Juliana Ferreira Produção de bioetanol utilizando cascas de banana, maracujá e coco verde por co-fermentação de Zymomonas mobilis e Pachysolen tannophilus São José do Rio Preto 2017 Juliana Ferreira Produção de bioetanol utilizando cascas de banana, maracujá e coco verde por co-fermentação de Zymomonas mobilis e Pachysolen tannophilus Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de Concentração – Ciência e Tecnologia de Alimentos, junto ao programa de Pós- Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES - DS Orientador: Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz São José do Rio Preto 2017 Juliana Ferreira Produção de bioetanol utilizando cascas de banana, maracujá e coco verde por co-fermentação de Zymomonas mobilis e Pachysolen tannophilus Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de Concentração – Ciência e Tecnologia de Alimentos, junto ao programa de Pós- Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos, do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de São José do Rio Preto. Financiadora: CAPES - DS COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia-Cruz UNESP - São José do Rio Preto Orientador Prof. Dr. Vanildo Luiz Del Bianchi UNESP - São José do Rio Preto Prof. Dr. Mauricio Boscolo UNESP - São José do Rio Preto Profa. Dra. Sandra Regina Ceccato Antonini UFSCAR - Araras Prof. Dr. Dr. Harvey Alexander Villa Vélez UFMA- São Luiz São José do Rio Preto 24 de março de 2017 AGRADECIMENTOS Ao Prof. Dr. Crispin Humberto Garcia Cruz por abrir as portas do seu laboratório e aceitar-me como sua aluna desde o Mestrado, pelos ensinamentos, pela confiança, paciência, transmissão de tranquilidade e amizade. Aos estagiários Adriano, Amanda e Aline pela colaboração nas análises desse trabalho, pela troca de conhecimentos, além da nossa amizade e alegria compartilhada. Aos meus pais, Anizio e Nida, por nunca terem medido esforços para a minha formação. Ao meu irmão, Fernando, minha cunhada, Mariana, e meus sobrinhos Ana Beatriz e João Pedro por serem meu ponto de apoio. Ao meu namorado, Nivaldo, pelo companheirismo, incentivo e compressão pelas vezes que precisei me ausentar em função do doutorado. À todas as doutorandas, mestrandas e estagiários do laboratório de biopolímeros, agradeço por toda ajuda. Aos professores, Dr. Mauricio Boscolo e Dra. Sandra Regina Ceccato Antonini, os quais fizeram parte da banca de qualificação e muito contribuíram com o desenvolvimento deste trabalho. Aos professores, membros da banca de defesa, que gentilmente aceitaram o convite para avaliar este trabalho. À todos os funcionários da seção de Pós-graduação do IBILCE e do Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos, pela atenção e auxilio prestados. À técnica de laboratório, Tânia, por todo apoio, estando sempre disposta a colaborar com a execução do trabalho. À todas as minhas amigas “adquiridas” em Rio Preto, Ana Karla e Família, Cíntia, Juliana, Lady, Luana, Michelle Coimbra, Michele Menis, Natalia, Vidiany e Tatiane, vocês tornaram tudo mais fácil e feliz. À CAPES pelo apoio financeiro. RESUMO As crises no fornecimento de petróleo, a possibilidade de sua escassez, instabilidade dos preços e, principalmente, os efeitos negativos ao meio ambiente, aumentaram, nos últimos anos, o interesse pela procura de fontes alternativas para produção de energia. A possibilidade de produzir etanol a partir de resíduos lignocelulósicos é um grande atrativo para os pesquisadores, pois reduziria a necessidade em aumentar as áreas plantadas para incremento da produção, a competição direta com a produção de alimentos e o custo de matéria-prima. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi estudar a produção de etanol por culturas individuais e co-culturas de Zymomonas mobilis e Pachysolen tannophilus usando cascas de banana, maracujá e coco verde hidrolisadas. O pré-tratamento ácido, seguido de hidrólise enzimática das cascas de banana, maracujá e coco, promoveram a liberação de 74,1, 87,2 e 13,4 g L -1 de açúcares totais, respectivamente. Foram avaliadas três concentrações de substrato (5, 10 e 15%) e três pH iniciais dos meios de fermentação (4,5; 5,0 e 5,5). Nas fermentações com a bactéria Z. mobilis, com os três resíduos avaliados, foi verificado que o substrato mais concentrado não contribuiu para um aumento significativo da produção de etanol. Além disso, a maior concentração do produto foi de 2,9 g L -1 , obtido nas fermentações de cascas de banana hidrolisadas com concentração de 5%. Já nas fermentações com a levedura P. tannophilus, as maiores produções de etanol foram determinadas utilizando hidrolisado de cascas de maracujá com concentração de sólidos de 10%, proporcionando a produção de 10 g L -1 de etanol. E a associação da bactéria Z. mobilis e da levedura P. tannophilus, no processo de co-cultura, mostrou potencial para a fermentação dos hidrolisados lignocelulósicos. O sistema de inoculação que apresentou melhores resultados foi aquele no qual a bactéria foi inoculada no inicio do processo, e depois de 7 h de fermentação, a levedura foi inoculada. Além do mais, os melhores resultados obtidos com esse sistema foram os das fermentações com cascas de banana hidrolisadas, sendo determinada concentração 11,3 g L -1 de etanol. Palavras-Chaves: etanol, co-fermentação, resíduos lignocelulósicos, hidrolisados, bactéria, levedura. ABSTRACT Crises in oil supply, the possibility of their scarcity, price instability and, especially, the negative effects to the environment have increased the interest in alternative sources for energy production, in recent years. The possibility of producing ethanol from lignocellulosic residues is a great attractive to the researchers, because it would reduce the need for increasing the planted areas to increase production, the direct competition with food production and the high costs of raw materials. In this context, the objective of this work was to study the ethanol production by individual cultures and co-cultures of Zymomonas mobilis and Pachysolen tannophilus using banana, passion fruit and coconut peels hydrolysate. The acid pretreatment, followed by enzymatic hydrolysis of banana, passion fruit and coconut peels promoted the liberation of 74.1, 87.2 and 13.4 g L -1 of total sugars, respectively. Three substrate concentrations (5, 10 and 15%) and three initial pH of fermentation media (4.5; 5.0 and 5.5) were evaluated. In the fermentations with Z. mobilis bacteria, using the three residues, it was found that the most concentrated substrate did not contribute to a significant increase in ethanol production. In addition, the highest product concentration was 2.9 g L -1 , obtained in hydrolysed banana peels fermentations at 5% concentration. In the fermentations with yeast P. tannophilus, the highest ethanol yields were determined using passion fruit peel hydrolysates at 10% solids concentration, providing the ethanol production of 10 g L -1 . And the association of Z. mobilis bacteria and P. tannophilus yeast, in the co-culture process, showed potential for the lignocellulosic hydrolysates fermentation. The inoculation system that showed the best results was the one in which the bacterium was inoculated at the beginning of the process, and after 7 h of fermentation, the yeast was inoculated. Moreover, the best results obtained with this system were those with hydrolysed banana peels fermentations, with 11.3 g L -1 of ethanol concentration. Keywords: ethanol, co-fermentation, lignocellulosic residues, hydrolysate, bacteria, yeast. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Estrutura molecular da celulose...............................................................................24 Figura 2 – Estrutura molecular da hemicelulose.......................................................................25 Figura 3 – Estrutura molecular da lignina.................................................................................26 Figura 4 – Estrutura do coco.....................................................................................................32 Figura 5 – Metabolismo dos carboidratos em Z. mobilis..........................................................35 Figura 6 – Fluxograma da via metabólica de glicose e xilose em leveduras xilose- fermentadoras............................................................................................................................37 Figura 7 – Fluxograma com os fatores avaliados na produção de etanol por Z. mobilis CCT 4494...........................................................................................................................................46 Figura 8 – Fluxograma com os fatores avaliados na produção de etanol por P. tannophilus CCT 1891..................................................................................................................................47 Figura 9 – Liberação de Açúcares Totais (AT) durante a hidrólise enzimática de cascas de banana pré-tratadas...................................................................................................................51 Figura 10 – Liberação de Açúcares Totais (AT) durante a hidrólise enzimática de cascas de maracujá pré-tratadas................................................................................................................52 Figura 11 – Cascas de coco verde, trituradas e desidratadas....................................................53 Figura 12 – Avaliação do açúcar residual (g L -1 ) e da produção de etanol, durante a fermentação de glicose por Z. mobilis, incubada a 30ºC, sem agitação, por 12 h....................56 Figura 13 – Relação entre pH final e crescimento celular de Z. mobilis na fermentação da glicose, incubada a 30ºC, sem agitação, por 12 h.....................................................................57 Figura 14 – Produção de etanol pela levedura P. tannophilus, por 24 h, durante o processo de fermentação estática e com agitação de 100 rpm, incubada a temperatura de 30ºC utilizando glicose como substrato do meio sintético.................................................................................60 Figura 15 – Crescimento celular da levedura P. tannophilus durante 24 h de fermentação utilizando glicose com substrato do meio sintético, incubada a 30ºC, com agitação de 100 rpm e sem agitação...........................................................................................................................61 Figura 16 - Determinação do pH final da fermentação utilizando glicose com substrato do meio sintético, pela levedura P. tannophilus durante 24 h, incubada a 30ºC, com agitação de 100 rpm e sem agitação.............................................................................................................61 Figura 17 – Produtividade de etanol da levedura P. tannophilus para os dois ensaios realizados, com agitação de 100 rpm e sem agitação, incubada a 30 o C por 24 h.....................62 Figura 18 – Efeito de diferentes concentrações de glicose usadas como substrato do meio sintético e do pH inicial sobre a produção de etanol por Z. mobilis, incubada a 30ºC, por 7 h e agitação de 50 rpm....................................................................................................................64 Figura 19 – Efeito do pH inicial e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de casca de banana usado como substrato sobre a produção de etanol por Z. mobilis, incubada a 30ºC, por 7 h e agitação de 50 rpm...........................................................................................66 Figura 20 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de casca de maracujá usado como substrato na produção de etanol pela bactéria Z. mobilis, incubada a 30ºC, por 7 h e agitação de 50 rpm...........................................................68 Figura 21 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de cascas de coco usado como substrato na produção de etanol pela bactéria Z. mobilis, incubada a 30ºC, por 7 h e agitação de 50 rpm...........................................................71 Figura 22 – Efeito de diferentes concentrações de glicose usadas como substrato do meio sintético e do pH inicial sobre a produção de etanol por P. tannophilus, incubada a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm.......................................................................................................74 Figura 23 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de casca de banana usado como substrato na produção de etanol por P. tannophilus, incubada a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm................................................76 Figura 24 – Efeito do pH inicial e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de cascas de maracujá usado como substrato na produção de etanol por P. tannophilus, incubada a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm....................................................................................78 Figura 25 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de cascas de coco usado como substrato na produção de etanol por P. tannophilus, incubada a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm.....................................................................80 Figura 26 – Efeito de diferentes concentrações de glicose usadas como substrato do meio sintético e do pH inicial sobre a produção de etanol por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), incubada a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm........................82 Figura 27 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de cascas de banana usado como substrato na produção de etanol empregando a co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), incubada a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm................................................................................................................................84 Figura 28 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de cascas de maracujá usado como substrato na produção de etanol, empregando a co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), incubada a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm................................................................................................................................87 Figura 29 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de cascas de coco usado como substrato na produção de etanol por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), incubada a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm............................................................................................................................................89 Figura 30 – Efeito de diferentes concentrações de glicose usadas como substrato do meio sintético e do pH inicial sobre a produção de etanol por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 2), incubada a 30ºC, sob agitação de 100 rpm...................................91 Figura 31 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de cascas de banana usado como substrato na produção de etanol por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 2), incubada a 30ºC, sob agitação de 100 rpm......94 Figura 32 – Efeito do pH inicial do meio e da adição de diferentes concentrações do hidrolisado de cascas de maracujá usado como substrato na produção de etanol por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 2), incubada a 30ºC, sob agitação de 100 rpm......96 Figura 33 – Produção de etanol e açúcares residuais da fermentação do meio sintético, usando glicose como substrato, conduzida em biorreator por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), incubada a 30ºC, agitação de 100 rpm, por 96 h..............................................98 Figura 34 – Produção de etanol e açúcares residuais apresentados na fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de banana, conduzida em biorreator, empregando a co- cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 2), incubada a 30ºC, agitação de 100 rpm, por 72 h...................................................................................................................................100 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Enzimas e dosagens recomendadas e empregadas nos ensaios de hidrólise enzimática das cascas de banana, maracujá e coco verde.........................................................40 Tabela 2 – Meio de manutenção do micro-organismo P. tannophilus CCT 1891....................42 Tabela 3 – Meio de manutenção do micro-organismo Z. mobilis CCT 4494...........................42 Tabela 4 – Composição do Meio Sintético...............................................................................44 Tabela 5 – Concentração de Sólidos Totais (ST) e Compostos Fenólicos (CF) determinados antes e após o tratamento de detoxificação do hidrolisado das cascas de banana, maracujá e coco...........................................................................................................................................54 Tabela 6 – pH final, biomassa, substrato consumido e concentrações de etanol determinadas durante a avaliação da influência da agitação na produção de etanol por Z. mobilis, utilizando glicose como substrato do meio sintético, durante 7 h, a 30ºC.................................................58 Tabela 7 – Crescimento celular, pH final, substrato consumido, produtividade e rendimento da fermentação da glicose utilizada como substrato do meio sintético por Z. mobilis, a 30ºC, por 7 h e agitação de 50 rpm...........................................................................................................65 Tabela 8 – Crescimento celular, pH final, substrato consumido, produtividade e rendimento da fermentação no meio composto pelo hidrolisado de cascas de banana por Z. mobilis, a 30ºC, por 7 h e agitação de 50 rpm....................................................................................................................................67 Tabela 9 – Crescimento celular, pH final, substrato consumido, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de maracujá por Z. mobilis, a 30ºC, por 7 h e agitação de 50 rpm............................................................................ ...............................................69 Tabela 10 – Crescimento celular, pH final, substrato consumido, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de coco por Z. mobilis, a 30ºC, por 7 h e agitação de 50 rpm.....................................................................................................72 Tabela 11 – Crescimento celular, pH final, substrato consumido, produtividade e rendimento da fermentação da glicose usada como substrato do meio sintético por P. tannophilus, a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm.................................................................................................75 Tabela 12 – Crescimento celular, pH final, substrato consumido, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de banana por P. tannophilus, a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm.......................................................................................77 Tabela 13 – Crescimento celular, pH final, substrato consumido, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de maracujá por P. tannophilus, a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm....................................................................................79 Tabela 14 – Crescimento celular, pH final, substrato consumido, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de coco por P. tannophilus, a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm.......................................................................................81 Tabela 15 – Crescimento celular, pH final, consumo de açúcares, produtividade e rendimento da fermentação glicose usada como substrato do meio sintético por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm...................................83 Tabela 16 – Crescimento celular, pH final, consumo de açúcares, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de banana por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm....................85 Tabela 17 – Crescimento celular, pH final, consumo de açúcares, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo caldo hidrolisado de cascas de maracujá por co- cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm............................................................................................................................................88 Tabela 18 – Crescimento celular, pH final, consumo de açúcares, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo caldo hidrolisado de cascas de coco, por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), a 30ºC, por 19 h e agitação de 100 rpm...............90 Tabela 19 – Crescimento celular, pH final, consumo de açúcares, produtividade e rendimento da fermentação da glicose usada como substrato do meio sintético, por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 2), a 30ºC e agitação de 100 rpm...................................92 Tabela 20 – Crescimento celular, pH final, consumo de açúcares, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de banana por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 2), a 30ºC e agitação de 100 rpm...................................95 Tabela 21 – Crescimento celular, pH final, consumo de açúcares, produtividade e rendimento da fermentação do meio composto pelo hidrolisado de cascas de maracujá, por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 2), a 30ºC e agitação de 100 rpm...............................97 Tabela 22 – Valores médios de biomassa (g L -1 ), açúcares totais (g L -1 ), produtividade e rendimento da fermentação utilizando glicose como substrato do meio sintético, realizada em fermentador de 5 L, por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co-cultura 1), a 30ºC, agitação de 100 rpm, por 96 h...................................................................................................99 Tabela 23 – Valores médios de biomassa (g L -1 ), açúcares totais (g L -1 ), produtividade e rendimento da fermentação realizada com meio composto por hidrolisado de cascas de banana, em fermentador de 5 L, empregando a co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus (Co- cultura 2), a 30ºC, agitação de 100 rpm, por 72 h...................................................................101 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 19 2 OBJETIVOS ........................................................................................................................ 21 2.1 Geral ................................................................................................................................ 21 2.2 Específicos ...................................................................................................................... 21 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................... 22 3.1 Etanol .............................................................................................................................. 22 3.2 Biomassa lignocelulósica ................................................................................................ 23 3.3 Produção de bioetanol a partir de resíduos lignocelulósicos .......................................... 26 3.3.1 Pré-tratamento .......................................................................................................... 26 3.3.2 Hidrólise enzimática ................................................................................................. 28 3.4 Detoxificação .................................................................................................................. 28 3.5 Casca de banana .............................................................................................................. 29 3.6 Casca de maracujá .......................................................................................................... 30 3.7 Casca de coco verde ........................................................................................................ 31 3.8 Micro-organismos ........................................................................................................... 33 3.8.1 Zymomonas mobilis .................................................................................................. 33 3.8.2 Micro-organismos fermentadores de pentoses ......................................................... 36 3.8.3 Pachysolen tannophilus............................................................................................ 37 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 39 4.1 Matéria-prima ................................................................................................................. 39 4.1.1 Preparo da matéria-prima ......................................................................................... 39 4.2 Pré-tratamento da biomassa ............................................................................................ 39 4.3 Hidrólise enzimática da biomassa ................................................................................... 40 4.4 Detoxificação .................................................................................................................. 41 4.5 Micro-organismos ........................................................................................................... 41 4.5.1 Meio de manutenção ................................................................................................ 41 4.5.2 Preparo do pré-inóculo ............................................................................................. 42 4.5.3 Pré-fermentação ....................................................................................................... 42 4.5.4 Padronização do inóculo .......................................................................................... 43 4.6 Meios de fermentação ..................................................................................................... 43 4.6.1 Meio sintético ........................................................................................................... 43 4.6.2 Meio contendo os hidrolisados lignocelulósicos ...................................................... 44 4.7 Condições de fermentação .............................................................................................. 44 4.7.1 Testes preliminares ................................................................................................... 44 4.7.1.1 Parâmetros cinéticos da bactéria Z. mobilis .......................................................... 44 4.7.1.2 Parâmetros cinéticos da levedura P. tannophilus .................................................. 45 4.7.2 Parâmetros das fermentações ................................................................................... 45 4.8 Co-cultura ....................................................................................................................... 48 4.9 Métodos analíticos .......................................................................................................... 48 4.9.1 Determinação dos sólidos totais ............................................................................... 48 4.9.2 Determinação do pH final ........................................................................................ 48 4.9.3 Determinação da concentração celular ..................................................................... 48 4.9.4 Determinação de etanol ............................................................................................ 49 4.9.5 Determinação de açúcares totais (AT) ..................................................................... 49 4.9.6 Determinação de açúcares redutores (AR) ............................................................... 49 4.9.7 Determinação dos teores de compostos fenólicos .................................................... 49 4.10 Análises estatísticas ...................................................................................................... 50 4.11 Parâmetros de fermentação ........................................................................................... 50 4.11.1 Fator de conversão do substrato em etanol ................................................................ 50 4.11.2 Produtividade em etanol ............................................................................................ 50 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ........................................................................................ 51 5.1 Ensaios de hidrólise ........................................................................................................ 51 5.1.1 Cascas de banana ...................................................................................................... 51 5.1.2 Cascas de maracujá .................................................................................................. 52 5.1.3 Casca de coco ........................................................................................................... 53 5.1.4 Detoxificação ........................................................................................................... 54 5.2 Ensaios de fermentação................................................................................................... 55 5.2.1 Parâmetros cinéticos da bactéria Zymomonas mobilis ............................................. 55 5.2.2 Parâmetros cinéticos da levedura Pachysolen tannophilus ...................................... 59 5.3 Fermentações com a bactéria Zymomonas mobilis ......................................................... 62 5.3.1 Meio sintético ........................................................................................................... 63 5.3.2 Hidrolisado de casca de banana ............................................................................... 65 5.3.3 Hidrolisado de casca de maracujá ............................................................................ 68 5.3.4 Hidrolisado de casca de coco ................................................................................... 70 5.4 Fermentações com a levedura P. tannophilus ................................................................ 73 5.4.1 Meio sintético ........................................................................................................... 73 5.4.2 Hidrolisado de casca de banana ............................................................................... 75 5.4.3 Hidrolisado de casca de maracujá ............................................................................ 77 5.4.4 Hidrolisado de casca de coco ................................................................................... 79 5.5 Ensaios de Co-cultura ..................................................................................................... 81 5.5.1 Co-cultura Z. mobilis e P. tannophilus inoculados juntos no inicio da fermentação (Co-cultura 1) .................................................................................................................... 82 5.5.1.1 Meio sintético ........................................................................................................ 82 5.5.1.2 Hidrolisado de casca de banana ............................................................................ 84 5.5.1.3 Hidrolisado de Casca de maracujá ........................................................................ 86 5.5.1.4 Hidrolisado de Casca de coco ............................................................................... 88 5.5.2 Co-cultura de Z. mobilis inoculada no inicio e P. tannophilus inoculada depois de 7 h de fermentação (Co-cultura 2)........................................................................................ 90 5.5.2.1 Meio Sintético ....................................................................................................... 90 5.5.2.2 Hidrolisado de Casca de banana............................................................................ 93 5.5.2.3 Hidrolisado de Casca de maracujá ........................................................................ 95 5.6 Fermentações em biorreator ............................................................................................ 97 5.6.1 Meio Sintético .......................................................................................................... 98 5.6.2 Casca de Banana..................................................................................................... 100 6 CONCLUSÕES .................................................................................................................. 103 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................ 104 ANEXOS ............................................................................................................................... 112 APÊNDICES ......................................................................................................................... 113 19 1 INTRODUÇÃO Os biocombustíveis têm sido objeto de grande interesse nos últimos anos, uma vez que sua utilização contribui para reduzir a emissão de gases ligados ao efeito estufa e, portanto, para a mitigação do aquecimento global. Além disso, seu uso poderia constituir uma das alternativas ao petróleo, cuja oferta mundial deverá sofrer consideráveis restrições no futuro próximo. O termo biocombustível refere-se a combustíveis líquidos ou gasosos com aplicação no setor de transporte e predominantemente produzidos de biomassa. Dentre os principais combustíveis produzidos a partir destes recursos naturais, pode-se destacar o etanol. No entanto, os biocombustíveis enfrentam uma limitação fundamental na sua produção: originam-se, em geral, de plantações que exigem áreas de cultivo extensas. Para amenizar esse problema, têm se desenvolvido processos biotecnológicos que permitem a utilização de biomassas residuais de composição lignocelulósica, abundantemente geradas nos setores agrícolas e florestais. O Brasil destaca-se como um dos maiores produtores agrícolas do mundo e, em consequência disso, gera grandes quantidades de resíduos agroindustriais. Dentre os possíveis usos desses resíduos (cascas, folhas, bagaço e palhas), pode-se destacar sua aplicação como biomassa para a produção de Bioetanol de Segunda Geração. A produção de bioetanol, com base na biomassa lignocelulósica, utiliza processos químicos (empregando bases ou ácidos) e biológicos (empregando enzimas), para a quebra de moléculas de celulose e hemicelulose e liberação de açúcares, para então produzir o etanol por meio de processos fermentativos. Entretanto, não há um único micro-organismo que possa converter, eficientemente, os açúcares (hexoses e pentoses) contidos nos hidrolisados hemicelulósicos, para isso o processo fermentativo requer micro-organismos fermentadores de hexoses e pentoses, em particular da xilose. O emprego da “Co-cultura” é uma opção bastante interessante, pois utiliza dois micro-organismos simultaneamente em um único sistema de fermentação. Pode-se utilizar um fermentador de hexoses, como a bactéria Zymomonas mobilis, que apresenta grande potencial industrial para a produção de etanol, e, ao mesmo tempo, um fermentador de pentoses. Os micro-organismos naturalmente capazes de fermentar pentoses incluem algumas linhagens de leveduras como Pichia stipitis, Candida shehatae, Spathaspora arborariae e Pachysolen tannophilus. Dentre essas espécies, a P. tannophilus tem recebido grande 20 destaque por apresentar altos rendimentos na produção de etanol a partir da fermentação de xilose. Com base nos argumentos anteriores ressalta-se a importância do estudo de co-cultura para melhorar o rendimento fermentativo e posterior produção de etanol através do uso de resíduos lignocelulósicos e co-culturas de micro-organismos, bactérias e leveduras. 21 2 OBJETIVOS 2.1 Geral Estudar a produção de etanol por co-culturas de Z. mobilis e P. tannophilus a partir de hidrolisados hemicelulósicos, usando cascas de banana, maracujá e coco verde. 2.2 Específicos  Avaliar o efeito da hidrólise enzimática nas cascas de banana, maracujá e coco verde a serem utilizados como substrato;  Estudar a produção de etanol com culturas puras de Z. mobilis e P. tannophilus;  Estudar a produção de etanol por co-cultura de Z. mobilis e P. tannophilus;  Avaliar a produção de etanol utilizando meio sintético e caldo hidrolisado obtido de cascas de banana, maracujá e coco verde, pelo estudo dos efeitos dos seguintes parâmetros: pH e diferentes concentrações de substrato;  Utilizar os melhores parâmetros para ampliação da escala de produção de etanol. 22 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 Etanol A produção de biocombustíveis foi insignificante até o fim da década de 1970. De fato, o etanol era, até esse período, utilizado essencialmente como insumo para as indústrias de bebidas e alguns segmentos da indústria química. A totalidade da produção mundial de etanol – quase todo destinado a usos não energéticos equivalia a menos de um milésimo da extração de petróleo. Este panorama mudou sensivelmente com a implantação pelo Governo Brasileiro, em 1975, do Programa Nacional do Álcool – Proálcool (ROSA; GARCIA, 2009). Em resposta às crises do petróleo nos anos 70 e 80, foram feitas diversas tentativas em todo o mundo para substituir derivados do petróleo por fontes renováveis. A única experiência de grande porte, com êxito, foi o uso energético da cana-de-açúcar, no Brasil. O Proálcool provocou o primeiro grande impacto no setor sucroalcooleiro brasileiro, gerando a primeira grande onda transformista. O Proálcool teve por objetivo criar uma fonte alternativa de combustível para veículos providos de motor a explosão com ciclo Otto, e fomentar a criação de empregos no Brasil. Este programa, apesar de suas falhas, injetou considerável soma de capital no setor, fomentando o início do desenvolvimento tecnológico em todos os segmentos econômicos relacionados com a produção de álcool a partir da cana-de-açúcar, principalmente (SOARES; ROSSELL, 2007). Em apenas dez anos o álcool já superava a gasolina como combustível automotivo, e reduzia o impacto na balança comercial de dezenas de bilhões de dólares. Isto exigiu transformações radicais do mercado consumidor, do setor produtivo e de logística para introduzir em todo o território um novo combustível líquido. Investimentos em desenvolvimento tecnológico aumentaram a produtividade agrícola e industrial. Melhorou, também, a eficiência de conversão do caldo da cana em álcool, que se aproxima dos limites teoricamente possíveis (ERBER; HOLLANDA, 2007). Após um período de estagnação de cerca de 15 anos, motivada, essencialmente, pela queda dos preços do petróleo, a produção mundial de etanol voltou a crescer acentuadamente. Um dos fatores que explicam esse crescimento foi, a partir de 2003, a introdução dos veículos com motor flex no Brasil (ROSA; GARCIA, 2009). Mais recentemente, a percepção do risco de catástrofes climáticas provocadas pelo aquecimento global propiciou grande aumento na demanda por biocombustíveis. Tal aumento 23 se manifesta, principalmente, pela introdução ou aumento de metas de utilização de combustíveis de origem orgânica em diferentes países (ROSA; GARCIA, 2009). O novo conceito de etanol (ou bioetanol) corresponde a sua fabricação utilizando como matéria-prima a biomassa lignocelulósica. Essas matérias-primas provenientes de sobras e resíduos de produtos naturais (como o sabugo e a palha do milho, o bagaço, as pontas e as palhas da cana-de-açúcar, cascas de frutas, entre outros) são fundamentais para a expressiva ampliação pretendida da produção de etanol, que hoje esbarraria em limitações para expansão da área plantada, seja por competir com a produção de alimentos, seja pelo nível de seus preços relativos frente ao petróleo e aos próprios alimentos (BASTOS, 2007). Com o crescimento econômico e populacional, consequentemente, com o aumento no número de veículos, houve um aumento na demanda global por energia, e com isso a necessidade energética tornou-se um problema comum em todo o mundo. Há uma previsão de que o crescimento na produção de petróleo e gás não corresponderá à taxa de demanda projetada para 2040-2050, uma vez que a demanda por petróleo vai passar de 85 Mb.dia -1 (Milhões de barris por dia) em 2008 para 105 Mb.dia -1 em 2030, e posteriormente para valores maiores, ao passo que o número de veículos vai passar de 1,3 bilhões em 2030 para 2 bilhões em 2050 (BRADSHAW, 2010). Diante de todos esses fatores, como a necessidade de redução na emissão de poluentes, necessidade energética, alta nos preços do barril do petróleo e limitações de área para cultivo de matéria-prima para produção de etanol, é de extrema necessidade que outras fontes alternativas para produção de combustiveis sejam utilizadas. Dentro desse panorama, a produção de etanol combustível a partir da biomassa lignocelulósica apresenta-se como uma das mais importantes e vantajosas tecnologias para a produção sustentável de combustíveis (SUKUMARAN et al., 2009). 3.2 Biomassa lignocelulósica Entende-se por biomassa toda a matéria-prima derivada de organismos vivos que abrange uma extensa variedade de materiais que podem ser disponibilizados como matérias- primas para produção de combustíveis ou para diversos fins. Pode-se considerar um recurso natural renovável em curto prazo, tendo como principais vantagens o baixo custo, além de permitir o aproveitamento dos resíduos, sendo menos poluente que outras opções energéticas (SCHULZ, 2010). 24 A biomassa lignocelulósica é um material abundante na natureza, não compete com a produção de alimentos, além de estar disponível como resíduos agrícolas, florestais e industriais. A lignocelulose é o principal componente da parede celular de plantas, é composta principalmente por celulose (40-60% do peso seco total), hemicelulose (20-40%) e lignina (10-25%). A celulose, representada na Figura 1, é o polissacarídeo mais abundante na natureza, é a base estrutural das células das plantas, e é a substância natural mais importante produzida por organismos vivos. As moléculas de celulose são constituídas de monômeros de glicose, unidas através de ligações glicosídicas (β-1,4), tendo entre 2.000-25.000 unidades de glicose, resultando em um polímero de alto peso molecular (BAEYENS et al., 2015). Figura 1 - Estrutura molecular da celulose. Fonte: FERREIRA; ROCHA; SILVA (2009). Cada resíduo de glicose está orientado em 180º em relação ao próximo resíduo. As ligações de hidrogênio intramoleculares mantêm a rede mais fixa e com características hidrofóbicas. As interações de Van der Waals entre as cadeias poliméricas formam zonas com estruturas cristalinas, em sua maioria, bastante ordenadas, que não permitem a água penetrar no seu interior. Porém, outras zonas amorfas e secas podem absorver água e tornar a celulose macia e flexível. Apesar da natureza higroscópica das moléculas individuais de celulose, a absorção de moléculas de água só é possível nas zonas amorfas devido à falta de espaços vazios na estrutura cristalina. A organização cristalina da celulose influencia a sua reatividade ao controlar o acesso de substâncias químicas ou enzimas aos grupos funcionais e às ligações químicas nas regiões cristalinas (NISHIYAMA et al., 2003). Os processos de dissolução da celulose começam com a degradação das fibras e estruturas fibrilares e resulta na completa desintegração modificando o comprimento das cadeias. A degradação da estrutura supramolecular ocorre pela inserção de grupos químicos que quebram as ligações intermoleculares e solvatam as moléculas deslocadas da cadeia (MARABEZI, 2009). A hemicelulose, representada na Figura 2, é formada por uma classe heterogênea de polímeros, contendo uma mistura de pentoses (β-D-xilose, α-L-arabinose), hexoses (β-D- 25 glicose, β-D-manose, α-D-galactose) e/ou ácidos urônicos (α-D-glucurônicos, α-D-4-O- metilgalacturônico e ácidos α-D-galacturônicos). Outros açúcares também podem estar presentes em menores quantidades, como a α-L-ramnose e a α-L-fucose (GÍRIO et al., 2010). As hemiceluloses não são cristalinas e encontram-se intercaladas às microfibrilas da celulose, dando elasticidade e impedindo que elas se toquem, variam nas estruturas e nas composições dependendo da fonte natural (FERREIRA; ROCHA; SILVA, 2009). Figura 2 - Estrutura molecular de fragmento da hemicelulose. Fonte: FERREIRA; ROCHA; SILVA (2009). Já a estrutura química da fração de lignina, representada na Figura 3, não está relacionada a moléculas simples de açúcar, não sendo pretendida para a produção de bioetanol por rotas fermentativas. Essa fração, no entanto, desempenha um papel fundamental para o sucesso da tecnologia de hidrólise (NOGUEIRA et al., 2008). Sua presença representa um importante problema para o processo de conversão da biomassa, porque a estrutura física da lignocelulose é intrinsecamente resistente ao ataque enzimático, especialmente celulose, a qual é protegida pela matriz circundante de lignina, hemicelulose e pectina (OGEDA; PETRI, 2010). Apesar de ser possível produzir diversos produtos com base na lignina, atualmente o foco dos estudos tem se voltado para o uso desse material como fonte de energia para os processos, o que garantiria a auto-suficiência e, eventualmente, até a possibilidade de exportar alguma energia elétrica excedente (NOGUEIRA et al., 2008). 26 Figura 3 - Estrutura molecular de fragmento da lignina. Fonte: FERREIRA; ROCHA; SILVA (2009). 3.3 Produção de bioetanol a partir de resíduos lignocelulósicos A produção de etanol combustível a partir da biomassa lignocelulósica está emergindo como uma das mais importantes tecnologias para a produção sustentável de combustíveis (SUKUMARAN et al., 2009), uma vez que representam uma importante fonte de açúcares fermentescíveis para a produção destes biocombustíveis e existem em grande disponibilidade (EL-ZAWAWY et al., 2011). Para o melhor aproveitamento do material lignocelulósico para a produção de bioetanol, são necessários três processos, o pré-tratamento, a hidrólise enzimática e a fermentação. O pré-tratamento é o processo inicial e mais importante, pois promove a separação da celulose do resíduo agro-industrial. A segunda etapa é a hidrólise enzimática, que também é importante, pois hidrolisa os polissacarídeos em açúcares fermentescíveis e, por último, é necessário realizar a fermentação, para converter esses açúcares em etanol (GUPTA; PRAKASH, 2015). 3.3.1 Pré-tratamento A hidrólise da celulose para glicose em meio aquoso, catalisada por enzimas celulolíticas, possui uma taxa de rendimento muito baixa, principalmente devido à cristalinidade da celulose, baixa área superficial acessível, proteção pela lignina e 27 hemicelulose, aos graus de polimerização da celulose e de acetilação da hemicelulose (TAHERZADEH; KARIMI, 2008), em conjunto dificultam o acesso aos sítios ativos do substrato. A dificuldade aumenta também porque algumas celulases se adsorvem fisicamente sobre ligninas. Além disso, a lignina restringe a hidrólise, pois esconde a superfície celulósica impedindo o intumescimento das fibras. Logo, torna-se necessário o processo chamado pré- tratamento para romper a cristalinidade das fibras lignocelulósicas e remover lignina, expondo as moléculas de celulose e hemicelulose à ação enzimática (OGEDA; PETRI, 2010). Vários métodos de pré-tratamentos têm sido propostos e desenvolvidos. Esses métodos podem ser classificados de diferentes formas, pré-tratamentos físicos, químicos, biológicos ou uma combinação destes no intuito de reduzir a recalcitrância da biomassa lignocelulósica (SUN; CHENG, 2002). A hidrólise ácida é utilizada no pré-tratamento da biomassa, promovendo a quebra da matriz lignocelulósica e hidrólise da hemicelulose, resultando na liberação de quantidade significativa de pentoses, principalmente xilose e, monômeros de glicose que também podem ser liberados nessa etapa. Além disso, o pré-tratamento reduz o grau de cristalinidade das cadeias de celulose e aumenta a porção de celulose amorfa, a qual é mais susceptível à hidrólise (ALZATE; TORO, 2006). Propriedades como o tamanho, a forma, a porosidade, o grau de polimerização, a área superficial, a conformação molecular e a cristalinidade são fatores que influenciam na hidrólise da celulose, sendo que estes dependerão da origem e dos processos a que esse polissacarídeo for submetido (CHANG; HOLTZAPPLE, 2000). Durante a hidrólise com ácidos diluídos, o material lignocelulósico é misturado com um ácido (H2SO4, tipicamente) diluído em água - catalisador - e aquecido por certo tempo. Os grupos acetila ligados à hemicelulose são clivados e também atuam como catalisadores da hidrólise. Grande parte da hemicelulose é removida. Por outro lado, a remoção da lignina ocorre de maneira bastante limitada. Embora haja fusão e despolimerização desta fração durante o pré-tratamento, também há repolimerização e redistribuição superficial intensa. Estas reações acarretam em alterações radicais na estrutura da parede celular vegetal, favorecendo a acessibilidade das enzimas para a hidrólise subseqüente da celulose (LI; HENRIKSSON; GELLERSTEDT, 2007; SCHELL et al., 2004). 28 3.3.2 Hidrólise enzimática A hidrólise enzimática é uma das rotas utilizadas para aumentar a eficiência do pré- tratamento. A hidrólise dos materiais lignocelulósicos é conduzida utilizando enzimas celulases, que são altamente específicas. Os três maiores grupos de celulases que estão envolvidos no processo de hidrólise são as endoglucanases, que atacam regiões de baixa cristalinidade na fibra celulósica, as exoglucanases, que degradam ainda mais a molécula separando as unidades de celobiose e as β-glucosidases, que hidrolisam a celobiose liberando glicose (SUN; CHENG, 2002). Muitos fatores podem afetar a hidrólise enzimática da celulose, como por exemplo, a concentração de substrato, a atividade da celulase e as condições da reação (temperatura, pH, bem como outros parâmetros). Para melhorar o rendimento e a taxa de hidrólise, é necessário otimizar o processo e reforçar a atividade das celulases (SUN; CHENG, 2002). Essa etapa é considerada de grande potencialidade devida a sua baixa toxicidade, ao baixo custo de operação e menos problemas de corrosão em comparação com a hidrólise ácida ou alcalina. Além disso, no processo de hidrólise enzimática não são formados sub- produtos tóxicos (GUPTA; PRAKASH, 2015). No entanto, ainda enfrenta vários gargalos tecnológicos; destes, o principal é o elevado custo das enzimas utilizadas no processo (STROPARO et al., 2012). 3.4 Detoxificação Uma das dificuldades associada ao processo de hidrólise é a formação de subprodutos da degradação de açúcares e lignina, os quais são tóxicos para os micro-organismos fermentativos, inibindo seu metabolismo. Durante a hidrólise ácida do material lignocelulósico, além dos açúcares, também são formados ácidos alifáticos (ácido acético, fórmico e levulínico), derivados de furano, furfural e 5-hidroximetilfurfural (HMF), e compostos fenólicos (CHANDEL et al., 2007). Os furanos (furfural e HMF) são compostos que afetam os micro-organismos, pois reduzem suas atividades enzimáticas e biológicas, quebram o DNA e inibem a síntese de RNA e proteínas (MODIG; LIDÉN; TAHERZADEH, 2002). Os tipos de compostos tóxicos e a sua concentração no caldo hidrolisado dependem da matéria-prima e das condições operacionais empregadas na hidrólise. Dessa forma, é interessante que o processo de hidrólise seja otimizado para minimizar a formação de 29 inibidores e que se usem processos de purificação do caldo hidrolisado antes da fermentação. Em geral, a fermentação de hidrolisados não tratados é caracterizada por cinética lenta, rendimento e produtividade limitados. Vários tipos de processos de purificação do hidrolisado já foram propostos, como por exemplo, o tratamento do hidrolisado com carvão ativado (MUSSATTO; ROBERTO, 2004a). Quando se mistura um sólido finamente moído em uma solução diluída corada, observa-se que a intensidade da coloração decresce pronunciadamente. O corante é adsorvido sobre a superfície do sólido. A intensidade do efeito depende da temperatura, da natureza da substância adsorvida, da natureza e agregação do adsorvente (o sólido finamente dividido) e da concentração do corante (CASTELLAN, 1999). O tratamento do hidrolisado lignocelulósico utilizando carvão ativo baseia-se na capacidade deste material poroso, de origem vegetal, de adsorver sobre sua superfície diferentes tipos de moléculas, as quais são retidas na superfície por interações físicas fracas denominadas forças ou interações de Van der Waals. Estas interações são resultantes de uma atração intermolecular de tal modo que seu potencial é, basicamente, uma função da área superficial do material. Dentre vários materiais comumente usados em processos de adsorção física, o carvão ativo apresenta a maior área superficial, podendo variar entre 600 e 1600 m 2 g -1 , dependendo da matéria-prima empregada para sua fabricação (CONSIDINE, 1974 apud CARVALHO, 2005). 3.5 Casca de banana Dentre os produtos agrícolas brasileiros, destaca-se a produção e consumo da banana. A cultura da banana ocupa o segundo lugar em volume de frutas produzidas no Brasil, perdendo apenas para a laranja. Segundo IBGE, a produção de banana na safra de 2016 foi de 6,9 milhões de toneladas, em uma área de, aproximadamente, 514 mil hectares, apresentando um rendimento médio de 15 kg/ha. Considerando que a porcentagem da produção de banana que é industrializada neste país é de 3% (FOLEGATTI; MATSUURA, 2008), e que a casca da banana corresponde a 40% do seu peso, tem-se uma geração de resíduo industrial anual de 86 mil toneladas de cascas de banana. Além disso, das bananas que são colhidas nas lavouras, somente cerca de 40 a 50% chegam efetivamente às mãos dos consumidores (SANCHES et al., 2004). O resto é perdido em diversas fases, desde o plantio até o consumidor final. Segundo Mesquita et al. (2009), o processamento da banana apresenta-se como alternativa para o aproveitamento dos frutos excedentes ou fora dos padrões exigidos pelo 30 mercado, possibilitando a redução de perdas pós-colheita e representando uma forma de aumentar a vida de prateleira e agregar valor ao produto. A casca de banana apresenta alto teor de carboidratos, que são facilmente metabolizados por micro-organismos devido à sua natureza orgânica, é uma fonte rica em amido (3%), lignina (6-12%), pectina (10-21%), celulose (7,6-9,6%) e hemicelulose (6,4- 9,4%) (MOHAPATRA; MISHRA; SUTAR, 2010). Esses fatores aliados ao seu baixo custo e alta disponibilidade tornam a casca de banana um interessante resíduo lignocelulósico que pode ser convertido em bioetanol (ESSIEN; AKPAN; ESSIEN, 2005). Schulz (2010) em seu estudo de produção de etanol a partir de rejeitos (polpa e cascas) de banana, com fermentação em biorreator, obteve uma produção de etanol na ordem de 7,9 e 7,1 g L -1 , com o uso de cascas in natura, com concentrações iniciais de açúcares totais de 19,5 e 12,2 g L -1 , respectivamente. 3.6 Casca de maracujá O Brasil é o principal produtor e consumidor mundial de maracujá. Conforme censo do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2016), o país produziu 690 mil toneladas de maracujá em 2015 e a região Nordeste detiveram 65% dessa produção, sendo a Bahia o destaque, com produção de 297 mil toneladas, seguido pelo Ceará com 93 mil toneladas. O maracujá pode ser consumido in natura, mas a maior parte das frutas produzidas é destinada a indústria, principalmente para a extração de suco. O suco, além de ser consumido no mercado interno, é também exportado. Os frutos podem ainda ser processados como polpa, geléia, néctar, dentre outros (LIMA et al., 2006). A fruta in natura e o suco são produtos muito apreciados em função de suas características sensoriais (MACORIS et al., 2011). As cascas e as sementes de maracujá, provenientes do processo de corte e extração da polpa para obtenção do suco, são, ainda, em grande parte, descartadas e representam cerca de 40% do peso total do fruto. Como este descarte representa inúmeras toneladas, agregar valor a esses subprodutos é de interesse econômico, científico e tecnológico (CARVALHO et al., 2005; FERRARI; COLUSSI; AYUB, 2004). Estudos anteriores têm reportado a aplicação de resíduo de maracujá para diversos fins, como a extração de óleo a partir das sementes (FERRARI; COLUSSI; AYUB, 2004); enriquecimento de alimentação animal (NEIVA et al., 2006); aproveitamento das fibras para produção de barras de cereais (SILVA et al., 2009); biscoitos enriquecidos com a farinha da casca de maracujá (ABUD; NARAIN, 2009; 31 ISHIMOTO et al., 2007); fabricação de produtos flavorizados (CARVALHO et al., 2005) e doce em calda da casca de maracujá (OLIVEIRA et al., 2002). De acordo com Lousada Júnior et al. (2006), os subprodutos do maracujá (mesocarpo e casca) apresentam em sua composição, em média, 39% de celulose, 10% de hemicelulose, 9% de lignina e 25% de pectina. Portanto, de acordo com a composição, as cascas de maracujá podem ser utilizadas como biomassa para a produção de bioetanol lignocelulósico. 3.7 Casca de coco verde Pesquisas do IBGE mostram uma produção de coco no ano 2016 ao redor de 1,7 milhões frutos, em uma área de 245 mil hectares, sendo que a maior produção encontra-se na região Nordeste, com um volume de aproximadamente 1,4 milhões de frutos. A Bahia é o estado que tem a maior produção, representando 29,5% do total (IBGE, 2016). O coco (Cocus nucifera L.) é considerado, em todo o mundo, uma fruta fornecedora de óleo, tendo aplicações diversas, nas mais distintas áreas industriais e culinárias. O Brasil é o único país produtor no qual o coco é tratado como uma fruta e não como uma oleaginosa, com uma vasta aplicação do fruto in natura e seus derivados tanto como insumo industrial, como na forma de condimentos, bebidas, especiarias e outros modos de utilização (SCHNEIDER et al., 2012). O fruto do coqueiro é constituído por albúmen líquido (água de coco), albúmen sólido ou amêndoa, endocarpo conhecido popularmente como “Quenga” e casca (Figura 4). A casca representa em torno de 57% do fruto sendo composta pelo mesocarpo (fibra e pó) e epicarpo (camada mais externa da casca). O volume e o peso da casca variam com as condições climáticas da região, forma de plantio, adubação, tratos culturais e fitossanitários do coqueiro e a variedade cultivada (NUNES; SANTOS; SANTOS, 2007). 32 Figura 4 - Estrutura do coco. Fonte: MATTOS et al. (2011). O crescimento agroindustrial, se por um lado é um vetor de desenvolvimento, por outro contribui para o aumento da geração de resíduos sólidos, que muitas vezes podem criar um impacto negativo para o meio ambiente. Um dos exemplos é a água de coco verde, que vem despontando como um produto bastante promissor no mercado brasileiro, com crescimento de mercado estimado em 20% ao ano. O problema, no entanto, é que o aumento na produção e no consumo da água-de-coco está gerando cerca de 2,29 bilhões de casca/ano, transformando-se em um sério problema ambiental, principalmente para as grandes cidades (NUNES; SANTOS; SANTOS, 2007). O estado da Bahia é o maior gerador de resíduos de cascas de coco no Brasil, com um montante de 98 mil tonelada/ano. Ao se analisar as grandes regiões em relação ao país, nota-se que a produção de resíduos está concentrada no Nordeste, com 69% de participação (SCHNEIDER et al., 2012). Segundo Corradini et al. (2009) a fibra da casca do coco verde é constituída por cerca de 40% de lignina, 35% de celulose e 25% de componentes secundários, como a hemicelulose. Devido às grandes quantidades de resíduos do coco verde gerado e a composição da fibra da casca, justifica-se a importância de avaliar o potencial desta matéria- prima para a obtenção de etanol lignocelulósico. Vaithanomsat et al. (2011) estudaram a produção de bioetanol a partir de cascas de coco, as cascas foram pré-tratadas com solução de hidróxido de sódio, hidrolisadas por enzimas comerciais e fermentadas por Saccharomyces cerevisiae a 30ºC por 72 h. A partir de uma concentração de glicose de 50 g L -1 foi obtida a concentração de etanol de 22,8 g L -1 . 33 Gonçalves et al. (2014) avaliaram o pré-tratamento das cascas com peróxido de hidrogênio e NaOH (Alk-H2O2), hidrólise com enzimas comerciais e produção de etanol pelo processo de sacarificação e fermentação simultâneas por S. cerevisiae PE2, Pichia stipitis Y7124 e Z. mobilis B14023, a 30ºC, por 48 h. As concentrações de etanol e rendimentos (g etanol/ g açúcar) obtidos foram 8,4 g L -1 e 84,6%, 9,1 g L -1 e 79,3%, 8,3 g L -1 e 82%, para S. cerevisiae, P. stipitis e Z. mobilis, respectivamente. 3.8 Micro-organismos 3.8.1 Zymomonas mobilis Z. mobilis é uma bactéria Gram-negativa, não patogênica que engloba apenas uma espécie, dividida em duas subespécies: Z. mobilis subespécie mobilis e Z. mobilis subespécie pomaceae (SWINGS; DE LEY, 1977). As células dessas bactérias podem ocorrer isoladamente, embora seja mais comum sua ocorrência aos pares. Não possuem cápsulas e não formam esporos e, em sua grande maioria, não possuem mobilidade (algumas linhagens perderam a mobilidade, embora cerca de 30% sejam móveis). Suas células possuem a forma de bastonetes com 2 a 6 μm de comprimento e de 1 a 1,5 μm de largura, com extremidades arredondadas, possuindo de 1 a 4 flagelos polares. As colônias apresentam coloração branca ou creme, crescem em temperaturas em torno de 30°C (FALCÃO DE MORAIS, 1983). Gibbs e Demoss (1954) demonstraram que essa bactéria utiliza, para o catabolismo anaeróbio de carboidratos, uma modificação da via de Entner-Duodoroff, podendo produzir mais de 1,9 mol de etanol por mol de glicose fermentada e pequena quantidade de lactato, de acordo com a seguinte reação: 1 mol de glicose  1,93 moles de etanol + 1,8 moles de CO2 + 0,053 mol de lactato Z. mobilis é apontada por alguns pesquisadores como um micro-organismo capaz de substituir a levedura S. cerevisiae, pois possui algumas características superiores quando comparadas à essa levedura e está sendo estudada intensivamente nas últimas décadas (BAI; ANDERSON; MOO-YOUNG, 2008; ERNANDES; BOSCOLO; GARCIA-CRUZ, 2010; SANTOS; GARCIA-CRUZ, 2016). Apresenta alta tolerância ao etanol, maiores velocidades 34 específicas de consumo de substrato, de produção de etanol e consequentemente, maior rendimento. Metaboliza açúcares pela via Entner–Doudoroff (ED), a qual produz menos ATP e menos biomassa. Devida à menor produção de ATP durante a fermentação de etanol, Z. mobilis mantém um fluxo metabólico de glicose superior, normalmente de três a cinco vezes maior ao da S. cerevisiae (BAI; ANDERSON; MOO-YOUNG, 2008). O metabolismo de açúcares por Z. mobilis está ilustrado na Figura 5. A sacarose é hidrolisada a glicose e frutose pela ação das enzimas invertase (INV B) e levanasacarase (LEV U). As duas hexoses entram na célula via sistema de difusão facilitada (GLF) ou são convertidas pela GFOR (glicose-frutose oxirredutase), uma enzima contendo NADP (nicotinamida-adenina dinucleotideofosfato) que existe na bactéria Z. mobilis. A enzima GFOR, que está localizada no periplasma, oxida glicose a gliconolactona e reduz frutose a sorbitol. A gliconolactona é, então, convertida pela gliconolactonase (GL), outra enzima periplasmática, em ácido glicônico (gliconato). Ambas as enzimas (GL e GFOR) são os principais constituintes do periplasma, formando aproximadamente 20 a 30% das proteínas deste compartimento. O ácido glicônico é consumido pelas células e pode ser completamente degradado (como um co-substrato) a etanol e ácido acético. O sorbitol é produzido para neutralizar o efeito prejudicial de estresse osmótico (SPRENGER, 1996). 35 Figura 5 - Metabolismo dos carboidratos em Z. mobilis. Fonte: SPRENGER (1996). Legenda: INV B: invertase LEV U: levanasacarase GNL: gliconolactonase FRK: frutoquinase GLK: glicoquinase PGI: fosfoglicose isomerase ZWF: glicose-6-fosfato desidrogenase GNTK: gliconatoquinase TKT: transcetolase PGL: 6-fosfogliconolactonase EDO: 6-fosfogliconato desidrogenase GAP: gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase EDA: 2-ceto 3-dioxi 6-fosfogliconato aldolase PGK: fosfoglicerato quinase PGM: fosfoglicerato mutase ENO: enolase PYK: piruvato quinase PDHC: piruvato desidrogenase ADH: piruvato descarboxilase álcool deidrogenase PDC: fosfatase 36 3.8.2 Micro-organismos fermentadores de pentoses Apesar das inúmeras vantagens apresentadas pela Z. mobilis para a produção de etanol, ela não é adequada para a fermentação de todos os açúcares obtidos na hidrólise da biomassa lignocelulósica. Ela é incapaz de fermentar xilose, que em geral é de 30-40% do total de açúcares fermentescíveis liberados no processo de hidrólise da biomassa lignocelulósica (SINGH; MAJUMDER; GHOSH, 2014). Na literatura são encontradas duas alternativas para o melhor aproveitamento dos açúcares (hexoses e pentoses) liberados na hidrólise da biomassa. A primeira baseia-se na utilização de micro-organismos geneticamente modificados, os quais são estudados e modificados com o objetivo de fermentar tanto a glicose como a xilose. Dentre os micro- organismos, destacam-se cepas geneticamente modificadas de S. cerevisiae, Z. mobilis e Escherichia coli (ZHANG; LYND, 2010). Outra opção é a utilização de dois micro- organismos, simultaneamente, em um único sistema de fermentação, definido como “Co- cultura”. Um sistema eficiente de co-cultura envolve a combinação de micro-organismos que não afetem as atividades metabólicas, como o crescimento, um do outro, e a competição por substrato ou nutrientes seja mínima, de forma a maximizar a produção de etanol. Entretanto, um micro-organismo capaz de fermentar de forma eficiente glicose e xilose deve ser escolhido cuidadosamente. As leveduras Pichia stipitis, Candida shehatae e Pachysolen tannophilus são alguns dos micro-organismos relatados por produzir quantidades significativas de etanol a partir de xilose (SINGH; MAJUMDER; GHOSH, 2014). Estão sendo realizadas várias pesquisas para avaliar a co-cultura na produção de etanol por co- fermentação de glicose e xilose derivadas da hidrólise de biomassa lignocelulósica (SINGH; MAJUMDER; GHOSH, 2014; SURIYACHAI et al., 2013; CHEN, 2011; PATLE; LAL, 2008; FU; PEIRIS, 2008). A utilização de xilose por leveduras é possível graças à capacidade que alguns destes micro-organismos apresentam de metabolizar essa pentose. A transformação das pentoses segue uma via metabólica diferente das hexoses, chamada de via das pentoses-fosfato, como ilustrado na Figura 6. A metabolização da xilose procede por meio de duas etapas, uma de redução e outra de oxidação, as quais são mediadas pela xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH), transformando a xilose em xilitol e posteriormente em xilulose. Assim, a xilose entra para a via da pentose fosfato (PPP) através da xilulose, que pela xiluloquinase (XK) é fosforilada a xilulose-5P. A PPP é considerada como tendo duas fases. A fase 37 oxidativa converte a hexose, glicose-6P, para a pentose ribulose-5P, mais CO2 e NADPH. A fase não oxidativa converte ribulose-5P em ribose-5P, xilulose-5P, sedo-heptulose-7P e eritrose-4P, que finalmente através da frutose-6P e gliceraldeído-3P, retornam os carbonos para a glicólise, permitindo a posterior fermentação do açúcar (HAHN-HÄGERDAL et al., 1994). Figura 6 - Fluxograma da via metabólica de glicose e xilose em leveduras xilose- fermentadoras. FONTE: Adaptado Hahn-Hägerdal et al. (1994). 3.8.3 Pachysolen tannophilus A levedura P. tannophilus foi isolada pela primeira vez a partir de extratos de madeira (SLININGER, BOLEN, KURTZMAN, 1987) e passou a atrair a atenção dos pesquisadores devido a sua capacidade de utilizar xilose para produção de etanol (SALEH et al., 2014; SATHESH-PRABU; MURUGESAN, 2011; FU, PEIRIS, 2008). P. tannophilus cresce em meio contendo glicose, galactose, xilose e frutose, mas não utiliza sacarose e nem lactose como fonte de carbono (HAHN-HÄGERDAL et al., 1994). Membrana Celular Xilose Glicose Xilose Glicose Etanol Glicerol Acetaldeído Acetil CoA Piruvato Gliceraldeído 3P Glicerol 3P Dihidroxicetona P Glicose 6P Frutose 6P Frutose 1,6-difosfato Cadeia Respiratória Frutose 6P Gliceraldeído 3P Xilitol Xilulose Xilulose 5P Sedoheptulose Ribose 5P Ribulose 5P 6 Fosfogluconato Eritrose 4P Frutose 6P Ciclo do Ácido Tricarboxílico 38 De acordo com Zhao, Zhang e Tan (2008), na fermentação de um meio contendo hexoses e pentoses, a levedura tem preferência pela hexose e o consumo de xilose inicia-se somente após a exaustão da glicose, além disso, em meios contendo apenas xilose, há maior formação de biomassa e menor produção de etanol. Fu e Peiris (2008) investigaram a produção de etanol por co-fermentação de Z. mobilis e P. tannophilus, em um meio sintético composto por glicose e xilose. Essa mistura de açúcares foi utilizada para simular a composição do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana, e pode ser observado que a co-cultura foi vantajosa, tendo alcançado um rendimento de 0,33 g etanol/g substrato. Sathesh-Prabu e Murugesan (2011) avaliaram o potencial de utilização de resíduos do cultivo de sorgo para produção de etanol combustível empregando as leveduras P. tannophilus e S. cerevisiae. Foi obtida concentração máxima de etanol de 56 g L -1 por P. tannophilus a partir da palha de sorgo. 39 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Matéria-prima Foram utilizadas como biomassa, cascas de banana (Mussa acuminata AAA var. Cavendish anão) popularmente conhecida como banana nanica, cascas de maracujá amarelo (Passiflora edulis) e cascas de coco verde (Cocos nucifera). As cascas de banana foram coletadas no Restaurante Universitário do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas, IBILCE/UNESP, São José do Rio Preto – SP. As cascas de maracujá foram coletadas no mercado local de São José do Rio Preto – SP. E as cascas de coco verde foram coletadas nas barracas de venda, localizadas na represa municipal de São José do Rio Preto – SP. 4.1.1 Preparo da matéria-prima As cascas foram cortadas manualmente com auxílio de uma faca inox em pedaços menores que 3 cm, distribuídas em bandejas de inox e expostas ao sol, durante aproximadamente 24 h, até que ficassem duras e quebradiças. As amostras secas foram moídas em um moedor de facas até a obtenção de um pó com tamanho máximo de partículas de 1,41 mm. Após a moagem, as amostras foram peneiradas em uma malha serie Tyler #14, acondicionadas em frascos de vidro e armazenadas a temperatura ambiente. Para todos os ensaios de hidrólise ácida e enzimática, bem como de fermentação descontínua, foram utilizados frascos Erlenmeyer de 250 mL. 4.2 Pré-tratamento da biomassa O pré-tratamento foi realizado de acordo com o método proposto por Monsalve, Perez e Colorado (2006), com algumas modificações. Foram adicionados 50 mL de ácido sulfúrico a 5% (v/v) para cada 10 g de casca de banana; para as cascas de maracujá e coco verde, o volume de ácido foi duplicado (100 mL). Todos foram aquecidos em autoclave a 121°C, 1 atm, durante 15 min. Ao término do pré-tratamento, o pH do material hidrolisado foi neutralizado, até pH 7,0, utilizando uma solução de NaOH a 50% (m/v). 40 4.3 Hidrólise enzimática da biomassa Foram empregadas enzimas comerciais fornecidas pela Novozymes Latin America Ltda. Foi utilizado um complexo enzimático, contendo arabinase, β-glucanase, celulase, hemicelulase, pectinase e xilanase e um complexo de celulase, de acordo com Schulz (2010), com algumas modificações. Todas as enzimas foram utilizadas de uma só vez, empregando as doses máximas recomendadas pelo fornecedor. As dosagens enzimáticas utilizadas, assim como o pH inicial (5,5) e a temperatura de reação (50ºC) foram definidas de modo que os seus valores estivessem dentro das faixas recomendadas pelo fornecedor das enzimas (ANEXO A). A solução enzimática foi preparada em solução tampão Citrato 0,1 M, pH 5,5. A massa de cada uma das enzimas utilizadas na solução foi calculada de forma que 10 mL desta solução resultassem nas concentrações apresentadas na Tabela 1. Tabela 1 - Enzimas e dosagens empregadas nos ensaios de hidrólise enzimática das cascas de banana, maracujá e coco verde. Enzima Descrição Dosagem (% m/m) NS22086 Celulase- complexo Os principais produtos da reação são a celobiose e a glicose 5,0 NS22083 Xilanase É um purificado de endo-xilanase com alta especificidade para pentosanas 0,25 NS22118 β-glicosidase Hidrolisa a celobiose, um dímero de glicose. Também conhecida como celobiase 0,6 NS22119 Complexo enzimático Contém arabinase, β-glucanase, celulase, hemicelulase, pectinase e xilanase 0,4 NS22002 β-glucanase Xilanase Contém uma mistura de enzimas com atividade β-glucanase e xilanase 2,0 *% m/m: porcentagem em massa. Como reatores foram empregados frascos Erlenmeyers de 250 mL contendo 90 mL de substrato (pré-tratado por ácido) e 10 mL de solução enzimática. Os tempos de reação 41 avaliados foram de: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 e 24 h. As reações foram conduzidas em incubadora de movimento giratório (Shaker) com agitação de 100 rpm. Ao final de cada tempo de reação foram retiradas amostras, sendo estas filtradas em papel filtro Whatman, para separação dos sólidos. O líquido obtido foi então utilizado para as determinações do teor de sólidos totais e das concentrações de açúcares totais, conforme descrito nos itens 4.9.1 e 4.9.5, respectivamente. Após as etapas de hidrólises, a biomassa obtida foi filtrada em papel filtro Whatman Nº 1 para separação dos sólidos, os quais foram descartados, permanecendo somente o líquido hidrolisado. 4.4 Detoxificação O processo de detoxificação foi realizado de acordo com Mussatto e Roberto (2004), com algumas modificações. Primeiramente, empregando o método de alteração de pH, o pH inicial foi ajustado para 10, pela adição de óxido de cálcio sob agitação. A mistura permaneceu em repouso por meia hora, seguida de centrifugação (3000 g, 20 min) e filtração. Depois o pH do hidrolisado foi reduzido para 6 usando H2SO4 concentrado. Ao hidrolisado, foi então adicionado 2,5% (m/v) de carvão ativo, a mistura foi submetida a agitação de 200 rpm, a 30º C, por 1 h. A mistura foi então novamente centrifugada (3000 g, 20 min) e filtrada. O hidrolisado tratado foi caracterizado quanto à concentração de Açúcares Totais e Compostos Fenólicos. 4.5 Micro-organismos Foram utilizados dois micro-organismos, a bactéria Zymomonas mobilis CCT 4494 e a levedura Pachysolen tannophilus CCT 1891, adquiridos da Coleção de Culturas Tropical (CCT) da Fundação André Tosello - Pesquisa e Tecnologia de Campinas, SP. 4.5.1 Meio de manutenção A levedura foi mantida em geladeira a 4°C, após o crescimento prévio em estufa a 28°C por 24 h em meio de manutenção, conforme especificados na Tabela 2, sendo reativada mensalmente. 42 Tabela 2 - Meio de manutenção do micro-organismo P. tannophilus CCT 1891. Composto Concentração (g L -1 ) Glicose 10,0 Extrato de levedura 3,0 Extrato de malte 3,0 Peptona de carne 5,0 Agar 20,0 A linhagem bacteriana foi mantida em geladeira a 4°C, após o crescimento prévio em estufa a 30°C por 24 h em meio de manutenção, conforme especificados na Tabela 3, sendo reativada mensalmente. Tabela 3 - Meio de manutenção do micro-organismo Z. mobilis CCT 4494. Composto Concentração (g L -1 ) Glicose 20,0 Extrato de levedura 10,0 Peptona de carne 10,0 4.5.2 Preparo do pré-inóculo A partir das culturas de Z. mobilis e/ou P. tannophilus armazenadas em geladeira, em meio de manutenção, foi feito o pré-inóculo para a reativação das células. A cepa foi inoculada em tubos de ensaio contendo 10 mL do meio de manutenção do micro-organismo Z. mobilis, conforme descrito no item 4.5.1, e incubados em estufa a 30°C, por 24 h. As cepas P. tannophilus foram inoculadas em tubos de ensaio contendo 10 mL do meio de manutenção, conforme descrito no item 4.5.1, e incubados em estufa a 28°C, por 24 h. 4.5.3 Pré-fermentação Para a pré-fermentação, 5 tubos de ensaio com crescimento celular obtidos no pré- inóculo foram transferidos para frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio de manutenção previamente esterilizados. Os Erlenmeyers inoculados com a bactéria Z. mobilis 43 foram incubados em agitador orbital rotatório, mantido a 30ºC, por 24 h, sem agitação. Os Erlenmeyers inoculados com a levedura P. tannophilus foram incubados a 28ºC, por 24 h, com agitação de 100 rpm. 4.5.4 Padronização do inóculo A padronização do inóculo foi realizada de acordo com Vignoli (2003) para garantir que a concentração de inóculo inicial fosse igual para todos os ensaios de fermentação. A suspensão celular obtida na pré-fermentação (item 4.5.3) foi centrifugada a 6941g, por 15 min, para separação de células, e ressuspensas em água destilada estéril de forma a se obter uma suspensão celular com absorbância da ordem de 0,600 a 570 nm. Separadamente foi construída uma curva analítica com diferentes concentrações da suspensão celular de Z. mobilis CCT 4494 (APÊNDICE A) e P. tannophilus (APÊNDICE B), que relaciona a absorbância com concentração celular (g L -1 ), com a qual foi possível calcular o inóculo inicial de células transferido para os frascos de Erlenmeyer contendo o meio de fermentação. O espectrofotômetro utilizado para determinações fotométricas foi o Biochrom modelo: Libra 22. 4.6 Meios de fermentação Para a produção de etanol foram utilizados os meios de fermentação especificados a seguir: 4.6.1 Meio sintético O meio sintético foi semelhante ao definido por Rodríguez e Callieri (1986), com algumas modificações, conforme especificado na Tabela 4. Para os ensaios utilizando a levedura, foi utilizada uma mistura de açúcares (glicose e xilose), simulando o hidrolisado. A glicose e xilose foram utilizadas nas proporções de 60% e 40%, respectivamente, com três concentrações diferentes, além disso, houve variação do pH inicial do meio, a variação de ambos está especificada no item 4.7.2. Já para ensaios com a bactéria utilizou-se apenas glicose. A solução de açúcares foi esterilizada separadamente a 121°C, por 15 min, e depois de resfriadas até a temperatura ambiente, foi misturada assepticamente no momento do 44 preparo do meio de fermentação contendo os demais constituintes que foram previamente dissolvidos em água destilada e esterilizados. Tabela 4 - Composição do Meio Sintético. Composto Concentração (g L -1 ) Glicose e/ou Xilose 5; 10 e 15% Extrato de levedura 5,0 KH2PO4 1,0 (NH4)2SO4 1,0 MgSO4.7H2O 1,0 4.6.2 Meio contendo os hidrolisados lignocelulósicos Os hidrolisados de casca de banana, maracujá e coco foram padronizados com base nas concentrações de sólidos totais, os quais foram medidos em Refratômetro (Quimis), com três concentrações diferentes, conforme apresentado no item 4.7.2. Os outros componentes do meio estão especificados na Tabela 4. Os frascos de Erlenmeyer, contendo o caldo hidrolisado de cada casca, com a concentração adequada de sólidos totais, foram esterilizados separadamente a 121°C, por 15 min, e depois de resfriados até a temperatura ambiente, misturados assepticamente para o preparo do meio de fermentação contendo os demais constituintes, previamente dissolvidos em água destilada e esterilizados. Cada hidrolisado foi estudado separadamente. 4.7 Condições de fermentação 4.7.1 Testes preliminares 4.7.1.1 Parâmetros cinéticos da bactéria Z. mobilis Para determinar as melhores condições de metabolismo da bactéria, foram realizados testes para determinar o melhor tempo de fermentação para produção de etanol. Foi realizada uma fermentação, utilizando meio sintético, acrescido de glicose (100 g L -1 ), incubada a 30ºC, sem agitação, com tempo de fermentação de 12 h, com retirada de amostras a cada hora. 45 Depois de determinado o melhor tempo para produção de etanol, foi avaliada a agitação, com meio sintético, acrescido de glicose (45 g L -1 ), pH 5,5, a 30ºC, foram estudadas: a fermentação estática e agitada a 50; 100; 150 e 200 rpm. 4.7.1.2 Parâmetros cinéticos da levedura P. tannophilus Para determinar as melhores condições do metabolismo da levedura, foram realizados testes para determinar o melhor tempo e agitação para condução da fermentação para produção de etanol. Foi realizada uma fermentação, utilizando meio sintético, acrescido de glicose (100 g L -1 ), incubada a 30ºC, durante 24 h, foi estudada a fermentação estática e agitada a 50 e 100 rpm. Após a definição da melhor condição de agitação, foi realizada uma fermentação durante 24 h, com retiradas de amostras a cada hora, para determinar o tempo ótimo de produção de etanol. 4.7.2 Parâmetros das fermentações Depois de estabelecidos as melhores condições de tempo e agitação para produção de etanol, os micro-organismos, Z. mobilis e P. tannophilus, foram empregados para avaliar os substratos (cascas de banana, maracujá e coco verde e meio sintético), quanto as concentrações (5, 10 e 15%) e pH inicial de cada meio (4,5; 5,0 e 5,5). As fermentações foram realizadas em agitador orbital rotatório, a 30ºC. As fermentações com a bactéria Z. mobilis foram conduzidas por 7 h e 50 rpm. E com a levedura P. tannophilus a fermentação foi realizada por 19 h, com agitação de 100 rpm. Nas Figuras 7 e 8 estão apresentados os fluxogramas para as fermentações com Z. mobilis e P. tannophilus. 46 Figura 7 – Fluxograma com os fatores avaliados na produção de etanol por Z. mobilis CCT 4494. Micro-organismo: Z. mobilis Meio sintético: glicose Tempo de fermentação: 7 h Agitação: 50 rpm Concentrações dos Substratos (%) 5 10 15 4,5 5,5 5,0 4,5 5,0 5,5 4,5 5,5 5,0 Meio sintético Hidrolisado de casca de banana Hidrolisado de casca maracujá Substratos avaliados Hidrolisado de casca de coco pH inicial do meio pH inicial do meio pH inicial do meio 47 Figura 8 – Fluxograma com os fatores avaliados na produção de etanol por P. tannophilus CCT 1891. Micro-organismo: P. tannophilus Meio sintético: glicose e xilose Tempo de fermentação: 19 h Agitação: 100 rpm Concentrações dos Substratos (%) 5 10 15 4,5 5,5 5,0 4,5 5,0 5,5 4,5 5,5 5,0 Meio sintético Hidrolisado de casca de banana Hidrolisado de casca maracujá Substratos avaliados Hidrolisado de casca de coco pH inicial do meio pH inicial do meio pH inicial do meio 48 4.8 Co-cultura Os ensaios de co-fermentação de Z. mobilis e P. tannophilus foram avaliados por dois métodos. O primeiro (co-cultura 1) foi realizado com inoculação simultânea de Z. mobilis e P. tannophilus no início do processo fermentativo, a fermentação foi conduzida em Erlenmeyer, contendo 50 mL do meio de fermentação, incubada em shaker, a 30ºC, agitação de 100 rpm, durante 19 h. No segundo método de co-cultura (co-cultura 2) a Z. mobilis foi inoculada no início da fermentação, a qual foi estática, a 30ºC, depois de 7 h o meio foi centrifugado, assepticamente, para remoção das células da bactéria, e então a P. tannophilus foi inoculada. A fermentação foi realizada durante 19 h, a 30ºC e agitação de 100 rpm. 4.9 Métodos analíticos 4.9.1 Determinação dos sólidos totais O teor de sólidos totais foi determinado utilizando um refratômetro Quimis (ºBrix). 4.9.2 Determinação do pH final O pH final foi determinado diretamente no caldo fermentado por potenciometria em pHmetro (modelo DM20, Digmed, Brasil). 4.9.3 Determinação da concentração celular A concentração celular foi monitorada através das medidas de absorbância no espectrofotômetro Biochrom, modelo Libra S22, das suspensões diluídas do meio de fermentação, num comprimento de onda de 570 nm. A conversão da suspensão em concentração (massa de matéria seca por unidade de volume) foi obtida através das curvas de crescimento de cada micro-organismo. 49 4.9.4 Determinação de etanol O etanol foi determinado por cromatografia gasosa utilizando um Cromatógrafo (Modelo GC Focus, Thermo Scientific, USA) acoplado a um detector de chama ionizante (FID) (Flame Ionization Detector), temperatura do forno de 100ºC (mantendo esta temperatura por toda a corrida - isotérmica); tempo da corrida de 5 min; temperatura do injetor de 230ºC; temperatura do detector de 270ºC; injeção de 200 µL de vapor da amostra. As amostras foram aquecidas em banho-maria à temperatura de 40ºC. 4.9.5 Determinação de açúcares totais (AT) Os açúcares totais (AT) foram determinados pelo método fenol-sulfúrico, descrito por Dubois et al. (1956). Foram realizadas leituras de absorbância no comprimento de onda de 490 nm, e a quantificação foi determinada por curva padrão de glicose utilizando o método fenol-sulfúrico (APÊNDICE D). 4.9.6 Determinação de açúcares redutores (AR) Os açúcares redutores (AR) foram determinados de acordo com o método do cuproarsenato descrito por Somogyi (1952) e Nelson (1944). Foram realizadas leituras de absorbância no comprimento de onda de 570 nm, e a quantificação foi determinada por curva padrão de glicose utilizando o método Somogyi (1952) e Nelson (1944) (APÊNDICE E). 4.9.7 Determinação dos teores de compostos fenólicos A concentração de fenóis totais foi determinada pelo do método de Folin-Ciocalteau modificado, descrito por Chaovanalikit e Wrolstad (2004). Uma amostra de 0,5 mL de hidrolisado foi misturada com 0,5 mL de reagente de Folin-Ciocalteu e 7,5 mL de água destilada. A mistura foi deixada em repouso por 10 min, à temperatura ambiente. Depois foram adicionados 1,5 mL de carbonato de sódio (20%), as amostras foram deixadas em repouso novamente, por 20 min, à temperatura ambiente. Foram realizadas leituras de absorbância no comprimento de onda de 755 nm tendo como base amostras de ácido vanílico com concentrações conhecidas e, posteriormente, foi 50 construída uma curva analítica (APÊNDICE F). O resultado foi expresso em concentração de polifenóis correspondente a ácido vanílico. 4.10 Análises estatísticas Os resultados das variáveis respostas analisadas foram submetidos à Análise de Variância (ANOVA), e quando houve diferença estatística, as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de significância. 4.11 Parâmetros de fermentação 4.11.1 Fator de conversão do substrato em etanol Os valores de rendimento de etanol em função do substrato consumido, expressos em porcentagem, foram obtidos por meio da Equação 1. Yp/s = (P) (So - Sf) 4.11.2 Produtividade em etanol Os valores de produtividade total de etanol, expressos em massa do produto formado por unidade de tempo e volume (g L -1 h -1 ), foram obtidos por meio da Equação 2. Qp = (P) (tf – to) Onde: Yp/s = rendimento de etanol por substrato (%); Qp = produtividade (g L -1 h -1 ); P = massa de etanol (g L -1 ); So = Concentração inicial de açúcares (g L -1 ); Sf = Concentração final de açúcares (g L -1 ); tf = tempo final de fermentação (h); to = tempo inicial de fermentação (h); (Equação 2) (Equação 1) 51 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Ensaios de hidrólise 5.1.1 Cascas de banana Os parâmetros do pré-tratamento ácido das cascas de frutas utilizadas nesse trabalho foram estudados e definidos em trabalhos anteriores (FERREIRA, 2013). As cascas de banana foram secas, trituradas e padronizadas quanto ao tamanho de partícula, com tamanhos menores ou iguais a 1,41 mm. Após a padronização da matéria-prima, estas foram submetidas ao pré-tratamento com ácido sulfúrico a 5%, durante 15 min, etapa a qual promoveu a liberação de 20,3 g L -1 de açúcares totais. Após a etapa de pré-tratamento, as amostras foram hidrolisadas enzimaticamente. Na Figura 9 são apresentadas as concentrações de açúcares totais obtidas durante o tratamento enzimático das cascas de banana, nos tempos de 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 e 24 h. Figura 9 - Liberação de Açúcares Totais (AT) durante a hidrólise enzimática de cascas de banana pré-tratadas. A Análise de Variância e comparação das médias pelo Teste de Tukey, a 5% de significância, mostraram diferença significativa entre as amostras, e a hidrólise enzimática durante 24 h teve maior liberação de açúcares (74,1 g L -1 ). A hidrólise enzimática aumentou a concentração de açúcares em praticamente 4 vezes da concentração inicial. Após essas 52 análises, foi padronizado o tempo de 24 h para a realização de hidrólise enzimática de todas as cascas de banana utilizadas no trabalho. 5.1.2 Cascas de maracujá Assim como as cascas de banana, as cascas de maracujá também foram secas, trituradas e padronizadas quanto ao tamanho de partícula. Após a padronização, as cascas de maracujá foram submetidas ao pré-tratamento ácido, o qual promoveu uma liberação de 26,4 g L -1 de açúcares totais. Após o pré-tratamento, as cascas foram submetidas ao processo de hidrólise enzimática, realizada durante os tempos de 0; 1; 2; 3; 4; 5; 6; 7; 8 e 24 h. Na Figura 10 são apresentadas as concentrações de açúcares totais obtidos durante o tratamento enzimático das cascas de maracujá. Figura 10 – Liberação de Açúcares Totais (AT) durante a hidrólise enzimática de cascas de maracujá pré-tratadas. A Análise de Variância e comparação das médias pelo Teste de Tukey, a 5% de significância, mostraram diferença significativa entre as amostras, e a hidrólise enzimática durante 24 h teve maior liberação de açúcares (87,2 g L -1 ). As cascas de maracujá são pouco exploradas como matéria-prima para produção de etanol, não são encontrados muitos dados na literatura, um dos estudos encontrados foi realizado por Almeida et al. (2015). Esses pesquisadores avaliaram a produção de β- 53 glicosidases utilizando casca de maracujá como substrato e depois as hidrolisaram, utilizando essas enzimas produzidas. Para isto, as cascas foram pré-tratadas utilizando um processo alcalino e então hidrolisadas pelas enzimas β-glicosidases. Houve uma liberação de 6,4 g L -1 de glicose, o que correspondeu a 45,54 % de rendimento do processo. 5.1.3 Casca de coco As cascas de coco verde foram trituradas e secas ao sol. Devido ao aspecto fibroso das cascas de coco, conforme apresentado na Figura 11, esse resíduo não foi padronizado quanto ao tamanho de partícula. Após a secagem da matéria-prima, estas foram submetidas ao pré- tratamento com ácido sulfúrico a 5%, durante 15 min, que promoveu a liberação de 9,4 g L -1 de açúcares totais. Valores próximos foram determinados por Prado et al. (2014), que a partir da hidrólise da casca de coco com água no estado subcrítico, a 259ºC, por 30 min, encontraram 11,7 g de açúcares redutores para cada 100 g de matéria seca. Figura 11 – Cascas de coco verde, trituradas e desidratadas. FONTE: Elaborada pelo autor. Após a etapa de pré-tratamento, as amostras foram hidrolisadas enzimaticamente por 24 h, o que proporcionou aumento na concentração de açúcares totais, sendo determinados 13,4 g L -1 . Se comparadas às outras cascas avaliadas, houve baixo rendimento na liberação de açúcares. Isso pode ser justificado devido ao alto teor de lignina desse substrato, pois segundo Vaithanomsat et al. (2011), a casca de coco tem em torno de 30 % de lignina. Segundo Ayeni 54 et al. (2016), a lignina interfere na hidrólise enzimática, pois bloqueia o acesso da celulase e promove uma ligação irreversível com as enzimas hidrolíticas. Isso foi comprovado por Cabral (2015), quando as cascas de coco foram pré-tratadas por H2SO4 a 5%, houve pouca liberação de açúcares após a hidrólise enzimática (2,7 g L -1 ). Os resultados mais satisfatórios foram obtidos do material pré-tratado em meio alcalino, com 5% de NaOH, após a conversão enzimática, determinaram 8,7 g L -1 de açúcares. Essa diferença pode ser explicada devido ao uso de NaOH. O pré-tratamento alcalino reduz a concentração de lignina do substrato, enquanto a biomassa pré-tratada por ácido possui grande quantidade de lignina em sua composição, a qual favorece a inibição dos agente enzimáticos. 5.1.4 Detoxificação Os hidrolisados de casca de banana, maracujá e coco foram tratados com carvão ativo comercial (tamanho de partícula <100 µm) para remover compostos inibitórios. O teor de compostos fenólicos presentes foi determinado antes e após o processo de detoxificação, e os valores estão apresentados na Tabela 5. Tabela 5 - Concentração de Sólidos Totais (ST) e Compostos Fenólicos (CF) determinados antes e após o tratamento de detoxificação do hidrolisado das cascas de banana, maracujá e coco. Ensaio STantes (%) STdepois (%) CFantes (g L -1 ) CFdepois (g L -1 ) Casca de banana 17 17 0,8 ± 0,1 0,2 ± 0,1 Casca de maracujá 12 11 1,0 ± 0,0 0,2 ± 0,0 Casca de coco 10 12 2,3 ± 0,1 0,2 ± 0,0 Analisando os dados da Tabela 5, verifica-se que, após o tratamento de detoxificação, 75% dos compostos fenólicos foram removidos dos hidrolisados de casca de banana e analisando o teor de sólidos totais, não houve alteração após o tratamento. Na avaliação dos resultados obtidos para o hidrolisado de casca de maracujá, 80% dos compostos fenólicos foram removidos e, com relação à concentração de sólidos totais, houve uma pequena redução, a concentração inicial era de 12%, após o tratamento com o carvão ficou em 11%. Os dados apresentados na Tabela 5 mostram que as cascas de coco apresentaram a maior concentração de compostos fenólicos após os tratamentos de hidrólise (2,3 g L -1 ) em comparação as demais cascas, que pode ser devida a composição desse substrato, o qual tem 55 alta concentração de lignina. Segundo Vaithanomsat et al. (2011), as cascas de coco contêm em torno de 30% de lignina. Ainda analisando a Tabela 5, verifica-se que em torno de 91% desses compostos foram removidos do caldo após a detoxificação. Já com relação aos sólidos totais, observou-se um comportamento diferente, após a etapa de desintoxicação, houve um pequeno aumento, de 10 passou para 12%. Portanto, o tratamento de detoxificação foi vantajoso para os hidrolisados, uma vez que removeu grande quantidade dos compostos fenólicos do meio, os quais poderiam ser tóxicos aos micro-organismos, e, de acordo com Mussatto e Roberto (2004b), compostos tóxicos podem estressar micro-organismos fermentativos, reduzindo a capacidade de assimilação dos açúcares e, consequentemente, a formação do produto. Günan Yücel e Aksu (2015) obtiveram resultados parecidos com esse trabalho, a remoção compostos fenólicos foi de 71,1%, após o processo de detoxificação do hidrolisado de bagaço de beterraba, utilizando carvão ativo comercial. 5.2 Ensaios de fermentação 5.2.1 Parâmetros cinéticos da bactéria Zymomonas mobilis Visando avaliar o comportamento da bactéria Z. mobilis na fermentação alcoólica, realizou-se um ensaio de fermentação com meio sintético utilizando glicose como fonte de carbono durante 12 h. O perfil fermentativo determinado nessa fermentação está apresentado nas Figura 12 e 13. Analisando as figuras, observ