UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL Plutella xylostella: VARIABILIDADE POPULACIONAL E SUSCETIBILIDADE A Beauveria bassiana E A NEMATOIDES ENTOMOPATOGÊNICOS João Rafael De Conte Carvalho de Alencar Engenheiro Agrônomo JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL 2012 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CAMPUS DE JABOTICABAL Plutella xylostella: VARIABILIDADE POPULACIONAL E SUSCETIBILIDADE A Beauveria bassiana E A NEMATOIDES ENTOMOPATOGÊNICOS João Rafael De Conte Carvalho de Alencar Orientador: Prof. Dr. Ricardo Antonio Polanczyk Co-orientador: Prof. Dr. Sergio Antonio De Bortoli Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - Unesp, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Entomologia Agrícola). JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Julho de 2012 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento de Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação – UNESP, Câmpus de Jaboticabal. Alencar, João Rafael De Conte Carvalho de A368p Plutella xylostella: variabilidade populacional e suscetibilidade a Beauveria bassiana e a nematoides entomopatogênicos / João Rafael De Conte Carvalho de Alencar.- Jaboticabal 2012 iv, 89 f. il. ; 28 cm Dissertação (Mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2012 Orientador: Ricardo Antonio Polanczyk Co-orientador: Sergio Antonio De Bortoli Banca examinadora: Antonio Carlos Busoli, Luís Garrigós Leite. Bibliografia 1. Controle microbiano, 2. Populações, 3. Traça-das-crucíferas, 4. Fungo entomopatogênico, 5. Rhabditida . I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 595.7:632.937 DADOS CURRICULARES DO AUTOR JOÃO RAFAEL DE CONTE CARVALHO DE ALENCAR – Nascido em 12 de Março de 1987, em São Paulo – São Paulo. Engenheiro Agrônomo pelo Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo (CCA- UFES), título obtido em Agosto de 2010. Estagiou no Laboratório de Entomologia no Núcleo de Desenvolvimento Científico e Tecnológico de Manejo Fitossanitário de Pragas e Doenças, onde desenvolveu projetos de iniciação científica com bolsa do CNPq durante a graduação. Durante a sua graduação teve a oportunidade de participar de eventos na área de Entomologia agrícola, publicar trabalhos em eventos e periódicos. Foi então aprovado no Mestrado em Agronomia / Entomologia Agrícola pela Unesp - Campus de Jaboticabal, com início em Agosto de 2010 e término em Julho de 2012. Aprovado na mesma área e instituição para Doutorado com início em Agosto de 2012. “O grande rio tem seu trajeto, antes do mar imenso.” André Luiz Aos meus amados pais Regina Maria De Conte Carvalho de Alencar e Celio Carvalho de Alencar, que dedicaram suas vidas ao sucesso de seus filhos, sendo o grande exemplo de conduta moral e afetiva. À minha amada Marina Aparecida Viana, que com seu amor e dedicação tem sido minha base, inspiração e fonte de alegrias. Dedico Aos meus queridos irmãos Isabel De Conte Carvalho de Alencar e João Gabriel De Conte Carvalho de Alencar, que sempre abriram portas e auxiliaram incondicionalmente meus passos, além do convívio fraternal inesquecível. Aos meus avós Maria Luiza De Conte (in memoriam), Amilcar De Conte (in memoriam), Lucília Carvalho de Alencar e João de Alencar, que são os responsáveis pela base sólida na educação. Aos meus cunhados Felipe Bertholdi Fraga, Daniele Ferreira Mugrabi, Francisco José Viana, Cácia Tigre Pereira Viana, e aos meus sogros Luiz Viana Neto e Rita de Oliveira Viana, que hoje constituem nossa família, sempre com uma palavra amável a oferecer. Ofereço AGRADECIMENTOS A Deus por criar a vida, a maior maravilha que existe. À Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista pela superior infraestrutura e oportunidade concedida. Aos professores da Pós Graduação em Agronomia/Entomologia Agrícola, pelos conhecimentos passados e por serem responsáveis por mais um degrau alçado, em especial aos professores Drs. Antonio Carlos Busoli e Arlindo Leal Boiça Jr, pelos conselhos e ensinamentos além-aula. Aos funcionários do Departamento de Fitossanidade, que são indispensáveis para o correto andamento de tantos trabalhos, em especial à Lígia Dias Tostes Fiorezzi, pelos tantos auxílios prestados, e a Iara Macedo e ao André Maurício Múscari pela amizade. Ao Prof. Dr. Ricardo Antonio Polanczyk, pela orientação durante a Graduação e o Mestrado, e ao Prof. Dr. Sergio Antonio De Bortoli pela co- orientação durante o Mestrado. Ao Prof.Dr. Sergio de Freitas (in memoriam) pelos grandes ensinamentos e valores morais transmitidos. Aos Profs. Drs. Manoel Victor Franco Lemos e Janete Apparecida Desidério por auxiliar parte dos experimentos. Ao Prof. Antonio Carlos Monteiro por ceder gentilmente material para a execução deste trabalho. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela concessão de bolsa de estudos. À minha noiva Marina Aparecida Viana por tantas ajudas e companheirismo. Ao grande Ulysses Rodrigues Vianna por ter sido um ótimo orientador e amigo acima de tudo. A amiga e colega de pós-graduação Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa, pelo amizade e grande ajuda na dissertação. Aos amigos dos tempos de graduação: Alan Azevedo de Almeida, Caio Cesar Queiroz Nogueira, Heitor Broetto Marin, Matheus Fonseca de Souza, Rafael Andrade, Rodolfo Teixeira, Rômulo Mazieiro e Rômulo Mora, pelos tempos inesquecíveis. Aos novos amigos feitos durante a pós-graduação: Jacob Crosariol Neto, José Fernando Jurca, Míriam Kubota, Oniel Aguirre, Leandro Souza, Laís Santos, Diego Lopes, Diego Fraga, Jaqueline Maeda, Alessandra Otuka, Elizabeth Pedroso, Natalia Vieira, Milena Sato, Rogério Teixeira, Tatiana Ramos, Vanessa Paes, Andrea Varella, Juliana Nais, Marina Funichello e Nirelcio Pereira. Que tanto apoiaram e auxiliaram nessa caminhada. A família Agostini, por ser tão amiga e atenciosa. A todos que de alguma maneira contribuíram para a realização dessa dissertação. i SUMÁRIO Página RESUMO.............................................................................................................. iii SUMMARY........................................................................................................... iv 1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 1 2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 3 2.1. Cultura das Brassicaceas........................................................................ 3 2.2. Plutella xylostella...................................................................................... 3 2.3.Controle Microbiano.................................................................................. 6 2.3.1. Beauveria bassiana.......................................................................... 7 2.3.2. Nematoides entomopatogênicos.................................................... 8 2.4. Métodos Moleculares para diferenciação de populações.................... 9 2.4.1. DNA mitocondrial............................................................................. 10 2.4.2 DNA genomico.................................................................................. 11 3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................ 13 3.1. Obtenção e criação das populações de Plutella xylostella................. 13 3.2. Análise molecular das populações....................................................... 15 3.2.1. Sequenciamento gene COI............................................................. 16 3.2.2. Método ISSR-PCR........................................................................... 17 3.3. Testes de suscetibilidade....................................................................... 19 ii Página 3.3.1 Beauveria bassiana........................................................................... 19 3.3.2 Nematoides entomopatogênicos..................................................... 21 3.3.3. Bactérias simbionte de nematoides entomopatogênicos............ 24 3.4 Efeitos subletais........................................................................................ 27 3.5 Consumo foliar.......................................................................................... 27 3.6. Delineamento experimental e análise estatística.................................. 28 4. RESULTADOS E DISCUSSÂO....................................................................... 29 4.1 Sequenciamento do gene COI.................................................................. 29 4.2. Método ISSR-PCR..................................................................................... 34 4.3. Suscetibilidade de Plutella xylostella aos entomopatógenos.............. 36 4.4. Produção de conídios de Beauveria bassiana e de juvenis infectivos de NEPs..................................................................................................... 48 4.5. Consumo foliar.......................................................................................... 50 4.6. Efeitos subletais....................................................................................... 54 5. CONCLUSÕES................................................................................................ 67 6. REFERÊNCIAS................................................................................................ 68 iii Plutella xylostella: VARIABILIDADE POPULACIONAL E SUSCETIBILIDADE A Beauveria bassiana E A NEMATOIDES ENTOMOPATOGÊNICOS RESUMO O isolamento geográfico de populações de uma mesma espécie de inseto pode resultar em alterações fisiológicas, originando populações com suscetibilidade diferente às diversas táticas de controle. Plutella xylostella, a traça- das-crucíferas é uma praga cosmopolita específica das Brassicaceaes, apresentando problemas de resistência à inseticidas químicos e biológicos. O objetivo deste trabalho foi determinar a influência da variabilidade populacional da traça-das-crucíferas na eficiência das táticas de controle com micro-organismos entomopatogênicos. Foram utilizados os métodos de sequenciamento do gene COI e ISSR-PCR para aferir a variabilidade populacional entre quatro populações da praga, e estudou-se a suscetibilidade delas às táticas de controle com o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana (20 isolados), nematoides entomopatogênicos (quatro espécies) e bactérias simbiontes de nematoides entomopatogênicos (dez isolados), avaliando-se o consumo foliar, a multiplicação do entomopatógeno no hospedeiro e estudando os aspectos biológicos em busca de efeitos subletais. . Foram selecionados seis isolados de B. bassiana e as quatro espécies de nematoides, pois foram as mais virulentas à praga. As populações são distintas devido sua variabilidade e isso resulta em diferenças no desenvolvimento de insetos que sobrevivem a aplicação dos entomopatógenos, inclusive na virulência de Steinernema brazilense sobre a população de Jaboticabal. Foi constatada também a redução de consumo foliar nos tratamentos com os entomopatógenos. Palavras-chave: traça-das-crucíferas; populações; controle microbiano, patogenicidade; virulência. iv Plutella xylostella: POPULATIONAL VARIABILITY AND SUSCEPTIBILITY TO Beauveria bassiana AND ENTOMOPATHOGENIC NEMATODES SUMMARY The geographical isolation of same species populations can result in physiological changes, resulting in populations with different susceptibility to various control tactics. Plutella xylostella, is a specific pest of Brassicaceaes widely spread around the globe, presenting problems with chemical and biological insecticides resistance. The aim of this study was to determine the influence of Diamondback moth populational variability in the efficiency of control tactics with entomopathogenic microorganisms. The methods used were sequencing of the COI gene and ISSR-PCR to measure the population variability among four populations of the pest, and the study of their susceptibility to tactics control with the entomopathogenic fungus B. bassiana (twenty strains), entomopathogenic nematodes (four species) and symbiotic bacteria of entomopathogenic nematodes (ten strains), evaluating leaf consumption, the multiplication of the pathogen in the host and studying the biological aspects in search of sub lethal effects. Six isolates of B. bassiana and four species of nematodes were selected, as were the more virulent to the pest. The populations are distinct because due the genetic, variability and and that results in differences in the development of insects that survive the entomopathogens application, including the virulence of Steinernema brazilense on the population of Jaboticabal. It was also found to reduce leaf consumption in the emtomopathogens treatments. Key words: diamondback moth; populations; microbial control, pathogenicity; virulence 1 1. INTRODUÇÃO As Brassicaceaes pertencem a Família botânica que abrange um grande grupo de hortaliças que são consumidas diariamente pela humanidade ao redor do mundo (ANJUM et al., 2012). Plutella xylostella (Linneaus, 1758) (Lepidoptera: Plutellidae), a traça-das- crucíferas, é uma praga específica das Brassicaceaes (TALEKAR & SHELTON, 1993) que se encontra amplamente espalhada pelo globo devido seu comportamento cosmopolita e a ampla utilização destas espécies vegetais para o consumo humano (BADENEZ-PEREZ et al., 2006). Os danos que esta praga causa podem ser diretos quando se alimentam de partes do vegetal que são comercializadas, causando grande prejuízo econômico, como é o caso de folhas de couve (Brassica oleracea L. var. acephala) e de repolho (Brassica oleracea L. var. capitata), ou ainda, pode ocasionar danos indiretos como quando a praga se alimenta da parte do vegetal que não é comercializado como o rabanete (Raphanus sativus L.) (GALLO et al, 2002). O controle da traça-das-crucíferas geralmente é realizado com o uso de inseticidas químicos (CZEPAK et al, 2005). Para a couve, o Programa de Análise de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA) elaborado pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) apontou que esta cultura é a quinta colocada entre 20 onde foi verificado uso excessivo ou de produtos não registrados. Para esta cultura, 44,2% das amostras continham resíduos de agrotóxicos acima do permitido ou ingredientes ativos não registrados para a couve, onde 11 dos 31 encontrados são inseticidas (ANVISA, 2010). Perante a este grande uso a evolução de resistência desta praga a agrotóxicos no mundo é uma realidade há mais de uma década(SHELTON et al., 1993). Constatado o problema mundial de resistência de P. xylostella com o controle químico, procurou-se o uso de alternativas biológicas para o seu controle, como parasitoides (TABONE et al., 2010) e predadores (ALMEIDA et al., 2009) e, 2 principalmente o uso da bactéria Bacillus thuringiensis (Berliner, 1911) (SILVA et al., 2012). Mas devido a grande utilização desta bactéria entomopatogênica para controlar a praga em questão, houve também a evolução da resistência de populações da praga à tecnologia de controle biológica supracitada (ZHAO et al., 1993; TABASHNIK, 1994; PEREZ & SHELTON, 1997; WRIGHT et al., 1997; CASTELO BRANCO et al., 2003). Para reverter este quadro preocupante para a atividade agrícola e também para a saúde pública, o controle químico pode ser substituído total ou parcialmente por organismos entomopatogênicos como nematoides e fungos, com eficiência semelhante aos inseticidas convencionais e reduzido impacto ambiental (SALEM et al., 2007; ALVES et al., 2008; WRAIGHT et al., 2010). O isolamento geográfico de populações de uma mesma espécie de inseto pode resultar em alterações fisiológicas devido ao isolamento reprodutivo, originando populações com suscetibilidade diferente às diversas táticas de controle, o que implicaria na necessidade de elaboração de sistemas de manejo de acordo com a variabilidade populacional intraespecífica. Essa variação de resposta pode ocorrer mesmo para entomopatógenos conforme observado para populações de P. xylostella e Spodoptera frugiperda oriundas de países da América Latina, Europa e de diferentes estados brasileiros (GONZÁLES- CABRERA et al., 2001; POLANCZYK et al., 2005; MONNERAT et al., 2006). O objetivo deste trabalho foi determinar se a variabilidade populacional da traça-das-crucíferas, afeta a virulência de Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin, 1912 e nematoides entomopatogênicos assim como as bactérias simbiontes associadas a esses nematoides. 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Brassicaceaes Brassicaceae é uma das maiores famílias botânicas de hortaliças com cerca de 400 gêneros e aproximadamente 4000 espécies (KOCH et al., 2001; JOHNSTON et al., 2005), Dentre as diversas espécies, muitas são utilizadas para a alimentação na forma de folhas, inflorescências, hipocótilos e sementes, como respectivamente: couve e repolho, couve-flor (B. oleracea L. var. botrytis) e brócolis (B. oleracea L. var. italica), Rúcula (Eruca sativa Thell) e Mostarda (B. juncae L.). Além destas, existem na família várias outras espécies hortícolas e/ou oleaginosas tais como a couve chinesa (B. pikinensis L.), nabo (B. rapa L.var. rapa), rabanete, mostarda- de-folha (B. juncea L.) (FILGUEIRA, 2008). Existem também espécies de importância medicinal, como o agrião (Nasturtium officinalis L.) que é utilizado como antinflamatório e cicatrizante (JACOBUS, 2006), e ainda espécies consideradas invasoras como o nabo em regiões mais frias por perdurar por mais de dois ciclos em estado vegetativo. As Brasicaceaes são de grande importância econômica e encontram-se amplamente cultivadas pelo mundo, um bom exemplo é a importância econômica da canola (B. napus L. var. oleifera), que é a oleaginosa com maior área plantada no mundo, outro exemplo é o repolho que é uma hortaliça folhosa com grande fonte de nutrientes e de alto valor econômico (FREITAS LUZ et al., 2002). 2.2. Plutella xylostella A traça-das-crucíferas, P. xylostella é uma das pragas mais importantes de Brassicaceaes no mundo (DIAS et al., 2004), devido aos sérios danos causados às plantas, ocasionando grandes perdas nos campos de produção (CASTELO 4 BRANCO & FRANÇA, 2001). Ataca todas as plantas deste grupo preferencialmente repolho, couve-flor e couve comum, (TALEKAR & SHELTON, 1993; CASTELO BRANCO et al., 2001; GALLO et al., 2002; SALEM et al., 2007; SARFRAZ et al., 2010). Sua origem é atribuída a duas hipóteses ligadas a centro de origem de Brassicaceaes, a primeira é de que a praga é originária da Europa da região do Mediterrâneo que é centro de origem de algumas Brassicaceaes (HARCOURT 1954, TSUNODA 1980), por outro lado existem evidencias de que a praga tenha origem na África do Sul devido a gama de hospedeiros nativos neste país e a ocorrência de vários parasitoides associados à traça-das-crucíferas (KFIR, 1998). Entretanto a realidade é que hoje esta praga se encontra em todos os continentes com exceção da Antártida. É um inseto com ciclo reprodutivo rápido (Figura 1), em que a variação da temperatura é preponderante para o desenvolvimento do inseto, pois em condições mais quentes o ciclo pode ser de 12 dias. O número de gerações pode variar dependendo das condições climáticas e da disponibilidade de alimento, mas de forma geral ocorrem de cinco a dez gerações por ano em condições de campo, (CASTELO BRANCO & VILLAS BÔAS, 1997; DIAS et al., 2004). As fêmeas fazem as posturas na parte abaxial das folhas, e após a eclosão, as lagartas de primeiro instar perfuram as folhas se alimentado no mesófilo foliar, por cerca de dois a três dias. Logo em seguida, saem do interior da folha a partir do segundo instar e passam a alimentar-se da epiderme, causando injúrias generalizadas nas folhas e/ou inflorescências, inutilizando-as para o consumo. Ao completar o desenvolvimento, as larvas empupam no interior de um pequeno casulo de seda tecido geralmente na face abaxial das folhas (IMENES et al., 2002). Existe uma relação direta entre o desenvolvimento fenológico da cultura e o aumento dos danos ocasionados por P. xylostella, os quais podem ser irreversíveis, sendo comum o controle preventivo com agrotóxicos no início do desenvolvimento da cultura (SILVA et al., 2003; SARFRAZ et al., 2006). Além 5 disso, áreas cultivadas ao longo do ano, com plantas de idades diferentes proporcionam à praga suprimento abundante e contínuo de alimento dificultando o controle desta espécie (IMENES et al., 2002). Figura 1: Ciclo de vida da traça-das-crucíferas, Plutella xylostella. Fonte: (VIANA, 2012) Esta praga está diretamente relacionada à redução de produção de Brassicaceaes nos plantios comerciais em todo o mundo (DICKSON et al., 1990), sendo que seus danos causam o atraso no crescimento da planta, depreciação do produto no comércio e ainda a inviabilização do cultivo (MONNERAT et al., 2004). O uso de inseticidas químicos é a tática mais empregada para o controle de P. xylostella (CASTELO BRANCO & MELO, 2002; DIAS et al., 2004). No entanto, o manejo em áreas que se baseiam somente nesta ferramenta de controle é falho e não apresenta bons resultados ao longo do tempo (CASTELO BRANCO et al., 2001). Atualmente visa-se a obtenção de medidas de controle tecnicamente mais 6 adequadas, economicamente satisfatórias e ecologicamente corretas como medidas com o emprego de produtos biológicos (THULER, 2006). 2.3. Controle microbiano O controle microbiano de insetos é a utilização de microrganismos como ferramentas para supressão de populações de pragas, desenvolvendo patologia no hospedeiro. Esses organismos são conhecidos como entomopatógenos (ALVES, 1998a). O controle microbiano de insetos se iniciou com as observações da epizootia de Beauveria bassiana sobre o bicho da seda, Bombyx mori L., 1758 (Lepidoptera: Bombycidae) a pouco mais de 130 anos, logo, não demorou muito para colocarem em prática o uso de fungos para o controle de pragas (STARNES et al., 1993). Os principais micro-organismos entomopatogênicos são fungos, bactérias, vírus e nematoides entomopatogênicos, com muitos exemplos de sucesso em utilização comercial como Metarhizium anisopliae (Metchinikoff, 1879) Sorokin 1883 para o controle de cigarrinhas de pastagem e da cana-de-açúcar (Hemiptera: Cercopidae) (MARQUES, 1976), B. thuringiensis para lepidópteros desfolhadores em grandes culturas como o milho e algodão (MARTINS et al., 2007), nematoides para o controle de moscas-das-frutas (ALMEIDA et al., 2007) e, vírus da poliedrose nuclear (Baculovirus anticarsia) para o controle da lagarta da soja Anticarsia gemmatalis Hubner, 1818 (Lepidoptera: Noctuidae) (ALLEN & KNELL, 1977). Também existem outros organismos entomopatogênicos de menor expressão como protozoários, rickétsias, espiroplasmas e fitoplasmas, pois são menos estudados, mas com boas perspectivas de uso num futuro próximo (ALVES, 1998b). Os micro-organismos entomopatogênicos são vantajosos no controle de pragas devido a especificidade e a seletividade, bem como a facilidade de 7 multiplicação e dispersão, a produção em meios artificiais e a ausência ou redução de poluição ambiental e toxicidade ao homem e outros organismos não-alvo (TANADA & KAYA, 1993). 2.3.1. Beauveria bassiana Atualmente existem vários produtos a base de fungos entomopatogênicos que são comercializados no mundo e produzidos em diversos países, entretanto, estes produtos estão inseridos em uma fatia de mercado que representa somente 1% do mercado mundial de pesticidas, e, deste percentual, correspondem apenas a um quinto do total, sendo B. bassiana uma das principais espécies de fungos entomopatogênicos utilizadas no mundo (CPL BUSINESS CONSULTANTS, 2010). Além disso, os fungos entomopatogênicos apresentam grande crescimento de mercado, devido ao seu pequeno custo de produção, a eficiência de controle e por não apresentar risco ao homem e ao meio ambiente (ALVES & PEREIRA, 1998; LEITE, 2003). Beauveria bassiana é um fungo generalista que é encontrado naturalmente no solo infectando artrópodes (ZIMMERMANN, 2007). Está inserido na Ordem dos Hypocreales e na família Clavicipitaceae (FERNANDES et al., 2006). É conhecido vulgarmente como o fungo da muscardine branca devido sua coloração que pode variar do branco até o amarelo claro. A importância deste fungo no controle microbiano de insetos é desde a história da patologia de insetos, devido as observações feitas em relação da sua manifestação em criação de B. mori, até na proporção da sua utilização para o controle de diversos artrópodes como insetos e ácaros (FERRON, 1978). O modo de ação do fungo da muscardine branca é através do contato, onde o fungo em contato com o tegumento do inseto e na presença de umidade e calor suficientes, emite o apressório, que é a estrutura de penetração que pode penetrar por poros naturais como espiráculos, ou ainda degradar o exoesqueleto, e por fim, 8 colonizar o inseto, crescer e se multiplicar. Outra maneira de ação é a ingestão de conídios, que são a estrutura reprodutiva de B. bassiana, e a colonização se iniciar de dentro para fora, o que é uma condição atípica (SHAH & PELL, 2003). O grande potencial de controle deste fungo entomopatogênico está comprovado em vários trabalhos que exploram o uso em diversas ordens de insetos como Lepidoptera, Coleoptera e Hemiptera (MEYLING & EINLENBERG, 2007). 2.3.2. Nematoides entomopatogênicos Os Nematoides entomopatogênicos (NEPs) são pertencentes às famílias Steinernematidae e Heterorhabditidae, localizadas na Ordem Rhabditida. Os gêneros mais comuns são Heterorhabditis Poinar, 1976 e Steinernema Travassos, 1927. Estes nematoides são agentes etiológicos de patologias que muitas vezes desencadeiam na morte do inseto (VOSS et al., 2009). Os NEPs possuem relação mutualística com bactérias do seu tubo digestivo, e estas quando regurgitadas, são as responsáveis pela rápida morte do hospedeiro por septicemia, pois, estas bactérias degradam a hemolinfa e os tecidos do inseto, que serve de alimento para os NEPs. Os principais gêneros de bactérias simbiontes são Xenorhabdus (Thomas & Poinar, 1979) e Photorhabdus (BOEMARE et al., 1993) (OWUAMA, 2001). Os nematoides entomopatogênicos passam por três fases de desenvolvimento, ovo, juvenil e adulto. Após eclodirem dos ovos, iniciam a fase de juvenil, sendo esta subdividida em quatro estádios, juvenil um (J1), juvenil dois (J2), juvenil três (J3) ou juvenil infectivo (JI) e, juvenil quatro (J4). Após a fase de juvenil os NEPs completam o ciclo tornando-se férteis, quando chegam na fase adulta. Os adultos de Steinernematidae são dioicos enquanto os de Heterorhabditidae são obrigatoriamente monoicos em sua primeira geração dentro 9 do hospedeiro, e dioicos nas demais gerações que possam se desenvolver dentro de um mesmo hospedeiro (KAYA & GAUGLER, 1993). O JI é encontrado no solo quando abandona o hospedeiro quando o alimento já não é mais suficiente para o desenvolvimento de novos nematoides, os juvenis no terceiro estádio armazenam células da bactéria simbionte em seu interior e abandonam o cadáver (ALMENARA et al., 2010). Os JIs podem permanecer no solo à procura de um novo inseto hospedeiro por meses, dependendo da temperatura, da umidade do solo e da espécie de nematoide envolvida (SMITH et al., 1992). Os JIs buscam o inseto e os localizam através de sinais químicos, como a presença de CO2. A infecção ocorre pelas aberturas naturais do exoesqueleto do hospedeiro (boca, ânus ou espiráculos) ou mesmo através da perfuração no tegumento. No interior do insetom, migram para a hemocele e liberam na hemolinfa as bactérias simbiontes. Estas produzem toxinas que matam o hospedeiro dentro de 24 a 48 horas reiniciando o ciclo (LEITE, et al., 2006). Para ambos os gêneros, o número de gerações dentro do cadáver do inseto varia de acordo com a quantidade de alimento disponível, comumente duas ou três gerações. As bactérias simbiontes também tem potencial para serem utilizadas de forma isolada para o controle de pragas agrícolas, ou seja, sem a ação de NEPs como vetores (GOODRICH-BLAIR & CLARKE, 2007). Os estudos sobre NEPs tem focado a utilização destes agentes de controle microbiano em grande escala, ou seja, visando a comercialização destes agentes que são eficientes, porém, ainda de alto custo (FERRAZ et al., 2008) 2.4. Métodos moleculares para diferenciação de populações Avanços na área de Biologia Molecular permitiram o desenvolvimento de técnicas de caracterização molecular (ABDELNOOR et al., 2001). A biologia 10 molecular tem por finalidade de investigar a presença/ausência de informação genética, e através disso possibilitar a comparação da informação de diferentes amostras e poder concluir a respeito. As ferramentas moleculares mais apropriadas para a detecção da variabilidade genética populacional são: a análise do DNA mitocondrial que apresenta herança uniparental materna, sem recombinações e com altas taxas evolutivas (CALCAGNOTTO et al., 2001); e DNA microssatélite que é altamente polimórfico e com unidades de repetição com 2-6 pares de base ao acaso (NAHUM, 2001) 2.4.1. DNA mitocondrial O gene do citocromo C oxidase subunidade I (COI), tem sido considerada uma ferramenta útil na identificação de espécies animais. A sequência de um fragmento deste gene é chamada de barcoding, ou código de barras de DNA (HARRISON, 1989). Através da análise deste gene que armazena o DNA mitocondrial, pode-se explorar a diversidade entre as sequências de DNA para identificar organismos (AVISE, et al., 1987). As características fundamentais do gene COI são que seu genoma mitocondrial é amplamente distribuído entre os animais, tem alto número de cópias por célula, apresenta taxa de mutação diferente entre espécies, não sofre recombinação, tem uma herança predominantemente materna além de possuir baixo polimorfismo ancestral (BOORE, 1999). Este sistema permite que um grande número de exemplares seja estudado de modo eficiente e identificar os que apresentam código de barra do DNA diferentes que poderiam ser indicativos de novas espécies, subespécies e populações (HEBERT et al., 2003) 11 Esse sistema permite dar novos rumos em pesquisas sobre biodiversidade, complementando várias outras iniciativas em curso para absorver os conhecimentos taxonômicos atuais (WILSON et al., 1985). 2.4.2. DNA genômico – marcadores ISSR Os marcadores moleculares de DNA são sequências genômicas localizadas num mesmo loco. Com eles é possível prever, mapear e caracterizar a informação molecular. Com os conhecimentos moleculares em plena evolução, há cerca de 30 anos surgiram então diversos métodos de detecção de polimorfismo genético diretamente ao nível de DNA. São vários os marcadores moleculares, e dentre eles os marcadores moleculares ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat), representam uma das classes mais recentes e foi desenvolvida a partir da necessidade de explorar repetições microssatélites sem a utilização de sequenciamento do DNA (ZIETKIEWICZ et al. 1994; CAIXETA et at. 2006). São facilmente detectados usando poucos equipamentos, são bastante variáveis e fornecem grande número de dados por um custo relativamente baixo. (WOLFE, 2005). O princípio da técnica é baseado em reações em cadeia da polimerase - PCR (Polymerase chain reaction) e envolve amplificações de segmentos de DNA presente numa região de distância amplificável entre duas regiões repetidas de microssatélites idênticas orientadas em direções opostas (ZIETKIEWICZ, et al, 1994). As amplificações não requerem informação da sequência do genoma e conduz a multilocos e altos padrões polimórficos. ISSR é uma técnica simples rápida e eficiente, pois os produtos amplificáveis são geralmente de 200-2000 pares de base de comprimento e apresentam alta reprodutibilidade devido ao uso de primers longos na qual permite 12 um uso de alta temperatura de anelamento. (BORNET & BRANCHARD; 2001 REDY et al., 2002). Os marcadores ISSR tem sido utilizados para estimar a extensão da diversidade genética a nível inter e intra-especifico em uma ampla variedade de espécies. Devido à sua abundancia e dispersão no genoma, tem sido muito empregado para estudar relações entre duas populações muito relacionadas (REDY et al., 2002). 13 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Obtenção e criação das populações de Plutella xylostella Para o presente trabalho foram utilizadas quatro populações de P. xylostella: População “Px” – data da coleta: 15 de janeiro de 2007 – coleta realizada em plantas de repolho na cidade de Recife-PE - 74 gerações em laboratório. População inicial: 143 espécimes adultos. População “PA” – data da coleta: 22 de julho de 2008 – coleta realizada em plantas de repolho na cidade de Alegre-ES, área de cultivo com atitude de cerca de 250m em relação ao nível do mar, com temperaturas mais elevadas – 41 gerações em laboratório. População inicial: 160 espécimes adultos. População “PC” – data da coleta: 19 de maio de 2008 – coleta realizada em plantas de repolho na cidade de Alegre-ES, área de cultivo com altitude de cerca de 830m em relação ao nível do mar, com temperaturas mais amenas – 44 gerações em laboratório. População inicial: 150 espécimes adultos. População “PJ” – data da coleta: 5 de julho de 2010 – coleta realizada em plantas de repolho na cidade de Jaboticabal-SP - 10 gerações em laboratório. População inicial: 147 espécimes adultos. Todas as populações foram coletadas em áreas sem relato de aplicação de inseticidas, e após, foram mantidas isoladas reprodutivamente, ou seja, sem a introdução de novos espécimes. 14 Os insetos foram criados no Laboratório de Biologia e Criação de Insetos do Departamento de Fitossanidade da FCAV/Unesp, Jaboticabal, SP. Após a emergência, os adultos eram liberados em gaiolas contendo um disco de folha de couve manteiga (B. oleracea var. manteiga) de oito cm de diâmetro, que era colocado sobre um disco de papel filtro de mesmo tamanho, este disco de papel filtro era levemente umedecido com água deionizada estéril. Os dois discos então eram dispostos sobre um copo plástico transparente com a abertura voltada para baixo, ficando a folha de couve elevada dentro da gaiola transparente onde ocorria a oviposição. No ápice do recipiente foi feito uma abertura de cerca de 2,3 cm de diâmetro. Este orifício era utilizado para a alimentação dos adultos com solução aquosa de mel a 10%, que era fornecida por embebição de uma esponja presa com uma pequena “trouxa” de tecido tipo voile nessa abertura. Em cada gaiola também foi feito uma abertura lateral, quadrada, coberta com tecido tipo voile para permitir troca de ar com o ambiente. Os discos retirados das gaiolas eram colocados em placas de Petri de mesmo tamanho até a eclosão das lagartas, quando estas eram transferidas para caixas plásticas com folhas de couve, repostas quando necessário, até que as larvas atingissem a fase pupal. As pupas então eram coletadas com o auxílio de pincel de finas cerdas e acondicionadas em tubos de ensaio vedados com filme plástico (PVC) com pequenos furos feitos com um estilete, cuja finalidade foi promover aeração no interior dos tubos (Figura 2). As pupas então eram mantidas no tubo até a emergência dos adultos, quando o processo se repetia. 15 Figura 2: Criação de Plutella xylostella para utilização nos experimentos. Fonte: THULER (2006). A criação da traça das crucíferas foi conduzida em sala regulada a 25 ± 1°C e 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 12 horas . 3.2. Análise molecular das populações Os estudos moleculares foram realizados no Laboratório de Biossistemática, Biologia e Ecologia Molecular de Neurópteros e no Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada, ambos localizados na UNESP/Jaboticabal. 16 Para a extração do DNA foi utilizado o kit Wizard™ Genomic DNA Purification (Promega), adicionando 20 mg/ml Proteinase K. Foram utilizados 20 insetos por população sendo cada população representada por dois abdomens de adultos de P. xylostella, que eram então incubados por 12 horas e 50 °C e adicionado a Proteinase K. As proteínas e resíduos foram precipitados utilizando-se 200µL de solução saturada de NaCl e posteriormente centrifugadas a 1400 rpm por 30 minutos. O isopropanol foi eliminado e o precipitado lavado com 500 µL de etanol, centrifugado a 1400 rpm por 10 minutos a 2 °C, seco e ressuspenso em 100 µL de tampão TE (ROUX et al., 2007). 3.2.1. Amplificação e sequenciamento COI Para a amplificação do gene COI foi utilizado par de iniciadores: PLU1 - 5’- AAATTTACAATTTATCGCTTAAATCTCAGCC-3’ (Forward) e PLU2 - 5’- CCTCTTTCTTGTGATAATAATATGGAAATTATACC-3’ (Reverse) (LI et al., 2006; YUKUHIRO et al., 2002). Esta região do COI é regularmente utilizada como um sistema global para animais em todo o mundo (HEBERT et al., 2003). As reações de PCR foram realizadas num termociclador Eppendorf® modelo Mastercicler Gradient HX0128-00208, com desnaturação inicial durante 5 min a 95 ° C, seguido por 35 ciclos de 1 min a 94 ° C, 45 s de anelamento a 53 ° C, e 1 min a 72 °C e uma extensão subsequente de 7 minutos a 72 ° C. para finalizar a extensão. Para confirmar amplificação de DNA por PCR, foi realizado eletroforese, utilizando 0,5 × tampão TAE em 1% de gel de agarose (LI et al., 2006). O produto de PCR foi então purificado utilizando um kit de purificação PCR Wizard® SV Gel e PCR System Clean-up (Promega), seguindo os protocolos do fabricante, e posteriormente foi quantificado o DNA mitocondrial em 17 espectofotometro NanoDrop® 2000c (Thermo Scientific - Uniscience) para padronização das amostras para o sequenciamento. Os produtos purificados do PCR foram sequenciados utilizando os mesmos iniciadores utilizados na PCR, utilizando o kit BigDye™ Terminator versão 3.1 (Perkin-Elmer Applied Biosystems). O sequenciamento foi realizado em um sequenciador genético ABI Prism™ 3100, com as mesmas condições na PCR. Após o sequenciamento, o fragmento foi submetido a várias lavagens com 75% de isopropanol, seguido por centrifugação (MORALES & FREITAS, 2010). As sequencias puras foram editadas e alinhadas usando o programa, BioEdit v. 7.1.3.0 (HALL, 1999). A diversidade nucleotídica (Pi), diversidade haplotípica (Hd), número total de mutações Eta (η), número médio de nucleotídeo diferenças (k) e número de sítios polimórficos (em segregação) (S) foram calculados com o programa DnaSP v 5.10.01 para as amostras como um todo (ROZAS et al., 2003). O percentual médio de bases em todas as sequências de amostras de DNA foi estimado por meio do programa MEGA v.5.10 β3 (TAMURA et al., 2007). A fim de estimar os níveis de distância genética, uma matriz de distâncias foi calculada através do modelo de Kimura 2-parâmetro (KIMURA, 1980), e o dendrograma foi obtido utilizando o método de Neighbor-Joining (SAITOU & NEI, 1987). Foi testada por 1.000 permutações aleatórias utilizando o MEGA v.4 (TAMURA et al., 2007) programa. O Arlequin 3.5.3.1 (SCHNEIDER et al., 2000) estimou se os dados eram significativos ou não pela análise hierárquica da variância molecular (AMOVA) (EXCOFFIER et al., 1992), 3.2.2. Método ISSR-PCR A análise por ISSR-PCR (Inter Simple Sequence Repeat) foi realizada com sete iniciadores (Tabela 1). Para a reação foi utilizado o Kit “WizardTM Genomic DNA Purification KIT ” (Promega) em termociclador Eppendorf® modelo Mastercicler Gradient HX0128-00208 nos ciclos: desnaturação inicial de 4 minutos 18 a 94 °C, 39 ciclos de 45 segundos a 94 °C, 45 segundos a 50 ou 58 °C e 2 minutos a 72 °C e última etapa de 10 minutos a 72 °C, seguindo de armazenamento a 4 °C (ROUX et al., 2007). Tabela 1. Iniciadores a serem utilizados na diferenciação de populações de Plutella xylostella (Roux et al., 2007). Iniciador Sequência (5’ 3’) Código T de anelamento oC PLU3 - CA CACACACACACACA (CA)7 47 PLU4 - CA+ CACACACACACACARY (CA)7RY 50 PLU5 - +CA RYCACACACACACACA RY(CA)7 50 PLU6 - +ACA BDBACAACAACAACAACA BDB(ACA)5 50 PLU7 - ACA+ ACAACAACAACAACABDB (ACA)5BDB 50 PLU8 - +GACA WBGACAGACAGACAGACA WB(GACA)4 58 PLU9 - GACA+ GACAGACAGACAGACAWB (GACA)4WB 58 B = T, C ou G; D = A,T ou G; R = A ou G; W = A ou T; Y = C ou T. Os produtos das reações foram visualizados em gel de agarose a 2%, corados com brometo de etídeo (0,05%) de acordo com. Amplificações controle eram realizadas para verificar possíveis contaminações no DNA e a quantificação do DNA foi feita com Nanodrop® 2000c (Thermo Scientific - Uniscience). De acordo com o resultado das eletroforeses, estas foram transformadas em matrizes binárias de forma isolada e como um todo, para que então os resultados fossem interpretados em AMOVA realizada com o programa Arlequin pelos método clássico para verificar a significância dos dados (ROUX et al., 2007). Além disso dados de distância genética foram calculados assim como na análise do COI. 19 3.3. Testes de suscetibilidade 3.3.1. Beauveria bassiana Os isolados de B. bassiana utilizados (Tabela 2) foram escolhidos do estoque do Banco de Entomopatógenos do Laboratório de Controle Microbiano de Artrópodes Praga (LCMAP) da UNESP Jaboticabal. Os testes foram realizados no mesmo laboratório. Os isolados foram repicados em placa de Petri em meio de cultura artificial BDA (Batata, Dextrose e Agar) + Levedura para produção de esporos (ME) (ALVES et al, 1998). O experimento foi dividido em duas etapas: teste de patogenicidade e teste de virulência. Foram utilizadas seis repetições com 20 lagartas de segundo instar nos testes de patogenicidade a fim de selecionar os isolados eficientes. Já nos testes de virulência foram utilizadas cinco repetições com 10 lagartas de segundo instar cada. Em todos os testes os tratamentos controle foram compostos pela pulverização de água destilada e autoclavada mais o espalhante adesivo a 0,05% - Tween 80®, com mesmo número de insetos e repetições. Para os testes de patogenicidade, foram obtidos os conídios através de raspagem das placas de multiplicação. Para isso foi utilizada uma alça raspadora, água deionizada estéril, um Becker e gaze estéril para filtragem a fim de se obter somente conídios da raspagem da placa. Logo após, os conídios eram contabilizados em câmara de Neubauer e determinado a concentração da suspensão mãe, para que em seguida fosse ajustado o volume para uma concentração de 1x108 conídios/mL adicionado do espalhante. A pulverização dos isolados foi feita utilizando Torre de Potter com pressão de 15 lb/in2 e volume de 6 mL de suspensão de conídios, o que possibilitou uma deposição média de 1,80 mg/cm² de suspensão, de acordo com a recomendação da International Organization of Biological Control of 20 Noxious Animals and Plants (IOBC) (OVERMEER & VAN ZON 1982, HASSAN et al. 1985). Tabela 2. Isolados de B. bassiana utilizados nos experimentos de P. xylostella. Acesso Laboratório de origem Cidade AM09 Laboratório de Microbiologia Jaboticabal - SP IBCB01 Instituto Biológico Campinas - SP IBCB07 Instituto Biológico Campinas - SP IBCB17 Instituto Biológico Campinas - SP IBCB18 Instituto Biológico Campinas - SP IBCB33 Instituto Biológico Campinas - SP IBCB35 Instituto Biológico Campinas - SP IBCB63 Instituto Biológico Campinas - SP IBCB66 Instituto Biológico Campinas - SP IBCB87 Instituto Biológico Campinas - SP JAB01 Laboratório de Microbiologia Jaboticabal - SP JAB06 Laboratório de Microbiologia Jaboticabal - SP JAB07 Laboratório de Microbiologia Jaboticabal - SP JAB43 Laboratório de Microbiologia Jaboticabal - SP JAB44 Laboratório de Microbiologia Jaboticabal - SP JAB48 Laboratório de Microbiologia Jaboticabal - SP LCMAP01 Laboratório de Controle Microbiano Jaboticabal - SP LCMAP02 Laboratório de Controle Microbiano Jaboticabal - SP LCMAP03 Laboratório de Controle Microbiano Jaboticabal - SP LCMAP05 Laboratório de Controle Microbiano Jaboticabal - SP A pulverização foi efetuada sobre discos foliares de couve manteiga (B. oleracea var. acephala cv. manteiga), em suas duas faces, os discos mediam cerca de oito centímetros de diâmetro, e foi o alimento da traça-das-crucíferas. Antes de pulverizados, os discos eram imersos em solução de hipoclorito de sódio (água sanitária) a um por cento durante cinco minutos, e enxaguados com água deionizada, em seguida, secos com papel toalha. As repetições eram colocadas em placas de Petri (9,5 cm de diâmetro x 2,0 cm de altura). As suspensões de conídios sobre a face abaxial dos discos foliares de couve manteiga que ficaram 21 sobre papel filtro nas placas de Petri, e após a secagem da folha, lagartas foram transferidas para a face abaxial da folha pulverizada com o auxílio de um pincel de finas cerdas. Ao final dos processos, as placas foram tampadas e vedadas com filme plástico para evitar que as lagartas fugissem. Para os testes de virulência, o procedimento foi idêntico ao de patogenicidade, porém as concentrações a serem utilizadas foram determinadas em testes pré-seletivos. O número de conídios produzidos por cadáver foi avaliado após o teste de patogenicidade, para isso os cadáveres de P. xylostella foram individualmente lavados em água deionizada e autoclavada e a quantidade de conídios foi contabilizada em câmara de Neubauer. Foram constituídas 10 repetições por tratamento, sendo que a contabilização somente foi realizada após o décimo quinto dia garantindo a cessão da conidiogênese, dos cadáveres onde houve a confirmação da patologia em câmara úmida. Os bioensaios com B. bassiana foram conduzidos em biocâmaras climatizadas regulada a 25 ± 1°C e 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 12 horas 3.3.2. Nematoides entomopatogênicos Quatro espécies de nematoides entomopatogênicos foram obtidos junto ao Centro Experimental do Instituto Biológico, (Campinas, SP) (Tabela 3). Para a multiplicação dos nematoides foi utilizado o hospedeiro alternativo Galleria mellonella (L., 1758) (Lepidoptera: Pyralidae), e sua criação foi conduzida de acordo com a metodologia de Andaló et al. (2004), em dieta para desenvolvimento larval com a seguinte composição: farinha de trigo 200g, farelo de trigo 200g, leite em pó desnatado 400g, levedura de cerveja 120g, gérmen de trigo 200g, mel 240g, glicerina 130g e água destilada 20mL. 22 Tabela 3. Espécies de nematoides entomopatogênicos utilizadas nos trabalhos. NEP¹ Laboratório de Origem Cidade - Estado Heterorhabditis. amazonensis Instituto biológico Campinas SP Heterorhabditis indica Instituto biológico Campinas SP Steinernema brazilense Instituto biológico Campinas SP Steinernema feltiae Instituto biológico Campinas SP ¹Nematoide entomopatogênicos. A dieta do hospedeiro alternativo então era misturada e colocada em potes plásticos forrados com folhas de papel. Desta forma o substrato poderia receber as posturas. Após o completo desenvolvimento larval as pupas então eram retiradas ao longo do desenvolvimento e transferidas para placas de Petri, onde ficavam até a emergência do adulto, devido . Os adultos então eram transferidos para tubos de PVC forrados com papel sulfite, contendo o mesmo tipo de papel em seu interior dobrado em “sanfona” para receber as posturas, estes tubos eram tapados com tecido do tipo voile na abertura superior e colocados sobre o fundo de uma placa de 15 cm de diâmetro correspondente a largura do tubo, que tinha aproximadamente 25 cm de altura. Completado o ciclo de criação as etapas se repetiam para que sempre houvesse larvas de G. mellonella para a multiplicação dos NEPs. Para a multiplicação dos NEPs, eram selecionadas dez lagartas, de quinto instar e de tamanho aproximado e, posteriormente, colocadas em uma placa de Petri de nove cm de diâmetro com duas folhas de papel filtro no fundo, sendo neste inoculados dois mL da suspensão com os nematoides (ANDALÓ et al., 2004 ). Após a inoculação, as placas eram mantidas em câmara BOD por cerca de 48 a 60 horas, tempo que normalmente levava para ocorrer a morte das lagartas do hospedeiro e houvesse confirmado o sintoma da patologia, para então transferir as lagartas mortas para novas placas de Petri de 9 cm de diâmetro, com papel filtro 23 seco, e lá ficavam por cerca de 5 a 7 dias. Após esta fase era montada a armadilha de White, que consiste em uma placa de Petri de 15 cm de diâmetro, contendo em seu interior a tampa de uma placa de 9 cm virada para baixo, sobre esta foi posta uma folha de papel filtro cortada com diâmetro de 13,5 cm, onde foram colocadas as lagartas mortas por nematoides e cerca de 3 mL de água deionizada estéril no fundo da placa. As armadilhas foram colocadas em B.O.D. por um período de 3 a 7 dias, para então recolher o conteúdo de JI dispersos em água. Os juvenis mortos dos vivos foram separados pelo processo de decantação e filtragem. Para a filtragem foi utilizado uma peneira de malha 150 mesh. Após isso, os nematoides eram acondicionados em Erlenmeyers de 500 mL em água deionizada e autoclavada. Esta suspensão mãe permanecia em B.O.D. por um prazo máximo de 15 dias para a reinoculação de criação e por no máximo de 3 dias para a utilização em experimentos. O ajuste de suspensões de NEPs para experimentos era feito utilizando-se uma alíquota de 1 ml da suspensão mãe, que era contabilizada em vidro de relógio com auxílio de uma lupa No ensaio de patogenicidade com NEPs, foram considerados 5 tratamentos representados pelos 4 nematoides mais a testemunha. Para cada tratamento foram estabelecidas 6 repetições, e cada repetição representada por uma placa de Petri (9,5cm de diâmetro x 2,0cm de altura) contendo um disco (8 cm de diâmetro) de folha de couve (B. oleracea var. acephala cv. Manteiga) infestada com 20 lagartas de 2º instar da praga. No fundo da placa foi colocado um circulo de papel filtro de mesmo tamanho, que era umedecido com água a fim de manter o disco foliar turgido. Os nematoides foram aplicados em suspensão aquosa com o auxílio de uma pipeta, adicionando-se em cada círculo de folha 0,5 mL da suspensão contendo uma dose equivalente a 200 JI/inseto. As placas foram seladas com filme PVC e acondicionadas em câmara climatizada a 25 ± 1°C e 70 ± 10% de umidade relativa com fotofase de 12 horas. 24 A avaliação foi realizada diariamente após a aplicação, com base na mortalidade dos insetos. Os insetos mortos foram transferidos para placas de Petri com papel filtro seco a fim de confirmar a mortalidade pelo desenvolvimento da patologia. Após 24 horas esses foram transferidos para armadilhas de White para permitir a coleta dos JI que deixaram o cadáver, para que se pudesse realizar a sua contagem e determinar o número de JI produzidos por cadáver. Foram constituídas 10 repetições por tratamento, Para os testes de virulência foram realizados pré-testes nas mesmas condições dos ensaios de patogenicidade a fim de definir os pontos extremos para a análise da concentração letal, após isso, mais quatro pontos equidistantes dentro das concentrações extremas foram calculados. Os ensaios com NEPs foram conduzidos em biocâmaras climatizadas reguladas a 25 ± 1°C e 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 12 horas 3.3.3. Bactérias simbiontes de nematoides entomopatogênicos Foi estudado a suscetibilidade das populações da traça-das-crucíferas a dez isolados de bactérias simbiontes de NEPs (Tabela 4). Para este bioensaio foram cedidos os isolados em meio NB (0,5% de peptona e 0,3% de extrato de carne), e neste mesmo meio eram repicados a medida que se fazia necessário. A cultura de cada isolado era feita em Erlenmeyers de 100mL contendo a metade do volume de meio. Após a inoculação o meio era colocado em mesa agitadora horizontal a 26ºC, e depois de 24 horas era cessada a agitação e utilizado. As bactérias foram isoladas a partir da hemolinfa do hospedeiro infectado (KAYA & STOCK, 1997), conforme a metodologia descrita a seguir: 25 Ta be la 4 . R el aç ão d as b ac té ria s si m bi on te s de n em at oi de s en to m op at og ên ic os u til iz ad as . A ce ss o Es pé ci e da b ac té ria s im bi on te N EP ¹ h os pe de iro La bo ra tó rio d e O rig em C id ad e - E st ad o B1 Xe no rh ab du s po in ar ii S. g la se ri In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B2 X. n em at op hi la St ei ne rn em a ca rp oc ap se In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B5 Ph ot or ha bd us lu m in es ce ns a kh ur st ii H et er or ha bd iti s in di ca In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B6 Xe no rh ab du s sp . – St ei ne rn em a sp . In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B9 Xe no rh ab du s sp . - St ei ne rn em a sp . In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B2 4 Ph ot or ha bd us s p. – H et er or ha bd iti s sp . In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B2 7 Xe no rh ab du s sp . - St ei ne rn em a sp . In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B2 8 Xe no rh ab du s sp . - St ei ne rn em a sp . In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B3 8 Xe no rh ab du s sp . - St ei ne rn em a sp . In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P B4 7 X. b ov ie ni i St ei ne rn em a fe lti ae In st itu to B io ló gi co C am pi na s -S P 25 26 Foram colocadas 10 lagartas de ultimo instar de G. Mellonella em uma placa de Petri com papel filtro e inoculado com 100 juvenis infectivos para cada inseto. Após 12 a 48 horas, esterilizou-se superficialmente a larva de Galleria mellonella mergulhando a mesma em uma solução de hipoclorito de sódio (1%) e enxaguando 3 vezes seguidamente em água destilada, seguido de mergulho em água destilada. Rompeu-se o tegumento com pinça ou agulha estéril, tomando o cuidado para não romper o intestino, e foi plaqueado uma gota da hemolinfa sobre meio MacConkey, NBTA - Extrato de carne (0,3%) + Peptona (0,5%) + NaCl (0,8%) + ágar (1,5%) + cloreto de trifeniltetrazolium (TTC) (0,004%) + azul de bromotimol (0,0025%), ou nutriente ágar (AKHURST, 1980). Caso não fosse encontrado contaminantes após o plaqueamento, transferiu-se a colônia (cor verde para Heterorhabditis e marrom escuro para Steinernema) para meio nutriente-ágar e incubou-se por 1 a 3 dias a 25�C no escuro. Neste ensaio de patogenicidade os discos foliares de couve manteiga eram imersos no meio contendo a cultura bacteriana e agitado por um período de 10 segundos, sendo retirado e colocado para secar o excesso sobre um papel filtro. Logo após eram inoculadas 20 lagartas de segundo instar de P. xylostella na face abaxial da folha. Foram constituídas seis repetições por isolado Para confirmar a mortalidade pelos isolados foi verificado a alteração de cor característica da patologia desencadeada por estes agentes de controle microbiano. Estes ensaios com as bactérias simbiontes dos NEPs também foram conduzidos em biocâmaras climatizadas reguladas a 25 ± 1°C e 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 12 horas 27 3.4. Efeitos Subletais Com os sobreviventes aos testes de patogenicidade, foram avaliados alguns aspectos biológicos quando o número amostral foi de no mínimo doze indivíduos. Os aspectos biológicos avaliados foram: peso de lagartas sobreviventes após cinco dias da aplicação dos agentes de controle, peso de pupas de macho e fêmea, razão sexual, número total de ovos (fecundidade) e viabilidade de ovos. O peso de lagartas e pupas foram verificados em balança de precisão; a razão sexual foi estudada logo após a eclosão dos adultos (JUSTUS & MITCHELL, 1999), pela observação da morfologia das asas e das genitálias. Para estudar o total de oviposição e a viabilidade de ovos foram montadas gaiolas com casais da praga, num total de seis casais por tratamento. Os ovos foram retirados diariamente e acondicionados em placas de Petri junto com o disco foliar de couve que serviu como substrato de oviposição, os quais foram contabilizados e avaliados quanto a viabilidade. Os ensaios de efeitos subletais foram conduzidos em salas climatizada s reguladas a 25 ± 1°C e 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 12 horas 3.5. Consumo Foliar O consumo foliar foi aferido nos discos foliares de couve manteiga (B. oleracea var. acephala cv. Manteiga) que foram oferecidos nos ensaios de patogenicidade. A medição foi feita em cada repetição com o uso de um medidor de área foliar a laser (CI 203® – CID Incorporation). Os discos de oito centímetros de diâmetro eram colocados na mesa do aparelho e em seguida escaneados através da passada do leitor a laser em seu trilho, com isso era obtida a área antes do consumo. Após o consumo, era medido novamente o restante de cada disco ,e, 28 desta forma, calculou-se através da diferença a área consumida pelas lagartas de P. xylostella. Os ensaios de efeitos subletais foram conduzidos em câmaras climatizada reguladas a 25 ± 1°C e 70 ± 10% de umidade relativa e fotofase de 12 horas 3.6. Delineamento experimental e análise estatística Os experimentos foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado. Para os experimentos de patogenicidade e virulência, a mortalidade corrigida foi calculada em relação à testemunha pela fórmula de Abbott (1925). Para isso foi utilizada a mortalidade confirmada pela porcentagem de insetos mortos que apresentaram o desenvolvimento da patologia correspondente a cada agente de controle microbiano testado. No teste de patogenicidade os dados observados foram transformados por arc sen √(x/100), submetidos a análise de variância (ANOVA) e teste de Tukey (P < 0,05 e 0,01) para comparação entre médias, o que forneceu os isolados que foram submetidos ao teste de virulência para estimar a concentração letal 50 (CL50), que foi analisada com a utilização do programa Polo-Plus® (LeOra Software) pelo qual foi realizado a Análise de Probit, conforme Haddad (1998) Os dados de produção de microrganismos em cadáveres de P. xylostella, aspectos biológicos e consumo foliar, foram submetidos a Análise de Variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5 e 1% de probabilidade. . 29 4. RESULTADOS E DISCUSSÂO 4.1 Sequenciamento do gene COI Foram utilizados dez indivíduos para as populações PX, PC e PJ e nove indivíduos da população PA. O número menor de indivíduos em PA se deve a uma amostra perdida durante a purificação do DNA. Não inserções, exclusões ou códons de parada foram detectados nas análises, totalizando 776 pares de base. Um fragmento de 815-pares de base (pb), foi utilizado em todas as análises dos 39 indivíduos que foram sequenciados, não havendo variação do comprimento. Em comparação aos dados obtidos por Li et al. (2006), foram utilizados 104 pares de base a mais. Provavelmente o número de bases codificadas a mais se deve ao aproveitamento da sequencia cortada que teve boa qualidade de sequenciamento. Sendo a região codificada a mesma que a dos autores supracitados quando analisaram populações de P. xylostella do sudeste da China e da Coréia do Sul, sobrando pares de base tanto no sentido 5’ quanto no sentido 3’, sobrepondo o material sequenciado. A composição média percentual de bases foi de 39,6% timina, 30,7% adenina, 14,9% de citosina e 14,8% de guanina, obedecendo a proporção de distribuição de bases em DNA mitocondrial de animais (BOORE, 1999). Globalmente, 43 sítios polimórficos (S) foram observados, definindo 19 haplótipos (Tabela 5), com uma diversidade geral (Hd) de 0,887 ± 0,040, a diversidade de nucleotídeos (Pi) foi de 0,00832 ± 0,00125, o número total de mutações (η) foi de 46 e o número médio de diferentes nucleotídeos (k) foi 6,458. Os valores de diversidade geral (Hd) de cada população mostram que a população PA é a mais homogênea em sua constituição gênica mitocondrial, e ainda é a que apresenta menor diversidade de nucleotídeos (Tabela 6). A distância genética foi calculada para as populações de forma total (e entre as populações (Tabela 7)), utilizando o modelo de dois parâmetros de 30 Kimura (KIMURA, 1980). Para as populações como um todo, o valor da distância genética foi de 0,008 ± 0,002 (FST = 0,056; p= 0,04), estando o valor dentro do esperado para a variação de DNA mitocondrial para insetos como constataram Brower. (1994) e Kim et al. (2001), mostrando pequena distância genética de forma global, e entre as populações a maior distância foi de 0,013, valor encontrado entre os indivíduos da população PX e da população PJ, que também são as populações mais distantes geograficamente, entretanto o valor da distância é pequeno. Um dendrograma foi produzido utilizando o método Neighbor-Joining (SAITOU & NEI, 1987) (Figura 3), onde foram testadas 1.000 permutações aleatórias utilizando “bootstrap”, como valores de nós basais. Através do dendrograma podemos observar que os indivíduos das populações PX e PA são os mais similares e que as populações PC e PJ são as mais diversas, no entanto, verificou-se que a diversidade do mtDNA não proporcionou um agrupamento homogêneo de acordo com a grande variabilidade de haplótipos. Morales & Freitas (2010) também verificaram que a diversidade gênica mitocondrial de indivíduos de Chrysoperla externa (Hagen, 1861) (Neuroptera: Chrysopidae) era grande, e que apesar de mostrar uma boa similaridade genética, não houve um padrão bem definido de dendrograma separando populações distintamente, uma vez que os indivíduos se misturam em diversos ramos. A AMOVA para a distância genética foi significativa para a distância entre as populações PA e PC (FST = 0,162 e p=0,009) (Tabela 7). Estas duas populações são provenientes de uma mesma localidade. Isto quer dizer que a distância geográfica não influenciou na formação de populações distintas, e sim outros fatores como temperatura, alimentação alternativa ou migração. A diferenciação das populações através da diversidade de mtDNA, das distâncias e do número de haplótipos encontrado é considerável, uma vez que o número amostral foi de 39 indivíduos, ou seja, mais da metade possui material 31 mitocondrial em segregação, o que pode ser encontrado em indivíduos que migram longas distâncias (CHAPMAN, et al., 2002 ). Tabela 5. Lista de haplótipos, diversidade haplotípica (Hd) e diversidade nucleotídica (Pi) das populações de Plutella xylostella. Indivíduo Posição 32 PX1 PC5 PC4 PA8 PJ1 PA4 PA3 PJ8 PX2 PA6 PX6 PX5 PA7 PA1 PA2 PA5 PJ5 PX7 PX3 PX4 PC7 PC1 PC9 PC2 PX10 PA9 PX8 PX9 PC3 PJ10 PJ2 PJ9 PC8 PJ6 PJ7 PC10 PC6 PJ3 PJ4 86 63 52 64 51 47 47 57 27 28 13 10 10 9 16 63 99 6 5 5 4 40 11 60 6 15 1 1 0 0 1 0 0 0 0 0 Figura 3. Dendrograma gerado a partir do método Neighbor-Joining com sequências mitocondriais da oxidase do Citocromo I (COI) de populações da traça-das-crucíferas. Os números nos ramos correspondem aos valores de Bootstrap. 33 Tabela 6. Diversidade haplotípica (Hd) e nucleotídica (Pi) e erro padrão das populações da traça das crucíferas. População PX PA PC PJ Hd 0,867 ± 0,085 0,583 ± 0,183 0,956 ± 0,059 0,956 ± 0,060 PI 0,116 ± 0,040 0,021 ± 0,008 0,158 ± 0,032 0,180 ± 0,025 Tabela 7. Distância média dentro e entre as populações da traça-das-crucíferas. População Dentro das Populações PX 0,006 ± 0,01* PA 0,001 ± 0,01* PC 0,009 ± 0,02* PJ 0,010 ± 0,02* Entre as Populações PX PA PC PJ PX - - - - PA 0,004 - - - PC 0,008 0,006* - - PJ 0,013 0,011 0,010 - * Significativo ao nível de 5% de probabilidade. P. xylostella tem o grande potencial biológico, podendo formar grandes grupos durante o ano (TALEKAR & SHELTON, 1993). Segundo Caprio & Tabashnik (1992) cerca de 8% de uma população da traça-das-crucíferas faz migração diariamente, sendo que a distância pode chegar a milhares de quilometros em alguns dias (LORIMER, 1981, CHAPMAN et al. 2002). Portanto este fluxo gênico no DNA mitocondrial pode ser devido a grande taxa de reprodução e a capacidade migratória desta espécie (CHU, 1986; HONDA,1990; HONDA et al., 1992; COULSON et al., 2002), 34 4.2. Método ISSR-PCR Dos sete iniciadores testados somente um não marcou bandas (PLU 7), para confirmação os procedimentos foram repetidos por duas vezes. No entanto, foi possível utilizar os dados obtidos com as 39 amostras, sendo um total de dez amostras para PX, PC e PJ e 9 para PA, que foi perdida na extração do DNA. Os seis iniciadores juntos marcaram um total de 48 bandas, número bem inferior ao encontrado por Roux et al. (2007), que encontraram 188 bandas, além disso, esses pesquisadores não conseguiram bandas com os iniciadores PLU 3, PLU 4 e PLU5, pois obtiveram apenas manchas que não foram consideradas, sendo que o mesmo efeito observado neste trabalho ocorreu somente no primer Plu7. Este fato pode ser devido a menor variabilidade genética encontrada neste trabalho em relação ao trabalho dos autores supracitados. De acordo com a análise de variância molecular, as diferenças entre e dentro das populações foram significativas devido ao valor de p= 0,0000 (Tabela 8), As variações entre as populações alcançaram o valor médio de 10,2%, enquanto dentro das populações o valor foi de aproximadamente 90%, o que demonstra que as diferenças genéticas de DNA genômico são relativamente notáveis e de acordo com a Tabela 9, pode-se notar que isso reflete em diferenças entre cada população de forma pareada e em sua própria diversidade. Apesar das populações terem sido coletadas em áreas onde não havia sido empregado o uso de agrotóxicos, não podemos garantir que estas populações não entraram em contato com tais produtos que tem grande poder mutagênico sendo uma fonte de variação gênica muito grande (WEILL et al, 2004) devido aos relatos de migração a longas distâncias desta praga (CHAPMAN et al., 2002) 35 Tabela 8. Análise de Variância Molecular para as diferenças entre e dentro das populações pelo método de ISSR-PCR. Fonte de Variação G.L.¹ Soma dos Quadrados Componetes de Variância Porcentagem de Variação Entre Populaçõesa 3 33,56 0,61 10,2 Dentro das Populaçõesb 34 183,02 5,38 89,8 Total 37 216,58 5,99 - FST 0,102 pa, b 0,00000 ¹ Graus de liberdade; Tabela 9. Proporção da diferença dentro e entre as populações pelo método ISSR- PCR. População Dentro das Populações PX 11,98 ± 0,009* PA 9,61 ± 0,001* PC 10,87 ± 0,09* PJ 10,44 ± 0,03* Entre as Populações PX PA PC PJ PX - - - - PA 0,01 ± 0,009* - - - PC 0,08 ± 0,001* 0,07 ± 0,036* - - PJ 0,15 ± 0,009* 0,12 ± 0,009* 0,1 ± 0,001* - *Significativo ao nível de 5% de probabilidade. Como as populações são de origem tropical e permanecem em temperatura que permite desenvolver várias gerações ao ano, a continua segregação do DNA 36 genômico é resultante das diversas contribuições de diferentes insetos que contribuíram com informação genética diferente (GRANT & MACKAY, 1969) 4.3. Suscetibilidade de Plutella xylostella aos entomopatógenos As populações de P. xylostella mostram-se suscetíveis a todas as táticas de odos os entomopatógenos testados, entretanto, melhores resultados foram obtidos com o uso de fungos entomopatogênicos (Tabela 10). Os resultados de patogenicidade com NEPs (Tabela 11) também foram promissores, no entanto nenhum NEP conseguiu ser tão eficiente quanto alguns isolados de B. bassiana. Já os resultados de mortalidade da traça-das-crucíferas expostas as bactérias simbiontes de NEPs (Tabela 12), foram os resultados menos promissores, ainda mais por ter sido utilizado a cultura pura das bactérias nos discos foliares de couve. A mortalidade com B. bassiana não evidenciou diferenças de resultados entre as populações, mas diferenciou bem entre os isolados testados, atingindo 100% de mortalidade pelos isolados AM09 e JAB 48, e ainda o teste de médias adicionou mais quatro isolados (IBCB18, IBCB66, JAB01e LCMAP03) ao grupo mais virulento para o microlepidóptero estudado. Estes seis isolados foram os selecionados entre os fungos entomopatogênicos estudados nos testes de virulência. Silva et al. (2003) e Rondelli et al. (2011), também verificaram que isolados de B. bassiana foram patogênicos à P. xylostella, e apresentaram os mesmo sintomas de coloração de confirmação da patologia deste fungo entomopatogênicos, com uma alteração para coloração rósea e posterior produção de conídios, desenvolvendo o aspecto de massa pulverulenta. 37 Tabela 10. Mortalidade média corrigida das populações de P. xylostella quando aplicados isolados de Beauveria bassiana (média ± erro padrão). Fungo/População PX PA PC PJ F C.V.(%) AM09 100,00 ± 0,00 A 100,00 ± 0,00 A 100,00 ± 0,00 A 100,00 ± 0,00 A - 0,00 IBCB01 92,67 ± 0,76 CDE 92,17 ± 0,87 BC 93,17 ± 0,70 BCD 93,67 ± 0,80 B 0,67ns 2,07 IBCB07 67,17 ± 0,33 H 66,33 ± 0,71 E 65,17 ± 0,95 G 66,00 ± 1,29 F 0,68ns 3,72 IBCB17 92,67 ± 0,88 CDE 92,50 ± 0,99 BC 94,50 ± 0,67 B 92,33 ± 0,95 BC 1,30ns 2,33 IBCB18 99,50 ± 0,34 A 99,67 ± 0,33 A 99,33 ± 0,49 A 99,17 ± 0,48 A 0,26ns 1,03 IBCB33 89,67 ± 1,15 DEF 91,67 ± 0,92 BC 87,33 ± 1,02 E 90,33 ± 1,45 BCD 2,48ns 3,14 IBCB35 94,67 ± 0,61 BC 93,00 ± 0,82 B 94,17 ± 0,83 B 94,17 ± 0,48 B 1,02ns 1,83 IBCB63 90,17 ± 1,22 DEF 90,50 ± 1,65 BC 89,17 ± 1,47 DE 89,17 ± 0,54 CD 0,28ns 3,52 IBCB66 99,86 ± 0,17 A 100,00 ± 0,00 A 99,50 ± 0,50 A 99,83 ± 0,17 A 0,58ns 0,68 IBCB87 89,83 ± 0,60 DEF 92,00 ± 0,26 BC 89,67 ± 0,80 CDE 91,67 ± 0,71 BCD 3,71ns 1,70 JAB01 99,50 ± 1,39 A 100,00 ± 0,00 A 100,00 ± 0,00 A 99,67 ± 0,21 A 0,85ns 0,67 JAB06 55,00 ± 1,39 I 54,17 ± 1,35 F 55,83 ± 0,95 H 54,17 ± 1,25 G 0,41ns 5,57 JAB07 93,67 ± 0,33 CD 93,83 ± 0,40 B 93,67 ± 0,33 BC 93,83 ± 0,33 B 0,08ns 0,90 JAB43 88,20 ± 1,01 F 88,50 ± 0,96 C 89,17 ± 1,30 DE 88,67 ± 1,33 CD 1,32ns 3,23 JAB44 75,67 ± 1,09 G 76,67 ± 0,80 D 75,67 ± 0,92 F 76,17 ± 1,17 E 0,23ns 3,23 JAB48 100,00 ± 0,00 A 100,00 ± 0,00 A 100,00 ± 0,00 A 100,00 ± 0,00 A - 0,00 LCMAP01 89,17 ± 1,01 EF 88,50 ± 1,34 C 87,83 ± 1,19 E 87,67 ± 1,26 D 0,32ns 3,35 LCMAP02 37,83 ± 0,65 J 36,00 ± 0,82 G 36,83 ± 0,75 I 3 7,67 ± 0,42 H 1,56ns 4,47 LCMAP03 98,67 ± 0,61 AB 99,50 ± 0,22 A 99,67 ± 0,21 A 99,17 ± 0,65 A 0,86ns 1,17 LCMAP05 54,00 ± 1,15 I 54,33 ± 1,23 F 55,83 ± 0,95 H 52,67 ± 0,80 G 1,54ns 4,73 F 472,96** 475,82** 488,20** 468,68** - - C.V.(%) 2,37 2,42 2,35 2,43 - - Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem ao nível de 5 ou 1 % de significância de acordo com o teste de Tukey. PX - população de Recife, PE; PA – população 1 de Alegre, ES; PC – população 2 de Alegre; PJ – população de Jaboticabal. * Significativo ao nível de 5% de probabilidade; ** significativo ao nível de 1% de probabilidade; ns não significativo. . Os resultados de mortalidade de P. xylostella a NEPs (Tabela 11) foram similares aos encontrados por Schroer et al. (2005), Salem et al. (2007), Nyasani et al. (2007) e Maketon et al. (2011), com cerca de 80 a 100% de similaridade quando analisados os dados referentes a nematoides do gênero Heterorhabditis e Steinernema respectivamente. Estes resultados corroboram o potencial dos 38 nematoides entomopatogênicos para o controle da traça-das-crucíferas. A pequena variação dos nossos resultados com os destes autores pode ser devido as semelhança genéticas das populações da praga verificadas neste trabalho, como também a dos agentes de controle biológico utilizados. Com exceção de S. brazilense que demonstrou diferença significativa na mortalidade entre as populações testadas, sendo mais efetiva para PJ e PX, os demais NEPs não demonstraram diferença entre os resultados em cada população. Já quando analisou-se o efeito causado entre nematoides em cada população, verificou-se que os nematoides do gênero Heterorhabditis causaram maior mortalidade em PX e PC, e não havendo diferença da ação dos NEPs na mortalidade de PA e PJ. Contudo, os valores de mortalidade foram promissores para o próximo teste onde estimou-se a virulência dos NEPs. Tabela 11. Mortalidade média corrigida das populações de P. xylostella quando expostas a nematoides entomopatogênicos (média ± erro padrão). NEP/População PX PA PC PJ F C.V.(%) H. amazonensis 75,00 ± 5,16 A 70,83 ± 9,17 A 75,00 ± 4,08 A 79,17 ± 5,07 A 0,30ns 20,2 H. indica 73,33 ± 4,22 A 69,17 ± 4,73 A 70,00 ± 4,28 A 72,50 ± 4,43 A 0,20ns 15,18 S. brazilense 65,00 ± 3,42 Aab 63,33 ± 4,22 Ab 63,33 ± 4,22 Ab 80,83 ± 4,36 Aa 4,37* 14,63 S. feltiae 54,17 ± 3,00 B 52,50 ± 3,35 B 53,33 ± 3,80 B 65,00 ± 3,65 B 2,87ns 15,09 F 60,25** 24,90** 53,20** 60,69** - - C.V. (%) 16,46 24,46 17,48 15,97 - - Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem ao nível de 5 ou 1 % de significância de acordo com o teste de Tukey. PX - população de Recife, PE; PA – população 1 de Alegre, ES; PC – população 2 de Alegre; PJ – população de Jaboticabal. * Significativo ao nível de 5% de probabilidade; ** significativo ao nível de 1% de probabilidade; ns não significativo. Os dados observados para a mortalidade corrigida das bactérias simbiontes (Tabela 12) revelaram uma menor virulência destes agentes de controle. A aplicação de bactérias simbiontes teve resultados muito semelhantes entre si sendo a variação da mortalidade entre isolados de 38 a 42%, e só foi observado diferença entre o comportamento de populações com o isolado B28 (Steinernema 39 sp.) que teve maior eficiência de controle sobre a população PA, e menor eficiência em PC e PJ, no entanto as diferenças foram muito sutis. Somente na população PA os isolados das bactérias mostraram diferença no controle sendo mais eficiente com o isolado B27 (Xenorharbdus sp.) e menos eficiente com o isolado B38 (Xenorharbdus sp.), ambos isolados de Steinernema sp. Tabela 12. Mortalidade média corrigida das populações de P. xylostella quando expostas às bactérias simbiontes de nematoides entomopatogênicos (média ± erro padrão). Bactéria/População PX PA PC PJ F. C.V. (%) X. poinarii 41,33 ± 0,61 41,17 ± 0,87 AB 40,50 ± 0,76 40,00 ± 0,82 0,63ns 4,65 X. nematophilla 39,83 ± 0,75 40,33 ± 0,80 AB 41,16 ± 0,70 41,00 ± 0,82 0,64ns 4,64 P. luminescens akhurstii 40,83 ± 0,54 40,00 ± 0,82 AB 39,83 ± 0,54 40,50 ± 0,62 0,51ns 3,89 Xenorharbdus sp. 40,50 ± 0,56 41,00 ± 0,52 AB 39,67 ± 0,67 39,83 ± 0,75 0,96ns 3,84 Xenorharbdus sp. 39,33 ± 0,61 40,17 ± 0,60 AB 40,83 ± 0,79 40,67 ± 0,71 0,97ns 4,17 Photorhabdus sp. 40,50 ± 0,43 39,50 ± 0,50 AB 40,67 ± 0,67 41,17 ± 0,75 1,36ns 3,63 Xenorharbdus sp. 41,50 ± 0,62 41,83 ± 0,65 A 40,67 ± 0,80 40,67 ± 0,84 0,65ns 4,38 Xenorharbdus sp. 41,17 ± 0,40 ab 42,00 ± 0,45 Aa 39,83 ± 0,60 Ab 39,83 ± 0,60 Ab 4,20* 3,13 Xenorharbdus sp. 40,67 ± 0,92 38,67 ± 0,33 B 40,17 ± 0,54 40,50 ± 0,76 1,82ns 4,15 X. bovienii 42,17 ± 0,54 39,67 ± 0,80 AB 41,50 ± 0,62 41,00 ± 0,73 2,46ns 4,06 F 1,77ns 2,59* 0,80ns 0,42ns - - C.V(%) 3,70 3,99 4,09 4,50 - - Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem ao nível de 5 ou 1 % de significância de acordo com o teste de Tukey. PX - população de Recife, PE; PA – população 1 de Alegre, ES; PC – população 2 de Alegre; PJ – população de Jaboticabal. * Significativo ao nível de 5% de probabilidade; ** significativo ao nível de 1% de probabilidade; ns não significativo. Abdel-Razek (2003) encontrou valores de mortalidade com bactérias simbiontes de NEPs para a mesma praga entre 40 e 60%, entretanto, visando o controle de pupas. Tais dados reafirmam que o potencial de controle das bactérias simbiontes sem seus vetores não alcançou a mesma eficiência. Por outro lado Lanjewar et al. (2008) e Mahar et al. (2008), conseguiram resultados melhores de mortalidade para P. xylostella somente com o uso de 40 isolados de Photorhabdus luminescens, isso mostra que existem isolados mais virulentos do que os testados neste trabalho, ou que as populações da praga testadas neste trabalho, não são tão suscetíveis a aplicação deste entomopatógeno de forma isolada. Como esses últimos agentes de controle não alcançara a faixa de 50% de controle, nenhum isolado foi selecionado para testes de virulência. A estimativa da concentração letal 50 (CL50) dos isolados de B. bassiana foi igual, tanto comparando os isolados entre si como quando comparado o efeito em cada população. Isto é devido a sobreposição do valor do intervalo de confiança a 95% (Tabelas 13 a 18). Portanto não houve diferença na virulência sobre a traça- das-crucíferas, com os isolados selecionados. O valor da estimativa da Cl50 variou de 3,29x105 conídio/mL a 1,36x106 conídios/mL, sem diferença na virulência dos isolados entre eles nem entre as populações. Tabela 13. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) do isolado AM09 de Beauveria bassiana sobre as populações de Plutella xylostella. Fungo População CL50 (conídios/mL) (IC 95%)¹ GL2 ��²3 PX 3,92x105 3 8,12 (1,15x105 - 1,85x106 AM09 PA 6,64x105 3 1,65 (3,34x105 - 1,76x106) PC 3,29x105 3 8,88 (8,91x104 - 1,69x106) PJ 7,26x105 3 1,32 (3,48x105 - 2,10x106) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). 41 Tabela 14. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) do isolado IBCB18 de Beauveria bassiana sobre as populações de Plutella xylostella. Fungo População CL50 (conídios/mL) (IC 95%)¹ GL2 ��²3 PX 8,93x105 3 0,59 (4,28x105 - 2,58x106) IBCB18 PA 9,75x105 3 0,50 (4,66x105 - 2,84x106) PC 4,41x105 3 9,26 (1,13x105 - 2,46x106) PJ 9,51x105 3 1,21 (4,69x105 - 2,61x106) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). Tabela 15. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) do isolado IBCB66 de Beauveria bassiana sobre as populações de Plutella xylostella. Fungo População CL50 (conídios/mL) (IC 95%)¹ GL2 �²3 PX 1,04x106 3 0,75 (4,59x105 - 3,61x106) IBCB66 PA 8,48x105 3 0,25 (3,98x105 - 2,54x106) PC 9,95x105 3 0,42 (4,52x105 - 3,21x106) PJ 9,18x105 3 0,84 (4,22x105 - 2,89x106) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). 42 Tabela 16. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) do isolado JAB01 de Beauveria bassiana sobre as populações de Plutella xylostella. Fungo População CL50 (conídios/mL) (IC 95%)¹ GL2 ��²3 PX 9,95x105 3 1,06 (4,72x105 - 2,94x106) JAB01 PA 9,80x105 3 1,99 (4,47x105 - 3,13x106) PC 9,07x105 3 0,65 (4,09x105 - 2,96x106) PJ 1,31x106 3 1,52 (5,27x105 - 5,48x106) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). Tabela 17. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) do isolado JAB48 de Beauveria bassiana sobre as populações de Plutella xylostella. Fungo População CL50 (conídios/mL) (IC 95%)¹ GL2 �²3 PX 8,24x105 3 1,77 (3,41x105 - 3,23x106) JAB48 PA 7,63x105 3 0,40 (3,39x105 - 2,58x106) PC 6,77x105 3 0,41 (3,13x105 - 2,10x106) PJ 6,06x105 3 0,28 (2,93x105 - 1,71x106) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). 43 Tabela 18. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) do isolado LCMAP03 de Beauveria bassiana sobre as populações de Plutella xylostella. Fungo População CL50 (conídios/mL) (IC 95%)¹ GL2 ��²3 PX 9,53x105 3 0,73 (4,11x105 - 3,43x106) LCMAP03 PA 7,80x105 3 0,38 (3,63x105 - 2,39x106) PC 9,28x105 3 0,57 (4,19x105 - 3,03x106) PJ 8,75x105 3 0,92 (3,87x105 - 2,98x106) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). Os valores obtidos com a estimativa de CL50 são similares aos valores de trabalhos onde também foi estudado este parâmetro, como em Silva et al., 2003 e Rondelli et al. (2011), ambos próximo a 100% de similaridade ,em P. xylostella, Almeida et al.(2005) com Anthonomus grandis Boheman, 1843 (Coleoptera: Curculionidae). Esta semelhança de resultados, se deve a estabilidade das enzimas proteolíticas que apresentam os fungos entomopatogênicos (STÜMER et al, 2003), que muitas vezes dependem do meio de cultivo utilizado para se expressarem durante o crescimento (THIAGO & FURLANETO, 2003), sendo o meio BDA utilizado nos trabalhos. Nos bioensaios de virulência dos NEPs (Tabelas 19 a 22), os nematoides do gênero Heterorhabditis foram mais virulentos do que os do gênero Steinernema, pois necessitaram de uma dose menor de JI para causar a mortalidade nas populações de P. xylostella. 44 Tabela 19. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) de Heterorhabditis amazonensis sobre as populações de Plutella xylostella. Nematoide População CL50 (Juvenis infectivos/lagarta) GL2 ��²33 (IC 95%)¹ PX 151,97 3 13,29 (140,88 – 163,87) H. amazonensis PA 158,12 3 15,68 (146,65 - 169,60) PC 151,79 3 14,11 (140,14 – 163,45) PJ 148,01 3 10,66 (136,88 – 159,14) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). Tabela 20. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) de Heterorhabditis indica sobre as populações de Plutella xylostella. Nematoide População CL50 (Juvenis infectivos/lagarta) GL2 �²3 (IC 95%)¹ PX 158,79 3 13,12 (147,67 – 170,07) H. indica PA 153,04 3 17,26 (141,25 – 164,84) PC 158,87 3 14,93 (147,05 – 170,70) PJ 150,98 3 19,63 (139,51 – 162,45) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). 45 Tabela 21. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) de Steinernema brazilense sobre as populações de Plutella xylostella. Nematoide População CL50 (Juvenis infectivos/lagarta) GL2 ��²3 (IC 95%)¹ PX 191,17 3 6,68 (178,04 – 204,30) S. brazilense PA 190,88 3 10,17 (177,74 – 204,03) PC 190,96 3 9,31 (177,17 – 204,75) PJ 130,12 3 11,33 (124,33 – 136,43) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). Tabela 22. Estimativa da concentração letal 50 (CL50) de Steinernema feltiae sobre as populações de Plutella xylostella. Nematoide População CL50 (Juvenis infectivos/lagarta) GL2 �²3 (IC 95%)¹ PX 209,28 3 9,65 (192,99 – 225,57) S. feltiae PA 168,21 3 7,14 (151,88 – 185,66) PC 209,69 3 11,13 (192,86 – 226,52) PJ 184,97 3 8,12 (172,02 – 197,91) ¹ Intervalo de confiança das CL50 a 95% de probabilidade; 2número de graus de liberdade; 3teste do Qui-quadrado (�²). 46 As CL50 de H. amazonensis, H. indica e S. feltiae não diferenciam sobre as populações da traça-das-crucíferas testadas, pois se sobrepõem em seus os intervalos de confiança, possuindo a mesma resposta. O estudo da CL50 de S. brazilense revelou que PJ é mais suscetível a esse nematoide, pois os intervalos de confiança a 95% evidenciam que existe diferença entre as outras populações testadas. Bélair et al. (2003) e Salem et al. (2007),observaram valores inferiores de CL50, entre 2 e 60 JI quando testaram a eficácia destes agentes de controle para P. xylostella, entretanto, eles utilizaram lagartas de 3º instar nos ensaios, o que talvez possibilitou aos NEPs maior facilidade de penetração, pois os orifícios naturais como os espiráculos são maiores em relação as lagartas de 2º instar , que foi o padrão utilizado, pois nesta fase, já é possível atingir a praga com este método de controle devido o imaturo deixar de ter hábito minador, passando a se alimentar externamente às folhas. Isso pode resultar em uma menor capacidade de penetração, ou seja, ter que aplicar um número maior de JI para que se controle a praga com maior eficácia dados um valor médio maior para as larvas que testamos. Entretanto, quando Salem et al. (2007) testaram em lagartas de 2º instar encontraram valores semelhantes aos dados obtidos nesta pesquisa. As diferenças entre as populações não ficaram tão evidentes nos ensaios de virulência, muito provável devido à proximidade entre elas, apesar da significante diferença de constituição genômica entre todas as populações e mitocondrial entre PA e PC. Isto pode implicar que a ação dos entomopatógenos está pouco ou nada ligado aos sítios que estão em segregação, ou seja, pode ser que os sítios de ação dos entomopatógenos testados não sofreram alteração com a diversificação do código genético da espécie de inseto estudada (ENKERLI & WIDMER, 2010). Ainda pode ser que as toxinas produzidas pelos isolados de B. bassiana como beauvericina, bassianinae e oosporeína, (ARBOLEDA VALENCIA, 2011), podem ser produzidas em quantidades similares (SANTINI, et al. 2009), uma vez 47 que os intervalos de confiança oscilaram entre as populações de um mesmo isolado, entretanto foram iguais pelo fato da sobreposição dos intervalos de confiança. Isso talvez seja explicado pela possibilidade dos isolados serem geneticamente próximos ou iguais. O mesmo pode ser considerado para as toxinas das bactérias que os NEPs testados possuem (KAYA & GAUGLER, 1993; SHARMA, et al., 2011) A capacidade dos entomopatógenos produzirem suas toxinas influencia diretamente na virulência dos mesmos, o que pode gerar diferença na ação, como na quantidade de inoculo para o controle, e ainda, no tempo de ação (STÜMER et al., 2003), como observado com S. brazilense em PJ, que diferenciou nas demais populações. Caso as proteínas sejam diferentes ou ainda produzidas em quantidades diferentes, elas possuam grande similaridade de sítios, ou ainda sejam sítios polimórficos que permitam a ligação de diversas toxinas. Na mesma linha de raciocínio a variação encontrada na estimativa de virulência com S. brazilense sobre PJ, leva a acreditar que existam mais sítios para as toxinas produzidas pela bactéria deste NEP. Para sanar tais dúvidas, podem ser realizados trabalhos explorando análises moleculares sobre a presença/ausência de toxinas e de sítios para as mesmas no hospedeiro, inclusive sobre populações da mesma praga, o que sanaria a teoria de que estes locos não estão segregando, e de forma geral trazer maior elucidação a este comportamento de populações expostas a mesmos entomopatógenos e/ou agrotóxicos, tendo reações distintas ou não. Contudo, o estudo da virulência destes agentes de controle microbiano vem mostrar o potencial infectivo dos mesmos, para próximos estudos, podendo talvez substituir produtos químicos, uma vez que as CL50 mostram valores quantitativos relevantes, e, possíveis de serem produzidos em uma concentração maior para alcançar taxas superiores a 90% de controle. 48 4.4. Produção de conídios de Beauveria bassiana e de juvenis infectivos de NEPs A produção de conídios de B. bassiana em lagartas de P. xylostella (Tabela 23) variou de 10685,8 a 13434,11conídios/lagarta, ocorrendo diferença apenas entre as populações PA e PC no tratamento com o isolado JAB07. Esta diferença pode ser devida as lagartas da população PA ser mais ricas em carboidratos e/ou proteínas, talvez devido uma predisposição genética, permitindo um melhor meio para o desenvolvimento na conidiogênese, e ainda este isolado ser mais sensível à concentração de nutrientes do meio. Alexandre et al. (2006) verificaram que a produção de conídios de B. bassiana em Alphitobius diaperinus (Panzer, 1727) (Coleoptera: Tenebrionidae) foi influenciada pela temperatura e por agentes saprófitos, em temperaturas constantes não houve variação significativa na produção da estrutura reprodutiva do fungo, explicando a homogeneidade de resultados, já que a temperatura deste trabalho foi constante. Sosá-Gómez & Alves (2000) relatam que a umidade também interfere diretamente na conidiogênese, e que níveis entre 90 a 100% de umidade são os mais eficientes para a produção de conídios de B. bassiana. A quantidade de conídios produzida por cadáveres da traça-das-crucíferas é um dado inédito, mas, é bem menor do que o produzido, por exemplo, por Nomureae rileyi em A. gemmatalis, que é de aproximadamente 7,05x108 conídios/mg de lagarta (SUJII et al., 2002). No entanto, além de ser outra espécie de fungo e de hospedeiro utilizado, a diferença de tamanho entre uma praga e outra é grande, o que nos mostra que os resultados obtidos estão dentro do esperado. A produção de juvenis infectivos em lagartas de P. xylostella (Tabela 24) é um dado que nunca foi aferido. Mas, em comparação ao hospedeiro alternativo G. 49 mellonella que produz cerca de 8.000 a 30.000 JI/lagarta (ACEVEDO et al., 2005), é muito inferior. Por outro lado, a traça-das-crucíferas é um inseto bem menor e com orifícios reduzidos para a entrada do agente de controle (GALLO et al., 2002), e por isso houve um número reduzido de JI nesta relação. Tabela 23. Produção média de conídios de Beauveria bassiana em lagartas de Plutella xylostella. Fungo/População PX PA PC PJ F C.V.(%) AM09 12909,76 ± 514 12132,86 ± 508 12555,33 ± 713 11673,03 ± 400 0,58ns 14,01 IBCB01 12547,14 ± 707 11400,26 ± 808 12641,71 ± 512 11753,02 ± 667 0,67ns 15,01 IBCB07 12398,99 ± 723 11621,85 ± 624 12232,53 ± 521 12219,34 ± 581 0,25ns 13,82 IBCB17 11563,29 ± 662 11872,01 ± 533 11997,7 ± 651 12244,39 ± 455 0,20ns 13,18 IBCB18 12288,25 ± 322 12497,82 ± 462 12374,69 ± 891 12798,1 ± 942 0,10ns 14,10 IBCB33 11787,55 ± 572 11080,46 ± 365 11642,22 ± 498 12163,63 ± 895 0,47ns 13,80 IBCB35 11516,75 ± 545 11466,03 ± 668 12559,83 ± 540 11031,04 ± 590 1,07ns 13,22 IBCB63 12740,30 ± 428 11325,86 ± 817 11559,72 ± 737 12205,32 ± 674 0,83ns 14,38 IBCB66 11918,30 ± 545 11945,48 ± 670 11950,57 ± 681 12624,85 ± 697 0,32ns 13,98 IBCB87 12859,80 ± 640 11891,53 ± 832 11790,84 ± 759 12123,23 ± 978 0,32ns 17,16 JAB01 11039,04 ± 530 12854,52 ± 772 11956,53 ± 740 11331,89 ± 732 1,20ns 15,21 JAB06 12608,68 ± 495 12075,55 ± 729 12343,37 ± 778 11471,89 ± 717 0,46ns 14,50 JAB07 13347,51 ± 262 ab 13434,11 ± 454 a 11268,5 ± 636 b 11790,51 ± 627 ab 4,29* 10,40 JAB43 12919,07 ± 593 13254,43 ± 370 12542,06 ± 682 12326,18 ± 534 0,43ns 11,72 JAB44 11497,50 ± 565 11298,01 ± 699 11296,7 ± 857 12879,04 ± 678 1,05ns 15,52 JAB48 12668,43 ± 443 12725,80 ± 581 11446,19 ± 788 12344,97 ± 717 0,76ns 13,36 LCMAP01 11186,84 ± 608 11838,84 ± 768 10685,80 ± 539 12041,34 ± 623 0,82ns 14,70 LCMAP02 12569,18 ± 657 11273,3 ± 709 10278,53 ± 313 12052,66 ± 103 1,67ns 16,36 LCMAP03 10862,43 ± 469 11557,36 ± 744 11892,9 ± 650 11081,75 ± 874 0,41ns 15,66 LCMAP05 12062,45 ± 543 11176,38 ± 745 11990,34 ± 619 12884,88 ± 633 1,06ns 13,78 F 0,96ns 1,08ns 0,86ns 0,57ns - - C.V.(%) 14,41 13,66 14,09 14,73 - - Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem ao nível de 5 ou 1 % de significância de acordo com o teste de Tukey. PX - população de Recife, PE; PA – população 1 de Alegre, ES; PC – população 2 de Alegre; PJ – população de Jaboticabal. * Significativo ao nível de 5% de probabilidade; ** significativo ao nível de 1% de probabilidade; ns não significativo. 50 Em H. amazonensis e H. indica foram produzidos em maior quantidade, isso ocorre por serem menores em relação aos nematoides do gênero Steinernema (GIOMETTI et al., 2011). E, devido a isso, ter maior potencial biológico, pois ocupam menos espaço e utilizam menor quantidade de substrato para se desenvolverem em iguais condições. A produção de juvenis não foi influenciada pela população da praga. Tabela 24. Produção média de juvenis infectivos dos nematoides em lagartas das populações brasileiras de P. xylostella (média ± erro padrão). NEP/População PX PA PC PJ F C.V.(%) H. amazonensis 322,20 ± 9,39 A 324,50 ± 11,07 A 321,10 ± 8,48 A 326,80 ± 10,87 A 0,11ns 7,57 H.indica 324,40 ± 11,05 A 321,10 ± 10,56 A 327,10 ± 8,27 A 316,80 ± 15,14 A 0,25ns 8,76 S. brazilense 237,90 ± 10,12 B 237,20 ± 14,04 B 235,90 ± 11,59 B 236,80 ± 13,17 B 0,01ns 12,74 S. feltiae 243,50 ± 12,86 B 241,60 ± 14,08 B 243,00 ± 11,44 B 237,60 ± 10,08 B 0,08ns 12,16 F 31,79** 24,61** 41,76** 25,73** - - C.V. (%) 9,5 10,93 8,51 10,93 - - Médias seguidas pela mesma letra maiúscula na coluna e minúscula na linha não diferem ao nível de 5 ou 1 % de significância de acordo com o teste de Tukey. PX - população de Recife, PE; PA – população 1 de Alegre, ES; PC – população 2 de Alegre; PJ – população de Jaboticabal. * Significativo ao nível de 5% de probabilidade; ** significativo ao nível de 1% de probabilidade; ns não significativo. 4.5. Consumo foliar Os discos foliares de couve manteiga foram trocados a cada dia assim que perdiam a turgescência ou quando eram consumidos por inteiro. O consumo foliar de couve manteiga por lagartas de P. xylostella (Tabela 25) apresentou-se bem diversificado de acordo com o isolado utilizado, e quando as lagartas não foram expostas (testemunha) observou-se diferenças populacionais. De forma geral o consumo foliar obedeceu a proporção da mortalidade de lagartas, onde houve maior taxa de mortalidade ocasionada por isolados, houve 51 proporcional redução da área foliar consumida nos tratamentos. No entanto é notável destacar que o isolado JAB07 foi o responsável pelo menor consumo ocasionado nas folhas de couve, e no outro viés podemos afirmar que os isolados menos patogênicos foram responsáveis pela menor redução. Já o consumo foliar de couve manteiga para as lagartas expostas aos NEPs (Tabela 26) foi fortemente influenciada, tanto pelas populações, quanto pelas espécies de nematoide, esses dados também são incipientes, porém, de acordo com este estudo, houve menor consumo onde aplicou-se H. amazonesis seguido de H. indica, S. brazilense e S. feltiae e testemunha. Ainda pode-se afirmar que o consumo foliar evidencia diferenças nas populações, devido as diferenças nas médias de consumo entre as populações sendo que PJ foi a mais afetada além de necessitar de menor quantidade de substrato para seu desenvolvimento. O consumo foliar das lagartas expostas às bactérias simbiontes (Tabela 27) foi o menos afetado. Efeito esse decorrente da menor eficiência de controle. Entretanto, ao contrário dos isolados de B. bassiana, as bactérias geraram informações sobre a divergência de área foliar consumida por populações diferentes expostas a um mesmo isolado. Além disso, estes tratamentos também ocasionaram redução em relação ao tratamento controle. Jesus et al. (2011), verificaram que a traça-das-crucíferas se alimenta menos quando se alimenta em plantas tratadas com inseticidas, o mesmo pode ser observado nos métodos biológicos testados, os quais também são eficientes. Carvalho (2008) verificou que a redução do consumo foliar também é consequência de ação deterrente dos produtos aplicados, além da mortalidade ocasionada pelos mesmos. Isto pode ser observado com os insetos que sobreviveram aos tratamentos, uma vez que esses possibilitaram redução do peso de lagartas (Tabelas 28 a 30). 52 Tabela 25. Consumo foliar médio de Brassica oleracea var. acephala cv. Manteiga em cm² por populações de P. xylostella quando expostas à Beauveria bassiana (média ± erro padrão). Fungo/População PX PA PC PJ F C.V.(%) AM09 1,54 ± 0,21 FGH 1,66 ± 0,23 GHI 1,42 ± 0,24 G 1,45 ± 0,27 G 0,21ns 3,41 IBCB01 3,77 ± 0,40 E 3,57 ± 0,32 F 3,44 ± 0,21 F 3,94 ± 0,20 F 0,57ns 19,43 IBCB07 7,87 ± 0,19 D 8,10 ± 0,25 D 7,84 ± 0,20 D 7,86 ± 0,29 D 0,25ns 7,54 IBCB17 3,71 ± 0,26 E 3,34 ± 0,21 FG 3,56 ± 0,29 F 3,68 ± 0,27 F 0,41ns 17,83 IBCB18 1,39 ± 0,18 GH 1,45 ± 0,22 HI 1,40 ± 0,26 G 1,49 ± 0,19 G 0,04ns 37,06 IBCB33 3,81 ± 0,38 E 3,59 ± 0,12 F 3,65 ± 0,34 F 3,88 ± 0,30 F 0,19ns 19,87 IBCB35 4,19 ± 0,28 E 3,52 ± 0,26 FG 3,61 ± 0,40 F