o ponto de vista econômico, como ambiental e social, sendo utilizadas em vários países do mundo, na indústria alimentícia, de medicamentos, da cosmética e agricultura (CABRAL et al., 2011; VIDOTTI & ROLLEMBERG, 2004). Algumas espécies de algas encontram uso na avaliação da qualidade dos sistemas aquáticos, para os quais, já foi sugerido um “índice de poluição” baseado nos generos de algas 16 presentes : quanto menos diversificada a população, maior a poluição do sistema (VIDOTTI & ROLLEMBERG, 2004). As macroalgas do gênero Sargassum pertencem ao Filo Phaeophyta, e a ordem Fucales, incluindo cerca de 400 espécies, este Filo inclui todas as demais algas pardas totalizando cerca de 1500 espécies. As algas pardas dominam os costões rochosos ao longo das regiões mais frias do globo, ocorrendo desde o nível da maré baixa até a profundidade de 30m. Em costões com declividade suave, elas podem estender-se por 5 a 10 quilômetros da costa. Nos trópicos as imensas massas flutuantes de Sargassum são denominadas como Mar de Sargaços (RAVEN et al., 2001). O Mar de Sargaços, com superfície de 3,5 milhões de quilômetros quadrados, chega até parte do chamado Triângulo das Bermudas, já no Mar do Caribe (BROW, 2012). As algas pardas também têm sido utilizadas como adubos, pois sua decomposição é geralmente lenta e seus elementos minerais são liberados progressivamente; uma vez que os polifenóis destas algas têm certa atividade antimicrobiana, essas algas são assim degradadas mais lentamente pelos micro-organismos do solo (REVIERS, 2006). A presença de vírus em algas pardas foi frequentemente evidenciada. Espécimes infectados foram isolados, cultivados e estudados por Muller e seus colaboradores desde 1988 (ROBLEDO et al., 1994) tendo sido estabelecido o caráter patogênico desses vírus (MULLER & FRENZER, 1993; REVIERS, 2006). Apesar de serem susceptíveis a contaminantes químicos e microbiológicos, existem poucos estudos na literatura a respeito da contaminação de algas por bactérias; sendo as macroalgas do gênero Sargassum potenciais recursos marinhos renováveis, o presente estudo analisou a ocorrência de bactérias indicadoras de contaminação fecal (Enterococcus sp e Escherichia coli) nestas algas e a resistência destas bactérias a determinados antibióticos. 17 2. Objetivos • Qualidade das Praias � Avaliar a contaminação por de Enterococcus sp e Escherichia coli isoladas da água do mar, de areias de praias recreacionais e de algas do gênero Sargassum, em praias do Litoral Norte do Estado de São Paulo: Perequê Mirim, Enseada, e Fortaleza. � Estudar a influência de fatores abióticos, tais como: temperatura, salinidade e precipitação na contaminação destes ambientes. 18 3. Materiais e Métodos 3.1. Área de Estudo A área de estudo (Figura 4) está localizada entre as baías do Flamengo e da Fortaleza, no município de Ubatuba, Litoral Norte do Estado de São Paulo, em uma faixa costeira de cerca de 30 km, assim distribuídos: (a) Baía da Fortaleza - Ponta da Fortaleza (S 23° 31' 53,6'' / W 45° 09' 41,2''), Praia Bravinha (S 23° 30' 18,6'' / W 45° 10' 21,2'') e Domingas Dias (S 23° 30' 18,6'' / W 45° 10' 21,2''); (b) Baía do Flamengo - Praia da Base (S 23° 29' 48,8'' / W 45° 06 49,9''), Perequê Mirim (S 23° 29' 29,0'' / W 45° 06' 12,4'') e Praia de Enseada (S 23° 29' 50,0'' / W 45º 04' 58,9''). A distância linear reta entre esses locais varia de 1,6 a 9,2 km, enquanto que a distância considerando as irregularidades da linha de costa varia de 3,1 a 35,0 km. Fig.4. Localização dos costões rochosos a serem estudados: (1) Ponta da Fortaleza; (2) Perequê-Mirim; (3) Enseada. 19 3.2. Coleta e processamento de amostras As amostras do presente trabalho (água, areia e algas) foram coletadas nas praias do Perequê, Enseada (impróprias a maior parte do tempo) e Fortaleza (a qual não tem controle pela CETESB). 3.2.1. Água As amostras de água foram coletadas durante a maré alta e maré baixa, em frascos estéreis, na isóbata de 1 metro (Figura 5). No momento da coleta foram medidas in situ a temperatura e a salinidade, esta última através do uso de um refratômetro portátil (REF211, salinity/ATC- 0-100%) e um termômetro de mercúrio (Incoterm- 0-60°C). 3.2.2. Areia Em cada praia também foram colhidas, em duplicata, amostras de areia, nos pontos correspondentes às coletas de água, em duas zonas distintas da praia: - Zona Seca – que normalmente não é banhada pela água do mar e corresponde à área mais frequentada pelos banhistas; - Zona Úmida – a qual sofre influências das marés sendo local preferido pelas crianças para brincar (Figura 5). Em cada ponto de coleta de areia, tanto na zona seca quanto na zona úmida, foi considerado um transecto paralelo à linha costeira com três pontos equidistante de coleta de areia para constituir uma amostra composta. Nos dois pontos mediu-se a temperatura utilizando o termômetro (Incoterm- 0-60°C). Fig.5. Coleta de areia e acondicionamento das amostras de águas e areias sob-refrigeração 20 3.2.3. Algas do gênero Sargassum As algas foram coletadas na praia do Perequê Mirim em dois pontos P1 (mais próximo à praia) e P2 (mais próximo a mar aberto) nas praias da Enseada e Fortaleza em um único ponto (P1) e armazenadas em sacos plásticos. As amostras foram mantidas sob refrigeração até o momento do processamento. As amostras coletadas (água, areia e Sargassum) foram transportadas sob-refrigeração para o Laboratório de Microbiologia da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus Experimental do Litoral Paulista – Unidade São Vicente, onde foram analisadas. 3.3. Determinação da densidade de Enterococcus sp 3.3.1. Amostras de Areia No laboratório, com o auxílio de uma espátula estéril, as amostras de areia foram pesadas em balança analítica (Bel engineering, precisão de 0,001g) (Figura 6), acondicionadas em erlenmeyers, acrescidas de água destilada estéril (1:10) e submetidas à agitação em um agitador , por cerca de 10 minutos para lavagem e extração das bactérias da areia e obtenção do sobrenadante. As determinações das densidades de bactérias no sobrenadante foram feitas através da técnica de membrana filtrante (APHA, 2005). Volumes de 10 ml e 50 ml de areia seca e de areia úmida do sobrenadante foram filtrados em membranas de 0,45µm de porosidade. Após a filtração, as membranas foram depositadas em placas contendo meio de cultura Agar mEnterococcus (Dfico). As placas de Agar mEnterococcus foram incubadas em estufa bacteriológica da marca Olidef cz (Figura 6) a 35 +- 0,5oC por 48h. Após este período, as colônias de coloração vermelho-marrom foram contadas como Enterococcus (Figura 6). 21 Fig.6. Balança analítica, estufa bacteriológica e placa com colônias de Enterococcus sp 3.3.2. Amostras de Água Para análise das densidades bacterianas na água do mar, realizou-se a filtragem com os volumes de 10 e 50ml de amostra. O meio de cultura e os procedimentos para incubação e contagem são os mesmos que os utilizados para as amostras de areia (Figura 7). Fig.7. Procedimentos da técnica de Membrana Filtrante 3. 3.3. Amostras de algas do gênero Sargassum O processamento consistiu, inicialmente, na trituração em um liquidificador simples de 20g de amostra de alga acrescidas de 180 ml de água destilada estéril. O composto foi filtrado em malha fina, com a finalidade de retirar resíduos não triturados (Figura 8).O filtrado foi submetido a técnica da Membrana Filtrante, iniciou-se as filtrações com volumes de 5 e 10ml 22 e depois passou-se para 1 e 5ml, devido as concetrações serem muito altas para a porosidade da membrana. Fig.8. Trituração e filtração do Sargassum sp As densidades médias das colônias de bactérias do grupo Enterococos isoladas foram expressas em Unidades Formadoras de Colônias por 100 ml (UFC 100ml-1) para água do mar e Unidades Formadoras de Colônias por 100g (UFC 100g-1) para a areia e algas. Com o auxílio de alça de platina estéril, algumas colônias consideradas nas contagens e escolhidas aleatoriamente, de todas as amostras, foram repicadas para tubos de ensaio contendo o meio Enterococcosel Caldo (Becton Dickinson Laboratories) e incubadas a 35 +- 0,5oC por48h. Os tubos que apresentaram enegrecimento do meio foram considerados positivos. Após a confirmação de colônias positivas, estas foram repicadas para tubos de ensaio contendo o meio Agar BHI inclinado (Oxoid) para a realização de testes de suscetibilidade a antimicrobianos. 3.4. Determinação da Densidade de Escherichia coli 3.4.1 Amostras de areia Para o processamento da areia, foram pesados 20 gramas da amostra em balança analítica (Bel engineering), e depositados em frascos contendo 180 ml de água destilada estéril. A amostra foi agitada e ressuspendida por cerca de 10 minutos para a extração das bactérias presentes no sedimento. O sobrenadante foi retirado por meio de pipetas estéreis nos 23 volumes de 10 ml e 50 ml que foram filtrados e transferidos para placas de Petri com meio mTEC. Estas foram incubadas a 35 +- 0,5 o C por 2 horas e em seguida a 44,5 +- 0,2° C por 24 horas em banho Maria. Após o período de incubação contou-se como E. coli as colônias de coloração amarela (Figura 9). Fig.9. Placa de mTEC com colônias de Escherichia coli 3.4.2. Amostras de água Para a determinação da densidade de Escherichia coli também foi utilizada a técnica de Membrana Filtrante (APHA, 2005). Volumes das amostras de água foram filtrados (10 e 50 ml), em membranas de 0,45 µm de porosidade e foram transferidos para placas de Petri contendo meio de cultura Agar mTEC. Estas foram incubadas semelhantemente as placas de areias. 3.4.3. Amostras de algas do gênero Sargassum Utilizou-se o mesmo processo de coleta e extração do método para a densidade de Enterococos. O isolamento, filtração e incubação foram semelhantes aos de água e areias para densidade de E.coli. Para a confirmação dos resultados, uma porcentagem representativa das colônias selecionadas contadas como E.coli das amostras de água, areia e Sargassum foram submetidas ao teste bioquímico de hidrólise da ureia. As colônias que permaneceram com sua coloração original amarela foram confirmadas como Escherichia coli devido à quebra da ureia pela urease produzida por estas bactérias. Os resultados das densidades médias de Escherichia coli foram expressos como Unidades Formadoras de Colônias em 100 ml (UFC 100 ml-1) para as águas e Unidades Formadoras de Colônias por 100g (UFC 100g-1) para as areias e algas. 24 Após a confirmação de colônias positivas, estas foram repicadas para tubos de ensaio contendo o meio Agar BHI inclinado (Oxoid) para a realização de testes de suscetibilidade a antimicrobianos. 3.5. Meios de cultura utilizados Agar mEnterococcus (Difco) Digerido pancreático de caseína.................................. 12,0g Peptona de proteose.................................................... 8,0g Extrato de levedura...................................................... 5,0g Dextrose....................................................................... 2,0g Fosfato dipotássico...................................................... 4,0g Azida de sódio.............................................................. 0,4g Agar.............................................................................. 10,0g Cloreto de trifeniltetrazólio....................................... 0,1g mTEC Agar (Difco) Fórmula aproximada por litro Peptona de proteose no. 3 .........................................5,0 g Extrato de levedura ...................................................3,0 g Lactose .....................................................................10,0g Cloreto de sódio ........................................................7,5 g Fosfato monopotássico ..............................................1,0g Fosfato dipotássico ....................................................3,3g Lauril sulfato de sódio.................................................0,2g Sódio Desoxycholate ..................................................0,1g Bromcresol roxo ........................................................0,08g Bromcresol vermelho .................................................0,08g Agar …........................................................................15,0g Enterococcosel Caldo (Becton Dickinson Laboratories) Caseína digerida por enzimas pancreáticas…...................17,0g Tecido animal digerido por enzimas pépticas…............... 3,0g Extrato de levedura…........................................................5,0g Bilis de boi…....................................................................10,0g 25 Cloreto de sódio…............................................................ 5,0g Citrato de sódio…..............................................................1,0g Esculina.......................................................................... 1,0g Citrato de amônio férrico................................................ 0,5g Azida sódica................................................................... 0,25g Agar BHI (Oxoid) Infusão de cérebro de bezerro........................................ 12,5g Infusão de bife de coração.............................................. 5,0g Peptona de proteose....................................................... 10,0g Cloreto de sódio.............................................................. 5,0g Glicose............................................................................ 2,0g Fosfato dissódico............................................................ 2,5g Agar................................................................................. 10,0g Agar Mueller-Hinton (Difco) Infusão de carne.............................................................. 2,0g Hidrolisado de caseína................................................. ....17,5g Amido........................................................................ ......1,5g Agar-agar.......................................................................... 13,0g 3.6. Salinidade, Temperatura e Precipitação A temperatura da água do mar foi obtida com auxílio de um termômetro de mercúrio (Incoterm- 0-60°C) suspenso na coluna d’ água por 5 minutos. A salinidade da água do mar foi determinada com o auxílio de um refratômetro portátil (REF211, salinity/ATC- 0-100%). Os valores de precipitação do local de estudo, foram obtidos pela CIIAGRO- Centro integrado de informações agrometeorológicas. 26 3.7. Teste de sensibilidade a antimicrobianos Colônias de Escherichia coli e Enterococcus sp, isoladas da água do mar, da areia e de algas do gênero Sargassum foram submetidas aos testes de suscetibilidade a antimicrobianos no Laboratório de Microbiologia da UNESP-São Vicente. Para os testes de sensibilidade a antimicrobianos foi utilizado o método de antibiograma disco-difusão proposto por Kirby-Bauer, recomendado pelo National Comittee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2003) utilizando o Agar Müller-Hinton. As colônias de Enterococcus sp e Escherichia coli foram submetidas aos seguintes antimicrobianos (Sensifar – Cefar): amoxicilina + ácido clavulânico 30µg, ampicilina 10µg, ciprofloxacina 5µg, eritromicina 15µg, estreptomicina 10µg, gentamicina 10µg, rifampicina 5µg, tetraciclina 30µg e vancomicina 30µg (Figura 10). Fig.10. Frascos contendo discos impregnados com antimicrobianos Das culturas mantidas em BHI inclinado (Figura 11), algumas colônias foram escolhidas aleatoriamente e transferidas, com o auxílio de uma alça de platina estéril, para tubos contendo 1 ml de água destilada estéril, em quantidade suficiente para atingir o grau de turvação 0,5, comparativamente a tubo padronizado de acordo com a escala de MacFarland (Bier, 1994). 27 Fig.11. Colônias de Enterococcus sp e Escherichia coli em Agar BHI inclinado. Esta escala é utilizada para aferir uma suspensão bacteriana mediante o grau de turvação e consiste numa série de 10 tubos de turvação crescente, obtidos pela mistura de soluções de cloreto de bário (BaCl2) a 1% e de ácido sulfúrico (H2SO4) a 1% em quantidades variáveis. A densidade dos inóculos a serem usados para o teste de sensibilidade foi padronizada utilizando-se um controle de turbidez de BaSO4, equivalente a uma solução padrão de MacFarland 0,5, que foi preparada acrescentando-se uma alíquota de 0,5ml de BaCl2 0,048 mol l-1 (1,175% w/v BaCl2 .2H2O) a 99,5 ml de H2SO4 0,18 mol l-1 (1% v/v), homogeneizando constantemente para manter a suspensão. A solução de sulfato de bário foi, então, transferida para tubos do mesmo tipo e tamanho daqueles usados para diluir o inóculo bacteriano, devidamente selados e armazenados em local escuro, à temperatura ambiente. Os inóculos foram preparados imediatamente antes do início de cada teste. Após o ajustamento de sua turbidez, introduziu-se em cada inóculo um “swab” de algodão estéril, girando-o várias vezes a apertando-o firmemente contra a parede interna do tubo, a fim de retirar qualquer excesso de inóculo do swab. A superfície seca da placa de Agar Müeller-Hinton foi inoculada esfregando o swab em toda ela, procedimento que foi repetido outras duas vezes, girando a placa cerca de 60º cada vez, assegurando a distribuição uniforme do inóculo. Posteriormente, a placa foi tampada para que houvesse uma completa absorção do excesso de umidade. Com o auxílio de uma pinça previamente flambada, os discos de antimicrobianos foram distribuídos de forma equidistante sobre a superfície da placa, evitando que a distância de centro para centro não excedesse 24 mm. Após este procedimento, as placas foram invertidas e colocadas em estufa a 35ºC por 16-18 horas. Passado o período de incubação, as amostras foram analisadas quanto à presença ou ausência de halos de inibição. Nos casos em que houve formação de halos de inibição, os 28 diâmetros foram medidos em milímetros com o auxílio de uma régua, incluindo o diâmetro do disco. Realizou-se a medição encostando-se a régua na parte de trás da placa de Petri invertida, a qual estava sobre um fundo não refletor. As medidas obtidas dos halos foram comparadas com valores já conhecidos, especificados na tabela padrão fornecida pelo fabricante dos discos de papel (Tabelas 2 e 3). De acordo com os diâmetros encontrados (Figura 12), pôde-se estabelecer o grau de suscetibilidade das bactérias aos antimicrobianos testados, verificando se os organismos são sensíveis, intermediários ou resistentes. Fig.12. Placas de antibiogramas mostrando halos de Escherichia coli e Enterococcus sp respectivamente Tabela 2 – Tabela padrão para interpretação de halos de inibição para Enterococcus sp (NCCLS, 2011). Antibacterianos Padrão Interpretativo (mm) Resistente Intermediária Sensível Amoxicilina + Ac. Clavulânico (AMC) 14 15-16 17 Ampicilina (AMP) 16 - 17 Ciprofloxacino (CIP) 15 16-20 21 Eritromicina (ERI) 13 14-22 23 Estreptomicina (EST) 11 12-14 15 Gentamicina (GEN) 12 13-14 15 Rifampicina (RIF) 16 17-19 20 Tetraciclina (TET) 14 15-18 19 Vancomicina (VAN) 14 15-16 17 29 Tabela 3 – Tabela padrão para interpretação de halos de inibição para Escherichia coli (NCCLS, 2011). Antibacterianos Padrão Interpretativo (mm) Resistente Intermediária Sensível Amoxicilina + Ac. Clavulânico (AMC) 17 18-24 25 Ampicilina (AMP) 15 16-22 23 Ciprofloxacina (CIP) 29 30-40 41 Eritromicina (ERI) 13 14-17 18 Estreptomicina (EST) 11 12-20 21 Gentamicina (GEN) 18 19-26 27 Rifampicina (RIF) 7 8-10 11 Tetraciclina (TET) 17 18-25 26 Vancomicina (VAN) 9 10-11 12 A categoria “sensível” significa que uma infecção por uma determinada cepa pode ser tratada adequadamente com a dose do agente antimicrobiano recomendada, exceto quando contra-indicado. A categoria “intermediária” implica que uma infecção causada por este isolado pode ser tratada apropriadamente em locais do corpo onde as drogas se concentram fisiologicamente ou quando for possível a prescrição de uma dosagem mais alta da droga que a habitual. Por fim, as cepas “resistentes” não são inibidas pelas concentrações do agente antimicrobiano normalmente prescritas em tratamentos habituais (frequência e dosagem) e/ou caem na faixa em que a ocorrência de mecanismos de resistência antimicrobiana específicos são mais prováveis, e a eficácia clínica não tem sido confiável em estudos clínicos (NCCLS, 2011). 3.8. Análise estatística A partir dos resultados de densidades de Escherichia coli e Enterococcus sp, temperaturas das águas e areias, salinidades e dos valores de precipitação, foi realizada análise de correlação entre esses parâmetros a partir do coeficiente de correlação de Pearson, com nível de significância 5%. Também foi analisada a variação entre as três praias através da análise de variância teste de Friedman também com 5% de significância. 30 4. Resultados 4.1. Densidade de Escherichia coli em água A legislação CONAMA nº 274/2000 estabelece que valores de densidade de bactérias Escherichia coli na água do mar maiores ou iguais a 2000 UFC100ml-1 na última amostragem classificam a praia como imprópria ao banho. Nas amostras de água analisadas o valor estabelecido pelo CONAMA foi ultrapassado no mês de junho (2,400x103 UFC100ml -1) e outubro (2,300x103 UFC100ml -1) na praia do Perequê Mirim (Figura 13). Fig.13. Densidade de Escherichia coli em água na Praia do Perequê Mirim Na praia da Enseada, as densidades atingiram seus valores máximos no mês de maio (1,300x103 UFC100ml-1 no ponto 1 e 900 UFC100ml-1 no ponto 2); estes valores não ultrapassaram o valor limite estabelecido na legislação ( 2000 UFC100ml-1) para considerar a praia como imprópria (Figura 14). 36 2400 2300 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 Ab r/ P1 M ai /P 1 Ju n/ P1 Ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 U FC 1 00 m l - 1 Meses de coleta Água-Perequê Mirim Densidade 31 Fig.14. Densidade de Escherichia coli em água na Praia da Enseada Já na praia da Fortaleza, a maior densidade ocorreu no mês de maio com um valor de 800 UFC100ml-1 a qual pode ser considerada como própria segundo a legislação CONAMA 274/2000 para as densidades de Escherichia coli (Figura 15). Fig.15. Densidade de Escherichia coli em água na Praia da Fortaleza 4.2. Densidade de Escherichia coli em areias As amostras de areias da praia do Perequê Mirim apresentaram altas densidades de Escherichia coli, com picos de 9,091x103 UFC100ml-1 para a areia úmida no mês de agosto e 5,036x103 UFC100ml-1 para a areia seca no mês de junho. As concentrações permaneceram altas entre os meses de abril a novembro com valores de densidades que ultrapassam o valor que é estabelecido na legislação para a água (2000 UFC100ml-1) (Figura 16). 4 1300 900 8 30 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 U FC 1 00 m l - 1 Meses de coleta Água-Enseada Densidade 50 8 2 800 270 4 0 4 0 6 0 200 400 600 800 1000 fev mar abril mai jun jul ago set out nov U FC 1 00 m l - 1 Meses de coleta Água-Fortaleza Densidade 32 Fig.16. Densidade de Escherichia coli em areias na Praia do Perequê Mirim Na praia da Enseada os valores de densidades foram bem mais elevados nas areias em relação às amostras de água, com picos de 7,810x103 UFC100ml-1 para areia úmida no mês de maio e 7,300x103 UFC100ml-1 para areia seca no mês de junho. Estas densidades permaneceram altas até o final do período de estudo (Figura 17). Fig.17. Densidade de Escherichia coli em areias na Praia da Enseada Para a praia da Fortaleza as densidades de Escherichia coli em areias também foram maiores em relação às amostras de água, com picos de 6,281x103 UFC100ml-1 para areia seca e 3,818x103 UFC100ml-1 para areia úmida no mês de junho. Observou-se uma diminuição nas densidades nos meses seguintes, entretanto as densidades na areia úmida aumentaram nos meses de outubro (2,364x103 UFC100ml-1) e novembro (3,272x103 UFC100ml-1) (Figura 18). 5036 9091 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 Ab r/ P1 M ai /P 1 Ju n/ P1 Ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 U FC 1 00 g -1 Meses de coleta Areias- Perequê Mirim Areia Seca Areia Úmida 7300 7273 54 7810 5454 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 Ab r/ P1 M ai /P 1 Ju n/ P1 Ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 U FC 1 00 g-1 Meses de coleta Areias-Enseada Areia Seca Areia Úmida 33 Fig.18. Densidade de Escherichia coli em areias na Praia da Fortaleza 4.3. Densidade de Escherichia coli em algas Sargassum sp As concentrações em algas do gênero Sargassum foram altas em todo o período de estudo, com densidades muito altas e superiores a legislação estabelecida para a água, com picos de 6,872x103 UFC100ml-1 para o Sargassum do P1 (Frente do costão) no mês de maio e 9,134x103 UFC100ml-1 para o Sargassum do P2 (ponta do costão) no mês de agosto (Figura 19). Fig.19. Densidade de Escherichia coli em Sargassum sp na Praia do Perequê Mirim 6281 455 400 0 0 3818 2364 3272 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 U FC 1 00 g -1 Meses de coleta Areias-Fortaleza Areia Seca Areia Úmida 5000 181 9134 300 6872 4000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V U FC 1 00 g-1 Meses de coleta Sargassum sp- Perequê Mirim sarg P2 sarg P1 34 Nas amostras da praia da Enseada o Sargassum foi coletado em um único ponto P1 na frente do costão, e estas apresentaram altas densidades de E.coli, com exceção dos meses de abril e maio e de julho a setembro onde a concentração foi nula, os meses de junho e outubro tiveram as maiores concentrações com valores de 4,909x103 UFC100ml-1 e 7,636x103 UFC100ml-1 respectivamente (Figura 20). Fig.20. Densidade de Escherichia coli em Sargassum sp na Praia da Enseada Na praia da Fortaleza o Sargassum foi coletado em apenas cinco meses (de junho a outubro) em um único ponto P1 (frente do costão). Neste período de junho a setembro as concentrações foram nulas. Em outubro ocorreu alta densidade (2,182x103 UFC100ml-1) (Figura 21). Fig.21. Densidade de Escherichia coli em Sargassum sp na Praia da Fortaleza 2363 3363 0 4909 0 0 0 7636 1818 0 2000 4000 6000 8000 10000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V U FC 1 00 g -1 Meses de coleta Sargassum sp- Enseada SARG.P1 0 0 0 0 2182 0 500 1000 1500 2000 2500 jun jul ago set out U FC 1 00 g -1 Meses de coleta Sargassum-Fortaleza Sargassum 35 4.4. Densidade de Enterococcus sp em água Para a praia ser considerada como própria a resolução CONAMA 274/2000 estabelece valores de densidades de Enterococcus sp de no máximo 100 UFC100ml-1 em duas ou mais amostras em cinco semanas consecutivas e 400 UFC100ml-1 na última medição. Acima destes valores ela se encontrará imprópria ao banho. Neste trabalho fizemos uma única coleta, portanto considerando-se o valor de 400 UFC100ml-1 para caracterizar a praia do Perequê Mirim esta não ultrapassou o valor estabelecido para ser considerada como imprópria, podendo ser considerada como própria nos dias da coleta. Apresentou uma maior concentração no mês de dezembro/2011 (228 UFC100ml-1) (Figura 22). Fig.22. Densidade de Enterococcus sp em água na praia do Perequê Mirim Na praia da Enseada as densidades de Enterococcus sp não ultrapassaram o valor de 400 UFC100ml-1, podendo ser considerada como própria nos dias de coleta. Apresentou maior densidade no mês de julho (218 UFC100ml-1) (Figura 23). Fig.23. Densidade de Enterococcus sp em água na praia da Enseada 228 172 116 0 50 100 150 200 250 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai /P 1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 U FC 1 00 m l -1 Meses de coleta Água- Perequê Mirim Densidade 142 156 218 0 50 100 150 200 250 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai o/ P1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 U FC 1 00 m l -1 Meses de coleta Água-Enseada Densidade 36 Baixas densidades de Enterococcus sp foram encontradas na praia da Fortaleza, com uma maior concentração em abril (200 UFC100ml-1) e junho (112 UFC100ml-1) (Figura 24). Fig.24. Densidade de Enterococcus sp em água na praia da Fortaleza 4.5. Densidade de Enterococcus sp em areias Os resultados das análises das amostras de areias em relação à contaminação por Enterococcus sp na praia do Perequê Mirim foram altos e bem maiores quando comparados com os resultados das análises da água. Estes valores ultrapassaram o valor estabelecido na legislação para a concentração na água (400 UFC100ml-1). Os maiores picos foram para areia úmida em junho (1,691x103 UFC100ml-1) e areia seca em julho (1,509x103 UFC100ml-1) (Figura 25). Fig.25. Densidade de Enterococcus sp em areias na praia do Perequê Mirim 4 200 112 2 4 0 50 100 150 200 250 Fev Mar Abr mai jun jul ago set out nov U FC 1 00 m l -1 Meses de coleta Água-Fortaleza Densidade 1455 1509 1691 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai /P 1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 U FC 1 00 g -1 Meses de coleta Areias-Perequê Mirim Areia Seca Areia Úmida 37 As areias da praia da Enseada apresentaram altas concentrações de Enterococcus sp, principalmente a areia seca que apresentou uma maior densidade no mês de junho (5,273x103 UFC100ml-1). A areia úmida também teve um pico de densidade no mês de junho (945 UFC100ml-1). As densidades na areia seca permaneceram altas até outubro e as de areia úmida diminuíram até o final do estudo (Figura 26). Fig.26. Densidade de Enterococcus sp em areias na praia da Enseada Nas areias da praia de Fortaleza foram relativamente baixas comparando-se com as outras duas praias, com exceção do mês de junho que apresentou altas densidades tanto para areia úmida (2,109x103 UFC100ml-1) quanto para areia seca (982 UFC100ml-1) (Figura 27). Fig.27. Densidade de Enterococcus sp em areias na praia da Fortaleza 2818 5273 909 945 364 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai o/ P1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 U FC 1 00 g-1 Meses de coleta Areias-Enseada Areia Seca Areia Úmida 982 309 2109 0 500 1000 1500 2000 2500 Fev Mar Abr mai jun jul ago set out nov U FC 1 00 g -1 Meses de coleta Areias-Fortaleza Areia Seca Areia Úmida 38 4.6. Densidade de Enterococcus sp em algas Sargassum sp As densidades de Enterococcus encontradas no Sargassum da praia do Perequê Mirim foram muito altas em todo o período tanto para o Sargassum da frente do costão (P1) quanto aquele da ponta do costão (P2). Para o Sargassum do ponto P1 a maior concentração foi em junho (3,636x103 UFC100ml-1) e para P2 este pico foi em dezembro/2011 chegando a 4,800x103 UFC100ml-1 (Figura 28). Fig.28. Densidade de Enterococcus sp em algas Sargassum sp na praia do Perequê Mirim O Sargassum da praia da Enseada coletado em um único ponto, apresentou altas densidades de abril a novembro, com valores de 3,272x103 UFC100ml-1 e 3,636x103 UFC100ml-1 para os meses de abril e julho respectivamente (Figura 29). Fig.29. Densidade de Enterococcus sp em algas Sargassum sp na praia da Enseada 272 2545 4800 3636 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 U FC 1 00 g-1 Meses de coleta Sargassum sp- Perequê Mirim Sarg. P1 Sarg. P2 36 3272 3636 1818 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 U FC 1 00 g-1 Meses de coleta Sargassum sp- Enseada Sarg. P1 39 O Sargassum na praia da Fortaleza foi coletado de junho a outubro, também em um único ponto (frente do costão). As amostras apresentaram em geral altas densidades de Enterococcus sp, com exceção do mês de agosto onde as densidades foram nulas. A maior densidade ocorreu no mês de julho (5,636x103 UFC100ml-1) (Figura 30). Fig.30. Densidade de Enterococcus sp em algas Sargassum sp na praia da Fortaleza 4.7. Relação entre a Densidade de Escherichia coli e fatores abióticos: temperatura, salinidade e precipitação A salinidade da água de Perequê Mirim apresentou pequenas variações no período de estudo, sendo que observou-se uma maior densidade de Escherichia coli para salinidades mais baixas. Em relação à temperatura verificou-se uma relação inversa, com maior densidade de bactérias no mês de junho (Figura 31). No caso da areia seca, verificou-se também uma relação negativa entre a densidade das bactérias e a temperatura, pois nos meses de menor temperatura (24,5°C) observou-se um pico na densidade (5,036 x103 UFC100g-1). No mês de outubro observou-se novamente um aumento na densidade (3,636x 103 UFC100g-1) a temperatura de 27,7°C (Figura 32). Para a areia úmida verificou-se uma maior densidade no mês de agosto (9,091x 103 UFC100g-1) à temperatura de 27°C. Em geral a correlação entre a densidade de Escherichia coli e a temperatura foi negativa (Figura 33). 4545 5636 0 4545 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 jun jul ago set out U FC 1 00 g -1 Meses de coleta Sargassum sp- Fortaleza Sarg. 40 Fig.31. Variação da densidade de Escherichia coli na água em relação à temperatura e salinidade Fig.32. Variação da densidade de Escherichia coli em areia seca com a temperatura Fig.33. Variação da densidade de Escherichia coli em areia úmida com a temperatura 2400 160 23 33 39,1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 Ab r/ P1 M ai /P 1 Ju n/ P1 Ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 U FC 1 00 m l -1 Meses e pontos Perequê Mirim-água Escherichia coli temperatura salinidade 5036 39,6 24,5 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai /P 1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 Te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g- 1 Meses e pontos Perequê Mirim- Areia seca Densidade Temperatura 1272 9091 36,4 27 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai /P 1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 Te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g-1 Meses e pontos Perequê Mirim - Areia úmida Densidade Temperatura 41 As densidades de E.coli em água e areias (seca e úmida) da praia Perequê Mirim comparadas com a precipitação (tabela 4) mostraram uma relação negativa, onde a maior densidade na água foi em junho de 2,400x103 UFC100ml-1 com uma média de precipitação mensal de 92mm, na areia seca também em junho com 5,036 x103 UFC100g-1 e na areia úmida em agosto com 9,091x103 UFC100g-1 para uma precipitação média mensal de 26,3 mm (Figura 34). Tabela. 4. Médias mensais de volumes de precipitação de dezembro/2011 a novembro/2012 (CIIAGRO, 2012) Meses DEZ JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV Precipitação (mm) 436,7 254,8 80,9 235,7 99,6 185 92 129,3 26,3 58,1 164,4 262,4 Fig.34. Variação da densidade de Escherichia coli em águas e areias com a precipitação Não houve relação entre as densidade de Escherichia coli e a precipitação para o Sargassum sp do P1. Para o Sargassum sp do P2 a relação foi negativa, pois a densidade de E.coli com a diminuiu com a precipitação (Figura 35). 5036 9091 2400 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V U FC 10 0m l -1 p ar a ág ua e U FC 10 0g -1 p ar a ar ei as Meses de coleta Perequê Mirim Areia Seca Areia Úmida ÁGUA Precipitação 42 Fig.35. Variação da densidade de Escherichia coli em Sargassum sp com a precipitação Na praia da Enseada, as análises dos valores para as densidades de Escherichia coli em água, mostraram uma relação negativa tanto para a salinidade quanto para a temperatura (Figura 36). Para a areia seca os valores mostraram uma relação negativa da densidade com a temperatura, com maiores valores de densidade em junho 7,300x103 UFC100g-1 e outubro 7,273x103 UFC100g-1 ambos para a temperatura de 25°C, em temperaturas mais elevadas observou-se uma menor densidade (Figura 37). Na areia úmida também foi verificado uma relação negativa entre as densidades de E.coli e a temperatura, com o maior pico de densidade em maio de 7,810x103 UFC100g-1 na temperatura de 26°C (Figura 38). Fig.36. Variação da densidade de Escherichia coli na água com a temperatura e salinidade 9134 6872 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V Pr ec ip ita çã o m m U FC 1 00 -1 Meses de coleta Sargassum sp-Perequê Mirim sarg P2 sarg P1 Precipitação 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 Ab r/ P1 M ai /P 1 Ju n/ P1 Ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 U FC 1 00 m l -1 Meses e pontos Enseada-água Escherichia coli temperatura salinidade 43 Fig.37. Variação da densidade de Escherichia coli na areia seca com a temperatura Fig.38. Variação da densidade de Escherichia coli na areia úmida com a temperatura A relação das densidades de E.coli com os volumes de precipitação mostraram que não houve relação significativa para a água e areia úmida. Entretanto para as densidades na areia seca esta relação mostrou-se negativa, com um picos de densidades em junho de 7,300x103 UFC100g-1 e média de precipitação mensal de 92 mm (Figura 39). 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 Ab r/ P1 M ai /P 1 Ju n/ P1 Ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g -1 Meses e pontos Enseada-areia seca Densidade temperatura 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 Ab r/ P1 M ai /P 1 Ju n/ P1 Ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g -1 Meses e pontos Enseada-areia úmida Densidade temperatura 44 Fig.39. Variação da densidade de Escherichia coli em água e areias com a precipitação As densidades de Escherichia coli em Sargassum sp mostraram uma relação positiva com os valores de precipitação, ou seja quanto maior foi a precipitação maior a densidade de bactérias, com um pico em outubro de densidade de 7,636x103 UFC100g-1 com média mensal de precipitação de 164,4 mm (Figura 40). Fig.40. Variação da densidade de Escherichia coli em Sargassum sp com a precipitação 7300 7810 1300 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V Pr ec ip ita çã o m m U FC 1 00 m l-1 p ar a ág ua e U FC 10 0g -1 pa ra a re ia s Meses de coleta Enseada Areia Seca Areia Úmida Água Precipitação 7636 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V Pr ec ip ita çã o m m U FC 10 0g -1 Meses de coleta Sargassum sp-Enseada SARG.P1 Precipitação 45 Na praia da Fortaleza observou-se uma relação negativa da densidade tanto com a salinidade como para a temperatura (Figura 41). Na areia seca também se verificou-se uma relação negativa com a temperatura, com maior densidade em junho de 6,281x103 UFC100g-1 à temperatura de 22°C (Figura 42). A areia úmida também mostrou relação negativa da densidade com a temperatura, sendo o pico de densidade em junho de 3,818x103 UFC100g-1e temperatura de 23°C (Figura 43). Fig.41. Variação da densidade de Escherichia coli em água com temperatura e salinidade Fig.42. Variação da densidade de Escherichia coli na areia seca com a temperatura 800 24,2 36,9 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 fev mar abril mai jun jul ago set out nov U FC 1 00 m l -1 Meses de coleta Fortaleza-água Escherichia coli temperatura salinidade 6281 22 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 Te m pe ra tu ra C ° U FC 10 0g -1 meses de coleta Fostaleza-areia seca Densidade Temperatua 46 Fig.43. Variação da densidade de Escherichia coli na areia úmida com a temperatura A comparação dos dados de precipitação mostrou que não houve relação com as densidades de Escherichia coli na água e na areia úmida, já com a areia seca houve relação negativa, sendo a maior densidade em junho 6,281x103UFC100g-1 com média mensal de precipitação de 92 mm. Não houve correlação para as densidades de E.coli em Sargassum com os volumes de precipitação (Figura 44). Fig.44. Variação da densidade de Escherichia coli em água, areias e Sargassum com a precipitação 3818 23 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 te m pe ra tu ta C ° U FC 1 00 m l -1 Meses de coleta Fortaleza-areia úmida Densidade temperatura 6281 3818 800 2182 0 50 100 150 200 250 300 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 fev mar abril mai jun jul ago set out nov Pr ec ip ita çã o em m m U FC 1 00 m l -1 p ar a ág ua e U FC 1 00 g-1 pa ra a re ia s e S ar ga ss um Meses de coleta Fortaleza Areia Seca Areia Úmida Água Sargassum Precipitação 47 4.8. Relação entre a Densidade de Enterococcus sp e fatores abióticos: temperatura, salinidade e precipitação A densidade de Enterococcus sp na água da praia do Perequê Mirim apresentou uma relação negativa a salinidade. Em junho a densidade foi de 172 UFC100ml-1 para uma salinidade de 33%, e em novembro em salinidade mais alta, 39,1%, a densidade caiu para 74 UFC100ml-1. Também houve uma relação negativa das densidades com a temperatura (Figura 45). Os resultados das areias mostraram que estas também apresentaram uma relação negativa das densidades de Enterococcus sp com a temperatura, ou seja, as densidades foram maiores em temperatura menores. A areia seca teve um pico na densidade em julho (1,509x103UFC100g-1) em temperatura de 18°C (Figura 46) e a areia úmida em junho (1,691x103UFC100g-1) em temperatura de 25°C (Figura 47). Fig.45. Variação da densidade de Enterococcus sp em água com a temperatura e salinidade 228 172 74 23 33 39,1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 50 100 150 200 250 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai /P 1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 U FC 1 00 m l-1 Meses e pontos Perequê Mirim- Água Enterococcus sp. Temperatura salinidade 48 Fig.46. Variação da densidade de Enterococcus sp em areia seca com a temperatura Fig.47. Variação da densidade de Enterococcus sp em areia úmida com a temperatura 1509 39,6 18 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai /P 1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g -1 Meses e pontos Perequê mirim-areia seca Densidade Temperatura 36 1691 36,4 25 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai /P 1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g-1 Meses e pontos Perequê- areia úmida Densidade Temperatura 49 As densidades de Enterococcus sp em águas e areias (seca e úmida) de Perequê Mirim não apresentaram relação significativa com os volumes de precipitação (Figura 48). Fig.48. Variação da densidade de Enterococcus sp em água e areias com a precipitação Os dados de densidade de Enterococcus sp relativos ao Sargassum do P1 apresentaram relação negativa com a precipitação, onde a maior densidade foi em junho (2,545x103 UFC100g-1) com média de precipitação mensal de 92 mm. As densidades de Sargassum sp do P2 não apresentaram relação significativa com os volumes de precipitação, sendo que o pico foi nos mês de dezembro de 4,800x103 UFC100g-1 com um volume de precipitação de 436,7 mm (Figura 49). Fig.49. Variação da densidade de Enterococcus sp em Sargassum sp com a precipitação 1509 1691 228 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 de z ja n fe v m ar ab r m ai ju n ju l ag o se t ou t no v Pr ec ip ita çã o m m U FC 10 0m l-1 p ar a ág ua e U FC 1 00 g-1 pa ra a re ia s Meses de coleta Perequê Mirim Areia Seca Areia Úmida agua Precipitação 2545 4800 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V Pr ec ip ita çã o em m m U FC 10 0g -1 Meses de coleta Sargassum sp-Perequê Mirim Sarg. P1 Sarg. P2 Precipitação 50 Na praia da Enseada, observou-se que as densidades de Enterococcus sp em água apresentaram relação negativa com a salinidade, com maior densidade em julho de 218 UFC100ml-1 para uma salinidade de 37,2%. As densidades também apresentaram relação negativa com a temperatura da água, sendo que neste mês de julho de maior densidade a temperatura foi de 21,3°C (Figura 50). Para a areia seca não houve relação significativa das densidades de Enterococcus sp com a temperatura (Figura 51). Já a areia úmida apresentou uma relação negativa com maior densidade em junho (945 UFC100g-1) com temperatura de 25°C (Figura 52). Fig.50. Variação da densidade de Enterococcus sp em água com a temperatura e salinidade Fig.51. Variação da densidade de Enterococcus sp em areia seca com a temperatura 218 10 21,3 37,2 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 50 100 150 200 250 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai o/ P1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 U FC 1 00 m l -1 Meses e pontos Enseada-Água Enterococcus sp. Temperatura Salinidade 5273 25 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai o/ P1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 N ov /P 1 Te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g-1 Meses e pontos Enseada - Areia seca Densidade temperatura 51 Fig.52. Variação da densidade de Enterococcus sp em areia úmida com a temperatura As densidade de Enterococcus sp em água e areias (seca e úmida) não apresentaram relação significativa com os volumes de precipitação (Figura 53). Já as densidades de Sargassum sp apresentaram relação negativa com os volumes de precipitação, com maior densidade em julho ( 3,636x103 UFC100g-1) com média mensal de precipitação de 129,3 mm (Figura 54). Fig.53. Variação da densidade de Enterococcus sp em água e areias com a precipitação 18 945 34,8 25 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 de z/ P1 ja n/ P1 fe v/ P1 m ar /P 1 ab r/ P1 m ai o/ P1 ju n/ P1 ju l/P 1 ag o/ P1 se t/ P1 O ut /P 1 no v/ P1 Te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g-1 Meses e pontos Enseada-Areia úmida Densidade Temperatura 5273 945 218 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V Pr ec ip ita çã o em m m U FC 1 00 m l-1 p ar a ág ua e U FC 10 0g -1 pa ra a re ia s Meses de coleta Enseada areia seca areia úmida agua precipitação 52 Fig.54. Variação da densidade de Enterococcus sp em Sargassum sp com a precipitação Na praia da Fortaleza, as densidades de Enterococcus sp em água apresentaram relação negativa com a salinidade, com maior densidade em abril ( 200 UFC100ml-1) com salinidade de 36,1%. A relação com a temperatura também foi negativa, com a maior densidade em temperatura de 27,5°C (Figura 55). Para as areias a relação de densidades com a temperatura foi negativa, onde a areia seca obteve maior densidade em junho (982 UFC100g-1) com temperatura de 22°C (Figura 56). A areia úmida também apresentou maior densidade em junho (2,109X103UFC) para a temperatura de 23°C (Figura 57). Fig.55. Variação da densidade de Enterococcus sp em águas com a temperatura e salinidade 3636 129,3 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 DE Z JA N FE V M AR AB R M AI JU N JU L AG O SE T O U T N O V Pr ec iit aç ão e m m m U FC 1 00 g-1 Meses de coleta Sargassum sp-Enseada Sarg. P1 precipitação 200 27,5 36,1 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 50 100 150 200 250 Fev Mar Abr mai jun jul ago set out nov U FC 10 0m l -1 Meses de coleta Fortaleza-água Enterococcus sp Temperatura salinidade 53 Fig.56. Variação da densidade de Enterococcus sp em areia seca com a temperatura Fig.57. Variação da densidade de Enterococcus sp em areia úmida com a temperatura A comparação das densidades de Enterococcus sp da praia de Fortaleza com os volumes de precipitação foi significativa e negativa, tanto para água quanto para areias (seca e úmida), com as maiores densidades em junho para areias (982 UFC100g-1 areia seca e 2,109x103 UFC100g-1 areia úmida) com volume médio de 92 mm de precipitação e em abril para água (200 UFC100ml-1) com volume médio de precipitação de 99,6 mm (Figura 58). Para o Sargassum sp a relação de densidades de Enterococcus sp com a precipitação não foi significativa (Figura 59). 80 982 37,4 22 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 200 400 600 800 1000 1200 Te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g-1 Meses de coleta Fortaleza-areia seca Densidade temperatura 2109 23 0 5 10 15 20 25 30 35 40 0 500 1000 1500 2000 2500 Fev Mar Abr mai jun jul ago set out nov Te m pe ra tu ra C ° U FC 1 00 g -1 Meses de coleta Fortaleza-areia úmida Densidade temperatura 54 Fig.58. Variação da densidade de Enterococcus sp em água e areias com a precipitação Fig.59. Variação da densidade de Enterococcus sp em Sargassum sp com a precipitação 4.9. Resistência a antimicrobianos de Escherichia coli 4.9.1. Verão-outono-Água Na praia do Perequê Mirim, 100% das cepas de E.coli testadas apresentaram resistência aos antibióticos amoxicilina + ácido Clavulânico, ciprofloxacina, eritromicina, tetraciclina e vancomicina; 80% a ampicilina e rifampicina e 60% a estreptomicina e gentamicina. Na praia da Enseada 80% das cepas apresentaram resistência amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina, rifampicina e vancomicina; 60% de cepas foram 982 2109 200 0 50 100 150 200 250 300 0 500 1000 1500 2000 2500 Fev Mar Abr mai jun jul ago set out nov Pr ec ip ita çã o em m m U FC 10 0m l -1 p ar a ág ua e U FC 10 0g -1 pa ra a re ia s Meses de coleta Fortaleza Areia Seca areia umida água precipitação 5636 129,3 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 jun jul ago set out Pe ci pi ta çã o m m U FC 10 0g -1 Meses de coleta Sargassum sp-Fortaleza Sarg. precipitação 55 resistentes à tetraciclina, 40% gentamicina e todas as cepas foram sensíveis à estreptomicina (0% de resistência). Na praia da Fortaleza 100% das cepas foram resistentes a eritromicina, rifampicina e a vancomicina, 50% foram resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, ciprofloxacina, gentamicina e tetraciclina e todas as cepas foram sensíveis a estreptomicina (Figura 60). Fig.60. Resistência de Escherichia coli em água 100% 80% 100% 100% 60% 60% 80% 100% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 80% 80% 80% 80% 0% 40% 80% 60% 80% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 50% 50% 50% 100% 0% 50% 100% 50% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 56 4.9.2. Verão-outono- areia seca Nas amostras de areia seca da praia do Perequê Mirim, 100% das cepas de Escherichia coli testadas foram resistentes a quase todos os antibióticos à exceção de gentamicina. Na praia da Enseada 100% das cepas foram resistentes a ciprofloxacina, 50% das cepas foram resistentes a eritromicina, gentamicina e vancomicina e quantos aos demais antibióticos (amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, estreptomicina, rifampicina e tetraciclina) todas as cepas testadas foram sensíveis. Na praia de Fortaleza, 100% das cepas de Escherichia coli testadas foram resistentes a todos os antibióticos (Figura 61). Fig.61. Resistência de Escherichia coli em areia seca 100% 100% 100% 100% 100% 0% 100% 100% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 0% 0% 100% 50% 0% 50% 0% 0% 50% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 57 4.9.3. Verão-outono- areia úmida Para as amostras de areia úmida, verificou-se na praia do Perequê Mirim que 100% das cepas de E.coli foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, eritromicina e vancomicina; 75% de cepas resistentes a ampicilina, ciprofloxacina e gentamicina e 50% de cepas resistentes à estreptomicina, rifampicina e tetraciclina. Na praia da Enseada, 100% de cepas de E.coli foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina, estreptomicina, gentamicina e vancomicina e 50% foram resistentes a rifampicina e a tetraciclina. Na praia da Fortaleza 100% das cepas testadas foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, eritromicina, rifampicina, tetraciclina e vancomicina e todas foram sensíveis aos antibióticos ciprofloxacina, estreptomicina e gentamicina (Figura 62). 100% 75% 75% 100% 50% 75% 50% 50% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 100% 100% 100% 100% 50% 50% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 58 Fig.62. Resistência de Escherichia coli em areia úmida 4.9.4. Verão-outono- Sargassum sp Nas amostras de Sargassum sp da praia Pereque Mirim, 100% das cepas de Escherichia coli testadas foram resistentes a quase todos os antibióticos, com exceção a rifampicina e tetraclina que 50% das cepas apresentaram resistência e 50% foram sensíveis. Na praia da Enseada 100% das cepas testadas foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, gentamicina e vancomicina; 50% de cepas resistentes a ciprofloxacina, eritromicina e rifampicina e todas as cepas foram sensíveis à tetraciclina e estreptomicina (0% de resistência) (Figura 63). Fig.63. Resistência de Escherichia coli em Sargassum sp 100% 100% 0% 100% 0% 0% 100% 100% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 100% 100% 100% 100% 50% 50% 100% Resistencia Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 50% 50% 0% 100% 50% 0% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 59 Não houve coleta de Sargassum sp para a praia da Fortaleza nos meses de início das coletas, portanto não foram feitos os testes de resistência para esta praia neste período. 4.9.5. Outono-inverno-Água Das cepas testadas na amostra de água da praia do Perequê Mirim, 100% foram resistentes aos antibióticos ampicilina, ciprofloxacina, tetraciclina e vancomicina; 75% foram resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico, eritromicina, estreptomicina e gentamicina e 0% de cepas resistentes a rifampicina, ou seja, todas as cepas foram sensíveis a este antibiótico. Na praia da enseada 100% das cepas de amostras de água testadas foram resistentes aos antibióticos ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina e estreptomicina; 67% de cepas resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico; 50% de cepas resistentes à gentamicina e todas sensíveis (0% de cepas resistentes) a rifampicina. Na praia da Fortaleza 100% das cepas testadas foram resistentes a todos os antibióticos testados (Figura 64). 75% 100% 100% 75% 75% 75% 0% 100% 100% Resistência em Pereque Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 67% 100% 100% 100% 100% 50% 0% 100% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 60 Fig.64. Resistência de Escherichia coli em água 4.9.6. Outono-inverno-Areia seca Na praia do Perequê Mirim, 100% das cepas testadas de Escherichia coli foram resistentes a quase todos os antibióticos com exceção do antibiótico rifampicina o qual todas as cepas foram sensíveis. Na Enseada, 100% das cepas foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, gentamicina e vancomicina; 80% de cepas resistentes a ciprofloxacina, eritromicina, estreptomicina e tetraciclina e 0% de cepas resistentes a rifampicina, todas foram sensíveis a este antibiótico. Na praia da fortaleza 100% das cepas de E.coli foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, eritromicina, gentamicina, rifampicina e vancomicina; 50% de cepas resistentes a ciprofloxacina e tetraciclina e todas as cepas foram sensíveis ao antibiótico estreptomicina (0% de cepas resistentes) (Figura 65). 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 61 Fig.65. Resistência de Escherichia coli em areia seca 4.9.7. Outono-inverno-Areia úmida Analisando as cepas da praia do Perequê Mirim, 100% destas foram resistentes aos antibióticos ampicilina, eritromicina, ciprofloxacina, tetraciclina e vancomicina; 67% de cepas resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico e gentamicina, 33% de cepas resistentes à 100% 100% 100% 100% 100% 100% 0% 100% 100% Resistência em Pereque Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 80% 80% 80% 100% 0% 80% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 50% 100% 0% 100% 100% 50% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 62 estreptomicina e todas as cepas sensíveis ao antibiótico rifampicina. Na Enseada 100% das cepas foram resistentes aos antibióticos ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina e vancomicina; 75% das cepas foram resistentes à gentamicina e tetraciclina; 50% de cepas resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico e estreptomicina e 33% de cepas resistentes a rifampicina. Em fortaleza, 100% das cepas de E.coli foram resistentes a quase todos os antibióticos testados com exceção de rifampicina, o qual todas as cepas foram sensíveis (Figura 66). Fig.66. Resistência de Escherichia coli em areia úmida 67% 100% 100% 100% 33% 67% 0% 100% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 50% 100% 100% 100% 50% 75% 33% 75% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 100% 100% 100% 100% 0% 100% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 63 4.9.8. Outono-inverno-Sargassum sp Das cepas de Escherichia coli da praia de Perequê Mirim, 100% foram resistentes aos antibióticos ciprofloxacina, eritromicina, gentamicina, rifampicina e vancomicina e todas as cepas foram sensíveis aos demais antibióticos (amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, estreptomicina e tetraciclina). Para a praia da Enseada 100% cepas testadas foram resistentes a quase todos os antibióticos com exceção de estreptomicina e rifampicina aos quais todas as cepas testadas foram sensíveis. Para a praia de Fortaleza, não foram encontradas densidades de E.coli durante estes meses (Figura 67). Fig.67. Resistência de Escherichia coli em Sargassum sp 0% 0% 100% 100% 0% 100% 100% 0% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 100% 100% 0% 100%0% 100% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 64 4.9.9. Primavera-verão-água Das cepas de escherichia coli de Perequê Mirim 100% foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, eritromicina, tetraciclina e vancomicina; 83% de cepas resistentes a ampicilina, ciprofloxacina e estreptomicina e 67% de cepas resistentes a gentamicina e rifampicina. Na praia da Enseada 100% de cepas foram resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico, rifampicina, tetraciclina e vancomicina e 67% das cepas foram resistentes a ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina, estreptomicina e gentamicina. Em Fortaleza 100% das cepas de E.coli foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ciprofloxacina, eritromicina, gentamicina, tetraciclina e vancomicina, e todas as cepas foram sensíveis aos antibióticos rifampicina e estreptomicina (0% de cepas resistentes) (Figura 68). 100% 83% 83% 100% 83% 67% 67% 100% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 67% 67% 67% 67% 67% 100% 100% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 65 Fig.68. Resistência de Escherichia coli em água 4.9.10. Primavera-verão-Areia seca Na praia de Perequê Mirim 67% das cepas foram resistentes à estreptomicina e 100% das cepas a quase foram resistentes aos demais antibióticos testados. Das cepas de E.coli da Enseada 100% foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulanico, ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina, rifampicina e vancomicina; 83% a gentamicina e 67% a estreptomicina e tetraciclina. Na praia de Fortaleza 100% das cepas testadas foram resistentes a antibióticos amoxicilina + ácido clavulanico, ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina, e vancomicina; 67% de cepas resistentes à tetraciclina; 33% de cepas resistentes a gentamicina e rifampicina e 0% de cepas resistentes a estreptomicina, todas foram sensíveis a este antibiótico (Figura 69). 100% 50% 100% 100% 0% 100% 0% 100% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 66 Fig.69. Resistência de Escherichia coli em areia seca 100% 100% 100% 100% 67% 100% 100% 100% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 100% 100% 67% 83% 100% 67% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 100% 100% 0% 33% 33% 67% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 67 4.9.11. Primavera-verão-Areia úmida Os testes com as cepas de Escherichia coli de Perequê Mirim mostraram que 100% destas foram resistentes aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulanico, ampicilina, ciprofloxacina, eritromicina, rifampicina e vancomicina; 75% de cepas resistentes à tetraciclina e 25% de cepas resistentes a gentamicina e estreptomicina. Já a praia da Enseada apresentou 100% de cepas resistentes a amoxicilina + ácido clavulanico, ampicilina, eritromicina, rifampicina e vancomicina; 80% de resistência a ciprofloxacina e tetraciclina e 60% de cepas resistentes à estreptomicina e gentamicina. E em Fortaleza 100% das cepas de E.coli foram resistentes a todos os antibióticos testados (Figura 70). Fig.70. Resistência de Escherichia coli em areia úmida 100% 100% 100% 100% 25% 25% 100% 75% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 80% 100% 60% 60% 100% 80% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 68 4.9.12. Primavera-verão-Sargassum sp Das cepas de E.coli isoladas do Sargassum em Perequê Mirim 72% foram resistentes a rifampicina; 43% resistentes à gentamicina; 28% das cepas foram resistentes à estreptomicina e 100% das cepas de E.coli foram resistentes aos demais antibióticos. Na praia da Enseada, 100% foram resistentes à tetraciclina e vancomicina; 75% de cepas resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, eritromicina e rifampicina, 25% resistentes a ciprofloxacina e todas as cepas foram sensíveis à estreptomicina e a gentamicina, ou seja, 0% de cepas resistentes a estes dois antibióticos. Em Fortaleza 67% das cepas testadas foram resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico, 0% de cepas resistentes a gentamicina, todas foram sensíveis a este antibiótico e 100% das cepas foram resistentes aos demais antibióticos (Figura 71). 100% 100% 100% 100% 28% 43% 72% 100% 100% Resistência em Pereque Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 75% 75% 25% 75% 0% 0% 75% 100% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 69 Fig.71. Resistência de Escherichia coli em Sargassum sp 4.10. Resistência a antimicrobianos de Enterococcus sp 4.10.1. Verão-outono-Água Na praia de Perequê Mirim 100% das cepas de Enterococcus sp testadas foram resistentes a estreptomicina, gentamicina e tetraciclina; 50% de cepas de Enterococcus sp resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, eritromicina, rifampicina e vancomicina e todas as cepas foram sensíveis a ciprofloxacina (0% resistentes). Na praia da Enseada 34% de cepas de Enterococcus sp foram resistentes a tetraciclina, 0% de resistentes a ciprofloxacina, ou seja, todas as cepas foram sensíveis a este antibiótico e 66% de cepas resistentes aos demais antibióticos. Em Fortaleza 100% das cepas de Enterococcus sp foram resistentes a quase todos os antibióticos testados com exceção de ciprofloxacina o qual todas as cepas testadas foram sensíveis (Figura 72). 67% 100% 100% 100% 100% 0% 100% 100% 100% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 70 Fig.72. Resistência de Enterococcus sp em água 4.10.2. Verão-outono-Areia seca Em Perequê Mirim das cepas de Enterococcus sp testadas, 100% apresentaram resistência a quase todos os antibióticos com exceção de ciprofloxacina, as quais toda as cepas foram sensíveis (0% resistentes). Na praia da Enseada 60% das cepas foram resistentes aos antibióticos eritromicina, gentamicina e rifampicina; 40% resistentes à estreptomicina, 50% 50% 0% 50% 100% 100% 50% 100% 50% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 66% 66% 0% 66% 66% 66% 66% 34% 66% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 0% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Resistência emFortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 71 tetraciclina e vancomicina; 20% de cepas resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico e ampicilina e todas as cepas foram sensíveis a ciprofloxacina. Já na praia da fortaleza, 50% das cepas foram resistentes a quase todos os antibióticos, com exceção de ciprofloxacina, o qual todas as cepas de Enterococcus testadas foram sensíveis (Figura 73). Fig.73. Resistência de Enterococcus sp em areia seca 100% 100% 0% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 20% 20% 0% 60% 40% 60% 60% 40% 40% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 50% 50% 0% 50% 50% 50% 50% 50% 50% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 72 4.10.3. Verão-outono-Areia úmida Para a praia de Perequê Mirim, 50% das cepas de Enterococcus sp testadas apresentaram resistência a gentamicina, 0% de cepas resistentes a ciprofloxacina, todas sensíveis as este antibiótico e 100% de cepas resistentes aos demais antibióticos. Na praia da Enseada, 100% das cepas foram resistentes a eritromicina; 75% resistentes a rifampicina e a tetraciclina, 25% das cepas de Enterococcus sp resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina e vancomicina e todas as cepas foram sensíveis ao antibiótico ciprofloxacina (0% de resistência). Em Fortaleza as cepas apresentaram sensibilidade a ampicilina e ciprofloxacina com 0% das cepas resistentes a estes dois antibióticos e 50% das cepas foram resistentes aos demais antibióticos testados (Figura 74). Fig.74. Resistência de Enterococcus sp em areia úmida 100% 100% 0% 100% 100% 50% 100% 100% 100% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 25% 25% 0% 100% 50% 50% 75% 75% 25% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 50% 0% 0% 50% 50% 50% 50% 50% 50% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 73 4.10.4. Verão-outono-Sargassum sp Em Perequê Mirim 100% das cepas de Enterococcus sp apresentaram resistência ao antibiótico rifampicina; 60% das cepas foram resistentes a eritromicina, 40% a amoxicilina + acido clavulânico, ampicilina, estreptomicina, gentamicina e vancomicina e 20% das cepas foram resistentes a ciprofloxacina. Na praia da Enseada 100% das cepas de Enterococcus sp foram resistentes a quase todos os antibióticos testados com exceção de ciprofloxacina o qual todas as cepas foram sensíveis. Em Fortaleza não houve coleta de Sargassum nesta estação (Figura 75). Fig.75. Resistência de Enterococcus sp em Sargassum sp 4.10.5. Outono-inverno-Água Em Perequê Mirim as das cepas de Enterococcus sp testadas, 100% apresentaram resistência ao antibiótico rifampicina; 84% das cepas foram resistentes a eritromicina e a estreptomicina; 50% de cepas resistentes a eritromicina; 17% das cepas resistentes a amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina e vancomicina e todas as cepas de Enterococcus 40% 40% 20% 60% 40% 40% 100% 40% 40% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 100% 100% 0% 100% 100% 100% 100% 100% 100% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 74 sp testadas foram sensíveis a ciprofloxacina. Na praia da Enseada 75% das cepas foram resistentes eritromicina, estreptomicina e tetraciclina; 50% das cepas foram resistentes a gentamicina; 34% resistentes a rifampicina e as cepas de Enterococcus apresentaram sensibilidade ( 0% resistentes) aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, ciprofloxacina e vancomicina. Na praia da Fortaleza, 100% das cepas foram resistentes a eritromicina; 67% resistentes à estreptomicina e tetraciclina; todas as cepas testadas apresentaram sensibilidade (0% de cepas de Enterococcus resistentes) aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ampicilina, ciprofloxacina, rifampicina e vancomicina (Figura 76). Fig.76. Resistência de Enterococcus sp em água 17% 17% 0% 50% 84% 84% 100% 84% 17% Resistência em Perequê Mirim AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 0% 0% 0% 75% 75% 50% 34% 75% 0% Resistência em Enseada AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 0% 0% 0% 100% 67% 0% 0% 67% 0% Resistência em Fortaleza AMC AMP CIP ERI EST GEN RIF TET VAN 75 4.10.6. Outono-inverno-Areia seca Na praia de pereque mirim, as cepas apresentaram 75% de resistência para os antibióticos eritromicina, rifampicina e tetraciclina; 50% de cepas resistentes à estreptomicina e a gentamicina; 25% de cepas resistentes a ampicilina e todas as cepas apresentaram sensibilidade (0% de cepas resistentes) aos antibióticos amoxicilina + ácido clavulânico, ciprofloxacina e vancomicina. Em Enseada das cepas de Enterococcus sp 50% apresentaram resistência aos antibióticos eritromicina, estreptomicina, rifampicina e tetraciclina; 75% de cepas resistentes a gentamicina; 25% resistentes a ampicilina e todas as cepas com sensibilidade a amoxicilina + ácido clavulânico, ciprofloxacina e vancomicina. As cepas de Fortaleza apresentaram sensibilidade a quase todos os antibióticos com exceção do antibiótico eritromicina o qual 100% das cepas apresentaram resistência (Figura 77). Fig.77. Resistência de Enterococcus sp em are