RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 30/03/2022. UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Julio Cesar Sánchez Puetate Avaliação de diferentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica antimicrobiana no tratamento da doença periodontal induzida: estudo in vivo e in vitro Araraquara 2020 UNESP - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Odontologia de Araraquara Julio Cesar Sánchez Puetate Avaliação de diferentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica antimicrobiana no tratamento da doença periodontal induzida: estudo in vivo e in vitro Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara para obtenção do título de Mestre em Odontologia, na Área de Periodontia Orientadora: Profa. Dra. Rosemary Adriana Chierici Marcantonio Coorientadora: Profa. Dra. Denise M. Palomari Spolidório Araraquara 2020 Sánchez Puetate, Julio Cesar Avaliação de diferentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica antimicrobiana no tratamento da doença periodontal induzida: estudo in vivo e in vitro / Julio Cesar Sánchez Puetate.-- Araraquara: [s.n.], 2020 64f.; 30 cm. Te Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia Orientadora: Profa. Dra. Rosemary Adriana Chiérici Marcantonio Coorientadora: Profa. Dra. Denise M. Palomari Spolidório 1. Fotoquimioterapia 2. Biofilmes 3. Periodontite I.Título Ficha catalográfica elaborada pela Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB/5646 Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Odontologia, Araraquara Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação Julio Cesar Sánchez Puetate Avaliação de diferentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica antimicrobiana no tratamento da doença periodontal induzida: estudo in vivo e in vitro Comissão julgadora Dissertação para obtenção do grau de Mestre em Odontologia Presidente e orientadora: Profa. Dra. Rosemary Adriana Chierici Marcantonio 2º Examinador: Profa. Dra. Leticia Helena Theodoro 3º Examinador: Prof. Dr. Guilherme José Pimentel Lopes de Oliveira Araraquara, 30 de março de 2020 DADOS CURRICULARES Julio Cesar Sánchez Puetate NASCIMENTO 02 de Maio de 1990 – Quito – Equador FILIAÇÃO Rosa de las Nieves Puetate Llerena Julio César Sánchez Zambrano 2008-2013 Graduação em Odontologia Universidad Central del Ecuador - Equador 2015-2017 Especialização em Periodontia Universidad San Francisco de Quito - Equador 2017-2019 Especialização em Implantodontia Fundação Araraquarense de Ensino e Pesquisa em Odontologia Faculdade Herrero 2018-Atual Curso de Pós-Graduação em Odontologia, Área de Concentração em Periodontia – Nível Mestrado Faculdade de Odontologia de Araraquara (FOAr) Universidade Estadual Paulista (UNESP) Aos meus Pais, que iluminam meu caminho com o coração cheio de amor e paciência, pela compreensão, por aceitarem e apoiarem a minha escolha neste caminho, as palavras não são suficientes para descrever todo o amor que sinto por vocês, muito obrigado por sonhar comigo. Aos meus irmãos, pelo suporte incondicional mesmo com a distância e as saudades, vocês sempre serão parte das minhas conquistas. Aos meus sobrinhos, que me inspiram com o brilho de suas miradas e a ingenuidade de seus sorrisos, vocês são a minha grande inspiração. Ao meu avô. AGRADECIMENTOS ESPECIAIS À minha querida orientadora Profa. Dra. Rosemary Adriana Chierici Marcantonio, pela confiança para a realização desta pesquisa, pela motivação e por sua valiosa orientação, por suas contribuições científicas e humanas para me formar plenamente durante esse período. À Profa. Denise Madalena Palomari Spolidorio, pela solicitude e pela oportunidade de fazer parte da equipe do laboratório de Microbiologia, por guiar os passos nesse novo desafio que foi trabalhar num laboratório. À Profa. Janice Rodrigues Perussi e ao Prof. Anderson Ribeiro de Oliveira, pela síntese dos fotossensibilizadores, para o desenvolvimento deste trabalho. À Profa. Alessandra Rastelli, pelo empréstimo do equipamento para o desenvolvimento da parte do projeto. À Patty Maquera Huacho, por toda a paciência, e pelos ensinamentos transmitidos, fico muito grato por ter tido a oportunidade de compartilhar essa fase da minha formação acadêmica ficando perto de você, obrigado pela compreensão das minhas limitações durante este período. Ao Gabriel e José Rodolfo, companheiros e grandes amigos, por seus valiosos conselhos e tornar esta etapa acadêmica mais suportável, com todas as experiências e memórias. À Beatriz Aroni, pela ajuda com parte do desenvolvimento deste trabalho, tendo sempre interesse em crescermos juntos. Aos meus amigos David, Luis e Javier amizade de longa data e irmãos que a vida me deu, apesar da distância, minha gratidão pelo apoio nos momentos mais difíceis. AGRADECIMENTOS À Faculdade de Odontologia de Araraquara (UNESP), na pessoa de seu Diretor, Prof. Dr. Edson Alves de Campos e Vice-Diretora, Profa. Dra. Patrícia P. Nordi Sasso Garcia, pela oportunidade e infra-estrutura oferecidas para à realização deste projeto. Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação, José Alexandre e Cristiano, pela sua atenção. À CAPES: O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de financiamento 001. À FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (Processo nº 2016/00275-8) pelo apoio financeiro essencial para realização dessa pesquisa. Existem muitas hipóteses em ciência que estão erradas. Isso é perfeitamente aceitável, eles são a abertura para achar as que estão certas. Carl Sagan* * Sagan C. Pálido ponto azul. Rio de Janeiro: Companhia das Letras; 2019. Sánchez-Puetate JC. Avaliação de diferentes fotossensibilizadores na terapia fotodinâmica antimicrobiana no tratamento da doença periodontal induzida: estudo in vivo e in vitro [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2020. RESUMO A Terapia Fotodinâmica Antimicrobiana (antimicrobial Photodynamic Therapy – aPDT), tem sido utilizada como uma terapia coadjuvante na doença periodontal (DP). O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos antimicrobianos da aPDT, com os fotossensibilizadores Hipericina-glucamina (Hy-g) e Ftalocianina-glucamina (Ft-g), no tratamento e progressão da doença periodontal induzida experimentalmente em ratos, assim como sobre um modelo de biofilme multiespécie in vitro. Os micro- organismos avaliados foram Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis, ATCC 33277), Aggregatibacter actynomicetemcomitans (A. actynomicetemcomitans, JP2), Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum, ATCC25586), e Streptococcus oralis (S. oralis, ATCC 35037). Dois estudos distintos foram conduzidos. No Estudo 1, foi avaliado in vivo a viabilidade dos micro-organismos mediante o modelo da doença periodontal induzida experimentalmente em ratos após 7 dias de indução da DP. Os animais foram divididos em 7 grupos experimentais (n=8): Grupo Controle; Ftalocianina-glucamina (Ft-g); Hipericina-glucamina (Hy-g); LED vermelho (LV, 655nm; 34 J/cm2); LED âmbar (LA, 590nm; 34,10 J/cm2); aPDT 1(aPDT-Hy-g + LA); aPDT 2 (aPDT-Ft-g + LV). Os animais foram eutanasiados com 7 e 30 dias após a aplicação dos tratamentos no período baseline. No Estudo 2, foi avaliado in vitro a viabilidade dos micro-organismos mediante o modelo de biofilme multiespécie, as amostras foram divididas em 8 grupos experimentais: Controle Negativo; Controle Positivo (clorexidina 0,12%); Ftalocianina-glucamina (Ft-g); Hipericina-glucamina (Hy-g); LED Vermelho (LED-V, 660nm; 39,65 J/cm2); LED Âmbar (LED-A, 590nm; 39,30 J/cm2); aPDT 1 (aPDT-Ft-g + LV); aPDT 2 (aPDT-Hy-g + LA), três experimentos independentes foram realizados em triplicata (n=9). Para os dois estudos foi analisada a quantificação individual dos micro-organismos pela técnica de qPCR combinada com Propidium Monoazide (PMA). Os dados foram submetidos a análise estatística (α=0,05). Os resultados do modelo in vivo no período baseline quando comparados os grupos aPDTs com o grupo controle negativo para P. gingivalis foram, no grupo controle (6,89 ± 0,11), aPDT 1 (6,74 ± 0,26), aPDT 2 (5,88 ± 0,42); para F. nucleatum foram, no grupo controle (9,98 ± 0,20), aPDT 1 (9,76 ± 0,42), aPDT 2 (9,10 ± 0,43*); para A. actynomicetemcomitans foram, no grupo controle (9,75 ± 0,54), aPDT 1 (10,25 ± 0,47*), aPDT 2 (9,57 ± 0,14); para So foram, no grupo controle (2,62 ± 0,30), aPDT 1 (2,28 ± 0,30*), aPDT 2 (2,12 ± 0,14*); no período de 7 dias para P. gingivalis foram, no grupo controle (6,08 ± 0,39), aPDT 1 (7,13 ± 0,18*), aPDT 2 (6,73 ± 0,35); para F. nucleatum foram, no grupo controle (8,39 ± 0,27), aPDT 1 (9,45 ± 0,29*), aPDT 2 (9,42 ± 0,11*); para A. actynomicetemcomitans foram, no grupo controle (8,75 ± 0,30), aPDT 1 (8,36 ± 0,27), aPDT 2 (8,44 ± 0,44); para So foram, no grupo controle (2,55 ± 0,26), aPDT 1 (2,66 ± 0,20), aPDT 2 (2,75 ± 0,28); no período de 30 dias para P. gingivalis foram, no grupo controle (6,98 ± 0,31), aPDT 1 (6,95 ± 0,39), aPDT 2 (6,67 ± 0,38); para F. nucleatum foram, no grupo controle (9,18 ± 0,59), aPDT 1 (9,41 ± 0,42), aPDT 2 (9,26 ± 0,33); para A. actynomicetemcomitans foram, no grupo controle (8,75 ± 0,34), aPDT 1 (8,39 ± 0,35*), aPDT 2 (7,80 ± 0,75*); para S. oralis foram, no grupo controle (2,62 ± 0,35), aPDT 1 (2,93 ± 0,44), aPDT 2 (2,98 ± 0,26). Os resultados do modelo in vitro quando comparados os grupos aPDTs com o grupo controle negativo para A. actynomicetemcomitans foram, no grupo controle negativo (8,77 ± 0,93), aPDT 1 (6,74 ± 0,74*), aPDT 2 (9,05 ± 0,70); para F. nucleatum foram, no grupo controle negativo (8,99 ± 0,84), aPDT 1 (7,42 ± 0,52*), aPDT 2 (12,24 ± 0,42*); para P. gingivalis foram, no grupo controle negativo (6,60 ± 0,33), aPDT 1 (5,77 ± 0,58*), aPDT 2 (7,63 ± 0,23); para S. oralis foram, no grupo controle negativo (8,81 ± 0,49), aPDT 1 (8,34 ± 0,65), aPDT 2 (9,78 ± 0,20). Palavras – chave: Fotoquimioterapia. Biofilmes. Periodontite. Sánchez-Puetate JC. Evaluation of different photosensitizers in antimicrobial photodynamic therapy in the treatment of induced periodontal disease: in vivo and in vitro study [dissertação de mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2020. ABSTRACT Antimicrobial Photodynamic Therapy (antimicrobial Photodynamic Therapy - aPDT), has been used as an adjunct therapy in periodontal disease (PD). The objective of this work was to evaluate the antimicrobial effects of aPDT, with the photosensitizers Hypericin-glucamine (Hy-g) and Phthalocyanine-glucamine (Ft-g), in the treatment and progression of experimentally induced periodontal disease in rats, as well as on a model of multispecies biofilm in vitro. The microorganisms evaluated were Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis, ATCC 33277), Aggregatibacter actynomicetemcomitans (A. actynomicetemcomitans, JP2), Fusobacterium nucleatum (F. nucleatum, ATCC25586), e Streptococcus oralis (S. oralis, ATCC 35037). Two separate studies were conducted. In Study 1, the viability of microorganisms was evaluated in vivo using the periodontal disease model experimentally induced in rats after 7 days of PD induction. The animals were divided into 7 experimental groups (n = 8): Control Group; Phthalocyanine-glucamine (Ft-g); Hypericin-glucamine (Hy-g); Red LED (LV, 655nm; 34 J / cm2); Amber LED (LA, 590nm; 34.10 J / cm2); aPDT 1 (aPDT-Hy-g + LA); aPDT 2 (aPDT-Ft-g + LV). The animals were euthanized 7 and 30 days after the application of the treatments in the baseline period. In Study 2, the viability of microorganisms was evaluated in vitro using the multispecies biofilm model, the samples were divided into 8 experimental groups: Negative Control; Positive Control (0.12% chlorhexidine); Phthalocyanine- glucamine (Ft-g); Hypericin-glucamine (Hy-g); Red LED (LED-V, 660nm; 39.65 J / cm2); Amber LED (LED-A, 590nm; 39.30 J / cm2); aPDT 1 (aPDT-Ft-g + LV); aPDT 2 (aPDT-Hy-g + LA), three independent experiments were carried out in triplicate (n = 9). For both studies, the individual quantification of microorganisms was analyzed using the qPCR technique combined with Propidium Monoazide (PMA). The data were submitted to statistical analysis (α = 0.05). The results of the in vivo model in the baseline period when comparing the aPDTs groups with the P. gingivalis negative control group were, in the control group (6.89 ± 0.11), aPDT 1 (6.74 ± 0.26), aPDT 2 (5.88 ± 0.42); for F. nucleatum, in the control group (9.98 ± 0.20), aPDT 1 (9.76 ± 0.42), aPDT 2 (9.10 ± 0.43 *); for A. actynomicetemcomitans, in the control group (9.75 ± 0.54), aPDT 1 (10.25 ± 0.47 *), aPDT 2 (9.57 ± 0.14); for S. oralis, in the control group (2.62 ± 0.30), aPDT 1 (2.28 ± 0.30 *), aPDT 2 (2.12 ± 0.14 *); in the 7- day period for P. gingivalis, in the control group (6.08 ± 0.39), aPDT 1 (7.13 ± 0.18 *), aPDT 2 (6.73 ± 0.35); for F. nucleatum, in the control group (8.39 ± 0.27), aPDT 1 (9.45 ± 0.29 *), aPDT 2 (9.42 ± 0.11 *); for A. actynomicetemcomitans, in the control group (8.75 ± 0.30), aPDT 1 (8.36 ± 0.27), aPDT 2 (8.44 ± 0.44); for S. oralis, in the control group (2.55 ± 0.26), aPDT 1 (2.66 ± 0.20), aPDT 2 (2.75 ± 0.28); in the 30- day period for P. gingivalis, in the control group (6.98 ± 0.31), aPDT 1 (6.95 ± 0.39), aPDT 2 (6.67 ± 0.38); for F. nucleatum, in the control group (9.18 ± 0.59), aPDT 1 (9.41 ± 0.42), aPDT 2 (9.26 ± 0.33); for A. actynomicetemcomitans, in the control group (8.75 ± 0.34), aPDT 1 (8.39 ± 0.35 *), aPDT 2 (7.80 ± 0.75 *); for S. oralis, in the control group (2.62 ± 0.35), aPDT 1 (2.93 ± 0.44), aPDT 2 (2.98 ± 0.26). The results of the in vitro model when comparing the aPDTs groups with the negative control group for A. actynomicetemcomitans were, in the negative control group (8.77 ± 0.93), aPDT 1 (6.74 ± 0.74 *), aPDT 2 ( 9.05 ± 0.70); for F. nucleatum, in the negative control group (8.99 ± 0.84), aPDT 1 (7.42 ± 0.52 *), aPDT 2 (12.24 ± 0.42 *); for P. gingivalis, in the negative control group (6.60 ± 0.33), aPDT 1 (5.77 ± 0.58 *), aPDT 2 (7.63 ± 0.23); for S. oralis, in the negative control group (8.81 ± 0.49), aPDT 1 (8.34 ± 0.65), aPDT 2 (9.78 ± 0.20). Keywords: Photochemotherapy. Biofilms. Periodontitis. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 13 2 PROPOSIÇÃO .................................................................................................................... 18 3 REVISÃO DA LITERATURA .............................................................................................. 19 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................... 26 4.1 Estudo In Vivo ................................................................................................................. 26 4.2 Estudo In Vitro ................................................................................................................ 32 4.3 Análise Estatística Modelo Biofilme In Vivo ................................................................ 37 4.4 Análise Estatística Modelo Biofilme Multiespécie In Vitro ......................................... 38 5 RESULTADOS .................................................................................................................... 39 5.1 Efeitos Da aPDT No Modelo Biofilme In Vivo .............................................................. 39 5.2 Efeitos Da aPDT No Modelo De Biofilme Multiespécie In Vitro .................................. 42 6 DISCUSSÃO ....................................................................................................................... 45 7 CONCLUSÃO ..................................................................................................................... 49 REFERÊNCIAS ................................................................................................................... 50 ANEXO A – DECLARAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA ....................................................... 62 APÊNDICE A –RESULTADOS ........................................................................................... 63 13 1 INTRODUÇÃO O entendimento da patogênese das doenças e condições periodontais está continuamente mudando com o aumento do conhecimento científico. A Periodontite é definida como uma doença inflamatória dos tecidos de suporte dos dentes, causada por grupos de micro-organismos específicos, sítio-específica e caracterizada por sinais clínicos como inflamação, sangramento à sondagem e perda de inserção1,2. A terapia periodontal visa reduzir a carga microbiana, mediante remoção mecânica do biofilme para impedir ou retardar a progressão da doença periodontal3 e atualmente o tratamento mais usado é a remoção e desorganização do biofilme, sendo a Raspagem e o Alisamento Radicular (RAR) a terapia não-cirúrgica de escolha. Os resultados clínicos obtidos com RAR são, em geral, satisfatórios4–6. No entanto, esta terapia pode apresentar limitações em determinados quadros clínicos, assim, novas terapias têm surgido como alternativas terapêuticas7,8. Sabendo da crescente resistência de algumas cepas bacterianas pelo uso de antibióticos e do interesse em buscar estratégias terapêuticas que apresentem pouco ou nenhum efeito colateral, nos últimos anos, vêm sendo utilizadas terapias com fontes de luzes (Lasers e LEDs) para o tratamento das doenças periodontais8. Neste contexto, a terapia fotodinâmica antimicrobiana (aPDT – Photodynamic Antimicrobial Therapy) tem relevância por ser um procedimento coadjuvante pela sua ação antimicrobiana e pela pouca invasividade. Vários estudos têm comprovado a eficácia da aPDT, tanto em modelos in vitro como in vivo9–15, porém ainda não existe consenso para benefícios da aPDT. A aPDT como mostrado na Figura 1, consiste na utilização de um fotossensibilizador (FS) associado a uma fonte de luz (LASER/LED), capaz de excitar o FS formando radicais livres e espécies altamente reativas de oxigênio, que subsequentemente produzem a morte bacteriana e destruição dos seus subprodutos14,16. A aPDT apresenta segurança na sua utilização, devido aos seus produtos e subprodutos não serem citotóxicos com células não alvo (aonde o FS não teve permeabilidade)17. 14 Figura 1 – Diagrama de Jablonski Fonte: Adaptado de Cieplik et al.18 2018 para o português. Estudos tem demonstrado que a aPDT é uma terapia coadjuvante no tratamento da periodontite crônica, retratamento de bolsas residuais, coadjuvante na terapia cirúrgica, terapia de manutenção, dentre outros19–21. Sua indicação na terapia de manutenção tem como vantagem o menor desgaste da superfície radicular, neste caso reduzindo a incidência da hipersensibilidade dentinária causada pela remoção excessiva do cemento radicular nas sessões de manutenção de RAR22. Os estudos do grupo de pesquisa de Garcia et al.12 e Theodoro et al.22 que avaliaram a utilização da terapia fotodinâmica em associação a raspagem e alisamento radicular, em vários modelos, concluíram que a aplicação de aPDT como tratamento adjunto à RAR reduziu significativamente os níveis de A. actinomycetemcomitans, além de observarem menor perda óssea em área de furca quando realizada apenas uma aplicação da aPDT. Vários FS estão mencionados na literatura, sendo as fenotiazinas como o azul de metileno e azul de toluidina os mais citados, porém estes estudos não têm demonstrado vantagens clínicas no tratamento periodontal23,24, indicando, desta forma, a necessidade de novos estudos com objetivo de testar novos FS. A literatura mostra que as bactérias Gram-positivas (G+) podem ser eliminadas por diversos FS e doses mais baixas de irradiação do que bactérias 15 Gram-negativas (G-)25,26. Os parâmetros importantes do FS para esta interação bacteriana incluem: solubilidade relativa em água e lipídios, capacidade de ionização, fatores específicos como as características de absorção de luz, e a eficiência da formação do estado excitado triplete ou da produção de oxigênio singleto26–28. Portanto, para uma maior eficiência da inativação dos micro-organismos, essas diferenças devem ser superadas modificando o FS quanto a sua hidrofobicidade e carga, de acordo com a característica celular de cada micro- organismo26. A importância da hidrofobicidade baseia-se que em meio aquoso leva à autoagregação e, em muitos casos, a uma subsequente precipitação, reduzindo drasticamente a capacidade do composto de gerar espécies reativas de oxigênio, desse modo, é necessário que o princípio fotoativo apresente-se solúvel em meio aquoso para possível aplicação clínica. A Hipericina (Figura 2) é um FS natural, presente em plantas herbáceas conhecidas como erva de São João (gênero Hypericum perforatum)29. Possui propriedades anti-inflamatórias, antissépticas, anti-infecciosas, antivirais, estimula a circulação sanguínea e elimina hematomas29–33. É considerada uma quinona policíclica (Figura 2a) que, quando ativada, reage com moléculas vizinhas por transferência de energia ao oxigênio, induzindo a produção do oxigênio singlete (1O2), além de ser potente e fotoestável32,34,35. Figura 2 - Estrutura química da Hipericina: estrutura base da Hipericina (2a), e sua espécie supramolecular Hipericina-glucamina (2b) Fonte: Macedo et al.36 16 O FS Hipericina possui característica hidrofóbica e, perde a sua ação quando em meio biológico. Uma estratégia proposta para melhorar o comportamento químico é a indução da formação de espécies supramoleculares hidrofílicas. Uma supramolécula é uma espécie química constituída por duas ou mais moléculas, unidas por interações moleculares, visando a obtenção de uma determinada propriedade ou funcionalidade37. No caso da Hipericina, para a formação de uma supramolécula hidrofílica, é induzida uma reação a partir do grupo fenólico, que cede o próton H+, formando a Hipericina-glucamina (Figura 2b). A presença de vários grupos hidroxila na supramolécula Hipericina-glucamina, fornece os sítios onde as ligações de hidrogênio serão estabelecidas, aumentando sua hidrofilicidade. Em estudos prévios in vitro, foram avaliadas diferentes concentrações do FS Hipericina. Os resultados mostraram que a concentração de 10 mg/mL foi capaz de eliminar bactérias G+ e G-26. As Ftalocianinas (Figura 3), que são corantes sintéticos semelhantes às porfirinas e estruturalmente consideradas azaporfirinas38 têm sido estudadas e avaliadas suas aplicações39–41. A Ftalocianina é um macrociclo simétrico composto por quatro unidades iminoisoindol com uma cavidade central de tamanho suficiente para acomodar vários íons metálicos e este metal central possui influência considerável em sua propriedade fotossensibilizadora38,42. Entre as Ftalocianinas, a Ftalocianina de cloro-alumínio tem sido sugerida por possuir propriedades fotofísicas favoráveis para uso em aPDT, uma vez que produz altas quantidades de oxigênio singlete40. A eficácia desse FS associado à luz LED foi comprovada em um estudo in vitro que avaliou o potencial fotodinâmico da Ftalocianina de cloro-alumínio diluída em nanoemulsão catiônica para inativar as culturas planctônicas e de biofilmes formados por Candida albicans41. Outros estudos43–47 têm corroborado a eficiência das Ftalocianinas como agentes fotossensíveis na eliminação de micro-organismos periodonto patogênicos com uso em aPDT. 17 Figura 3 - Estrutura química da Ftalocianina: Estrutura base da Ftalocianina (3a), Ftalocianina acomodando o íon metálico zinco (3b), e a sua espécie supramolecular Ftalocianina-glucamina (3c) Fonte: de Melo et al.48 Portanto, observa-se que a utilização da aPDT demonstrou efeito antimicrobiano contra vários periodonto patogênicos49,50, além de ser capaz de reduzir fatores-chave de virulência como lipopolisacarídeos e proteases49,51,52, e inativar citocinas inflamatórias do hospedeiro, tais como interleucina 1β e TNFα51. Conhecendo as propriedades dos FS Hipericina-glucamina e Ftalocianina- glucamina, os objetivos deste estudo foram avaliar in vivo (modelo de doença periodontal induzida em ratos) a viabilidade das bactérias periodonto patogênicas presentes nas ligaduras dos animais após o tratamento com aPDT nos diferentes períodos, utilizando a técnica de qPCR (PCR quantitativo em tempo real) em combinação com Propidium Monoazide (PMA), e in vitro, avaliar a viabilidade das bactérias periodonto patogênicas (modelo de biofilme multiespécie) após o tratamento com aPDT, utilizando a técnica de qPCR (PCR quantitativo em tempo real) em combinação com PMA. 49 7 CONCLUSÃO De acordo com as metodologias utilizadas e dentro das limitações dos estudos, podemos concluir: 1. A aPDT apresenta reduções na viabilidade das cepas que foram utilizadas nos diferentes modelos. 2. Embora os fotossensibilizadores utilizados, tenham sido modificados para melhorar o comportamento nos modelos estudados, ainda é limitada a sua ação contra micro-organismos anaeróbios e G- em forma de biofilmes. 3. Mais estudos in vitro e in vivo são necessários para elucidar a ação da aPDT e o efeito destes fotossensibilizadores como terapia coadjuvante no tratamento da Doença Periodontal. 50 REFERÊNCIAS* 1. Azarpazhooh A, Shah PS, Tenenbaum HC, Goldberg MB. The effect of photodynamic therapy for periodontitis: a systematic review and meta- analysis. J Periodontol. 2010;81(1):4-14. doi:10.1902/jop.2009.090285 2. Wolff L, Dahlén G, Aeppli D. Bacteria as risk markers for periodontitis. J Periodontol. 1994;65(5 Suppl):498-510. doi:10.1902/jop.1994.65.5s.498 3. Grzech-Leśniak K, Gaspirc B, Sculean A. Clinical and microbiological effects of multiple applications of antibacterial photodynamic therapy in periodontal maintenance patients. A randomized controlled clinical study. 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