UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL CRESCIMENTO DE MUDAS FRUTÍFERAS SOB AÇÃO DE MICRORGANISMOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO Carlos Henrique Barbosa Santos Engenheiro Agrônomo 2017 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA – UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL CRESCIMENTO DE MUDAS FRUTÍFERAS SOB AÇÃO DE MICRORGANISMOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO Carlos Henrique Barbosa Santos Orientador: Prof. Dr. Gustavo Henrique de Almeida Teixeira Coorientador: Prof. Dr. Everlon Cid Rigobelo Tese apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Agronomia (Produção Vegetal) 2017 Santos, Carlos Henrique Barbosa S237c Crescimento de mudas frutíferas sob ação de microrganismos promotores de crescimento / Carlos Henrique Barbosa Santos. – – Jaboticabal, 2017 x, 71 p.; il.; 29 cm Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2017 Orientador: Gustavo Henrique de Almeida Teixeira Coorientador: Everlon Cid Rigobelo Banca examinadora: Ane Sizuki Nociti Dezem, Eduardo Augusto Girardi, Antonio Baldo Geraldo Martins, Renata Aparecida de Andrade Bibliografia 1. Bactérias promotoras do crescimento de plantas. 2. Encapsulamento. 3. Inóculo microbiano. 4. Propagação de frutíferas. 5. Substrato. 6. Desidrogenase. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 634.1:631.461 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Diretoria Técnica de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DO AUTOR CARLOS HENRIQUE BARBOSA SANTOS– natural de Sapeaçu, Estado da Bahia, nasceu em 20 de setembro de 1984. Graduou-se em Agronomia pela Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Câmpus de Cruz das Almas (2006-2011). Foi bolsista do Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC) do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) desenvolvendo o projeto intitulado “Avaliação de diferentes épocas de colheita de espécies medicinais utilizadas no programa ervas” (2008-2009). Atuou no Projeto “Ervanários do Recôncavo de Valorização da Agroecologia Familiar e da Saúde - PROJETO ERVAS”, como bolsista do CNPq, na modalidade ITI-A-Iniciação Tecnológica e Industrial (2009-2010). Também foi bolsista do Programa Institucional de Bolsas de Extensão Universitária (PIBEX) com projeto voltado à agricultura familiar (2010-2011). Foi monitor voluntário das disciplinas Plantas Medicinais, Condimentares e Aromáticas e Tecnologia e Beneficiamento de Sementes. Em agosto de 2011, ingressou no curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Ciências Agrárias da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB). Foi bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), obtendo o título de Mestre em dezembro de 2013, com a dissertação intitulada “Propagação, desempenho e sobrevivência a estresses bióticos de maracujazeiro amarelo enxertado em espécies de Passiflora”. Em março de 2014, ingressou no curso de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Produção Vegetal), da Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias de Jaboticabal (UNESP/FCAV), sendo bolsista CAPES, finalizando-o com o desenvolvimento deste trabalho, parte das exigências para obtenção do título de Doutor em Agronomia. “Todo jardim começa com um sonho de amor. Antes que qualquer árvore seja plantada ou qualquer lago seja construído, é preciso que as árvores e os lagos tenham nascido dentro da alma. Quem não tem jardins por dentro, não planta jardins por fora e nem passeia por eles...” Rubem Alves AGRADECIMENTOS A Deus, pelo cuidado dispensado a mim, na conquista de mais um objetivo. A meus pais, Maria de Lourdes Barbosa Santos e José Souza dos Santos, pelo amor incondicional. A meus avôs, Benedito Borges e Edézio Barbosa (in memoriam) e as minhas avós Erotildes Queiroz e Maria São Pedro Souza (in memoriam), pelo carinho. A Patricia Santana de Novais, minha companheira, pelo amor, paciência e incentivo. Aos meus irmãos, Adriana, Cristina e Adriano, por se fazerem presentes mesmo estando distante. A toda minha família, pelos seus valiosos conselhos, atenção, carinho e incentivo. À UNESP/FCAV e ao Programa de Pós-Graduação em Agronomia (Produção Vegetal), por todas as oportunidades que me proporcionaram. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de doutorado. Ao professor Dr. Antonio Baldo Geraldo Martins, pelos valiosos ensinamentos, pela amizade e pelo exemplo de profissional. Aos professores Drs. Gustavo Henrique de Almeida Teixeira e Everlon Cid Rigobelo, pelos valiosos ensinamentos, confiança e disponibilidade na realização deste trabalho. Ao professor Dr. José Carlos Barbosa, pela atenção e auxílio na realização das análises estatísticas. Aos membros da banca examinadora da qualificação, Profa. Dra. Renata Aparecida de Andrade e Profa. Dra. Kátia Lopes Piveta, por todas as contribuições para este trabalho. Aos membros da banca examinadora da defesa, Profa. Dra. Letícia Ane Sizuki Nociti Dezem, Dr. Eduardo Augusto Girardi, Prof. Dr. Antonio Baldo Geraldo Martins e Profa. Dra. Renata Aparecida de Andrade, por todas as sugestões e conhecimentos que aprimoraram este trabalho. Aos amigos que estiveram presentes, contribuindo com seus ensinamentos, disposição e amizade. Em especial a Estevan Penha, Ruy Aguiar, Riviane Donha e Fernanda Nascimento. Aos funcionários da UNESP/FCAV, em especial a Rosane Innocente (secretária do Departamento de Produção Vegetal – Horticultura), Edna Daquila (secretária do laboratório de microbiologia), Luiz Carlos de Assis (técnico do laboratório de microbiologia) e ao Sidney Bedim (assistente do Ripado de Fruticultura), pela amizade e atenção do dia-a-dia. Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente para a realização deste trabalho, muito obrigado! viii SUMÁRIO Página RESUMO .................................................................................................................... ix ABSTRACT ................................................................................................................. x CAPÍTULO 1 – Considerações gerais ...................................................................... 1 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 1 2. REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................... 3 2.1 Potencial da fruticultura no Brasil ....................................................................... 3 2.2 Uso de inoculante microbiano na agricultura ..................................................... 4 2.3 Uso de microrganismos na produção de mudas ................................................ 5 2.4 Biomassa microbiana do solo ............................................................................ 6 2.5 Os microrganismos e suas enzimas .................................................................. 8 2.5.1 Atividade enzimática da desidrogenase .......................................................... 9 2.6 Encapsulação de microrganismos ................................................................... 10 3. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 12 CAPÍTULO 2 – Promoção do crescimento de mudas frutíferas por meio de microrganismos encapsulados .............................................................................. 23 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 24 2. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 26 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 28 4. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 31 5. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 32 CAPÍTULO 3 – Parâmetros microbiológicos em substrato de mudas frutíferas inoculado com microrganismos encapsulados ................................................... 44 1. INTRODUÇÃO ...................................................................................................... 45 2. MATERIAL E MÉTODOS ...................................................................................... 47 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 52 4. CONCLUSÃO ........................................................................................................ 56 5. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 56 CAPÍTULO 4 – Considerações finais ..................................................................... 71 ix CRESCIMENTO DE MUDAS FRUTÍFERAS SOB AÇÃO DE MICRORGANISMOS PROMOTORES DE CRESCIMENTO RESUMO – A utilização de microrganismos promotores do crescimento de plantas (MPCP) tem sido aceita como alternativa a redução do uso de adubos químicos. O objetivo deste trabalho foi avaliar dois métodos de encapsulamento de diferentes MPCP para verificar o estabelecimento destes microrganismos no solo e, consequentemente, o efeito do uso dos MPCP no crescimento de mudas de espécies frutíferas. O inóculo microbiano continha as seguintes espécies: Azospirillum brasilense, Burkolderia cepacia, Bacillus thuringienses, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis, Tricoderma spp. e Isolado 411. As espécies frutíferas avaliadas foram: Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg (jabuticaba); Myrciaria glazioviana (Kiaersk.) G. Barros & Sobral (cabeludinha); Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh (camu-camu); Eugenia brasiliensis Lam. (grumixama); Diospyros kaki L. (caqui); Garcinia brasiliensis Mart. (bacupari); Annona muricata L. (graviola); Duguetia lanceolata A. St. – Hil. (pindaíba); Chrysophyllum cainito L. (caimito); Anacardium occidentale L. (caju); Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl. (nêspera) e Litchi chinensis Sonn. (lichia). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 3 (controle, alginato de sódio e argila) x 2 (presença e ausência de inóculo microbiano) com cinco repetições (uma muda por repetição). As mudas foram mantidas em 50% de iluminação à temperatura média de 22,5°C, durante noventa dias, sendo avaliada a altura da planta, diâmetro do colo, massa seca da parte aérea e de raiz, atividade enzimática da desidrogenase, determinação do amônio e nitrato, fosfato solúvel em bicarbonato, carbono da biomassa microbiana e número total de bactérias. O diâmetro do caule para as mudas de M. dubia foi maior quando não se utilizou os MPCP, sejam eles encapsulados ou não. A presença de MPCP, independentemente do encapsulante utilizado, promoveu melhor desenvolvimento das mudas de caimito (altura, diâmetro do caule e massa seca de raiz) e de lichia (diâmetro do caule e massa seca da planta). Desta forma, os MPCP favorecem o crescimento das mudas destas espécies. A atividade microbiana no substrato não foi influenciada pela adição de microrganismos encapsulados. Os agentes encapsulantes argila e alginato de sódio, com ou sem inóculo microbiano, podem modificar a atividade enzimática da desidrogenase, o nitrogênio e o carbono da biomassa microbiana no solo, porém são dependentes da espécie frutífera cultivada. Palavras-chave: Bactérias promotoras do crescimento de plantas, encapsulamento, inóculo microbiano, propagação de frutíferas, substrato, desidrogenase. x GROWTH OF FRUIT SEEDLINGS UNDER THE ACTION OF GROWTH PROMOTING MICROORGANISMS ABSTRACT – The use of plant growth promoting microorganisms (PGPM) has been accepted as an alternative to reduce the use of chemical fertilizers. The objective of this study was to evaluate two methods of encapsulation of different PGPM to verify the establishment of these microorganisms in the soil and, consequently, the effect of PGPM on the growth of seedlings of fruit species. The microbial inoculums contained the species: Azospirillum brasilense, Burkolderia cepacia, Bacillus thuringienses, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis, Tricoderma spp. and Isolado 411. The fruit species evaluated were: Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg; Myrciaria glazioviana (Kiaersk.) G. Barros & Sobral; Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh; Eugenia brasiliensis Lam.; Diospyros kaki L.; Garcinia brasiliensis Mart.; Annona muricata L.; Duguetia lanceolata A. St. – Hil.; Chrysophyllum cainito L.; Anacardium occidentale L.; Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl. and Litchi chinensis Sonn. The experimental design was a completely randomized, in a factorial arrangement 3 (control, sodium alginate and clay) x 2 (presence and absence of microbial inoculum) with five replicates (one seedling per replicate). Seedlings were maintained in 50% illumination at an average temperature of 22.5 °C for ninety days, and evaluated for plant height, diameter, root shoot and stem dry shoot, enzymatic activity of dehydrogenase, determination of ammonium and nitrate, bicarbonate soluble phosphate, carbon of the microbial biomass and total number of bacteria. The stem diameter of M. dubia seedlings was higher when PGPM was not used, either encapsulated or not. The presence of PGPM, regardless the encapsulant used, promoted a better development of C. cainito (height, stem diameter and root dry mass) and L. chinensis (stem diameter and plant dry mass) seedlings. In this way, the PGPM favor the growth of the seedlings of these species. Microbial activity in the substrate was not influenced by the addition of encapsulated microorganisms. The encapsulating agent clay and sodium alginate, with or without microbial inoculum, may modify the enzymatic activity of the dehydrogenase, the nitrogen and the carbon of the microbial biomass in the soil, but are dependent on the cultivated fruit species. Keywords: Plant growth promoting bacteria, encapsulation, fruit propagation, microbial inoculums, substrate, dehydrogenase. 1 CAPÍTULO 1 – Considerações gerais 1. INTRODUÇÃO O cultivo de plantas frutíferas é uma atividade econômica de grande importância, que gera emprego e renda aos produtores rurais, além de ser uma alternativa que contribui para a melhoria da qualidade na alimentação das famílias. A produção de mudas frutíferas tem expandido e exigido, cada vez mais, conhecimentos técnicos para seu bom desenvolvimento, garantindo assim uma melhor qualidade do fruto ofertado no mercado. Um dos principais fatores que influenciam na qualidade dos frutos é a da qualidade da muda (SILVA et al., 2011). A produção de mudas frutíferas sofre influência de fatores climáticos e edáficos, e.g. luz, temperatura, troca de gases, água, substrato e nutrição, e bióticos, como patógenos, pragas e micróbios da rizosfera (HARTMANN et al., 2010). Quanto ao substrato, destina-se a sustentar as plantas durante o enraizamento e servir de fonte de nutrientes para as mesmas. Uma mistura ideal é aquela que tem porosidade suficiente para proporcionar aeração adequada, que apresente boa drenagem e tenha capacidade de retenção de água satisfatória para oferecer umidade adequada (ZIETEMANN; ROBERTO, 2007; HARTMANN et al., 2010). Os microrganismos, quando encontradas em habitats naturais, são muitas vezes colonizadores do interior e exterior de órgãos de plantas e, nestes termos, podem ser benéficos, neutros ou prejudiciais ao seu crescimento e desenvolvimento (MARIANO et al., 2004). Os microrganismos promotores de crescimento de plantas (MPCP) exercem efeito benéfico, podendo ser de vida livre ou estar em simbiose com a planta (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Estes podem ser utilizadas para o tratamento de sementes, na produção de mudas, incorporadas ao substrato de plantio, no tratamento de estacas, tubérculos e raízes, além de serem pulverizadas na parte aérea (folhagem e frutos) e em pós-colheita (FREITAS, 2007). Os MPCP estimulam diretamente na fixação de nitrogênio (HAN et al., 2005), são capazes de solubilizar nutrientes (RODRÍGUEZ; FRAGA, 1999; SOUZA et al., 2017), produzir fitoreguladores de crescimento por meio da presença de 1-amino- 2 ciclopropano1-carboxilato (ACC) deaminase (DONATE-CORREA et al., 2004), ácido indol acético (AIA) (CATTELAN, 1999), entre outros benefícios (SINGH; PANDEY; SING, 2011). Indiretamente, os MPCP atuam como agentes de controle biológico pela produção de ácido cianídrico, bactericidas e antibióticos, competição por espaço, liberação de Fe+3 e outros nutrientes, parasitismo, indução de resistência e proteção cruzada (BERNARDES et al., 2010). A técnica de encapsulação consiste em envolver materiais sólidos, líquidos e gasosos em pequenas cápsulas que liberam seu conteúdo sob condições controladas. Atualmente vem sendo utilizada para manter a estabilidade dos microrganismos, podendo aumentar a sobrevivência dos mesmos no solo. Existem diversos tipos de materiais encapsulantes, como, por exemplo, alginato de cálcio, proteínas do soro do leite e gomas (SCHOEBITZ; LÓPEZ; ROLDÁN, 2013; VEMMER; PATEL, 2013). Existem muitas dificuldades de estabelecimento dos microrganismos promotores do crescimento de plantas no solo e/ou na rizosfera, como a reduzida sobrevivência a condições adversas e competição com os microrganismos nativos. O encapsulamento, no entanto, pode promover um efeito protetor destes microrganismos. O objetivo do presente trabalho foi avaliar dois métodos de encapsulamento de diferentes MPCP para verificar o estabelecimento destes microrganismos no solo e, consequentemente, o efeito do uso dos MPCP no crescimento de mudas de espécies frutíferas. 3 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Potencial da fruticultura no Brasil A fruticultura é uma das atividades econômicas que merece destaque no agronegócio brasileiro. A grande diversidade de frutas encontradas aqui só é possível porque o país apresenta variados tipos de solo e clima, o que garante a produção durante todo o ano de frutas tropicais, subtropicais e temperadas (ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA, 2017). De acordo com os últimos dados divulgados pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE), a fruticultura brasileira somou 38,775 milhões de toneladas de frutas frescas no ano de 2016. Mesmo esse resultado tendo diminuído, em comparação as 40,953 milhões de toneladas registradas em 2015 (IBGE, 2016), o Brasil mantém a posição de terceiro produtor mundial de frutas, ficando atrás apenas de China e Índia, o que mostra a relevância do setor para a economia brasileira (AGRIANUAL, 2016). O setor frutícola emprega 5,6 milhões de pessoas, que corresponde a 27% da mão de obra agrícola. Para cada US$ 10 mil investidos na fruticultura tecnificada, são gerados, em média, três empregos diretos permanentes e dois indiretos. É uma atividade importante para o desenvolvimento rural do país, principalmente por estar fundamentada em pequenas e médias propriedades (ANUÁRIO BRASILEIRO DA FRUTICULTURA, 2016). O IBGE divide a produção nacional de frutas na Produção Agrícola Municipal (PAM) em 22 produtos, sendo três classificados como oriundas de lavouras temporárias (abacaxi, melancia e melão) e 19 pertencentes às lavouras permanentes (abacate, banana, caqui, castanha-de-caju, coco-da-baía, figo, goiaba, laranja, limão, maçã, mamão, manga, maracujá, marmelo, noz, pera, pêssego, tangerina e uva). Em 2016, os plantios com frutíferas representavam 2,5 milhões de hectares, correspondendo a 3,4% da área total ocupada pela agricultura brasileira, com um valor da produção avaliado em R$ 33,3 bilhões de reais, acréscimo de 26,0% quando comparado ao obtido em 2015 (IBGE, 2016). 4 2.2 Uso de inoculante microbiano na agricultura O desenvolvimento de inoculantes microbianos tem aumentado devido ao reconhecimento dos efeitos nocivos ao ambiente da aplicação excessiva de fertilizantes químicos (HUNGRIA, 2011). A produção agrícola sustentável pode ser alcançada enfatizando o uso de microrganismos promotores de crescimento como inoculantes microbianos (SCHOEBITZ; LÓPEZ; ROLDÁN, 2013). O solo funciona como um sistema vivo que sustenta a produtividade biológica, promovendo a qualidade do ar e da água e, em geral, mantendo vegetais, animais e a saúde humana. Assim, um solo com qualidade fornece condições para as plantas expressarem o seu máximo potencial produtivo (VEZZANI; MIELNICZUC, 2009). Por outro lado, as plantas também podem afetar a biota do solo influenciando a quantidade e, muitas vezes, a qualidade dos substratos orgânicos em que estão estabelecidas, pois podem estabelecer associações com microrganismos do solo (VIKETOFT et al., 2005). A coexistência de várias espécies de plantas e seus exsudatos radiculares podem aumentar a diversidade dos microrganismos do solo pelo aumento da heterogeneidade de substratos orgânicos liberados (BROUGHTON; GROSS, 2000) e pela serrapilheira que é decomposta (HOLANDA et al., 2015). As plantas podem ainda desempenhar funções importantes na determinação da atividade enzimática do solo (SINGH; KUMAR, 2008). Microrganismos promotores do crescimento de plantas (MPCP) têm sido citados como beneficiadores de uma gama de espécies vegetais. Dentre estas espécies, as mais frequentemente citadas são as anuais, geralmente de ciclo curto, como a abóbora (CHEN et al., 2000), alface (FREITAS; MELLO; DONZELI, 2003), feijão (SILVEIRA et al., 1995), trigo (LUZ, 2001) etc; no entanto, existem também estudos da promoção de crescimento em plantas perenes, como café (FREITAS, 1989), abeto (CHANWAY et al., 2000) e citros (FREITAS; VILDOSO, 2004). Uma das maneiras de exercer benefício, além da promoção direta do crescimento, é indiretamente, o controle biológico de fitopatógenos, em que as formas de atuação dos microrganismos também podem ser variados (FREITAS; PIZZINATTO, 1991). Barka et al. (2000) observaram o aumento da resistência de videiras a Botrytis cinerea, possivelmente associada ao aumento da produção de 5 citocininas na rizosfera. A utilização de MPCP, direta ou indiretamente, teria a vantagem de diminuir a utilização de insumos químicos, com benefícios tanto de ordem econômica quanto de ordem ecológica, uma vez que tais produtos geram, frequentemente, problemas de contaminação ambiental. Em plantas anuais, o benefício, se consistir em aumento de matéria seca, poderá resultar em encurtamento do ciclo ou em aumento na produção, dependendo da espécie (FREITAS; MELLO; DONZELI, 2003). Em plantas perenes, uma forma de benefício seria a diminuição do período em que a muda passa em viveiro, o que é o caso das frutíferas em geral, nas quais este tipo de manipulação é na maioria das vezes desejável. Dentre outras formas de benefício, destaca-se a solubilização de fosfatos, que, associada à presença de micorrizas arbusculares, pode favorecer grandemente a nutrição de plantas (CARDOSO et al., 1986). Na produção de mudas em viveiro, seria aconselhável que a inoculação dos microrganismos fosse feito no substrato, de modo que a colonização da rizosfera e o benefício ocorressem o mais cedo possível (CHANWAY et al., 2000; STURZ; NOWAK, 2000). 2.3 Uso de microrganismos na produção de mudas A produção de mudas é uma das etapas mais importantes do sistema de produção agrícola, uma vez que dela depende o desempenho final das plantas no campo (HARTMANN et al., 2010). Quando falamos em espécies perenes, como as frutíferas, esta etapa merece uma atenção ainda maior, visto que não é possível aqui uma renovação do pomar a cada ano. O substrato é o meio onde se desenvolvem as raízes das plantas produzidas em sementeiras e/ou viveiros de mudas olerícolas, ornamentais, frutíferas ou silvícolas (ROS et al., 2015). Ele deve garantir, por meio de sua fase sólida, a manutenção mecânica do sistema radicular e estabilidade da planta; da fase líquida o suprimento de água e nutrientes; e da fase gasosa, o suprimento de oxigênio e o transporte de dióxido de carbono entre as raízes e o ar externo (BRAGA JUNIOR; BRUNO; ALVES, 2010; HARTMANN et al., 2010). Deve ainda estar isento de 6 elementos minerais ou qualquer outra substância em concentração fitotóxica, assim como de fitopatógenos, pragas e plantas indesejáveis (SOUZA et al., 2001). Com relação à qualidade dos substratos, um aspecto pouco estudado é o efeito da microbiota na qualidade das mudas produzidas. Sabe-se que a microbiota do solo exerce efeitos diretos e indiretos na produtividade e na qualidade dos produtos agrícolas (ANDREOLA; FERNANDES, 2007) e, provavelmente, as populações microbianas naturais ou adicionadas aos substratos de mudas desempenham funções similares às do solo, tais como decomposição de resíduo orgânico com a liberação de nutrientes e CO2 (ALVES et al., 2011; CAPUANI et al., 2012); produção de substâncias estimuladoras do crescimento vegetal (HAYAT et al., 2010; SOUZA et al., 2017); estabelecimento de simbiose mutualista com plantas (CARNEIRO; SIQUEIRA; DAVIDE, 2004); e controle biológico de pragas e doenças (RUANO-ROSA et al., 2014; LIU et al., 2016; LIU, et al., 2017). Os MPCP têm ganhado destaque na agricultura, devido seu baixo custo, fácil acesso e modo de aplicação simples. Em geral, os MPCP quando usados sozinhos ou em consórcios, resulta em impacto positivo na produção de diversas culturas (ZAIDI et al., 2015). Os resultados promissores dos estudos realizados até o momento, sobre a utilização de MPCP com inúmeras atividades de promoção de crescimento de plantas, em diferentes sistemas de produção, estimulam o desenvolvimento desta pesquisa no estudo de microrganismos promotores de crescimento em mudas de espécies frutíferas. 2.4 Biomassa microbiana do solo O solo funciona como um substrato de crescimento para as plantas, regulando o fluxo de água no ambiente e age como meio intermediário de armazenamento de alguns elementos no ecossistema. Apresenta-se como um complexo habitat que regula a produtividade da planta e promove a manutenção de parte dos ciclos biogeoquímicos pela atividade de microrganismos capazes de degradar compostos orgânicos (AVIDANO et al., 2005). A biomassa microbiana do solo (BMS) pode ser entendida como a parte viva da matéria orgânica, exceto as raízes e organismos maiores do que 5 x 10³ µm³, 7 com proporção média de 2 a 5% de carbono orgânico e 1 a 5% do nitrogênio total do solo (CERRI; ANDREUX; EDUARDO, 1992; DE-POLLI; GUERRA, 1997), sendo constituída por bactérias, fungos, actinomicetos, algas e protozoários. Quanto maior a BMS, maior também será a reserva de carbono no solo, expressando menor potencial de decomposição da matéria orgânica (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). A biomassa pode atuar como um agente de transformação da matéria orgânica, na ciclagem de nutrientes e no fluxo de energia, facilitando um maior estabelecimento e desenvolvimento de espécies vegetais que forem implantadas em uma área, pois a diversidade microbiana vai se alterando junto com o crescimento das mesmas (SMITH et al., 2001; JOHNSON; LEE; SCOW, 2003). A determinação dos microrganismos do solo tem sido feita pela estimativa do C e N da biomassa microbiana (BENINTENDE et al., 2008). A BMS atua tanto como fonte e dreno de nutrientes e catalisadora de processos enzimáticos no solo, o que a caracteriza com uma função dupla que é aceita amplamente (TEMPLER; FINDLAY; LOVETT, 2003). Ela compreende uma fonte potencial de N, P, S e outros nutrientes para as plantas, e os fluxos através do reservatório microbiano podem ser de particular relevância no solo (DE-POLLI; GUERRA, 1999; KOUNO; WU; BROOKS, 2002) A dinâmica da matéria orgânica é importante por influenciar na fertilidade e qualidade do solo e, consequentemente, sua capacidade produtiva. Esta dinâmica é regida por diversos fatores e caracterizada por transformações que dependem da biomassa microbiana do solo e resulta na disponibilidade ou indisponibilidade de nutriente às plantas (DE-POLLI; GUERRA, 1999). Ainda que todas as propriedades física, química, biológica e bioquímica estejam envolvidas nas funções do solo, as propriedades bioquímicas e biológicas geralmente reagem mais rapidamente em curto prazo às mudanças do ambiente, por estarem ligadas diretamente ao número e atividade da biota do solo, bem como associadas com propriedades de decomposição de componentes orgânicos e ciclagem dos elementos biogeoquímicos (GREEN et al., 2007; TRASAR-CEPEDA et al., 2008), em geral usadas para estimar a qualidade do solo (DORAN, 2002; GARCIA; NAHAS, 2007). Desta forma, um solo de alta qualidade pode possuir 8 atividade biológica intensa com populações microbianas balanceadas (DE-POLLI; GUERRA, 1997; TÓTOLA; CHAER, 2002). Os parâmetros bioquímicos, comumente utilizados para estimar as mudanças na qualidade do solo, compreendem as associações da biomassa microbiana do solo às atividades enzimáticas das enzimas desidrogenase, urease, fosfatase e β- glucosidase e a capacidade de mineralização do nitrogênio (GIL-SOTRES et al., 2005). 2.5 Os microrganismos e suas enzimas Visto que a qualidade do solo é dependente de variáveis físicas, químicas, biológicas e bioquímicas, sua caracterização exige a escolha dos parâmetros mais sensíveis a mudanças que serão provocadas pelas práticas de manejo. Neste contexto, é válido desenvolver índices que aliem essas diferentes propriedades e ainda possam servir como indicadores dos principais processos do solo. Também é importante avaliar os parâmetros que forneçam indicações sobre os níveis de atividade das comunidades microbianas do solo, tais como as atividades enzimáticas, para verificar o estado metabólico das populações de microrganismos presentes no solo (LIU et al., 2014). Os parâmetros relacionados com o estado bioquímico e microbiológico do solo são importantes indicadores da atividade microbiana no solo, principalmente a atividade de enzimas que estão diretamente relacionadas com os ciclos do N, P e C (como a protease, fosfatase e β-glucosidase, respectivamente), ou enzimas de características mais gerais, como a desidrogenase (LISBOA et al., 2012). No solo são encontradas muitas enzimas como, oxido-redutases, transferases, hidrolases, liases dentre outras. No entanto, a maioria são desidrogenases, catalases, fosfatases, amilases, celulases, pectinases, proteases, ureases, argininadeaminases e nitrato redutases. São principalmente de origem bacteriana ou fúngica, com uma pequena fração secretada por animais ou plantas (SINGH; KUMAR, 2008). Estas enzimas agem intra ou extracelularmente e regulam a maioria dos processos bioquímicos do solo (Tabela 1). 9 Tabela 1 – Principais enzimas indicadoras da qualidade do solo. Enzimas do solo Reação enzimática Atividade indicadora Desidrogenase Sistema de transporte de elétrons Atividade microbiana β-glucosidase Hidrólise de celobiose Ciclagem de carbono Celulase Hidrólise de celulose Ciclagem de carbono Urease Hidrólise da uréia Ciclagem de nitrogênio Amidase Mineralização do N Ciclagem do N Fosfatase Liberação de PO4 - Ciclagem do P Arisulfatase Liberação de SO4 - Ciclagem de S FDA Hidrólise Atividade enzimática Fonte: ARAÚJO; MONTEIRO (2007) Uma maneira de se medir a atividade microbiana do solo é determinando sua atividade enzimática, que indica mudanças ocorridas na microbiota do solo, sem, entretanto, relacioná-las a algum grupo específico de organismos. Os métodos enzimáticos são representativos com relação à capacidade metabólica do solo, além de permitirem obter resultados geralmente rápidos e de baixo custo (CHAPERON; SAUVÉ, 2008). 2.5.1 Atividade enzimática da desidrogenase A desidrogenase é uma enzima intracelular oxi-redutora que catalisa reações de compostos orgânicos. Os processos de oxidação-redução que ocorrem no solo podem ser representados por essa enzima, exibindo alta correlação com a respiração, o que pode dar idéia de metabolismo (PANDEY; SINGH, 2006). Por isso, pode refletir mudanças na população microbiana e o potencial redox do solo. A desidrogenase é encontrada exclusivamente em células vivas, e está envolvida no processo de transporte de elétrons, que é acoplado à síntese de ATP, e que, por isso, pode ser empregada como medida da atividade biológica (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Por causa da sensibilidade desta enzima em responder a alterações ocorridas no solo, diversos estudos têm utilizado a atividade 10 da desidrogenase para verificar o efeito da adoção de diferentes práticas agrícolas sobre a biota do solo (CHU et al., 2007; MOLERO et al., 2009). 2.6 Encapsulação de microrganismos A encapsulação de microrganismos é uma técnica que tem sido utilizada na agricultura para obter uma estrutura envolvente que permita a proteção, liberação e funcionalização dos microrganismos. De fato, a encapsulação tende a estabilizar as células, proporcionando uma menor exposição a tensões abióticas e bióticas e potencialmente a sua viabilidade e estabilidade durante a produção, armazenamento e manuseamento, ao mesmo tempo que confere uma proteção adicional durante a reidratação (SCHOEBITZ; SIMONIN; PONCELET, 2012). A inoculação de plantas com microrganismos para aumentar o rendimento das culturas ou plantas nativas tem sido praticada há várias décadas (BASHAN et al., 2014; CALVO; NELSON; KLOEPPER, 2014). Dois fatores predominam no sucesso da inoculação: efetividade do isolado da bactéria e a técnica de aplicação. A primeira formulação de encapsulamento com alginato, que é o mais comum polímero experimental na agricultura, já tem 30 anos (BASHAN, 1986). As tecnologias de encapsulamento relacionadas aos campos agrícolas estão atrasadas em relação aos avanços da área farmacêutica e da nanotecnologia. Consequentemente, o principal objetivo da encapsulação é incorporar os microrganismos promotores de crescimento em produtos comerciais e tornar-los aceitáveis para os agricultores, como uma prática rotineira. Isto deve consistir numa adaptação das técnicas às atuais necessidades agrícolas. Os derivados de alginato (C6H8O6)n, frequentemente combinados com adesivos, nutrientes, surfactantes, estabilizantes, materiais de dispersão e crioprotetores, são os polímeros experimentais preferidos para a maioria das encapsulações de microrganismos para usos agrícolas e ambientais (CALVO; NELSON; KLOEPPER, 2014). As formulações de alginato são utilizadas para a aplicação de agentes de controle biológico, promotores de crescimento bacteriano, fungos micorrízicos e cultivo de cogumelos. As vantagens das formulações de alginato para estes 11 propósitos são a sua natureza não tóxica, a biodegradabilidade, a disponibilidade a baixo custo e a liberação lenta dos microrganismos aprisionados no solo, o que pode ser conseguido por variações na estrutura polimérica (SCHOEBITZ; LÓPEZ; ROLDÁN, 2013). Formulações do tipo encapsulado granulado ("pellets") podem ser armazenadas e, após um certo período, serem reativadas por reidratação. No caso de utilização do alginato como polímero de géis granulados, este pode proteger os microrganismos da radiação ultravioleta, aumentando a vida útil em condições de campo (SANHUEZA; MELO, 2007). Os alginatos são sais monovalentes de ácido algínico extraídos de diferentes tipos de algas marrons. São disponíveis como sais solúveis em água, tais como: alginato de amônia, alginato de potássio e alginato de sódio; ou como sal de cálcio insolúvel em água (SANHUEZA; MELO, 2007). Espera-se que as cápsulas sejam suficientemente pequenas, contudo ainda capazes de encapsular um número suficiente de bactérias. Sementes revestidas com fertilizantes e fungicidas já são comuns e universalmente aceitas pela maioria dos agricultores, sendo que a aplicação de formulações em esferas de micro- alginato para inocular plantas no solo tem sido bem sucedida em diversas ocasiões (BASHAN et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2014). As áreas de alimentos, farmacologia, nanotecnologia e cosméticos representam campos de pesquisa muito maiores para o uso de encapsulamento do que seus usos em agricultura. Técnicas derivadas destes campos foram utilizadas para tornar o polímero adequado para a encapsulação de materiais biológicos. Embora estas encapsulações não estejam relacionadas com os inoculantes de plantas, podem proporcionar incentivos para desenvolvimentos futuros (CHAMPAGNE et al., 2011; MENEZES et al., 2013). A argila é outro material que pode ser adicionado às formulações e utilizado como agente encapsulante de microrganismos, sendo uma alternativa promissora por causa da sua grande disponilidade e custo baixo (CARNEIRO; GOMES, 1997; MESSA et al., 2016). Os minerais de argila oferecem espaço intercalar expansível que pode ser colonizado por microrganismos (PARK et al., 2013) e por isso, são reconhecidos como moléculas de proteção dos mesmos. 12 3. 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O inóculo microbiano continha as seguintes espécies: Azospirillum brasilense, Burkolderia cepacia, Bacillus thuringienses, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis, Tricoderma spp. e Isolado 411. As espécies frutíferas avaliadas foram: Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg (jabuticaba); Myrciaria glazioviana (Kiaersk.) G. Barros & Sobral (cabeludinha); Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh (camu-camu); Eugenia brasiliensis Lam. (grumixama); Diospyros kaki L. (caqui); Garcinia brasiliensis Mart. (bacupari); Annona muricata L. (graviola); Duguetia lanceolata A. St. – Hil. (pindaíba); Chrysophyllum cainito L. (caimito); Anacardium occidentale L. (caju); Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl. (nêspera) e Litchi chinensis Sonn. (lichia). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 3 (controle, alginato de sódio e argila) x 2 (presença e ausência de inóculo microbiano) com cinco repetições (uma muda por repetição). Foi avaliada a altura da planta, diâmetro do colo, massa seca da parte aérea e de raiz. Para a espécie M. dubia o diâmetro do caule foi maior quando não se utilizou os microrganismos promotores de crescimento, sejam eles encapsulados ou não. Microrganismos promotores do crescimento de plantas (MPCP), independente do encapsulamento utilizado, promovem maior crescimento das mudas de caimito (altura, diâmetro do caule e massa seca de raiz) e de lichia (diâmetro do caule e massa seca da planta). Palavras-chave: Propagação de frutíferas, encapsulamento, inóculo microbiano, substrato. ABSTRACT - The use of microorganisms capable of promoting plant growth has been accepted as an alternative to reducing the use of chemical fertilizers. The 24 objective of this study was to evaluate the inoculation of plant growth promoter microorganisms in substrate used for fruit tree seedlings using two encapsulating agents, clay and sodium alginate. The microbial inoculums contained the species: Azospirillum brasilense, Burkolderia cepacia, Bacillus thuringienses, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Tricoderma spp. and Isolado 411. The fruit species evaluated were: Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg; Myrciaria glazioviana (Kiaersk.) G. Barros & Sobral; Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh; Eugenia brasiliensis Lam.; Diospyros kaki L.; Garcinia brasiliensis Mart.; Annona muricata L.; Duguetia lanceolata A. St. – Hil.; Chrysophyllum cainito L.; Anacardium occidentale L.; Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl. and Litchi chinensis Sonn. The experimental design was completely randomized, in a factorial scheme 3 (control, sodium alginate and clay) x 2 (presence and absence of microbial inoculum) with five replicates (one seedling per replicate). Was evaluated plant height, diameter, root shoot and stem dry shoot. For the M. dubia species the diameter of the stem was higher when the growth promoting microorganisms, whether encapsulated or not, were not used. Plant growth promoting microorganisms (PGPM), regardless of the encapsulation used, promote greater growth of the caimito (height, root diameter and root dry mass) and lychee (stem diameter and dry plant mass) seedlings. Keywords: Fruit propagation, encapsulation, microbial inoculum, potting mix. 1. INTRODUÇÃO A produção de mudas frutíferas sofre influência de fatores climáticos e edáficos, e.g. luz, temperatura, troca de gases, água, umidade, substrato e nutrição, e bióticos, como patógenos, pragas e micróbios da rizosfera (HARTMANN et al., 2010). Em relação ao substrato, este deve ser denso e firme, altamente decomposto e estável, suficientemente poroso para drenar o excesso de água, livre de pragas e doenças, apresentar baixa salinidade, ser capaz de ser pasteurizado ou tratado quimicamente, ter alta capacidade de troca de cátions (CTC), reter nutrientes e ser de fácil disponibilidade (HARTMANN et al., 2010). Além disso, os fatores bióticos, 25 e.g. micróbios da rizosfera, micorrizas e/ou bactérias, podem influenciar o desenvolvimento das mudas, sendo que as bactérias promotoras de crescimento de plantas (BPCP) exercem efeitos benéficos ao estimular, por exemplo, a fixação de nitrogênio (HAN et al., 2005), a solubilização de nutrientes (MAJEED et al., 2015), a produção de reguladores vegetais (DONATE-CORREA et al., 2004) e o aumento da capacidade de absorção das raízes (SINGH; PANDEY; SING, 2011). Indiretamente, as BPCP atuam como agentes de controle biológico contra patógenos presentes no substrato (BARKA et al., 2000), possivelmente pela produção de ácido cianídrico, bactericidas e antibióticos, pela competição por espaço, liberação de Fe+3 e outros nutrientes, parasitismo, indução de resistência e proteção cruzada (FREITAS; PIZZINATTO, 1991; BERNARDES et al., 2010). Em relação às espécies de BPCP, o gênero Azospirillum possui várias espécies de bactérias que crescem amplamente na rizosfera de gramíneas e, após serem isoladas e utilizadas na produção vegetal, apresentaram respostas positivas sobre a produtividade e na fixação biológica de nitrogênio (FBN) (JAMES, 2000; HAUWAERTS et al., 2002; RAMOS et al., 2002; FISCHER et al. 2007). A Burkholderia cepacia é outra importante bactéria no processo de FBN (WONG- VILLARREAL; CABALLERO-MELLADO, 2010). Isolados epifíticos de Bacillus tem apresentado efeitos satisfatórios quando utilizados como agentes de biocontrole e na promoção do crescimento de plantas, em destaque estão os isolados Bacillus subtilis, B. megaterium, B. cereus (LUNA et al., 2002) e B. thuringienses (GOMES et al., 2003). Entre os fungos, Trichoderma spp. se destacam como agente de biocontrole (HARMAN, 2006) e também na promoção de crescimento de plantas (NIETO-JACOBO et al., 2017). Uma das formas de se incorporar as BPCP aos substratos seria utilizando a encapsulação em materiais sólidos, líquidos e gasosos em pequenas cápsulas que liberam seu conteúdo sob condições controladas. A encapsulação é importante para a manutenção da estabilidade dos microrganismos e para aumentar a resistência das bactérias no substrato. Dentre os muitos tipos de materiais encapsulantes, o alginato de cálcio e de sódio, bem como as proteínas do soro do leite e gomas têm sido os mais utilizados (SCHOEBITZ et al., 2013; VEMMER; PATEL, 2013). A argila é outro material que pode ser adicionado às formulações e utilizado como agente 26 encapsulante de microrganismos, sendo uma alternativa promissora por causa da sua grande disponilidade e custo baixo (CARNEIRO; GOMES, 1997; MESSA et al., 2016). Os minerais de argila oferecem espaço intercalar expansível que pode ser colonizado por microrganismos (PARK et al., 2013) e por isso, são reconhecidos como moléculas de proteção dos mesmos. Como a inoculação isolada ou combinada de microrganismos pode se constituir em uma ferramenta biotecnológica de interesse na produção de mudas de espécies frutíferas, o objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da inoculação de microrganismos promotores do crescimento de plantas (MPCP) em substrato utilizado para mudas de espécies frutíferas, usando dois agentes encapsulantes, argila e alginato de sódio. 2. MATERIAL E MÉTODOS O experimento foi conduzido entre 16 de março e 16 de junho de 2015 (90 dias) no Ripado de Fruticultura do Departamento de Produção Vegetal da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (UNESP-FCAV), Câmpus de Jaboticabal-SP, (21º14’05 de Latitude Sul, 48º17’09’’ de Longitude Oeste e altitude de 590m). O clima da região, segundo a classificação de Köppen é Cwa, apresentando uma temperatura média anual de 22 ºC. Os dados climáticos observados no período encontram-se na Figura 1. O inóculo utilizado continha as seguintes espécies de microrganismos: Azospirillum brasilense, Burkolderia cepacia, Bacillus thuringienses, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Tricoderma spp. e Isolado 411. Todos os microrganismos fazem parte da coleção do Laboratório de Microbiologia do Solo do Departamento de Produção Vegetal da UNESP-FCAV, Câmpus de Jaboticabal. Os microrganismos cresceram separadamente em caldo nutritivo por sete dias em frascos mantidos em B.O.D. (Eletrolab, modelo 347 F, Brasil), à temperatura de 25 ºC. Após o período de incubação, os microrganismos foram centrifugados separadamente a 10.000 rpm durante 10 min a 28 ºC (Novatecnica, modelo MLW K24, Brasil). A concentração do inóculo foi padronizada conforme recomendação de Barry e Thornsberry (1991) e Sahm e Washington II (1991) em 1 x 107 UFC mL-1, 27 com auxílio de espectrofotômetro (Micronal, modelo B382, Brasil) na absorbância de 695 nm. A cada solução de microrganismos foi adicionada uma solução de alginato de sódio (NaC6H7O6) na concentração de 1% (m/v). As soluções de microrganismos acrescidas de alginato de sódio foram gotejadas em solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 0,1 M, dando origem às esferas com o inóculo microbiano (SHEU; MARSHALL, 1993; SULTANA et al., 2000). A seguir, as esferas foram lavadas com água destilada, com auxílio de uma peneira, submetidas ao processo de secagem em câmara de fluxo laminar por um período de seis horas e armazenadas em temperatura ambiente (17 – 28 °C). Para cada 1 mL de solução de um microrganismo foram originada 12 esferas. Como em cada vaso foram aplicados oito microrganismos diferentes, consequentemente, cada vaso recebeu 96 esferas microbianas no total, que foram incorporadas ao substrato em um orifício de aproximadamente 10 cm de profundidade, a fim de se garantir maior proximidade do material depositado no substrato com as raízes das mudas. Para o tratamento que continha o alginato, este recebeu apenas as esferas de alginato de sódio sem a presença do inóculo microbiano, sendo adicionadas 96 esferas por vaso. Visando a inoculação dos microrganismos com a argila, foi preparada uma suspensão que continha 1 mL de cada microrganismo para 1 mL de argila na diluição de 1:3 (m/v) de água destilada (adaptado CARNEIRO; GOMES, 1997). Cada vaso recebeu, no total, 8 mL de inóculo microbiano adicionado a 8 mL de argila, que foram incorporados ao substrato em um orifício de aproximadamente 10 cm de profundidade, totalizando 16 mL por vaso. Para o tratamento que continha somente argila, realizou-se o mesmo procedimento, excluindo apenas a adição do inóculo microbiano. Todas as mudas das espécies frutíferas estudadas foram originadas de sementes obtidas de plantas matrizes do Banco Ativo de Germoplasma da UNESP- FCAV, Câmpus de Jaboticabal. Os microrganismos foram inoculados nos substratos onde as mudas das seguintes espécies frutíferas estavam sendo conduzidas: Myrciaria cauliflora (DC.) O. Berg (jabuticaba); Myrciaria glazioviana (Kiaersk.) G. Barros & Sobral (cabeludinha); Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh (camu-camu); Eugenia brasiliensis Lam. (grumixama); Diospyros kaki L. (caqui); Garcinia 28 brasiliensis Mart. (bacupari); Annona muricata L. (graviola); Duguetia lanceolata A. St. – Hil. (pindaíba); Chrysophyllum cainito L. (caimito); Anacardium occidentale L. (caju); Eriobotrya japonica (Thunb.) Lindl. (nêspera) e Litchi chinensis Sonn. (lichia). O substrato utilizado foi composto de uma mistura de terra, areia e esterco bovino na proporção de 3:1:1 (v/v/v), disposto em sacos de polietileno (22x11 cm). A irrigação foi manual, diária, conforme monitoramento da umidade do substrato. As mudas foram mantidas sob telado com 50% de luminosidade, por um período de 90 dias. Durante o experimento, a temperatura mínima foi de 17°C e a máxima de 28°C (Figura 1). As mudas selecionadas para este experimento foram padronizadas, por espécie, em função da altura e diâmetro do caule antes da inoculação. Ao final dos 90 dias, estas foram avaliadas quanto: altura da planta (cm), medindo-se da base até o ápice da planta; diâmetro do caule (mm), na região do colo com auxílio de paquímetro digital; massa seca da parte área (g) e massa seca da raiz (g) (65 °C, 72 h), de acordo com o descrito por Souza et al. (2003). Em função dos distintos padrões de crescimento de cada espécie frutífera, não foi realizada a análise estatística comparando os resultados entre as espécies. Desta forma, para cada espécie frutífera, separadamente, foi adotado o delineamento inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 3 (controle, alginato de sódio e argila) x 2 (presença e ausência de inóculo microbiano) com cinco repetições (uma muda por repetição), totalizando 30 plantas. Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias comparadas pelo teste de Tukey (p≤0,05), utilizando-se o Software AgroEstat (BARBOSA; MALDONADO JÚNIOR, 2009). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foi observado efeito significativo (p<0,01) dos microrganismos promotores de crescimento apenas para a altura de plantas da espécie C. cainito L. (caimito) no fator encapsulamento (Tabela 1). Para esta espécie, uma maior altura de plantas foi atingida quando os microrganismos foram inoculados com argila, porém sem diferir do controle (Tabela 1). A inoculação com alginato de sódio diminuiu a altura de 29 plantas. Para as demais espécies, não foram observadas diferenças significativas para a altura de planta, indicando que os microrganismos não influenciaram o crescimento das mudas, independente do tipo de encapsulamento (em argila ou alginato de sódio), durante 90 dias de cultivo. Spassin et al. (2016) relataram que isolados bacterianos podem apresentar efeitos benéficos ou não em relação à sobrevivência e ao enraizamento de Eucalyptus dunnii (Myrtaceae), o que levanta a hipótese de que o estabelecimento dos microrganismos promotores de crescimento e sua associação à espécie vegetal podem variar de acordo com a espécie em questão, manejo e, possivelmente, quanto ao local de estudo. Por outro lado, Salla et al. (2014) concluíram que a utilização de MPCP (rizobactérias Streptomyces PM9) resultou na maior produção de ácido indolacético e um melhor potencial para indução de raízes, bem como nos níveis de compostos fenólicos e flavonóides envolvidos no mecanismo de defesa de plantas de E. grandis e E. globulus. Estes autores relataram ainda que houve alteração no metabolismo secundário, sugerindo resposta sistêmica induzida, indicando seu potencial uso como controle biológico na silvicultura. Ao se fazer o desdobramento da variável altura para a espécie caimito, foi observado que o encapsulamento com argila foi superior ao com alginato de sódio, pois este não diferiu estatisticamente do controle (Tabela 2). Foi observado também menor crescimento das mudas não tratadas (controle) quando comparadas aos demais tratamentos (Tabela 2), sugerindo que o uso dos microrganismos promoveu o desenvolvimento das mudas de caimito. Assim, pode-se inferir que as associações de comunidades bacterianas associadas à rizosfera de espécies frutíferas são hospedeiras dependentes do táxon, ou seja, da espécie em si, como concluíram Lambais et al. (2014), que ao estudar a rizosfera de espécies arbóreas da mata atlântica, mostraram que as comunidades bacterianas associadas às árvores foram específicas aos hospedeiros das plantas. Em relação ao diâmetro do caule, foi observado efeito significativo (p<0,01) para as mudas de M. dubia (Kunth) Mc Vaugh (camu-camu). Para essa espécie, o diâmetro do caule foi maior quando não se utilizou os microrganismos promotores de crescimento, sejam eles encapsulados ou não (Tabela 3). Isto pode ocorrer quando os microrganismos utilizados apresentam alguma incompatibilidade com a 30 microbiota nativa associada à rizosfera da planta, o que vai gerar competição entre eles, alterando os efeitos positivos do microrganismo-alvo e, consequentemente, um não desenvolvimento adequado para as mudas. Outra possível causa desse resultado se refere à colonização radicular variável, por problemas de sobrevivência do inóculo ou por condições desfavoráveis para os microrganismos, pois se estes não puderem colonizar a rizosfera, não terão como interagir com a planta (FREITAS, 2007). Entretanto, para as espécies C. cainito L. (caimito) e L. chinensis Sonn. (lichia) ocorreu o contrário, ou seja, em ambas foi observado maior diâmetro do caule quando as mudas foram inoculadas com os microrganismos (Tabela 3). Esse resultado reafirma o observado para a variável altura de plantas, que as alterações no crescimento das plantas podem estar relacionadas com a interação entre os microrganismos e a rizosfera. Uma possível explicação para este fato é que os micro-organismos do solo encontrados na zona da raiz afetam o crescimento e desenvolvimento vegetal, mas o potencial para aproveitar esses benefícios depende da abundância e diversidade dos indivíduos que influenciam os efeitos benéficos para a planta (PANKE-BUISSE et al., 2015). Além disso, a mesma espécie vegetal pode estimular comunidades microbianas diversas entre um local e outro, o que leva a respostas diferentes à inoculação de um mesmo isolado promotor de crescimento (CHANWAY et al., 2000). Adicionalmente, pode-se considerar que a variabilidade genética nas mudas propagadas por semente possa ser um fator de diferenciação do crescimento das plantas (HARTMANN et al., 2010). As mudas de lichieira apresentaram aumento significativo (p<0,05) no teor de massa seca (MS) da parte aérea das plantas com a presença dos microrganismos, independente se estavam encapsuladas ou não (Tabela 4). Esse resultado sugere que pode ter ocorrido uma associação com a rizosfera das mudas de lichia, que promoveu melhor estabelecimento dos microrganismos e, consequentemente, levou a um maior diâmetro de caule, possivelmente em função do teor mais elevado de MS. A massa seca da raiz foi significativamente diferente apenas nas mudas de caimito tratadas com os microrganismos promotores de crescimento (Tabela 5). 31 Nessa espécie, o acúmulo de MS da raiz foi maior quando o substrato foi inoculado com os microrganismos, independente do tipo de encapsulante utilizado. Silva et al. (2006), ao avaliarem onze isolados dos gêneros Acremonium (GFR6 e GRR1), Colletotrichum (GFR4 e PFR4), Phomopsis (PFR3 e GCR4), Cylindrocladium (GRR4), Chaetomium (GRR7) e Fusarium (GRR5, PRR1 e PRR6) relataram efeitos desses microrganismos nos parâmetros de crescimento de mudas de pinha (Annona squamosa L.) e graviola (Annona muricata L.), sendo observado aumento na massa seca da parte aérea de mudas de pinha entre 23,2 a 32,7%, porém nenhum isolado afetou a massa seca da raiz, semelhante ao observado neste estudo. Estes mesmos autores relataram que 20 isolados apresentaram efeito negativo sobre a massa seca das raízes das mudas de pinha, e observaram que em tecidos aparentemente sadios de pinha e graviola foram encontrados alguns fungos que poderiam promover o crescimento da parte aérea, mas também alguns que poderiam reduzir o crescimento da raiz e outros que não afetariam o crescimento das mudas de pinha. Outra observação interessante é que os isolados que promoveram o crescimento das mudas de pinha foram provenientes da graviola, evidenciando que isolados de um hospedeiro podem facilmente colonizar hospedeiros de espécies diferentes, até mesmo com maior intensidade (SILVA et al., 2006). Estas características podem estar associadas à eficiência de colonização da raiz pelos microrganismos, já que a exsudação de diferentes compostos atrai diferentes populações microbianas (SOUZA et al., 2015). 4. CONCLUSÃO Microrganismos promotores do crescimento de plantas (MPCP), independente do encapsulamento utilizado, promovem maior crescimento das mudas de caimito (altura, diâmetro do caule e massa seca de raiz) e de lichia (diâmetro do caule e massa seca da planta). 32 5. REFERÊNCIAS BARBOSA, J. C.; MALDONADO JÚNIOR, W. Software AgroEstat: Sistema de análises estatísticas de ensaios agronômicos. Jaboticabal, Universidade Estadual Paulista, 2009. BARKA, E. 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Fonte: Estação Agroclimatológica – FCAV/UNESP - Jaboticabal. 39 Tabela 1 - Altura de mudas de jabuticaba, cabeludinha, camu-camu, grumixama (Myrtaceae); caqui (Ebenaceae); bacupari (Clusiaceae); graviola, pindaíba (Annonaceae); caimito (Sapotaceae); caju (Anacardiaceae); nêspera (Rosaceae) e lichia (Sapindaceae), 90 dias após a inoculação com microrganismos promotores de crescimento em dois métodos de encapsulação. Tratamentos Jabuticaba Cabeludinha Camucamu Grumixama Caqui Bacupari Graviola Pindaíba Caimito Caju Nêspera Lichia Encapsulamento (A) ALTURA (cm) Controle 33,91 a 24,83 a 46,50 a 12,66 a 56,16 a 31,16 a 59,16 a 9,66 a 75,08 a 47,00 a 41,66 a 62,50 a Argila 34,91 a 24,83 a 38,16 a 11,00 a 59,75 a 41,91 a 58,16 a 8,08 a 77,66 a 43,83 a 40,16 a 44,33 a Alginato de sódio 41,33 a 26,16 a 41,75 a 11,83 a 57,66 a 37,16 a 60,83 a 7,83 a 54,33 b 48,16 a 43,08 a 49,83 a Inóculo (B) ALTURA (cm) Com inóculo 36,77 a 24,66 a 38,72 a 11,44 a 56,44 a 41,00 a 57,33 a 8,88 a 68,50 a 44,44 a 44,94 a 55,22 a Sem inóculo 36,66 a 25,88 a 45,55 a 12,22 a 59,27 a 42,05 a 61,44 a 8,16 a 69,55 a 48,44 a 38,33 a 52,55 a CV (%) 22,29 18,57 26,63 21,52 20,19 31,02 15,26 27,67 15,08 15,31 18,88 20,37 Test F Encapsulamento (A) 1,45 ns 0,16 ns 0,83 ns 0,64 ns 0,14 ns 0,63 ns 0,13 ns 1,06 ns 9,06 ** 0,60 ns 0,21 ns 2,77 ns Inóculo (B) 0,00 ns 0,30 ns 1,67 ns 0,42 ns 0,26 ns 0,02 ns 0,93 ns 0,42 ns 0,05 ns 1,28 ns 3,18 ns 0,27 ns A x B 0,01 ns 0,16 ns 0,42 ns 0,32 ns 0,00 ns 0,26 ns 0,56 ns 1,18 ns 8,70 ** 1,17 ns 0,79 ns 0,05 ns Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, sendo * significativo a 5% de probabilidade, ** significativo a 1% de probabilidade e ns não significativo. 40 Tabela 2 - Desdobramento para a variável altura das mudas (cm) de caimito (Chrysophyllum cainito L.), 90 dias após a inoculação com microrganismos promotores de crescimento em função da encapsulação. Encapsulamento Inóculo Ausência Presença Altura de plantas (cm) Controle 65,33 aB 84,83 aA Argila 74,50 aA 80,83 aA Alginato de sódio 68,83 aA 39,83 bA Médias seguidas por mesma letra minúscula nas colunas e maiúscula na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05). 41 Tabela 3 – Diâmetro do caule (DIAM) de mudas de jabuticaba, cabeludinha, camu-camu, grumixama (Myrtaceae); caqui (Ebenaceae); bacupari (Clusiaceae); graviola, pindaíba (Annonaceae); caimito (Sapotaceae); caju (Anacardiaceae); nêspera (Rosaceae) e lichia (Sapindaceae), 90 dias após a inoculação com microrganismos promotores de crescimento em dois métodos de encapsulação. Tratamentos Jabuticaba Cabeludinha Camucamu Grumixama Caqui Bacupari Graviola Pindaíba Caimito Caju Nêspera Lichia Encapsulamento (A) DIAM (mm) Controle 7,12 a 2,90 a 3,83 a 2,13 a 6,85 a 6,65 a 9,61 a 2,58 a 9,21 a 7,76 a 4,22 a 9,37 a Argila 7,00 a 2,93 a 3,60 a 2,02 a 5,93 a 6,24 a 8,69 a 2,18 a 9,07 a 6,98 a 3,54 a 8,68 a Alginato de sódio 7,22 a 2,50 a 3,50 a 1,96 a 7,43 a 7,07 a 8,51 a 2,31 a 7,31 a 7,77 a 4,05 a 8,31 a Inóculo (B) DIAM (mm) Com inóculo 7,14 a 2,84 a 3,32 b 2,07 a 6,77 a 6,31 a 9,00 a 2,37 a 9,27 a 7,24 a 3,92 a 9,64 a Sem inóculo 7, 10 a 2,71 a 3,97 a 2,00 a 6,70 a 6,99 a 8,87 a 2,35 a 7,79 b 7,77 a 3,93 a 7,93 b CV (%) 11,69 19,19 12,14 17,43 15,23 36,12 10,59 22,49 16,68 14,28 16,32 17,82 Test F Encapsulamento (A) 0,11 ns 1,25 ns 0,84 ns 0,35 ns 3,24 ns 0,18 ns 2,33 ns 0,89 ns 3,33 ns 1,08 ns 1,83 ns 0,71 ns Inóculo (B) 0,01 ns 0,28 ns 9,55 ** 0,19 ns 0,02 ns 0,36 ns 0,08 ns 0,00 ns 4,89 * 1,10 ns 0,00 ns 5,38 * A x B 2,02 ns 0,50 ns 0,11 ns 0,35 ns 1,05 ns 0,21 ns 2,85 ns 0,94 ns 0,30 ns 0,90 ns 0,22 ns 0,16 ns Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, sendo * significativo a 5% de probabilidade, ** significativo a 1% de probabilidade e ns não significativo. 42 Tabela 4 – Massa seca da parte aérea (MSPA) de mudas de jabuticaba, cabeludinha, camu-camu, grumixama (Myrtaceae); caqui (Ebenaceae); bacupari (Clusiaceae); graviola, pindaíba (Annonaceae); caimito (Sapotaceae); caju (Anacardiaceae); nêspera (Rosaceae) e lichia (Sapindaceae), 90 dias após a inoculação com microrganismos promotores de crescimento em dois métodos de encapsulação. Tratamentos Jabuticaba Cabeludinha Camucamu Grumixama Caqui Bacupari Graviola Pindaíba Caimito Caju Nêspera Lichia Encapsulamento (A) MSPA (g) Controle 9,79 a 4,83 a 6,34 a 4,40 a 12,04 a 21,18 a 11,92 a 4,89 a 33,52 a 12,04 a 15,42 a 10,86 a Argila 9,26 a 5,14 a 4,61 a 4,62 a 11,49 a 18,16 a 12,19 a 4,62 a 34,60 a 11,49 a 12,05 a 11,59 a Alginato de sódio 12,35 a 6,66 a 4,59 a 4,89 a 10,47 a 22,21 a 14,23 a 4,89 a 23,95 a 10,12 a 13,36 a 11,69 a Inóculo (B) MSPA (g) Com inóculo 10,35 a 5,14 a 4,60 a 4,67 a 11,70 a 16,97 a 11,53 a 4,71 a 35,51 a 11,46 a 14,85 a 12,22 a Sem inóculo 10,58 a 5,95 a 5,76 a 4,60 a 10,97 a 24,97 a 14,04 a 4,89 a 25,88 a 10,97 a 12,38 a 10,54 b CV (%) 32,50 29,17 31,91 9,46 15,81 75,66 28,17 10,25 40,53 16,17 30,25 13,80 Test F Encapsulamento (A) 1,41 ns 0,21 ns 2,21 ns 1,86 ns 1,18 ns 0,11 ns 0,74 ns 0,61 ns 1,33 ns 1,79 ns 1,02 ns 0,50 ns Inóculo (B) 0,02 ns 1,12 ns 2,19 ns 0,13 ns 0,74 ns 0,94 ns 2,17 ns 0,56 ns 2,70 ns 0,33 ns 1,62 ns 5,15 * A x B 0,30 ns 0,74 ns 0,32 ns 0,67 ns 0,17 ns 0,50 ns 3,37 ns 1,06 ns 0,70 ns 0,46 ns 1,64 ns 0,88 ns Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, sendo * significativo a 5% de probabilidade, ** significativo a 1% de probabilidade e ns não significativo. 43 Tabela 5 – Massa seca da raiz (MSR) de mudas de jabuticaba, cabeludinha, camu-camu, grumixama (Myrtaceae); caqui (Ebenaceae); bacupari (Clusiaceae); graviola, pindaíba (Annonaceae); caimito (Sapotaceae); caju (Anacardiaceae); nêspera (Rosaceae) e lichia (Sapindaceae), 90 dias após a inoculação com microrganismos promotores de crescimento em dois métodos de encapsulação. Tratamentos Jabuticaba Cabeludinha Camucamu Grumixama Caqui Bacupari Graviola Pindaíba Caimito Caju Nêspera Lichia Encapsulamento (A) MSR (g) Controle 6,03 a 1,26 a 2,97 a 1,31 a 5,85 a 7,02 a 8,18 a 1,18 a 10,54 a 1,97 a 3,17 a 3,33 a Argila 5,25 a 1,33 a 2,09 a 1,25 a 5,82 a 5,53 a 6,82 a 1,23 a 11,09 a 1,95 a 2,47 a 3,62 a Alginato de sódio 7,28 a 1,86 a 1,74 a 1,08 a 5,77 a 6,57 a 5,95 a 1,01 a 6,85 a 2,02 a 2,49 a 3,16 a Inóculo (B) MSR (g) Com inóculo 5,97 a 1,44 a 2,01 a 1,25 a 5,91 a 6,07 a 6,98 a 1,11 a 11,76 a 1,92 a 2,79 a 3,74 a Sem inóculo 6,41 a 1,53 a 2,40 a 1,18 a 5,72 a 6,68 a 6,99 a 1,17 a 7,22 b 2,04 a 2,63 a 2,99 a CV (%) 23,26 39,65 32,86 16,24 7,98 68,71 49,33 15,15 43,31 19,80 54,63 26,43 Test F Encapsulamento (A) 3,03 ns 1,86 ns 3,26 ns 2,03 ns 0,04 ns 0,18 ns 0,64 ns 2,69 ns 1,89 ns 0,05 ns 0,43 ns 0,40 ns Inóculo (B) 0,42 ns 0,11 ns 1,29 ns 0,58 ns 0,78 ns 0,09 ns 0,00 ns 0,64 ns 5,50 * 0,38 ns 0,05 ns 3,17 ns A x B 0,62 ns 0,85 ns 0,33 ns 1,22 ns 0,84 ns 0,21 ns 2,59 ns 0,57 ns 0,47 ns 0,63 ns 1,95 ns 1,01 ns Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey, sendo * significativo a 5% de probabilidade, ** significativo a 1% de probabilidade e ns não significativo. 44 CAPÍTULO 3 – Parâmetros microbiológicos em substrato de mudas frutíferas inoculado com microrganismos encapsulados RESUMO – O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da inoculação de microrganismos promotores do crescimento de plantas sobre o carbono da biomassa microbiana, nitrogênio e fósforo do solo e estimar a atividade microbiana em substrato utilizado para o crescimento de mudas frutíferas. O inóculo microbiano continha as seguintes espécies: Azospirillum brasilense, Burkolderia cepacia, Bacillus thuringienses, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis, Tricoderma spp. e Isolado 411. As espécies frutíferas avaliadas foram: Myrciaria glazioviana (Kiaersk.) G. Barros & Sobral (cabeludinha); Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh (camu-camu); Annona muricata L. (graviola); Chrysophyllum cainito L. (caimito); e Litchi chinensis Sonn. (lichia). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado (DIC), em esquema fatorial 3 (controle, alginato de sódio e argila) x 2 (presença e ausência de inóculo microbiano) com cinco repetições (uma muda por repetição), durante 90 dias. Ao final deste período, foram avaliados os seguintes parâmetros nas amostras do solo: atividade enzimática da desidrogenase (AED), determinação do amônio (NH4 +) e nitrato (NO3 -), fosfato solúvel em bicarbonato (FSB), carbono da biomassa microbiana (CBM) e número total de bactérias (UFC). A atividade microbiana no substrato não foi influenciada pela adição de microrganismos encapsulados. Os agentes encapsulantes argila e alginato de sódio, com ou sem inóculo microbiano, podem modificar a atividade enzimática da desidrogenase, o nitrogênio e o carbono da biomassa microbiana no solo, porém são dependentes da espécie frutífera cultivada. Palavras-chave: Propagação de frutíferas, encapsulamento, inóculo microbiano, bactérias promotoras do crescimento de plantas, desidrogenase, biomassa, carbono. ABSTRACT – The objective of this study was to evaluate the effect of the inoculation of the encapsulated plant growth promoter microorganisms on microbial biomass carbon, soil nitrogen and phosphorus and to estimate the microbial activity in the substrate used for seedlings of fruit species. The microbial inoculums contained the 45 species: Azospirillum brasilense, Burkolderia cepacia, Bacillus thuringienses, B. megaterium, B. cereus, B. subtilis, Tricoderma spp. and Isolado 411. The fruit species evaluated were: Myrciaria glazioviana (Kiaersk.) G. Barros & Sobral; Myrciaria dubia (Kunth) Mc Vaugh; Annona muricata L.; Chrysophyllum cainito L.; and Litchi chinensis Sonn. The experimental design was completely randomized in a factorial scheme 3 (control, sodium alginate and clay) x 2 (presence and absence of microbial inoculum) with five replicates (one seedling per replicate), for ninety days. At the end of this period, the following parameters were evaluated in the soil samples: enzymatic activity of dehydrogenase (AED), determination of ammonium (NH4 +) and nitrate (NO3 -), bicarbonate soluble phosphate (FSB), carbon of the microbial biomass (CBM) and total number of bacteria (UFC). Microbial activity in the substrate was not influenced by the addition of encapsulated microorganisms. The clay and sodium alginate encapsulating agents, with or without microbial inoculum, can modify the enzymatic activity of the dehydrogenase, the nitrogen and the carbon of the microbial biomass in the soil, but are dependent on the cultivated fruit species. Keywords: Fruit propagation, encapsulation, microbial inoculum, plant growth promoting bacteria dehydrogenase, biomass, carbon. 1. INTRODUÇÃO A qualidade do substrato é um dos principais fatores que garantem o sucesso da produção de mudas de espécies frutíferas. Um substrato adequado deve ser denso e firme, altamente decomposto e estável, suficientemente poroso para drenar o excesso de água, ser livre de pragas e doenças, apresentar baixa salinidade, ser capaz de ser pasteurizado ou tratado quimicamente, ter alta capacidade de troca de cátions (CTC), reter nutrientes e ser de fácil disponibilidade (HARTMANN et al., 2010). Além destes aspectos, a presença de microrganismos benéficos às espécies a serem propagadas também pode ser vantajosa, pois existe uma grande diversidade de microrganismos que participam de processos biológicos, bioquímicos e biogeoquímicos responsáveis pela formação e manutenção da estrutura física e da 46 fertilidade do solo. Muitos destes microrganismos desempenham funções nas interações com plantas, tais como: fixação de nitrogênio, solubilização de fosfato e micorrização, além de atuarem na ação antagônica aos patógenos e na produção de substâncias promotoras ou inibidoras do crescimento das plantas, contribuindo, dessa forma, para a fertilidade do solo e nutrição das plantas (ANDREOLA; FERNANDES, 2007). Os microrganismos são responsáveis pelos processos de mineralização, representando eles próprios uma quantidade considerável de nutrientes potencialmente disponíveis para as plantas (HAYAT et al., 2010). Consequentemente, os processos mais importantes no solo que afetam a biodisponibilidade de nutrientes são regulados pela microbiota (FRIGHETTO; VALARINI, 2000). A encapsulação é considerada uma técnica importante para a manutenção da estabilidade dos microrganismos e possibilita aumentar a resistência das bactérias às condições do substrato, podendo ser um meio utilizado para a inoculação de microrganismos. Dentre os muitos tipos de materiais encapsulantes, o alginato de cálcio e de sódio, bem como as proteínas do soro do leite e as gomas tem sido os mais utilizados (SCHOEBITZ et al., 2013; VEMMER; PATEL, 2013). A argil