RESSALVA Atendendo a solicitação da autora, o texto completo desta dissertação será disponibilizado a partir de 16/03/2025. 2022 SARAH DE OLIVEIRA MARCO AVELINO AVALIAÇÃO DO EFEITO DO RECOBRIMENTO DOS BIOVIDROS BIOK E 45S5 NA SUPERFÍCIE DE IMPLANTES DE ZIRCÔNIA: estudo in vitro e in vivo São José dos Campos 2022 SARAH DE OLIVEIRA MARCO AVELINO AVALIAÇÃO DO EFEITO DO RECOBRIMENTO DOS BIOVIDROS BIOK E 45S5 NA SUPERFÍCIE DE IMPLANTES DE ZIRCÔNIA: estudo in vitro e in vivo Dissertação apresentada ao Instituto de Ciência e Tecnologia, Universidade Estadual Paulista (Unesp), Campus de São José dos Campos, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRA pelo Programa de Pós-Graduação em CIÊNCIAS APLICADAS À SAÚDE BUCAL. Área: Biomateriais. Linha de pesquisa: Estudo da biocompatibilidade de novos materiais de uso médico-odontológico. Orientadora: Profa. Assoc. Luana Marotta Reis de Vasconcellos Coorientador: Prof. Dr. Tiago Moreira Bastos Campos Instituto de Ciência e Tecnologia [internet]. Normalização de tese e dissertação [acesso em 2023]. Disponível em http://www.ict.unesp.br/biblioteca/normalizacao Apresentação gráfica e normalização de acordo com as normas estabelecidas pelo Serviço de Normalização de Documentos da Seção Técnica de Referência e Atendimento ao Usuário e Documentação (STRAUD). Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca Prof. Achille Bassi e Seção Técnica de Informática, ICMC/USP com adaptações - STATI, STRAUD e DTI do ICT/UNESP. Renata Aparecida Couto Martins CRB-8/8376 Avelino, Sarah de Oliveira Marco Avaliação do efeito do recobrimento dos biovidros biok e 45S5 na superfície de implantes de zircônia: estudo in vivo e in vitro / Sarah de Oliveira Marco Avelino. - São José dos Campos : [s.n.], 2022. 60 f. : il. Dissertação (Mestrado) - Pós-Graduação em Ciências Aplicadas à Saúde Bucal - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos, 2022. Orientador: Luana Marotta Reis De Vasconcellos Coorientador: Tiago Moreira Bastos Campos 1. Osteogênese. 2. Osseointegração. 3. Zircônia. 4. Biovidro. I. De Vasconcellos, Luana Marotta Reis, orient. II. Campos, Tiago Moreira Bastos, coorient. III. Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia, São José dos Campos. IV. Universidade Estadual Paulista 'Júlio de Mesquita Filho' - Unesp. V. Universidade Estadual Paulista (Unesp). VI. Título. BANCA EXAMINADORA Profa. Assoc. Luana Marotta Reis de Vasconcellos (Orientadora) Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia São José dos Campos Profa. Assoc. Maria Aparecida Neves Jardini Universidade Estadual Paulista (Unesp) Instituto de Ciência e Tecnologia São José dos Campos Prof. Dr. Felipe Eduardo de Oliveira Universidade Braz Cubas Faculdade de Odontologia Mogi das Cruzes São José dos Campos, 17 de novembro de 2022. DEDICATÓRIA Aos meus pais, por terem me concedido o privilégio de estudar nas melhores condições possíveis do Maternal à Pós-Graduação. Mais do que a possibilitar tantos acessos, a educação tem um papel transformador único que nos concede autonomia, possibilidades de escolhas e de mudanças na vida, muito obrigada por essa herança preciosa. Todas as minhas conquistas (pessoais e profissionais) sempre serão nossas, nunca conseguirei retribuir à altura tudo que fizeram e fazem por mim. Amo vocês incondicionalmente. Ao Léo, que me acompanhou desde o início e foi peça fundamental para que esse trabalho acontecesse de uma forma menos pesada. Sem dúvidas, essa dissertação é nossa, sou eternamente grata pela parceria e disponibilidade que teve em me ajudar em todos os momentos que precisei, ser sua co-orientadora foi um presente pra mim. Tenho certeza que sua dedicação em tudo que faz te conduzirá à caminhos brilhantes. Conte sempre comigo. AGRADECIMENTOS À Deus, por ser meu sustento em todos os momentos, por tantas bênçãos a mim concedidas e por sempre guiar meu caminho. À minha família, pelo amor e apoio incondicionais em todos os momentos da minha vida. Mãe, pai, Felipe, amo vocês infinitamente, não consigo colocar em palavras tanto amor e gratidão. Estendo meus agradecimentos aos meus avôs e avós por serem bons exemplos e por me amarem tanto. Agradeço também as minhas tias e tios, por tudo que fizeram por mim, e por me darem meus primos que tanto amo. Minha família é a maior benção da minha vida. À minha orientadora, profa. Luana, sou extremamente grata pela oportunidade de aprender e trabalhar com alguém tão competente. Muito obrigada pela parceira que, por muitas vezes, foi além do profissional. Tenho imensa admiração e respeito por sua trajetória. Obrigada por tudo ao longo desses 6 anos trabalhando juntas, sempre me lembrarei de você com carinho. Ao Léo, meu querido aluno co-orientado, a quem também dedico esse trabalho e sou imensamente grata. Muito obrigada por me ajudar em todos os momentos que precisei. É um privilégio poder trabalhar com pessoas comprometidas, competentes e determinadas como você. Te desejo a colheita de tantos bons frutos que vem plantando em sua jornada. Mais do que um bom profissional, você já é uma excelente pessoa, e isso é o que mais importa. Ao meu co-orientador, Tiago, pela parceria importante ao desenvolvimento desse trabalho. Obrigada pelo o que me ensinou nesse período de convivência e por ter me permitido enxergar outras possibilidades. Às minhas amigas da vida: Luana, Lenira, Gabriela Trindade, Júlia, Gabriella Azevedo, Ana Gabriele, Bia Mendes, Bia Carreira, Giovanna Lotto, Giovanna Saroli, Thamires, Thayná Brito, Thayná Lemos e Larissa, por terem incansavelmente me ouvido e apoiado durante essa fase (e em tantas outras). Não sei o que seria de mim sem vocês, sou infinitamente grata por nosso encontro. Obrigada pela paciência e por tanto amor. Desejo de todo o coração que possamos estar sempre juntas. Às pessoas especiais que entraram em minha vida nesse período difícil, e que indiretamente me ajudaram muito, tornando essa fase mais leve, dividindo bons momentos, boas conversas, e me fazendo mais feliz: Ricardo, Stephanie, Vitória, Flávia, Verônica, Raíssa, muito obrigada. Ter vocês comigo me deu ânimo e alegria para fazer o que precisava ser feito. Às amigas que o mestrado me deu, em especial à Marina, que foi meu braço direito em muitos dias de laboratório e biotério, sempre pronta para me ajudar, ouvir e compartilhar bons momentos. Obrigada Ma, teria sido muito mais difícil sem você. Estendo os agradecimentos à Bia e Tainá, que dividiram a graduação e o mestrado comigo. Foi uma alegria enorme ter me aproximado ainda mais de vocês. À todos os orientados da professora Luana, pela ótima convivência que tivemos e por toda ajuda e suporte no desenvolvimento dessa pesquisa. Trabalhar com um grupo comprometido, responsável e leve faz toda diferença. Juliani, Mari, Ju Lupp, Thays, Bia, Júlia, Vini, Hugo, Léo: muito obrigada por tudo que compartilhamos, vou sempre me lembrar com muito carinho de cada um de vocês. Ao ICT-UNESP São José dos Campos, por ter sido minha casa por quase 7 anos, me oportunizando ter uma profissão e acesso à educação pública e de extrema qualidade. Sou muito feliz por ter escolhido essa instituição e me orgulho muito de minha formação. Ao programa de pós-graduação em Ciências Aplicadas à Saúde Bucal (CASB) e todos os seus funcionários técnico-administrativos e docentes que me acompanharam ao longo do mestrado. Todos vocês foram essenciais para que essa dissertação acontecesse. Agradeço em especial à Carla, ao Sérgio e ao André pelo suporte em todos os momentos que precisei. Ao Instituto de Ciência e Tecnológica (ITA) pela parceria que firmamos, disponibilidade de utilização dos laboratórios e equipamentos, fundamentais para realização desse trabalho. Estendo o agradecimento ao professor Gilmar Tim, que gentilmente me acolheu e cedeu todos esses espaços. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (Capes), pela concessão de bolsa no período de Agosto de 2021 à Agosto de 2022. À todos os animais utilizados nessa pesquisa, minha sincera gratidão. "Faça o melhor que você pode, nas condições que você tem, enquanto não tiver condições de fazer melhor ainda". Mario Sérgio Cortella RESUMO Avelino SOM. Avaliação do efeito do recobrimento dos biovidros biok e 45s5 na superfície de implantes de zircônia: estudo in vitro e in vivo [dissertação]. São José dos Campos (SP): Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Ciência e Tecnologia; 2022. O estudo avaliou o efeito do recobrimento de biovidros 45S5 e bioK na superfície de implantes de zircônia na osteogênese in vitro e na osseointegração in vivo. Para isso, foram confeccionadas amostras de zircônia T (Tosho, Japão) que foram divididas em 3 grupos: zircônia polida (Z); zircônia recoberta com biovidro 45S5 (45); zircônia recoberta com biovidro biok (bk). As amostras produzidas para os testes de caracterização e etapa in vitro mediram 6,0 x 4,0 mm, enquanto que para a etapa in vivo apresentaram 2,5x 2,5mm de altura. Após a produção, a morfologia das superfícies das amostras foi analisada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) e estas foram submetidas ao teste de rugosidade média (Ra). Posteriormente à caracterização, as amostras foram submetidas aos testes biológicos in vitro e in vivo. Na etapa in vitro células mesenquimais obtidas de fêmures de ratos foram isoladas e plaqueadas com as amostras visando avaliar a influência destas na morfologia, atividade e diferenciação celular de osteoblastos, utilizando os testes biológicos de citotoxicidade, avaliação do conteúdo de proteína total, atividade da fosfatase alcalina e formação de nódulos de mineralização. Na etapa in vivo 18 ratos foram submetidos à cirurgia para colocação dos implantes nas tíbias direitas e esquerdas, os quais receberam implantes do mesmo material, conforme os grupos descritos acima. Os animais foram eutanasiados após 4 semanas do procedimento cirúrgico. As tíbias direitas foram submetidas à análise histológica e histomorfométrica, enquanto as tíbias esquerdas foram submetidas ao teste de push out. Com os resultados in vitro pudemos observar que os grupos experimentais não foram citotóxicos, propiciaram um ambiente adequado à atividade e diferenciação celular, e ainda permitiram o espraiamento celular sobre as amostras. Não foram observadas diferenças estatisticamente significantes entre os grupos experimentais nas análises in vivo. Concluiu-se que os recobrimentos nos implantes de zircônia com os biovidros 45S5 e biok foram produzidos adequadamente e permitiram a atividade e diferenciação celular, bem como neoformação óssea ao redor dos implantes. Novos estudos devem ser realizados para fornecer informações adicionais sobre o comportamento do recobrimento dos biovidros na superfície de implantes de zircônia. Palavras-chave: osteogênese; osseointegração; zircônia; biovidro. ABSTRACT Avelino SOM. Evaluation of the effect of coating biok and 45S5 bioglasses on the surface of zirconia implants: in vitro an in vivo study. [dissertation]. São José dos Campos (SP): São Paulo State University (Unesp), Institute of Science and Technology; 2022. The study evaluated the effect of bio-glass 45S5 and bioK coating on zirconia implant surfaces on in vitro osteogenesis and in vivo osseointegration. For this purpose, zirconia T (Tosho, Japan) samples were made and divided into 3 groups: polished zirconia (Z); zirconia coated with bioglass 45S5 (45); zirconia coated with biok (bk). The samples produced for the characterization tests and in vitro stage measured 6.0 x 4.0 mm, while for the in vivo stage they were 2.5x 2.5 mm in height. After production, the surface morphology of the samples was analyzed by scanning electron microscopy (SEM) and they were submitted to the average roughness test (Ra). After characterization, the samples were submitted to in vitro and in vivo biological tests. In the in vitro stage mesenchymal cells obtained from rat femurs were isolated and plated with the samples to evaluate their influence on osteoblast morphology, activity and cell differentiation, using the biological tests of cytotoxicity, total protein content, alkaline phosphatase activity and mineralization nodule formation. In the in vivo stage 18 rats underwent surgery to place the implants in the right and left tibiae, which received implants of the same material, according to the groups described above. The animals were euthanized 4 weeks after the surgical procedure. The right tibiae were subjected to histological and histomorphometric analysis, while the left tibiae were subjected to the push out test. With the in vitro results we could observe that the experimental groups were not cytotoxic, provided an adequate environment for cell activity and differentiation, and also allowed cell spreading over the samples. No statistically significant differences were observed between the experimental groups in the in vivo analyses. It was concluded that the coatings on zirconia implants with 45S5 and biok bioglass were adequately produced and allowed cell activity and differentiation, as well as bone neoformation around the implants. Further studies should be carried out to provide additional information on the coating behavior of bio glasses on the surface of zirconia implants. Keywords: osteogenesis; osseointegration; zirconia; bioglass. SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 12 2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 14 3 PROPOSIÇÃO ....................................................................................................... 18 4 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 19 4.1 Confecção das amostras e dos implantes ...................................................... 19 4.2 Caracterização das amostras ........................................................................... 21 4.3 Experimentos in vitro ........................................................................................ 22 4.3.1 Isolamento e cultura de células mesequimais ............................................ 22 4.3.2 Determinação da viabilidade celular ............................................................ 22 4.3.3 Análise do conteúdo de proteína total ......................................................... 22 4.3.4 Atividade de fosfatase alcalina .................................................................... 22 4.3.5 Análise de formação de nódulos de mineralização .................................... 22 4.4 Experimentos in vivo com modelo experimental proposto ........................... 22 4.4.1 Animais ............................................................................................................ 27 4.4.2 Cirurgia de confecção dos defeitos ósseos ................................................. 27 4.5 Metodologia de análises ................................................................................... 27 4.5.1 Teste de push out ........................................................................................... 27 4.5.2 Análise histológica e histomorfométrica ...................................................... 31 4.5.3 Análise estatística .......................................................................................... 32 5 RESULTADO ......................................................................................................... 33 5.1 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) .................................................... 33 5.2 Análise de rugosidade superficial.................................................................... 36 5.3 Ensaios biológicos in vitro ............................................................................... 37 5.3.1 Determinação da viabilidade celular ............................................................. 37 5.3.2 Conteúdo de proteína total ............................................................................ 38 5.3.3 Análise de fosfatase alcalina ......................................................................... 39 5.3.4 Formaçao de nódulos de mineralização ....................................................... 40 5.4 Análise histológica ............................................................................................ 41 5.5 Análise histomorfométrica ............................................................................... 43 5.6 Teste de push out .............................................................................................. 44 6 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 46 7 CONCLUSÃO ........................................................................................................ 50 REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 51 ANEXO ...................................................................................................................... 59 50 7 CONCLUSÃO Baseado nos resultados acima descritos pôde-se concluir que os recobrimentos de implantes de zircônia com os biovidros 45S5 e biok foram produzidos adequadamente. Nas etapas biológicas in vitro e in vivo observou-se que todas as amostras permitiram a atividade e diferenciação celular, bem como neoformação óssea ao redor dos implantes. Contudo, novos estudos com ênfase na propriedade mecânica e diferentes períodos de análise de neoformação óssea podem fornecer informações adicionais sobre o comportamento do recobrimento dos biovidros na superfície de implantes de zircônia. 51 REFERÊNCIAS Aguilar-Reyes EA, León-Patiño CA, Jacinto-Diaz B, Lefebvre L-P. Structural Characterization and Mechanical Evaluation of Bioactive Glass 45S5 Foams Obtained by a Powder Technology Approach. J Am Ceram Soc. 2012;95(12):3776– 80. doi:10.1111/j.1551-2916.2012.05465.x. Albulescu R, Popa AC, Enciu AM, Albulescu L, Dudau M, Popescu ID, et al. Comprehensive In Vitro Testing of Calcium Phosphate-Based Bioceramics with Orthopedic and Dentistry Applications. Materials (Basel). 2019 Nov 10;12(22):3704. doi: 10.3390/ma12223704. PMID: 31717621; PMCID: PMC6888321. 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