UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA E MOLECULAR DA RAIVA EM BOVINOS NO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL Gislaine Raquel Santos Médica Veterinária 2016 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA E MOLECULAR DA RAIVA EM BOVINOS NO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL Gislaine Raquel Santos Orientadora: Profa. Dra. Adolorata Aparecida Bianco Carvalho Coorientador: Prof. Dr. Daniel Figuglietti Brandespim 2016 Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutora em Medicina Veterinária, área de Medicina Veterinária Preventiva. Santos, Gislaine Raquel S237 Caracterização epidemiológica e molecular da raiva em bovinos no Estado de Pernambuco, Brasil. / Gislaine Raquel Santos. – – Jaboticabal, 2016 xviii, 60 p. : il ; 29 cm. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2016 Orientador: Adolorata Aparecida Bianco Carvalho Banca examinadora: Luís Antonio Mathias, Maria da Glória Buzinaro, Fumio Honma Ito, Darci Lara Perecin Nociti Bibliografia 1. Epidemiologia. 2. Filogenia. 3. Herbívoros. 4. Lyssavirus. 5. Raiva. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 619:614.4:636.2 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR Gislaine Raquel Santos – Nascida em Esperança/PB, no dia 25 de outubro de 1977, graduou-se em Medicina Veterinária pela Universidade Federal de Campina Grande (UFCG) – Câmpus de Patos, em setembro de 2004. Trabalhou na Agência de Defesa Sanitária do Estado de Rondônia (IDARON), durante o período de 2005 a 2008. Ingressou como Professora substituta na Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) – Unidade Acadêmica de Garanhuns (UAG), onde permaneceu durante o período de 2008 a 2011. Iniciou no ano de 2010 a especialização em Defesa Sanitária e Inspeção e Higiene de Alimentos de Origem Animal. Concluiu o curso de mestrado no Programa de Pós-graduação em Sanidade e Reprodução de Ruminantes na Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) – Unidade Acadêmica de Garanhuns (UAG) em dezembro de 2011 com a dissertação intitulada: Aspectos epidemiológicos da Leucose Enzoótica Bovina (LEB) em rebanhos bovinos leiteiros na microrregião Garanhuns do Estado de Pernambuco. Em março de 2012, iniciou o curso de Doutorado na área de Medicina Veterinária Preventiva no Programa de Pós-graduação em Medicina Veterinária, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Câmpus de Jaboticabal. “Mesmo quando tudo parece desabar, cabe a mim decidir entre rir ou chorar, ir ou ficar, desistir ou lutar; porque descobri, no caminho incerto da vida, que o mais importante é o decidir” Cora Coralina DEDICATÓRIA Dedico à minha família, que é o meu suporte, o meu referencial, o meu exemplo em todos os momentos da minha vida. É o amor de vocês que fortalece as minhas asas, fazendo-me alçar voos mais altos, acreditando, sonhando, buscando e tendo a certeza de que, quando eu precisar descansar, sempre terei o meu ninho para voltar. Obrigada por nunca me deixarem desanimar. Eu amo muito vocês!!! AGRADECIMENTOS A DEUS, que está ao meu lado em cada segundo do meu dia, iluminando os meus passos e mostrando sempre o melhor caminho a seguir. Aos meus pais, Alexandre e Carmita, por sempre acreditarem em mim, mesmo quando eu duvidava. O amor, a dedicação, o exemplo e a presença constante de vocês em minha vida é o que me fortalece, me dá coragem para lutar pelos meus sonhos e asas para voar. Á minha irmã Gilmara, por se fazer tão presente na minha vida, me acolhendo, me repreendendo quando necessário, mas acima de tudo me dando a certeza do seu amor incondicional e de que nunca, onde quer que eu esteja, estarei sozinha. Você é o meu amor maior. Ao meu irmão Max, à minha cunhada-irmã Débora e aos meus sobrinhos Eduarda e Guilherme, por sempre almejarem o meu sucesso e estarem sempre me envolvendo com o seu amor. Aos meus avós Lourival, Denise e Rita Daluz (in Memorian) e à minha Tia Margarida (in Memorian), que onde quer que estejam estão acompanhando os meus passos e desejando minha felicidade e sucesso. Saudades eternas. À minha orientadora, Adolorata Aparecida Bianco Carvalho, que me guiou por este caminho com paciência, dedicação e amizade. Conviver com a senhora me fez não só crescer profissionalmente, mas acima de tudo evoluir como ser humano. Com a senhora aprendi a cada dia a me tornar uma pessoa melhor. Tenho muito orgulho de ser sua “filha”. Muito Obrigada!! Ao meu coorientador, Daniel Friguglietti Brandespim, que me fez acreditar que era possível a realização deste sonho. Obrigada por sempre estar presente na minha vida, me aconselhando, ensinando, repreendendo, mas acima de tudo sendo meu amigo. Por mais que eu agradeça, nunca será o suficiente. Aos professores da Pós-graduação em Medicina Veterinária, pelo conhecimento compartilhado, pela atenção e paciência dedicada a cada dúvida. Em especial aos professores Luís Antônio Mathias, Maria da Glória Buzinaro, Samir Issa Samara, Luiz Augusto do Amaral e Antônio Sérgio Ferraudo, pela significativa contribuição a este trabalho. A vocês dedico o meu respeito, a minha admiração e a minha gratidão. Aos técnicos e funcionários do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva, em especial a Assis, Cidinha, Marisa, Andreia, Márcia e Roseane, pelo acolhimento, amizade, carinho e atenção. Vocês tornarem a minha caminhada mais leve. A Andressa, pelas orientações e preciosa colaboração nas análises moleculares. A meus irmãos de orientação, em especial a Fernanda Cassioli, Zé (José Honorato Begali) e Maurício Machado; no início tínhamos em comum apenas a mesma orientadora, com o tempo passamos a dividir as alegrias, os momentos difíceis, a torcer um pelo outro e nos tornamos amigos. Obrigada por tudo! À Heloísa Godoy e André Buzutti, poderia falar apenas de um e mesmo assim seriam dois, meus amigos, que se tornaram irmãos de vida. Sempre presentes, me ouvindo, aconselhando, acalmando, falando coisas que eu precisava ouvir e, acima de tudo, sendo meus amigos nos momentos difíceis e nos momentos felizes. O meu ciclo está acabando, mas o que me faz feliz é a certeza de que sempre terei vocês na minha vida. Muito Obrigada!!! À Glaucenyra Pinheiro, que foi umas das primeiras pessoas que conheci no Departamento. Naquela época ela me chamava de Marta, coisas da Glau, e eu não sabia que tinha encontrado uma irmã. Foram tantas emoções, alegrias, superações, despedidas, momentos difíceis compartilhados. E muitas, muitas gargalhadas. Hoje você não está mais em Jaboticabal, mas continua tão presente em minha vida. Obrigada por tudo!!! À Renata Ferreira dos Santos, como é bom ter você na minha vida. Você me dá paz, me faz pensar melhor e acreditar que eu posso e consigo. Sabe o que nunca te contei, que desde que te conheci, eu quis ser sua amiga. E não sabia ainda, a pessoa especial que você é, mas a minha intuição já sabia que logo eu reconheceria mais uma irmã. A sua amizade foi um dos grandes presentes que ganhei no Doutorado e vai seguir comigo por toda a vida. Obrigada por estar sempre tão presente. A todos aqueles a quem pude ter o privilégio de reconhecer como amigos, obrigada pelo carinho, pelos puxões de orelha, pelos sorrisos, pelo ombro amigo, por sempre estarem ao meu lado. Em especial a Thyago Lira, Sônia Amaro, Augusto Amaro, Lucília Machado, Agda Facincani, Vanja Gondim, Gustavo Claudiano, Fabiana Cirino, Edimar Soares, Jéssica Oliveira e Lucimara Borges. Aos amigos Daniele Araújo (Dani), Karla Alvarenga, Carolina Alvarenga Cruz, Eric Matheus, Paulo Eduardo Carrara (Poodle), por fazerem os meus dias mais felizes. À Universidade de Nihon, em especial ao Prof. Takuya e à Profa. Yuki Kobayashi, pelo carinho, atenção, conhecimento compartilhado e imensa contribuição na realização desta pesquisa. Ao Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento pela cessão do material biológico utilizado neste trabalho. Sem a contribuição de vocês, nada disso seria possível. A CAPES pelo apoio financeiro, sendo essencial na execução deste projeto. A todos que contribuíram, direta ou indiretamente, nesta etapa da minha vida. Levarei vocês sempre comigo. Muito obrigada! x SUMÁRIO Página RESUMO....................................................................................................... xii ABSTRACT................................................................................................... xiii LISTA DE ABREVIATURAS......................................................................... xiv LISTA DE QUADROS................................................................................... xvi LISTA DE TABELAS..................................................................................... xvi LSTA DE FIGURAS...................................................................................... xvii 1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 1 2. REVISÃO DE LITERATURA............................................................... 2 2.1. Etiologia.................................................................................... 2 2.1.1. Estrutura e propriedades do vírus da raiva (VR)............ 2 2.1.2. Características moleculares do vírus da raiva................ 3 2.2. Epidemiologia........................................................................... 5 2.3. Patogenia e sinais clínicos....................................................... 8 2.4. Diagnóstico............................................................................... 10 2.5. Controle e profilaxia................................................................. 11 2.6. Estudos moleculares................................................................ 12 3. OBJETIVOS........................................................................................ 15 3.1. Objetivo geral........................................................................... 15 3.2. Objetivos específicos............................................................... 15 4. MATERIAL E MÉTODOS.................................................................... 16 4.1. Área de estudo......................................................................... 16 4.2. Levantamento de dados e análise da distribuição temporal dos casos de raiva em bovinos................................................ 16 4.3. Distribuição espacial dos casos de raiva em bovinos.............. 17 4.4. Determinação da taxa de incidência e da sazonalidade da raiva em bovinos...................................................................... 17 4.5. Caracterização molecular do vírus da raiva............................. 18 4.5.1. Amostras de encéfalos utilizadas na caracterização molecular............................................................................... 18 xi 4.5.2. Reação de transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) para o gene N............... 19 4.5.3. Síntese de cDNA do gene N.......................................... 20 4.5.4. Sequenciamento............................................................. 21 4.5.5. Análise das sequências de DNA.................................... 21 4.5.6. Análise filogenética........................................................ 22 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................... 25 5.1. Distribuição temporal dos casos de raiva em bovinos.............. 25 5.2. Distribuição espacial dos casos de raiva em bovinos............... 26 5.3. Taxas de incidência e sazonalidade da raiva em bovinos....... 36 5.4. Taxa de incidência da raiva bovina por mesorregião................ 39 5.5. Análise filogenética do gene N.................................................. 40 5.5.1. Análise filogenética relacionada à distribuição geográfica.................................................................... 42 6. CONCLUSÃO..................................................................................... 45 7. REFERÊNCIAS................................................................................... 46 APÊNDICES 54 APÊNDICE A - População bovina do Estado de Pernambuco, Brasil, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012...... 55 APÊNDICE B - Alinhamento das sequências.......................................... 56 ANEXO - Documento de cessão do material biológico (Informação CRHE n. 15/2013 de 08/03/13).................................................................. 60 xii CARACTERIZAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA E MOLECULAR DA RAIVA EM BOVINOS NO ESTADO DE PERNAMBUCO, BRASIL RESUMO - A raiva é uma antropozoonose de evolução letal causada por vírus do gênero Lyssavirus. É uma das doenças infecciosas responsáveis por causar prejuízos aos produtores rurais, levando a impactos econômicos significativos no agronegócio. Objetivou-se com o presente trabalho determinar o perfil epidemiológico da raiva em herbívoros no Estado de Pernambuco, Brasil, no período de 2007 a 2012. Foi realizado um estudo retrospectivo dos dados relativos aos casos positivos de raiva de herbívoros, levando em consideração o mês e o ano da ocorrência e a região geográfica. As análises moleculares foram desenvolvidas a partir de amostras de encéfalos provenientes das cinco Mesorregiões (Agreste, Mata, Sertão, Metropolitana e São Francisco) do Estado. No período estudado foram detectados 238 resultados positivos para o vírus da raiva em herbívoros, distribuídas espacialmente nas cinco mesorregiões, em 78 (42,1%) dos 185 municípios. Observou-se no decorrer do período uma diminuição significativa na taxa de incidência, com ausência de sazonalidade. Quando se analisou a taxa de incidência levando em consideração as Mesorregiões, observou-se que a Mata foi a que apresentou maior oscilação. Para complementar a análise epidemiológica, 16 amostras foram submetidas à técnica de RT-PCR para amplificação parcial do gene N. As sequências geradas foram alinhadas com sequências homólogas obtidas no GenBank para a construção da árvore filogenética, pelo método Bayesiana. Todas as amostras foram homólogas às sequências de vírus da raiva relacionadas à linhagem do morcego hematófago Desmodus rotundus. Diante dos resultados obtidos, constata-se que o vírus da raiva está presente em todo o Estado de Pernambuco, relacionado à linhagem do morcego hematófago Desmodus rotundus. Os focos de raiva em herbívoros estão distribuídos em graus diferenciados em todas as mesorregiões, porém não se constatou um aumento no número de casos que se repita de forma sistemática em uma mesma época do ano, indicando ausência de sazonalidade. Observou-se, também, uma significativa diminuição da incidência no decorrer do período estudado. Esse panorama enfatiza a importância da contínua realização das atividades de prevenção e controle pela Vigilância Agropecuária. Palavras-chave: epidemiologia, filogenia, herbívoros, Lyssavirus, raiva xiii EPIDEMIOLOGICAL AND MOLECULAR CHARACTERISTICS OF RABIES IN CATTLE IN THE STATE OF PERNAMBUCO, BRAZIL. ABSTRACT –- Rabies is an anthropozoonosis with lethal evolution caused by genus lyssavirus viruses. It is one among infectious diseases who are responsible for causing losses to farmers, leading to a significant economic impacts on agribusiness. The objective of this study was to determine the epidemiological profile in herbivores whithin the State of Pernambuco, Brazil, from 2007 to 2012. A retrospective study was conducted based on data from positive cases of rabies of herbivores, considering the month, the year of occurrence and geographic region. The molecular analyzes were developed using brain samples from the five Mesoregions (Agreste, Mata, Sertão, Metropolitana and São Francisco) within the State. During the study period, were detected positive for rabies 238 from herbivores, spatially distributed in 78 (42.1%) of 185 municipalites from the five mesoregions. It was observed, during the period cited, a significant decrease in the incidence rate, with no seasonal nature. While analyzing the incidence rate considering the mesoregions, the Mata region showed the greatest oscillation. As a complement to the epidemiological analysis, 16 samples were subjected to RT-PCR for the partial amplification of the gene N. The generated sequences were aligned with homologous sequences obtained from the GenBank to build the phylogenetic tree by bayesian method. On the results, it was found that the rabies virus is present all over the state of Pernambuco, related to the lineage of vampire bat Desmodus rotundus. The rabies outbreaks in herbivores are distributed in different degrees throughout the mesoregions but it was not found an increase in cases numbers that repeats systematically during the same time of the years, indicating, therefore, the absence of seasonality. It was observed also a significant decrease in incidence over the studied period. This scenario emphasizes the importance of continued prevention and control activities by the Agricultural Surveillance. Keywords: epidemiology, herbivores, Lyssavirus, phylogeny, rabies xiv LISTA DE ABREVIATURAS ABLV Australian bat virus ADAGRO Agência de defesa e fiscalização agropecuária ARAV Aravan virus BBLV Bokeloh bat virus cDNA DNA complementar DNA Ácido dexoxirribonucleico DUW Duvenhage virus EBLV-1 European bat vírus-1 EBLV-2 European bat vírus-2 ELISA Ensaio imunoenzimático G Glicoproteína IC Inoculação em Camundongos ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IFD Imunofluorescência direta IKOV Ikoma lyssavirus IRKV Irkut virus KHUV Khujand virus LANAGRO Laboratório nacional agropecuário LBV Lagos bat virus M Proteína de Matriz xv MAPA Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MOKV Mokola virus N Nucleoproteína OIE World organization for animal health/ Organização Mundial de Saúde Animal P Fosfoproteína PNCRH Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros RABV Rabies virus RFFT Teste de inibição rápida de focos fluorescentes RNA Ácido ribonucleico rpm Rotação por minuto RT-PCR Reação em cadeia de polimerase por transcrição reversa SBV Shimoni bat virus SNC Sistema Nervoso Central TE Tris-Acetato-EDTA VR Vírus da raiva WHO/OMS World Health Organization/ Organização Mundial de Saúde µL Microlitro μM Micromolar xvi LISTA DE QUADROS Página 1. Espécies reconhecidas do gênero Lyssavirus. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), 2015…………………………………...... 04 2. Estudos de caracterização genética do vírus da raiva realizados no Brasil, nos anos de 2001 a 2014.............................................................. 13 3. Amostras de encéfalos de bovinos submetidas à caracterização molecular, de acordo com a procedência e o ano de isolamento, do Estado de Pernambuco, Brasil................................................................. 19 4. Primers utilizados para síntese de cDNA do gene N do vírus da raiva.......................................................................................................... 21 5. Primers utilizados no sequenciamento do gene codificador da proteína N do vírus da raiva................................................................................... 21 6. Sequências disponíveis no Genbank utilizadas para a construção da árvore filogenética, de acordo com o número de acesso e local de isolamento (município/Estado, espécie, animal e ano)............................ 23 LISTA DE TABELAS Página 1. Número de casos de raiva bovina diagnosticados pelo LANAGRO, período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil.................................................................................. 25 2. Distribuição dos focos de raiva bovina, por mesorregiões, no período de 2007 a 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil................................. 35 3. Taxa de incidência (por 1.000.000) de raiva bovina, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil......................................................................................................... 36 4. Médias móveis trimestrais da taxa de incidência mensal (por 1.000.000) de raiva bovina, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil............................................. 37 5. Taxa de incidência (por 100.000.000) de raiva bovina, de acordo com a mesorregião e o ano de ocorrência, no período de 2007 a 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil................................................................. 39 xvii LISTA DE FIGURAS Página 1. Distribuição espacial das mesorregiões do Estado de Pernambuco, Brasil, indicando a origem das amostras utilizadas no presente estudo.................................................................................................. 16 2. Distribuição espacial dos focos de raiva em bovinos, por mesorregiões, no Estado de Pernambuco, Brasil, no período de 2007 a 2012......................................................................................... 27 3. Distribuição espacial dos casos de raiva em bovinos, por municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil,.no período de 2007 a 2012..................................................................................................... 27 4. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2007.......................... 28 5. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2007............................................................................................... 28 6. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2008............................ 29 7. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2008................................................................................................ 29 8. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2009............................ 30 9. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2009............................................................................................... 30 10. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2010............................ 31 11. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, ano de 2010..................................................................................................... 31 xviii 12. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2011............................ 32 13. Distribuição espacial do número de casos positivos de raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2011 ............................................................................................... 32 14. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2012........................... 33 15. Distribuição espacial do número de casos de raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2012......... 33 16. Concentração de casos de raiva na superfície, de acordo com mesorregião e municípios do Estado de Pernambuco, Brasil, no período de 2007 a 2012...................................................................... 34 17. Taxa de incidência (por 1.000.000) de raiva bovina no Estado de Pernambuco, Brasil, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012..................................................................................................... 36 18. Médias móveis trimestrais da taxa de incidência mensal (por 1.000.000) de raiva bovina, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil....................... 38 19. Árvore filogenética bayesiana obtida pelo alinhamento das sequências parciais do gene N de vírus da raiva provenientes do Estado de Pernambuco e das sequências virais depositadas no GenBank.............................................................................................. 44 1 1. INTRODUÇÃO A raiva é uma enfermidade de evolução letal que compromete principalmente o Sistema Nervoso Central (SNC), causada por um vírus do gênero Lyssavirus e considerada uma das antropozoonoses de maior importância mundial. Embora seja conhecida desde a antiguidade, ainda é considerada como uma doença negligenciada, gerando elevados custos sociais e econômicos. No Brasil, a raiva dos herbívoros representa um grave problema e é considerada endêmica em todas as regiões do país, causando prejuízos aos produtores rurais e levando a impactos econômicos significativos para o agronegócio. A ocorrência da enfermidade está relacionada à população do morcego hematófago Desmodus rotundus, considerado o principal ator na manutenção da enfermidade no ambiente rural, e às condições que favoreçam a sua manutenção, como oferta de alimento, abrigos, variações climáticas e características topográficas e hidrográficas. O Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros (PNCRH) prevê ações para o controle das populações de morcego e a vacinação dos rebanhos, além de educação sanitária, em todos os estados brasileiros. No Estado de Pernambuco, a responsabilidade pela execução do PNCRH é da Agência de Defesa e Fiscalização Agropecuária (ADAGRO). Embora a Agência informe sobre a ocorrência da raiva em herbívoros no Estado, não existem estudos que avaliem sua incidência e distribuição. Este fato é agravado se forem consideradas as subnotificações, devido à falta de conhecimento por parte dos produtores e às falhas na vigilância epidemiológica. Considerando a importância da raiva dos herbívoros na cadeia produtiva e para a saúde pública, e pelo fato de o Estado de Pernambuco ocupar o oitavo lugar na produção de leite, no ranking nacional, a presente pesquisa propôs realizar uma caracterização epidemiológica que forneça informações fidedignas para se entender a real situação da raiva nesse Estado e, consequentemente, fornecer subsídios às tomadas de decisão para o estabelecimento de uma correta vigilância epidemiológica e de adequadas estratégias de prevenção. 2 2. REVISÃO DE LITERATURA A raiva é uma enfermidade infecciosa conhecida e estudada desde a antiguidade. É de distribuição cosmopolita, mundialmente endêmica, de evolução aguda, com capacidade de infectar todos os mamíferos e que compromete, principalmente, o Sistema Nervoso Central (SNC). 2.1. Etiologia O agente etiológico da raiva é um vírus da ordem Mononegavirales, família Rhabdoviridae, gênero Lyssavirus (ICTV, 2015). 2.1.1. Estrutura e propriedades do vírus da raiva (VR) O VR tem cerca 130-180 nm de comprimento e entre 70-85 nm de diâmetro, com o formato de um cilindro e composto por ribonucleocapsídeo e envelope. O ribonucleocapsídeo contém o genoma não segmentado de RNA fita simples, com polaridade negativa (BANERJEE, 1987), e três proteínas: a N, uma nucleoproteína associada ao RNA viral; a proteína L, uma RNA-polimerase RNA dependente; e a proteína P (a proteína NS ou M1), uma fosfoproteína. O envelope é composto pelas proteínas G, uma glicoproteína que se projeta na parte externa do virion, e M ou M2, que é uma proteína de matriz. Dentre as proteínas, destacam-se a glicoproteína (G) e a nucleoproteína (N), que funcionam como antígenos principais e são os alvos da maioria dos estudos de epidemiologia molecular (NADIN-DAVIS et al., 1998; RUPPRECHT et al., 2002; RODRIGUEZ et al., 2007; KOTAIT et al., 2009). A proteína G forma as espículas que se projetam na superfície da partícula viral, possui a capacidade de induzir a produção de anticorpos neutralizantes e é responsável pela adsorção às células do hospedeiro; qualquer variação no gene que a codifica afetará a imunogenicidade, a patogenicidade e o neurotropismo do vírus. A proteína M mantém a ligação entre o envelope e o nucleocapsídeo (BANERJEE,1987; RODRIGUEZ et al., 2007). 3 A nucleoproteína, principal componente interno do virion, é constituída por 450 aminoácidos e peso molecular de aproximadamente 57.000 daltons. A proteína N está presente em grande quantidade na célula infectada, sendo responsável pela transcrição, replicação e encapsidação do RNA (BANERJEE,1987; RODRIGUEZ et al., 2007), além de ser a região mais conservada e fortemente expressa (BOURHY et al., 1993). O vírus da raiva é sensível a solventes lipídicos e detergentes. É inativado a temperaturas altas, sendo destruído a 50⁰C durante 15 minutos. É sensível à luz solar, ao dessecamento, aos raios ultravioleta e aos extremos de pH. Mantém-se estável a 4ºC por dias e a -70⁰C ou temperaturas mais baixas, durante anos (BATISTA et al., 2007; BRASIL, 2008; RODRIGUEZ et al., 2007). 2.1.2. Características moleculares do vírus da raiva A diversidade genética entre os membros do gênero Lyssavirus foi avaliada em estudo de Badrane et al. (2001) utilizando o gene que codifica a glicoproteína G envolvida na interação vírus-hospedeiro, na patogenicidade e na imunogenicidade. A análise filogenética distinguiu sete genotipos: 1–Rabies virus (RABV), 2–Lagos Bat virus (LBV), 3-Mokola virus (MOKV), 4-Duvenhage virus (DUVV), 5-European bat Lyssavirus tipo 1 (EBLV-1), 6-European bat Lyssavirus tipo 2 (EBLV-2) e 7- Australian bat Lyssavirus (ABLV). O estudo de imunogenicidade demonstrou que a vacina que imuniza contra os genótipos 1, 4, 5, 6 e 7 não imuniza contra o 2 e o 3, propondo que os genotipos poderiam ser divididos em dois principais filogrupos. Outros genotipos vem sendo estudados, ora denominados “espécies” pelo Comitê Internacional de Taxonomia Viral (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV). No ano de 2015 o gênero Lyssavirus apresentava 14 espécies (Quadro 1) (ICTV, 2015). A OMS e a OIE consideraram como raiva apenas a doença causada pela espécie 1, classificando as demais como “encefalites relacionadas”, e como “aparentados” os vírus pertencentes às outras espécies (WHO, 2008). Dentro de uma espécie viral, o vírus da raiva (VR) pode ser classificado em variantes a partir de suas diferenças genéticas e antigênicas. Essas variantes permanecem estáveis quando infectam hospedeiros de uma mesma espécie animal; 4 quando a transmissão do vírus ocorre entre hospedeiros de espécies diferentes, que não são consideradas como reservatórios naturais da enfermidade, o vírus sofre mutações, o que é denominado de spillover (RUPPRECHT et al., 2002). Esse contato entre espécies animais pode levar à formação de uma nova variante do vírus (CARNIELI JR et al., 2006; KOBAYASHI et al., 2007a). Quadro 1. Espécies reconhecidas do gênero Lyssavirus. International Committee on Taxonomy of Viruses (ICTV), 2015 Espécies Abreviações Origem Geográfica Reservatório Rabies Virus RABV Distribuição Mundial Carnívoros e morcegos Lagos-Bat-Virus LBV África Morcegos frugívoros (Megacharopter ) Mokola-Virus MOKV África (Nigéria) Mussaranhos Duvenhage-Virus DUVV África Morcego insetívoro European Bat Lyssavirus 1 EBLV1 Europa Morcego insetívoro (Eptesicus serotinus) European Bat Lyssavirus 2 EBLV2 Europa Morcego insetívoro (Myotiis sp.) Australian Bat Lyssavirus ABLV Austrália Morcego insetívoro (Megachiropter) e frugívoro (Microchiropter) Aravan virus ARAV Ásia Central (Quirguistão) Morcego insetívoro (Myotis blythi) Khujand virus KHUV Ásia Central (Tadjiquistão) Morcego insetívoro (Myotis mystacinus) Irkut virus IRKV Sibéria Ocidental Morcego insetívoro (Murina leucogaster) West Caucasian bat virus WCBV Região do Cáucaso Morcego insetívoro (Miniopteros schreibersi) Shimoni bat virus SBV África (Kênia) Morcego insetívoro (Hipposideros commersoni) Bokeloh bat lyssavirus BBLV Alemanha Morcego insetívoro (Myotis Nattereri) Ikoma lyssavirus IKOV África Mamífero (Civetticus civetta) 5 No Brasil, Favoretto et al. (2002) realizaram um estudo antigênico com amostras de animais domésticos, animais de produção, animais silvestres e humanos utilizando um painel de anticorpos monoclonais contra a nucleoproteína viral, e identificaram seis variantes antigênicas que foram compatíveis com o painel pré-estabelecido para tipificação de estirpes encontradas nas Américas: variante 2 (cão), 3 (Desmodus rotundus), 4 (Tadarida brasiliensis), 5 (morcego-vampiro da Venezuela), 6 (Lasiurus cinereus) e “Lab” (reagente a todos os anticorpos utilizados). Foram identificados também seis perfis não compatíveis com o painel utilizado. Estudos subsequentes identificaram novas variantes relacionadas a morcegos insetívoros, raposas (MORAIS et al., 2000; ITO, 2005; SILVA et al., 2011), saguis (FAVORETTO et al., 2001) e cachorro-do-mato (CARNIELI JR et al., 2009). 2.2. Epidemiologia O VR está presente em quase todo o mundo; as únicas exceções são o continente da Antártida e alguns países que erradicaram a enfermidade como Japão, Inglaterra, países escandinavos e Irlanda. Na América Latina, o vírus da raiva é encontrado em todos os países (BATISTA et al., 2007; RODRIGUEZ et al., 2007). Esse vírus se mantém na natureza em várias espécies de mamíferos, denominados reservatórios (RUPPRECHT et al., 2002) e, devido a grande variedade deles, a cadeia epidemiológica da raiva foi dividida em quatro ciclos inter- relacionados: o ciclo urbano, que apresenta como hospedeiros naturais os animais domésticos, representados pelos cães e gatos; o ciclo silvestre, no qual a transmissão ocorre entre diferentes espécies como raposa, lobo, macaco, gambá, raccoon-dogs, coiotes, guaxinis (ITO, 2005; BATISTA et al., 2007) e sagui (FAVORETTO et al., 2001); o ciclo rural, que envolve principalmente hospedeiros herbívoros e tem como principal transmissor o morcego hematófago; e o ciclo aéreo, representado pelos morcegos (KOTAIT et al., 1998). Os principais reservatórios do vírus da raiva são os carnívoros e os morcegos hematófagos (ITO et al., 2001), que foram identificados por meio da tipificação antigênica com anticorpos monoclonais como variante 2 (caninos) e variante 3 (morcegos hematófagos) (HEINEMANN et al., 2002). 6 Existem três espécies de morcegos hematófagos, as quais estão presentes apenas na América Latina: o Diaemus youngi, o Diphylla ecaudata e o Desmondus rotundos (SILVA; LANGONI, 2011). O Desmodus rotundus é considerado o principal responsável pela transmissão do VR no ambiente rural (GOMES, 2004). Esta espécie vive em colônias formadas por um macho alfa, várias fêmeas e seus filhotes, não é migratória, mas costuma mudar de abrigo. Sua taxa reprodutiva é baixa, gerando apenas um filhote por ano, mas não apresenta um período definido de reprodução, podendo gerar filhotes em qualquer época do ano (ALENCAR et al., 1994). De acordo com Gomes (2004), a maioria dos nascimentos ocorre nas estações mais quentes e chuvosas do ano. As fêmeas são as principais responsáveis pelo hábito de lamber outros indivíduos da colônia, dividindo o alimento e mantendo a integridade do grupo (BRASIL, 2009). Suas ações são noturnas e influenciadas pela claridade da lua (ALENCAR et al., 1994). Essa espécie de morcego tem uma preferência pelo sangue de herbívoros, e os bovinos e equinos são as espécies mais afetadas (MERINI et al., 2010). Devido aos seus hábitos, permanece por um longo período em um mesmo local, sendo, portanto, uma presa fácil (JOHNSON et al., 2014). Além disso, essa espécie de morcego tem o hábito de retornar todas as noites para se alimentar do mesmo animal. Assim, mesmo quando não ocorre a transmissão do vírus, os ataques dos morcegos aos herbívoros podem gerar um grave impacto econômico à pecuária devido ao estresse gerado nos animais, o que se reflete na sua produção, além dos danos ao couro devidos às lesões causadas pela espoliação (BRASIL, 2009). A raiva rural é endêmica em todas as regiões do país, porém sua ocorrência depende de variações definidas de acordo com cada região que está associada ao morcego hematófago, e sua distribuição está relacionada às variações climáticas e características topográficas e hidrográficas que afetam a ecologia dos morcegos (KOBAYASHI et al., 2006). A manutenção da raiva no ambiente rural está ligada a alguns fatores, como: aumento da oferta de alimento, representada pelo significativo crescimento dos rebanhos; ocupação desordenada, caracterizada por grandes modificações ambientais, como desmatamento, construção de rodovias e de hidroelétricas, que alteraram o ambiente em que os morcegos viviam, obrigando-os a procurar novas 7 áreas e outras fontes de alimentação; oferta de abrigos artificiais, representados pelas construções, como túneis, cisternas, casas abandonadas, bueiros, fornos de carvão desativados e outros (BRASIL, 2009). Nas primeiras décadas dos anos 2000 foram realizados estudos epidemiológicos com amostras suspeitas para a raiva em diferentes regiões do país: na região norte, Casseb et al. (2006) determinaram a ocorrência de casos de raiva, por meio do diagnóstico em 11.500 amostras de encéfalos de animais silvestres e domésticos no período de 2000 a 2004. Os resultados foram: 7,46% (704/9.448) de positividade em animais domésticos (cães e gatos); 32,25% (30/93) em bovídeos; 24% (6/25) em equinos; 16% (1/6) em suínos; e 0,12% (2/1670) em morcegos. Na região sul (Paraná), Patrício et al. (2009) realizaram um estudo epidemiológico em 460 amostras de encéfalos de herbívoros e detectaram 42,8% (191/460) de bovinos e 23% (3/13) de ovinos positivos para a enfermidade. Rissi et al. (2008) relataram a ocorrência da raiva em ovinos no Rio Grande do Sul; os casos ocorreram em uma área endêmica para raiva bovina e durante um surto de raiva bovina, o que levou à conclusão que houve o envolvimento do mesmo vírus e que a transmissão aos ovinos também foi pelos morcegos hematófagos. Na região sudeste, Queiroz et al. (2009) analisaram 10.579 amostras provenientes da região noroeste do Estado de São Paulo, durante o período de 1993 a 2007. Dos 42 municípios da região, 23 (55%) tiveram pelo menos um caso positivo da enfermidade. Entre as amostras positivas (518/10.579), identificou-se que 67% (346/518) eram cães, 16% (84/518), bovinos e 9,7% (50/518) eram morcegos. Gomes e Monteiro (2011) realizaram uma pesquisa sobre a influência do relevo, da temperatura, da precipitação e da sazonalidade na distribuição espacial da raiva bovina no Estado de São Paulo. Observaram que há uma relação espacial entre a raiva bovina, o relevo montanhoso, o maior índice de precipitação e a menor temperatura, e que não havia relação entre a sazonalidade e raiva bovina no período analisado. Menezes et al. (2008) estudaram a situação da raiva bovina em Minas Gerais no período de 1996 a 2008; constataram que a maioria dos casos ocorreu nos meses de abril a julho e que a enfermidade apresentava-se de forma regular nos municípios do Estado, com maior ou menor intensidade nas diferentes regiões. 8 Na região centro-oeste, Matta et al. (2010b) analisaram 2.225 amostras suspeitas de raiva oriundas dos três ecossistemas no Estado de Mato Grosso, no período de 1996 a 2006. Observaram que os focos estavam distribuídos em 95 dos 141 municípios do Estado e confirmaram a positividade de 745 (33,5%) das amostras. Concluíram que ocorreu uma variação crescente no número de casos positivos e que a maioria deles ocorreu na região do Cerrado, onde devem ser implementadas medidas mais rígidas de controle. Na região Nordeste, Santos et al. (2009) estudaram os casos de raiva no período de 2006 a 2007 em herbívoros no Estado da Bahia, utilizando as técnicas de geoprocessamento. Estimaram que a espécie bovina foi a principal envolvida nos focos (87,3%), seguida da equina (12,6%) e, depois, da caprina e ovina (0,1%). Também observaram que havia áreas silenciosas cercadas por áreas de risco, o que sugeria subnotificação. Ressaltaram a necessidade de uma melhor vigilância epidemiológica nas áreas atingidas e a realização de educação sanitária para a população local. Póvoas et al. (2012) determinaram a ocorrência de casos positivos para o vírus da raiva em herbívoros no Estado do Maranhão, no período de 2006 a 2010. Identificaram uma percentagem de 35,75% (69/193) de amostras positivas; destas, a espécie que apresentou o maior percentual de positividade foi a bovina com os seguintes valores de frequência relativa: 39,58% (2006), 55,56% (2007), 31,70% (2008), 25,92% (2009) e 24,42%(2010). 2.3. Patogenia e sinais clínicos A transmissão do vírus normalmente ocorre por meio da saliva dos animais infectados que penetra por arranhadura, mordedura e/ou lambedura (BRASIL, 2008). Existem alguns relatos da ocasional ocorrência por via aérea (pela inalação de partículas virais), transplante de córnea e de órgãos, vias transplacentária e mamária (KOTAIT et al., 2009). Após a inoculação, o vírus replica-se nas células musculares locais; em seguida é conduzido, via terminações nervosas motoras, aos nervos periféricos (JACOB et al., 2000); pelo fluxo axonal retrógrado, em movimento centrípeto, atinge 9 o SNC, onde ocorre intensa multiplicação. Pelo Sistema Nervoso Periférico e Sistema Nervoso Autônomo ocorre a disseminação de forma centrífuga, especialmente para as glândulas salivares, por onde é eliminado, e também para a pele, músculo liso e estriado, folículos pilosos, coração, pulmão, rins, baço, timo, útero, ovários, glândula adrenal, fígado, retina, córneas, intestino e epitélio da língua (BRASIL, 2008). O período de incubação do VR em herbívoros está entre 25 e 90 dias. Entre as diferentes espécies de mamíferos, esse período é variável e dependerá da variante do vírus, da susceptibilidade e do estado imunitário do animal, do local da mordedura (quanto mais próximo do SNC, mais rápida será a evolução da doença), da quantidade de vírus inoculado e da idade do animal (RODRIGUEZ et al., 2007; KOTAIT et al., 2009). Após o período de incubação, o animal começará a apresentar os sinais característicos da enfermidade. Os aspectos clínicos da doença são muito variáveis entre as espécies, e a doença nos animais apresenta-se principalmente sob a forma paralítica e furiosa. Nos herbívoros a doença pode apresentar-se das duas formas, porém a forma paralítica é a mais observada; inicialmente os animais se isolam, apresentam dificuldade para defecar, sialorreia, andar cambaleante (REIS et al., 2003), sinais de engasgo, aumento da sensibilidade e prurido na região da mordedura, hiperexcitabilidade e aumento da libido. Evoluindo para uma paralisia dos membros posteriores e decúbito, os animais não conseguem mais se levantar e ocorrem movimentos de pedalagem (PEDROSO et al., 2009), dificuldade respiratória, opistótono, asfixia e morte (RIET-CORREA, 2001). Os sinais clínicos da raiva não são patognomônicos, por isso a observação clínica só indica uma suspeita da enfermidade. Não existe tratamento para a doença e, uma vez iniciados os sinais clínicos, é invariavelmente fatal (BRASIL, 2008). Por isso, todos os animais suspeitos da enfermidade devem ser submetidos à necropsia, e torna-se essencial a realização de testes laboratoriais para a confirmação do diagnóstico e a identificação do vírus (OIE, 2015). 10 2.4. Diagnóstico O material biológico utilizado para o diagnóstico da raiva é o encéfalo dos animais suspeitos. As amostras devem ser enviadas refrigeradas ou imersas em líquido de Vallé para um laboratório credenciado pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA) ou Ministério da Saúde (BRASIL, 2009). A Organização Mundial de Saúde Animal (OIE) preconiza que o diagnóstico laboratorial seja realizado pela identificação do antígeno viral, por meio do teste de Imunofluorescência Direta (IFD), e pelo isolamento viral, por meio da inoculação em camundongos (IC) ou em cultivo celular (BRASIL, 2008). Outros meios de diagnóstico são normalmente utilizados para avaliar a capacidade imunogênica das vacinas e a resposta imune de animais domésticos à vacinação, como as provas sorológicas por meio do ensaio imunoenzimático (ELISA – Enzime-Linked Immunosorbent Assay) e os testes de soroneutralização em cultivos celulares, como o teste de inibição rápida de focos fluorescentes (RFFT– Rapide Fluorescent Focus Inhibition Test) e o teste fluorescente de vírus neutralização. No Brasil, na rotina laboratorial são utilizados os testes IFD e IC concomitantemente (BRASIL, 2005). De acordo com Kotait et al. (2009), essa associação de técnicas oferece resultados mais confiáveis. A IFD é um teste rápido, barato, e pode propiciar resultados confiáveis em 90% a 99% dos casos (ZIMMER et al., 1990; OIE, 2015) A IC é utilizada como teste biológico complementar e confirmatório do diagnóstico da raiva. É considerado sensível, porém oneroso e demorado (KOTAIT et al., 2009). Nos dias atuais, há uma propensão a substituir a IC pelo teste em cultura celular, por ser este mais rápido e barato, além de diminuir o uso de animais. Porém, é necessário um laboratório adequado e a otimização da técnica para ser usada na rotina de diagnóstico (OIE, 2015). Com o advento das técnicas imunológicas e de biologia molecular, foram desenvolvidos testes mais sensíveis e específicos para o diagnóstico da raiva (GERMANO, 1994), como aqueles que fazem uso de anticorpos monoclonais e a reação em cadeia da polimerase por transcrição reversa (RT-PCR). 11 A RT-PCR apresenta alta especificidade e sensibilidade, além de oferecer um resultado rápido (OIE, 2015). Essa técnica possibilita caracterizar geneticamente o vírus da raiva, distinguindo estirpes dentro de regiões geográficas e permitindo o cruzamento entre os dados da variante viral, do hospedeiro e da área geográfica (NADIN-DAVIS,1998). 2.5. Controle e profilaxia Após a confirmação do diagnóstico positivo, é de suma importância a implantação de medidas de vigilância epidemiológica para a realização do controle da raiva. No Brasil, em 1966 foi implantado o Plano de Combate à Raiva dos Herbívoros, denominado atualmente Programa Nacional de Controle da Raiva dos Herbívoros (PNCRH), com o objetivo principal de diminuir a incidência da doença nos herbívoros domésticos. As principais atividades desenvolvidas são o controle populacional do morcego hematófago, a vacinação dos herbívoros domésticos, a vigilância epidemiológica e a educação em saúde animal (BRASIL, 2009). A eliminação da doença depende da vacinação continuada e efetiva do rebanho em áreas endêmicas e do controle residual de infestações de morcegos em áreas de risco (VUILLAUME et al., 1998). O controle da população de morcegos hematófagos Desmodus rotundus é realizada por meio de métodos seletivos direto e indireto. O método seletivo direto consiste na captura do morcego com redes de neblina nos abrigos artificiais ou na fonte de alimento, aplicando o anticoagulante no dorso do animal capturado. Essa técnica tem como base o hábito desse animal de manter contato físico com os outros membros da colônia, espalhando a pasta para os demais morcegos da colônia, e também pelo hábito de se lamberem. O método seletivo indireto consiste na aplicação do produto ao redor das mordeduras dos herbívoros espoliados ou no dorso dos animais agredidos, sendo dessa forma eliminados apenas os morcegos que entram em contato com os herbívoros. Essa técnica tem como base o hábito dos morcegos Desmodus rotundus de retornarem ao mesmo animal para alimentar- se todas as noites (BRASIL, 2009). Almeida et al. (2002), ao realizarem um estudo utilizando o método seletivo direto, observaram uma redução significativa na incidência de mordeduras em 12 bovinos e equídeos e na presença ou vestígios recentes de Desmodus rotundus em quatro abrigos dos 18 que estavam habitados no início do trabalho. A vacinação dos herbívoros deve ser realizada utilizando vacina inativada, por via subcutânea ou intramuscular, na dosagem de 2 mL. Os animais devem ser revacinados 30 dias após a aplicação da primeira dose e revacinados anualmente (BRASIL, 2009). A educação sanitária é a base dos programas de sanidade animal, por promover a conscientização do produtor rural e da sociedade em geral, com o objetivo de obter a participação efetiva desses segmentos, visto que, de acordo com o PNCRH, é responsabilidade do proprietário notificar imediatamente ao serviço veterinário oficial a suspeita de casos de raiva em herbívoros, bem como a presença de animais apresentando mordeduras por morcegos hematófagos, ou ainda informar a existência de abrigos desses morcegos. A não notificação coloca em risco a saúde dos rebanhos da região, podendo expor o próprio ser humano à enfermidade (BRASIL, 2009). 2.6. Estudos moleculares No Brasil, foram realizados diversos estudos filogenéticos com amostras de vírus rábico originárias de diferentes regiões, principalmente por meio do sequenciamento parcial ou completo das proteínas N e G (Quadro 2). Ito et al. (2001), realizando o sequenciamento do gene da proteína N de diferentes mamíferos provenientes de diferentes regiões do Brasil, afirmaram que os isolados do vírus da raiva são agrupados em duas populações de reservatórios, geneticamente distintas, mantidas por cães e morcegos hematófagos. Sato et al. (2004), também realizando o sequenciamento de amostras brasileiras, a partir do gene N ou do gene G, e pela região intergênica G-L, demonstraram que os isolados podem ser classificados, pelo sequenciamento, em dois grupos distintos mantidos, respectivamente, pela variante de morcego hematófago e pela variante canina. Kobayashi et al. (2005), por meio do sequenciamento do gene N, analisaram filogeneticamente o vírus da raiva isolados de morcegos e afirmaram que o VR é geneticamente dividido dentro de cinco linhagens, que apresentam uma tendência a 13 dependerem das espécies de morcegos hospedeiras, o que sugere que as variantes de VR de morcegos, no Brasil, são espécie-específicas. Quadro 2. Estudos de caracterização genética do vírus da raiva realizados no Brasil, nos anos 2001 a 2014. Autores Ano Estado Especie Proteína Ito et al. 2001 GO, MG, SP, MT Morcego,herbívoros, humanos e animais domésticos N Ito et al. 2003 GO, MG, SP, MT Morcego,herbívoros, humanos e animais domésticos N Sato et al. 2004 Brasil Morcego,herbívoros, humanos e animais domésticos G; G-L Shoji et al. 2004 SP Morcegos frugíveros N Sato et al. 2005 SP; PB; GO; TO; MT Morcego, herbívoros, humanos e animais domésticos G Kobayashi et al. Nociti 2005 2005 SP MT Morcego Bovino N N Shoji et al. 2006 PB Animais silvestres, herbívoros N Sato et al. 2006 MA; PA; TO Humanos, animais domésticos, silvestres, herbívoros G Kobayashi et al. Carnieli Jr et al. 2006 2006 DF;GO; MA; MT;MG;RO;PA;SP;TO PB; PE; BA; PI Bovino; morcegos; cães Cão; gato, canídeo silvestre N N Kobayashi et al. 2007a GO;MG; SP; RJ; MA; Carnivoro N Kobayashi et al. 2007b RJ; SP; GO; PB Morcego P; M Kobayashi et al. Carnieli Jr et al. 2008 2009 DF; GO; MA; MG; MS; MT; PA; PB; RJ; SP; TO PB; PE; BA; PI; AL; SE; MA; PA Bovino; morcegos Animais domésticos; canídeos silvestres e humanos N N Mochizuki et al. 2009 PB Raposa N, P, M, G e L Kobayashi et al. 2011 Canino G Hirano et al. Matta et al. Carneiro 2010 2010b 2010 GO MT BA Morcego Bovino Morcegos G-L N N Mochizuki et al. 2011 SP Morcego N Mochizuki et al. Allendorf et al. Vieira et al. Peixoto et al. 2012 2012 2013 2014 PE; PB SP ES AM Herbivoro Morcego insentívoro e frugívoro Herbívoro; morcego Herbívoro N N G N e G 14 Utilizando amostras de vírus da raiva de herbívoros isoladas no período de 2003 a 2009, oriundas dos Estados da Paraíba e Pernambuco, Mochizuki et al. (2012) realizaram uma análise filogenenética com base na nucleoproteína e observaram que os isolados pertenciam a uma única linhagem que circula nesta área há pelo menos sete anos, a do morcego hematófago. E que o padrão de distribuição da linhagem pode ser correlacionada com a de uma população de morcegos hematófagos isolada por barreiras geográficas. Peixoto et al. (2014), por meio do sequenciamento parcial das proteínas N e G, realizaram uma análise filogenética de isolados de herbívoros, provenientes dos Estados do Acre, Pará, Tocantins e Rondônia. Observavam que o vírus da raiva de todos os isolados pertenciam à variante Desmodus rotundus, e que a análise filogenética baseada na proteína N resultou na presença de cinco sublinhagens (A1- A5), enquanto a análise baseada na proteína G resultou em 7 sublinhagens (A1-A7); quando comparadas, identificou-se a circulação de distintas linhagens nas regiões geográficas. Reconhecendo a relevância da raiva no cenário nacional e a necessidade de conhecimento da realidade dessa enfermidade em herbívoros, é extremamente importante a realização de estudos epidemiológicos que ofereçam subsídios para entender o comportamento desta enfermidade nas diferentes localidades do Brasil. 15 3. OBJETIVOS 3.1. GERAL Determinar o perfil epidemiológico da raiva em bovinos no Estado de Pernambuco, Brasil, no período de 2007 a 2012. 3.2. ESPECÍFICOS  Analisar a distribuição temporal e espacial da raiva dos bovinos  Determinar a taxa de incidência e a sazonalidade da raiva dos bovinos  Avaliar o risco nas áreas atingidas pelo vírus da raiva dos bovinos  Caracterizar molecularmente o vírus rábico circulante, comparando com outras amostras do Brasil e do mundo depositadas no GenBank 16 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Área de estudo O estudo foi desenvolvido a partir de amostras positivas para o vírus da raiva provenientes do Estado de Pernambuco, compreendendo as cinco mesorregiões: Metropolitana, Mata, Agreste, São Francisco e Sertão, compostas por 185 municípios (Figura 1). O Estado situa-se na região Nordeste do Brasil, possui 9.277.727 habitantes e ocupa uma área de 98 311km² (IBGE, 2015). Figura 1. Distribuição espacial das mesorregiões do Estado de Pernambuco, Brasil, indicando a origem das amostras utilizadas no presente estudo. 4.2. Levantamento de dados e análise da distribuição temporal dos casos de raiva em bovinos Foi realizado um estudo retrospectivo com análise dos dados dos casos positivos de raiva em bovinos no Estado de Pernambuco, Brasil, no período 2007 a 2012, levando-se em consideração o mês, o ano de ocorrência da doença e a região geográfica. Para tanto, foram consultados arquivos do Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO), do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Os dados foram tabulados e distribuídos em tabelas. 17 4.3. Distribuição espacial dos casos de raiva em bovinos A partir dos casos notificados foi realizado o mapeamento para observar a distribuição espacial dos focos e, consequentemente, a identificação das áreas de risco, utilizando o software MapInfo Professional 7.0. 4.4. Determinação da taxa de incidência e da sazonalidade da raiva em bovinos Foram calculadas as taxas de incidência da raiva em bovinos considerando os casos positivos e o rebanho bovino efetivo do Estado de Pernambuco. As informações sobre a população bovina nos meses de maio e novembro, de 2007 a 2012, foram fornecidas pela Agência de Defesa e Fiscalização Agropecuária do Estado de Pernambuco (ADAGRO). Para os demais meses da série, a população bovina foi estimada usando o método aritmético (MALETTA, 1981) (Apêndice A). Os coeficientes mensais de incidência de raiva, por 1.000.000 bovinos, foram obtidos pela relação entre o número de casos relatados e a população bovina no respectivo mês. Para melhor visualização das tendências, foram calculadas também as médias móveis trimestrais das taxas de incidência (THRUSFIELD, 2005). Para avaliar a ocorrência de tendência de longo prazo, analisou-se inicialmente a normalidade dos dados dos coeficientes de incidência, pelo teste de normalidade de Shapiro-Wilk. Como não se observou normalidade, empregou-se um método não paramétrico, teste de Wald-Wofowitz. Para investigar se os coeficientes de incidência apresentam variação sazonal, empregou-se a análise de variância (MORETTIN;TOLOI, 2006), uma vez que o teste de Bartelett mostrou que as variâncias são homogêneas (P>0,05), e o teste de shapiro-Wilk mostrou normalidade do resíduo (P>0,05). A comparação entre as taxas de incidência observadas nas mesorregiões foi feita com base no teste exato de Fisher. Os cálculos foram efetuados utilizando o software R (R Core Team, 2013), e para a elaboração dos gráficos foi usado o software Microsoft Excel. 18 4.5. Caracterização molecular do vírus da raiva Os métodos moleculares foram desenvolvidos no Laboratório de Epidemiologia Molecular do Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal, da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – FCAV/UNESP, Jaboticabal/SP, em parceria com o College of Bioresources Sciences – CBS da Nihon University, Japão. 4.5.1. Amostras de encéfalos utilizadas na caracterização molecular O material biológico foi cedido pela Coordenação da Raiva e das Encefalopatias Espongiformes Transmissíveis, da Secretaria de Defesa Agropecuária do MAPA, e pela Coordenação do Laboratório Nacional Agropecuário (LANAGRO) de Pernambuco, conforme documento Informação CRHE n. 15/2013 de 08/03/13 (Anexo A). As amostras de encéfalos de bovinos, oriundas do Estado de Pernambuco foram encaminhadas ao LANAGRO entre os anos de 2007 e 2012, e diagnosticadas como positivas para o vírus da raiva por meio das técnicas de IFD e IC. As amostras estavam armazenadas a -20°C e foram enviadas, via aérea, para o Laboratório de Epidemiologia e Diagnóstico da Raiva, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal da FCAV/Unesp. Das 238 amostras recebidas, 16 foram separadas para os testes moleculares, sendo provenientes das mesorregiões Agreste, Mata e Sertão (Quadro 3). 19 Quadro 3. Amostras de encéfalos de bovinos submetidas à caracterização molecular, de acordo com a procedência e o ano de isolamento. Estado de Pernambuco, Brasil. Código da amostra Ano Município Mesorregião BrPEAG11571 2011 Venturosa Agreste BRPEAG9837 2011 Pedra Agreste BRPEAG 6191 2011 Itaíba Agreste BRPEAG 11573 2011 Venturosa Agreste BRPEAG 49 2011 Belo jardim Agreste BRPEAG 1742 2011 Garanhuns Agreste BRPEAM2812 2011 Macaparana Mata BRPEAM11030 2011 Timbaúba Mata BRPEAM 1402 2011 Rio formoso Mata BRPEAM 1834 2011 Quipapá Mata BRPEAM 5604 2011 Timbaúba Mata BRPEAM 4448 2011 Timbaúba Mata BRPESE 3292 2011 Bodocó Sertão BRPESE261 2012 Sertânia Sertão BRPESE 1281 2012 Sertânia Sertão BRPESE 12362 2012 Mirandiba Sertão 4.5.2. Reação de transcrição reversa seguida da reação em cadeia pela polimerase (RT-PCR) para o gene N A partir das amostras de campo obtiveram-se as suspensões virais a 10%, que foram impregnadas em FTA cards (Whatman) para armazenagem a -20oC até o momento da extração. Inicialmente, o material era coletado dos FTA cards com o Uni-core punch Harris, e o disco obtido era colocado em um tubo de 1,5 mL. Em seguida adicionavam-se 200 µL do tampão TE e procedia-se a incubação à temperatura ambiente (15°C a 25°C) por 30 minutos. Posteriormente, eram adicionados ao tubo 560 µL do tampão AVL em seguida 140 µL do tampão TE e homogeinizado em vortex por 15 segundos. Essa solução era incubada à temperatura ambiente por 10 minutos. Após esse período, o tubo era centrifugado rapidamente para remover as gotas da parte interna da tampa. Adicionavam-se 560 µL de etanol, submetendo a vortex por 15 segundos e novamente à centrifugação para remover as gotas da parte interna da tampa. Cuidadosamente, 630 µL da mistura eram aplicados na 20 coluna QIAamp Mini, sem molhar o aro interno e, com a tampa fechada, centrifugava-se a 8000 rpm por 1 minuto. Posteriormente, a coluna era transferida para um tubo limpo de 2 mL e o tubo contendo o filtrado era descartado. A coluna era aberta, aplicavam-se os 630 µL restantes e novamente era realizado o procedimento anterior. Em seguida, cuidadosamente, eram adicionados 500 µL de tampão de lavagem AW1 na coluna QIAamp Mini e centrifugado a 8.000 rpm por 1 minuto. Após esse tempo, a coluna era inserida em um tubo limpo de 2 mL e o tubo contendo o filtrado, descartado. Posteriormente, adicionavam-se 500 µL de tampão de lavagem AW2 na coluna sem molhar o aro interno e centrifugava-se a 14.000 rpm por 3 minutos. A coluna QIAamp Mini era novamente inserida em um tubo de 2 mL limpo e o tubo contendo o filtrado, descartado. A coluna era centrifugada a 14.000 rpm por 1 minuto e transferida para um tubo de 1,5 mL. Com cuidado, abria-se a coluna e adicionavam-se 60 µL de tampão de eluição AVE. A coluna era incubada à temperatura ambiente por 1 minuto e centrifugada a 8.000 rpm por 1 minuto. 4.5.3. Síntese de cDNA do gene N Para a amplificação do gene N foi utilizado o Kit Superscript One-Step RT- PCR with Platinum Taq ® (Invitrogen Corp,Carsbad, CA, U.S.A.). O senso é P1 e o antisenso é o P2. Foram utilizados: 12,5 µL do RNA total extraído; 1 µL do primer senso–P1 (10 µM) e 1 µL do primer antisenso–P2 (10 µM) (Quadro 4); 0,5 µL do mix RT/Platinum Taq; e 9 µL de água destilada autoclavada, em uma reação com volume final de 25 µL. As reações eram realizadas em um termociclador PTC-0200 DNA Engine (MJ Research Inc., Waltham, MA, E.U.A.). As soluções eram incubadas a 50°C por 30 minutos, seguido de desnaturação a 94°C por 2 minutos, 40 ciclos a 94°C por 15 segundos, 51°C por 30 segundos, e uma extensão a 68°C por 2 minutos. Os produtos amplificados, referentes ao tamanho de banda do gene N, eram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1,5% em tampão T.A..E 1x (Tris10 mM; Acetato 0,1 M; EDTA 1 mM Ph 7,2), corado com brometo de etídio (0,5 µg/mL), sob luz UV em equipamento de fotodocumentação. O produto de PCR era submetido a purificação utilizando-se o QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha). 21 Quadro 4. Primers utilizados na síntese de cDNA do gene N do vírus da raiva. Primer Sequência (Sentido 5’ - 3’) Posição no genoma P1 5’CTACAATggATgCCgACAAgA3’ 66-86 P2 5’CCCATATAACATCCAACAAAgTG3’ 1029-1007 4.5.4. Sequenciamento Os primers utilizados no sequenciamento estão descritos no Quadro 5. Após a purificação, o produto era encaminhado para as reações de sequenciamento utilizando-se o kit Big Dye Terminator v3.1® (Applied Biosystems). O volume final de cada reação era de 20 µL, contendo: 2 µL de DNA purificado, 5µL tampão 5x, 3,2 µL dos primers (1µM) e 8,8 µL de água destilada autoclavada. A reação era processada em um termociclador nas seguintes condições: 25 ciclos de 96°C por 10s, 50°C por 5s e 60°C por 75s. Quadro 5. Primers utilizados no sequenciamento do gene codificador da proteína N do vírus da raiva. Primer Sequência Posição no genoma Nes-S 5’ ATGGATGCCGACAAGATTGT3’ 71-90 Nes-C 5’GCWATCAGGATTCCATAGCT3’ 360-341 4.5.5. Análise das sequências de DNA Os dados do sequenciamento foram analisados com o software ABI Analysis Data Collection e convertidos em sequências de nucleotídeos por meio do DNA Sequencyng Analysis Software versão 3.3. Os eletroferogramas gerados foram submetidos ao pacote de programas Phred/Phrap/Consed (EWING; GREEN, 1998; 22 GREEN, 1996; GORDON et al., 1998), para verificação da sua qualidade, alinhamento e corte das extremidades. 4.5.6. Análise filogenética A qualidade de bases dos eletroferogramas e as sequências consenso foram obtidas pelo pacote de programas Phred/Phrap/Consed (EWING; GREEN, 1998; GREEN, 1996; GORDON et al., 1998). Para as análises filogenéticas, as sequências da proteína N do vírus da raiva contido nas amostras selecionadas foram comparadas com sequências da mesma porção gênica do vírus depositadas no banco de dados GenBank (NCBI) relativas a herbívoros, cães, humanos e morcegos hematófagos, frugívoros e insetívoros, e demais sequências que compuseram o grupo externo, referentes aos vírus MOKV, ABLV e EBLV1 (Quadro 6). Todas as sequências foram alinhadas por MUSCLE (EDGAR, 2004) utilizando-se o software MEGA 6.06 (TAMURA et al., 2013) (Apêndice B). O mesmo software foi empregado na determinação do modelo evolutivo mais adequado para ser aplicado às sequências do estudo nas análises bayesianas, segundo o critério de informação de Akaike (AIC) (POSADA; BUCKLEY, 2004). Dessa forma, a árvore filogenética foi gerada pelo software MrBayes 3.2.3 (RONQUIST; HUELSENBECK, 2003) utilizando-se o modelo de substituição T92 (TAMURA, 1992), distribuição G+I e o algoritmo Markov Chain Monte Carlo (MCMC), programado para executar as análises em quatro cadeias simultaneamente, sendo três quentes e uma fria. Foram realizadas quatro corridas independentes com 4.000.000 de gerações, sendo as cadeias amostradas a cada 200 gerações. Ao final das análises, obtendo-se desvio padrão menor do que 0,01, 25% das árvores geradas foram descartadas como burn- in. O filograma gerado foi editado graficamente pelo software TreeGraph 2.3.0 (STÖVER; MÜLLER, 2010) (Anexos 1 e 2). 23 Quadro 6. Sequências disponíveis no Genbank utilizadas para a construção da árvore filogenética, de acordo com o número de acesso e local de isolamento (município/Estado, espécie animal e ano) Genbank Ano Espécie Município Estado AB206416 2003 Molossus sp. Patos PB AB675604 2002 Bovino Xinguará PA AB675606 2001 Bovino Nova Crixas GO AB675608 2000 Bovino Natividade TO AB675612 2002 Bovino Nobres MT AB206424 2003 Bovino Patos PB AB206430 2003 Bovino Patos PB AB675614 2002 Bovino Pirapozinho SP AB675616 2000 Bovino Miguel Pereina RJ AB675617 2004 Bovino Itapecuru Mirim MA AB675618 2004 Bovino Nossa Senhora do Livramento MT AB675620 2002 Bovino Nova América GO AB675626 2005 Bovino Godofredo Viana MA AB675629 2005 Bovino Cocalzinho de Goiás GO AB675630 2006 Bovino Itapaci GO AB675631 2005 Bovino Bandeirantes MS AB623082 2004 Bovino São José do Bonfim PB AB623086 2005 Bovino Santa Luzia PB AB623090 2006 Bovino Junco do Seridó PB AB623094 2007 Bovino Patos PB AB623106 2007 Bovino Brejinho PE AB623101 2008 Bovino Patos PB AB623107 2008 Bovino Vitória de Stº Antão PE AB623110 2008 Bovino Venturosa PE AB623112 2008 Bovino Venturosa PE AB623114 2008 Bovino Venturosa PE AB623117 2009 Bovino Lajedo PE AB623077 2008 Caprino São Mamede PB AB623076 2007 Equino Patos PB AB623078 2004 Ovino Santa Terezinha PB KF805574 2009 Bovino Caldas MG FJ649171 2001 Bovino Atibaia SP AB201804 2000 Desmodus rotundus Lindoia SP 24 GQ160952 2008 Bovino Serra Negra SP FJ649157 2001 Equino Itapuã SP GQ160921 2008 Bovino Belo Horizonte MG GQ160933 2008 Bovino Iacri SP GQ160934 2008 Bovino Iacri SP AB201805 2001 Desmodus rotundus São José do Barreiro SP GQ160943 2008 Bovino Salesópolis SP GQ160913 2007 Bovino Itirapuã SP AB201802 2002 Desmodus rotundus Dracena SP AB201808 2001 Nyctinomops ssp. São José do Rio Preto SP AB297628 2004 Artibeus sp Mesquita RJ AB297631 2004 Artibeus lituratus Vargem Grande Paulista SP AB297635 2003 Desmodus rotundus Tambaú SP AB297638 2005 Desmodus rotundus Cocalzinho de Goiás GO AB297642 2005 Desmodus rotundus Niquelândia GO AB297644 2006 Desmodus rotundus Nova Iguaçù de Goiás GO EF363748 2004 Humano Portel PA EF363752 2005 Humano Augusto Corrêa PA EU159381 2005 Canino Sem informação China EU086205 2004 Canino Sem informação Filipinas JX944599 2010 Canino Sem informação Nepal JX944572 2010 Bovino Sem informação Nepal AB357291 2001 Bovino Sem informação SP AB083811 1999 Bovino Sem informação TO AB083814 1999 Bovino Sem informação MT 25 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Distribuição temporal dos casos de raiva em bovinos No período de 2007 a 2012 foram diagnosticadas 238 amostras positivas para o vírus da raiva em herbívoros, no Estado de Pernambuco, por meio de análises laboratoriais no LANAGRO em Recife/PE. A tabela 1 demonstra a distribuição dos casos de raiva em bovinos, mês a mês, no período estudado. Tabela 1. Número de casos de raiva bovina diagnosticados pelo LANAGRO, período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil. Ano Mês Total JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ 2007 0 1 0 0 0 7 3 3 3 9 5 4 35 2008 8 10 5 8 4 3 4 3 4 13 4 5 71 2009 9 4 1 7 9 3 4 3 5 5 3 3 56 2010 5 3 4 5 2 4 2 3 2 5 1 3 39 2011 1 4 4 3 2 1 2 1 3 3 4 1 29 2012 2 2 2 1 0 0 0 0 0 0 0 1 8 Total 25 24 16 24 17 18 15 13 17 35 17 17 238 Conforme os dados analisados, constatou-se que 100% das amostras diagnosticadas positivas para raiva eram da espécie bovina. De acordo com dados do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), no período de 2000 a 2012, foram registrados 29.865 casos de herbívoros positivos para a raiva no país e, deste total, 27.218 (91,13%) eram de bovinos. Os estudos epidemiológicos sobre raiva em herbívoros no país relatam maior ocorrência da raiva em bovinos, seguida de equinos. Segundo Neves (2008), que analisaram laboratorialmente 2.467 amostras do Estado do Mato Grosso do Sul, no período de 1998 a 2006, dos 584 diagnósticos positivos, 533 foram da espécie bovina. Santos et al. (2009) realizaram uma caracterização da raiva em herbívoros 26 no Estado da Bahia, e constataram que dos 81 casos de raiva em herbívoros no período estudado, a maioria ocorreu na espécie bovina, ou seja, 87,3% (67/81). Póvoas et al. (2012) avaliaram 193 amostras de herbívoros (174 de bovinos, 9 de equinos, 4 de asininos, 3 de ovinos, 2 de caprinos e 1 de muar) no Estado do Maranhão e observaram que, das 69 amostras positivas, 63 também eram de bovinos. Observou-se no presente estudo que, apesar de o Estado de Pernambuco ser detentor do segundo maior rebanho de caprinos do país, não foi diagnosticado nenhum caso de raiva nessa espécie, no período estudado. Rodriguez et al. (2007) afirmam que a ocorrência da enfermidade em caprinos na região Nordeste representa uma parte significativa dos diagnósticos positivos; contrariando essa afirmação, alguns autores relatam que a raiva é uma doença rara em caprinos e ovinos (GOMES, 2004; LIMA et al., 2005). Essa maior ocorrência da raiva nos bovinos provavelmente se deve ao fato de a população ser superior à de outras espécies de herbívoros e ao tipo de manejo realizado, tornando-os uma presa fácil para o morcego hematófago. Também é possível que o quantitativo casos seja reduzido em outras espécies de herbívoros pelo fato de normalmente os produtores rurais não notificarem casos em outras espécies, muitas vezes por falta de conhecimento e por falhas nas ações do Programa Estadual de Controle da Raiva. 5.2. Distribuição espacial dos casos de raiva em bovinos Pela análise da distribuição espacial dos focos de raiva por mesorregiões no período de 2007 a 2012, constatou-se que os mesmos estão presentes em todas as mesorregiões, em 78 dos 185 municípios do Estado de Pernambuco (Figuras 2 e 3). 27 Figura 2. Distribuição espacial dos focos de raiva em bovinos, por mesorregiões, no Estado de Pernambuco, Brasil, no período de 2007 a 2012. Figura 3. Distribuição espacial dos casos de raiva em bovinos, por municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no período de 2007 a 2012. Ano de 2007- Observando-se a ocorrência da raiva, constatou-se que no ano de 2007 foram atingidos 16 (8,6%) dos 185 municípios do Estado de Pernambuco. Os focos estavam distribuídos em 6 (8,5%) dos 71 municípios da Mesorregião do Agreste de Pernambuco, em 4 (9,3%) dos 43 municípios da Mesorregião da Mata, em 3 (20%) dos 15 municípios da mesorregião de São Francisco, em 3 (7,3%) dos 41 municípios da mesorregião do Sertão (Figuras 4 e 5). 28 Figura 4. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2007. Figura 5. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2007. Ano de 2008 - os focos de raiva distribuiram-se em 31 (17%) dos 185 municípios do Estado de Pernambuco. Ocorreram em 8 (11,3%) dos 71 municípios da mesorregião do Agreste de Pernambuco, em 5 (11,3%) dos 43 municípios da mesorregião da Mata, em 8 (53,3%) dos 15 municípios da mesorregião Metropolitana, em 2 (13,3%) dos 15 municípios da mesorregião de São Francisco, em 8 (19,5%) dos 41 municípios da mesorregião do Sertão (Figuras 6 e 7). 29 Figura 6. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2008. Figura 7. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2008. 30 Ano de 2009 - observa-se que foram atingidos pelo vírus da raiva 26 (14%) dos 185 municípios dos Estado. Ocorreram focos em 10 (14,3%) dos 71 municípios da mesorregião do Agreste de Pernambuco, em 3 (7%) dos 43 municípios da mesorregião da Mata, em 7 (46,7%) dos 15 municípios da mesorregião Metropolitana, em 1 (6,7%) dos 15 municípios da mesorregião de São Francisco, em 5 (12,2%) municípios dos 41 da mesorregião do Sertão (Figuras 8 e 9). Figura 8. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2009 Figura 9. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2009. 31 Ano de 2010 - constatou-se que os focos estavam distribuídos em 19 (10%) dos 185 municípios do Estado. Foram atingidos 8 (11,3%) dos 71 municípios da Mesorregião do Agreste de Pernambuco, em 4 (9,3%) dos 43 municípios da Mesorregião da Mata, em 2 (13,3%) dos 15 municípios da mesorregião metropolitana, em 1 (6,7%) dos 15 municípios da mesorregião de São Francisco, em 4 (9,8%) dos 41 municípios da mesorregião do Sertão (Figuras 10 e 11). Figura 10. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2010. Figura 11. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2010. 32 Ano de 2011 - constatou-se a ocorrência de focos em 17 (9%) dos 185 municípios do Estado, distribuídos em 5 (7%) dos 71 municípios da Mesorregião do Agreste de Pernambuco, em 5 (4,6%) dos 43 municípios da Mesorregião da Mata, em 2 (13,3%) dos 15 municípios da mesorregião de São Francisco, em 5 (12,2%) dos 41 municípios da mesorregião do Sertão (Figuras 12 e 13). Figura 12. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2011. Figura 13. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2011. 33 Ano de 2012 - foram atingidos pela enfermidade 7 (4%) dos 185 municípios do Estado. Os focos ocorreram em 3 (4,2%) dos 71 municípios da Mesorregião do Agreste de Pernambuco, em 2 (4,7%) dos 43 municípios da Mesorregião da Mata, em 2 (4,9%) dos 41 municípios da mesorregião do Sertão (Figuras 14 e 15). Figura 14. Distribuição espacial de municípios com casos de raiva em bovinos, no Estado de Pernambuco, Brasil, no ano de 2012. Figura 15. Distribuição espacial do número de casos positivos para raiva em bovinos nos municípios, no Estado de Pernambuco, Brasil, 2012. Na figura 16, pelo Mapa de kernel, observa-se que a concentração de casos de raiva na superfície ocorreu nas mesorregiões da Mata, Agreste, Sertão e Metropolitana. Porém, a maior concentração de municípios com casos positivos está 34 localizada nas mesorregiões do Agreste e Sertão. Essa maior quantidade de casos pode ser atribuída ao fato de essas regiões possuírem, juntas, a maior população de bovinos do Estado. Figura 16. Concentração de casos de raiva na superfície, de acordo com mesorregiões e municípios do Estado de Pernambuco, Brasil, no período de 2007 a 2012. É evidente que no período estudado há uma diminuição dos casos de raiva no decorrer dos anos; porém, ao analisar os municípios atingidos, observa-se que alguns apresentaram focos em quase todos os anos (Tabela 2; Figuras 4 a 14). Considerando o Município de Venturosa, onde só não ocorreram casos positivos no ano de 2010 (Figura 10): está localizado na mesorregião do Agreste e faz limite ao norte com os municípios de Alagoinha, que apresentou foco no ano de 2009 (Figura 8), e de Pesqueira, que apresentou positividade em 2009 e 2010 (Figuras 6 e 12); ao sul com Caetés, que não apresentou nenhum foco; a oeste com Garanhuns, que apresentou casos positivos nos anos de 2010 e 2011 (Figuras 10 e 12) e com Capoeira, que não teve focos. O Município de Pedra faz limite com Venturosa ao norte e a leste e foi atingido nos anos de 2008 e 2011. Esse panorama sugere uma área silenciosa, sem ações eficientes de controle da raiva em herbívoros, o que é preocupante, visto que nessa região está inserida a bacia leiteira do Estado de Pernambuco, que, segundo o IBGE (2015), ocupa o 8º lugar na produção de leite do país. 35 Tabela 2. Distribuição dos focos de raiva bovina, por mesorregiões, no período de 2007 a 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil. Ano 2007 2008 2009 2010 2011 2012 Mesorregião (nº de munic.) Número de municípios (%) Agreste (71) 6 (8,5%) 8 (11,3%) 10 (14,3%) 8 (11,3%) 5 (7%) 3 (4,2%) Mata (43) 4 (9,5%) 5 (11,3%) 3 (7%) 4 (9,3%) 5 (4,6%) 2 (4,7%) São Francisco (15) 3 (20%) 2 (13,3%) 1 (6,7%) 1 (6,7%) 2 (13,3%) ------- Sertão (41) 3 (7,3%) 8 (19,5%) 5 (12,2%) 4 (9,8%) 5 (12,2%) 2 (4,9%) Metropolitana (15) ------- 8 (53,3%) 7 (46,7%) 2 (13,3%) ------ ------- Total (185) 16 (8,6%) 31 (17%) 26 (14%) 19 (10%) 17 (9%) 7 (4%) 36 5.3. Taxas de incidência e sazonalidade da raiva dos bovinos As taxas de incidência da raiva dos bovinos nos anos de 2007 a 2012, no Estado de Pernambuco, estão expressas na tabela 3 e na figura 17. Tabela 3. Taxa de incidência (por 1.000.000) de raiva bovina, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil. Ano Mês JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ 2007 0,00 0,46 0,00 0,00 0,00 3,35 1,45 1,46 1,47 4,45 2,49 1,99 2008 3,95 4,91 2,45 3,89 1,94 1,46 1,97 1,49 2,00 6,54 2,03 2,52 2009 4,51 1,99 0,50 3,45 4,41 1,47 1,97 1,48 2,46 2,46 1,48 1,47 2010 2,44 1,46 1,94 2,41 0,96 1,91 0,95 1,43 0,95 2,37 0,47 1,41 2011 0,46 1,84 1,83 1,36 0,90 0,45 0,89 0,44 1,33 1,32 1,76 0,44 2012 0,88 0,88 0,88 0,44 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,46 Figura 17. Taxa de incidência (por 1.000.000) de raiva bovina no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil. 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 0 12 24 36 48 60 72 Ta xa d e in ci d ê n ci a p o r 1 .0 0 0 .0 0 0 Mês 37 A figura 17 permite observar aumento na taxa de incidência até o final do segundo ano, seguido de acentuada redução até o final do período analisado. A figura 18, com as médias móveis trimestrais da taxa de incidência, mostra com mais clareza o aumento da incidência no início do período e a redução no final. No conjunto da série, constata-se tendência de redução significativa na taxa de incidência, pelo teste não paramétrico de Wald-Wofowtiz (P = 3,52 x 10-7). A redução na taxa de incidência pode estar relacionada a uma melhoria das ações do Programa de Controle da Raiva dos Herbívoros, devido ao aumento da vacinação dos herbívoros, a captura e tratamento de morcegos hematófagos com pasta vampiricida, e a diminuição de casos clínicos. Mas também podem estar ocorrendo falhas na vigilância epidemiológica e, com isso, o aumento das áreas silenciosas. É importante salientar que a subnotificação é uma realidade no país. Segundo Kotait et al. (1998), para cada caso notificado, 10 outros não o são, o que torna quase impossível avaliar as perdas reais com essa enfermidade e dificultam as ações do programa de controle. De acordo com Matta et al. (2010b), essa lacuna no programa pode ocorrer devido a problemas de logística e a falta de pessoal. Também foram calculadas as médias móveis trimestrais da taxa de incidência, demonstradas na tabela 4 e na figura 18. Tabela 4. Médias móveis trimestrais da taxa de incidência mensal (por 1.000.000) de raiva bovina, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil. Ano Mês JAN FEV MAR ABR MAI JUN JUL AGO SET OUT NOV DEZ 2007 ------ 0,15 0,15 0,00 1,12 1,60 2,09 1,46 2,46 2,81 2,98 2,81 2008 3,62 3,77 3,75 2,76 2,43 1,79 1,64 1,82 3,34 3,52 3,70 3,02 2009 3,01 2,33 1,98 2,79 3,11 2,62 1,64 1,97 2,13 2,14 1,81 1,80 2010 1,79 1,95 1,93 1,77 1,76 1,28 1,43 1,11 1,58 1,27 1,42 0,78 2011 1,24 1,38 1,68 1,36 0,90 0,75 0,59 0,89 1,03 1,47 1,17 1,03 2012 0,73 0,88 0,73 0,44 0,15 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,15 ------ 38 Figura 18. Médias móveis trimestrais da taxa de incidência mensal (por 1.000.000) de raiva bovina, no período de janeiro de 2007 a dezembro de 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil. A observação das figuras 17 e 18 sugere que não há variação sazonal, uma vez que não se constata aumento da taxa de incidência que se repita de forma sistemática na mesma época do ano. A ausência de sazonalidade é confirmada pela análise de variância, a qual apontou não haver diferença significativa entre as taxas de incidência segundo o mês (P = 0,6243). Resultados semelhantes de análise de sazonalidade foram encontrados por Póvoas et al. (2012) que, ao realizarem análise epidemiológica no Estado do Maranhão, não observaram a ocorrência de casos de raiva em épocas específicas do ano, e por Gomes e Monteiro (2011), que também não identificaram em seu estudo uma relação entre a sazonalidade e a raiva bovina. Entretanto, alguns estudos confirmaram uma tendência à sazonalidade na raiva, com a maioria dos casos ocorrendo na primavera e no verão (PEREIRA et al., 2011; BATISTA et al., 2007). Menezes et al. (2008), no Estado de Minas Gerais, observaram que a maior incidência da raiva ocorreu nos meses de março a agosto, com a maioria dos casos no final do período chuvoso e início do período seco; os autores sugeriram que essa tendência pode sofrer influência tanto das condições climáticas quanto da oferta de alimento e abrigo para os morcegos hematófagos. 39 A distribuição da raiva em herbívoros está diretamente ligada a alterações ambientais (BRASIL, 2009), que determinam o comportamento dos morcegos. Não haverá sazonalidade se os morcegos não conseguirem realizar o movimento de ida e volta para lugares mais secos ou mais úmidos (GOMES et al., 2011). Concordando com essa afirmação anterior, alguns estudos apontam que as epidemias nas épocas chuvosas e secas dependem do deslocamento dos morcegos à procura de novos abrigos. Kobayashi et al. (2008) afirmaram que os padrões de distribuição dos morcegos hematófagos, no Brasil, estão associados às variações climáticas, montanhas e rios que afetam a ecologia dos morcegos. As regiões montanhosas são mais propícias para a localização de abrigos de morcegos, e normalmente nessas áreas as temperaturas são mais baixas e com maiores índices pluviométricos (Kotait et al., 2003). 5.4. Taxa de incidência da raiva bovina por mesorregião Analisando a taxa de incidência da raiva de acordo com a mesorregião no período de 2007 a 2012 (Tabela 5), observa-se que, em 2009, a mesorregião Metropolitana continuou apresentando a maior incidência (22,31), e a mesorregião do Sertão a menor taxa (0,92). No ano de 2010, a mesorregião Mata teve a maior (8,88), e a mesorregião Sertão a menor incidência (1,00). Tabela 5. Taxa de incidência (por 100.000.000) de raiva bovina, de acordo com a mesorregião e o ano de ocorrência, no período de 2007 a 2012, no Estado de Pernambuco, Brasil. Mesorregião 2007 2008 2.009 2010 2.011 2012 Agreste 1,50a 1,50ª 1,61ª 1,68ª 1,97a 0,23ª Mata 5,37b 11,60b 12,85b 8,88b 17,13b 1,81ª Metropolitana 0,00a 26,69c 22,31b 3,69a,b 0,00ª 0,00ª São Francisco 5,41b 5,24b,d 1,22ª 1,15ª 4,90ª,b 0,00ª Sertão 1,45a 2,55ª,d 0,92ª 1,00ª 2,44ª 0,42ª Letra igual na coluna indica diferença não significativa (P>0,05). No ano de 2011, a mesorregião Mata continuou com a maior incidência (17,13), enquanto na Metropolitana a taxa de incidência foi zero. Já em 2012, a 40 mesorregião Mata também apresentou a maior taxa (1,81), enquanto Metropolitana e São Francisco tiveram taxas zero. Ao analisar estes dados, observa-se que no decorrer do período a maior taxa de incidência ocorreu no ano de 2008 na mesorregião Metropolitana, e nos anos posteriores a incidência foi diminuindo nessa mesorregião, sugerindo que as ações de controle foram efetivas. Porém, a mesorregião da Mata apresentou oscilação nas taxas de incidência no período analisado, o que sugere que esta seja uma área endêmica no Estado e que necessita de um plano de controle populacional de morcegos hematófagos mais efetivo, com a utilização de métodos seletivos diretos e indiretos. Essas técnicas baseiam-se nos hábitos dos morcegos hematófagos e o ideal é que sejam associadas, aumentando a eficácia do controle populacional. Constatou-se que, no período analisado no presente estudo, apenas no ano de 2012 não foi observado diferença significativa entre as taxas de incidência nas mesorregiões. As taxas na mesorregião da Mata, em todos os anos estudados, foram significativamente maiores que as taxas de incidência da Mesorregião Sertão e da Mesorregião Agreste. Isso pode estar relacionado à existência de abrigos de morcegos; talvez essa região apresente condições ambientais e climáticas que favoreçam o maior número de abrigos. Isso sugere que esta seja uma área propícia para a manutenção da enfermidade. 5.5. Análise filogenética do gene N Pelo sequenciamento do gene N, confirmou-se a positividade para o vírus da raiva das 16 amostras de bovinos do Estado de Pernambuco. As sequências obtidas neste estudo, com 820pb em média, apresentaram identidade de 99% com sequências do vírus da raiva depositadas no Genbank. Pela análise filogenética, observou-se que as amostras do estudo foram homólogas à sequências de vírus da raiva, relacionadas à linhagem de morcego hematófago Desmodus rotundus. De acordo com Ito et al. (2001), no Brasil circulam variantes de vírus da raiva pertencentes a pelo menos dois grupos de genótipos diferentes, e esses dois grupos são mantidos de forma independente entre cães e morcegos hematófagos. Esse resultado confirma a importância do Desmodus rotundus na manutenção da raiva, 41 no ambiente rural do Estado de Pernambuco, visto que esta espécie é considerada a principal transmissora do vírus da raiva aos herbívoros. Outros estudos realizados no Brasil com isolados de herbívoros encontraram resultados semelhantes. Mochizuki et al. (2012) realizaram uma análise filogenética em isolados pertencentes aos Estados de Pernambuco e Paraíba e constataram que todos as amostras analisadas pertenciam à linhagem do morcego hematófago, assim como Peixoto et al. (2014), que estudaram amostras pertencentes aos Estados de Pará, Rondônia e Tocantins. Para a construção da árvore filogenética, foram utilizadas as sequências deste estudo, juntamente com as outras retiradas do Genbank, relativas a isolados de herbívoros, cães, humanos, e morcegos hematófagos, frugívoros e insetívoros. A análise filogenética das sequências resultou na formação de quatro grupos: o grupo 1 corresponde aos isolados relacionados ao morcego hematófago Desmodus rotundus; o grupo 2, no qual estão agrupados os isolados de morcego insetívoro; o grupo 3, referente aos isolados de cães; e o grupo 4, correspondente às amostras utilizadas como grupo externo. A figura 19 demonstra a árvore filogenética obtida com o sequenciamento parcial do gene N. No grupo 1, agruparam-se todas as 16 amostras sequenciadas neste estudo, que foram denominadas como: BRPEAG11571, BRPEAG9837, BRPEAG 6191, BRPEAG 11573, BRPEAG49, BRPEAG1742, BRPEAM2812, BRPEAM11030, BRPEAM1402, BRPEAM1834, BRPEAM5604, BRPEAM4448, BRPESE3292, BRPESE261, BRPESE1281, BRPESE12362, e os isolados pertencentes a Estados das regiões Nordeste, Norte e Centro-oeste do Brasil. No grupo 4 estão as amostras usadas como grupo externo, identificadas como: GU992313.1(Mokola vírus), GU992312.1 (Australian bat lyssavirus), AY062089.1 (European bat lyssavirus), que são utilizadas para dar sustentação à árvore. Quando se observa o agrupamento da árvore filogenética no grupo 1, identifica-se a formação de subgrupos, com uma nítida divisão geográfica entre as amostras de vírus obtidas dos diferentes estados brasileiros: Paraíba (PB) e Pernambuco (PE); Goiás (GO); Pará (PA) e Tocantins (TO); São Paulo (SP); Mato Grosso (MT); Mato Grosso do Sul (MS); Maranhão (MA) e Pará; Rio de Janeiro (RJ) 42 e São Paulo (SP), e que não há distinção entre os vírus isolados de bovinos, equinos, ovinos ou caprinos, pois estes procedem da mesma fonte, morcegos hematófagos. 5.5.1. Análise filogenética relacionada à distribuição geográfica Quanto a distribuição geográfica, verifica-se que as sequências das amostras do estudo foram agrupadas juntamente com aquelas do banco de dados provenientes de Pernambuco (AB623106.1, AB623107.1, AB623117.1, AB623110.1) e da Paraíba (AB623082.1, AB623086.1, AB623101.1, AB623078.1, AB206430.1, AB623076.1), coincidindo assim com a sua procedência (Figura 19). O Estado de Pernambuco faz limite ao norte com o Estado da Paraíba, e não há barreiras geográficas e topográficas significativas que separem os Estados, o que facilita o deslocamento dos morcegos Desmodus rotundus. A nítida divisão geográfica observada entre os isolados de Pernambuco e dos outros estados, provavelmente ocorre devido a barreiras geográficas que separam esses estados. Os isolados são, inclusive, específicos para cada mesorregião, pois na árvore pode-se observar que as amostras provenientes da mesorregião da Mata (BRPAM1402, BRPEAM1834; BRPEAM2812, BRPEAM4448, BRPEAM5604 e BRPEAM11030) estão agrupadas separadamente das demais amostras do Agreste e Sertão (BRPESE1281 e BRPEAG6191; BRPESE2621, BRPEAG1742, BRPEAG9837, BRPEAG11573, BRPEAG11571, BRPESE32), as quais estão separadas em agrupamento específico, dada a proximidade dessas mesorregiões. As amostras provenientes das mesorregiões da Mata e Agreste estão agrupadas com as amostras do GenBank isoladas na região do Sertão da Paraíba. As amostras BRPEAM2812, oriunda do Município de Macaparana, e BRPEAM4448, BRPEAM5604 e BRPEAM11030, pertencentes ao Município de Timbaúba, estão segregadas em um subgrupo separado do restante das amostras deste estudo, assim como as amostras BRPEAG9837 e BRPEAG11573, sugerindo que seja um ciclo de transmissão independente, entre municípios próximos. De acordo com Kobayashi et al. (2008), a raiva transmitida pelo morcego hematófago apresenta aspectos epidemiológicos que estão associados às 43 características geográficas e topográficas das áreas ocupadas pelo rebanho e aos fatores que influenciam a ecologia dessa espécie de morcego. No presente estudo, as mesorregiões Mata, Sertão e Agreste possuem algumas características geográficas e topográficas que favorecem os hábitos dos morcegos hematófagos e propiciam a manutenção da enfermidade no ambiente. Na mesorregião da Mata, o relevo aumenta a sua altitude quando segue em direção à mesorregião Agreste do Estado, além de apresentar índice pluviométrico elevado com temperaturas sem oscilações ao longo do ano. Essa região é cortada pelos principais rios do Estado, o Capibaribe, o Ipojuca e o Ipanema. A mesorregião do Agreste está localizada entre as mesorregiões da Mata e Sertão e está situada sobre o Planalto da Borborema, que apresenta altitude entre 400 e 1.000 metros; o relevo elevado faz com que essa região tenha um clima ameno, com temperatura entre 8⁰C e 37⁰C. A mesorregião do Sertão apresenta um índice pluviométrico baixo e altas temperaturas, que variam entre 10⁰C e 41⁰C, sendo cortada pelos rios Moxotó, Pajeú e Brígida. Segundo Gomes e Monteiro (2011), existe uma relação espacial entre a raiva bovina, o relevo montanhoso, o maior índice de precipitação e a menor temperatura. Essas características estão associadas a alterações nos ecossistemas provocadas pelos humanos, como a oferta de alimento. De fato, nas três mesorregiões aqui estudadas encontra-se a maior parte do rebanho bovino do Estado de Pernambuco, e a formação de abrigos artificiais, que influenciam diretamente a ecologia dos morcegos. 44 Figura 19 - Árvore filogenética bayesiana obtida pelo alinhamento das sequências parciais do gene N de vírus da raiva provenientes do Estado de Pernambuco e das sequências virais depositadas no GenBank. 45 6. CONCLUSÃO 1- A distribuição temporal demonstra que houve um aumento do número de casos no segundo ano, decaindo gradativamente nos anos seguintes. A redução foi acentuada no último ano, sugerindo ações muito efetivas do Programa de controle ou falhas na vigilância epidemiológica e aumento das áreas silenciosas. 2- Os focos de raiva de herbívoros, no período de 2007 a 2012, estavam distribuídos por todo o Estado de Pernambuco, em 78 dos 185 municípios. A maior ocorrência foi observada nas mesorregiões Metropolitana, Mata, Sertão e Agreste, porém a maior concentração de municípios com casos positivos ocorreu nas regiões Agreste e Sertão. 3- A taxa de incidência aumentou até o final do segundo ano, seguido de acentuada redução até o final do período analisado. 4- Houve diferença significativa entre as taxas de incidência nas mesorregiões. Na mesorregião da Mata, em todos os anos estudados, as taxas foram significativamente maiores que aquelas nas mesorregiões Sertão e Agreste. Na mesorregião da Mata houve oscilação das taxas de incidência no período analisado, sugerindo que se mantenha como uma área endêmica no Estado de Pernambuco pois pode apresentar as condições ambientais e climáticas que favorecem o maior número de abrigos do reservatório Desmodus rotundus. 5- Não se constatou um aumento do número de casos que se repita de forma sistemática em uma mesma época do ano, indicando ausência de sazonalidade. 6- A área de maior risco para a manutenção e transmissão da raiva é a mesorregião da Mata, seguida por Agreste e Sertão. 7- Nos estudos filogenéticos, todas as amostras virais sequenciadas enquadram-se no grupo 1, correspondente aos isolados relacionados com a variante Desmodus rotundus. Na árvore filogenética, as amostras provenientes da região da Mata estão agrupadas separadamente das amostras de Sertão e Agreste, as quais compõem um agrupamento específico, sugerindo que haja ciclos de transmissão independentes. 46 7. REFERÊNCIAS ALENCAR, A. O.; SILVA, G. A. P.; ARRUDA, M. M.; SOARES. A.J.; GUERRA, D. Q. Aspectos biológicos e ecológicos de Desmodus rotundus (Chiroptera) no Nordeste do Brasil. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 14, n. 4, p. 95-103, 1994. ALLENDORF, S. D.; CORTEZ, A.; HEINEMANN, M. B.; HARARY, C. M. A.; ANTUNES, J. M. A. P.; PERES, M. G.; VICENTE, A. F.; SODRE, M. M.; ROSA, A. R.; MEGID, J. Rabies virus distribution in tissues and molecular characterization of strains from naturally inf