UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Curso de Pós-Graduação em Alimentos e Nutrição Área de Ciência de Alimentos Gustavo Guadagnucci Fontanari ISOLADO PROTÉICO DE FARINHA DE SEMENTE DE GOIABA (Psidium guajava): CARACTERIZAÇÃO DE PROPRIEDADES FUNCIONAIS E TÉRMICAS Araraquara 2006 Gustavo Guadagnucci Fontanari ISOLADO PROTÉICO DE FARINHA DE SEMENTE DE GOIABA (Psidium guajava): CARACTERIZAÇÃO DE PROPRIEDADES FUNCIONAIS E TÉRMICAS Orientador: Prof. Dr. José Paschoal Batistuti Araraquara 2006 Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da Universidade Estadual paulista “Júlio de Mesquita Filho” para obtenção do título de Mestre em Alimentos e Nutrição, Área de Ciência de Alimentos. Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Fontanari, Gustavo Guadagnucci F679i Isolado protéico de farinha de semente de goiaba (Psidium guajava): caracterização de propriedades funcionais e térmicas / Gustavo Guadagnucci Fontanari. – Araraquara, 2006. 117 f. Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Alimentos e Nutrição. Orientador: José Paschoal Batistuti 1.Proteínas – Propriedades funcionais e térmicas. 2. Semente de goiaba. 3. Isolado protéico. 4. Calorimetria diferencial exploratória (DSC). I.Batistuti, José Paschoal, orient. II. Título. CDD: 664.0763 CAPES: 50700006 Gustavo Guadagnucci Fontanari ISOLADO PROTÉICO DE FARINHA DE SEMENTE DE GOIABA (Psidium guajava): CARACTERIZAÇÃO DE PROPRIEDADES FUNCIONAIS E TÉRMICAS Dissertação de mestrado Faculdade de Ciências Farmacêuticas – Departamento de Alimentos e Nutrição - UNESP- Campus Araraquara Área de concentração: Ciência de Alimentos Banca examinadora Presidente: Prof. Dr. José Paschoal Batistuti (UNESP) Membros Pesquisadora Científica Dra. Maria Helena Martini (INST. ADOLFO LUTZ) Prof. Dr. Valdir Augusto Neves (UNESP) Prof. Dr. José Alfredo Gomes Arêas (USP) Prof. Dr. João Bosco Faria (UNESP) AGRADECIMENTOS O presente estudo é fruto de dedicação intensa e grande responsabilidade onde pessoas ao longo dessa trajetória foram importantes com o apoio, suporte técnico e financeiro e principalmente pela amizade: Prof. Dr. José Paschoal Batistuti, Prof. Dr. Fernando Fertonani, Prof. Dr. Valdir Augusto Neves, Prof. Dr. João Bosco Faria; às técnicas(o) Elizene Bonifácio, Maraiza Silva, Roseli, D. Albertina, Adriana, Osmar e todos do DAN; João Fontanari, Geraldo Fontanari e Cláudio Fontanari (tios); Fundação Siban, Capes, Gledison S., Mário A. Germano, Mônica Jacon, Camila M. Mariano e suas inseparáveis amigas Daniele Branta e Ana Luiza F., um agradecimento especial. Também aproveito para dispensar meus agradecimentos a todos os porteiros e vigias: Olívia, Tianna, Chicão, Plínio, Sr. Mário, Lazaretto, Bispo, Ourival, Elclides, Everson, Silvio e Zé Luis, pelo carisma e comprometimento. Um agradecimento ao apoio de informática e bibliotecário: Fernando, Tatiane, Célia, Joel, Marcão, Marcio, Renato, Chicão, Moacir, Max, Rafael, Pedro, Cris, Maria Irani e a simpática Rita. E o principal agradecimento fica à minha família, em especial a minha mãe (Profa. Gislaine), que sempre apoiou e incentivou essa trajetória; ao meu pai (Sr. Napoleão); aos meus irmãos Ricardo, Otávio e Fernando, e carinhosamente aos meus avós: Oscar e Maura, por sempre acreditar. Agradeço também a Deus, por ter concedido muita força, paz e saúde, determinantes em mais um caminho percorrido da minha vida. Amém! Resumo A partir da farinha da semente de goiaba (Psidium guajava), cuja composição centesimal é de aproximadamente 6,17 ± 0,04% de umidade, 8,43 ± 0,12% de proteína e alto teor de fibras, 60,88 ± 0,9%, obteve-se isolado protéico (IP) através da precipitação isoelétrica (pI 4,5), cuja fração majoritária pertence à classe das glutelinas. As condições para o preparo do IP foram definidas a partir da curva de solubilidade em água x pH e temperatura de 25 ± 3 ºC. Tais condições permitiram obter isolados protéicos com rendimento de extração de 45,2 ± 0,5% (pH10,0) e 66,2 ± 0,5% (pH11,5) e elevado conteúdo protéico 96,4 ± 0,5% e 93,5 ± 0,4% respectivamente. A capacidade de absorção de água e óleo foram baixas, apresentando 1,05 ± 0,07 e 2,3 ± 0,01 mL/g proteína respectivamente para IP 10,0 e 1,65 ± 0,07 e 1,70 ± 0,07 mL/g proteína respectivamente para IP 11,5. A maior capacidade de emulsificação, foi observado para o IP 11,5, 140 ± 8 g óleo/g prot., comparado com o IP 10,0, 37 ± 2 g óleo/g prot. A formação de gel foi observada em pH neutro e ausência de sal, apresentando as concentrações de 8% para IP 10,0 e 10% para IP 11,5. A cromatografia revelou a presença de dois picos para ambos isolados com sete frações de proteínas de diferentes pesos moleculares. As curvas TG-DTG / DSC revelaram maior quantidade de água para o IP 10,0 e elevada temperatura de estabilidade térmica 200 oC para ambos isolados. Palavras chave: semente de goiaba, isolado protéico, glutelina, DSC, propriedades funcionais Abstract From the guava seed flour (Psidium guajava), whose centesimal composition belongs to about 6,17 ± 0,04% of moisture, 8,43 ± 0,12% of protein and high content of fibers, 60,88 ± 0,9%, the protein isolate (PI) was obtained through the isoelectric precipitation (Ip 4,5) whose majority belongs to glutelins class proteins. The conditions for the preparation of the PI was defined from the solubility curve in water x pH and temperature of 25 ± 3ºC. Such conditions allowed to obtain protein isolated with extraction yield of 45,2 ± 0,5% (pH10,0) and 66,2 ± 0,5% (pH11,5) and high protein content of 96,4 ± 0,5% and 93,5 ± 0,4% respectively. The absorption capacity for water and oil were low, showing 1,05 ± 0,07 and 2,3 ± 0,01 mL/g protein, respectively, for PI 10,0 and 1,65 ± 0,07 and 1,70 ± 0,07 mL/g protein, respectively, for PI 11,5. The most emulsification capacity was observed for PI 11,5 (140 ± 8 g oil/g prot.), compared to PI 10,0 (37 ± 2 g oil/g prot.). The gel formation was observed in neutral pH and salt absence, showing the concentrations of 8% to PI 10,0 and 10% to PI 11,5. The chromatography shows the presence of two peaks for both protein isolated with seven fractions of proteins with different molecular weights. The curves of TG-DTG / DSC revealed high water quantity for PI 10,0 and high temperature for thermal stability 200 °C for both isolates. Key words: guava seed, protein isolate, glutelin, DSC, functional properties Lista de Figuras Pág. Figura 1 – Comportamento das cargas dos resíduos de aminoácidos das proteínas................................................................................29 Figura 2 – Fluxograma da obtenção das frações protéicas da farinha da semente de goiaba...........................................................................46 Figura 3 – Fluxograma da obtenção do Isolado Protéico da farinha da semente de goiaba. ....................................................................48 Figura 4 – Curvas de solubilidade de proteína da farinha de semente de goiaba (Psidium guajava), obtidas para 1 ≤ pH ≤ 12 e concentração de NaCl variando de 0 a 0,5 mol L-1. T= 25 ± 3 oC....................61 Figura 5 – Curvas de solubilidade dos IP extraído em pH 10,0 e pH 11,5, em temperatura ambiente (25 ± 3) oC, por 30 minutos.......................71 Figura 6 – Cromatografia do IP 10,0 em coluna de filtração em gel de Sepharose CL-6B (100 x 2,5 cm). A proteína foi eluida com tampão Tris/HCl, pH 8,6, contendo azida 0,01%, coletando-se frações de 5,6mL........84 Figura 7 – Cromatografia do IP 11,5 em coluna de filtração em gel de Sepharose CL-6B (100 x 2,5 cm). A proteína foi eluida com tampão Tris/HCl, pH 8,6, contendo azida 0,01%, coletando-se frações de 5,6mL........85 Figura 8 – Cromatografia da fração majoritária isolada em coluna de filtração em gel de Sepharose CL-6B (100 x 2,5 cm). A proteína foi eluida com tampão Tris/HCl, pH 8,6, contendo azida 0,01%, coletando-se frações de 5,6mL...............................................................................................86 Figura 9 – Eletroforese em gel de poliacrilamida dos IPs 10,0 e 11,5 e seus respectivos picos: (1) IP 10,0; (2) 1°pico IP 10,0; (3) 2°pico IP 10,0; (4) IP 11,5; (5) 1°pico IP 11,5; (6) 2°pico IP 11,5.................87 Figura 10 – Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% com SDS dos IPs 10,0 e 11,5: (1) padrão; (2) IP 10,0; (3) 1°pico IP 10,0; (4) 2°pico IP 10,0; (5) IP 11,5; (6) 1°pico IP 11,5; (7) 2°pico IP 11,5...............................................................................................88 Figura 11 – Curvas TG-DTA e DTG do IP preparado empregando pH 11,5, ausência de adição de NaCl e de agentes branqueadores. mi= 4 mg; β= 20 oC min-1; vazão de gás: 100 mL min-1; cadinho de Pt.....................................................................................................90 Figura 12 – Curvas DSC obtidas dos IP extraídos em pH 10,0 e 11,5. mi= 2 mg; β= 20 oC min-1; vazão de gás: 100 mL min-1; cadinho de Al tampado e perfurado (Φ= 1,0 mm)..............................................91 Lista de Tabelas Pág. Tabela 1 – Principais grupos de propriedades funcionais de proteínas............24 Tabela 2 – Composição química da farinha da semente de goiaba (Psidium guavaja)..............................................................................................56 Tabela 3 – Relação da proporção massa e volume de extrator........................59 Tabela 4 – Efeito da variação do tempo na extração da proteína de semente de goiaba (Psidium guajava)...............................................................59 Tabela 5 – Efeito de sais na extração da proteína da farinha de semente de goiaba............................................................................................65 Tabela 6 – Classificação das frações protéicas da farinha da semente de goiaba (Psidium guajava)...............................................................68 Tabela 7 – Rendimento e conteúdo protéico do isolado protéico extraído em pH 10,0 e 11,5...............................................................................69 Tabela 8 – Absorção de água e óleo para farinha de semente de goiaba (Psidium guavaja), IP 10,0 e IP 11,5, respectivamente.........................72 Tabela 9 – Capacidade de emulsão dos Isolados Protéicos extraídos em pH 10,0 e pH 11,5, T= (25 ± 3°C)......................................................................75 Tabela 10 – Atividade e estabilidade da emulsão preparadas para Isolado Protéico 10,0 e 11,5...................................................78 Tabela 11 – Capacidade e estabilidade de formação de espuma em amostras preparadas a partir de Isolados Protéicos 10,0 e 11,5......................80 Tabela 12 – Efeito do pH na formação de gel dos isolados protéicos extraídos em pH 10,0 e 11,5..............................................................................82 Tabela 13 – Efeito da concentração de NaCl na formação de gel dos isolados protéicos extraídos em pH 10,0 e 11,5.........................................83 Lista de siglas e abreviações AE – atividade de emulsão Al – alumínio CE – capacidade de emulsificação COOH – grupo carboxílico DSC – calorimetria exploratória diferencial DTA – análise térmica diferencial DTG – termogravimetria derivada EE – estabilidade de emulsão H – hidrogênio HCl – ácido clorídrico Ip – ponto isoelétrico IP – isolado protéico KCl – cloreto de potássio m/v – relação massa volume N – normalidade N2 – nitrogênio NaCl – cloreto de sódio NaOH – hidróxido de sódio NH2 – grupo amino O/A – óleo em água OH – hidroxila pI – ponto isoelétrico PI – protein isolate prot. – proteína Pt – platina rpm – rotação por minuto SDS – dodecilsulfato de sódio TG – termogravimetria Tris/HCl – tampão Vol. – volume Lista de símbolos % - porcentagem ΦΦΦΦ - diâmetro ββββ - razão de aquecimento ∆∆∆∆m – perda de massa °C – graus Celsius cm – centímetros H2O – água KDa – kilodaltons L – litro M – mol mg – miligrama mi – massa inicial mL – mililitro mm – milímetro nm – nanômetro T – temperatura V – volts SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT LISTA DE FIGURAS LISTA DE TABELAS LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS LISTA DE SÍMBOLOS Pág. 1- INTRODUÇÃO...............................................................................................17 2 – OBJETIVOS.................................................................................................21 3 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................22 4 – MATERIAL E MÉTODOS............................................................................41 4.1 – MATERIAL................................................................................................41 4.2 – MÉTODOS................................................................................................41 4.2.1 – Umidade.................................................................................................41 4.2.2 – Cinzas....................................................................................................41 4.2.3 – Fibras.....................................................................................................42 4.2.4 – Proteína.................................................................................................42 4.2.5 – Lipídeos totais........................................................................................42 4.2.6 – Otimização da extração da proteína da farinha da semente da goiaba...........................................................................................................42 4.2.6.1 – Proporção massa de farinha – volume de extrator ............................42 4.2.6.2 – Variação do tempo na extração da proteína.......................................43 4.2.7 – Influência do pH e concentração de sal na solubilização da proteína.........................................................................................................43 4.2.8 – Influência do tipo de sal na extração da proteína..................................44 4.2.9 – Extração das frações protéicas da farinha albumina, globulina prolamina e glutelina..........................................................44 4.2.10 – Obtenção do isolado protéico (IP).......................................................47 4.2.11 – Efeito do pH na solubilidade do IP.......................................................48 4.2.12 – Capacidade de absorção de água e óleo............................................49 4.2.13 – Capacidade de emulsificação (CE)......................................................49 4.2.14 – Atividade (AE) e estabilidade de emulsão (EE)...................................50 4.2.15 – Capacidade e estabilidade de formação de espuma...........................51 4.2.16 – Gelatinização.......................................................................................52 4.2.17 – Cromatografia em filtração em gel.......................................................53 4.2.18 – Eletroforese..........................................................................................53 4.2.18.1 – Eletroforese em gel de poliacrilamida...............................................53 4.2.18.2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS...............................53 4.2.19 – Análise térmica, obtenção das curvas TG-DTA e DSC.......................55 5 – RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................56 5.1 – Determinação da composição centesimal................................................56 5.2 – Otimização da extração da proteína da farinha da semente da goiaba...58 5.3 – Influência do pH e concentração de sal na extração da proteína.............60 5.4 – Influência do tipo de sal na extração da proteína.....................................63 5.5 – extração das proteínas da farinha da semente de goiaba obtenção das frações albumina, globulina, prolamina e glutelina.....................67 5.6 – Obtenção do isolado protéico...................................................................69 5.7 – Curvas de solubilidade para o IP 10,0 e IP 11,5.......................................70 5.8 – Absorção de água e óleo..........................................................................72 5.9 – Capacidade de emulsificação...................................................................75 5.10 – Atividade e estabilidade de emulsão......................................................77 5.11 – Capacidade e estabilidade de formação de espuma..............................79 5.12 – Gelatinização..........................................................................................81 5.13 – Cromatografia dos isolados protéicos (IP) 10,0 e 11,5...........................83 5.14 – Cromatografia da fração protéica majoritária (Glutelina)........................85 5.15 – Eletroforese.............................................................................................86 5.15.1 – Eletroforese em gel de poliacrilamida..................................................86 5.15.2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS..................................88 5.16 – Análise térmica, obtenção das curvas TG-DTA e DSC..........................89 6 – CONCLUSÃO..............................................................................................93 7 – REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................96 Introdução 17 1 - Introdução A crescente tendência de mercado na fabricação e formulação de alimentos industrializados tem incentivado novas buscas de fontes protéicas, a fim de aumentar o valor nutritivo e as propriedades organolépticas dos alimentos. As proteínas, devido sua grande importância nutricional e suas características físico-químicas, são componentes importantes em muitos alimentos industrializados (DUARTE et al., 1998a; DUARTE et al., 1998b). As indústrias brasileiras, buscando melhor rendimento e competitividade de mercado a nível nacional e internacional, vêm implantando e usando programas de controle e garantia de qualidade, visando alternativa eficaz para enfrentar a demanda e a concorrência, também buscam melhorar a situação econômica na produção do produto, evitando perdas durante o processamento, minimizando o tempo de processo e diminuindo os custos da empresa, elevando sua competitividade de mercado e reduzindo os preços para o consumidor final (WANG et al., 2000). Uma alternativa encontrada por empresários e pesquisadores para suprir a demanda e viabilizar novos produtos tem sido o aproveitamento total da matéria prima e seus sub produtos, durante o processamento (BASTOS, 1989). Estudos realizados com alimentos de origem vegetal vêm enfocando o estudo da caracterização e perfil dos nutrientes presentes nas sementes dos vegetais como fonte de proteína alternativa na dieta humana. De acordo com Pollonio (1998), o estudo de novas fontes protéicas com o objetivo de utilizar suas propriedades funcionais no processamento de alimentos pode ser justificado Introdução 18 por razões de ordem econômica e tecnológica, uma dessas fontes com grande potencial de utilização é o resíduo do processamento industrial de empresas alimentícias como, por exemplo, semente de Tomate (LIADAKIS et al., 1995). A utilização de novas fontes, de custos menores, que possam substituir ou simular alimentos protéicos tradicionais depende do conhecimento das propriedades funcionais das suas proteínas e do seu comportamento em determinado sistema alimentar. As sementes utilizadas como alimento têm sido objeto de estudo devido à presença de alta concentração de proteína e principalmente pela falta de conhecimento na aplicabilidade e utilização na dieta humana. Alimentos preparados a partir de novos compostos ou fontes de proteínas como, concentrados e isolados protéicos, requerem estudos para obter melhor entendimento quanto ao seu comportamento em diversos tipos de sistemas alimentares. Algumas sementes, contendo alto teor de proteínas, têm sido alvo de pesquisas, como é o caso da lentilha (NEVES e LOURENÇO, 1995); do tremoço (LQARI et al., 2002); amaranto (ABUGOCH et al., 2003); tomate (LIADAKIS et al., 1995), entre outros. A caracterização de propriedades dessas proteínas é necessária para fundamentar os estudos básicos e aplicados sobre proteínas dessas sementes (NEVES, 1998). No Brasil, são processadas cerca de 202 mil toneladas de goiaba por ano, onde 6% é semente, que corresponde aproximadamente 12 mil toneladas, atualmente descartada no campo (GOIABRAS, 2003). No Estado de São Paulo, os frutos são destinados aos mercados de frutas frescas e a Introdução 19 industrialização como produção de geléias, goiabadas, sorvetes, doce em pasta e até mesmo guatchup (condimento), sendo a goiaba para mesa, concentrada nas regiões próximas a capital: Valinhos, Vinhedo, Campinas, Atibaia e Mogi das Cruzes. O cultivo nas regiões de Mirandópolis, Pacaembu e Monte Alto é destinado à industrialização, e com a dupla finalidade são cultivadas principalmente nas regiões de Ribeirão Preto, São José do Rio Preto e São Carlos, com destaque aos municípios de Monte Alto, Taquaritinga, Itápolis, Urupês, Vista Alegre do Alto e São Carlos (PEREIRA, 2004). Um estudo realizado por Nicanor et al. (2001), avaliando a composição química da farinha de semente de goiaba mostrou teor de 7,6% de proteína, 61,4% de fibras brutas e 16% de gordura. Do conteúdo total de gordura, 11,8% são ácidos graxos saturados e 87,3% ácidos graxos insaturados (destes 76,5% polinsaturados). Os ácidos graxos presentes são mirístico 0,1%, palmítico 6,6%, esteárico 4,6%, oléico 10,8%, linoléico 76,4%, aracdônico 0,3% e linolênico 0,1% (PRASAD e AZEEMODDIN, 1994). Observa-se na literatura ausência de dados a respeito das características das frações protéicas da semente de goiaba, um fator importante para sua possível utilização e caracterização. Tais tipos de estudos visam à aplicabilidade do material em novos produtos para a indústria de alimentos ou até mesmo seu uso como um suplemento ou agente funcional de sistemas alimentares, como embutidos cárneos (FURTADO et al., 2001). Introdução 20 Considerando-se a importância do desenvolvimento de novos produtos para atender a demanda do mercado de ingredientes, com aplicação na formulação de alimentos e bebidas a partir de fontes alternativas de proteínas, e com a grande quantidade de semente descartada no Brasil, justifica-se a produção e caracterização das propriedades funcionais e estudo térmico da proteína, a partir dessas sementes, através da obtenção de isolados protéicos utilizando-os como possíveis elementos funcionais ou suplementos na alimentação humana. Objetivos 21 2 - Objetivos O objetivo principal desse estudo foi avaliar o potencial de utilização do isolado protéico de semente de goiaba caracterizando suas propriedades funcionais e térmicas, tendo como objetivos específicos: 2.1- Determinação das condições de extração da proteína da farinha obtida a partir da semente de goiaba; 2.2- Fracionamento das proteínas presentes na farinha; 2.3- Obtenção de isolados protéicos a partir da farinha; 2.4- Caracterização de algumas propriedades funcionais dos isolados protéicos obtidos; 2.5- Caracterização de algumas propriedades térmicas dos isolados protéicos obtidos. Revisão Bibliográfica 22 3 - Revisão bibliográfica A indústria de alimentos vem desenvolvendo novos produtos com ingredientes benéficos a saúde; o uso de alimentos de origem vegetal tem sido muito utilizado para substituir os de origem animal; o baixo custo e a presença crescente de doenças do tipo cardiovasculares, diabetes e digestivas são as principais causas dessa preocupação com a dieta humana (NUNES, 2003). A caracterização de propriedades funcionais em sementes utilizadas como alimentos vêm sendo alvo de estudos a fim de avaliar seu potencial de aplicação e fundamentar o conhecimento básico e aplicado sobre as proteínas de sementes. Estudos realizados com a proteína da semente de gergelim demonstraram boa solubilidade em pH básico e ácido, apresentando boas propriedades emulsificantes, e capacidade de reter água e óleo, com potencial para utilização como ingrediente funcional para alimentos industrializados (KHALID et al., 2003). Alimentos preparados a partir de novos compostos ou fontes de proteínas requerem estudo para obter melhor entendimento quanto ao seu comportamento em diversos tipos de sistemas alimentares. Algumas sementes contendo grandes quantidades de proteínas, tem sido alvo de pesquisas, como é o caso da Lentilha; a caracterização de propriedades físico-químicas das proteínas de leguminosas são necessárias para fundamentar os estudos básicos e aplicados sobre proteínas. Estudo de caracterização de proteína são necessários para se obter resultados e informações para então se verificar o potencial de aplicabilidade Revisão Bibliográfica 23 na indústria e na formulação de novos alimentos para o consumo humano ou animal, são esses estudos que apontam a funcionalidade dos nutrientes presentes no alimento para sua aplicação em novos produtos industrializados (BATISTUTI e FREITAS, 1995). Atualmente as proteínas de soja são utilizadas em alimentos, como ingredientes funcionais, com aplicação em produtos de panificação, fórmulas infantis, formulações para nutrição clínica, suplementos protéicos, produtos a base de peixe e como substituto em alimentos lácteos e cárneos (GEISE, 1994; LUSAS e RIAZ, 1995; TAKEITI et al., 2004). Experimentos visando à utilização de resíduos das indústrias de alimentos como fonte alternativa de proteína, vem sendo conduzidos com freqüência na tentativa de suprir as necessidades nutricionais diárias com fontes de proteínas eficientes e economicamente viáveis à população em geral. A substituição de alimentos protéicos de origem animal por alimentos protéicos de origem vegetal vem sendo realizada na tentativa de utilização de novas fontes alimentares com boas propriedades funcionais e nutritivas (NUNES et al., 2003). Nicanor et al. (2001), obtiveram isolados protéicos a partir de semente de goiaba com boas propriedades de digestibilidade, sendo mais hidrolisada que a da soja, demonstrando ser boa fonte de proteína, apresentando valores desejáveis de referencia diário pela FAO, apresentando deficiência em lisina porém boa fonte de triptofano e metionina, classificada como proteína de boa qualidade nutricional, podendo ser utilizada como ingrediente alimentício. Revisão Bibliográfica 24 Propriedades Funcionais Propriedades funcionais de proteínas são denominadas como propriedades químicas e físicas que afetam seu comportamento em sistemas alimentares durante o processamento, estocagem, preparo e consumo, onde se classificam como principais classes funcionais às propriedades organolépticas, de hidratação, de superfície, de ligação, de estrutura, reológicas, etc. (BASTOS, 1989; ZAYAS, 1997). Os principais grupos de propriedades funcionais encontram-se na Tabela 1. Tabela 1 – Principais grupos de propriedades funcionais de proteínas. Propriedade Geral Propriedades Funcionais Específicas Sensorial Cor, sabor, odor, textura, palatabilidade Hidratação Solubilidade, dispersilibidade, umidicidade, absorção de água, intumescimento- espessamento, gelatinização, capacidade de ligação de água. Atividade de superfície e ligante Emulsionantes, espumante, aeração, formação de filme, lipídeo-ligante, aroma- ligante. Reológica e estrutural Elasticidade, coevisidade, viscosidade, adesividade, formação de gel, formação de massa, texturizabilidade, extrudabilidade. Enzimática Coagulação, proteólise limitada. Fonte: Lourenço, (2000). Revisão Bibliográfica 25 A funcionalidade está estritamente relacionada com a estrutura da proteína, e o conhecimento da relação estrutura/funcionalidade permite a modificação de proteínas de modo a torná-las funcionais e atraentes. As propriedades funcionais das proteínas são influenciadas por diversos parâmetros intrínsecos, além de fatores relacionados às metodologias utilizadas em seu estudo (DUARTE et al., 1998a; DUARTE et al., 1998b; KABIRULLAH e WILLS, 1982). Assim, o conhecimento das propriedades intrínsecas das proteínas, como seqüência de aminoácidos, conformação, tamanho molecular, ligação intra e intermoleculares e o modo como são afetadas pelo meio, aliado a métodos padronizados de medidas de propriedades funcionais, irá resultar em um grande avanço na área de desenvolvimento de novas fontes protéicas (CANELLA, 1978; KINSELLA, 1982; KITABATAKE et al., 1988). Solubilidade A solubilidade de proteínas é a propriedade funcional que deriva da interação proteína-água, em geral é a primeira propriedade investigada na avaliação de suas propriedades funcionais, por isso, é um indicador do potencial de utilização funcional de proteínas, em especial na formação e estabilidade de emulsão e espuma, na formação de gel, na capacidade de absorção e ligação de água, e no aumento de viscosidade (LOURENÇO, 2000). Revisão Bibliográfica 26 A solubilidade das proteínas é influenciada pela composição e seqüência de aminoácidos, peso molecular, conformação das moléculas, conteúdo de grupos de aminoácidos polares e apolares, que está diretamente ligado com a densidade e distribuição das cargas elétricas, que por sua vez são influenciadas pelo pH do meio, natureza e concentração de íons ou força iônica e temperatura (ZAYAS, 1997). A solubilidade da proteína está diretamente relacionada com o balanço de hidrofilicidade/hidrofobicidade, determinado pelas cargas de resíduos laterais de aminoácidos, deste modo a composição de aminoácidos da proteína afeta suas características de solubilidade (DAMODARAN e PARAF, 1997). A solubilidade é uma propriedade físico-química fundamental das proteínas pela importância que exerce sobre as demais propriedades das proteínas nos alimentos. Em geral, a solubilidade da proteína é influenciada pela maior, ou melhor, afinidade das moléculas de proteínas pelo solvente, no caso dos alimentos é a água, daí o fato da solubilidade ser classificada como propriedade hidrofílica (SGARBIERI, 1996). As características de solubilidade em água determina condições apropriadas de extração e fracionamento de proteínas nos alimentos. Através do estudo de solubilidade verifica-se também o efeito do processamento de extração da proteína no perfil de solubilidade apresentado pela mesma (LOURENÇO, 2000; MORR et al., 1985). A proteína, para se solubilizar, depende de fatores intrínsecos e extrínsecos, entre os fatores intrínsecos estão à composição e seqüência de Revisão Bibliográfica 27 aminoácidos, tamanho e conformação das moléculas, relação hidrofilicidade/hidrofobicidade de superfície (capacidade dos grupos hidrófilos carregados de cadeia lateral dos aminoácidos de solvatar água por meio de pontes de hidrogênio, da interação da proteína com sais presentes no meio aquoso e da repulsão eletrostática entre moléculas e agregados protéicos carregados, ou seja, é o resultado do balanço entre a atração intermolecular das proteínas e a atração proteína-solvente) (GUERRERO et al., 2002; ZAYAS, 1997). Além dos fatores intrínsecos, a solubilidade protéica é muito influenciada por fatores extrínsecos, entre os quais são relevantes: tratamento térmico aplicado ao alimento ou à proteína, concentrações de sais, pH do meio, condições de processamento, concentração de proteína e interação com outros componentes do alimento ou do meio (LOURENÇO, 2000). De acordo com Sgarbieri (1996), considerando a solubilidade, as proteínas classificam-se mediante a sua dispersão em diversos tipos de solventes em: Albuminas – solúveis em água e coaguláveis pelo calor, representam um grande grupo em que a albumina do ovo e a albumina do soro sanguíneo constituem exemplos típicos. Globulinas – insolúveis ou muito pouco solúveis em água, a solubilidade é aumentada com a adição de sais neutros como NaCl. São facilmente coaguláveis pelo calor e podem ser isoladas a partir de tecidos animais e Revisão Bibliográfica 28 vegetais por serem facilmente extraídas com soluções salinas (2 a 10% de NaCl). Em geral são encontradas nas sementes. Prolaminas – são normalmente encontradas em sementes de cereais sendo insolúveis em água e em soluções salinas e solúveis em soluções alcoólicas (70-80% de etanol). Glutelinas – insolúveis em água, soluções salinas e alcoólicas sendo porém solúveis em soluções ácidas e alcalinas diluídas. Escleroproteínas – insolúveis em água, soluções salinas, soluções alcoólicas, soluções ácidas e básicas, por fazerem parte das estruturas celulares e serem praticamente insolúveis. Normalmente são proteínas fibrilares como, por exemplo, o colágeno, as queratinas a fibroína, a elastina. A solubilização dessas proteínas requer comumente a ação de agentes de degradação das moléculas, como ácidos e bases, detergentes e dispersantes. Histonas – são proteínas básicas solúveis em água e que liberam, pela hidrólise, grande quantidade de aminoácidos básicos. As histonas podem ser extraídas em grandes quantidades de certos tecidos glandulares como o timo e o pâncreas. A maioria das histonas aparece combinada com os ácidos nucléicos (nucleoproteína). Protaminas – proteína fortemente básica, de baixo peso molecular, também aparece associada a ácidos nucléicos e são obtidas em grandes quantidades de células espermáticas de peixes. Essas proteínas não contêm enxofre, contém elevado teor de nitrogênio (25-30%) devido à presença na molécula de grande quantidade de arginina. Tirosina e triptofano também estão Revisão Bibliográfica 29 ausentes nas protaminas, exemplos típicos são salmina (esperma de salmão), clupeína (esperma de arenque) e esturgina, extraída de esturjão. Um fator determinante para a solubilidade da proteína é o pH do meio. O fato das proteínas solubilizarem em meio aquoso é o resultado de interações eletrostáticas e hidrofóbicas entre as moléculas de proteínas (ZAYAS, 1997). O pH de menor solubilidade é denominado pI (ponto isoelétrico), que possui igual número de cargas positivas e negativas nas moléculas. Por se compensarem intrinsecamente quanto às cargas de suas cadeias laterais, no pI as moléculas não se repelem, devido à falta das repulsões eletrostáticas, e com isso ocorre a formação de agregados havendo uma precipitação, acarretando a diminuição da solubilidade (LOURENÇO, 2000). A Figura 1 representa o comportamento das cargas dos resíduos de aminoácidos em pH de 1 a 12. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 pH FIGURA 1 – Comportamento das cargas dos resíduos de aminoácidos das proteínas. 1- Proteína protonada (H+), meio ácido (pH ente 1 e 4), carga positiva. 2- Ponto isoelétrico, cargas iguais (pH 4,5 a 5,5), baixa ou nenhuma solubilidade. 3- Proteína desprotonada (OH-), meio alcalino (pH entre 8 a 12), cargas negativas. Revisão Bibliográfica 30 A solubilidade tende, em geral, ser maior em pH alcalino na faixa de pH 8,0 a 12,0 e em valores de pH ácido, pH 1,0 a 4,0, excesso de cargas de mesmo sinal produz repulsão das moléculas, que contribui para sua maior solubilidade (SGARBIERI, 1996). A solubilidade mínima ocorre na faixa de pH 4,5 a 5,5, que compreende a faixa do ponto isoelétrico (pI) das proteínas, onde as cargas são iguais e nulas, ocorrendo insolubilização das proteínas formando precipitados protéicos (LOURENÇO, 2000). Damodaran e Paraf (1997), apontam que a solubilidade protéica é afetada sensivelmente pelo balanço entre repulsões e atrações de forças intermoleculares, que por sua vez são definidas pelos grupos de aminoácidos em sua cadeia lateral, cujas cargas são compreendidas e classificadas em tipos diferentes de aminoácidos, de acordo com sua polaridade e cadeia lateral em: Cadeia lateral apolar (não possuem cargas em seus resíduos laterais, são considerados hidrofóbicos por não solubilizar em água). Fenilalanina Triptofano Revisão Bibliográfica 31 Cadeia lateral polar não carregada (não possuem cargas em seus resíduos laterais) são aminoácidos hidrofílicos, solubilizam com a água e contém grupos hidroxilas, sulfidrilas e grupamentos amidas. Prolina – Forma anel imina Alanina Valina Isoleucina Metionina Cisteína Treonina Revisão Bibliográfica 32 Cadeia lateral polar com cargas positivas (possuem cargas básicas em suas cadeias laterais, encontra-se na forma protonada em pHs ácidos) são aminoácidos diamínicos e monocarboxílicos, ou seja, possuem dois grupamentos básicos (NH2) e um grupamento ácido (COOH). Serina Asparagina Glutamina Glicina Tirosina Revisão Bibliográfica 33 Cadeia lateral polar com cargas negativas (possuem cargas ácidas em suas cadeias laterais) são monoamínico e dicarboxílico, ou seja, possuem dois grupamentos ácidos (COOH) e um grupamento básico (NH2). Capacidade de absorção de água e óleo Em virtude do conteúdo e distribuição de seus resíduos de aminoácidos polares (hidrófilos) e apolares (hidrófobos) na estrutura primária e das características das estruturas secundárias e terciárias, as proteínas agem como agentes ativos de superfície. Os agentes ativos de superfície, por causa da afinidade de seus grupos polares pela água e aversão de seus grupos apolares por esse solvente, adsorvem e distribuem-se nas interfaces fluido- fluido e água-ar com seus grupos polares orientados para a fase aquosa e os Histidina Lisina Arginina Ácido aspártico Ácido glutâmico Revisão Bibliográfica 34 grupos apolares orientados para a fase óleo ou ar, para formar emulsões e espumas, respectivamente. As moléculas protéicas, além de reduzir a tensão interfacial, formam, na interface, filme contínuo em decorrência de interações intermoleculares complexas (KINSELLA, 1984; LOURENÇO, 2000). As propriedades funcionais de interação proteína-água, intumescimento (inchamento), sorção, ligação e retenção de água (g de água ligada/ g de proteína) são importantes na formulação de alimentos, sobretudo de produtos derivados da carne – embutidos, salsichas, almôndegas, salgados- produtos de panificação e confeitaria – tortas, massas, doces, pudins, cremes de cobertura de sobremesas – nos quais as proteínas devem embeber e reter água sem dissolver e, simultaneamente, conferir corpo (espessamento). À medida que as proteínas absorvem água elas intumescem. A capacidade de intumescimento ou absorção e de retenção de água dependem de fatores extrínsecos, tipo e composição do material protéico, tempo em água, pH e força iônica do meio e temperatura do processamento, e de propriedades intrínsecas das proteínas, estrutura e organização espacial das proteínas do material. Os produtos protéicos de soja possuem boas propriedades de retenção de água: farinhas, concentrados protéicos e isolados protéicos de soja retém 2,6; 2,75 e 6,25 g de água/g de produto, respectivamente; a retenção de água do isolado protéico é máxima na faixa de pH 5,0 a 7,0 (HERMANSSON, 1973; LOURENÇO, 2000). De acordo com Naczk et al. (1986), a propriedade de absorção de água de uma proteína determina seu grau de interação com a água; Sathe et al. (1982b) e Sosulski e Mccurdy (1987), sugerem que a composição das frações Revisão Bibliográfica 35 protéicas e a seqüência de aminoácidos polares e apolares, são determinantes na resposta ao teste de capacidade de absorção de água e óleo. Os resultados de capacidade de absorção de água e óleo são normalmente expressos em gramas de água e ou óleo absorvido por grama de proteína. Alguns trabalhos apresentam resultados expressos em mL de água e ou óleo por grama de proteína, para esses casos, Sathe et al. (1982a), consideram a densidade da água igual a 1 g/mL e o valor de densidade do óleo determinado como 0,93 g/mL, dessa forma pode-se transformar os resultados de capacidade de absorção de água e óleo por g água e ou óleo / g de amostra. Propriedades de emulsão As proteínas despertam grande interesse industrial na tecnologia de alimentos, especialmente para os produtos emulsionados, isto ocorre devido a suas propriedades funcionais e nutricionais, que contribuem para a firmeza das emulsões, aumentam sua estabilidade e conferem aos produtos maior valor nutritivo, por serem fontes de aminoácidos (HEKKEN e STRANGE, 1993; KINSELLA, 1984). A emulsão compreende a dispersão de dois líquidos imiscíveis, tendo uma fase dispersante como fase contínua e uma fase dispersa na forma de gotículas. Em geral, as emulsões alimentares são do tipo óleo em água (O/A) ou água em óleo (A/O) onde o termo óleo, designa um líquido hidrófobo (PEARCE e KINSELLA, 1976; ORNELLAS et al., 2000). Revisão Bibliográfica 36 As proteínas se adsorvem na interface entre as gotículas de óleo dispersas e a fase aquosa contínua, desempenhando propriedades de espessamento, viscosidade, elasticidade e rigidez, que determinam a resistência das gotículas à coalescência, tendo portanto funções de facilitar a formação da emulsão, diminuindo a tensão interfacial e contribuindo para a estabilidade da emulsão, formando uma barreira física na interfase. Segundo Cheftel et al. (1985), a formação de gotículas emulsificadas ocorre com a criação de superfície interfacial entre as duas fases líquidas imiscíveis, esta superfície interfacial aumenta na forma não exponencial, enquanto o diâmetro das gotículas diminui atingindo então a forma de emulsão. A formação da emulsão é facilitada com a redução da tensão interfacial entre água e óleo (ELIZALDE et al., 1988). A propriedade emulsificante da proteína é importante para vários produtos alimentares, tais como creme de leite, glacês, manteiga, queijo fundido, maionese, carne finamente moída do tipo utilizada em salsichas e outros embutidos, além de que os constituintes protéicos exercem função importante na estabilização do sistema coloidal (CHEFTEL et al., 1985). Gelatinização A formação de gel ou gelatinização de proteínas é uma propriedade funcional térmica de ampla utilização em alimentos formulados. Na gelatinização a interação proteína-proteína, interação proteína-água e as forças de atração-repulsão cruzadas estabelecidas entre as cadeias polipeptídicas Revisão Bibliográfica 37 desnaturadas, devem estar balanceadas de maneira a permitir a formação de rede ou matriz protéica tridimensional contínua, capaz de reter grande quantidade de água (LOURENÇO, 2000; ZAYAS, 1997). O processo de formação da rede tridimensional dos géis protéicos envolve duas etapas, onde a primeira consiste o estado sol, solução que contenha quantidade de proteína suficiente para formar a rede protéica após desnaturação, provinda de aquecimento térmico formando o estado progel, segunda etapa do processo, ocorrendo um alinhamento das cadeias peptídicas e formando agregados constituído de rede protéica tridimensional cruzada, retendo água no interior das cadeias e conseqüentemente formando o gel (LOURENÇO, 2000). A reação inicial do processo de gelatinização, em geral, envolve o enfraquecimento e quebra das pontes de hidrogênio e dissulfídicas desestabilizando a estrutura conformacional das proteínas, posteriormente ocorre polimerização das moléculas de proteína produzindo uma estrutura tridimensional capaz de imobilizar fisicamente parte do solvente, através de ligações dissulfídicas intermoleculares, interações hidrofóbicas, iônicas e por pontes de hidrogênio (ANTUNES et al., 2003). A integridade física do gel é mantida pelo contrabalanceamento das forças de atração e repulsão entre as moléculas de proteína e destas com o solvente circundante (ZIEGLER e FOEGEDING, 1990). Revisão Bibliográfica 38 Analise térmica A análise térmica constitui um grupo de técnicas de grande interesse na caracterização de alimentos, visto que proporcionam dados relevantes ao processamento industrial de substâncias alimentícias, em um tempo relativamente curto e com certa especificidade quando associada a outras técnicas (CARRASCO, 1993; KEATTCH et al., 1975). A maioria dos alimentos sofre variações de temperatura durante sua produção, transporte, estocagem, preparação e consumo, essas mudanças de temperatura causam alterações nas propriedades físico-químicas dos alimentos, influenciando nas propriedades do produto final, tal como sabor, aparência, textura e estabilidade (RAEMY, 2003). As reações químicas como as hidrólises, oxidação ou redução, promovem mudanças físicas como evaporação, fusão, cristalização, agregação ou geleificação (RELKIN, 2005). A melhor compreensão da influencia da temperatura nas propriedades dos alimentos permite a otimização das condições de processos e melhoramento da qualidade do produto final (SILVA et al., 2001). A maioria dos controles utilizados nas indústrias de alimentos incorpora processos de aquecimento e resfriamento, como por exemplo, pasteurização, esterilização, cozimento, secagem, resfriamento e congelamento. Um importante conjunto de técnicas empregadas para o controle de qualidade no processamento de alimentos é a análise térmica (AMORIM et al., 2004; MAGOSHI et al., 2002; RAEMY, 2003; ROOS, 2003; SCHIRALDI e FESSAS, 2003). As técnicas TG-DTG e DSC têm sido aplicadas ao estudo de isolados Revisão Bibliográfica 39 protéicos (FONTANARI et al., 2006; MOHAMED, 2002; ORTIZ e WAGNER, 2002). Magoshi et al. (2002), estudaram as propriedades térmicas (transição vítrea, cristalização, estabilidade térmica, etc.) de filmes preparados a partir de isolado protéico (prolamina) de sementes de arroz, trigo e soja empregando as técnicas TG e DSC e técnicas auxiliares (XRD e IR). Roos (2003), estudou as propriedades térmicas de sistemas alimentares concentrados (baixo conteúdo de água e alimentos congelados) procurando entender as relações entre as propriedades dos alimentos e variações no parâmetro qualidade. Recentemente Amorim et al. (2004), evidenciaram a dimensão anual de rejeito de cascas de arroz (2,8 milhões de ton / ano), produzidas pelo Brasil. Os autores empregaram as técnicas TG/DTG e DSC para estudar o processo de gelatinização, teores de água e de cinzas em arroz e o estudo cinético do processo de eliminação de água. Fontanari et al. (2006), trabalhando com isolado protéico extraído da semente da goiaba, caracterizou a estabilidade e decomposição de cada condição de extração da proteína e também pôde observar que a técnica termogravimétrica obteve melhor repetitividade na determinação de água e cinzas. As potencialidades analíticas da termogravimetria no controle de qualidade dos alimentos têm despertado o interesse dos pesquisadores, devido à diminuição do tempo das análises e quantidade de amostra requerida, além Revisão Bibliográfica 40 de poder ser utilizada na obtenção de parâmetros cinéticos através de métodos de cálculo adequados (WENDLANDT, 1964). Os teores de umidade e cinzas, são parâmetros determinantes no controle de qualidade, o teor de umidade é utilizado para o controle microbiológico no armazenamento e a comercialização dos produtos e o teor de cinzas é utilizado para indicar a quantidade de minerais (ACCQUISTUCCI et al., 1991). Material e Métodos 41 4 - Material e métodos 4.1 - Material As sementes de goiaba foram obtidas das indústrias de alimentos Predileta. S. A. (São Lourenço do Turvo, SP), foram lavadas com água, para a remoção de fibras, secas a temperatura ambiente, trituradas previamente em moinho de facas por 10 minutos com malha de 1 mm e desengorduradas com éter etílico sob refluxo em aparelho de soxhlet. Após esta fase o produto foi exposto a temperatura ambiente para remoção do solvente; pulverizada em moinho de martelo com malha 0,4 mm e classificadas por tamis de 60 mesh (partículas de 0,250 mm) para a obtenção da farinha. 4.2 - Métodos 4.2.1 - Umidade A determinação de umidade foi realizada por método gravimétrico em estufa regulada a 105°C, até peso constante, conforme descrito pela AOAC (1995). 4.2.2 - Cinzas A determinação de cinzas foi realizada por método gravimétrico em forno tipo mufla, até peso constante, conforme descrito pela AOAC (1995). Material e Métodos 42 4.2.3 - Fibras A determinação de fibra foi realizada pelo método de fibra detergente acido, conforme descrito pela AOAC (1995). 4.2.4 - Proteína O teor de proteína total foi determinado pelo método de Kjeldahl, utilizando-se do fator de conversão de 6,25, conforme descrito pela AOAC (1995). 4.2.5 - Lipídeos totais O teor de lipídeos totais foi determinado pelo método de Bligh Deyer, conforme descrito pela AOAC (1995). 4.2.6 - Otimização da extração da proteína da farinha da semente da goiaba 4.2.6.1- Proporção massa de farinha – volume de extrator Alíquotas de farinha da semente da goiaba, com teor de proteína conhecido foram dispersas em solução aquosa, e estabelecidas diferentes proporções entre massa e volume, sendo o pH de extração ajustado em pH 10,0 com NaOH. A dispersão foi mantida sob agitação mecânica por uma hora a velocidade constante e temperatura de 4°C. O material foi centrifugado a Material e Métodos 43 8000 rpm/40min e, do sobrenadante foram colhidas alíquotas para a determinação do nitrogênio (N2) solúvel pelo método de KJELDAHL (AOAC, 1995). 4.2.6.2 - Variação do tempo na extração da proteína Alíquotas de farinha da semente da goiaba, com teor de proteína conhecido foram dispersas em solução aquosa na proporção m/v (1:10), nos intervalos de tempo entre; 10, 20, 30, 60 e 120 minutos, sendo o pH de extração ajustado em pH 10,0 com NaOH. A dispersão foi mantida sob agitação mecânica por uma hora a velocidade constante e temperatura de 4°C. O material foi centrifugado a 8.000 rpm/40min e, do sobrenadante foram colhidas alíquotas para a determinação do nitrogênio solúvel pelo método de KJELDAHL (AOAC, 1995). 4.2.7 - Influência do pH e concentração de sal na solubilização da proteína A solubilidade da farinha e do isolado protéico, foi determinado seguindo o método descrito por Wang e Kinsella (1976). Amostras de 1 g de farinha com teor de proteína conhecido foram dispersas em água destilada, na proporção massa-volume 1:30. O pH da suspensão foi ajustado ao valor desejado com HCl e/ou NaOH, o material foi agitado por 1 hora a velocidade constante e temperatura ambiente (25 ± 3 °C). Após esse tempo o material foi centrifugado a 8.000 rpm/60min; do sobrenadante foram colhidas alíquotas para a determinação do nitrogênio solúvel pelo método de KJELDAHL (AOAC, 1995). Material e Métodos 44 Para a avaliação do efeito combinado da concentração de NaCl e da variação do pH na extração da proteína, as amostras foram dispersas em água destilada com a proporção de 0,2 e 0,5M de NaCl e o mesmo procedimento foi realizado. 4.2.8 - Influência do tipo de sal na extração da proteína A influência de alguns sais na extração da proteína foi verificada pela dispersão de alíquotas de 1 grama de farinha, com teor de proteína conhecido, em água destilada, na proporção massa-volume de 1:100, seguido da adição do sal até atingir a concentração final desejada. A suspensão foi submetida à agitação mecânica por 1 hora à temperatura de 4°C, no pH da solução, e submetido à centrifugação a 8.000 rpm/40min. No sobrenadante recolhido, foi medido o pH e determinado o nitrogênio solúvel pelo método de KJELDAHL (AOAC, 1995). 4.2.9 - Extração das frações protéicas da farinha Obtenção das frações albumina, globulina, prolamina e glutelina A extração das frações foi realizada adotando-se o critério de solubilidade em diferentes sistemas extratores, baseado em procedimento de Osborne, com algumas modificações segundo Neves et al. (1996). Alíquotas de farinha desengordurada foram dispersas em água destilada na proporção massa-volume 1:30, submetidas à agitação mecânica durante 1 hora a 4°C e centrifugadas a 8000rpm/40 min. O resíduo obtido (R1) separado e o Material e Métodos 45 sobrenadante dialisado contra água destilada durante 72 horas a 4°C, com várias trocas de água. O precipitado protéico (P1) foi coletado por centrifugação e separado. O sobrenadante pós-diálise foi liofilizado e representa a fração albumina total. O resíduo R1 obtido na operação anterior foi disperso em solução de NaCl 0,5 M e submetido à agitação mecânica durante 1 hora a 4°C e centrifugado. O resíduo obtido (R2) separado e o sobrenadante dialisado por 48 horas contra água destilada a 4°C, com várias trocas de água. O precipitado (P2) foi separado por centrifugação e o sobrenadante descartado. Os precipitados P1 e P2 foram reunidos representando a fração globulina total da farinha. O resíduo R2 foi disperso em solução alcoólica a 70%, submetido à agitação mecânica durante 1 hora a 4°C e centrifugado. As proteínas solubilizadas no álcool representam a fração prolamina. O resíduo decantado (R3) foi disperso em solução de NaOH 0,1 N, submetido à agitação mecânica durante 1 hora a 4°C e centrifugado. A proteína do sobrenadante representa a fração glutelina. O resíduo final obtido por centrifugação, foi liofilizado e a proteína presente representando a proteína insolúvel nos solventes utilizados no processo de extração. Os percentuais de proteína extraídas em cada fase foram calculados tomando-se como base a proteína total da farinha. A fração quantitativamente majoritária foi separada e utilizada para os ensaios. A operação de extração foi repetida duas vezes. O procedimento geral para extração das diferentes frações protéicas está descrito na Figura 2. Material e Métodos 46 Figura 2 – Fluxograma da obtenção das frações protéicas da farinha da semente de goiaba. *Seguido de reextração. Farinha de semente de goiaba (Psidium guajava)* 10gr/300mL H2O (1:30) Extração 1h/4°C Centrifugação 8000rpm/40min Resíduo Insolúvel em água Sobrenadante (A) Diálise de 72h / 8000 rpm/40 min. Sobrenadante ALBUMINAS Precipitado (P1) GLOBULINAS Resíduo (R1) * NaCl 0,5 M / extração 1h/4°C / 8000 rpm/40min Sobrenadante (B) Diálise de 48h / 8000rpm/40min Resíduo (R2) * Álcool 70% / Extração 1h/4°C / 8000rpm/40min Sobrenadante descarte Precipitado (P2) GLOBULINAS Resíduo (R3) * NaOH 0,1N/ Extração 1h/4°C 8000rpm/40min Sobrenadante Prolaminas Sobrenadante GLUTELINAS Material e Métodos 47 4.2.10 - Obtenção do isolado protéico (IP) O isolado protéico, liofilizado, foi obtido de acordo com metodologia descrita por Liadakis et al. (1995) modificado. A modificação foi referente à extração, realizada por agitação mecânica na proporção (1:30 m/v), com ajuste de pH em 10,0 e 11,5, empregando solução de NaOH 0,5 mol L-1, em temperatura ambiente (25 ± 3 oC), por 30 minutos. A suspensão foi centrifugada a 8000 rpm/30 min. O sobrenadante foi recolhido em béquer de 500 mL e a proteína precipitada em pH 4,5 (ponto isoelétrico) com a adição lenta de HCl 0,5 mol L-1. A suspensão de proteína foi submetida à centrifugação a 8000 rpm/30 min. O precipitado foi separado do sobrenadante, tratado com água, o pH ajustado a 7,0 e, posteriormente, liofilizado e homogeneizado, tendo sido calculado o rendimento de extração e o conteúdo protéico, determinado pelo método de KJELDAHL (AOAC, 1995). O fluxograma está representado na Figura 3, ilustrando todas as etapas do método adotado para a obtenção do IP. Material e Métodos 48 Figura 3 – Fluxograma da obtenção do Isolado Protéico (IP) da farinha da semente de goiaba, seguindo o procedimento de Liadakis et al. (1995). 4.2.11 - Efeito do pH na solubilidade do IP A solubilidade do isolado protéico, foi determinado seguindo o método descrito por Wang e Kinsella (1976). Amostras de IP com teor de proteína conhecido foram dispersas em água destilada, na proporção massa-volume 1:30. O pH da suspensão foi ajustado ao valor desejado com HCl e/ou NaOH, o material foi agitado por 1 hora a velocidade constante e temperatura ambiente (25 ± 3 °C). Após esse tempo o material foi centrifugado a 8.000 rpm/60min; do Farinha de semente de goiaba (Psidium guajava) Extração em T°C (25 ± 3), por 1h com ajuste de pH Proporção m/v (1:30) Centrifugação 8000rpm/40min Sobrenadante Precipitação em pH 4,5 Centrifugação 8000rpm/40min Liofilizado Resíduo Precipitado Ressuspenso em H2O Ajustado em pH 7,0 Sobrenadante Material e Métodos 49 sobrenadante foram colhidas alíquotas para a determinação do nitrogênio solúvel pelo método de KJELDAHL (AOAC, 1995). 4.2.12 - Capacidade de absorção de água e óleo A capacidade de absorção de água e óleo foi determinada usando o método de Lin et al. (1974 apud WANG e KINSELLA, 1976), modificado. O volume de 10mL de óleo de soja e/ou água destilada foram homogeneizados por 3 minutos, em tubos de centrífuga com capacidade de 35mL, com a quantidade de material (IP) equivalente a um (1) grama de proteína, e mantidos em repouso em temperatura ambiente (25 ± 3°C) por 30 minutos, posteriormente centrifugados a 7000 rpm/30 minutos. A capacidade de absorção, foi determinada pela diferença entre o volume total e o volume livre, os resultados foram expressos em mL água e/ou óleo absorvido por grama de proteína (mL/g prot.). 4.2.13 - Capacidade de Emulsificação (CE) A capacidade de emulsificação foi determinada pelo método de Swift et al. (1961 apud WANG e KINSELLA, 1976). Alíquotas de pesos diferentes das amostras foram pesadas em béquer de 50 mL, com auxílio de balança analítica, e homogeneizados em 20mL de água destilada. A mistura foi mantida sob agitação magnética por 10 minutos e, em seguida transferida para copo de liquidificador, de tamanho pequeno, adaptado para este procedimento. O Material e Métodos 50 béquer foi lavado com 5 mL de água, para retirada de possíveis resíduos. Em seguida, a mistura, foi homogeneizada na velocidade de aproximadamente 16.000 rpm, e a adição de óleo de soja, em fluxo constante (69mL/minuto) até o momento de quebra da emulsão, determinada pela mudança de viscosidade da mistura juntamente com a mudança de som. A quantidade de óleo emulsionado foi determinada pela diferença de peso do seu reservatório. Os resultados foram expressos em gramas de óleo emulsionado por grama de proteína. 4.2.14 - Atividade (AE) e estabilidade de emulsão (EE) A atividade emulsificante e estabilidade de emulsão foram determinadas pelo método de Yasumatsu et al. (1972 apud WANG e KINSELLA, 1976), com modificações. Suspensões contendo volume de 20mL a 3,5% m/v (massa protéica) tiveram o pH ajustado em 3,0, 7,0 e 8,5, seguido de homogeneização em velocidade constante por 10 minutos com auxilio de agitador magnético, tendo seu conteúdo transferido ao copo adaptado de liquidificador, onde foi acionado à agitação de 16000rpm seguido da adição de 20mL de óleo de soja com fluxo contínuo de 1mL por segundo, no prazo de 1 minuto. A emulsão formada foi dividida em tubos de centrífuga e centrifugados à 6000 rpm por 5 minutos. A atividade de emulsão foi determinada como sendo o percentual do peso da camada que continuou emulsionada após a centrifugação, o cálculo foi feito de acordo com a equação abaixo: Material e Métodos 51 A estabilidade de emulsão foi determinada pelo aquecimento da emulsão a 80°C por 30 minutos em banho Maria seguido de refrigeração à 15°C e, centrifugação à 6000 rpm por 5 minutos. A estabilidade da emulsão foi calculada como sendo o percentual do peso da camada emulsificante que permaneceu emulsionada após sofrer tratamento térmico, o cálculo foi feito de acordo com a equação abaixo: 4.2.15 - Capacidade e estabilidade de formação de espuma A capacidade e estabilidade de formação de espuma foram determinadas pelo método de Coffman e Garcia (1977 apud LAWAL, 2004), com algumas modificações. Alíquotas de IP nas concentrações de 2% m/v (massa protéica) foram dispersos em 25mL de água destilada homogeneizadas em liquidificador na velocidade de 16000 rpm por 1 minuto. A mistura foi Peso da camada emulsionada do tubo (%) AE= X 100 Peso total do conteúdo do tubo Peso da camada emulsionada após aquecimento (%) EE= X 100 Peso total do conteúdo do tubo Material e Métodos 52 imediatamente transferida para uma proveta graduada de 50mL e o volume foi anotado. O volume de espuma formado no final do período de (1 minuto) de homogeneização, representou a capacidade de formação de espuma, e foi expressa como sendo a percentagem do aumento do volume inicial da dispersão, calculada de acordo com a equação abaixo: A estabilidade da espuma foi avaliada como sendo a diminuição do volume nos intervalos de tempo de 20, 40, 60 e 120 minutos. As determinações foram realizadas com ajustes em pH 3,0, 7,0 e 8,5. 4.2.16 - Gelatinização As propriedades de geleificação foram realizadas utilizando o método descrito por Coffman e Garcia (1977 apud LAWAL, 2004) com algumas modificações. Suspensões nas proporções (m/v) (massa protéica) 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 e 20% foram homogeneizadas e transferidas em tubos de ensaio com água destilada. Os tubos foram aquecidos a 98°C em banho Maria por 60minutos seguidos de refrigeração a 5°C em banho de gelo por 2 horas. A formação do gel foi observada para a concentração (m/v) que ao inverter o tubo nada foi escorrido. Vol. após homogeneização – Vol. Antes da homogeneização Volume (%) = X 100 Volume antes da homogeneização Material e Métodos 53 4.2.17 - Cromatografia de filtração em gel Alíquotas de 9,5mL de IP 10,0 e 11,5, contendo 55,57 mg/prot. e 52,72 mg/prot. respectivamente, foram levadas ao pH 8,6, com adição de NaOH e aplicada em coluna de Sepharose CL-6B (100 x 2,5cm), previamente equilibrada com tampão Tris-HCl, pH 8,6, contendo azida 0,01%. Na eluição, foram coletadas frações de 5,6 mL; o perfil de eluição acompanhado registrando-se a absorbância a 280 nm. Do material obtido, foram retiradas alíquotas para a determinação da proteína pelo método de Lowry et al. (1951) e para eletroforese em gel de poliacrilamida. 4.2.18 – Eletroforese 4.2.18.1 – Eletroforese em gel de poliacrilamida A eletroforese em gel de poliacrilamida em condições não dissociantes foi realizada de acordo com a técnica de Davis (1964), em tubos verticais de 0,3 x 10 cm. O gel de separação, com altura de 7cm, continha 10% de acrilamida e o gel de concentração, com altura de 0,3cm, continha 3% de acrilamida. A polimerização foi realizada com exposição dos tubos à luz durante 20 minutos. 4.2.18.2 – Eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS As determinações do número e dos pesos moleculares das subunidades foram feitas em eletroforese por gel de policrilamida-dodecilsulfato de sódio, Material e Métodos 54 sistema de pH descontínuo, utilizando-se o procedimento descrito por Laemmli (1970) na presença do agente redutor 2-mercaptoetanol. O gel de separação continha 10,0% de acrilamida e o gel de concentração, 4,5% de acrilamida. As cavidades no gel de concentração foram formadas pela presença de um molde de PVC com 10 dentes durante o processo de polimerização do gel. As amostras dos isolados protéicos liofilizados foram dispersas em solução de tampão Tris-HCl, pH 8,6 e juntamente com alíquotas dos picos, resultantes das frações cromatográficas (item 4.2.17), foram tratadas com solução contendo 62,5 mM de Tris, pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glicerol, 1% de 2-mercaptoetanol, 0,02% de azul de bromoferol e submetidas a banho fervente por 2 minutos, resfriadas para então serem aplicadas no gel de concentração. A curva de calibração do gel foi feita utilizando-se mistura de proteínas de pesos moleculares conhecidos, contendo: fosforilase (97000 Daltons), soroalbumina bovina (66000 Daltons), ovoalbumina (45000 Daltons), anidrase carbônica (30000 Daltons), inibidor de tripsina (20500 Daltons) e �-Lactalbumina (14400 Daltons) e submetida ao tratamento descrito acima. A corrida eletroforética foi realizada em cubas de acrílico e o tampão usado foi Tris/glicina 25 mM, pH 8,3, contendo 0,1% de SDS. A voltagem inicialmente foi de 100 V até que o corante atingisse o gel de separação e então foi alterada para 150 V. O gel permaneceu sob corrente constante até o final da corrida que durou aproximadamente 90 minutos. O gel foi corado por imersão em solução de commassie blue R-250 a 0,25% em ácido acético: metanol: água destilada durante 30 minutos. O gel foi descorado por imersão Material e Métodos 55 em solução de ácido acético glacial, metanol e água destilada na proporção de 1,5:1:1,17,5, respectivamente, com várias trocas desta solução. 4.2.19 - Análise térmica, obtenção das curvas TG-DTA e DSC As curvas TG-DTA foram obtidas em uma termobalança modelo SDT2960, TA Instrumensts, em atmosfera dinâmica de ar (100 mL min-1), usando cadinho de platina sem tampa, massa da amostra de 4 mg e razão de aquecimento (β) de 20 oC min-1. As curvas DSC foram obtidas em um calorímetro DSC-25, acoplado ao processador TC-15, METTLER, em atmosfera dinâmica de ar (100 mL min-1), usando cadinho de alumínio tampado e perfurado (Φ=1 mm), massa da amostra de 2 mg e razão de aquecimento de 20 oC min-1. Resultados e discussão 56 5 - RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 - Determinação da composição centesimal A avaliação físico química da farinha de semente de goiaba teve seu inicio pela composição química, cujos valores médios, estão apresentados na Tabela 2. TABELA 2 - Composição química da farinha desengordurada da semente de goiaba (Psidium guavaja) COMPONENTE g / 100g Umidade 6,17 ± 0,04 Lipídeos totais 0,47 ± 0,01 Proteína** 8,43 ± 0,12 Fibras 60,88 ± 0,90 Resíduo mineral fixo (cinzas) 0,70 ± 0,08 * Metodologia de acordo com [AOAC, 1995] ** Fator de conversão 6,25 Para a farinha de semente de goiaba triturada em moinho de martelo, procedimento adotado nesse projeto, obteve-se um maior rendimento de farinha, porém, como mostra a tabela acima, observa-se menor teor de proteínas (8,43 ± 0,12 %), e um valor maior de fibras (60,88 ± 0,9 %), em relação ao obtido por Fontanari et al. (2006), 22,7 ± 0,8% e 50,7 ± 1,5% respectivamente, em estudos anteriores. Isso se deve ao fato de que o procedimento de trituração em martelo, pulverizou toda a semente, não restando cascas, o que não aconteceu no trabalho anterior do autor, onde as Resultados e discussão 57 sementes foram trituradas em faca e conseqüentemente foi pulverizado maior parte do cotilédone da semente resultando num maior conteúdo de sobras (cascas). Esse procedimento possibilitou maior conteúdo de proteínas e menor conteúdo de fibras, uma vez que o procedimento de facas pulveriza maior parte do cotilédone, que são separados por tamis. Os resíduos que sobram são parte da casca, onde há maior quantidade de fibras e possivelmente taninos e alcalóides. Recentemente alguns trabalhos conduzidos com sementes de goiaba, demonstraram teores de proteína similares, como é o caso da farinha de semente de goiaba, (Psidium guajava), cultivada no México 7,60 ± 0,20% (NICANOR et al., 2001), no Egito 10,8% (espécie não fornecida) (EL-DIN e YASSEN, 1997) e Índia, (Psidium guajava L.) 9,0% (PRASAD e AZEEMODDIN, 1994). Entretanto, para farinhas de leguminosas, foram encontrados valores superiores, como por exemplo à farinha de tremoço (Lupinus angustifolius) com 33,8 ± 6,9% (LQARI et al., 2002), Brassica carinata, com 38,9 ± 2,3% (PEDROCHE et al., 2004), sementes de gergelim 47,7% (KHALID et al., 2003), grão-de-bico 26,7 ± 0,84% (KAUR e SINGH, 2005) e feijão caupi (Vigna unguiculata) 26,8% (RAGAB et al., 2004). O teor de cinzas (0,70 ± 0,08 %), está próximo aos teores observados na literatura para farinhas de sementes de goiaba, cujos valores variam entre 0,9% (PRASAD e AZEEMODDIN, 1994), 0,98% (EL-DIN e YASSEN, 1997) e 1,2 ± 0,02 % (NICANOR et al., 2001). Resultados e discussão 58 Para o teor de fibra bruta (60,88 ± 0,9%), observa-se uma pequena variação para a espécie cultivada no México 67,7 ± 0,12% (NICANOR et al., 2001), espécie cultivada na Índia 64,0% (PRASAD e AZEEMODDIN, 1994) e estando em concordância com a espécie cultivada no Egito, 60,2% (EL-DIN e YASSEN, 1997). Analisando os resultados de teor protéico e fibras da tabela 2 e comparando com a literatura, pode-se observar que as farinhas que apresentaram maior quantidade de fibra bruta, independente da região de cultivo, o teor de proteína é relativamente menor. 5.2 - Otimização da extração da proteína da farinha da semente da goiaba A Tabela 3 indica as proporções massa e volume de extrator utilizado para extração da proteína da semente de goiaba. A proporção massa/volume (farinha/solvente) é uma informação importante na realização das análises, pois mostra a condição ideal em que a proteína apresenta melhor performance de solubilidade, o que de acordo com a Tabela 3, a melhor condição foi de 1:30, apresentando 37 ± 0,8% de solubilidade, a mínima solubilização da proteína se deu em proporção de 1:100 apresentando um percentual de 14,84 ± 2,4 de proteína solubilizada. Resultados e discussão 59 TABELA 3 - Relação da proporção massa e volume de extrator. * PROPORÇÃO pH % PROTEINA SOLUBILIZADA 1:10 10 22,07 ± 0,4 1:15 10 23,52 ± 0,5 1:20 10 28,00 ± 0,7 1:25 10 27,10 ± 0,5 1:30 10 37,00 ± 0,8 1:50 10 25,60 ± 1,0 1:100 10 14,84 ± 2,4 *Solvente utilizado: água destilada; tempo de extração: 60 min ; T= 4°C A solubilidade da proteína também foi moderadamente afetada pela variação do tempo de extração. A Tabela 4 apresenta as variações de tempo de extração da proteína para a sua solubilização. TABELA 4 - Efeito da variação do tempo na extração da proteína de semente de goiaba (Psidium guajava).* PROPORÇÃO Tempo (min) pH % PROTEINA SOLUBILIZADA 1:10 10 10 25,6 ± 1,15 1:10 20 10 28,2 ± 0,30 1:10 30 10 30,7 ± 0,30 1:10 60 10 27,7 ± 0,30 1:10 120 10 22,3 ± 0,02 *Solvente utilizado: água Resultados e discussão 60 De acordo com a Tabela 4 o tempo máximo de extração (120min.) obteve o percentual mínimo de solubilidade (22,3 ± 0,02%), a tabela revela ainda que a melhor extração de proteína acontece no tempo de 30 minutos (30,7 ± 0,3%). Os parâmetros iniciais para os experimentos foram adotados de acordo com as tabelas 3 e 4 como sendo proporção massa/volume 1:30 e tempo de extração da proteína da farinha da semente de goiaba de 30 minutos. 5.3 - Influencia do pH e concentração de sal na extração da proteína A Figura 4, demonstra a influencia do pH e concentração de sal na solubilidade da proteína. Observa-se a partir da figura que: 1- a solubilidade da proteína foi maior nas regiões ácida (1,0 ≤ pH ≤ 2,0) e alcalina (9,0 ≤ pH ≤ 12,0), estando esse valor em concordância com valores da literatura para proteínas vegetais, como a proteína da farinha de semente de tomate, (LIADAKIS et al., 1995), proteína da ervilha “beach” (Lathyrus maritimus L.), (CHAVAN et al., 2001), proteína da vagem, (JOHNSON e BREKKE, 1983), proteína do tremoço (Lupinus mutabilis), (SATHE et al., 1982a), proteína do grão-de-bico (Cicer arietinum L.), (VIOQUE et al., 1999), proteína da algaroba, (SILVA et al., 1997), proteína do feijão guandu (Cajanus cajan (I.) Millsp), (MIZUBUTI et al., 2000), proteína do amendoim, (MCWATTERS e HOLMES, 1979b), proteína do sorgo, (ELKHALIFA et al., 2005), proteína da batata, (KONINGSVELD et al., 2001), proteínas dos feijões jack (Canavalia ensiformis) e feijão mucuna (Mucuna pruriens), (ADEBOWALE Resultados e discussão 61 e LAWAL, 2004), proteína do caupi (Vigna unguiculata L. Walp.), (HORAX et al., 2004) e proteína do feijão locust (Parkia biglobossa), (LAWAL et al., 2005), onde a solubilidade é maior nas regiões de pH ácido e regiões de pH alcalino. 0 2 4 6 8 10 12 0 10 20 30 40 50 60 70 % S ol ub ili da de pH Sem NaCl Solução NaCl 0,2M Solução NaCl 0,5M Figura 4 - Curvas de solubilidade da proteína da farinha de semente de goiaba (Psidium guajava), em função do pH (1,0 a 12,0) e concentração de NaCl variando entre 0 a 0,5 mol L-1. T= 25 ± 3 oC. O pH afeta a densidade de cargas e o balanço eletrostático intra e intermolecular, modificando a habilidade da proteína em participar das interações hidro e lipofílicas (DAMODARAN e PARAF, 1997). O aumento da densidade de cargas da proteína em pHs afastados da região do ponto Resultados e discussão 62 isoelétrico favorece as interações proteína-água, resultando num aumento das propriedades de hidratação (ELIZALDE et al., 1996). 2- a precipitação da proteína ocorre em pH 4,5, estando este valor em concordância com resultados obtidos na literatura para isolados protéicos de sementes de goiaba, pI 5,5 (NICANOR, 2001) e pI 4,5 (EL-AAL, 1992) e para precipitados de outras proteínas tais como: cártamo (safflower) pI 5,5 (PAREDES, 1986) e sementes de tomate pI 3,9 (LIADAKIS, 1995). Sabe-se que o pH tem um efeito sobre a carga liquida da proteína, influenciando dessa maneira a sua solubilidade, sendo que no pI esta propriedade atinge seu valor mínimo (CHEFTEL et al., 1989). A ocorrência de baixa solubilidade próxima a região do pI é devido principalmente à falta de repulsão eletrostática, que promoveu agregação e precipitação via interações eletrostáticas (DAMODARAN e PARAF, 1997). 3- a solubilidade da proteína é ligeiramente aumentada com a diminuição da concentração de NaCl, e sua maior solubilidade acontece na ausência total de sal, o que não é observado para a maioria das sementes de leguminosas, principalmente na região isoelétrica, onde a solubilidade é maior na presença de sal, como é na farinha de Lentilha (Lens culinaris MEDIK), (NEVES et al., 1998), farinhas de tremoço doce e amargo (ADAWY et al., 2001), farinha de soja (MC WATTERS e HOLMES, 1979a), concentrados protéicos de gergelim (INYANG E IDUH, 1996) e glúten do trigo (MEJRI et al., 2005). Esse fenômeno, que ocorre com as proteínas de leguminosas, geralmente acontece em baixas concentrações de sal, onde a solubilidade Resultados e discussão 63 protéica aumenta devido à interação dos íons salinos com os grupos iônicos da proteína, causando uma hidratação da molécula protéica e repulsão eletrostática entre as moléculas (BORA e RIBEIRO, 2004) Os efeitos quantitativos diferem muito entre os sais e depende da força iônica, do tipo e carga de superfície protéica e da água. Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica) a solubilidade em geral aumenta, por que os íons salinos em baixa concentração tendem a se associar às proteínas contribuindo para uma maior hidratação e/ou repulsão das moléculas de proteína, portanto, para uma maior solubilidade da proteína, provocando o efeito conhecido como “salting in”. Ao contrario, em elevadas concentrações de sais, os íons salinos, formam sua própria capa de hidratação e competem com a proteína pela água ocasionando perda de água de hidratação pelas moléculas protéicas, atração mutua entre as moléculas (forças eletrostáticas e não polares) e formação de precipitado, fenômeno conhecido como “salting out” (SGARBIERI,1996). 5.4 - Influência do tipo de sal na extração da proteína Para cada sistema protéico-salino existe um máximo de solubilidade que a proteína pode atingir antes que o efeito “salting out” tenha início. Alguns sais neutros, entre eles o NaCl e o KCl, promovem o efeito “salting in”, isto é, o aumento da solubilidade, mesmo em concentrações molares elevadas. O efeito “salting in” se manifesta porque, em baixa concentração de sal, os íons interagem com os grupos carregados da proteína e aumenta progressivamente Resultados e discussão 64 sua eletronegatividade, o que intensifica a repulsão eletrostática intermolecular (AROGUNDADE et al., 2004). Devido a esses efeitos, os íons “salting in” alteram de modo notável o perfil de solubilidade de certas proteínas, em função do pH (LOURENÇO, 2000). Estudos de caracterização do efeito de aditivos e sais, entre eles o NaCl e KCl, na solubilidade da proteína tem sido frequentemente realizados na justificativa de compreender os perfis de solubilidade para suas possíveis aplicações nas indústrias de alimentos (ABTAHI e AMINLARI, 1997). O NaCl, o principal ingrediente na formulação de alimentos devido a suas propriedades de flavor, conferindo sabor salgado aos alimentos, conservação e melhoria de solubilidade, recentemente tem sido substituído por outros sais, entre eles o KCl, na tentativa de reduzir o Sódio da dieta a fim de minimizar riscos de hipertensão (AROGUNDADE et al., 2004). Os resultados do efeito da utilização de alguns tipos de sal, em diferentes concentrações, na solubilização da proteína da semente de goiaba, estão apresentados na Tabela 5. Dos sais utilizados aqueles com pH final alcalino na suspensão apresentaram os melhores resultados, estando semelhantes com os resultados obtidos por Neves (1991), caracterizando a lentilha. As dispersões contendo os sais NaOH 0,02N, 0,04N e 0,10N solubilizaram 57%, 58,3% e 60,7% da proteína da farinha de semente de goiaba respectivamente, apresentando maior quantidade de proteína solubilizada na extração, por outro lado resulta num pH muito elevado na concentração final da dispersão. Resultados e discussão 65 TABELA 5 - Efeito de sais na extração da proteína da farinha de semente de goiaba SAL CONCENTRAÇÃO pH % SOLUBILIDADE 0,5% 10,62 53,20 Na2CO3 1,0% 10,70 48,90 2,0% 11,00 49,77 0,02 N 12,84 57,00 NaOH 0,04 N 12,67 58,30 0,10 N 12,58 60,70 0,20 M 5,44 5,10 NaCl 0,50 M 5,44 4,66 1,00 M 5,24 8,44 0,2% 5,19 1,40 0,5% 4,92 1,40 Pirofosfato de sódio 1,0% 4,68 1,80 0,5% 5,57 1,20 Hexametafosfato de sódio 1,0% 5,21 1,20 0,5% 5,11 1,65 1,0% 5,00 2,41 5,0% 4,46 6,14 NaH2PO4 10,0% 4,29 7,60 0,5% 5,67 1,94 1,0% 5,60 2,80 5,0% 5,45 6,50 Na2SO4 10,0% 5,32 6,92 0,5% 5,63 0,98 1,0% 5,58 2,71 5,0% 5,50 5,70 K2SO4 10,0% 5,52 7,63 0,5% 6,32 0,91 Acetato de sódio 1,0% 6,47 0,86 5,0% 6,96 2,80 Além do NaOH, outro sal que obteve considerada solubilidade foi o Na2CO3, solubilizando 53,2 – 48,9 e 49,77% de proteína nas concentrações de 0,5 – 1,0 e 2,0%, respectivamente. Resultados e discussão 66 O acetato de sódio, nas concentrações 0,5 e 1,0%, apresentou menor eficácia na solubilização da proteína com apenas 0,91 e 0,86%, respectivamente. Comparado ao NaOH tem a vantagem de apresentar pH final próximo da neutralidade ou levemente ácido. Os demais sais não apresentaram índices satisfatórios de solubilidade. Já o principal sal utilizado (NaCl) para o aumento da solubilidade da maioria das proteínas de sementes de leguminosas, não apresentou índices satisfatórios, solubilizando apenas 5,1 – 4,66 e 8,44% de proteína nas respectivas concentrações (0,2 – 0,5 e 1M), porém a farinha do grão-de-bico (Cicer arietnum L.), leguminosa que ocupa o quinto lugar na produção mundial de sementes de leguminosas, sendo precedido pela soja, amendoim, feijão e ervilha, tem sua solubilidade aumentada na presença de até 1,0M de NaCl (SILVA et al., 2001). Outros tipos de proteínas, como feijão (Phaseolus vulgaris) crú (CARBONARO et al., 1993), ervilha beach “peã” (CHAVAN et al., 2001), proteína da farinha de tremoço doce e amargo (ADAWY et al., 2001), proteína da batata (KONINGSVELD et al., 2001), glúten do trigo (MEJRI et al., 2005), farinha de lentilha (Lens culinaris Medik) (Neves et al., 1998), farinha de soja (MC WATTERS e HOLMES, 1979a) e concentrados protéicos de gergelim (INYANG e IDUH, 1996), também tiveram sua solubilidade aumentada na presença de NaCl, principalmente na região isoelétrica, apresentando características da proteína classificada como globulina, proteínas que aumentam sua solubilidade na presença de sal (SGARBIERI, 1996). Resultados e discussão 67 Apesar do NaCl não ter causado boa solubilidade para a farinha da semente de goiaba, é muito comum seu emprego pelas indústrias alimentícias, visando melhorar as propriedades funcionais através do aumento da solubilidade protéica, por isso é importante verificar o efeito desse sal nas propriedades funcionais das proteínas (DUARTE et al., 1998). 5.5 - Extração das proteínas da farinha da semente de goiaba Obtenção das frações albumina, globulina, prolamina e glutelina A extração fracionada e seqüencial do material, inicialmente com água destilada, seguida de solução de NaCl 0,5M, etanol 70% e finalmente com NaOH 0,1N, corresponde às frações albumina, globulina, prolamina e glutelina, respectivamente, como mostra o fluxograma da Figura 1. Essa prática é executada quando se deseja separar e classificar os tipos de frações quanto sua solubilidade. A Tabela 6 apresenta os resultados obtidos das frações protéicas da proteína. Pode-se observar que a glutelina é a fração presente em maior quantidade, sendo então a fração protéica majoritária da farinha da semente de goiaba, apresentando um conteúdo de 44,03% do total da proteína e 3,71 ± 0,021% do total da farinha. As proteínas também são classificadas de acordo com sua solubilidade, desta forma, as características descritas no parágrafo anterior e o fato da ação do sal não ter modificado a solubilidade da proteína da farinha da semente de Resultados e discussão 68 goiaba, sugere-se, para a proteína em estudo, a classificação como sendo pertencente ao grupo das glutelinas; proteínas solúveis em meio ácido e alcalino (AKABORI, 2002). Tabela 6 – Classificação das frações protéicas da farinha da semente de goiaba (Psidium guajava). Proteína * (N2 x 6,25) Frações % Farinha % Total Farinha 8,43 ± 0,12 100 Albumina 0,19 ± 0,09 2,25 Globulina 0,51 ± 0,07 6,06 Prolamina 0,21 ± 0,02 2,49 Glutelina 3,71 ± 0,02 44,03 Resíduo 2,16 ± 0,04 25,62 * proteína determinada pelo método de Kjeldahl (AOAC,1995) Agboola et al. (2005) executou o fracionamento, descrito por Osborne, para a obtenção das frações protéicas albuminas, globulinas, prolaminas e glutelinas para o arroz australiano e também constatou que a fração majoritária é a glutelina, representando mais de 50% da composição total da proteína do arroz. Essa semelhança é observada para proteínas de cereais, onde as glutelinas e prolaminas são encontradas em abundância, porém, essa composição é diferente das sementes oleaginosas e de leguminosas, que possuem globulinas como fração protéica majoritária (FUKUSHIMA, 1991; JACKS, 1994; MELITO e TOVAR, 1995; NEVES e LOURENÇO, 1995). Resultados e discussão 69 5.6 - Obtenção do isolado protéico Para a preparação do isolado protéico empregou-se o método de Liadakis et al (1995), conforme mostra o fluxograma da Figura 3, variando-se as condições de pH durante o processo de extração. As condições de extração para os IP foram selecionadas a partir da curva de solubilidade (figura 4), padronizando condições de pH alcalino em: 1- IP 10, extraído em pH 10,0 e, 2- IP 11,5, extraído em pH 11,5. A Tabela 7 apresenta os resultados de rendimento e conteúdo protéico dos isolados de semente de goiaba extraídos em pH 10 e 11,5. Tabela 7 – Rendimento e conteúdo protéico do isolado protéico extraído em pH 10,0 e 11,5. pH Rendimento (%) Conteúdo Protéico (%) 10,0 45,19 ± 0,6 96,4 ± 0,5 11,5 66,23 ± 0,4 93,5 ± 0,4 * As determinações de rendimento e conteúdo protéico foram realizados em triplicata. Os dados da tabela revelam que o IP extraído em pH 11,5 apresentou um índice de rendimento maior que o IP extraído em pH 10,0 (66,23 ± 0,45 e 45,19 ± 0,6%) respectivamente. De acordo com a Figura 4, onde está apresentada a curva de solubilidade em diferentes níveis de pH, em pH 11,5, a solubilidade é maior que em pH 10,0, esse comportamento refletiu no Resultados e discussão 70 rendimento da proteína durante sua precipitação isoelétrica, favorecendo maior quantidade de IP para a extração em pH 11,5 Nicanor et al. (2001), encontraram valores superiores de rendimento para isolado protéico da farinha da semente de goiaba (78,25 ± 0,07%), porém as condições de extrações foram diferentes, realizadas nas proporções de massa/volume (1:20), temperatura de 40°C e pH de precipitação (pI=5,0). Fontanari et al. (2005), em pH 11,5, obtiveram 77,0 ± 0,4% de rendimento para a mesma amostra, quando utilizaram metodologia diferente para a obtenção da farinha. As sementes foram trituradas em moinho de facas sendo separadas apenas o cotilédone das sementes em tamis de 60 mesh. Rendimentos inferiores foram relatados por El-Aal (1992), com apenas 9,73%, porém durante a extração foi utilizado pH 10,0. A Tabela 7, ainda revela que os conteúdos protéicos dos IP tiveram pouca diferença, apresentando 96,4 ± 0,5 e 93,5 ± 0,4% para os IP 10,0 e 11,5, respectivamente. Fontanari et al. (2006) e Nicanor et al. (2001), relataram conteúdos protéicos para IP de semente de goiaba extraídos em pH 11,5, de 94,2 ± 0,3 e 96,78 ± 0,07% respectivamente, estando em concordância com o conteúdo protéico do IP 11,5 neste estudo. 5.7 - Curvas de solubilidade para o IP 10,0 e IP 11,5. A Figura 5, apresenta os dados de solubilidade dos isolados protéicos extraídos da farinha da semente de goiaba em pH 10,0 e 11,5. Resultados e discussão 71 2 4 6 8 10 12 0 20 40 60 80 100 % S ol ub ili da de pH IP 11,5 IP 10,0 Figura 5 – Curvas de solubilidade dos IP extraídos em pH 10,0 e pH 11,5, em temperatura ambiente (25 ± 3 oC), por 30 minutos. A Figura 5 revela um perfil de solubilidade para os isolados protéicos, nas regiões ácidas e alcalinas, semelhante ao próprio perfil apresentado pela proteína da farinha, com um detalhe: a proteína da farinha apresentou solubilidade mínima entre o pH 4,0 até o pH 8,0, onde a partir desse ponto passou a ter um aumento em sua solubilidade. Já os isolados protéicos, tiveram boa solubilidade na região ácida até o pH 4,0, e começaram a ter aumento de solubilidade a partir do pH 6,0 sendo que em pH acima de 6,0 e abaixo de 10,0, o IP 10,0 apresentou solubilidade superior em relação ao IP 11,5. Puppo et al. (2004), também relataram perfis de solubilidade diferentes para o mesmo material, obtidos em condições distintas, observando menor Resultados e discussão 72 solubilidade para IP de soja extraído em pH 3,0 em relação ao IP extraído em pH 8,0. A solubilidade de uma proteína é a manifestação termodinâmica do equilíbrio, com a interação proteína-proteína e proteína-solvente e está relacionada a seu balanço de hidrofilicidade/hidrofobicidade. Assim, sua composição de aminoácidos afeta sua solubilidade, porém as características de hidrofobicidade e hidrofilicidade de superfície da proteína são os fatores mais importantes que afetam sua característica de solubilidade (DONADEL e FERREIRA, 1999). 5.8 - Absorção de água e óleo A Tabela 8 apresenta os valores obtidos para análises de capacidade de absorção de água e óleo para o isolado protéico da farinha da semente de Goiaba. Tabela 8 – Absorção de água e óleo para IPs obtidos da farinha de semente de goiaba (Psidium guavaja), IP 10,0 e IP 11,5, respectivamente. Material Absorção de água (mL água / g proteína) Absorção de óleo (mL óleo / g proteína) IP 10,0 1,05 � 0,07 2,3 ± 0,01 IP 11,5 1,65 ± 0,07 1,70 ± 0,07 * As determinações de absorção de água e óleo foram realizadas em triplicata. Resultados e discussão 73 A capacidade de absorção de água, de ambos os isolados, foram inferiores em comparação com a literatura para IP de soja (ELIZALDE et al., 1988) e proteína da algaroba, (SILVA et al., 1997), porém o mesmo autor revela uma capacidade de absorção de óleo inferior à encontrada no IP 10,0 e 11,5. Khalid et al. (2003), relatou absorção de água e óleo (2,10 e 1,50 mL água / g proteína), respectivamente para a proteína de gergelim, estando esses valores próximos ao obtidos para o IP de semente de goiaba. A absorção de água do IP 10,0 foi menor que a encontrada no IP 11,5, porém o valor de capacidade de absorção de água foi menor que a encontrada para IP 10 de farinha de goiaba do Egito (EL-AAL, 1992) e para isolado protéico de aveia (MA e KHANZADA, 1987), por outro lado à capacidade de absorção de água do IP 11,5, foi similar para o IP produzido a partir das sementes de goiaba do México relatadas por Nicanor et al. (2001), nas mesmas condições de pH de extração desse estudo. Outro aspecto importante revelado na tabela foi a maior capacidade de retenção de água para o IP 11,5. Mwasaru (1999), também encontrou dados diferentes para IP de mesma amostra em diferentes pH de extração, como por exemplo “pigeonpea” (1,26 e 2,10 mL água / g proteína) para IP extraído em pH 10,5 e 11,5, respectivamente. A absorção de óleo para IP 11,5 foi idêntica a Nicanor et al. (2001), porém o IP 10,0 apresentou uma capacidade maior de reter óleo, apresentando Resultados e discussão 74 valores superiores, inclusive aos relatados para isolado protéico de semente de goiaba do Egito (EL-AAL, 1992). A tabela ainda revela que houve maior capacidade de absorção de óleo do que a água, principalmente do IP 10,0. Essa afinidade por óleo é resultante da interação da proteína com o óleo através dos grupos de aminoácidos apolares, expondo mais áreas de microdomínios hidrofóbicos e, conseqüentemente, retendo mais óleo. De acordo com Dench et al. (1981), a absorção de óleo varia em função do número de grupos hidrófobos expostos da proteína, Lin et al. (1974), sugerem que as cadeias laterais não polares das proteínas tenham afinidade com as cadeias hidrofóbicas da molécula do óleo e contribuam para a absorção. Toda proteína, ou qualquer ingrediente alimentar, para ser funcional, deve ser capaz de movimentar-se no meio em que se encontra e apresentar um conjunto de reações físico-químicas, tais como hidratação, alteração conformacional, dispersão, rearranjo molecular, difusão, adsorção, formação de complexo protéico e de ligação de moléculas. Uma proteína, ou produto protéico é capaz de exercer, simultaneamente, várias propriedades funcionais interdependentes nas formulações às quais é adicionada. Tal versatilidade é principalmente, resultado da conjugação de fatores intrínsecos e extrínsecos, por isso, proteínas e produtos protéicos são agentes funcionais com demanda crescente pela indústria de alimentos (KINSELLA, 1976). Resultados e discussão 75 De acordo com Cheftel et al. (1985), a absorção e a retenção de água pelas proteínas exercem importante papel na qualidade da textura de diversos alimentos, notadamente produtos derivados da carne e produtos de panificação, onde conferem propriedades adequadas de consistência, viscosidade e adesão. Da mesma forma, a capacidade de absorção de óleo, também são requeridas nas formulações de carne, substitutos de carne e análogos, além de produtos de padaria e sopas (ABBEY e IBEH, 1988). 5.9 - Capacidade de emulsificação A Tabela 9 revela os dados obtidos com a capacidade de emulsificação apresentada pelo IP 10,0 e 11,5. Tabela 9 – Capacidade de emulsão* dos IP extraídos em pH 10,0 e pH 11,5, T= 25 ± 3 °C. Gramas de óleo emulsionado por grama de proteína Solução pH IP 10,0 IP 11,5 3,0 387 ± 6 343 ± 5 H2O 6,6 37 ± 2 140 ± 8 8,5 363 ± 6 388 ± 6 3,0 57 ± 3 67 ± 7 NaCl 2% 6,6 32 ± 3 39 ± 4 8,5 66 ± 7 53 ± 3 * Metodologia: [Wang e Kinsella, 1976] Os resultados da tabela revelam que as emulsões preparadas a partir dos isolados protéicos liofilizados e suspendidos em água na ausência de Resultados e discussão 76 NaCl: 1- a pH 3,0 e 8,5, apresentam elevada capacidade de emulsificação (343� CE �388) g óleo / g proteína, independente das condições originais de preparo do isolado (pH 10,0 ou 11,5), indicando que a capacidade de emulsificação aumenta nas regiões ácidas e alcalinas, perfil semelhante de comportamento foi encontrado para a proteína da algaroba (SILVA et al., 1997), proteína da semente de gergelim (KHALID et al., 2003) e proteína do feijão locust (LAWAL, 2004) onde o pH influenciou a capacidade de emulsificação. 2- em pH 6,6 (próximo à neutralidade) a formação de emulsão foi ligeiramente maior para o IP 11,5, CE= 140 ± 8 g óleo / g proteína, comparado com o IP 10,0, CE= 37 ± 2 g óleo / g proteína, o que mostra diferenças na estrutura da proteína, revelando uma maior exposição de microdomínios hidrofóbicos para o IP 11,5. A elevada capacidade de emulsificação do IP observado em pH 3,0 e 8,5 (região ácida e alcalina) está associado à formação de microdomínios hidrofóbicos induzidos pelo ajuste do pH do meio, o que favorece o processo, conforme também observado por Donadel e Ferreira, (1999). A capacidade de emulsão foi dependente do pH, observado na região ácida e principalmente na região de pH alcalino, onde a capacidade foi maior devido a influencia do pH no balanço hidrofílico/lipofílico, favorecendo o processo e aumentando a capacidade de emulsificação (RAGAB et al., 2004) Segundo alguns autores, Tornberg e Hermansson (1977); Mulvihill (1991); Mangino (1994), esta influência do pH na solubilidade pode interferir na Resultados e discussão 77 quantidade da proteína adsorvida na interface óleo/água (O/A) e dessa maneira modificar as propriedades emulsificantes da proteína. A solubilidade de proteína em água contribui para a diminuição da tensão interfacial entre os componentes hidrofóbicos e hidrofílicos, aumentando as propriedades emulsificantes (BORDERÍAS e MONTERO, 1988; CHEFTEL et al., 1989; WANG et al., 2000). 3- as suspensões de isolados protéicos preparados na presença de NaCl, em pH 3,0, 6,6 e 8,5 apresentam baixa capacidade de emulsificação e perfil de emulsificação semelhante ao observado para as emulsões preparadas na ausência do NaCl. Esta baixa capacidade pode estar associada ao efeito salino que promove a interação de íons com as cargas das proteínas, favorecendo a agregação e a precipitação da proteína, minimizando a solubilização e conseqüentemente promovendo uma diminuição da exposição dos microdomínios hidrofóbicos, diminuindo assim a capacidade de emulsificação (DUARTE et al., 1998). 5.10 – Atividade e estabilidade da emulsão A Tabela 10 apresenta os dados obtidos para ensaio da atividade e estabilidade da emulsão. A atividade e estabilidade da emulsão de ambos isolados protéicos apresentaram boas performances em pH 3,0 (próximo ao pI), estando de acordo com Mangino (1994). As análises revelam que para atividade de Resultados e discussão 78 emulsão, os resultados são similares entre os IPs 10,0 e 11,5, apresentando na região de pH 8,5 (73 ± 1%) e na região de pH 3,0, próxima ao pI, (76 ± 1). Esses valores de atividade de emulsão são maiores que os encontrados para IP de feijão locust (Parkia biglobossa) (Lawal, 2004) e proteína da alfafa (WANG e KINSELLA, 1976). Tabela 10 – Atividade e estabilidade da emulsão preparadas para IP 10,0 e 11,5. Material pH Atividade de emulsão (%) (AE) Estabilidade da Emulsão (%) (EA) 3,0 76,57 ± 0,70 78,98 ± 0,50 IP 10,0 7,0 74,30 ± 0,10 75,45 ± 0,40 8,5 73,50 ± 0,50 75,84 ± 0,70 3,0 75,85 ± 0,50 76,14 ± 0,50 IP 11,5 7,0 74,60 ± 0,70 74,85 ± 0,60 8,5 73,76 ± 0,80 74,97 ± 0,50 *Determinações realizadas em triplicata. Por outro lado, a estabilidade da emulsão, em pH 3,0, foi ligeiramente maior para o IP 10,0, com uma diferença de aproximadamente 3% em relação ao IP 11,5. O efeito do pH na estabilidade das emulsões, apresenta certa variação, assim de acordo com Mangino (1994), em valores próximos ao pI, as proteínas são capazes de formar filmes interfaciais mais coesos e mais