UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA Trabalho de Conclusão de Curso “Identificação Molecular e Genotipagem pela técnica de Spoligotyping de Mycobacterium tuberculosis isolado da população indígena e não-indígena do Mato Grosso do Sul (MS).” Leonardo Biancolino Marino Orientadora: Profª. Drª. Clarice Queico Fujimura Leite ARARAQUARA – SP 2011 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CAMPUS DE ARARAQUARA Trabalho de Conclusão de Curso “Identificação Molecular e Genotipagem pela técnica de Spoligotyping de Mycobacterium tuberculosis isolado da população indígena e não-indígena do Mato Grosso do Sul (MS).” Leonardo Biancolino Marino Orientadora: Profª. Drª. Clarice Queico Fujimura Leite Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista para obtenção do grau de Farmacêutico-Bioquímico. ARARAQUARA - SP 2011 Dedicatória Aos meus pais Altair Alaor Marino e Silmara Biancolino Marino, pela dedicação e presença constantes em minha vida, pelo apoio e amor incondicional e pela formação do meu caráter, sem os quais nada disso seria possível. Por representarem o meu “porto-seguro”, o meu exemplo e minha maior motivação. Dedicatória À Querida Profa. Dra. Clarice Queico Fujimura Leite, que durante esses anos representou muito mais que uma Orientadora, acreditando no meu trabalho e me dando esta oportunidade tão importante em minha vida. Agradeço pelas palavras de incentivo e pela possibilidade de conviver com alguém tão íntegro, que sem dúvida alguma será um dos maiores exemplos que terei para construir minha carreira. Agradecimentos Primeiramente a Deus, por tudo que sempre me concedeu e me concede, pela capacidade e pela força nos momentos de dificuldade, por me guiar pelos melhores caminhos e por me abençoar a cada dia com seu amor paternal. Aos meus grandes amigos Adolfo Carlos Barreto Santos, Fernando Rogério Pavan, Marcelo Miyata e Daisy Nakamura Sato, pela paciência, pelos ensinamentos e por tornarem possível a minha continuidade no campo da pesquisa científica. Durante todo esse tempo me passaram valores essenciais de um profissional, com base na competência e experiência que tanto lhes são características. Às minhas amigas Natália Helena Mendes, Leticia Sumie Sato, Isabella Santos e Heloísa Barbosa de Barros pelos momentos inesquecíveis e pelo ambiente de amizade criado no laboratório. Ao PIBIC/CNPq, pelo financiamento do Projeto. Sumário Lista de tabelas e figuras Lista de Siglas e Abreviaturas Resumo 1. Introdução 11 2. Objetivos 16 3. Material e Métodos 17 3.1. Parecer ético de pesquisa e Isolados de M. tuberculosis 17 3.2. Confirmação da pureza e identificação dos isolados 18 3.3. Técnica de Spoligotying 21 4. Resultados 23 4.1. PCR-IS6110 e PRA 23 4.2. Spoligotyping 26 4.3. Aprendizado com o Projeto 32 5. Conclusão 32 6. Referências Bibliográficas 33 7. Publicações 41 Lista de tabelas e figuras Figura 1 Gel de agarose, representando o perfil de 20 amostras positivas para o Complexo M. tuberculosis (amplificação do fragmento de 245 pb). 24 Figura 2 Perfis de PRA de 3 das amostras submetidas a esta técnica. 24 Figura 3 Figura explicativa utilizada pelo banco de dados para interpretação dos resultados de PRA. Tamanhos moleculares podem varia em uma taxa de + ou – 5 pb, o que não representa um problema na identificação. 26 Tabela 1 Tabela resumindo os resultados de Spoligotyping para as 97 amostras. 28 Figura 4 Dendrograma correspondente as 97 amostras analisadas por Spoligotyping. 30 Lista de Siglas e Abreviaturas μL Microlitro μM Micromolar μm Micrômetro μg Micrôgrama A Adenina BAAR Bacilo Álcool Ácido Resistente C Citosina CAS Central and Middle Eastern Asia C.F. Clemente Ferreira CMTB Complexo Mycobacterium tuberculosis dATP Desoxiadenosina Trifosfato dCTP Desoxicitidina Trifosfato dGTP Desoxiguanosina Trifosfato dTTP Desoxitimidina Trifosfato DNA Ácido Desoxirribonucléico DR Direct Repeat EAI East-African Indian EDTA Ácido etileno-diamino-tetracético EST Estreptomicina EBM Etambutol G Guanina H Haarlem Hab. Habitantes HIV Vírus da Imunodeficiência Humana INH Isoniazida IS Sequência de inserção LACEN Laboratório Central LAM Latin-American-Mediterranean L.J. Löwestein-Jensen km² Quilomêtros Quadrados MgCl2 Cloreto de Magnésio mL Mililitro mM Milimolar MDR Multi Droga Resistente MIRU Mycobacterial Interspersed Repetitive Units MS Mato Grosso do Sul M. tuberculosis Mycobacterium tuberculosis nmol Nanomol pb Pares de bases PCR Polymerase Chain Reaction pH Potencial hidrogeniônico pmol Picomol PRA PCR-restriction enzyme pattern analyses PZA Pirazinamida R Resistente RFLP Restriction Fragment Lenght Polymorphism RIF Rifampicina S Sensível SDS Sodium Dodecyl sulfate Spoligotyping Spacer Oligonucleotide Typing SIT Shared International Spoligotypes ST Shared-types T Timina TB Tuberculose TE Tampão Tris-EDTA Tris Tris (hidroximetil) aminometano U Unidade VNTR Variable Number of Tandem Repeats WHO World Health Organization x Vezes Resumo O presente trabalho baseou-se na análise de amostras de isolados de M. tuberculosis provenientes da população indígena e não indígena do Mato Grosso do Sul. As análises foram feitas basicamente por três técnicas de Biologia Molecular: PCR-IS6110 e PRA (para identificação) e Spoligotyping (para genotipagem), ressaltando que somente as amostras negativas para PCR-IS6110 foram submetidas ao PRA. Os objetivos do estudo eram: confirmar por técnicas moleculares de PCR e de PRA a identificação do complexo M. tuberculosis e de outras micobactérias, após o descongelamento e cultivo, analisar a incidência de isolados de M. tuberculosis da região do Mato Grosso do Sul que não tem o IS6110, avaliar a incidência de outras micobactérias entre a população indígena e não indígena do Mato Grosso do Sul, agrupar em famílias, por similaridade epidemiológica os isolados de M. tuberculosis procedentes da população indígena e não indígena com TB e avaliar a presença efetiva de grupos genéticos predominantes; Pela técnica de PCR-IS6110, analisamos um total de 119 isolados clínicos, sendo que apenas 6 apresentaram negatividade, sendo assim submetidos à técnica do PRA. Feito isso, também apresentaram resultado positivo para CMTB, nos permitindo concluir que essas técnicas podem se tornar ferramentas de grande valia no diagnóstico rápido da TB. Pela técnica de genotipagem do Spoligotyping foram analisadas 97 amostras e foi constatado um maciço predomínio da família LAM, principalmente da subfamília LAM 9, representados por 4 SITs, sendo SIT 42 com 44 isolados e SITs 177, 1337 e 1075 com respectivamente 4, 2 e 1 isolados cada (essa subfamília representou 52,6% do total de isolados). Outras famílias, tais como T, H e U também estiveram presentes no estudo em menores proporções. 11 1.Introdução A tuberculose (TB) é uma doença infecciosa transmitida pelo ar que pode ser curável, causada pelo M. tuberculosis, o “bacilo de Koch”. A principal via de transmissão é de pessoa a pessoa através de partículas infectantes, presente nas gotículas de 1,0 a 5,0 μm de diâmetro, produzidas pelos portadores de TB pulmonar ou laríngea ao tossir, espirrar ou falar (PANDOLFI et. al., 2007). Tal doença é um formidável desafio para a saúde pública, uma vez que contribui consideravelmente para elevadas taxas da doença e morte em todo o mundo. O agente causador mais comum da TB humana, M. tuberculosis, é um membro do complexo M. tuberculosis (CMTB), que inclui outras seis espécies intimamente relacionadas: M. bovis, M. africanum, M. microti, M. pinnipedii, M . caprae e M .canettii. Todos os membros CMTB são patógenos e podem causar a TB, no entanto, eles apresentam diferentes propriedades fenotípicas e gama de hospedeiros. Geneticamente, os membros do CMTB estão intimamente relacionados. O genoma do M. tuberculosis mostra > 99,9% de similaridade com M. bovis, a espécie que infecta principalmente bovinos, mas que também pode causar a TB em outros mamíferos inclusive o homem. A atual causa da epidemia de TB está sendo sustentada por dois fatores importantes: o vírus da imunodeficiência humana (HIV) e a crescente resistência das cepas do bacilo contra as drogas da primeira linha de tratamento (Ahmad 2010, Cole et. al., 1998 e Garnier et. al., 2003) . Entre os fatores de risco relacionados com a TB são citados: pobreza, desnutrição, imunodebilidade, ambientes fechados e aglomerados (Santos et. al., 2007). Segundo a OMS (Organização Mundial de Saúde), 1,7 milhões de pessoas morreram de TB em 2009, sendo 1,32 milhões de homens e 380000 mulheres, 380000 portadores de HIV (Vírus da Imunodeficiência Humana), com uma média de 4700 mortes por dia. Nesse mesmo 12 ano, houve 9,4 milhões de novos casos da doença, acometendo 6,1 milhões de homens e 3,3 milhões de mulheres e destes, 1,1 milhões eram portadores de HIV (WHO, 2009). Com os dados acima, fica evidente o quão alarmante é a situação da TB no mundo, o que faz necessária a adoção de medidas imediatas para o controle da mesma, principalmente no “Mundo subdesenvolvido”. Nesse contexto, a WHO, está trabalhando para reduzir drasticamente a ocorrência da doença no mundo, e reduzir pela metade as mortes e a prevalência de TB em 2015, através da sua estratégia "Stop TB" e apoiar o Plano Global do Stop TB. Seu objetivo é reduzir drasticamente a carga global da TB até 2015, assegurando que todos os pacientes com TB, incluindo, por exemplo, os co-infectados com HIV e aqueles com TB resistente a medicamentos, possam se beneficiar de um acesso a diagnóstico de alta qualidade e centrada no paciente em tratamento. A estratégia também apóia o desenvolvimento de ferramentas novas e eficazes para prevenir, detectar e tratar a TB. Os resultados já podem ser notados: a taxa de óbitos por TB caiu 35% desde 1990, a incidência caiu para 137 novos casos por 100.000 pessoas em 2009 e a taxa de pessoas tratadas e curadas com sucesso chegou ao nível mais alto em 2008, representando 86%. Desde 1995, 41 milhões de pessoas foram tratadas com sucesso e até 6 milhões de vidas salvas por meio do DOTS e da Estratégia Stop TB. 5.800 mil casos de TB foram notificados através de programas DOTS em 2009 (WHO, 2009). No Brasil, as taxas de incidência e prevalência da doença vêm acompanhando a tendência de declínio mundial. Em 1990, a incidência atingia 84 novos casos por 100000 habitantes, enquanto a prevalência era de 135 por 100.000 habitantes. Passados 19 anos, a incidência caiu para 45 novos casos por 100000 habitantes, enquanto a prevalência está em 50 para 100000 habitantes (WHO, 2009). Embora o declínio seja iminente em nosso país, algumas estatísticas ainda são preocupantes, como por exemplo os números da TB nas comunidades indígenas. Os dados 13 nacionais são insuficientes para a compreensão da situação epidemiológica da TB entre os povos indígenas. A incidência da TB nessas populações é elevada e, algumas vezes, os percentuais são dez vezes superiores aos encontrados na população brasileira em geral (Marques et al., 2010). Estima-se que a população indígena brasileira na época do descobrimento do Brasil estava em torno de 5 milhões de pessoas. Calcula-se que, atualmente, esta população foi reduzida a aproximadamente 385 mil índios (PORTAL CIDADÃO – FUNAI, 2008). Além da desnutrição, etilismo, doenças sexualmente transmissíveis, e as entero-parasitoses, a TB acompanha a população indígena desde o seu descobrimento, e foi responsável pela extinção de muitos povos indígenas (SOUSA et al., 1997). A TB em todas as suas formas clínicas nas comunidades indígenas brasileiras, no ano de 2003, alcançou coeficiente de incidência de 193,5 casos por 100.000 habitantes e, se consideradas as formas pulmonares positivas em que o diagnóstico etiológico é mais confiável, a taxa encontrada foi de 108/100.000, superando em muito a incidência nacional que se encontra em torno de 50/100.000 nas populações não indígenas (PORTAL CIDADÃO – FUNAI, 2008). O estado do Mato Grosso do Sul (MS) contabiliza hoje por volta de 58.000 indígenas, distribuídos em 71 aldeias, falantes de 05 idiomas distintos e 08 povos: Terena, Kadwéu, Kinikinawa, Guató, Ofaié-Xavante, Atikun, Guarani e Kaiowá (PORTAL CIDADÃO – FUNAI, 2008). No município de Dourados (MS), com a maior população indígena do MS (aproximadamente 12.000 índios), em 1999, a incidência da TB era de 700/100.000 habitantes. A partir do ano de 2002 esta incidência vem declinando, alcançando em 2005 um patamar de 180/100.000hab. O município de Corumbá, também no Mato Grosso do Sul, possui uma incidência de TB de 81,8/100.000hab., que é agravado por apresentar maior número de casos de pacientes multidrogas resistente de MS (SINAN, 2007). Este fato 14 provavelmente se deve ao fato do município de Corumbá fazer fronteira com a Bolívia que é um país extremamente pobre e com um programa de TB pouco organizado. Como parte do combate e controle da doença, além do grande auxílio à compreensão da epidemiologia, surgiu, na década de 1980, a utilização de ferramentas de biologia molecular aliadas as técnicas fenotípicas tradicionais já conhecidas, como por exemplo: morfologia de colônias, comparação de taxas de crescimento, susceptibilidade a drogas e testes bioquímicos. Ou seja, antes de métodos moleculares, a compreensão da disseminação de TB foi imprecisa e se baseou em dados observacionais ou correlações com poucos fundamentos. No entanto, dada a multiplicidade de técnicas moleculares disponíveis, é fundamental escolher um método apropriado para abordar uma questão particular do estudo, por exemplo, a dinâmica de transmissão, surtos ou filogenia (Mathema et. al., 2006). As ferramentas moleculares para o trabalho com M. tuberculosis ganharam um grande impulso com a publicação em 1998 do genoma completo da cepa laboratorial H37Rv (Cole et. al., 1998 e Mathema et. al., 2006). Estudos posteriores demonstraram que o genoma entre os membros do Complexo M. tuberculosis é altamente conservado, como por exemplo, o que ocorre na região ITS, um espaçador interno de transcrição nesses organismos (Mathema et. al., 2006). No presente trabalho, foram utilizadas técnicas de biologia molecular, sendo duas para identificação (PCR-IS6110 e PRA - PCR-restriction enzyme pattern analyses), e uma para genotipagem (Spoligotyping) das cepas provenientes do Estado do Mato Grosso do Sul. O IS6110 consiste em uma sequência de inserção da família das IS3, funcionando, na verdade, como um transposon. Essas sequências possuem normalmente menos de 2,5 kb de tamanho, e foram descritas pela primeira vez em M. tuberculosis por Thierry et. al., em 1990, que constatou que quando intactas essas sequências são particulares do M. tuberculosis. Outra sequência de inserção única do bacilo de Koch é o IS986, que difere do IS 6110 apenas em 15 três nucleotídeos (van Soolingen, et. al., 1991). Estudos anteriores, mostraram que cepas de M. tuberculosis possuem pelo menos uma cópia de IS 6110, usualmente de 6 a 15 cópias, podendo chegar algumas vezes a 20 cópias (Yuen, et. al., 1993). Porém em estudos realizados em dois estados australianos, foram encontradas cepas de M. tuberculosis que continham apenas uma ou não continham cópias do IS6110, e que posteriormente foram identificadas como sendo de indivíduos de origem vietnamita (Yuen, et. al., 1993). Em nosso laboratório, em trabalhos retrospectivos, analisando cepas de M. tuberculosis provenientes do Sanatório Clemente Ferreira de São Paulo e do Serviço Especial de Saúde de Araraquara, foi verificado ausência do IS6110 em cerca de 5% das cepas analisadas (dados não publicados). Para estas cepas de M. tuberculosis com ausência de IS6110, a confirmação foi feita pela técnica seguinte (PRA) ou por parâmetros bioquímicos através das técnicas tradicionais. A técnica de PRA foi desenvolvida por Telenti e colaboradores em 1993, consistindo na avaliação do gene que codifica para uma proteína de 65-kDa, a proteína do choque térmico (heat shock protein), através da realização de uma PCR para a identificação das espécies de Mycobacterium. O gene desta proteína contém “epítopos” que são únicos para determinadas espécies, assim como possui outros “epítopos” comuns a algumas espécies. A natureza conservada do gene permite então a diferenciação de micobactéria dentro de um dia, através da realização de uma digestão com enzimas de restrição dos produtos de PCR, feita com a utilização de primers comuns a todas as micobactérias. As enzimas que digerem o fragmento de 439 pares de base são as enzimas de restrição BstEII e HaeIII (Telenti et. al., 1993). Os produtos da digestão, quando separados por eletroforese em gel de agarose a 4%, apresentam perfis específicos de cada espécie de micobactéria (Tortoli et. al., 2003). Para genotipagem, no presente trabalho foi realizada a técnica de Spoligotyping com a finalidade de caracterizar nos isolados identificados como de M. tuberculosis por técnicas moleculares, as estirpes circulantes na população indígena e não indígena do Mato Grosso do 16 Sul. O emprego desta técnica possibilita agrupar os isolados em famílias. Esta técnica, descrita por Kamerbeek et al. (1997) é baseada na amplificação in vitro de um único locus altamente polimórfico no genoma de M. tuberculosis contendo múltiplas direct repeats – DRs, método que pode ser realizado em laboratórios sem equipamentos sofisticados. A subseqüente hibridização diferencial dos produtos amplificados é realizada com oligunucleotídeos complementares às regiões espaçadoras variáveis, localizadas entre as DRs que estão ligados à membrana (Molhuizen et. al., 1998). A presença das seqüências espaçadoras varia entre diferentes cepas e é visualizada por uma mancha em um ponto fixo da membrana de hibridização. O método é simples, rápido e robusto, e muito utilizado em inquérito epidemiológico em larga escala, sendo considerada uma ferramenta de primeira linha para o estudo da diversidade genética de isolados de M. tuberculosis (Kanduma et. al., 2003). Este projeto faz parte do projeto de doutorado intitulado “Genotipagem de isolados de M. tuberculosis provenientes das comunidades indígenas e não indígenas do Mato Grosso do Sul (MS)” e tem aprovação do comitê de ética em pesquisa (CONEP parecer n° 689/2007). O trabalho é de grande interesse em Saúde Pública uma vez que possibilita um diagnóstico rápido da TB bem como o estudo da transmissão e caracterização de genótipos prevalentes de M. tuberculosis dentro da população em estudo. 2. Objetivos Em vista do exposto, o presente trabalho teve como objetivo realizar a identificação molecular dos isolados clínicos provenientes do Mato Grosso do Sul, pelas técnicas de PCR- IS6110 e PRA e realizar a genotipagem pela técnica do Spoligotyping dos isolados de M. tuberculosis identificados. 17 Com este estudo, buscou-se alcançar os seguintes objetivos específicos. -Confirmar por técnicas moleculares de PCR e de PRA a identificação do complexo M. tuberculosis e de outras micobactérias, após o descongelamento e cultivo; -Analisar a incidência de isolados de M. tuberculosis da região do Mato Grosso do Sul que não tem o IS6110; -Avaliar a incidência de outras micobactérias entre a população indígena e não indígena do Mato Grosso do Sul; -Agrupar em famílias, por similaridade epidemiológica os isolados de M. tuberculosis procedentes da população indígena e não indígena com TB; -Avaliar a presença efetiva de grupos genéticos predominantes; -Propiciar ao aluno de graduação o aprendizado do manuseio de bactéria nível 3 de segurança biológica (NB3); -Propiciar ao aluno, o aprendizado das técnicas de biologia e de epidemiologia molecular da TB; -Propiciar ao aluno, o desenvolvimento científico e crítico dos aspectos concernentes a TB, considerada no Brasil uma das principais doenças negligenciáveis. 3. Material e Métodos 3.1. Parecer ético de pesquisa e Isolados de M. tuberculosis O projeto teve a aprovação do comitê de ética em pesquisa “CONEP parecer n° 689/2007”. Foram analisados isolados de M. tuberculosis provenientes de pacientes indígenas de aldeias do Mato Grosso do Sul - MS atendidos pelos laboratórios de fronteira LACEN - MS. Nestes, o diagnóstico de TB pulmonar foi suspeitado pelo histórico clínico do paciente e confirmado pelo médico e pelo diagnóstico laboratorial através da baciloscopia, do 18 isolamento em cultura e da identificação pela metodologia clássica do M. tuberculosis. As cepas foram congeladas e estocadas em temperatura -20°C. Esta primeira etapa do trabalho foi realizada no Laboratório Central de Saúde Pública – LACEN – MS. 3.2. Confirmação da pureza e identificação dos isolados A reativação e verificação da pureza da suspensão bacteriana foram feitas da seguinte maneira: após o descongelamento à temperatura ambiente, 200μL de cada isolado bacteriano foi colocado em 2,0mL do meio 7H9 enriquecido com OADC (BD BBL®) e acrescido de 20μL do antifúngico Ciclohexemida à 5% e incubado a 37ºC por 7 dias, com agitação manual uma vez ao dia. Em presença de turvação, o material foi submetido à confecção de um esfregaço, utilizando uma alíquota de 50μL sendo depositada em uma lâmina, e após o espalhamento, fixada pelo calor e corada pela técnica de Ziehl-Neelsen, para verificação de cultura pura de Bacilos Álcool Ácido Resistentes (BAAR). Em caso positivo, o conteúdo de 200μL de cada tubo, com cultura supostamente reativada, foi transferido para dois tubos contendo meio sólido de Löwestein-Jensen (LJ) inclinado, sendo incubado por no mínimo 21 dias a 37ºC podendo chegar a 60 dias. Após o aparecimento de colônias visíveis o isolado foi submetido à técnica de PCR. Inicialmente, foi realizada a extração de DNA através da termólise segundo MAZARS, 2001, com pequenas modificações. O procedimento constituiu em submeter, uma alçada da colônia crescida em meio sólido acrescido em 300μL de tampão TE (pH 8,0) em um microtubo com tampa de trava, a três ciclos de fervura por 10 minutos seguido de congelamento a -20ºC. A PCR foi feita segundo VAN EMBDEN et al. (1993), com pequenas modificações. Após a multiplicação bacteriana no meio de Löwestein Jensen (LJ), as culturas positivas foram 19 confirmadas como sendo de M. tuberculosis pela técnica de PCR, empregando o par de oligonucleotídeos iniciadores INS1 (5’-CGTGAGGGCATCGAGGTGGC-3’) e INS2 (5’- GCGTAGGCGGTGACAAA-3’) que amplifica um fragmento de 245pb especifico do complexo M. tuberculosis contidos na seqüência de inserção IS6110. Para a amplificação (VAN EMBDEN et al., 1993), em linhas gerais, no volume final da reação de 25μL, foram adicionados 21,5μL de “Master Mix” (PROMEGA® na diluição de 2 partes de PCR Master Mix 2x para 1 parte de água ultrapurificada, contendo: Taq DNA Polimerase, dNTPs, MgCl2 e tampões reacionais), 0,5μL dos oligonucleotídeos iniciadores INS1 e INS2 na concentração de 20μM e 2,5μL do DNA de cada amostra, extraído por termólise, e a mistura da reação foi amplificada no Termociclador empregando o seguinte protocolo de ciclagem: 1 ciclo de 10 minutos à 95 ºC (para desnaturação da dupla fita de DNA), seguido de 30 ciclos de 1 minuto à 94 ºC (para desnaturação da dupla fita a cada ciclo), 2 minutos à 56 ºC (para hibridização dos oligonucleotídeos) e 1 minuto a 72 ºC (para elongação da polimerização), finalizando com 10 minutos à 72 ºC (para assegurar o processo e aumentar eficiência) e mantido sob refrigeração à 4 ºC até o momento da revelação. Na seqüência, 15μL do produto amplificado foram aplicados em gel de agarose a 1% contendo 4μL de Brometo de etídio na concentração de 10μg/mL, e o produto da amplificação resolvido por eletroforese a 90 volts e padrão de peso molecular de 50 pares de bases aí adicionado. A eletroforese foi fotodocumentada, empregando o equipamento Alpha Imager – Alpha Innotech®. A presença de um produto de amplificação de 245 pares de base confirmou a identificação de M. tuberculosis. Os isolados cujo produto de amplificação esteve ausente, foram submetidos a técnica do PRA para identificação da espécie. A técnica do PRA foi realizada segundo PLIKAYTIS et al. (1992) e TELENTI et al. (1993). 20 Utilizando o DNA extraído por termólise descrito anteriormente, os isolados foram submetidos à PCR para amplificação do gene hsp65 produzida com a utilização dos oligonucleotídeos iniciadores Tb11 (5’-ACCAACGATGGTGTGTCCAT-3’) e Tb12 (5’- CTTGTCGAACCGCATACCCT-3’). Empregando volume final de 30μL em cada reação, foram utilizados 27μL de Master Mix (PROMEGA®) na diluição recomendada pelo fabricante de 1 parte de Master Mix 2x para 1 parte de água ultra-pura, e 0,25μL (25pmoles) de cada oligonicleotídeo iniciador (Tb11 e Tb12) e 2,5μL do DNA extraído por termólise. Para a amplificação foram utilizados o seguinte protocolo de ciclagem: 1 ciclo de 10 minutos à 94 ºC, seguido de 45 ciclos de 1 minuto à 94 ºC, 1 minutos à 60 ºC e 2 minuto a 72 ºC, finalizando com 10 minutos à 72 ºC e mantido sob refrigeração à 4 ºC até o momento da revelação. 10μL dos produtos dessa amplificação foram submetidos à eletroforese em gel de agarose a 1%, contendo 6,0μL brometo de etídio (10μg/mL) e em seguida fotodocumentada. Os isolados que apresentaram amplificados fragmentos de 439 pares de base foram submetidos à digestão com as enzimas de restrição BstEII e HaeIII. Para cada enzima de restrição foi feita uma reação com volume final de 20μL. Acrescidos em 7,5μL de água ultrapurificada (MiliQ), 2,0μL do tampão da enzima, 0,5μL de cada enzima (BstEII e HaeIII) e 10μL do produto amplificado. Para a digestão, a enzima BstEII foi incubada a 60ºC por 1 hora e para a HaeIII a 37ºC também por 1 hora. Após a incubação, os produtos digeridos foram submetidos a nova eletroforese em gel de agarose, porém agora a 4%, e a coloração com o brometo de etídio. Junto com o produto da digestão foi aplicado no gel padrões de peso molecular de 25 e de 50 pares de base. Após a eletroforese o gel foi fotodocumentado. 21 A interpretação dos resultados foi feita através de um site desenvolvido por alguns Institutos de pesquisa internacionais em parceria com o Instituto Adolfo Lutz (São Paulo - SP) denominado PRASITE (http://app.chuv.ch/prasite/index.html). O PRASITE consiste em uma página de internet onde é possível inserir os perfis encontrados após a digestão do produto amplificado pelas enzimas de restrição BstEII e HaeIII. A página informa a identificação da micobactéria com o perfil eletroforético informado. 3.3. Técnica de Spoligotying Esta técnica foi realizada segundo KAMERBEEK et al. (1997). Para a amplificação das regiões espaçadoras entre as DR foram utilizados os primers Dra (5´- GGTTTTGGGTCTGACGAC-3´) e DRb (5´-CCGAGAGGGGACGGAAAC-3´) e 1μL do DNA genômico extraído. A ciclagem no termociclador consistiu em 1 ciclo de 15 minutos à 95ºC, 20 ciclos de 1 minuto à 95ºC, 1 minuto à 55ºC e 30 segundos à 72ºC, finalizando com 1 ciclo de 5 minutos a 72ºC. Mantidos a temperatura de 4ºC até o momento do uso. Para a hibridização, a membrana foi previamente lavada por 5 minutos à 65ºC com 250 mL de SSPE 2x SDS 0,1% e posicionada sobre o suporte cushion no miniblotter (Immunetics®), de forma que os canais ficassem perpendiculares à sua aplicação, sendo então parafusada no miniblotter. Os produtos da PCR foram desnaturados por 10 minutos a 100ºC no termociclador e colocados imediatamente no gelo. Cada um dos canais foi preenchido com o produto da PCR diluído e desnaturado, evitando-se formação de bolhas. Os canais negativos foram preenchidos com 150μL de SSPE 2x SDS 0,1%. Os resíduos de líquidos presentes em cada canal na membrana foram aspirados. O miniblotter foi incubado por 60 minutos à 60ºC na posição horizontal e sem agitação. Antes da remoção da membrana do blotter, todos os 22 canais foram aspirados utilizando bomba à vácuo. A membrana após duas lavagens de 10 minutos à 60ºC com 250 mL de SSPE 2x SDS 0,5% pré-aquecido, foi transferida para o rolling bottle até o resfriamento. Adicionou-se à membrana, 10 mL de SSPE 2x SDS 0,5% com 10μL de estreptavidina incubando-a no forno de hibridação à 42ºC por 45 à 60 minutos. A membrana foi submetida à duas lavagens com 250mL de SSPE 2x SDS 0,5% por 10 minutos à 42ºC e duas lavagens com 250 mL de SSPE 2x por 5 minutos a temperatura ambiente, além de incubação por 1 minuto com 20 mL da mistura ECL, retirando-se o excesso de líquido em papel. A membrana, coberta com plástico PVC, foi colocada em cassete e, em sala escura, adicionado o filme de raio-x. A membrana ficou exposta por 20 a 30 minutos antes de sua revelação, seguindo instruções do fabricante. A membrana foi analisada de 3 em 3 espaçadores, onde para cada espaçador um valor é atribuído, 4, 2 e 1 respectivamente. Em presença dos espaçadores, os valores foram somados, por exemplo, se o isolado apresentar os 3 espaçadores o valor será 7, se o isolado não apresentar o segundo espaçador o valor será 5, e a interpretação é realizada até obter o número de 15 dígitos para cada isolado. Spoligotipos comuns a mais de um isolado foi designado de “Shared Type” (ST) e atribuídos a eles, um número “Shared International Type” (SIT) de acordo com a base de dados internacional SpolDB4.0 e comparado com SITVIT, que é uma versão atualizada do banco de dados SpolDB4.0 (Brudey et. al., 2006), disponível em HTTP://www.pasteur.guadalupe.fr.8081/SITVITdemo/index.jsp. Com o auxílio do SpolDB4.0 e do SITVIT, os spoligotipos foram agrupados em famílias e subfamílias. Para spoligotipos não relatados no SpolDB4.0 e SITVIT, o banco de dados Spotclust foi utilizado (VITOL et. al. 2006), que tem como base o banco de dados SpolDB3.0, disponível em HTTP://cgi2.cs.rpi.edu/~bennek/SPOTCLUST.html. O Spotclust permite verificar a porcentagem de similaridade do ST com as subfamílias já existentes. Determinado o perfil, 23 cada família foi analisada comparativamente empregando o programa Bionumerics, Euclidiana (Applied Maths®) e construído um dendrograma de acordo com a similaridade genética. 4. Resultados e Discussões 4.1. PCR-IS6110 e PRA Foram analisados 119 isolados clínicos identificados como de M. tuberculosis por ensaios fenotipicos, provenientes de pacientes do Estado do Mato Grosso do Sul (indígenas e não indígenas) pelo método de PCR-IS6110. Em 113 (94,96%) desses isolados foi verificado resultado positivo para Complexo M. tuberculosis já nessa primeira técnica. Os outros 6 isolados (5,04%), com resultado negativo pela técnica de PCR-IS6110, foram submetidos à técnica do PRA. A positividade para o IS6110 foi evidenciada pelo aparecimento de banda nítida de 245pb no gel de agarose a 1% (Fig.1). No PRA os resultados foram dependentes da análise do tamanho dos fragmentos no gel de agarose a 4%, após a utilização das duas enzimas de restrição (BstEII e HaeIII), além do auxilio de um banco de dados denominado PRASITE (http://app.chuv.ch/prasite/index.html). Os 6 isolados clinicos negativos para IS6110, forneceram os seguintes perfis no PRA: bandas de 245/115/85 pb para a enzima BstEII e 150/120/70 pb para a enzima HaeIII (Fig. 2). Junto ao PRASITE os fragmentos gerados pelas enzimas de restrição confirmaram a identificação desses seis isolados como sendo membros do Complexo M. tuberculosis. 24 Fig. 1: Gel de agarose, representando o perfil de 20 amostras positivas para o Complexo M. tuberculosis (amplificação do fragmento de 245 pb). Fig. 2: Perfis de PRA de 3 das amostras submetidas a esta técnica. Empregando apenas a técnica do PCR-IS6110 a partir da cultura, foi possível identificar M. tuberculosis em 94,96% dos isolados clínicos, em um dia de jornada de trabalho. Associando 25 o ensaio do PRA, foi alcançada 100% de identificação em três dias de trabalho, tornando o emprego das duas técnicas de biologia molecular ferramenta altamente promissora na identificação rápida e acurada dos membros do Complexo M. tuberculosis. Para a mesma identificação do Complexo M. tuberculosis pelas técnicas fenotípicas convencionais são necessários pelo menos 14 dias de jornada de trabalho (Gurung et. al., 2010). A porcentagem de isolados clínicos do Complexo M. tuberculosis que não apresentam cópias da IS6110, foi de aproximadamente 5% (6/119), com respeito a população do Mato Grosso do Sul (a maioria da região de Dourados). Este resultado é compativel com os obtidos previamente em nosso laboratório: em estudos anteriores no Sanatório Clemente Ferreira de São Paulo e do Serviço Especial de Saúde de Araraquara (SESA), encontramos aproximadamente 5% das cepas com ausência da sequência de inserção. Estudos posteriores no SESA (2002 a 2006) apresentaram 7,4% das cepas com ausência de IS6110 e no Sanatório Clemente Ferreira (período 2006 a 2008) nenhuma cepa apresentou ausência do IS6110. Yuen et. al.,1993, observou em pacientes de origem vietnamita, uma porcentagem maior de 9,75% (4/41) de isolados que não continham tal sequência de inserção. Nos estudos de van Soolingen et. al., 1993, ficou evidente o quanto a presença de um baixo número de cópias do IS6110 pode dificultar um diagnóstico ou o estudo dos polimorfismos. Nesse estudo, 21 das 63 cepas provenientes do sul da Índia (33,33%) apresentavam apenas uma cópia do transposon, e uma das amostras não apresentava nenhuma cópia. Com essa adversidade, surgiram outras propostas de identificação molecular de micobactérias do Complexo M. tuberculosis. Lazzarini et. al., 2007, utilizaram a IS1561 para a identificação das estirpes circulantes no Rio de Janeiro. Porém, em 30% (121/404) das amostras essa sequência (IS1561´) também estava ausente, provavelmente por deleções ou modificações em 10 genes causadas pela recombinação de homólogos de 2 genes similares codificadores de proteínas. Estas cepas foram denominadas como RDRio, apresentando como 26 ancestral comum um membro com “spoligotipo” da família LAM (Latin American- Mediterranean). As cepas RDRio foram identificadas como o principal grupo causador de TB no Rio de Janeiro, podendo estar associadas a perfis de cepas multidrogas resistentes. No contexto dos nossos estudos, a técnica de PRA possibilitou confirmar a identificação dos 6 isolados clínicos com ausência de IS6110 como de M. tuberculosis. Essa técnica desenvolvida por Telenti et. al. (1993), possibilita ainda a identificação da maioria das espécies do gênero Mycobacterium em menor tempo. Atualmente a identificação das espécies micobacterianas é realizada por inúmeros testes fenotípicos (Gurung et. al., 2010), bem como empregando técnicas de hibridização (Mathema et. al., 2006). Entretanto na técnica do PRA permanece a mesma desvantagem da PCR-IS6110, uma vez que ambas não diferenciam as espécies dentro do Complexo M. tuberculosis. Técnica semelhante já havia sido proposta por Plikaytis, porém ao invés de utilizar as enzimas de restrição BstEII e HaeIII, foram utilizadas BstNI e XhoI. A figura 3 é uma representação esquemática utilizada pelo banco de dados para interpretação dos resultados de PRA. 27 Fig. 3: Figura explicativa utilizada pelo banco de dados para interpretação dos resultados de PRA. Tamanhos moleculares podem varia em uma taxa de + ou – 5 pb, o que não representa um problema na identificação. 4.2. Spoligotyping Para a determinação dos genotipos, foram submetidas pela técnica de Spoligotyping, um total de 97 isolados clínicos de M. tuberculosis, provenientes da população indígena e não indígena do Estado do Mato Grosso do Sul. Os resultados são apresentados pela tabela 1 e figura 4. Foram encontrados 33 perfis diferentes, sendo que 30 destes já presentes no banco de dados SpolDB4.0. Os outros 3 perfis, por não apresentarem família no SpolDB4.0, foram analisados pelo SpolDB3.0, que é um banco de dados que nos dá a porcentagem de similaridade genética de um determinado perfil ainda não relatado com um perfil ou família já reconhecidos pelo SpolDB4.0. Dentre os 30 perfis encontrados no SpolDB4.0, foi observado um predomínio notável da família LAM, ou Latin American Mediterranean (65 amostras, correspondendo a 67%). A subfamília de maior expressão foi a LAM9, representados por 4 SITs, sendo SIT 42 com 44 isolados e SITs 177, 1337 e 1075 com respectivamente 4, 2 e 1 isolados cada (essa subfamília representou 52,6% do total de isolados). Na sequência, a família com maior número de isolados foi a família T, com 21 isolados, correspondendo a 21,65% do total. A subfamília T1 foi a mais predominante, com 19 isolados, agrupados nos seguintes SITs : 53 (6 isolados), 291 (2), 535 (2), 1800 ( 2) e os demais SITs (86, 1053, 174, 154, 1166 e 1284) com 1 isolado cada. As famílias Haarlem e S também apareceram como estirpes circulantes na população, com porcentagens de 4,12% e 2,06% respectivamente, sendo também identificados 2 isolados (2,06%) definidos como “não designado “U” no SpolDB4.0 . Dentre os 3 isolados sem SITs que foram analisados no SpolDB3, dois deles apresentaram 99% de similaridade com respectivas subfamílias T1 e EAI, e o ultimo, 76% com a H1. É 28 muito importante destacar, nesse contexto, que famílias como EAI, Bovis, Afri e CAS são as famílias mais ancestrais do gênero (Filliol et. al., 2002 e Ferdinand et. al., 2004). Provavelmente, esta família ancestral (EAI) encontrado neste trabalho com pequena variação, era uma das responsáveis pela TB no Mato Grosso do Sul no passado, mas com a chegada de linhagens mais agressivas e adaptáveis como a LAM, ela vem sendo substituída com queda na taxa de prevalência. Fato semelhante foi observado por Candía et. al. (2007) no Paraguai. A tabela 1 resume os resultados encontrados, apresentando o número de amostras para cada perfil, a família e sufamília a que correspondem, o número de SIT, a distribuição geográfica, o perfil representado na membrana após a hibridização e a porcentagem daquele perfil em relação ao todo. Os perfis que apresentam na frente da família um valor de porcentagem, são aqueles analisados pelo SpolDB3.0, sendo esta porcentagem indicativa do grau de similaridade genética com a família e subfamílias indicados. Esses perfis, por se tratarem de perfis ainda não relatados, não possuem uma distribuição geográfica definida. Número de isolados Família/subtipo SIT Distribuição Geográfica Perfil Porcentagem 44 LAM9 42 Ubiquitário 45,36% 4 LAM9 177 ARG, BRA, EGY, ESP, FXX, GUF, ITA, MYS, USA 4,12% 2 LAM9 1337 GUF, RUS 2,06% 1 LAM9 1075 FXX, MAR, USA 1,03% 1 LAM6 1768 CUB, MYS 1,03% 1 LAM5 93 VEN 1,03% 4 LAM4 60 Ubiquitário 4,12% 1 LAM3 33 ZAF 1,03% 1 LAM3 211 ARG, AUS, ESP, FXX, MDG, MEX, PRT, USA, ZAF 1,03% 2 LAM3 and S/convergent 4 SWE, TUR, USA, VEN, ZAF 2,06% 1 LAM2 17 MYS, NAM, NLD, PHL, PRT, USA, VEN 1,03% 3 LAM1 20 NLD, PER, PHL, PRT, RUS, SWE, USA, VEN, VNM, ZAF, ZWE 3,09% 6 T1 53 USA, VEN, VNM, ZAF, ZMB, ZWE 6,18% 3 T1 291 MDG, NAM, NLD, PER, POL, RUS, TUR, USA, VEN, VNM, ZWE 3,09% 2 T1 535 BRA, CMR, FIN, GEO, GNB, MYS, PRT, RUS, USA, VEM 2,06% 2 T1 1800 CHN, MWI, USA 2,06% 1 T1 86 AUT, ESP, FXX, GUF, ITA, ITAS, MDG, NLD, TUR, USA, VEN 1,03% 1 T1 1053 EGY, FXX 1,03% 1 T1 174 FXX, HTI, RUS, USA, VNM 1,03% 1 T1 154 ARG, AUS, AUT, DEU, ESP, FIN, FXX, HUN, ITAS, NLD, RUS, USA 1,03% 1 T1 1166 MWI, USA, VEM 1,03% 1 T1 1284 BEL, GUF, USA 1,03% 1 T1 (99%) 1,03% 1 T2 1491 GBR, MYS 1,03% 1 T4_CEU1 39 ARM, AUT, BEL, CZE, DEU, FXX, GBR, ITA, NLD, POL, USA, VNM, ZAF 1,03% 2 H3 50 ZAF 2,06% 1 H3 740 AUT, DEU, GLP, NLD, PER 1,03% 1 H1 47 RUS, SAU, SEN, SWE, TUR, USA, VEN, ZWE 1,03% 1 H1 (79%) 1,03% 1 U 450 CMR, CZE, DNK, FXX, ITA, MEX, NLD, USA 1,03% 1 U 396 BRA, ITA, PRT 1,03% 2 S 34 MOZ, MWI, NLD, NZL, PRT, REU, SAU, SWE, THA, USA, VEN, VNM, ZAF 2,06% 1 EAI1 (99%) 1,03% mmmmmmmmmmmmmmmmm Tabela 1: Tabela resumindo os resultados de Spoligotyping para as 97 amostras. 29 Os resultados deste trabalho apresentam grande similaridade com os demais realizados em outras regiões brasileiras e na América do Sul. Noguti et al. (2010), na cidade de Maringá-PR, avaliando 93 isolados clínicos de M. tuberculosis, encontraram os mesmos genótipos verificados na população do Mato Grosso do Sul, incluindo o achado de um isolado da família EAI. No estudo de Malaspina et al. (2008) na cidade de Araraquara, a T1 foi a subfamília mais freqüente onde predominaram os SITs 53 e 535 de forma coincidente ao nosso trabalho. O SIT 42 (de maior expressão em nosso estudo), da subfamília LAM 9, também foi verificado no trabalho de Malaspina et al. (2008). A predominância das 3 famílias (LAM, T e Haarlem) foi também verificada por Arenas et. al. (2008) na Colômbia e Aristimuño et. al. (2006) na Venezuela. Porém, na América do Sul, o trabalho de Candía et al. (2007), realizado no Paraguai é o que apresenta os genótipos mais semelhantes ao nosso achado, onde houve predominância do SIT 42 da subfamília LAM9 e outros genótipos comuns aos dois trabalhos, tais como SITs: 4, 17, 20, 33, 34, 47, 53, 60 e 177. O dendrograma representado pela figura 4 mostra o grau de correlação genética entre os 97 isolados: 30 Pearson correlation Spoligotyping 10 0 95908580757065605550454035 Key A014 A037 A032 A088 A089 A002 A005 A006 A009 A010 A020 A021 A023 A024 A026 A027 A033 A038 A039 A041 A042 A043 A044 A046 A047 A050 A059 A060 A068 A069 A070 A071 A072 A073 A079 A080 A082 A084 A085 A086 A087 A090 A091 A092 A093 A094 A095 A096 A097 A029 A062 A083 A004 A011 A015 A030 A022 A036 A103 A104 A048 A055 A034 A051 A052 A053 A100 A025 A061 A016 A075 A081 A013 A017 A049 A074 A102 A105 A028 A057 A058 A078 A076 A098 A099 A031 A054 A077 A008 A018 A056 A003 A045 A035 A040 A101 A001 Amostra 04/0330 03/0208 03/1446 03/0471 04/0159 04/1832 04/0257 04/0200 04/0263 04/0324 04/0152 04/0181 03/1407 04/0178 04/0203 04/0241 03/1461 03/0211 03/0226 03/0307 03/0337 03/0340 03/0524 03/0594 03/0780 03/0855 03/1193 03/1209 03/1236 04/0190 03/0273 03/1051 1153 04/1892 03/0208 03/0147 03/0506 03/0348 04/0261 1169 03/0606 04/0201 232 03/0578 03/1126 04/0209 03/1027 03/0826 03/1159 04/0184 03/1317 04/0177 04/0149 04/0207 04/0136 03/2056 04/0382 03/0175 04/0440 03/1284 03/0785 03/1030 03/1640 03/1013 03/1014 03/1015 03/0237 04/0238 03/1235 04/0208 04/0278 04/0290 03/0489 04/0390 03/0807 03/0587 03/1270 1358 04/1253 03/1039 03/1177 04/0247 04/0256 03/1416 03/1207 03/1800 03/1026 04/1390 04/0260 04/0317 03/1038 04/2278 03/0529 03/0038 03/0306 03/1093 04/0180 Família T1 LAM6 T4_CEU1 T1 T1 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM1 LAM1 LAM1 T1 T1 T1 T1 LAM9 LAM9 LAM9 LAM9 LAM5 LAM2 LAM4 LAM4 LAM4 LAM4 U LAM3 LAM3 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 T1 (99%) S S T1 H3 H3 H3 LAM9 LAM9 LAM9 U EAI1 (99%) H1 (79%) H1 LAM3 and S/convergent LAM3 and S/convergent T2 T1 SIT 174 1768 39 535 535 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 20 20 20 1800 1800 86 1053 177 177 177 177 93 17 60 60 60 60 396 33 211 291 291 291 53 53 53 53 53 53 154 34 34 1166 50 50 740 1337 1337 1075 450 47 4 4 1491 1284 Fig. 4: Dendrograma correspondente as 97 amostras. Outro fator que deve ser ressaltado é a presença de uma cepa analisada e que apresenta similaridade genética de 99% com T1, segundo o banco de dados SpolDB3.0. Podemos observar que esta cepa apresenta a diferença de apenas um espaçador com o perfil de uma cepa T1 de SIT 462 (não apresenta o 23º espaçador, que está presente no SIT 462), de acordo 31 com o SpolDB4.0. Isto pode ser decorrente de uma mutação que possa estar ocorrendo para uma melhor adaptação da estirpe em questão na região. Quanto à estabilidade dos genótipos e sua distribuição geográfica, os estudos indicaram que 61,7% de todos os isolados cujos genótipos foram identificados pelo SpolDB4.0, estavam enquadrados em apenas 4 SITs (42, 177, 60 e 53). Borsuk et. al. (2005), e David et. al. (2007) encontraram 7 e 8 SITs respectivamente, compondo 50% dos isolados estudados. Destaca-se neste trabalho a alta prevalência de SIT 42 (45,36%) da subfamília LAM 9. Segundo Lazzarini et al. (2007), os pacientes que apresentaram TB causada pelo bacilo pertencente à família LAM, apresentaram maior hemoptise, maior perda de peso e maior carga bacteriana em seus escarros. Neste sentido a predominância do SIT 42 neste trabalho pode ser em decorrência do maior grau de virulência deste genotipo. Este SIT, juntamente com SITs 53, 60 e 177 são ubiquitários, de ampla distribuição mundial (Sola et. al., 2001). Para Malaspina et. al., (2008), o ST53 é o segundo isolado mais freqüente no SpolDB4.0, sugerindo ser um isolado de fácil transmissão e adaptibilidade. Desta forma os estudos indicam que em cerca de 60% dos casos de TB que acometem a população de Mato Grosso do Sul, é em decorrência destes 4 SITs predominantes, que pertencem as famílias de evolução mais recente e que aparentemente são mais prevalentes ao redor do mundo. Vale ressaltar que as famílias encontradas no presente estudo apareceram como causadoras da doença em ambas as populações estudadas (indígenas e não indígenas), não existindo famílias infectantes de uma população em particular. Tal evidência pode estar inclusa no contexto de inserção do índio no mercado de trabalho da população não indígena, no qual ele adquire a doença e pode então transmiti-la à sua tribo. 32 4.3. Aprendizado com o Projeto Pelo lado cientifico, o projeto proporcionou ao aluno de Iniciação Científica grande crescimento e amadurecimento. Por empregar técnicas de biologia molecular o aluno desenvolveu destreza e cuidados no manuseio. A manipulação de bactéria patogênica de nível 3 de segurança biológica, estimulou ao aluno, senso de responsabilidade e seriedade. O conhecimento e emprego das ferramentas de Biologia Molecular propiciarão ao aluno maior embasamento e facilidade no desenvolvimento de futuras pesquisas, pois estas metodologias são consideradas de ponta num trabalho cientifico. Pelo lado humano, talvez este seja o item mais importante, incluindo o exercício e o crescimento da visão humanitária e social, fatos que deveriam ser considerados em todas as áreas da ciência, a partir da consciência do quanto um estudo pode interferir e auxiliar na vida de uma sociedade extremamente carente, ainda mais no caso de uma doença negligenciada como a TB. 5. Conclusão Com o presente trabalho, podemos concluir que técnicas de biologia molecular, tais como PCR-IS6110 e PRA podem se tornar ferramentas de grande valia no diagnóstico rápido, possibilitando tratamento adequado e redução na transmissão, diminuindo assim a incidência de TB e facilitando o seu controle em populações acometidas pela doença. São técnicas altamente promissoras, pois podem reduzir o tempo de identificação de 15 dias (por técnicas clássicas, envolvendo baciloscopia e provas bioquímicas) para 2 ou 3 dias, permitindo uma identificação muito rápida e acurada do M. tuberculosis. Concluímos também que os mesmos grupos genéticos de M. tuberculosis infectam tanto a população indígena quanto a não indígena, causando TB na população do Mato Grosso do 33 Sul. Num contexto mais abrangente, estes genótipos também acometem a população brasileira e populações de todo o continente sul americano, indicando como principais fatores de transmissão o grande fluxo de pessoas entre as regiões e a carência de políticas de tratamento e controle mais eficientes da doença. A predominância do SIT 42 pode também estar relacionada com maior infecciosidade e virulência deste isolado clínico, havendo necessidade de analisar no futuro, os perfis de sensibilidade/resistência frente às drogas de tratamento deste genótipo como de SITs de todas as famílias encontradas. 6. Referências Bibliográficas AHMAD S. Pathogenesis, Immunology, and Diagnosis of Latent Mycobacterium tuberculosis Infection. Clin Dev Immunol. 2011; v.2011: 814943. ARENAS, N.E.; TORRES, E.; DURANGO, C.J.; CUERVO, L.I.; CORONADO, S.M.; GÓMEZ, A. Búsqueda Activa de Individuos con Tuberculosis Pulmonar y Extrapulmonar en Calarcá-Quindío, Colombia-2005. Rev. salud pública. 10 (2):279-289, 2008. ARISTMUÑO, L.; ARMENGOL, R.; CEBOLLADA, A.; ESPAÑA, M.; GUILARTE, A.; LAFOZ, C.; LEZCANO, M.A.; REVILLO, M.J.; MARTÍN, C.; RAMÍREZ, C.; RASTOGI, N.; ROJAS, J.; SALAS, A.V.; SOLAS, C.; SAMPER, S. 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