UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JULIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA GLOBAL DA BACTÉRIA Xylella fastidiosa EM LARANJA DOCE POR MICROARRANJOS DE DNA María Teresa Federici Rodriguez Orientadora: Prof. Dra. Eliana G. de Macedo Lemos Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Microbiologia Agropecuária (Área de Concentracão em Microbiologia). JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Fevereiro de 2011 DADOS CURRICULARES DA AUTORA MARIA TERESA FEDERICI RODRIGUEZ- de nacionalidade uruguaia, graduou-se em Biologia pela Universidade da República- Montevideo- Uruguai, e foi mestre em Biotecnologia de Plantas pela Universidade Internacional de Andalucía (UNIA), “Sede Iberoamericana Santa María de la Rábida”, Huelva, España, sendo o trabalho experimental realizado no “National Institute of Agro- Biological Resources” (NIAR), Tsukuba, Japão. Trabalha no “Instituto Nacional de Investigación Agropecuaria” (INIA) desde fevereiro do ano 2001 (cargo atual: pesquisador adjunto da Unidade de Biotecnologia na Estação Experimental INIA Las Brujas) “Todos somos muito ignorantes. O que acontece é que nem todos ignoramos as mesmas coisas.” Albert Einstein AGRADECIMENTOS Agradeço em primeiro lugar, à Profa. Dra. Eliana G. de Macedo Lemos, por me receber no seu laboratório e pela grande oportunidade e credibilidade na realização deste projeto. Agradeço ao meu coorientador Dr. Jackson Marcondes, pelo apoio técnico e pela boa disposição de sempre, e por me estender sua mão no momento em que mais precisei. Também quero agradecer à Dra. Simone C. Picchi, que me ajudou nos trâmites no começo do doutorado, que me deu a orientação inicial no laboratório, assim como seu apoio e amizade. Meu grande agradecimento ao Rodrigo Pereira, o “poeta”, pela sua orientação no processo seletivo para o Doutorado em Microbiologia Agropecuária e sua grande ajuda com a documentação necessária. Agradeço ao Dr. João Carlos Campanharo, pela sua paciência e entusiasmo de sempre, por sua constante boa disposição e por todos os conselhos sobre Xyella fastidiosa. A Profa. Dra. Lúcia Alves, pelos conselhos sobre a técnica de microarranjos e dicas importantes nas distintas fases do experimento. Assim, também meus especiais agradecimentos aos bioinformatas Drs. Luciano Kishi e Mauricio Cantão, por sua pronta disposição, mesmo já fora do laboratório, sempre que precisei de ajuda com o processamento dos meus dados de microarranjos. Meus agradecimentos ao André Fadel, meu parceiro da Xylella, que trouxe alegria e camaradagem para o trabalho em equipe, e por conseguirmos juntos, em dias de intenso trabalho de campo e laboratório, avançar a grandes passos em nossos respectivos trabalhos. Ao Dr. Eduardo Stuchi, que me recebeu amavelmente no Centro de Citricultura de Bebedouro, e permitiu-me obter as amostras, que foram peças fundamentais do meu trabalho. Especialmente agradeço ao Dr. Marcelo Laia (Universidade Federal dos Vales do Jequitinhonha e Mucuri, Faculdade de Ciências Agrárias, Diamantina, MG), pelas análises estatísticas com o programa R, por sua inigualável ajuda; pois sem ter vínculo formal me assistiu com seus conhecimentos, seu profissionalismo e sua experiência em análises estatísticas de dados de microarranjos. Agradeço também à Dra. Larissa Scattolin, e aos colegas Karla Stropa, Wellington Moreira, Ana Rita Raimundo e à Erica Mendes Lopes, pela ajuda no laboratório durante a etapa do desenvolvimento do chip, e a todos os estudantes do LBMP, pela boa energia, companheirismo e por compartilhar as alegrias e dificuldades do nosso trabalho e da própria vida, durante o transcurso dos meus estudos de doutorado. Assim, também agradeço a minha “antecessora” do chip, a Dra. Regiane Travensolo por seus valiosos conselhos e dicas para a fabricação do chip. Ao Dr. Marcos A. Machado, Coordenador da Unidade de Biotecnologia do APTA Citros Sylvio Moreira, e aos pesquisadores Helvécio e Alessandra de Souza, também pela permissão para coletar as amostras do projeto e sugestões, bem como ao Dr. Leonardo Boava, pelas dicas sobre RT-qPCR e endógenos. Agradeço especialmente ao Instituto Nacional de Pesquisa Agropecuária do Uruguai (INIA), pelo apoio nos meus estudos de doutorado, à Direção do Programa Nacional de Citricultura (INIA Salto Grande) e da Unidade de Biotecnologia (INIA Las Brujas) considerando as autoridades do momento: Ing. Agr. Msc. Carmen Goñi; Ing. Agr. Dan Piestun, PhD e Ing. Agr. Fabián Capedevielle, PhD e as atuais: Ing. Agr. Marco Dalla-Rizza, PhD e Ing. Agr. Fernando Rivas, PhD. Também agradeço à Ing. Agr. MSc. Elena Perez pelos contatos no Brasil e pela continuação dos projetos em INIA, assim como à Lic. Natalia Rigamonti e a todos os amigos e colegas que me deram forças para sair na capacitação. Agradeço “in memoriam” ao meu primeiro chefe, o Ing. Agr. Mario Caro, que me introduziu na vida acadêmica na área da agronomia, especificamente na biotecnologia dos citros; à Dra. Marta Francis, que também nos inícios da minha carreira foi-me conduzindo no caminho da ciência aplicada à agronomia. Agradeço a todos que, no transcurso da minha vida profissional, apresentaram-me exemplos de vida e dedicação; de vocação genuína, de gosto pela ciência e pelo serviço à comunidade que tive a oportunidade de conhecer e que foram ajudando a orientar minha vocação: Dr. W. Gaertner, Dr. D. Vaughan, Dr. Jordi Garcia Mas e Dr. Victoriano Valpuesta, entre outros. Sobre todas as coisas, agradeço à minha família por não condicionar a minha vida, e em especial à minha mãe Elbita, pelo apoio incondicional, sem o qual não teria sido possível esta conquista. Também agradeço ao meu pai José Luis, irmã Laura, os tios Carlos María, Lula e Pocha e aos que já não estão; aos que fazem, e aos que fizeram e parte do meu caminho. E ao Guillermo, agradeço sua presença na minha vida e sua grande paciência com tantas viagens e tantas idas e voltas. Assim também agradeço aos meus amigos de Uruguai que estiveram sempre presentes e às novas e verdadeiras amizades do Brasil que me ajudaram em milhares de coisas (sejam materiais ou humanas) de que se precisam quando se muda a vida toda de um País a outro por tanto tempo, em especial a Teté, Rosinha, Denise e Viviane. Também agradeço à Agência PDT (“Programa de Desarrollo Tecnologico”, Uruguay) e à CAPES (“Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior”) pelo co-financiamento do meu trabalho. i SUMÁRIO ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA GLOBAL DE Xylella fastidosa em LARANJA DOCE POR MICROARRANJOS DE DNA I. INTRODUÇÃO..............................................................................................1 II. REVISÃO DA LITERATURA………………………………………………........2 1. Clorose variegada dos citros (CVC)...............................................................2 2. X. fastidiosa: o agente causal..........................................................................5 3. Resistência, tolerância e suscetibilidade de citros à CVC...................................8 4. Interação Patógeno- Hospedeiro...................................................................11 5. Modelo de colonização na planta e para transmissão ao inseto...................14 6. A análise da expressão gênica através de microarranjos.............................16 7. A técnica de PCR em tempo real (RT-qPCR) e sua utilisação na validação de dados de microarranjos................................................................................20 III. OBJETIVO.................................................................................................. 24 IV. HIPÓTESE.................................................................................................. 26 V. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................26 1. Desenho experimental................................................................................ 26 2. Isolado bacteriano e material vegetal..........................................................27 3. Coleta das amostras................................................................................... 28 4. Extrações de RNA........................................................................................29 5. Quantificação do RNA..................................................................................29 6. Obtenção do cDNA marcado com compostos fluorescentes Cy3/ Cy5.......30 6.1 Reação de transcrição inversa..............................................................30 6.2 Degradação do RNA e concentração do cDNA....................................31 7. Fabricação do microarranjo contendo o genoma total da X. fastidiosa.......31 ii 7.1 Cultivo do isolado 9a5c e extração do DNA .........................................32 7.2 Amplificações por PCR das 2600 ORF e quantificação do produto......33 7.3 Concentração e impressão dos produtos de PCR na lâmina................33 8. Hibridação dos microarranjos com os cDNAs marcados e lavagens...........34 9. Obtenção e análise das imagens.................................................................35 9.1 Digitalização da imagem........................................................................35 9.2 Quantificação e análise das imagens....................................................35 9.3 Análises estatísticas..............................................................................36 9.4 Busca dos genes candidatos na base de dados do Projeto Genoma da X. fastidiosa 9a5c..................................................................................36 10. Validação da técnica por RT-qPCR............................................................37 10.1 Fabricação do DNA complementar e quantificação relativa..............37 10.2 Genes escolhidos e desenho dos “primers”......................................37 10.3 Otimização das condições de reação...............................................39 10.4 Validação da eficiência de amplificação e especificidade dos primers..................................................................................................39 10.5 Quantificação relativa. Método delta delta Ct (∆∆Ct)………….........40 VI. RESULTADOS...........................................................................................41 1. Análises Estatísticas...................................................................................41 2. Busca de informação dos genes potenciais candidatos à patogenicidade............................................................................................43 3. Perfil Global da expressão gênica...............................................................43 4. Genes da categoria VII: “Patogenicidade, virulência e adaptação”.............46 5. Genes das categorias IV, V e VI: “Estrutura celular”, “Processos celulares” e “Elementos genéticos móveis”....................................................................48 6. Genes da categoria I “Metabolismo intermediário” e II “Biossíntese de pequenas moléculas....................................................................................50 7. Genes da categoria III “Metabolismo de macromoléculas...........................52 iii 8. Validação da técnica de microarranjos através de RTqPCR.................56 8.1 Validações da eficiência de amplificação e curvas de disociação.........56 8.2 Quantificação relativa e validação do experimento de microarranjos...60 VII. DISCUSSÃO..........................................................................................63 1. Fatores que influenciam a agregação celular..............................................64 1.1 Constituição do biofilme e regulação da patogenicidade.......................64 1.2 Adesinas (não do tipo fimbria)...............................................................71 2. Movimento através dos vasos xilemáticos...................................................73 2.1 Adesinas tipo fímbrias e movimento “twitching motility” (sistema quimiotático)...........................................................................................73 2.2 Degradação da parede celular e enzimas degradadoras......................77 3. Genes envolvidos na sobrevivência da bactéria..........................................78 3.1 Sistemas transportadores .....................................................................78 3.2 Toxinas, detoxificação e resposta antioxidante....................................80 3.3 Homeostase do ferro e outros metais....................................................83 3.4 Resposta “heat shock”...........................................................................85 3.5 Adaptação, condições atípicas..............................................................87 3.6 Sistemas de reparação, restricção e modificação do DNA ...................89 4. Genes relacionados com elementos genéticos móveis: fagos, profagos e plasmídeos....................................................................................................91 5. Genes de proteínas hipotéticas...................................................................92 6. Controles negativos e validação do experimento através de RT-qPCR.......95 VIII. CONCLUSÕES.................................................................................97 IX. IMPLICAÇÕES.................................................................................99 X. REFERÈNCIAS...............................................................................102 XI. APÊNDICE.....................................................................................131 iv ANÁLISE DA EXPRESSÃO GÊNICA GLOBAL DE Xylella fastidosa EM LARANJA DOCE POR MICROARRANJOS DE DNA RESUMO- Foi construído um microarranjo com as 2600 ORFs identificadas no projeto de sequenciamento da bactéria Xylella fastidiosa estirpe 9a5c, e utilizado para analisar diferenças na expressão gênica global da bactéria dentro de uma laranja doce suscetível (Pera) e uma tolerante (cultivar Navelina ISA 315). Foram achados mais genes diferencialmente expressos envolvidos na degradação, reguladores, componentes de membrana, adesinas tipo fímbrias, transportadores, elementos genéticos móveis e genes de patogenicidade na variedade sintomática. Assim, na cultivar Navelina ISA 315, foram diferencialmente expressos mais genes relacionados com a resposta ao estresse, seja detoxificação de espécies reativas do oxigênio ou proteínas chaperonas, assim como uma adesina do tipo hemaglutinina. Isso sugere diferenças na agregação celular e composição do biofilme assim como um maior estresse da bactéria na cultivar tolerante, provocado pelas próprias defesas da planta ou por microrganismos endofíticos que estão competindo com a X. fastidiosa. A técnica de microarranjos foi validada pela RT-qPCR, e apresentou-se como uma ferramenta poderosa na análise das mudanças na expressão gênica da bactéria X. fastidiosa em plantas de laranja doce in vivo, apresentando uma visão mais real da natureza do que os sistemas in vitro, que não a conseguem imitar completamente. Foram levantadas neste trabalho algumas hipóteses sobre os mecanismos de patogenicidade mas no entanto, mais pesquisas ainda são necessárias para lograr melhor compreensão dos mecanismos de patogenicidade e das interações patógeno-hospedeiro. Palabras chave: Xylella fastidiosa, microarranjo, Navelina ISA 315, expressão gênica, citrus v ANALYSIS OF GLOBAL GENE EXPRESSION OF Xylella fastidiosa IN SWEET ORANGE USING DNA MICROARRAY SUMMARY- A DNA microarray was constructed containing 2600 ORFs identified by the Genome sequencing project of Xylella fastidiosa 9a5c strain, and used to check global gene expression differences in the bacteria within a susceptible and a tolerant sweet orange plant, the variety Pera and the cultivar Navelina ISA 315, respectively. More genes related to degradation, regulation, membrane components, fimbrial adhesins, transport, genetic mobile elements and patogenicity genes were differentially expressed in Pera variety. On the other hand, in the cultivar Navelina ISA 315, more genes related to stress response, detoxification of oxygen reactive species or other substances, “heat shock” proteins, as well as an adhesin of the hemagglutinin type, suggesting differences in cellular aggregation and biofilm composition, as well as a higher estress of the bacteria in tolerant cultivar, produced either by plant defenses or by endophitic microorganisms which are competing with X. fastidiosa. This “handmade” DNA microchip was validated by RT-qPCR, and has revealed as a powerful technique for the analysis of global changes in gene expression of X. fastidiosa in sweet orange plants in vivo, generating a more real image of what is happening in nature than in vitro systems which would never reproduce nature conditions exactly. Some hypotheses were raised in this study about patogenicity mechanisms, therefore, more research is still necessary to achieve a better understanding of pathogenicity mechanisms and host-pathogen interactions. Keywords: Xylella fastidiosa, microarray, Navelina ISA 315, gene expression, citrus 1 I. INTRODUÇÃO O conhecimento da sequência completa do genoma da bactéria X. fastidiosa (SIMPSON et al., 2000) representou um grande passo para a compreensão de suas vias metabólicas, replicativas e para o entendimento de possíveis mecanismos de patogenicidade. Trabalhos publicados têm explorado as informações geradas pelo sequenciamento, destacando uma série de hipóteses para o funcionamento do metabolismo energético, transporte de nutrientes, adesão, agregação, toxicidade, secreção de fatores de patogenicidade, homeostase de ferro, resposta a antioxidantes e outros mecanismos importantes para a patogenicidade (SIMPSON et al., 2000; MEIDANIS et al., 2002; Da SILVA, 2004; KOIDE et al., 2004). Assim, desde que o genoma de Xylella fastidosa foi sequenciado, muito se tem avançado no entendimento dos processos pelos quais a bactéria se dissemina pelos vasos xilemáticos das plantas suscetíveis, assim como sobre os fatores que contribuem para sua aquisição e transmissão pelas cigarrinhas. Muitos dos focos das pesquisas têm sido na busca de informações a respeito da interação entre a bactéria e seus hospedeiros. De acordo com HAMMOND-KOSACK e JONES (2000), há três razões importantes para estudar a interação planta-patógeno: 1) o estudo detalhado dessa interação disponibilizará soluções para o controle da doença de plantas em culturas economicamente importantes; 2) cada estudo deve elucidar os mecanismos de sinalização pelos quais as células das plantas convivem com a situação de estresse; 3) o conhecimento dos mecanismos de interação levará à descoberta de como organismos de diferentes reinos se comunicam no mesmo ambiente com o hospedeiro. O sequenciamento completo do genoma dessa bactéria gerou importantes informações, que devem contribuir para o entendimento das relações dos isolados da bactéria X. fastidiosa com seus hospedeiros e, em consequência, no desenvolvimento de estratégias de controle da doença. 2 Com base na disponibilidade de informações sobre genes em banco de dados, novas estratégias para estudos dos mesmos tornaram-se necessárias, como a técnica de microarranjos, que permite detectar a expressão global e analisar genes envolvidos na interação patógeno/hospedeiro. Desse modo, o objetivo deste projeto foi analisar, por meio dessa técnica, quais os genes diferencialmente expressos em plantas de laranja doce (Citrus sinensis L. Osb.) infectadas por X. fastidiosa. Para tanto, foram utilizadas as variedades laranja Pera (suscetível à CVC) e Navelina ISA 315. II. REVISÃO DA LITERATURA 1. Clorose variegada dos citros (CVC) A Clorose Variegada dos Citros (CVC), causada pela bactéria X. fastidiosa, representa uma das principais doenças dos citros, principalmente em função de seu difícil controle, sendo uma das doenças de maior importância na citricultura brasileira. Esta doença foi observada pela primeira vez em 1987 no triangulo mineiro, Estado de Minas Gerais, e nas regiões Norte e Noroeste do Estado de São Paulo, onde um levantamento na época mostrou que cerca de quarenta e sete cidades do Estado tinham a ocorrência da CVC (ROSSETI; DE NEGRI, 1990). CHANG et al. (1993) relataram a conclusão dos postulados de Koch, confirmando a bactéria X. fastidiosa como agente causal da doença, o que mais tarde foi confirmado por LEE et al. (1993). Sua presença foi confirmada posteriormente nos Estados de Rio Grande do Sul, Paraná, Distrito Federal, Goiás, Rio de Janeiro (TUBELIS; BARROS; CAMPOS LEITE, 1993), Sergipe (LARANJEIRA et al.,1996) e Bahia (SANTOS FILHO et al., 1999). No ano de 2005, cerca de 43% das laranjeiras doces se encontravam 3 afetadas pela CVC em todas as regiões citrícolas do Brasil, ocasionando um perjuízo de mais de 120 milhões de dólares anuais (BOVÉ; AYRES, 2007). Plantas afetadas pela CVC apresentam inicialmente, na parte mediana e superior da copa, folhas com clorose na face ventral e pequenas bolhas gomosas cor de palha na face dorsal, usualmente acompanhada de sintomas de deficiências nutricionais. Em estadío mais avançado da doença, os frutos têm tamanho reduzido, são endurecidos, persistentes, com amarelecimento precoce e lesões pardas na casca que podem atingir até metade das áreas superficiais (Figura 1 A - D). Frutos com sintomas típicos de CVC são impróprios para o consumo ou processamento (VITTI et al., 1989; ROSSETTI et al., 1990; DE NEGRI, 1990; MENEGUCCI et al., 1995). Pode-se observar o tamanho dos frutos afetados em comparação com frutos sadios na figura 1 A. Figura 1: Sintomas do CVC: A) em fruto; B) em folha no primeiro estádio; C- D) na planta e na folha durante o estádio mais avançado. Fundepec Fundo de Desenvolvimento Agropecuário do Estado do Pará (www.fundepecpr.org.br). Além da CVC, X. fastidiosa causa doenças em outras culturas de importância econômica, como videira, ameixeira, pessegueiro, pereira (CARLOS; RODRIGUES NETO; BERETTA, 1997) e também em cafeeiro (PARADELLA FILHO et al., 1995). 4 Outras culturas hospedeiras da X. fastidiosa são também a amendoeira, Prunus amygdalus Batsch (MIRCETITCH et al., 1976), carvalho, Quercus rubra L. (HEARON et al., 1986, citado por HOPKINS, 1989), amoreira, L. (KOSTKA et al., 1986), vinca, Catharantus roseus L. G. Don (SHERALD et al., 1983, citado por HOPKINS, 1989). A doença de Pierce em videiras (Vitis vinifera L.) foi encontrada em toda a Região Sul dos Estados Unidos, que cultiva uva comercialmente, da Flórida à Califórnia, e países como Costa Rica e México. O sintoma mais característico da doença causado pela bactéria X. fastidiosa em videira, foi relatado como a escaldadura das folhas e a morte repentina de parte das folhas verdes. As áreas afetadas tornam-se necróticas e os tecidos adjacentes, amarelos ou vermelhos, e geralmente começam nas margens das folhas e progridem para o interior (RAJU; WELLS, 1986). Em ameixeira, X. fastidiosa causa a doença conhecida como “Escaldadura da Folha” (EFA). A EFA foi inicialmente descrita na Argentina, em 1935 (FERNANDEZ-VALIELA; BAKARCIC, 1954). Posteriormente, a doença foi também constatada no Brasil, Paraguai e sudeste dos Estados Unidos (FRENCH; KITAJIMA et al., 1981; FRENCH; FELICIANO, 1982). Os sintomas associados à EFA caracterizam-se pela necrose marginal, queima de bordos, quebra prematura de folhas, seca de ramos, declínio no vigor e na produção e, finalmente, morte prematura da planta (MOHAN et al.,1980). X. fastidiosa e é transmitida por insetos das famílias Cicadellidae (subfamília Cicadellinae) e Cercopidae. Estes, chamados comumente de cigarrinhas, se alimentam sugando a seiva do xilema das plantas infectadas e depois das sadias. Já foram identificadas onze espécies transmissoras (Dilobopterus costalimai, Acrogonia SP., Oncometopia facialis, Bucephalogonia xanthophis, Plesiommata corniculata, Macugonalia leucomelas, Sonesimia grossa, Ferrariana trivittata, Homalodisca ignorata, Acrogonia virescens e Parathona gratiosa), sendo que todas pertencem à família Cicadellidae (LOPES et al., 1996; ROBERTO et al., 1996; FUNDECITRUS, 1999; KRUGNER et al., 1998; YAMAMOTO et al., 2002). A rápida disseminação da 5 bactéria feita por insetos vetores deve-se ao fato destes se apresentarem em grandes populações e de o patógeno sobreviver no aparelho bucal do sugador. Além dos insetos, o homem também tem participado na disseminação do patógeno através do plantio de mudas doentes, originadas ainda nos viveiros, pela falta de proteção das mudas contra os vetores e/ou pelo uso de borbulhas contaminadas durante o processo de enxertia. Com a norma estadual em São Paulo, que estabelece que a produção de mudas deve ser feita somente em viveiros telados e não mais a céu aberto (FUNDECITRUS, 2003a), a importância do homem na disseminação do patógeno foi consideravelmente reduzida. Algumas das medidas de manejo propostas para o controle da CVC são: plantio de mudas sadias adquiridas de viveiros protegidos por telas antiafídicas (prevenção), poda de galhos ou ramos doentes com sintomas em plantas acima de dois anos, erradicação de árvores totalmente sintomáticas e controle de insetos vetores com inseticidas. 2. X. fastidiosa: o agente causal X. fastidiosa é uma bactéria Gram negativa, aeróbica, restrita ao xilema de plantas (LARANJEIRA et al., 2005) (Figura 2), Apresenta parede celular enrugada em forma de bastonete, podendo ser observada em espaços intercelulares do xilema, tendendo a se acumular em partes específicas, variando em função do hospedeiro e com o tipo de sintoma expresso (PURCELL; HOPKINS, 1996). É estritamente aeróbica e não fermentativa, não halofítica, apigmentada e apresenta ondulações na parede celular que podem estar envolvidas no reconhecimento do hospedeiro pelo patógeno (FRY; MILHOLLAND, 1990), (WELLS et al., 1987). SCHAAD et al. (2004) propôs a classificação da bactéria em três subespécies: piercei, multiplex e pauca, sendo X. fastidiosa subsp. pauca a responsável pela CVC. 6 Figura 2: Micrografías eletrónicas de um vaso do xilema contendo células de X. fastidiosa. A) Foto W. Kitajima. B) (JO Lima). C) Courtesia do Professor Jaime Maia. O genoma da X. fastidiosa compreende um cromossoma circular de 2.609.305 pares de bases (pb) (52,7% rico em bases GC) e dois plasmídeos de 51.158 pb e 1.285 pb, respectivamente. Foi possível atribuir funções putativas a 47% das 2.904 regiões codificantes inferidas (SIMPSON et al., 2000). Os genes ortólogos de algumas proteínas associados à patogenicidade e virulência foram somente identificados em patógenos animais e humanos. Pelo menos 83 genes são derivados de bacteriófagos, os quais incluem genes associados com a virulência de outras bactérias, o que proporciona evidência direta da transferência horizontal mediada por fagos (SIMPSON et al., 2000). A produção de energia na bactéria X. fastidiosa é aparentemente eficiente, sendo observada a presença de todos os genes envolvidos na via glicolítica, no ciclo do ácido tricarboxílico e na fosforilação oxidativa que ocorre nas cadeias de transporte de elétrons. A frutose, manose e glicerol podem ser utilizados em adição à glicose na via glicolítica e há uma completa via para hidrólise de celulose para glicose, consistindo em 1,4 glucanase e glucosidase, sugerindo que a celulose degradada pode suprir a baixa concentração de monossacarídeos existentes no xilema (SIMPSON et al., 2000). A expressão de genes relacionados com a via glicolítica, tais como 6-fosfofructoquinase, gliceraldeído 3-fosfate desidrogenase, triosefosfate isomerase e piruvato quinase tipo II, no experimento 7 de microarranjos realizado por Travensolo et al. (2008 e 2009), sugere que esta via está ativa e que a glicose é degradada em piruvato. No entanto Facincani et al. (2003) sugeriram que esta bactéria não utilisa a via glicolítica para produzir o piruvato a partir de glicose, valendo-se unicamente da via Entner-Doudoroff. Xyella e Xanthomonas são dois gêneros dentro da subdivisão das proteobactérias, Xanthomonadales, que pertencem à mesma família. O sequenciamento dos genomas destes patógenos e estudos comparativos entre eles deram a conhecer um alto grau de identidade e colinearidade no esqueleto cromossômico entre espécies e linhagens. As diferenças observadas estão usualmente agrupadas em ilhas genômicas, a maior parte das quais é delimitada por elementos genéticos móveis. Os genes essenciais para a reproducção e sobrevivência envolvidos em funções básicas, associadas com a geração de energia metabólica e com o fluxo de informação genética, são definidos como o genoma “estável”, o genoma “núcleo”, pelo qual é possível seguir a história evolutiva de um organismo (LIU et al.,1999). O genoma “núcleo” de Xylella e de Xanthomonas compartilha a mesma origem, embora essas espécies tenham evoluído e divergido pelas inserções e deleções potenciais (VITORELLO et al., 2005). Utilizando o algoritmo BlastP para análises comparativas, foi observado que as espécies de Xylella compartilham aproximadamente 74% dos genes com as espécies de Xanthomonas, enquanto Xanthomonas (com um genoma maior) compartilha quase 40% (MOREIRA et al., 2004). Dentro da espécie X. fastidiosa, alguns genomas completos já foram publicados:as estirpes 9a5c, o agente causal da Clorose Variegada dos Citros (SIMPSON et al., 2000) e X. fastidiosa Temécula, o agente causal da doença de Pierce da videira (VAN SLUYS et al., 2003). Posteriormente, outras duas estirpes foram parcialmente sequenciadas: Ann-1 (de oleandro) e Dixon (de amêndoa) (BHATTACHARYYA et al., 2002a,b). No gênero Xhantomonas, os genomas completos de duas espécies encontram-se publicamente disponíveis: Xanthomonas 8 axonopodis pv. citri (Xac) e Xanthomonas campestris pv. campestris (Xcc) (Da SILVA et al., 2002). Essas quatro estirpes de X.fastidiosa compartilham alguns sistemas característicos comumente usados para identificar membros da família e que foram relacionados com importantes funções na sobrevivência e adaptação. Por exemplo, o operon gum, o grupo extendido de xanthomonadinas e os genes rpf, mesmo identificados nos quatro genomas, apresentam importantes variações na ordem e conteúdo dos genes, e essas variações são provavelmente um dos fatores que diferenciam o fenótipo de cada linhagem. 3. Resistência, tolerância e suscetibilidade de citros à CVC A resistência de uma planta hospedeira é definida como a capacidade desta em atrasar ou impedir a entrada ou uma possível atividade do patógeno em seus tecidos. Embora na natureza as plantas estejam normalmente expostas a um grande número de microrganismos, a resistência mostra-se como regra, e a suscetibilidade, como exceção. A resistência envolve uma sequência de mecanismos dinâmicos e coordenados, que se iniciam após o contato do patógeno com o hospedeiro. O nível de resistência resulta do somatório das contribuições individuais destes diferentes mecanismos de resistência. Neste caso, as células vegetais constituem-se em barreiras naturais que impedem o ataque dos patógenos (PASCHOLATI; LEITE, 1995). Se o patógeno conseguir transpor a barreira física (a cutícula, os tricomas, os estômatos, as fibras dos vasos condutores, as papilas, camadas de cortiça e tiloses), ele poderá encontrar pela frente substâncias tóxicas já presentes no interior das células do hospedeiro ou substâncias produzidas por este em resposta à atividade agressora (fenóis, alcaloides, lactonas insaturadas, glicosídeos fenólicos e cianogênicos, inibidores proteicos e fitoalexinas.) Logo após a descrição desta doença em citros, acreditava-se que, como acontece com a maioria das culturas agrícolas, a resistência varietal pudesse ser explorada no controle da CVC. A grande decepção foi observar que as variedades 9 comerciais de laranja-doce eram todas suscetíveis ao patógeno (MACHADO et al., 1993). No entanto, as tangerinas e os limões não eram e continuam não sendo afetados pela CVC no campo (POMPEU et al., 1998; LARANJEIRA et al., 1998). Existem distintas hipóteses sobre essa aparente resistência ou tolerância. Uma hipótese seria que tangerinas e limões não são preferidos pelas cigarrinhas que colonizam as laranjas-doce (que são suscetíveis), não sendo, portanto, inoculadas pelos vetores. Outra hipótese seria que os mecanismos físicos ou químicos do sistema vascular dessas plantas não permitem a multiplicação da bactéria em seus tecidos. Mas observações indicam que tangerinas e limões são tão preferidos pelos insetos quanto às laranjas; por isso, a primeira hipótese foi descartada. A causa da resistência poderia estar na incapacidade do patógeno em colonizar o xilema das plantas. De LIMA GARCIA (2007) estudou em detalhes a aparente resistência dos limões e tangerinas, comparando-os com as laranjas-doce, por meio de inoculações artificiais da bactéria em condições de casa de vegetação e da análise morfológica das estruturas internas das plantas. As laranjas-doces Caipira, Natal e Valência; as tangerinas Sunki, Poncã, Cravo e Cleópatra assim como a lima da Pérsia, lima ácida Galego e o limão Cravo foram avaliados pela observação visual dos sintomas, isolamento do patógeno, serologia, microscopia ótica e PCR. Observou-se neste estudo uma grande quantidade de plantas de laranja assintomáticas com presencia de X. fastidiosa, sendo esta também detectada entre as limas, limões e tangerinas. Observou-se uma alta similaridade das estruturas internas dos vasos do xilema de pecíolos foliares entre os materiais resistentes e os suscetíveis à CVC e sugeriou-se, portanto, que a resistência das tangerinas, limas e limões não está associada, aparentemente, às barreiras físicas que impedem a multiplicação do patógeno no interior da planta, mas, sim, a uma possível presença de substâncias desconhecidas presentes na seiva do xilema ou na parede dos vasos. Das variedades suscetíveis, a laranja Pera foi a que 10 apresentou maior número de vasos xilemáticos aparentemente obstruídos, e modificações estruturais no tecido condutor foram observadas. A não ocorrência de CVC em limas e limões poderia estar relacionada com a presença de microrganismos endofíticos que, por intermédio de competição por espaço e nutrientes na planta hospedeira ou da produção de compostos antimicrobianos, poderia estar controlando a concentração do patógeno no interior da planta, por impedir sua multiplicação. Experimentos com intrações entre endofíticos e X.fastidiosa indicam que o crescimento desta foi estimulado in vitro por Methylobacterium extorquens e inibido por Curtobacterium flaccumaciens, evidenciando que realmetne ocorre uma interação entre endofíticos e o patógeno (LACAVA et al., 2004) A Navelina ISA 315 (Citrus sinensis L.Osbek.) teve origem na Itália, sendo resultante de um clone recuperado in vitro por cultivo de óvulos não desenvolvidos e foi introduzido no Brasil e estabelecido em campo no ano de 2000, para início de estudos relacionados à resistência a CVC. Segundo SOUZA et al. (2006), a Navelina ISA 315, Navelina SRA 332 e Newhall Navel SRA 343 apresentaram-se como hospedeiras assintomáticas de X. fastidiosa. STUCHI et al. (2007) relataram que apenas a Navelina ISA 315 permaneceu sem sintomas após sete anos no campo, mesmo em condições de alta pressão de inóculo ou após receber inoculações artificiais via subenxertia com plantas sintomáticas. FADEL (2011) reportou esta cultivar como tolerante após avaliações visuais e por meio da PCR em tempo real. Ainda há necessidade de estudos mais aprofundados em relação à interação patógeno-hospedeiro, para que este cultivar possa ser utilizado comercialmente e em programas de melhoramento vegetal. A laranja Pera e a cultivar Navelina ISA315 foram escolhidas para este estudo pela alta suscetibilidade e por não desenvolver sintomas, respectivamente. 11 4. Interação Patógeno- Hospedeiro As interações patógeno-hospedeiro podem ser classificadas em compatíveis (patógeno virulento e hospedeiro suscetível) e incompatíveis (patógeno avirulento e hospedeiro resistente). Nas interações incompatíveis, o sistema de defesa da planta é eficientemente ativado conduzindo à resistência, mas é tardiamente ativado ou não ativado em interações compatíveis condicionando a doença (RESENDE et al., 2003). O principal problema das interações de compatibilidade é o grande arsenal de patogenicidade que o patógeno dispõe para atacar seu hospedeiro, como a produção de toxinas, secreção de enzimas extracelulares e a liberação de fatores de virulência (WHITE et al., 2000), tornando a planta bastante suscetível a esse ataque. A proteção contra a maioria dos fitopatógenos em vegetais é conseguida por meio de barreiras pré-formadas, tais como cutículas espessas e presença de compostos antimicrobianos (HAMMOND-KOSACK, 2000). A defesa induzida segue um caminho básico de reconhecimento e transdução de sinais para ativar as respostas de defesas, tais como: geração de espécies ativas de oxigênio (DIXON, 1994; BOLWELL, 1995), morte programada de células no sítio de infecção (HR) (HAMMOND-KOSACK, 1996), deposição de glicoproteínas ricas em hidroxiprolinas (CORBIN, 1987), lignificação da parede das células (GRAND, 1987), síntese e acúmulo de fitoalexinas (GUSTINE, 1990) e síntese de proteínas PR antimicrobianas (DIXON, 1994). Os mecanismos de defesa de plantas suscetíveis respondem mais lentamente e em menor intensidade após a infecção. Assim, o tempo de reconhecimento a um microrganismo invadindo uma planta e a rápida resposta a essa invasão diferem entre as plantas resistentes e as suscetíveis (KELLER, 1999; YANG, 1997). O patógeno, por sua parte, tenta contrapor essas defesas, desenvolvendo novas estrategias em função da resposta do hospedeiro, induzindo 12 ou reprimindo genes que ajudam na sobrevivência da bactéria no xilema nas condições particulares de cada planta. Patogenicidade e virulência são termos que definem a capacidade de um microrganismo em causar doença em um hospedeiro suscetível, através de um conjunto de recursos que possibilitam sua sobrevivência e multiplicação no hospedeiro. A patogenicidade refere-se aos mecanismos de infecção e desenvolvimento da doença, e a virulência mede a intensidade da patogenicidade (Da SILVA, 2004). Fungos e bactérias patogênicos expressam grupos de genes envolvidos no estabelecimento da infecção, enquanto outros genes são expressos no hospedeiro como resposta. A regulação dos genes de patogenicidade envolve uma complexa troca de sinais entre o hospedeiro e o patógeno (DIXON; LAMB, 1990). O sucesso da infecção por microrganismos patogênicos requer ligação à superfície do hospedeiro, degradação das barreiras químicas e físicas do hospedeiro, produção de toxinas e inativação das defesas da planta (LAMB et al., 1989). Em relação aos mecanismos de colonização e patogenicidade da X. fastidiosa, estes são baseados principalmente em estudos com a doença mal de Pierce em videiras (HOPKINS, 1989). Segundo o mecanismo proposto para essa bactéria, agregados de bactérias (biofilmes), gomas e tiloses presentes no xilema obstruirão a passagem de água, entretanto não se sabe como ocorre a obstrução suficiente para gerar estresse hídrico. A bactéria agrega-se nos vasos xilemáticos através de goma polissacarídica e outras estruturas, como as fímbrias (HOPKINS, 1989). Essas gomas podem funcionar como uma resina trocadora de cátions, ligando nutrientes iônicos e disponibilizando-os de forma concentrada para a bactéria, o que seria um importante mecanismo de sobrevivência em um ambiente onde os nutrientes estão muito diluídos. Outro aspecto importante é o movimento sistêmico, ou seja, como a bactéria se propaga para colonizar o hospedeiro. Para a bactéria movimentar-se pelos vasos xilemáticos, é preciso a degradação dos 13 compostos da membrana (celulose, hemicelulose, pectina, lignina e proteína) por enzimas digestivas produzidas pela bactéria contra o tecido do hospedeiro. A habilidade para colonizar o hospedeiro está associada com capacidade eficiente de aderência e multiplicação nos vasos, o que resulta no bloqueio do xilema e consequentes sintomas provocados pelo estresse hídrico. As células que compõem o biofilme apresentam maior resistência a biocidas, antibióticos e resposta de defesa do hospedeiro (SOUZA et al., 2004). Assim, também nestas estas células é possível identificar genes de patogenicidade ligados à adesão, e de adaptação (SOUZA et al., 2005). O conhecimento da sequência completa deste genoma representou um grande passo para a compreensão das vias metabólicas, replicativas e para a determinação dos mecanismos de patogenicidade, mas ainda é preciso ter mais informação para chegar a um entendimento mais profundo sobre os mecanismos que permitem à bactéria sobreviver num ambiente inóspito e adaptar-se a um espectro de hospedeiro tão amplo e diverso. Estudos em genômica funcional e proteômica estão sendo desenvolvidos no intuito de conhecer melhor o complexo e dinâmico sistema de sinais e fatores de patogenicidade que operam em conjunto, ocasionando a virulência ou a tolerância na planta hospedeira. SIMPSON et al. (2000) apresentam os distintos sistemas relacionados com patogenicidade na X. fastidiosa: detoxificação e adaptação; produção de antibióticos e fluxo de drogas, síntese de toxinas e secreção; degradação de paredes celulares, regulação dos fatores de patogenicidade, síntese e secreção dos EPSs, genes relacionados à virulência, biogênese das fímbrias, adesão e captura do ferro. Assim, existem distintos tipos de genes relacionados à patogenicidade e à virulência nas bactérias fitopatógenas (classificados como Clase I, II e III). Os genes de degradação de tecidos, de toxinas de alto ou baixo peso molecular e de enzimas que destroem a integridade estrutural do tecido do hospedeiro, estão 14 incluídos na Classe I de virulência ou “genes de virulência verdadeiros”. São classificados como genes de virulência Classe II aqueles que codificam fatores de regulação e atividade da expressão dos genes da Classe I, como as proteases específicas, metilases, chaperoninas, etc. E, finalmente, os genes de virulência da Classe III são aqueles que codificam proteínas que comprometem a resposta da planta contra o patógeno, como transportadores específicos, sistema proteção redox, degradadores xenobióticos, osmossensores e reguladores de pH (WASSENAAR; GAASTRA, 2001). Têm surgido na literatura alguns modelos, nos quais se tenta explicar quais vias de transdução de sinais a nível molecular que promovem ou inibem a adesão aos tecidos do hospedeiro, entre as próprias células da bactéria, e a secreção de exopolissacarídeos ou gomas. Assim, também tentam explicar como todos esses fatores operam em conjunto obstruindo a passagem de seiva e nutrientes através dos vasos do xilema ou, pelo contrário, permitindo a movimentação entre os vasos do xilema e colonização da planta, ou transmissão ao inseto vetor. 5. Modelo de colonização na planta e transmissão ao inseto Segundo CHATERJEE et al. (2008), o complexo estilo de vida da X. fastidiosa como colonizador de ambas, a planta e o inseto, envolve caraterísticas em conflito com esses estádios; portanto necessita de um esquema de regulação gênica que permita às células expresar distintas características para poder coexistir na planta. Este autor sugere, portanto, a adaptação da percepção e função da mesma molécula de sinalização, o fator DSF, às próprias necessidades para a colonização dos distintos hospedeiros. De forma simplista, a virulência em X. fastidiosa está influenciada principalmente por: adesinas (fímbrias e afimbriais) envolvidas na adesão a superfícies e célula-célula para formar o biofilme; os pili tipo IV envolvidos no 15 movimento “twitching motility” ao longo dos vasos xilemáticos e talvez também entre eles; e enzimas extracelulares, tais como poligalacturonases, endoglucanases que são requeridas para a degradação das membranas de pontuação que permitem passar de um vaso a outro. Todas essas características estão controladas pelo acúmulo do fator DSF, portanto exibem uma dependência do tamanho populacional. Curiosamente, a produção de pili tipo IV e as enzimas extracelulares são reguladas de maneira oposta às adesinas, pelo DSF, sendo reprimidas com altas concentrações deste fator. A colonização da planta e o desenvolvimento dos sintomas são mais eficientes quando as células não expressam adesinas, o que permite sua livre movimentação dentro dos vasos do xilema. Quando a concentração do DSF está em baixa concentração nos vasos que não possuem grandes colônias de X. fastidiosa, a expressão das adesinas seria baixa e a das enzimas extracelulares e pili tipo IV alta. Esta seria uma fase exploratória da colonização da planta na qual se espera um movimento mais frequente até novos vasos xilemáticos. Por outro lado, nos vasos onde se formam colônias maiores, os nívels do DSF aumentariam, suprimindo a subsequente produção de enzimas e pili tipo IV, embora produzindo mais adesinas que dificultariam o movimento. Assim, também provavelmente, o DSF suprime a multiplicação da bactéria nos vasos, enquanto o número celular aumenta e o DSF se acumula. Este mecanismo atuaria como um “feedback” negativo para prevenir o crescimento excessivo nos vasos, o que pode resultar deletério no caso de bloqueio do vaso. (Figura 3) 16 Figura 3: Modelo para a transdução de sinais, colonização da planta e aquisição pelo inseto para X. fastidiosa. Fonte: CHATERJEE et al, 2008. 6. A análise da expressão gênica através de microarranjos A genômica, ciência que estuda como os genes ou a informação genética estão organizados no genoma e de que forma essa organização determina sua função, permite a análise sistemática e simultânea de um grande número de genes e o estudo dos processos biológicos como um todo. A “Genômica” é constituída pela “Genômica Funcional”, que emprega a informação da genômica estrutural para avaliar os processos biológicos de uma forma sistemática (STAUDT et al., 2000). O aparecimento dos microarranjos de DNA, na metade da década de 1990, forneceu uma metodologia capaz de permitir a análise do padrão de expressão de milhares de genes simultaneamente. Trata-se de um sistema avançado para o estudo simultâneo de expressão de genes (DIEHN; RELMAN, 2001; FREEMAN et 17 al., 2000). Essa técnica é baseada em um arranjo de alta densidade de sequências gênicas específicas, as quais são hibridizadas com cDNA marcados pela incorporação de nucleotídeos fluorescentes através de uma reação com a enzima transcriptasa reversa. O desenvolvimento da tecnologia de microarranjos de DNA proporcionou uma excelente oportunidade para caracterizar os genes responsáveis pelas doenças causadas pela bactéria X. fastidiosa. Atualmente, existem muitas plataformas de microarranjos além dos microarranjos chamados de “home made” (fabricados no próprio laboratório), tais como as Plataformas Affimetrix, Agilent, Nimblegen, Ilumina, entre outras, que utilizam métodos distintos para a fabricação dos arranjos. A companhia Affymetix foi a primeira a lançar os microarranjos de oligonucleotídeos, através da combinação de microfotolitografia (que é usada para a manufatura de chips de computadores), e de química combinatória, (empregada na indústria farmacêutica). A Affimetrix patenteou um método industrial de produção de microarranjos de DNA de alta qualidade. Ao invés de ligar as sondas de cDNA ao arranjo, por meio da síntese química direcionada por luz, são construídos oligonucleotídeos em posições determinadas sobre uma placa de quartzo. Cada placa pode comportar de 500 a 400 GeneChips, dependendo do número de sondas sobre o microarranjo. Os arranjos de oligonucleotídeos são considerados mais exatos e mais versáteis que os arranjos impressos de cDNA (MIKLOS; FREYER, 2005). Mais recentemente, o sequenciamento direto dos transcritos pelas tecnologias de alto desempenho, chamadas de “hight throughput” (RNA-Seq), tornou-se uma alternativa adicional aos microarranjos e começou a substituir as técnicas de SAGE e MPSS (BUSH; LOHMANN, 2007). Assim como estas, RNA- Seq não depende da anotação genômica para a seleção prévia das sondas e evita os vieses da hibridização dos microarranjos. Por outro lado, RNA-Seq possui novos algoritmos e desafios logísticos, e as estratégias laboratoriais requerem 18 demorados procedimentos. Portanto, RNA-Seq é o método de escolha em projetos que utilizam organismos não modelos e para a descoberta de transcritos e anotação genômica. Os microarranjos, por sua vez, devido aos sólidos processos para o processamento de dados e a análise de amostras, ainda são preferidos para projetos que envolvem um grande número de amostras, e para a análise de transcriptomas em organismos modelos com genomas bem caracterizados e anotados (BAGINSKY et al., 2010). Técnicas, como Microarranjos de DNA de alta densidade, utilizadas na Genômica Funcional, têm permitido o estudo da estrutura, organização e função de milhares de genes e sua expressão simultânea em um único experimento. Conjuntamente, a ampliação de sequências de DNA depositadas em bancos de genes, resultante de diversos projetos genoma realizados nos últimos anos, permitiu o aperfeiçoamento de novas estratégias para a elucidação do padrão de expressão gênica em diversos organismos. Um dos campos nos quais esta tecnologia causou maior impacto e aumentou sua importância, é o da análise da interação patógeno-hospedeiro (DIEHN; RELMAN, 2001). A alteração no padrão de expressão da planta hospedeira, quando infectada, e a classificação do agente causal com base neste padrão induzido são de suma importância na diagnose e no tratamento de doenças de plantas. NUNES et al. (2003) apresentaram evidências de um controle coordenado da transcrição dos elementos de transferência horizontal, comparando 12 isolados de X. fastidiosa através de microarranjos. KOIDE et al. (2004) compararam, através da técnica de microarranjos, isolados de X. fastidiosa patogênico e não patogênico e observaram que o isolado J1a12, quando inoculado em tabaco e em citros, não apresentou sintomas. Quando este foi comparado com o isolado 9a5c, considerado altamente patogênico, não apresentou genes relacionados à adesão e patogenicidade. 19 Assim, também KOIDE et al. (2006) analisaram a expressão gênica global da resposta a altas temperaturas (“heat shock”) através de microarranjos, revelando uma complexa rede de genes que atuam juntos em resposta à temperatura. SOUZA et al. (2003) analisaram a expressão gênica em dois estádios de crescimento na X. fastidiosa (uma e quarenta e seis vezes de passagem por meio de cultura) e sua relação com a patogenicidade através de microarranjos. Foi observado que a maioria dos genes induzidos após uma passagem estava associada com adesão e provavelmente adaptação ao ambiente. Assim, também, SOUZA et al. (2004) analisaram o padrão de expressão gênica da X. fastidiosa durante a formação do biofilme através de microarranjos, observando que a expressão gênica nas células que estão desenvolvendo o biofilme é similar aos outros sistemas já caracterizados. TRAVENSOLO et al. (2008; 2009) analisaram por microarranjos a expressão da bactéria X. fastidiosa em diferentes meios de cultura (meio XDM e BCYE). Foi observada a expressão de genes relacionados com metabolismo de aminoácidos, proteínas, nucleotídeos, energético, entre outros, sugerindo que esta bactéria é capaz de sintetizar substâncias de acordo com a sua necessidade e de acordo com a escassez de nutrientes no meio de cultura. ZAINI et al. (2008) estudaram o perfil de expressão gênica de X. fastidiosa em resposta à limitação de ferro através de microarranjos e observaram a indução de genes que codificam pilis tipo IV, assim como bactericinas do tipo Colicina V. SHI et al. (2007) analisaram o papel do gene algU através de mutação e a análise global da expressão gênica através de microarranjos, encontrando diminuição na agregação célula-célula, adesão, formação do biofilme e virulência no mutante. Do mesmo modo, SHI et al. (2009) identificaram vários genes regulados pelo gene GacA também através de mutação e da análise da expressão 20 gênica através de microarranjos, sugerindo o envolvimento deste gene na regulação de vários fatores que contribuem na adesão e formação do biofilme, assim como em processos fisiológicos que poderiam potenciar a adaptação ao estresse do ambiente, ou mesmo a competição dentro do xilema. 7. A técnica de PCR em tempo real (RT-qPCR) e sua utilização na validação de dados de microarranjos A validação dos dados obtidos em análises de microarranjos torna-se cada vez mais necessária e criteriosa, uma vez que, além do grande volume de dados obtidos, os mesmos são analisados de forma integrada, fornecendo padrões globais de transcriptoma para determinados sistemas biológicos. A ferramenta de PCR quantitativa em tempo real surgiu como uma tecnologia eficiente para validação de dados de arranjos devido a algumas características, como quantificação, rapidez e economia de RNA, utilizando até 1.000 vezes menos RNA que nos ensaios convencionais (RAJEEVAN, 2001a). A diferença com a PCR convencional (ou PCR qualitativa) é que o produto da amplificação é analisado ao término do processo, por meio de eletroforese. Na PCR em tempo real, esse passo pode ser evitado, pois a tecnologia combina a amplificação de DNA com a imediata detecção de produtos em um único tubo, diminuindo o risco de contaminação causada pela abertura do tubo após a reação. Além disso, a PCR em tempo real demanda menos tempo do que análises baseadas em gel e pode gerar um resultado quantitativo (KUBISTA et al., 2006). Os métodos de detecção atual são baseados nas mudanças da fluorescência que, por sua vez, é proporcional ao acúmulo de cópias do alvo. A fluorescência é monitorada durante cada ciclo da PCR, gerando um gráfico da amplificação, o que permite que o usuário acompanhe a reação em tempo real. 21 O sistema baseia-se na detecção e na quantificação de um repórter fluorescente, enquanto ocorre a amplificação. Este repórter consiste em oligonucleotídeos e sondas específicas marcadas, ou fluoróforos intercalantes na cadeia do DNA, que emitem fluorescência a cada hibridização e a cada passo de amplificação (KUBISTA et al., 2006). No caso deste trabalho, foi escolhida a molécula intercalante SYBR Green, a qual emite fluorescência repórter que é determinada no final de cada ciclo da PCR. A curva de amplificação define três etapas: baseline, fase exponencial e fase estacionária. O “cycle treshold” (Ct) é definido como o número de ciclos nos quais a reação inicia a sua fase exponencial de amplificação, cruzando o “threshold” (limiar), que é definido pela linha de início de sinais gerados. Em todas as reações se usa o corante Rox como referência passiva, o qual normaliza a fluorescência presente no meio e a fluorescência do repórter. Na análise e comparação dos resultados de ensaios de PCR em tempo real, muitos pesquisadores são confrontados com muitas variáveis incontroláveis que podem causar interpretação errada dos resultados. Tais variáveis podem ser a quantidade de material inicial, eficiência enzimática e diferenças entre tecidos, indivíduos ou condições experimentais. Como o objetivo é fazer uma boa comparação, a normalização pode ser utilizada como método de correção para essas variáveis. O método mais usado é a normalização por um gene endógeno, excluindo a variação em virtude de diferentes quantidades de RNA; no entanto, é fundamental que o gene endógeno esteja expresso constantemente e em mesmo nível, independentemente do grupo experimental ou das diferentes amostras. Os dois métodos mais utilizados de quantificação são a quantificação absoluta e a quantificação relativa (SELLARS et al., 2007). Na quantificação absoluta, o número exato de cópias do gene de interesse é calculado. Já na quantificação relativa, a expressão do gene de interesse em uma amostra é relativamente expressa ao mesmo gene de outra amostra, utilizada como uma referência. 22 Para a quantificação relativa, os níveis de expressão gênica são calculados pela razão entre a quantidade do gene-alvo e a quantidade do gene endógeno que, por sua vez, está presente nas amostras. Existem métodos simples e mais complexos para a quantificação relativa, dependendo da eficiência da PCR e do número de genes de referência utilizados. O método delta delta Ct (∆∆Ct) é o mais simples, pois é utilizada uma comparação direta dos valores de Ct entre o gene- alvo e o gene de referência. Porém, as eficiências da PCR do gene-alvo e do gene de referência devem estar perto de 100%, e não podem diferir mais do que 10%. A validação da eficiência de amplificação dos “primers” e do controle endógeno é requerida para uma quantificação por este método segundo o guia de informação mínima requerida para a publicação de experimentos RT-qPCR (BUSTIN et al, 2009). Portanto, somente o início do experimento requer uma curva-padrão para comparar a eficiência da PCR do alvo e do controle endógeno (SCHMITTGEN, 2008). Assim, a quantificação relativa envolve a escolha da amostra calibradora. A amostra calibradora pode ser qualquer amostra do experimento que possa ser comparada com as outras amostras. Inicialmente, o ∆Ct entre o gene-alvo e o gene de referência (endógeno) é calculado para cada amostra (para amostra de interesse e também para amostra calibradora). Então, a diferença entre o ∆Ct da amostra de interesse e o ∆Ct do calibrador é calculada, gerando o valor do ∆∆Ct. O valor normalizado da expressão do gene-alvo é igual a 2-∆∆Ct, valor que pode ser usado para comparar os níveis de expressão das amostras. Os microarranjos de DNA proporcionam maior vantagem para estudos genômicos, embora a qualidade dos dados de expressão gênica, obtida através de microarranjos, possa variar segundo a plataforma e os procedimentos utilizados. A PCR quantitativa em tempo real (RT-qPCR) é uma ferramenta comumente utilizada para a confirmação dos dados de expressão gênica, obtidos por meio de análises de microarranjos, embora muitas vezes estes dados não se 23 correspondam. Atualmente, não existe uma definição padrão da validação, pois as correlações de RT-qPCR com dados de microarranjos raramente são apresentadas na literatura; e os dados que não se correspondem são raramente explicados. Encontra-se bem documentado que ambas as técnicas RT-qPCR e os microarranjos possuem características próprias (BUSTIN, 2002; CHYAQUI, 2002; FREEMAN, 1999; WURUMBACH, 2003) que podem influenciar de forma significativa os dados obtidos por cada um dos métodos. Aliás, existem muitas plataformas distintas para ambos os microarranjos e análises RT-qPCR, o que gerou um debate sobre qual dos métodos produz a medida mais precisa da expressão gênica (BARRET, 2003; BRAZEAU, 2004; BUSTIN, 2000; MAH, 2004; YAUK, 2004; ZHU, 2005). Fatores tais como a qualidade do RNA, eficiência das transcriptases reversas, eficiências distintas de incorporação dos fluoróforos, hibridações inespecíficas nos microchips e erros próprios da RT-qPCR, assim como os distintos tipos de normalização aplicados para os microarranjos e para RT-qPCR, produzem variabilidade, o que pode influir nas correlações entre esses dois métodos. O mais comum na literatura é simplesmente afirmar que os resultados se encontram validados geralmente sem achar uma correlação ou com uma correlação extremamente baixa. RAJEEVAN et al. (2001a) consideram um resultado válido, quando o valor de FC medido por ambos os microarranjos e a RT-qPCR é igual ou maior que 2 vezes, sem considerar a magnitude da diferença. Vários estudos têm procurado determinar quais os fatores que influenciam essa variação. Menores correlações foram reportadas para genes exibindo valores de FC menores que 2 do que para aqueles maiores que 2 (WURMBACH, 2003; ETIENNE, 2004; RAJEEVAN, 2001b). ETIENNE et al. (2004) acharam que a maior distância entre a localização dos “primers” e as sondas do microarranjo em um determinado gene diminui também a correlação entre os métodos. BECKMAN 24 et al. (2004) acharam que os “spots” de baixa intensidade nos microarranjos em dois canais (duas cores) possuem consideravelmente menores correlações com os dados da RT-qPCR que os “spots” de alta intensidade. Este trabalho vai levar em consideração o sentido da expressão, não a extensão do valor LogFC nem o número de vezes a mais, que foi diferencialmente expresso em uma, ou outra condição. III. OBJETIVO 1. Identificar e analisar a expressão de genes diferencialmente expressos através de lâminas de microarranjos representando todos as “ORF” identificados no projeto de sequenciamento da bactéria X. fastidiosa em duas situações: 1.a- Dentro de uma planta que está manifestando os sintomas de CVC, a variedade suscetível (Pera); 1.b- Quando a bactéria se encontra dentro de uma variedade tolerante, a cultivar Navelina ISA 315. Esta cultivar foi reportada como hospedeiro assintomático por Souza et al. (2006) e foi confirmada sua tolerância por FADEL (2011) através de avaliação visual e RT-qPCR. 2. Relacionar a informação obtida sobre possíveis genes de patogenicidade com os fenótipos sintomático e assintomático das variedades, e, com os mecanismos de patogenicidade descritos na literatura. 2.a- Identificar os genes diferencialmente expressos através de “software” específico: Imagene (Biodiscovery); Array Weights e R (www.r-project.org): pacote Limma (bioconductor.org/packages/2.4/bioc/HTML/limma.html.); http://www.r-project.org/ 25 2.b- Categorizar os genes diferencialmente expressos nas categorias descritas no “site” do projeto Genoma: http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf/; 2.c- Analisar a distribução e número de genes diferencialmente expressos entre as subcategorias relacionadas com patogenicidade para cada categoria; 2.d- Analisar os dados de expressão gênica dos genes que poderiam ter influência nos distintos processos bioquímicos associados à patogenicidade descritos por SIMPSON et al. (2000) ou por outros autores, tais como detoxificação e adaptação, secreção e síntese de EPS, adesão, síntese e secreção de toxinas e biogênese das fímbrias entre outros. 3. Validação do experimento de microarranjos através da técnica de PCR em tempo real (RT-qPCR). 3.a- Escolha e desenho dos “primers” e controle endógeno, utilisando o “software” “Primer Express 3.0” (Applied Biosystems); 3.b- Otimização das condições de amplificação com o aparelho de PCR em tempo real: Applied Biosystems modelo 7500; 3.c- Validação da especificidade e eficiência de amplificação dos “primers” (curvas de “melting” e curvas-padrão); 3.d- Quantificação relativa, utilizando o método delta delta Ct (∆∆Ct) 3.e- Validação do experimento de microarranjos por intermédio da comparação da expressão diferencial pelas duas técnicas em número de vezes mais expresso e Log2FC. 26 IV. HIPÓTESE Podem existir diferenças nos níveis de expressão dos genes relacionados com a patogenicidade entre as plantas suscetíveis e as tolerantes; com uma maior expressão de genes de virulência, degradação e mobilidade nas suscetíveis, que permita a colonização da planta. Por sua vez, nas plantas tolerantes, a bactéria poderia apresentar maior expressão de genes de adesinas, de regulação negativa da patogenicidade ou de resposta ao estresse, seja em resposta às defesas da planta hospedeira ou à interação com algum microrganismo endófitico. V. MATERIAL E MÉTODOS 1. Desenho Experimental O desenho experimental consistiu em três preparações independentes de cDNA marcado com fluoróforos, derivados de RNAs de três repetições independentes de cada condição biológica (3 plantas de laranja Pera e 3 de laranja Navelina). Esses cDNAs foram hibridizados em lâminas, contendo produtos de PCRs impressos em duplicata contendo controles negativos distantes geneticamente. Esse microarranjo da X. fastidiosa (com as 2600 ORF e os controles negativos), foi padronizado no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia da UNESP de Jaboticabal por TRAVENSOLO (2008 e 2009). A condição da bactéria X. fastidiosa dentro da cultivar assintomática Navelina ISA 315 foi considerada, nesta análise, como condição experimental (marcada com fluoróforo Cy5) e dentro da variedade suscetível Pera como controle (marcada com fluoróforo Cy3). 27 Também, foram realizadas três hibridações entre uma planta sadia Navelina ISA 315 (condição experimental) e a planta sadia Pera (condição controle), para descartar amplificação inespecífica com o genoma da planta. Ambas, a Pera e a Navelina ISA 315 sadias, foram coletadas dentro da casa de vegetação, protegidas de qualquer contaminação via inseto, e produzidas por microenxertia. 2. Isolado bacteriano e material vegetal A linhagem bacteriana de X. fastidiosa utilizada foi a 9a5c (isolado de citros), sequenciada no Projeto Genoma ONSA-FAPESP. Para o experimento, as bactérias foram cultivadas em meio BCYE (WELLS et al., 1981), a 28ºC, em agitação por 6 dias. As amostras vegetais das variedades mencionadas foram fornecidas pelo Dr. Stuchi e coletadas no campo, na Estação Experimental de Citricultura de Bebedouro, São Paulo. As condições climáticas e de solo dessa Estação foram semelhantes, já que os sítios de coleta se separam por aproximadamente 500 m. O clima é considerado subtropical: temperatura média de 16,8ºC a 30,6ºC, chuva média anual de 1.550 mm. O tipo de solo é Latossolo vermelho distrófico típico, com textura média. A Estação Experimental se encontra a 20º53´16´´ S (latitude), 48º28´11´´ W (longitude) em São Paulo, Brasil. As amostras de laranjeira Pera foram coletadas em plantas com sintomas típicos de CVC, dispostas em talhão experimental, enquanto as amostras da cultivar Navelina foram coletadas em plantas utilizadas em estudo de avaliação da tolerância desta cultivar à CVC (FADEL, 2007). Em Novembro de 2006, plantas de Pera com sintomas avançados de CVC, com grau três, pela escala diagramática de AMORIM et al. (2003), enxertadas sobre portainjerto limão cravo foram submetidas à poda drástica. Em Março de 2007, realizou-se, naquelas plantas de Pera, a enxertia em “T” invertido utilizando borbulhas de plantas assintomáticas da cultivar Navelina ISA 315, oriundas de três plantas estabelecidas em campo no ano de 2000. Essas plantas, 28 apesar de expostas a condições naturais de infecção há sete anos, não apresentaram sintomas de CVC, porém foram positivas para presença de X. fastidiosa via PCR (STUCHI et al., 2007). Em Dezembro de 2008 já se havia formado uma nova copa da variedade Navelina ISA 315 nessas plantas. O manejo e tratos culturais foram usuais, somente sem aplicação de inseticias visando à manutenção da população de cigarrinhas e conseqüente inoculação natural de X. fastidiosa. Em Janeiro e Agosto de 2009, a concentração da bactéria foi avaliada em 10 plantas através da observação de sintomas (utilizando a escala diagramática acima citada) e da quantificação absoluta pela RT-qPCR usando a curva padrão desenvolvida por OLIVEIRA et al. (2002). Por meio das citadas avaliações, a cultivar Navelina ISA 315 foi reportada tolerante à CVC por FADEL (2011). As plantas usadas como controles sadios, por sua vez, provêm de microenxertia, e foram mantidos e coletados na casa de vegetação. 3. Coleta das amostras As folhas da laranjeira Pera foram coletadas de ramos com sintomas avançados, com grau três, pela escala diagramática de AMORIM et al. (1993), enquanto da laranjeira assintomática, Navelina ISA 315, as folhas foram coletadas em uma amostra composta (folhas pertencentes a vários ramos assintomáticos). Foram coletadas de 30-35 folhas de três plantas por cada variedade. Assim, foram escolhidas para a análise de expressão gênica, as três plantas da cultivar Navelina ISA 315 com a maior concentração bacteriana na avaliação por RT-qPCR (realizada em Janeiro de 2009), que não apresentaram variações significativas na avaliação de Agosto de 2009. As concentrações de X. fastidiosa nessas 3 plantas foram de 6,8x103, 6,5x103 e 6,3x103 cópias de X. fastidiosa/ DNA total na primeira avaliação; e de 8,2 x103, 1,29x104 e 5,07 x103 na 29 segunda avaliação, respectivamente. Do mesmo modo, foi coletado da casa de vegetação, o mesmo número de folhas de três plantas sadias de cada variedade, para usar como controles negativos. 4. Extrações de RNA Aproximadamente 200 mg de pecíolo e nervura central das folhas sintomáticas e das assintomáticas foram cortados e macerados em N2 líquido em cadinho e transferidos a microtubo do tipo “eppendorf”, contendo 1 mL do reagente Trizol (Invitrogen). O material foi misturado em vórtex e incubado, por 5 min, a 25 ºC. Imediatamente, 2 mL de clorofórmio foram adicionados e misturados. As amostras homogeneizadas foram incubadas por 3 min a 25ºC para permitir a completa dissociação dos complexos de nucleoproteínas. Após esse tempo, o material foi centrifugado a 7.500 xg, por 10 min, a 5 ºC. Após a centrifugação, a fase aquosa formada foi transferida para um novo tubo, e o RNA foi precipitado pela adição de 2,5 mL de álcool isopropílico. A solução foi incubada a 25ºC por 10 min e centrifugada a 12.000 xg por 10 min, a 5ºC. Removido o sobrenadante, o sedimento formado foi lavado com 5 mL de etanol a 75%, sendo novamente coletado por meio de centrifugação a 7.500 xg, por 5 min, a 5 ºC. No final do procedimento, o RNA foi secado rapidamente e solubilizado em H2O livre de RNAse (água Milli-Q tratada com DEPC - 0,01% - H2ODEPC). 5. Quantificação do RNA A integridade das amostras de RNA foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 1,2%, contendo tampão de MOPS [10x] (MOPS 200 mM, AcNa 50 mM, EDTA 10 mM) e 5,5 % v/v com formaldeído absoluto. Foram dissolvidos aproximadamente 1 -2 g de RNA em 5 L de formamida deionizada e 30 adicionados 5 L de solução de corrida para RNA (1 volume de tampão [10x] de formaldeído, 2 volumes de formaldeído absoluto, 1 volume de 400 g/mL de brometo de etídio e 1 volume de H2ODEPC), e aquecidos a 65°C por 10 minutos. Imediatamente, foi adicionado 1 L de SDS/glicerol/azul de bromofenol [10x] para cada amostra e aplicado no gel. A corrida eletroforética foi conduzida em tampão de corrida [1x] (MOPS 20 mM, AcNa 5 mM, EDTA 1 mM), durante 1h 30min a 80 V constantes. Como marcador molecular de RNA, foi utilizado o RNA “ladder” (“Life Technologies”), com seis fragmentos visualizados de 0,24 a 9,49 Kb. 6. Obtenção do cDNA marcado com compostos fluorescentes Cy3 e Cy5 6.1. Reação de transcrição reversa A obtenção de cDNAs fluorescentes para as reações de hibridização foi realizada em um microtubo contendo 100 μg de RNA total, 15 ug de oligonucleotídeos exâmeros aleatórios pdN6 (“Amersham Bioscience”), 4U de RNAsin (Promega) e água para completar o volume final para 9,0 μL. Essa mistura foi agitada por pipetagens, incubada a 70ºC por 5 min e mantida a 4ºC por 5 min, para permitir o pareamento dos oligonucleotídeos com o RNA. Foram utilizados 100 μg, considerando que o RNA bacteriano possa estar diluído com RNA de origem vegetal. Após a incubação, foi adicionada a cada tubo uma solução contendo: 6 μL de tampão 5X ImProm, 3,6 µL MgCl2 25mM, 3 µL dNTPs 5mM A/C/G, 2mM T; 2 µL de ImPromII Reverse transcriptase (“Promega”) e 2µL do dUTP-Cy3 (ao RNA Pera) ou dUTP-Cy5 (ao RNA Navelina). Para a síntese do cDNA fluorescente, as amostras foram incubadas a 25 ºC, por 5 min, e 40 ºC durante 3 horas no termociclador PC-100 “Programmable Thermal Controller” (“MJ Research INC.”). 31 Três reações de transcrição reversa distintas (uma para cada amostra biológica: as três plantas) foram realizadas para as duas variedades, assim como para os controles sadios (Pera e Navelina ISA 315). Essas amostras foram, posteriormente, hibridizadas em triplicata (em três lâminas distintas, uma para cada planta), para diminuir a variação na expressão gênica não relacionada com a presença da X. fastidiosa. 6.2 Degradação do RNA e concentração do cDNA Após a síntese do cDNA, foi incluído um passo de degradação do RNA por meio de incubação a 37ºC, durante 4 min, em uma solução com 2,5uL EDTA 0,5M (pH 8,0) e 5,0µL de NaOH 1M. Foi então ressuspenso o cDNA de cada amostra em 400 μL de tampão TE (10 mM e 1 mM EDTA, pH 7,5) e 12,5 μL de Tris-HCL 1M, pH 7,5 e concentrado em uma coluna tipo Microcon-YM30 (“Millipore”). Essas colunas foram centrifugadas por 15 min, a 15ºC, a 15.294 xg., e o filtro foi logo lavado com 200 μL de TE e centrifugado por 10 min a 15ºC, a 15.294 xg. A coluna foi, posteriormente, invertida em um novo tubo e aplicados 30 μL de água ultrapura. Os tubos foram logo submetidos à centrifugação por 10 min a 15.294 xg a 15 ºC, a coluna descartada e o fluido quantificado. 7. Fabricação do microarranjo contendo o genoma total da X. fastidiosa A padronização da técnica de microarranjos para X. fastidiosa foi realizada previamente no Laboratório de Bioquímica de Microrganismos e Plantas do Departamento de Tecnologia da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal (FCAV) por TRAVENSOLO (2008) e (2009). Assim, foi desenvolvida uma estratégia para monitorar múltiplos genes simultaneamente com a disponibilidade do genoma inteiro desta bactéria. Foram desenhados oligonucleotídeos iniciadores específicos para amplificar os 2.600 ORFs identificados no genoma, usando o “software” PRIMER3. Assim, uma temperatura 32 de pareado de 48ºC até 57 ºC foi determinada para todos eles. Assim, foram amplificados as 2.600 ORFs anotados no projeto Genoma da X. fastidiosa ONSA FAPESP, tanto aqueles que codificam para proteínas com funções putativas assinaladas por homologia de sequência com outros organismos, como aqueles que não apresentam homologia com proteínas funcionais conhecidas (hipotéticos e hipotéticos conservados). O arranjo final obtido apresentou aproximadamente 5.200 “spots” oriundos da duplicação de cada produto amplificado. As ORFs amplificadas foram dispostas na lâmina na forma de arranjo com a distânia de 250 m. Esse adensamento permitiu minimizar o volume da solução de hibridação para a lâmina inteira. 7.1 Cultivo do isolado 9a5c e extração do DNA A bactéria foi cultivada em meio líquido BCYE (WELLS et al., 1981) a 28ºC, mantido em agitação por 6 dias. Para o meio BCYE, 10 g de ACES foram hidratados em 500 mL de água destilada a 50ºC. A solução de ACES foi misturada com 40 mL de uma solução 1,0 N KOH, em 440 mL de água destilada, sendo, posteriormente, utilizada para hidratar 2 g de carvão ativado, 10 g de extrato de levedura e 17 g de ágar, autoclavada e equilibrada para 50ºC. Então, 0,4 g de L- cisteína e 0,25 g de pirofosfato férrico foram dissolvidos em 20 mL de água, esterilizados por filtragem e adicionados ao meio. O método de extração de amostras de DNA utilizado foi o descrito por AUSUBEL et al. (1987) com algumas modificações. Suspensões bacterianas (1 mL) foram transferidas para um tubo estéril de 1,5 mL e centrifugadas a 14.000 x g por 2 min. Os sobrenadantes foram descartados, e os precipitados, ressuspensos em 567 L de Tampão TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0; EDTA 1 mM, pH 8,0), 30 L de 10% SDS e 3 L de proteinase K (20 mg/mL). Nessa etapa, foram acrescentados 100 L de solução de RNAse (200 g/mL), e as soluções foram 33 incubadas a 37ºC por 1h 30 min. Em seguida, continuou-se com o procedimento sugerido pelo protocolo. A quantificação das amostras de DNA foi realizada em espectrofotômetro (BECKMAN-DU 640), medindo-se a absorbância em contraste com uma amostra de TE, nos comprimentos de onda de 260 e 280 nm. A integridade do material genético foi analisada por eletroforese em gel de agarose a 1,0 % em TBE 1X (0,89 M Tris, 0,89 M ácido bórico, 0,022 M N2EDTA), deslocando-se a 90 V, por 90 min. 7.2 Amplificações por PCR dos 2.600 ORFs e quantificação do produto As reacções de PCR foram realizadas partindo do DNA extraído do isolado bacteriano mencionado no item 7.1, em tampão PCR [1x] (50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl, pH 8,4), 2 mM MgCl2 , 10mM dNTP, 2 U Taq. DNA polimerase, 5 pmols de cada primer, 60 ng do DNA genômico e água ultrapura estéril para completar um volume de 10µL. As seguintes condições de reação foram usadas: 94ºC/2 min, 35 ciclos de 94ºC/1min, 58ºC/1 min, 72ºC/1min 30s, seguidos de uma extensão final de 72ºC/5 min. Todos os produtos foram analisados e quantificados por eletroforese em gel de agarose a 1,5 % em tampão TBE 1X (0,89 M Tris, 0,89 M ácido bórico, 0,022 M N2EDTA) com 0,5 µg/mL de brometo de etídio. 7.3 Concentração e impressão dos produtos de PCR na lâmina Os produtos amplificados foram levados até uma concentração de 200-350 µg/uL com base na quantificação realizada. Após a concentração, cada produto foi ressuspenso em 50 % DMSO v/v numa concentração final de 100-300 ng/ µL com base na quantificação realizada. O DMSO é bastante utilizado em experimentos com arranjos, inicialmente devido a sua propriedade higroscópica e baixa evaporação, permitindo a armazenagem do DNA por longos períodos e 34 proprocionando uma maior uniformidade na área do “spot” (HEGDE et al., 2000). Os produtos que não resultaram um produto de PCR na concentração acima mencionada foram novamente amplificados até a obtenção da a concentração desejada. A impressão dos microarranjos foi feita em lâminas de vidro, previamente tratadas com aminosilano (GMT-GAPS, Corning, Cat. Nº 40004), por um dispositivo robotizado, modelo GMS 417 Arrayer (Affymetrix Inc., Santa Clara, CA, USA). Os “spots” foram impressos a uma distância de 250 µm na forma de arranjo, em réplica (dois “spots”/amostra) Após a impressão robótica, os DNAs foram reidratados (42 ºC por um seg), secos (70 ºC por 1 min) e fixados na lâmina por meio da câmara UV “cross-link” (130x 10 µJ cm2). As lâminas foram mantidas a 70ºC por duas horas e, posteriormente, guardadas no vácuo à temperatura ambiente. 8. Hibridização dos microarranjos com os cDNAs marcados e lavagens As etapas de hibridização e lavagens foram realizadas em um aparelho “GeneTac hybridization” (“Genomic Solutions” TM, Ann Arbor, Michigan, USA). Inicialmente, as lâminas foram mantidas a 65ºC por 5 min. Sobre essas lâminas, foi aplicada uma solução de hibridização, contendo 8 L de líquido bloqueador (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA RPN 3601), 1 L de SSC 2X, 5,5 uL de SDS 2% (w/v), e o cDNA marcado com Cy3/ Cy5, em um volume final de 11 L. Essa solução foi injetada na câmara de hibridação de forma a cobrir todo o microarranjo. A hibridização foi realizada a uma temperatura de 42ºC durante 16 horas. As lavagens foram realizadas em forma automática após as 16 horas da hibridação. Desse modo, os transcritos que não acharam homologia foram 35 retirados. As lâminas foram lavadas com SSC 2X /SDS 0,5 % (w/v) em 10 ciclos de 10 seg de fluxo e 20 seg de incubação, com SSC 0,5X a 25ºC em 10 ciclos de 10 seg de fluxo, 20 seg de incubação e, finalmente, com SSC 0,05X a 25ºC, com 10 seg de fluxo e 20 seg de incubação. Todas as etapas de lavagem consistiram de ciclos de 1 seg de fluxo e 2 seg de incubação. Após a lavagem, as lâminas foram centrifugadas individualmente, dentro de tubos de centrífuga de 50 mL (tubo Falcon), por 5 min a 201 xg, secas à temperatura ambiente por 15 min para serem, posteriormente, submetidas à detecção da fluorescência. 9. Obtenção e análise das imagens 9.1 Digitalização da imagem As imagens foram obtidas pelo Scanner (Gene Pix 4000 B Molecular Devices Agilent), e as leituras foram feitas sob diferentes comprimentos de onda, para permitir a excitação dos marcadores fluorescentes contidos nos cDNAs: 550 nm (Cy3) e 650 nm (Cy5). A localização e a identidade de cada gene na lâmina foram definidas em um arquivo-texto, criado com auxílio do Programa Clone Tracker2 (BioDiscovery, Los Angeles, USA) por Travensolo (2008; 2009). 9.2 Quantificação e análise das imagens O sinal foi quantificado por intermédio do “sofwtare” ImaGene (v. 4.1 BioDiscovery, Los Angeles, USA), no qual as duas imagens, a vermelha (emissão fluorescência Cy5) e a verde (emissão fluorescência Cy3), foram superpostas, e os “spots” classificados em função da sua morfologia e da sua intensidade. Os “spots” foram então quantificados pela medida da intensidade de todos os “pixels” delimitados por um círculo fixo, e o “background” também foi 36 quantificado para cada “spot” pela medida da intensidade de todos os pixels do local ao redor do “spot”. 9.3 Análises estatísticas A normalização e as análises estatísticas foram realizadas usando o programa R (www.r-project.org) (R. Development Core Team, 2009) e o pacote Limma (http// bioconductor.org/packages/2.4/bioc/html/limma.html) (SMYTH, 2005). O “software” “Array Weights” foi utilizado para testar a qualidade dos arranjos, e o sinal do “background” foi descontado do sinal de cada “spot” pelo método normexp, com um limiar igual a 1 (RITCHIE, 2006). Posteriormente, os “spots” foram normalizados pelo método “loess” (RITCHIE, 2006; YANG, 2001; YANG, 2002; SMYTH, 2003) e, finalmente, o teste T de “Students” foi aplicado (SMYTH, 2004; SMYTH, 2005). 9.4 Busca dos genes candidatos na base de dados do projeto Genoma Xylella fastidosa 9a5c A informação referente a cada um dos genes candidatos foi achada no sítio “web” do Projeto Genoma da X. fastidiosa linhagem 9a5c (http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf/). Na base de dados foram recoletadas informações, tais como o nome do gene e a categoria funcional, o produto gênico e a informação anotada sobre possíveis funções por meio da homologia de sequência com proteínas relacionadas de outros organismos na base de dados do NCBI (utilizando o algoritmo Blast). http://www.r-project.org/ 37 10. Validação da técnica por RT-qPCR 10.1 Fabricação do DNA complementar e quantificação relativa A transcrição reversa (RT) foi realizada usando 2 µg do RNA total da X. fastidiosa, 1,5 µL de “random primer hexamers” pdN6 (Invitrogen) e a enzima transcritasa reverse Improm II (Promega), seguindo as instruções desse kit. O RNA utilizado nessa reação incluiu proporções iguais dos RNAs das três plantas utilizadas no experimento de microarranjos (para cada condição). Essa mistura foi incubada por 1h 30 min, a 40ºC, para a obtenção do cDNA. Após essa síntese, o cDNA foi armazenado a -20ºC. Para verificar sua integridade, foram aplicados 5 µL dessa solução, junto com 3 µL de tampão “bromofenol blue” em um gel de agarose a 1,5%, e realizada a eletroforese, durante 1h 30 min a 85 volts. 10.2 Genes escolhidos e desenho dos primers Os genes candidatos para validar foram escolhidos dentre aqueles relacionados à patogenicidade pela literatura que, por sua vez, tivessem valores de LogFC que se destacaram nas duas condições analisadas, assim como também valores médios. As sequências “fasta” foram selecionadas no banco de dados do Projeto Genoma de X. fastidiosa, linhagem 9a5c (http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf/), e desenhados os oligonucleotídeos iniciadores com o auxílio do “software” do aparelho de PCR em tempo real de “Applied Biosystems” modelo 7500: “Primer Express Software for Real Time PCR 3.0”. Cinquenta sequências foram analisadas uma a uma para cada um dos genes para não incluir, se possível, estruturas secundarias tipo “hairpin” ou dímeros de “primer” que produzem fragmentos inespecíficos que inteferem na quantificação relativa. A Tabela 1 apresenta a sequência dos “primers” escolhidos, assim como o valor de LogFC obtido para cada gene no microarranjo. 38 O controle endógeno foi escolhido dentre os genes que apresentaram uma expressão constante nas condições do experimento de microarranjos e que tenha sido usado em trabalhos anteriores para este patógeno. O gene escolhido foi Nuo A (XF0305), cujo produto gênico é NADH-ubiquinone oxidorredutase, NQO7 subunidade (15.4 kDa), categoria I.C.1 (metabolismo energético, carbono, respiração aeróbica). Este gene apresentou um valor de LogFC de -0,75 e -0,21, e a expressão promédio foi de 5,86 e 5,61 para cada uma das réplicas no microarranjo. Tabela 1: Genes escolhidos, LogFC (microarranjo) e sequência dos “primers” respectivos (“software Primer Express for real time PCR 3.0”). ID/ Nome do gene LogFC Sequencia (5'-3') XF0305 NUOA forward - CATTGATATTGATTGGCAGGTTTC XF0305 NUOA reverse - GAGGACAGCTTTTCGGAATCAG XFa 0052 Vap D forward -1,71 CGTCAGACAAGCACATGGAACT XFa 0052 Vap D reverse - TCGAACCATTGGAAGCGTATG XF0369 Pil M forward -4,37 CAGCTTTCCCGCAGTGGTA XF0369 Pil M reverse - GGTAGCGGCTCCACAGCATA XF1632 Pil U forward -2,08 TCGAGAAAGTCCATGAATGCAA XF1632 Pil U reverse - GCGGAAGCGACCAATGTT XF1626 AlgR forward -5,5 CGGCTGCGTGTGTTGCT XF1626 AlgR reverse - AGCCTCAGCCACCACCTCTA XF1625 AlgZ forward -1,39 CAGCATTGCGCATCGTCTT XF1625 AlgZ reverse - CCAAAACCCCGTCATTCG XF2535 ColS forward 1,66 GCCTCGGTCATGTCGTAAGC XF2535 ColS reverse - ACTCGCGGTACGCAAAGC XF1952 chpA forward 1,78 GACCCAGGCAGTATTCATTCG XF1952 chpA reverse - AAGCCACCGGAACTGCAA XF2339 DNA J forward 1,31 GCGGACGAGGCGTTATTATTC XF2339 DNA J reverse - AACACGCCCAGCACCATT XF0978 HTPG forward 1,71 CCCAAGCCACCCACTCATC XF0978 HTPG reverse - CGCAAAACGGTCCATGTCT 39 10.3 Otimização das condições de reação Foram otimizadas as condições de reação para os “primers” escolhidos, utilizando-se quatro concentrações de “primer” (400, 600, 800 e 1.000 nM) e duas de cDNA (60 e 200ng) na reação. Após a otimização, 400 nM de “primer” e 200 ng de cDNA foram escolhidos para realizar a quantificação relativa. 10.4 Validação da eficiência de amplificação e especificidade dos “primers” Essa validação é recomendada na guia da informação mínima para a publicação de experimentos de RT-qPCR (BUSTIN, 2009). Utilizou-se uma mistura do cDNA das duas condições (cDNA Navelina ISA315 e Pera), em proporções iguais, e diluições seriadas deste cDNA foram submetidas a RT-qPCR, para a fabricação das curvas-padrão de cada par de “primers” usando o “software 7500 System SDS”. O fator de diluição foi registrado no “software”, já que o interesse não é determinar concentração exata da amostra inicial, mas, sim, calcular eficiências de amplificação dos primers que logo serão utilizados na quantificação relativa. Aliás, não se recomenda quantificar a concentração inicial de cDNA em virtude dos restos da reação de transcrição reversa influírem na medição. A fórmula da reta padrão determinada pelo cálculo de regressão linear para a curva padrão RT-qPCR é: y = mx + b, na qual y representa o Ct; m é o valor da inclinação da curva; b é a intersecção dos eixos, e o valor de x determinará a concentração em escala logarítmica da amostra de interesse. Tomando como exemplo os valores obtidos pela curva-padrão do gene Nuo A, gerados neste trabalho (Figura 17), a reta gerada é representada pela equação, a saber: y = - 3,400087x + 25,901331. A intersecção é o ponto em que o eixo do gráfico que define a concentração em valores logarítmicos cruza com um determinado Ct no 40 ponto zero da escala logarítmica (abscissa), o qual apresenta o valor de 25,901331. O coeficiente de regressão linear (R2) foi 0,935680. A eficiência é, entretanto, definida por meio da inclinação da curva, assumindo 100% de amplificação. Segundo PFAFFL (2004), a eficiência da PCR deve ser de E= 100± 20%, correspondente a -3,6 < inclinação < -3,1. A eficiência da amplificação é determinada pela fórmula: E = (10(-1/slope) -1) x 100 %. No caso do gene NuoA, a eficiência calculada foi 96,851. Calculou-se a eficiencia de amplificação para todos os “primers” e para o controle endógeno pela fórmula acima mencionada. Fabricaram-se também as curvas de dissociação ou curvas de “melting” para cada par de “primers”, utilizando-se o “software” SDS (“Applied Biosystems”). Essas curvas foram utilizadas como controle de especificidade dos “primers”, para identificar amplificação inespecífica que poderia interferir nos resultados da RT- qPCR. 10.5 Quantificação relativa para estudos de expressão gênica- Método Delta Delta Ct (∆∆Ct) Duzentos ng do cDNA, 400 nM “primers” e, 6,25 µL do reativo “SYBR Green PCR Master Mix” (“Applied Biosystems”) foram utilizados na reação de RT-qPCR, num volume final de 25 µL, no aprelho de PCR em tempo real modelo 7500 (“Applied Biosystems”), usando o programa “default” do termociclador. As reações foram realizadas em triplicata para cada um dos genes e para o endógeno. A quantificação relativa foi calculada pelo método Delta delta Ct (∆∆Ct) para todos os primers validados pela eficiência de amplificação e curvas de dissociação, utilizando-se o gene endógeno NuoA para a normalização, e, a variedade Pera como calibrador. 41 Foram calculados os Log2 da Ração entre o valor da expressão relativa (ER) da cultivar Navelina ISA 315 e da Pera, partindo do Log10 da ER extraído do “software” SDS. Ambos, Log2 obtido pelo microarranjo e pela RT-qPCR, foram comparados. Do mesmo modo, foi calculado o número de vezes que um gene foi mais expresso em uma variedade do que na outra pelo RT-qPCR, e comparado com o número de vezes mais expresso que apresentou no microarranjo. Com esses valores, o Log2 (ER) e o número de vezes mais expresso (pela RT-qPCR e pelo microarranjo), foram construídos os gráficos das Figuras 18 e 19, respectivamente. Na Figura 18, pode-se observar o sentido da expressão gênica, ou seja, em qual planta foi diferencialmente expresso. VI. RESULTADOS 1. Análises Estatísticas Foram identificados 400 genes como diferencialmente expressos, definindo um limiar de 1,0 Log FC (logaritmo do “fold change”, ou seja, logaritmo da razão entre o sinal do experimento/controle), para identificar sinais baixos, mas que poderiam ser biologicamente significativos. Portanto, os genes com valores superiores a LogFC=1 foram considerados induzidos na cultivar Navelina ISA 315, enquanto os valores menores que -1 foram considerados diferencialmente expressos na variedade Pera. O gráfico da Figura 4 apresenta os dados normalizados e a dispersão destes em cada uma das três lâminas pelo método “loess”, utilizando-se o programa R (pacote Limma). Na Figura 5, podem-se observar os gráficos do teste T de “Students” e o “Vulcano plot”. 42 Figura 4: Dados normalizados por meio do programa R (www.r-project.org), pelo método “loess”, usando-se o pacote limma (http// bioconductor.org/packages/2.4/bioc/html/limma.html). Figura 5: Testes estatísticos (Programa R) Genes diferencialmente expresssos em função do valor de LogFC (Fold change) (LogFC). a) Teste “students”; b) Gráfico volcano: Logaritmo da probabilidade em função do LogFC. http://www.r-project.org/ 43 2. Busca de informação dos genes potenciais candidatos à patogenicidade Os 400 genes diferencialmente expressos foram distribuídos nas categorias funcionais, e estas foram analisadas em função do número de genes de cada subcategoria, para cada condição biológica (dentro das variedades Pera e cultivar Navelina ISA 315) (Figuras 6 e 7) Posteriormente à busca de informação dos 400 genes na base de dados do Genoma da X. fastidiosa, à luz dos valores de LogFC e da literatura, foram selecionados alguns genes para a discussão dentre as distintas categorias funcionais, segundo a literatura, pelo possível envolvimento na virulência, e a informação da base de dados, transcrita no Apêndice. Sua implicação na patogenicidade foi posteriormente tratada em função da expressão gênica obtida neste experimento. Do mesmo modo, alguns desses genes foram escolhidos para a análise de validação por RT-qPCR. 3. Perfil Global de expressão gênica Genes diferencialmente expressos foram achados dentro das oito categorias oficiais descritas no site http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf/, nas duas variedades. Só um gene diferencialmente expresso na variedade Pera apresentou-se na nona categoria: “ORFs de categoria indefinida”, mas, como este foi descrito como uma proteína integral de membrana passou-se para a categoria IV “Estruturas celulares”, para uma melhor visualização gráfica. Como pode-se observar na Figura 6, a maior percentagem de genes diferentialmente expressos da bactéria nas duas variedades foi achada para a categoria VIII (Proteínas hipotéticas), 47,5%. http://aeg.lbi.ic.unicamp.br/xf/ 44 Figura 6: Porcentagem que os genes diferencialmente expressos de cada categoria funcional representam dos 400 genes diferencialmente expressos nas duas variedades. Dentre os genes analisados, aproximadamente 15,4% (400 genes) foram diferencialmente expressos: 249 genes (62,25 %) apresentaram-se induzidos na variedade suscetível Pera, e 151 genes (37,75%) na variedade assintomática cultivar Navelina ISA 315. Na figura 7, pode-se observar que quando a bactéria infecta a variedade suscetível Pera, expressa maior número de genes do que dentro da planta assintomática cultivar Navelina ISA 315 em todas as categorias descritas. 45 Figura 7: Número de genes diferencialmente expressos por categoría funcional. (I: Metabolismo intermediário; II: Biossíntese de pequenas moléculas; III: Metabolismo de Macromoléculas; IV: Estrutura Celular; V: Processos celulares; VI: Elementos genéticos móveis; VII: Patogenicidade, virulência e adaptação; VIII: Hipotéticos). Na Tabela 1 do Apêndice, apresentam- se os 400 genes de expressão diferencial (ID, nome do gene, LogFC e produto gênico) seguidos dos nomes das categorias de genes descritas, e o número de genes total identificado no genoma para cada uma delas. Pode-se observar o número de genes total identificado em cada categoria ou subcategoria, assim como aqueles que foram diferencialmente expressos na Pera e na Navelina. Genes diferencialmete expressos foram achados para todas as categorias descritas, em algumas das respectivas subcategorias. Após a descrição das categorias, foi transcrita a informação obtida na página web do Genoma da X. fastidiosa para os genes que foram tratados na discussão. 46 Finalmente, as Figuras do Apêndice: A1, A2, A3, A4, A5, A6 e A7, permitem visualizar a extensão da expressão gênica, expressada em LogFC, nas duas condições para as categorias mencionadas, o que facilita a análise e apresenta o perfil global da expressão gênica dos distintos processos vinculados à patogenicidade. Pode-se confirmar a eficiência do microarranjo padronizado para a linhagem 9a5c na hibridização de distintas linhagens de Xylella fastidiosa; já que todos os genes impressos no microarranjo hibridaram com as linhagens de X. fastidiosa presentes nas duas variedades (Pera e Navelina) coletadas no campo. Por sua vez, os controles negativos das hibridações com as plantas sadias, não apresentaram hibridação (somente fluorescencia de base), confirmando que a hibridação obtida no microarranjo para a Navelina e para a Pera é da X. fastidiosa, e, não representa uma hibridação inespecífica com o genoma da planta. 4. Genes da categoria VII: Patogenicidade, virulência e adaptação Genes diferencialmente expressos da categoria VII: Patogenicidade, virulência e adaptação, foram classificados dentro das respectivas subcategorias: produção de toxinas e detoxificação, exopolissacarídeos, proteínas de superfície, adaptação e condições atípicas e outros (Figura 8). Pode-se observar, na Figura 8, que todas as subcategorias incluem mais genes diferencialmente expressos na Pera, com exceção da subcategoria “proteínas de superfície”. Quatro genes foram diferencialmente expressos na cultivar Navelina ISA 315, na subcategoria “producção de toxinas e detoxificação”, codificando para a dimetiladenosine transferase, catalase/peroxidase, peptídeo sintase e proteína beta-lactamase. Na Pera, os valores mais altos de logFC foram 47 ac