RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 25/04/2020. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS BOTUCATU ASPECTOS REPRODUTIVOS DE RATOS OBESOS E DIABÉTICOS MARCOS GOMIDES CARVALHO Botucatu - SP Abril/2019 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA CAMPUS BOTUCATU ASPECTOS REPRODUTIVOS DE RATOS OBESOS E DIABÉTICOS MARCOS GOMIDES CARVALHO Dissertação apresentada a Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para o Exame Geral de Defesa do curso de Mestrado em Biotecnologia Animal. Orientador: Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Botucatu – SP Abril/2019 Nome do autor (a): Marcos Gomides Carvalho Título: ASPECTOS REPRODUTIVOS DE RATOS OBESOS E DIABÉTICOS BANCA EXAMINADORA Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza Presidente e Orientadora Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária- FMVZ- UNESP, Botucatu/SP. Profa. Dra. Alessandra Melchert Membro Departamento de Clínica Veterinária – FMVZ - UNESP, Botucatu/SP. Profa. Dra. Lucilene Delazari dos Santos Membro Departamento de Doenças Tropicais – CEVAP - UNESP, Botucatu/SP. Data da defesa: 25 de abril 2019 AGRADECIMENTOS A Profa. Dra. Fabiana Ferreira de Souza, pela paciência e competência na minha orientação, por quem tenho grande admiração por ser um exemplo profissional, pessoal, tendo papel fundamental em meu amuderecimento durante esse percurso. Obrigado por ter acreditado na minha capacidade, pelo carinho e amizade. Obrigado por muitas vezes ter soltado minha mão, para poder aprender a solucionar problemas, mesmo falhando algumas vezes, quando na verdade você estava só esperando para entrar em ação. A Profa. Dra. Cláudia Valéria Seullner Brandão, por ceder o Biotério local da FMVZ UNESP onde foi realizado todo o experimento. Obrigado pela paciência e compreensão por longos 10 meses. A Profa. Dra. Alessandra Melchert por ter contribuído com o delineamento experimental, ajudando a extender o estudo até outros profissionais possibilitando análise de mais materiais melhorando a qualidade do estudo. Também quero agrace-lá por ter disponibilizado todo o material para adaptação correta dos animais ao biotério. Muito obrigado pelo bom humor, pela amizade e pelo crédito atribuído a pesquisa, e por estar presente no momento da coleta ajudando e auxiliando a todos que estavam presentes, graças o seu incentivo acadêmico, montamos uma bela equipe, onde todos nós apredemos muito. Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Fonseca Alves Departamento de Clinica Veterinária- Setor de Patologia Clínica-FMVZ- UNESP, por toda prontidão em escutar e esclarecer minhas dúvidas sempre com muita preocupação, ajudando a melhorar o processamento e análise do matérial de histologia. Ao Prof. Dr. João Luiz Amaro e Prof. Dr. Paulo Roberto Kawano do Departamento de Urologia da FMB UNESP por estarem pesente no momento da coleta do material, somando aprendizado e por terem possibilitado os imunoensaios realizado pela Maria Regina Moretto Assistente de Suporte Acadêmico FMB-Unesp/Unipex, a todos o meu muito obrigado. Aos servidores do Biotério Central da Unesp, os quais sempre me atenderam com muito carinho fornecendo os animias dentro dos princípios éticos experimentais. Em especial a Sislaine Aparecida Balestrim Alquati, também bióloga, pelo carinho e amizade, que sempre esteve disposta a ajudar, a quem muitas vezes em momento de sufocos recorri, creio que foi a época que mais tocou seu telefone, muito obrigado por tudo. A Profa. Dra. Wilma de Grava Kempinas do Departamento de Morfologia, IBB- UNESP por ceder gentilmente os laboratórios para a realização da pesquisa. Em especial sua orientada de doutorado Josiane de Lima Rosa, pelos momentos de desespero e correria juntos terminando em alegria e amizade, obrigado por ter feito do meu experimento o seu, admiro todo seu comprometimento e profissionalismo. A todos os profissionais e alunos que compõem o Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária- FMVZ- UNESP, Botucatu/SP. Em especial A Profa. Dra. Fernanda Landim, Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa e a Profa. Dra Eunice Oba por ceder gentilmente os laboratórios para a realização do projeto e estar sempre dispostos a contribuirem. A Dra. Camila Paula Freitas-Dell’Aqua pelo bom humor e intusiasmo com a pesquisa, durante meses de piloto em busca de aprimorar os resultados do experimento, obrigado pela paciência, carinho e pela dedicação. Gostaria de agradecer ao Felipe, Dona Raquel, Dona Lurdes e Evandro, pelos momentos de descontração, por tornarem os momentos de descansos em total alegria, obrigado por toda o exemplo de humildade e simplicidade, são pessoas indispensáveis e que cuidam e auxiliam para o bom funcionamento do departamento, também sempre dispostos a ajudar. A todos os colegas do laboratório REPAS e Eletroforese, Otávio, Michele, Laura, por todos os momentos compartilhados de desespero ou alegria, por todas as horas de conversas, pois também é necessário. Obrigado por tornarem a convivência tranquila e harmonioza fazendo com que me sentisse em “casa”, por contribuírem de forma única e de acordo com suas áreas de apresendizado específicas engrandecendo muito o projeto de pesquisa. E queria desculpar por minha alegria demasiada e euforia, risos. A Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, por tornar possível a realização do curso de mestrado, e a cada um dos professores que me permitiram participar das aulas e pelos ensinamentos acadêmicos em diferentes institutos. Ao programa da CAPES pela concessão da bolsa de estudos. Esse paragráfo gostaria de agradecer em especial a equipe que esteve comigo do início ao fim garantindo que tudo fosse possível, com muitas horas de estudo individual porteriormente sendo somado em um objetivo só. Por abracerem esse projeto com tanta dedicação e profissionalismo, sinceramente tudo que foi realizado só aconteceu porque tinham vocês, pois sozinho ninguém consegue chegar a lugar nenhum. Em momentos de desespero vocês tornavam tudo mais simples. Esse trabalhao é tanto meu quanto de vocês, e não tenho palavras suficientes ou mesmo vocabulário para agradecer o quanto gostaria. Essa parceria foi formada por: Kelry, Cristiane, Viviana, Pablo. Aos meus amigos Carol Scott, Kelrynha meu amor, Kite, Rubia, Laiza princesa, Vivi fartura, Vivi mama, Pablo papa, Lauuuu, Lu, Jaque, Gaibe, Ivaldo, Lais xerox, Alice, Dona Cleusa. Tmbém as pessoas que me acompanharam desde a graduação Lais e Suzane. As amizades internacionais temporárias e duradoras, Cristian, Javier, John, Andrés, Santi, Alejo, Diego, Tiago portuga. Amo vocês obrigado por todo apoio emocional e profissional, por toda alegria e lembranças que carrego em meu coração, momentos inesquecíveis que levo para onde for, contem comigo sempre. Nossa vivemos muitas coisas, e cada um sabe a importância que tem. Agradeço e me desculpa todas as pessoas que possa ter esquecido, mas que passaram pela minha vida acrescentando e me tornanando uma pessoa melhor. Obrigado por todos os momentos bons e ruins compartilhados. Vocês são minha mais “nova” família. E ao mais recente chegado Juan Pablo, por ter trazido paz e tranquilidade em momentos difíceis. Aos meus amigos de longe e de infância, pois, “melhor que fazer novas amizades é manter as velhas”, também sempre apoiando e torcendo, Luiza, Soraya, Aline, Jema, Paula, Vanila, Betânia, Gruppi, Tarley, Carol, Joãozinho. Me desculpa se mais uma vez esqueço pessoas importantes. Obrigado por todos os momentos bons e ruins compartilhados, mesmo distantes estiveram sempre presentes. Amo vocês velha família. A minha família, pais: Ginaldo Inácio e Maria Terezinha, aos meus irmãos: Ricardina, Mariana e Ginaldo Jr. e avó Candida, por sempre acrediterem na minha capacidade e por apoiarem meus sonhos, tanto emocionalmente como financeiramente, foram as pessoas mais importantes para conclusão dessa fase. Amo vocês inconcionalmente, que nada possa abalar nossa união e fé, obrigado pelos exemplos de simplicidade e humildade, e por me ensinarem que o mais importante é ver o lado positivo das situações e seguir sorrindo e acreditando, semeando esperança e alegria no coração de cada um que cruza nossos caminhos. Essa é a missão da nossa família, afinal “tirando as coisas ruins ficam só as boas” certo paizão. Aos demais familiares que de certa forma apoiaramm e ajudaram, que também são muito importantes. A Deus e Nossa Senhora, a quem nos momentos de total desespero eu recorria, e com um suspiro retirava minha maior força. A vida dos animais, pois, graças a esses estudos experimentais conseguimos descobrir melhorias importantes para saúde animal e humana. A todos que ajudaram e apioraram de alguma maneira para a realização deste trabalho e para meu crescimento profissional e pessoal, muito obrigado! " Perfer et obdura; dolor hic tibi proderit olim" Ovid SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA.................................................................................2 2. REVISÃO DE LITERATURA ...........................................................................................3 2.1. Tecido adiposo, leptina e obesidade ................................................................................3 2.2. Diabetes .........................................................................................................................5 2.4. Implicaçoes da diabetes e obesidade na proteomica reprodutiva .................................... 10 2.5. Citocinas ...................................................................................................................... 12 REFERÊNCIAS .................................................................................................................... 16 HIPÓTESE............................................................................................................................ 25 OBJETIVO GERAL ............................................................................................................. 27 ARTIGO 1 ...............................................................................................................................2 RESUMO ASPECTOS REPRODUTIVOS DE RATOS OBESOS E DIABÉTICOS. Botucatu - SP. 2018, p.120. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. A obesidade e o diabetes têm alto índice mundial, ambas ligadas a infertilidade em diferentes espécies e em humanos. Pretende-se investigar os efeitos dessas doenças sobre a capacidade reprodutiva e o perfil proteico de células espermáticas. Foram utilizados 30 ratos Rattus novergicus (Wistar) com ~50 dias de idade, separados em 3 grupos: controle (n=10), diabéticos (n=10) e (obesos (n=10). O grupo obeso recebeu dieta de cafeteria e água ad libitum com 5% de sacarose, por 38 semanas. Os animais foram pesados uma vez por semana, para avaliação da evolução do peso para cálculo do índice de Lee. Foi induzida diabetes, com aplicação de 35 mg/kg de estreptozotocina, dose única, e foram considerados diabéticos animais com perda de peso corporal e níveis de glicemia maiores ou iguais a 120 mg/dL. Houve aumento e diminuição do peso corporal nos grupos obesos e diabéticos respectivamente. Os animais diabéticos apresentam aumento significativo no índice glicêmico. Quanto às alterações sistêmicas houve aumento da leptina no grupo obeso e redução da adiponectina nos diabéticos. Na citologia testicular houve aumento na concentração de das linhagens finais da espermatogênese, aumento das células de Sertoli, e na morfologia houve redução de células normais nos grupos diabéticos e obesos. As váriaveis foram normalizadas e analisadas pelo ANOVA one way, e comparações múltiplas pelo teste Newman-Keuls, os resultados foram apresentados como médias ± erro padrão (SEM), com P ≤ 0,05. Na análise proteômica, foram identificadas 15 proteínas como importantes na separação dos grupos, 14 encontravam-se menos expressas no grupo diabético e 7 obeso. Apenas 1 proteína foi mais expressa no grupo diabético e 8 no obeso. A maioria dessas peoteinas foram relacionadas com a produção de ATP e função estrutural. Quanto as avaliações das concentrações de IL-8, testosterona, histologia testicular e peroxidação lipídica, não apresentaram diferenças estatísticas. Há poucos trabalhos com proteômica de espermatozoide frente a obesidade e diabetes. Foram relatadas proteínas não identificadas em estudos anteriores. Assim, essas descobertas podem tornar-se marcadores uteis da fertilidade. Palavra-chave: Obesidade, diabetes, reprodução, citocina, proteômica. ABSTRACT GOMIDES, M.C. REPRODUCTIVE ASPECTS OF OBESE AND DIABETIC RATS. Botucatu - SP. 2019, p.120. Dissertação (Mestrado) - Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista. Obesity and diabetes have a high worldwide index, both linked to infertility in different species and in humans. It is intended to investigate the effects of these diseases on the reproductive capacity and protein profile of sperm cells. A total of 30 Rattus novergicus (Wistar) rats at ~50 days of age were divided into three groups: control (n = 10), diabetics (n = 10) and obese (n = 10) and water ad libitum with 5% sucrose for 38 weeks. The animals were weighed once a week to evaluate the evolution of the weight for the Lee's index calculation. Diabetes was induced with application of 35 mg / kg streptozotocin, and diabetic animals with a loss of body weight and glycemia levels greater than or equal to 120 mg / dL were observed to be diabetic, with increased and decreased body weight in the obese and diabetic groups, respectively. As for the systemic alterations, there was an increase in leptin in the obese group and reduction of adiponectin in diabetics. In the testicular cytology there was an increase in the concentration of the final spermatogenesis lines, increase of Sertol cells i, and in the morphology there was reduction of normal cells in the diabetic and obese groups. The variances were normalized and analyzed by ANOVA one way, and multiple comparisons by the Newman-Keuls test, the results were presented as means ± standard error (SEM), with P ≤ 0.05. In the proteomic analysis, 15 proteins were identified as important in the separation of the groups, 14 were less expressed in the diabetic and 7 obese groups. Only 1 protein was more expressed in the diabetic group and 8 in the obese group. Most of these peoteins were related to the production of ATP and structural function. Regarding the concentrations of IL-8, testosterone, testicular histology and lipid peroxidation, there were no statistical differences. There are few works with sperm proteomics against obesity and diabetes. Unidentified proteins have been reported in previous studies. Thus, these findings can become useful markers of fertility. Key words: Obesity, diabetes, reproduction, cytokine, proteomics. CAPÍTULO 1 2 1. INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA Atualmente, em humanos estima-se que a infertilidade atinja 10% a 20% dos casais em idade reprodutiva, e em aproximadamente 30% dos casos a infertilidade é causada apenas por fatores masculinos, enquanto que em 20% têm causas masculinas e femininas combinadas. Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS, 2010) estima- se que aproximadamente 80 milhões de pessoas ao redor do mundo apresentam o problema, sendo a obesidade, uma das doenças que predispõem a infertilidade no homem. Segundo a Sociedade Brasileira de Endocrinologia e Metabologia (SBEM), a obesidade é caracterizada pelo acúmulo excessivo de gordura corporal no indivíduo, causada pela predisposição genética, maus hábitos alimentares ou disfunção endócrina. O diagnóstico da obesidade é realizado pelo índice de massa corporal (IMC), parâmetro utilizado pela OMS. A obesidade é caracterizada por ser um importante fator de risco para outras doenças, entre estas hipertensão, doenças cardiovasculares e diabetes mellitus (PEDERSEN, 2013). A OMS aponta a obesidade como um dos maiores problemas de saúde pública no mundo. A projeção é que, em 2025, cerca de 2,3 bilhões de adultos estejam com sobrepeso, e mais de 700 milhões obesos, sendo esses índices maiores entre homens. No Brasil, a obesidade vem crescendo a cada dia e segundo a Associação para o Estudo da Obesidade e Síndrome Metabólica (ABESO, 2009), alguns levantamentos apontam que mais de 50% da população está acima do peso normal, ou seja, na faixa de sobrepeso e obesidade. As implicações genéticas na ocorrência de obesidade são raras, sendo originada por diversos fatores, como alterações ambientais e comportamentais (MALIK, HU, 2012; NASCIMENTO et al., 2008). Por esse motivo modelos experimentais poligênicos de obesidade induzida por dietas, são, preferencialmente utilizados, mimetizando a fisiopatologia da doença em humanos e outros animais, levando a melhor compreensão da síndrome metabólica e potenciais tratamentos (BROWN, PANCHAL, 2011; NILSSON et al., 2012). Em vista da importância da obesidade e das comorbidades associadas, incluindo a síndrome metabólica, sobre a fertilidade masculina, este estudo tem como objetivo identificar os efeitos da doença sobre a capacidade reprodutiva de ratos obesos ou diabéticos e no perfil proteômico. 30 os parâmetros reprodutivos. É importante, em conjunto com o estudo da reprodução, entender a nível sistêmico, como a síndrome metabólica está ligada a fisiologia e funcionalidade do órgão reprodutor, no intuito de melhor compreendermos o impacto das alterações proteômicas associadas à obesidade e ao diabetes na função espermática. 1. Pedersen SD. Metabolic complications of obesity. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab [Internet] 2013;27(2):179–93. Available from: http://dx.doi.org/10.1016/j.beem.2013.02.004 2. Petroianu A, Alberti LR, Antonio M, Melo B De. Relação entre diabetes mellitus e fertilidade masculina. Einstein [Internet] 2009;7(31):407–10. 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