UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (MICROBIOLOGIA APLICADA) DESTOXIFICAÇÃO E DESCOLORAÇÃO DE EFLUENTE TÊXTIL SINTÉTICO POR MICRO-ORGANISMOS ASSOCIADOS A AMBIENTES MARINHOS ELISA PAIS PELLIZZER Rio Claro - SP Janeiro – 2019 unesp PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (MICROBIOLOGIA APLICADA) DESTOXIFICAÇÃO E DESCOLORAÇÃO DE EFLUENTE TÊXTIL SINTÉTICO POR MICRO-ORGANISMOS ASSOCIADOS A AMBIENTES MARINHOS Elisa Pais Pellizzer Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Rio Claro, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas (Microbiologia Aplicada). Orientadora: Lara Durães Sette Co-orientadora: Patricia Giovanella Grazziotin Rio Claro - SP Janeiro – 2019 P391d Pellizzer, Elisa Pais Destoxificação e descoloração de efluente têxtil sintético por micro-organismos associados a ambientes marinhos / Elisa Pais Pellizzer. -- Rio Claro, 2019 89 f. : il., tabs. Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Biociências, Rio Claro Orientadora: Lara Durães Sette Coorientadora: Patricia Giovanella Grazziotin 1. Microbiologia industrial. 2. Biorremediação. 3. Corantes e tingimento. 4. Poluentes. 5. Fungos Biotecnologia. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Biociências, Rio Claro. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. AGRADECIMENTOS Sou grata a Deus pela vida, pela natureza, pela saúde, pelas oportunidades de crescimento e por ter tantas pessoas queridas em minha vida. Agradeço aos meus pais, Lino e Gabriella, pelo amor incondicional doado através de tantas atitudes. À minha querida tia Nene, pelo exemplo de coragem e força. Aos meus irmãos, cunhadas, sobrinhos e tios, obrigada pelo afeto e alegria que vocês transmitem. Gratidão por ter uma família como essa. Ao meu amigo e namorado Iago, pelo companheirismo, paciência e cuidado. Obrigado por ser quem é e por fazer tanto por mim sem nem se dar conta. Agradeço a professora Lara, por acreditar no meu potencial, dar todo o suporte necessário para pesquisa e pela oportunidade única em coletar amostras na Antártica. Meu muito obrigada a Paty, por toda ajuda desde compartilhar métodos, discutir resultados, pensar como uma cientista até os rolês mais divertidos. A todos os integrantes do LAMAI, em especial ao Igor, Ju, Bruno e Gabi. Obrigada meus amigos por tantos momentos compartilhados e toda ajuda prestada. Gratidão também a Dani pelo auxilio nos testes de toxicidade. Aos técnicos, pessoal da limpeza, secretaria e professores do departamento de bioquímica e microbiologia. Um agradecimento especial ao Dri por estar disposto a ajudar sempre que precisei, pelas críticas construtivas e pelas análises no FTIR. A todos os meus amigos, onde quer que estejam, por serem tão companheiros, verdadeiros, por acreditarem em mim e me darem forças sempre que preciso. A caminhada fica muito mais leve com vocês. A UNESP, ao CNPq e a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (processo 2016/07957-7) pelo apoio financeiro. A todos que participaram da minha caminhada até este momento o meu sincero agradecimento e a certeza que este trabalho é uma conquista de todos nós. Difficulties are just things to overcome, after all. Ernest Shackleton RESUMO Quantidades significativas de efluentes, contendo corantes, sais e pH alcalino, são produzidas diariamente pelas indústrias têxteis. Esses efluentes devem ser tratados adequadamente antes de serem descartados em corpos d’água, pois são potencialmente tóxicos a vários organismos. Neste contexto, a biorremediação utilizando fungos e bactérias tem sido uma alternativa sustentável para o tratamento destes poluentes. Aliado a isso, a utilização de micro- organismos de origem marinha apresenta vantagens, tendo em vista que esses organismos são adaptados à salinidade e alcalinidade do ambiente marinho. Assim, os objetivos deste trabalho foram avaliar o potencial de micro-organismos associados a ambientes marinhos na destoxificação e descoloração de Efluente Têxtil Sintético (ETS) e otimizar o processo. Para tanto, foram estruturados diversos experimentos com os seguintes micro-organismos: os fungos Tinctosporellus sp. CBMAI 1061, Marasmiellus sp. CBMAI 1062, Peniophora sp. CBMAI 1063, o isolado LAMAI 659 e as bactérias Bacillus subtilis CBMAI 707 e Dietzia maris CBMAI 705. Em adição, foi preparado um efluente têxtil sintético utilizando NaCl 30 g L-1 e os corantes Azul Índigo, Marinho Reativo e Preto Sulfuroso em diversas concentrações. Os experimentos foram analisados quanto à biomassa seca formada, atividade de enzimas ligninolíticas, pH, descoloração, adsorção e toxicidade utilizando os bioindicadores Artemia sp., A. fischeri e C. sativus. O planejamento experimental foi aplicado para otimização dos processos de destoxificação e descoloração. Além disso, foram feitas duas validações para confirmação dos resultados dos planejamentos e analisados os espectros dos tratamentos em UV-Vis e FTIR. Os resultados mostraram que o consórcio formado por Marasmiellus sp., B. subtilis e D. maris foi o mais adequado no biotratamento do ETS. Os planejamentos experimentais utilizando este consórcio elevaram as taxas de descoloração de 41,22% (200 mg L-1 de cada corante) a 71,39% (300 mg L-1 de cada corante) e também de destoxificação (EC50 de 12,16% a 27,56%), nas mesmas concentrações de corantes (200 mg L-1 de cada corante). Os experimentos de validação confirmaram os resultados, que poderiam ser considerados válidos, nos planejamentos experimentais e evidenciaram a necessidade de validação após cada planejamento realizado. Além disso, as análises de UV-Vis e FTIR permitiram a inferência de processos de adsorção e a biotransformação dos corantes têxteis estudados. Os resultados do presente trabalho demostram a capacidade do fungo Marasmiellus sp., em consórcio com as bactérias B. subtilis e D. maris, nos processos de destoxificação e descoloração de ETS, mesmo em altas concentrações de corantes. Além disso, os resultados evidenciam a relevância do estudo de micro-organismos derivados de ambientes marinhos em processos de biorremediação. Palavras-chave: Corantes têxteis, Biotecnologia ambiental, Toxicidade aguda, Biorremediação. ABSTRACT Significant amounts of effluent containing dyes, salts and alkaline pH are produced daily by the textile industries. These effluents must be properly treated before being disposed in water bodies, as they are potentially toxic to various organisms. In this context, bioremediation using fungi and bacteria has been a sustainable alternative for the treatment of these pollutants. In addition, the use of microorganisms of marine origin has advantages, since these organisms are adapted to the salinity and alkalinity of the marine environment. Thus, the aims of this work were to evaluate the potential of microorganisms associated to the marine environments in the detoxification and discoloration of Synthetic Textile Effluent (STE) and to optimize the process. For this, several experiments were structured with the following microorganisms: the fungi Tinctosporellus sp. CBMAI 1061, Marasmiellus sp. CBMAI 1062, Peniophora sp. CBMAI 1063, the isolate LAMAI 659, the bacteria Bacillus subtilis CBMAI 707 and Dietzia maris CBMAI 705. In addition, a STE was prepared using NaCl 30 g L-1 and the dyes Indigo blue, Reactive Blue and Sulfur Black at various concentrations. The experiments were analyzed for dried biomass, ligninolytic enzymes activities, pH, discoloration, adsorption and toxicity using the bioindicators Artemia sp., A. fischeri and C. sativus. The experimental design was applied to optimize detoxification and discoloration processes. In addition, two validations were made to confirm the results of the experimental design and the spectra of the UV-Vis and FTIR treatments were analyzed. The results showed that the consortium formed by Marasmiellus sp., B. subtilis and D. maris was the most suitable in the biotreatment of STE. The experimental design using this consortium increased the discoloration rates from 41.22% (200 mg L-1 of each dye) to 71.39% (300 mg L-1 of each dye) and the detoxification rates as well (EC50 from 12.16% to 27.56%), in the same concentration of dyes (200 mg L-1 of each dye). The validation experiments confirmed the results that could be considered valid in the experimental design and evidenced the need for validation after each planning. In addition, the UV-Vis and FTIR analyzes allowed the inference of adsorption processes and the biotransformation of the studied textile dyes. Results from the present work demonstrate the ability of the fungus Marasmiellus sp., in consortium with the bacteria B. subtilis and D. maris, in the processes of detoxification and discoloration of STE, even in high concentrations of dyes. In addition, the results highlight the relevance of the study of microorganisms derived from marine environments in bioremediation processes. Key-words: Textile dyes, Environmental biotechnology. Acute toxicity, Bioremediation. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química do Azul Índigo. ............................................................................ 21 Figura 2. Reactive Blue 4. ........................................................................................................ 22 Figura 3. Hipótese da estrutura química do preto sulfuroso. .................................................... 22 Figura 4. Oxidação de estruturas fenólicas pelas enzimas manganês peroxidase, lignina peroxidase, lacase ou um mediador redox. ............................................................................... 27 Figura 5. Catabolismo microbiano de hidrocarbonetos envolvendo as enzimas citocromo P- 450 mono-oxigenase, lacase, LiP e MnP. ................................................................................. 28 Figura 6. Degradação de benzeno via monooxigenase e dioxigenase. ..................................... 29 Figura 7. Medidas de biomassa seca dos bioensaios utilizando o isolado LAMAI 659 e Peniophora sp., após 7 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm, na presença e ausência dos efluentes A (50 mg L-1 de cada corante), B (100 mg L-1 de cada corante) e C (200 mg L-1 de cada corante). .................................................................................................................................... 44 Figura 8. Análise de toxicidade em Artemia sp. (percentual de indivíduos vivos) submetida a diferentes concentrações do efluente, com proporções iguais dos corantes. O pH foi ajustado para 8,0 com a utilização de hidróxido de sódio, em todas as amostras. ................................. 46 Figura 9. Medidas de biomassa seca após bioensaio utilizando os fungos LAMAI 659, Tinctosporellus sp., Peniophora sp. e Marasmiellus sp., após 7 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm, na presença do ETS (200 mg L-1 de cada corante)........................................................... 47 Figura 10. Medidas de biomassa seca dos bioensaios utilizando consórcios microbianos formados pela(s) bactéria(s) (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) por mais 7 dias, na presença do ETS (200 mg L-1 de cada corante). Além do experimento contendo apenas as bactérias (9 dias). Os cultivos foram realizados a 28ºC e 140 rpm. .................................................................................................................................... 49 Figura 11. Medidas de biomassa seca após bioensaio com ETS (200 mg L-1 de cada corante) utilizando consórcios microbianos em duas estratégias diferentes. Além do bioensaio utilizando apenas Marasmiellus sp. após 9 dias de cultivo de cultivo a 28ºC e 140 rpm. ....... 51 Figura 12. Diagrama de Pareto com o efeito estimado das onze variáveis na descoloração do ETS obtidos no planejamento experimental PB1. .................................................................... 54 Figura 13. Diagrama de Pareto com o efeito estimado das onze variáveis na destoxificação do ETS obtidos no planejamento experimental PB1. .................................................................... 55 Figura 14. Diagrama de Pareto com o efeito estimado das onze variáveis na descoloração do ETS obtidos no planejamento experimental PB2. .................................................................... 57 Figura 15. Diagrama de Pareto com o efeito estimado das onze variáveis na destoxificação do ETS obtidos no planejamento experimental PB2. .................................................................... 57 Figura 16. Diagrama de Pareto com o efeito estimado das duas variáveis na descoloração do ETS obtidos no DCCR. ............................................................................................................ 60 Figura 17. Diagrama de Pareto com o efeito estimado das duas variáveis na destoxificação do ETS obtidos no DCCR. ............................................................................................................ 60 Figura 18. Medidas de biomassa seca após ensaios 2 (PB2) e 8 (DCCR) com ETS (200 mg L-1 utilizando as bactérias (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) durante 3, 5, 7 e 9 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. ................................ 61 Figura 19. Porcentagem de descoloração após ensaios 2 (PB2) e 8 (DCCR) com ETS (200 mg L-1 utilizando as bactérias (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) durante 3, 5, 7 e 9 dias. .............................................................................. 63 Figura 20. Porcentagem de descoloração do micélio inativo e vivo após ensaios 2 (PB2) e 8 (DCCR) com ETS (200 mg L-1 de cada corante) e utilizando o consórcio microbiano durante 7 dias. ........................................................................................................................................ 64 Figura 21. Medidas de inibição de crescimento radicular de C. sativus após os ensaios 2(PB2) e 8 (DCCR) com ETS (200 mg L-1) utilizando as bactérias (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) durante 3, 5, 7 e 9 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. Além do controle contendo as mesmas condições de cultivo, porém sem o consórcio. .................................................................................................................................. 65 Figura 22. Concentração efetiva (EC50), após 15 minutos de exposição nas amostras contendo ETS (200 mg L-1 de cada corante) antes e após bioensaio utilizando as bactérias (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) por mais 7 e 9 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. ......................................................................................................... 66 Figura 23. Medidas de biomassa seca após bioensaios em diferentes condições utilizando as bactérias (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) durante 7 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. ............................................................................. 68 Figura 24. Porcentagem de descoloração após bioensaios com ETS em diferentes condições utilizando as bactérias (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) durante 7 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. .............................................. 69 Figura 25. Concentração efetiva (EC50), após 15 minutos de exposição das amostras contendo ETS antes e após bioensaios em diferentes condições utilizando as bactérias (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) por mais 7 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. ........................................................................................................................ 71 Figura 26. Espectro UV-Vis após Ensaio 4 (PB1) utilizando o fungo (Marasmiellus sp.) durante 7 dias, seguido pelas bactérias (B. subtilis e D. maris) por mais dois dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. Além do controle sob as mesmas condições, mas sem o consórcio. ............. 72 Figura 27. Espectro UV-Vis após Ensaio 7 (PB2) utilizando o fungo (Marasmiellus sp.) durante 7 dias, seguido pelas bactérias (B. subtilis e D. maris) por mais dois dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. Além do controle sob as mesmas condições, mas sem o consórcio. ............. 73 Figura 28. Espectro de FTIR após Ensaio 7 (PB2) utilizando o fungo (Marasmiellus sp.) durante 7 dias, seguido pelas bactérias (B. subtilis e D. maris) por mais dois dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. Além do controle sob as mesmas condições, mas sem o consórcio. ............. 74 Figura 29. Espectro UV-Vis após Ensaio 12 (PB1) utilizando o fungo (Marasmiellus sp.) durante 7 dias, seguido pelas bactérias (B. subtilis e D. maris) por mais dois dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. Além do controle sob as mesmas condições, mas sem o consórcio. ............. 75 Figura 30. Espectro de FTIR após Ensaio 12 (PB1) utilizando o fungo (Marasmiellus sp.) durante 7 dias, seguido pelas bactérias (B. subtilis e D. maris) por mais dois dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. Além do controle sob as mesmas condições, mas sem o consórcio. ............. 76 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Fungos e bactérias isoladas de ambientes marinhos: descrição de suas propriedades e fontes de isolamento. ............................................................................................................. 25 Tabela 2. Efluentes Têxteis Sintéticos (ETS) preparados com diferentes concentrações de corantes. .................................................................................................................................... 34 Tabela 3. Variáveis utilizadas no planejamento experimental 1 (PB16) e as concentrações de cada uma. .................................................................................................................................. 40 Tabela 4. Variáveis utilizadas no planejamento experimental 2 (PB12) e as concentrações de cada uma. .................................................................................................................................. 41 Tabela 5. Níveis das variáveis estudadas no DCCR. ................................................................ 41 Tabela 6. Análise de toxicidade aguda em Artemia sp. (percentual de sobrevivência) e registro do pH dos ETS A (50 mg L-1 de cada corante), B (100 mg L-1 de cada corante) e C (200 mg L- 1 de cada corante) antes e após o bioensaio com os isolados LAMAI 659 e Peniophora sp. cultivados por 7 dias a 28 ºC e 140 rpm. .................................................................................. 45 Tabela 7. Concentração efetiva (EC50) de A. fischeri, após 30 min de exposição utilizando as amostras contendo ETS (200 mg L-1 de cada corante), antes e após bioensaio com os fungos LAMAI 659, Tinctosporellus sp., Peniophora sp. e Marasmiellus sp. .................................... 48 Tabela 8. Concentração efetiva (EC50), após 30 minutos de exposição no equipamento Microtox®, das amostras contendo ETS (200 mg L-1 de cada corante) antes e após bioensaio utilizando a(s) bactéria(s) (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) por mais 7 dias, além do experimento contendo apenas as bactérias (9 dias). Os cultivos foram realizados a 28ºC e 140 rpm. ............................................................. 49 Tabela 9. Descoloração e destoxificação (inibição do crescimento das sementes de C. sativus) do ETS (200 mg L-1 de cada corante) utilizando consórcios microbianos e duas estratégias diferentes. Além do controle contendo o ETS (200 mg L-1 de cada corante) antes do bioensaio e do bioensaio utilizando apenas Marasmiellus sp. após 9 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. 52 Tabela 10. Descoloração e destoxificação do ETS utilizando planejamento experimental PB1. O pH foi medido ao término do experimento. Os ensaios de 17 a 19 são os pontos centrais, utilizados como controles. Os cultivos foram realizados a 28ºC e 140 rpm. ........................... 53 Tabela 11. Descoloração e destoxificação do ETS utilizando planejamento experimental PB2. O pH foi medido ao término do experimento. Os ensaios de 13 a 15 são os pontos centrais, utilizados como controles. Os cultivos foram realizados a 28ºC e 140 rpm. ........................... 56 Tabela 12. Descoloração e destoxificação do ETS utilizando DCCR com duas variáveis. Os ensaios de 9 a 11 são os pontos centrais, utilizados como controles. Os cultivos foram realizados a 28ºC e 140 rpm. .................................................................................................... 59 Tabela 13. Medidas de inibição de crescimento radicular de C. sativus após ensaios 4 (PB1) e 7 (PB2) utilizando as bactérias (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) durante 7 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm. Além do controle contendo as mesmas condições de cultivo, porém sem o consórcio. ........................................................... 70 LISTA DE ABREVIATURAS ABIT - Associação Brasileira da Indústria Têxtil e Confecção ABTS – 2,2-azino-bis-etilbenthiazolina ANOVA – Analysis of variance ASW – Água do mar artificial ATCC - American Type Culture Collection BD – B. subtilis e D. maris CBMAI - Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Industria CNI - Confederação Nacional da Indústria CONAMA - Conselho Nacional do Meio Ambiente CPQBA - Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas CRM – Central de Recursos Microbianos UNESP/RC DCCR – Delineamento Composto Central Rotacional EC50 – Concentração efetiva EPS – Exopolissacarideos ETS – Efluente Têxtil Sintético FTIR – Fourier Transform Infrared Spectroscopy HPA – Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos LAMAI – Laboratório de Micologia Ambiental e Industrial LiP – Lignina Peroxidase M - Marasmiellus sp. MB - Marasmiellus sp. e B. subtilis MBD - Marasmiellus sp., B. subtilis e D. maris MD - Marasmiellus sp. e D. maris MnP - Manganês Peroxidase PB – Plackett-Burman U – Unidade enzimática UFC – Unidades Formadoras de Colônia USEPA – United States Environmental Protection Agency UV-Vis - Ultraviolet–visible spectroscopy ZDHC – Zero Discharge of Hazardous Chemicals SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................ 17 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 19 2.1 – Indústria têxtil .............................................................................................................. 19 2.1.1 – Corantes têxteis .................................................................................................... 20 2.1.1.1 - Azul Índigo ..................................................................................................... 21 2.1.1.2 – Marinho Reativo ............................................................................................ 21 2.1.1.3 - Preto sulfuroso ............................................................................................... 22 2.1.2 – Tratamentos de efluentes têxteis........................................................................... 22 2.2 – Biorremediação ............................................................................................................ 23 2.2.1. Bioprospecção ........................................................................................................ 23 2.2.1.1. Micro-organismos de origem marinha ............................................................ 23 2.2.1.2. Fungos ligninolíticos ....................................................................................... 25 2.2.1.3. Bactérias degradadoras .................................................................................... 28 2.3. Análise de toxicidade..................................................................................................... 29 2.3.1. Artemia sp. .............................................................................................................. 29 2.3.2. Aliivibrio fischeri – Microtox® .............................................................................. 30 2.3.3. Cucumis sativus ...................................................................................................... 30 2.4. Planejamento experimental............................................................................................ 30 3. OBJETIVO GERAL ......................................................................................................... 32 4. MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 33 4.1. Micro-organismos .......................................................................................................... 33 4.2. Cultivo dos fungos e estruturação do experimento para determinação da concentração do Efluente Têxtil Sintético (ETS) ....................................................................................... 33 4.2.1. Biomassa seca ......................................................................................................... 34 4.2.2. Teste de toxicidade com Artemia sp. ...................................................................... 35 4.3. Determinação do fungo com melhor capacidade de destoxificação .............................. 35 4.3.1. Teste de toxicidade com A. fischeri ........................................................................ 35 4.3.2. Atividade das enzimas ligninolíticas frente ao ETS ............................................... 36 4.4. Destoxificação utilizando consórcios microbianos ................................................... 37 4.5. Destoxificação e descoloração utilizando consórcios microbianos em duas estratégias diferentes .............................................................................................................................. 37 4.5.1. Teste de toxicidade com C. sativus ........................................................................ 38 4.5.2. Descoloração do ETS ............................................................................................. 38 4.5.3. Adsorção do ETS pela biomassa ............................................................................ 38 4.6. Otimização da destoxificação e descoloração do ETS .................................................. 39 4.6.1. Planejamento experimental Plackett-Burman 1 (PB1) ........................................... 39 4.6.2. Planejamento experimental Plackett-Burman 2 (PB2) ........................................... 40 4.6.3. Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) ........................................... 41 4.7. Validação experimental ................................................................................................. 42 4.7.1. Primeira validação .................................................................................................. 42 4.7.2. Segunda validação ................................................................................................. 42 4.7.3. FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) ................................................. 43 4.7.4. Análise estatística ................................................................................................... 43 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ..................................................................................... 44 5.1. Determinação da concentração do ETS ......................................................................... 44 5.2. Determinação do fungo com melhor capacidade de destoxificação .............................. 47 5.3. Destoxificação utilizando consórcios microbianos ....................................................... 48 5.4. Destoxificação e descoloração utilizando consórcios microbianos e duas estratégias diferentes .............................................................................................................................. 50 5.5. Otimização da destoxificação e descoloração do ETS .................................................. 52 5.5.1. Planejamento experimental Plackett-Burman 1 (PB1) ........................................... 52 5.5.2. Planejamento experimental Plackett-Burman 2 (PB2) ........................................... 55 5.5.3. Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) ........................................... 58 5.6. Validação experimental ................................................................................................. 61 5.6.1. Primeira validação .................................................................................................. 61 5.6.2. Segunda validação .................................................................................................. 67 6. CONCLUSÕES ................................................................................................................ 77 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................................. 78 APÊNDICES ............................................................................................................................ 87 17 1. INTRODUÇÃO A indústria têxtil produz grandes quantidades de efluentes, os quais contêm, principalmente, corantes, sais, surfactantes, compostos de cloro e sólidos suspensos. Embora todas essas substâncias sejam potencialmente tóxicas ao ambiente, os corantes são considerados os principais poluentes do ponto de vista ambiental. Isto é devido, em parte, pela capacidade dos corantes de afetar a transparência da água, mesmo em pequenas concentrações (KHANDEGAR; SAROHA, 2013). Consequentemente, os organismos fotossintetizantes dos corpos d’água não recebem a quantidade de luz adequada, sendo prejudicial à toda a cadeia trófica. Além disso, alguns corantes são tóxicos e mutagênicos podendo afetar a qualidade da água para consumo, irrigação e recreação, bem como apresentar efeitos deletérios à fauna, flora e microbiota que estão em contato com a água poluída (PRZYSTAŚ; ZABŁOCKA- GODLEWSKA; GRABIŃSKA-SOTA, 2012; HUBBE et al., 2012). Nesse contexto, o tratamento dos efluentes provenientes de indústrias têxteis é importante para a manutenção e preservação do meio receptor dos rejeitos. Dessa forma, o tratamento deve ser capaz de descolorir e destoxificar o efluente, para que não ocorram malefícios ao ambiente. Sendo assim, a biorremediação pode ser vista como uma alternativa sustentável para o tratamento de efluentes, pois age otimizando processos que já ocorrem naturalmente, buscando a mineralização dos compostos sem que haja rejeitos tóxicos como resultado. A utilização de micro-organismos de origem marinha para a destoxificação e descoloração de efluentes têxteis pode apresentar vantagens em relação aos micro-organismos isolados de outros ambientes. Isso por que, apresentam tolerância às condições de alta salinidade e alcalinidade, particularidades também encontradas neste tipo de efluente (BUNUGLI-SANTOS et al., 2015). Estudos de biorremediaçao têm reportado o sucesso na descoloração e destoxificação de apenas um corante dissolvido. Entretanto, o efluente industrial é uma mistura complexa, composta por múltiplos corantes e outras substâncias. O que faz com que estes compostos interajam quimicamente, alterando a toxicidade inicial, ou seja, podem apresentar um efeito sinérgico que aumenta a toxicidade do efluente. Portanto, a utilização de uma solução que simule um efluente têxtil real tem sido uma estratégia utilizada em diversos estudos (MACHADO et al., 2006; SAROJ et al., 2015; KURADE et al., 2017). Além disso, a utilização de efluente têxtil sintético é uma alternativa eficaz em estudos laboratoriais, pois com o conhecimento das concentrações exatas de corantes e de outros compostos no efluente 18 é possível comparar e mensurar as substâncias antes e depois da ação microbiana (bioprocesso). Considerando o que foi exposto acima, no presente trabalho foram utilizados fungos filamentosos associados ao ambiente marinho (Peniophora sp. CBMAI 1063, Tinctosporellus sp. CBMAI 1061, Marasmiellus sp. CBMAI 1062 e o isolado LAMAI 659, os quais foram selecionados devido à capacidade de produção de enzimas e degradação/destoxificação de poluentes ambientais (BONUGLI-SANTOS; DURRANT; SETTE, 2010; MENEZES et al., 2010; BONUGLI-SANTOS; DURRANT; SETTE, 2012; BONUGLI-SANTOS et al., 2016, PAIVA, 2016). Os três primeiros pertencem ao grupo dos basidiomicetos e foram isolados de esponjas marinhas e o último é um ascomiceto (ainda não identificado) isolado de sedimento marinho. Em adição, foram também utilizadas bactérias associadas ao ambiente marinho (reservatório de petróleo offshore), pertencentes a dois gêneros já reportados como degradadores de corantes têxteis, Bacillus e Dietzia (LEELAKRIANGSAK; BORISUT, 2012; DAS et al., 2015), as quais foram previamente selecionadas por apresentarem capacidade de degradar compostos orgânicos e poluentes ambientais (DELLAGNEZZE et al., 2016; VASCONCELLOS et al., 2011; VIEIRA, 2016). Nesta perspectiva, o grupo de pesquisa coordenado pela professora Dra. Lara Durães Sette, há mais de uma década vem concentrando esforços em pesquisas relacionadas com o isolamento de fungos de ambiente marinho, visando produção de enzimas e aplicação das mesmas, ou dos próprios micro-organismos em processos de biorremediação de poluentes ambientais (BONUGLI-SANTOS et al., 2010; MAGRINI, 2012; BONUGLI-SANTOS et al., 2012; VIEIRA, 2016; PAIVA, 2016; BONUGLI-SANTOS et al., 2016; OTERO et al., 2017; MAINARDI et al., 2018; VIEIRA et al, 2018). O foco do presente estudo foi avaliar o potencial dos fungos Peniophora sp. CBMAI 1063, Tinctosporellus sp. CBMAI 1061, Marasmiellus sp. CBMAI 1062 e LAMAI 659 e das bactérias Bacillus subtilis CBMAI 707 e Dietzia maris CBMAI 705 na destoxificação e descoloração de efluente têxtil sintético, bem como conhecer a influência de diferentes fatores visando otimização do processo. 19 2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 – Indústria têxtil Segundo a Confederação Nacional da Indústria – CNI (2017), o setor têxtil brasileiro possui importância econômica relevante, sendo a maior cadeia têxtil completa do Ocidente, possuindo desde as plantações de algodão, passando pelas fiações, tecelagens, beneficiadoras, confecções e varejo até os desfiles de moda. Além disso, é a quinta maior indústria têxtil do mundo, tendo faturado 51,58 bilhões de dólares em 2017, o que representa 8,64 bilhões de dólares a mais do que o total faturado em 2016 (Associação Brasileira da Indústria Têxtil e Confecção - ABIT, 2018). Sendo assim, é um setor industrial que a cada ano cresce mais e é responsável por 1,5 milhões de empregos diretos. Porém, embora a indústria têxtil tenha sua importância econômica, há uma série de impactos ambientais decorrentes dos rejeitos desse setor. A indústria têxtil utiliza grandes quantidades de água e uma série de compostos químicos em várias etapas do processamento de têxteis. Segundo Arslan-Alaton et al. (2008), há geração de até 100 litros de efluentes para a confecção de 1 quilo de tecido. Entre os compostos utilizados, destacam-se os corantes, sais, surfactantes e compostos de cloro, sendo os corantes os maiores contaminantes dos efluentes têxteis (KHANDEGAR; SAROHA, 2013). Os processos que mais geram efluentes no setor têxtil são os de preparação do tecido (purga, desengomagem, alvejamento) e o de tingimento (CNI, 2017). Um dos impactos gerados pelos corantes no efluente têxtil, inadequadamente tratado, é o turvamento da água, dificultando a entrada de luz. Consequentemente, a taxa fotossintética diminui, causando deficiência de oxigênio. Além disso, alguns corantes são tóxicos e mutagênicos. Portanto, esse contaminante pode prejudicar a qualidade da água para consumo, irrigação e recreação e causar efeitos deletérios a fauna, flora e microbiota que estão em contato com a água poluída do rio. (PRZOYSTAŚ; ZABŁOCKA-GODLEWSKA; GRABIŃSKA-SOTA, 2012; HUBBE et al., 2012). Outro fato alarmante relacionado aos corantes sintéticos foi levantado por Revankar e Lele (2007), onde aproximadamente todo material orgânico de corantes inseridos no meio ambiente é proveniente da descarga de rejeitos da industrial têxtil. Seguindo esse panorama, embora as indústrias têxteis representem um componente fundamental para a economia brasileira, há um descaso ambiental, referente à poluição gerada por esse segmento industrial. Tendo em vista a poluição gerada pelos setores industriais em 20 geral, os governos e agências regulatórias criaram leis para que haja um controle sobre os efluentes lançados. No mundo, há países como os Estados Unidos da América, Canadá, e os participantes da União Europeia que possuem legislações específicas para as descargas de efluentes industriais têxteis, o que é um avanço para a preservação do ambiente (ZDHC, 2016). No Brasil, a Resolução nº 357 de 17 de março de 2005, do Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA) nos artigos 14, 15 e 16, estabelece que nos corpos de água doce classe 1, 2 e 3 não é permitida a presença de corantes provenientes de fontes antrópicas que não sejam removíveis por processos de coagulação, sedimentação e filtração convencionais (BRASIL, 2005). Nesse contexto, com relação à quantidade de componentes tóxicos que compõem o efluente, grande parte dos parâmetros são exigidos em referência as suas concentrações em águas residuais, o que favorece o uso desnecessário de água para a diluição do efluente, anteriormente à descarga do mesmo no ambiente (THE TEXTILE INSTITUTE, 2007). Esse ato de diluição é considerado ilegal também pela legislação brasileira (BRASIL, 2005). Porém, assim como outros setores da indústria brasileira, há uma deficiência de fiscalização e planos de monitoramento para que a lei seja cumprida corretamente. 2.1.1 – Corantes têxteis Os primeiros registros de coloração de tecidos mostram a utilização do corante natural Índigo, retirado de uma planta, o qual é ainda utilizado, porém, em sua forma sintética. Apesar de haver atualmente corantes naturais, a maior parte das indústrias utiliza corantes sintéticos por terem menor custo de produção, maior fixação nos tecidos onde são aplicados e maior durabilidade. Isso é devido à estrutura química estável e as fortes ligações covalentes que possuem. Entretanto, essas características também dificultam a degradação química e biológica dos corantes (CHAKRABORTY, 2011). Os corantes têxteis podem ser classificados basicamente em duas classes. A primeira é em relação à estrutura química do corante, por exemplo, os corantes azos, antraquinona e índigo. E a segunda é de acordo com o método de aplicação destes corantes, como os corantes reativos, à cuba (vat dyes), diretos, ácidos, básicos e dispersos (IBRAHIM, 2011). Os corantes à cuba são compostos orgânicos insolúveis em água devido à presença de grupos cetônicos em seu cromóforo. O mais importante corante deste tipo é o Índigo. Corantes reativos são assim chamados pois um grupo reativo é introduzido no corante e assim, este se liga covalentemente às moléculas das fibras do tecido. Para tingir tons suaves que oferecem alta resistência a umidade e a luz são utilizados os corantes sulfurosos. Porém, 21 esses corantes apresentam uma estrutura química complexa e muitas vezes desconhecida. Corantes ácidos são utilizados para coloração de fibras animais em conjunto com uma solução ácida, que pode ser ácido acético, sulfato de sódio, ácido sulfúrico e surfactantes. Os corantes azoicos são reconhecidos por conterem o grupo azo (-N=N-), são insolúveis em água e geralmente aplicados em algodão e fibras sintéticas (GUARATINI; ZANONI, 2000). 2.1.1.1 - Azul Índigo O corante Azul Índigo tem caráter básico e é utilizado no tingimento de fios de algodão empregados na manufatura do tecido conhecido como jeans. É um composto azul e possui como característica química a presença do grupo cetônico (C = O) (Figura 1). Cerca de 5 a 20% do corante é perdido no processo de tingimento, e quando é descartado diretamente no ambiente, pode gerar sérios problemas nos processos biológicos aquáticos (SOUSA et al., 2008). Figura 1. Estrutura molecular do Azul Índigo. Fonte: Christie (2007). 2.1.1.2 – Marinho Reativo Os corantes reativos são muito utilizados na indústria têxtil para colorir fibras de algodão, lã e poliamida, os quais proporcionam uma grande variedade de tonalidade de cores (Figura 2). São também fáceis de aplicar e tem aumentado sua demanda pelo crescente uso de algodão mundialmente. Geralmente, o tingimento é realizado em banhos contendo 25 a 100 g L-1 de sais (NaCl ou Na2SO4). Além disso, durante as colorações, até 50% do corante inicial permanece no banho em sua forma hidrolisada, a qual não tem afinidade com o tecido e é descartado como efluente têxtil (MAHAPATRA, 2016). 22 Figura 2. Estrutura molecular do Marinho Reativo 4. Fonte: Sigma-Aldrich 2.1.1.3 - Preto sulfuroso Corantes sulfurosos se caracterizam por apresentar enxofre integrando o cromóforo e sob a forma de pontes sulfídricas. São os corantes mais comuns produzidos para corar algodão, em termos de volume, e a sua aplicação nos tecidos ocorre através de redução em meio alcalino e por isso são responsáveis por altos graus de contaminação ambiental (ESTEVES, 2000). Além disso, são baratos, tem boa solidez à lavagem e são fáceis de aplicar. O preto é o corante sulfuroso mais utilizado e tem a fórmula empírica C24H16N6O8S7 ou C24H16N6O8S8. Entretanto, sua estrutura molecular ainda precisa ser elucidada (Figura 3) (CHAKRABORTY, 2011). Figura 3. Hipótese da estrutura molecular do preto sulfuroso. Fonte: Esteves (2000). 2.1.2 – Tratamentos de efluentes têxteis Atualmente, as indústrias brasileiras utilizam principalmente tratamentos físicos e/ou químicos para reduzir a carga poluidora dos efluentes gerados. Entretanto, os métodos convencionais utilizados não têm sido suficientes para remoção dos contaminantes, antes dos mesmos serem despejados nos corpos d’água (FERREIRA, 2011). Tendo isso em vista, a Agência Brasileira de Desenvolvimento Industrial (2009) desenvolveu um Estudo Prospectivo Setorial Têxtil e Confecção, no qual descreve a visão de Futuro do setor até 2023. Nesta 23 visão, fica nítida a importância do desenvolvimento sustentável para a diferenciação competitiva do setor têxtil brasileiro a nível global. 2.2 – Biorremediação O processo de biorremediação é um tratamento que consiste em utilizar micro- organismos para diminuir ou anular a contaminação de poluentes (BOOPATHY, 2000). Comparada aos tratamentos físico-químicos, a biorremediação apresenta vantagens como o baixo custo e o fato de ser uma alternativa considerada melhor do ponto de vista ambiental. Além disso, os micro-organismos são capazes, muitas vezes, de mineralizar completamente os poluentes, produzindo produtos não tóxicos (FORGACS; CSERHÁTI; OROS, 2004). Os micro-organismos que possuem o aparato enzimático capaz de degradar poluentes são os mais promissores para a biorremediação. Porém, como a maioria dos corantes têxteis possui moléculas com alta estabilidade e recalcitrância, a probabilidade de degradar esses poluentes aumenta se forem utilizados consórcios microbianos constituídos por dois ou mais micro-organismos (SARATALE et al., 2009; DAVE; PATEL; TIPRE, 2015). Isso porque eles atuam de maneira sinérgica, aumentando as vias metabólicas para biotransformação, e consequentemente, há a melhora na eficácia do processo biodegradativo (DAS; DASH, 2014). Os bioprocessos mais utilizados para a biorremediação de corantes têxteis são a biossorção, biodegradação e a bioacumulação. A biossorção é um processo independente do metabolismo dos micro-organismos e que pode ocorrer tanto com a biomassa viva ou morta. Ela se baseia na ligação dos poluentes à biomassa, fazendo com que se diminua a concentração dos corantes ou até mesmo os remova completamente do meio (SRINIVASAN; VIRARAGHAVAN, 2010). A biodegradação é um mecanismo que demanda de energia e do metabolismo do micro-organismo, onde as moléculas complexas de corantes são degradadas em moléculas menores através da ação de determinadas enzimas. A bioacumulação também é um processo dependente de energia e do metabolismo, onde células ativas acumulam os poluentes dentro do citoplasma (WANG; HU, 2008). 2.2.1. Bioprospecção 2.2.1.1. Micro-organismos de origem marinha Os ambientes marinhos são caracterizados pelas condições físicas e químicas diversas, de pH, salinidade, variações de temperatura, entre outras. Desta forma, os micro-organismos que habitam os ambientes marinhos estão adaptados às condições adversas presentes nos mesmos e, por isso, podem apresentar vantagens em processos salinos e alcalinos quando 24 comparados aos seus análogos terrestres (DASH et al., 2013). Devido ao fato de resistirem e de se desenvolverem em condições variáveis, os micro-organismos de origem marinha possuem grande potencial para aplicação em processos de biorremediação, principalmente aqueles conduzidos em condições salinas (BIROLLI et al., 2016). Os fungos derivados de ambiente marinho não podem ser definidos somente por critérios fisiológicos, necessitam de um vasto estudo de sua ecologia para serem classificados como fungos marinhos obrigatórios, aqueles que crescem e esporulam exclusivamente em estuários e ambientes marinhos, ou fungos marinhos facultativos, que são organismos terrestres e aquáticos que conseguem crescer em ambientes marinhos (KOHLMEYER e KOHLMEYER 1979). Desta forma, quando não é possível comprovar que o fungo isolado é obrigatório ou facultativo, utiliza-se a expressão “fungo derivado” de ambiente marinho (OSTERHAGE, 2001). A associação entre micro e macro-organismos é uma característica proeminente dos ecossistemas marinhos. Corais e esponjas são conhecidos por manterem relações simbióticas ou de parasitismo com micro-organismos como cianobactérias, fungos e bactérias, o que os torna um conglomerado em miniatura de vários organismos. Entretanto, para muitos dos organismos marinhos a natureza destas associações não foi, até o presente momento, rigorosamente investigada e definida. Vários animais marinhos, como as esponjas, se alimentam por meio da filtração da água que os rodeia e, portanto, podem estar sujeitos ao contato com poluentes, impurezas do fitoplâncton ou outras substâncias. Dessa forma, é possível encontrar micro-organismos que estão nestes animais e que são capazes de degradar a matéria orgânica. Utilizando suas enzimas hidrolíticas e/ou oxidativas, esses organismos conseguem obter nutrientes dos poluentes que estão em contato (WANG, 2006; SETTE; BUNUGLI-SANTOS, 2013). Na Tabela 1 estão apresentados os micro-organismos associados a ambientes marinhos utilizados neste estudo. Os fungos já foram previamente estudados e apresentaram resultados relevantes na produção de enzimas ligninolíticas e/ou degradação de poluentes ambientais, incluindo a descoloração/destoxificação de corantes têxteis. As bactérias selecionadas apresentaram capacidade de degradar hidrocarbonetos e produzir EPS (exopolissacarídeos). No estudo de Vieira (2016) o melhor consórcio degradador de poluentes ambientais (óleo diesel, pireno e corante têxtil RBBR) continha em sua composição as bactérias Bacillus subtilis CBMAI 707 e Dietzia maris CBMAI 705, além do fungo marinho basidiomiceto Marasmiellus sp. CBMAI 1062 e de um zigomiceto de origem marinha Mucor racemosus CBMAI 847. 25 Representantes dos gêneros Bacillus e Dietzia são capazes de produzir azoredutases, enzimas responsáveis pela quebra das ligações azo, presentes em muitos corantes têxteis (LEELAKRIANGSAK; BORISUT, 2012; BABU et al., 2015). No estudo de Das et al. (2015) a bactéria Dietzia sp. foi capaz de degradar diferentes corantes azo. Tabela 1. Fungos e bactérias isoladas de ambientes marinhos: descrição de suas propriedades e fontes de isolamento. Fonte: Elaborado pela autora. Micro-organismo Fonte de isolamento Propriedades Referências Tinctosporellus sp. CBMAI 1061 Dragmacidon reticulatum (esponja) Produção de Lacase, LiP e MnP; Degradação de HPA (BONUGLI-SANTOS; DURRANT; SETTE, 2010; MAGRINI, 2012). Marasmiellus sp. CBMAI 1062 Amphimedon viridis (esponja) Produção de Lacase, LiP e MnP; Degradação de HPA; Descoloração de corante têxtil (BONUGLI-SANTOS; DURRANT; SETTE, 2012). Peniophora sp. CBMAI 1063 Amphimedon viridis (esponja) Produção de Lacase, LiP e MnP; Degradação de HPA; Descoloração e destoxificação do corante Preto Reativo 5 (BONUGLI-SANTOS et al., 2010; MAGRINI, 2012; BONUGLI-SANTOS et al., 2016).). Isolado LAMAI 659 Sedimento Marinho Produção de Lacase (PAIVA, 2016) Bacillus subtilis CBMAI 707 Petróleo altamente degradado Degradação de fenantreno Produção de EPS (DELLAGNEZZE et al., 2016; VASCONCELLOS et al., 2011) Dietzia maris CBMAI 705 Petróleo altamente degradado Degradação de n- octadecano e de fenantreno + n- octadecano (DELLAGNEZZE et al., 2014; VASCONCELLOS et al., 2011) 2.2.1.2. Fungos ligninolíticos Fungos que degradam a molécula de lignina (presente na madeira), são chamados de fungos ligninolíticos. Estes fungos não utilizam a lignina como única fonte de carbono e nitrogênio. A degradação da lignina é geralmente feita pelo metabolismo secundário do fungo, quando o mesmo se encontra em condições adversas de falta de nutrientes. Levando 26 em conta que a molécula de lignina é uma estrutura orgânica complexa, com vários anéis aromáticos e de difícil degradação, um conjunto de enzimas precisa ser secretada para a sua degradação. Os fungos basidiomicetos conhecidos como de podridão branca são considerados os degradadores mais eficientes da madeira, tendo desenvolvido mecanismos não específicos para degradar a lignina (BAZANELLA et al., 2014). Considerando o fato de que a estrutura química dos corantes têxteis é semelhante à da lignina, os fungos ligninolíticos têm sido utilizados na oxidação desses corantes (MOREIRA-NETO et al., 2013; DHARAJIYA; SHAH; BAJPAI, 2016; KURADE et al., 2017). As principais enzimas responsáveis pela degradação da lignina são a lignina peroxidase (LiP), a manganês peroxidase (MnP) e as lacases (SÁNCHEZ 2009; KARIGAR; RAO, 2011; BUGG, et al., 2011; BONUGLI-SANTOS et al., 2015), as quais geram quinonas que após a fissão do anel aromático são metabolizadas a CO2 e H2O (CERNIGLIA, 1997; TUOMELA et al., 2000). As enzimas manganês peroxidase [EC 1.11.1.13] e lignina peroxidase [EC 1.11.1.14] pertencem à família das oxidoredutases. Elas reduzem o oxigênio dissolvido em peróxido de hidrogênio com a simultânea oxidação de grupos hidroxil de substratos específicos da carbonila. Catalisam, assim, várias oxidações das cadeias de lignina e de outros compostos (SHARMA et al., 2007). Nos radicais fenólicos, os elétrons são absorvidos por um mediador redox ou pela enzima ligninolítica (Figuras 4 e 5). As lacases (benzenediol: oxigênio oxi-redutase) [EC 1.10.3.2] são glicoproteínas pertencentes ao grupo de enzimas multicobre oxidases, contendo em sua estrutura quatro átomos de cobre. Estas enzimas oxidam um grande número de reações de compostos aromáticos fenólicos e não fenólicos (SHARMA et al., 2007), reduzindo oxigênio à agua, sem necessidade de coenzima (Figura 5) (LEONOWICZ, et al., 2001; DURÁN et al., 2002). 27 Figura 4. Oxidação de estruturas fenólicas por um mediador redox. Fonte: Traduzido de Teerii; Henriksson (2009). Outra via metabólica conhecida para degradação de poluentes orgânicos presente em fungos envolve a hidroxilação do composto pela enzima citocromo P-450 mono-oxigenase, mediante uma sequência de reações que é semelhante às que estão envolvidas no metabolismo de mamíferos (CAPOTORTI et al., 2004; HARITASH; KAUSHIK, 2009). Esta via é também utilizada por fungos não-ligninolíticos (Figura 5). 28 Figura 5. Catabolismo microbiano de hidrocarbonetos envolvendo as enzimas citocromo P- 450 monooxigenase, lacase, LiP e MnP. Fonte: Modificado e traduzido de Haritash, Kaushik (2009). 2.2.1.3. Bactérias degradadoras As bactérias utilizam oxigenases para a degradação aeróbica de poluentes ambientais (compostos orgânicos), por meio da adição de oxigênio molecular ao substrato. As dioxigenases catalisam a adição de dois grupos hidroxil, enquanto as mono-oxigenases catalisam a introdução de um átomo de oxigênio na molécula (Figura 6). Esse mecanismo resulta na formação de diidrodiol, o qual será desidrogenado, formando outros compostos intermediários que poderão ser metabolizados até CO2 e H2O (BAMFORTH; SINGLETON, 2005; HARITASH; KAUSHIK, 2009; FUENTES et al., 2014). 29 Figura 6. Degradação de benzeno via monooxigenase e dioxigenase. Fonte: Traduzido de El Mahdi, Aziz (2017). 2.3. Análise de toxicidade A eficácia da biodegradação é frequentemente determinada em termos da diminuição da concentração do contaminante. Entretanto, a redução dos níveis do poluente muitas vezes não está diretamente relacionada com a diminuição da atividade biológica (toxicidade). Em muitos casos, a transformação biológica do poluente resulta na formação de metabólitos intermediários que podem ser mais tóxicos do que o composto original, mesmo que se apresentem em pequenas concentrações (BOOPATHY, 2000; VIEIRA, 2016). Desta forma, a determinação da redução da toxicidade deve ser realizada. Neste contexto, é recomendado que se realizem análises de toxicidade em organismos de diversos níveis tróficos, tais como bactérias, microcrustáceos, algas e plantas (MOLNÁR; GRUIZ; HALÁSZ, 2007; GIROTTI et al., 2008). 2.3.1. Artemia sp. O microcrustáceo do gênero Artemia sp. pode ser encontrado em vários corpos d’água, servindo de alimento para peixes (BUSTOS-OBREGON; VARGAS, 2010). Como são animais filtradores e aquáticos, estão altamente expostos ao ambiente onde estão, e podem ser 30 sensíveis aos poluentes. Portanto, se há contaminação no meio onde estão, esses organismos podem proporcionar respostas toxicológicas rápidas. Além disso, possuem a vantagem do baixo custo e a não necessidade de equipamentos especiais (ALMEIDA; CORSO, 2014). Estudos previamente realizados utilizaram com sucesso Artemia sp. como bioindicador de toxicidade de corante têxtil e outros poluentes (ALMEIDA, 2013; LEME et al., 2015; MORAES; BIDOIA, 2015; DUARTE, 2016; VIEIRA, 2016). 2.3.2. Aliivibrio fischeri – Microtox® A bactéria bioluminescente A. fischeri tem sido utilizada como bioindicador em diversos trabalhos científicos, demonstrando a mudança na toxicidade de corantes têxteis após os tratamentos utilizados, sejam eles físicos, químicos ou biológicos (LEME et al., 2015; VIEIRA, 2016; PAŹDZIOR et al., 2017; GIOIA et al. 2018). Utilizando o luminômetro Microtox®, os testes são rápidos, possuem alta sensibilidade, reprodutibilidade, além do fato de demandarem um pequeno volume de amostra para serem feitos. 2.3.3. Cucumis sativus A dicotiledônea C. sativus, popularmente conhecida como pepino-caipira e outras plantas superiores são reconhecidas como importantes indicadoras ambientais. A Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (USEPA – United States Environmental Protection Agency), por exemplo, já validou e indica o uso de vegetais em testes de toxicidade (USEPA, 1985). Os testes consistem, geralmente, em colocar as sementes em contato com os poluentes antes e após o tratamento, até que as medidas de porcentagem de germinação, crescimento radicular e do hipocótilo sejam medidas. Pela comparação entre essas medidas é possível analisar se a toxicidade aumentou, diminuiu ou permaneceu a mesma. As sementes de C. sativus já foram utilizadas em diversos trabalhos para a análise de toxicidade de corantes têxteis (BEDOUI et al., 2015; MORAES; BIDOIA, 2015; OLIVEIRA et al. 2018), tendo demonstrado resultados confiáveis. 2.4. Planejamento experimental O planejamento experimental é uma abordagem estatística e tem se mostrado ser uma ferramenta útil na otimização de bioprocessos (SHUIB et al., 2016; HASHEM et al., 2018). Isto porque é possível avaliar diversas variáveis independentes, diminuindo consideravelmente o número de ensaios a serem feitos, além da grande economia de custos e tempo que o maior número de ensaios geraria (DENIZ, 2014). Utilizando variáveis como as 31 fontes de carbono, nitrogênio, fósforo e a concentração de corantes, é possível atingir resultados que apontem para maior descoloração e destoxificação em bioensaios. No estudo de Hashem et al. (2018) foi possível otimizar as condições de cultivo para a descoloração do corante azo Remazol black B pela bactéria Pseudomonas aeruginosa KY284155. Utilizando o planejamento Plackett–Burman, 100% de descoloração foi atingida em 32 h. No ensaio que teve a maior descoloração o meio de cultivo otimizado foi composto por 4 g K2HPO4; 4 g KH2PO4; 2 g (NH4)2SO4; 1 g MgSO4·7H2O; 0,01 g CaCl2; 0,5 g FeSO4·7H2O, 5 g L-1 de glicose e 8 g L-1 de extrato de malte no pH 5 e temperatura de 37 °C. Baseado no desenho experimental utilizando Plackett-Burman, Shuib et al. (2016) conseguiram analisar onze variáveis na biodegradação do corante têxtil RBBR (Remazol Brilliant Blue R). Os resultados revelaram que quatro dessas variáveis (concentração de corante, extrato de malte, inóculo e tempo de incubação) foram os fatores mais efetivos na biodegradação. Mostrando assim, a eficiência e rapidez na seleção de variáveis com a mínima quantidade de ensaios. No estudo de Vieira (2016), utilizando o mesmo corante, foi utilizado o planejamento experimental para otimizar a biorremediação por consórcio microbiano, o qual permitiu que se chegasse a uma condição de cultivo de baixo custo e similar às condições reais dos efluentes têxteis. Em adição, Bonugli-Santos et al. (2016) obtiveram sucesso na descoloração e destoxificação do corante Preto Reativo 5 pelo fungo Peniophora sp. CBMAI 1063, de origem marinha, utilizando o planejamento experimental. 32 3. OBJETIVO GERAL Avaliar o potencial dos fungos Peniophora sp. CBMAI 1063, Tinctosporellus sp. CBMAI 1061, Marasmiellus sp. CBMAI 1062 e LAMAI 659 e das bactérias Bacillus subtilis CBMAI 707 e Dietzia maris CBMAI 705 na destoxificação e descoloração de efluente têxtil sintético, bem como conhecer a influência de diferentes fatores visando otimização do bioprocesso. Objetivos específicos:  Preparar um efluente têxtil sintético utilizando corantes e substâncias que simulem um efluente proveniente da indústria têxtil.  Selecionar o fungo com maior capacidade de destoxificar o efluente sintético.  Avaliar a destoxificação do efluente sintético, utilizando o fungo com o melhor desempenho de destoxificação em consórcio com as bactérias Bacillus subtilis CBMAI 707 e Dietzia maris CBMAI 705.  Otimizar o processo de destoxificação/descoloração do efluente têxtil sintético por meio de desenho experimental, avaliando a influência de diferentes fatores.  Validar os ensaios com os melhores resultados do desenho experimental e avalia-los utilizando a técnica de FTIR. 33 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Micro-organismos Os fungos basidiomicetos de origem marinha utilizados neste trabalho Peniophora sp. CBMAI 1063, Marasmiellus sp. CBMAI 1062 e Tinctosporellus sp. CBMAI 1061 foram isolados das esponjas marinhas Amphimedon viridis (dois primeiros) e Dragmacidon reticulatum (terceiro) coletadas no litoral norte do Estado de São Paulo (MENEZES et al., 2010) e foram identificados por Bonugli-Santos e colaboradores (2010). O fungo LAMAI 659 foi isolado de sedimento marinho em Alcatrazes (litoral norte do Estado de São Paulo). A identificação deste isolado ainda não foi concluída. Entretanto, análises taxonômicas preliminares indicam ser este um representante do grupo dos ascomicetos. Todos os fungos estudados estão preservados por dois métodos distintos (criopreservação e Castellani) na coleção de pesquisa do Laboratório de Micologia Ambiental e Industrial (LAMAI) do Instituto de Biociências da UNESP campus Rio Claro, a qual é parte da Central de Recursos Microbianos da UNESP (CRM-UNESP). As bactérias utilizadas neste trabalho foram isoladas e identificadas pelo grupo de pesquisa da Dra. Valéria Maia de Oliveira do Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). B. subtilis CBMAI 707 e D. maris CBMAI 705 foram isoladas de reservatórios de petróleo na Bacia de Campos, Rio de Janeiro (VASCONCELLOS et al., 2011; DELLAGNEZZE et al., 2014). Ambas bactérias fazem parte do acervo da Coleção Brasileira de Micro-organismos de Ambiente e Industria (CBMAI) do CPQBA/UNICAMP. 4.2. Cultivo dos fungos e estruturação do experimento para determinação da concentração do Efluente Têxtil Sintético (ETS) Os fungos Peniophora sp. e o isolado LAMAI 659 foram cultivados em placas de Petri contendo ágar malte (extrato de malte 2% e ágar 2%) durante 7 dias. Após esse período, três cilindros (0,5 cm de diâmetro) de cada fungo, separadamente, foram transferidos para tubos de fundo cônico de 50 mL contendo 10 mL de extrato de malte 1,5%. Os fungos foram cultivados por 48 horas a 28 oC, sob agitação de 140 rpm (pré-inóculo). A massa fúngica filtrada foi adicionada a frascos Erlenmeyers contendo 50 mL do ETS preparado com diferentes concentrações de corantes (Tabela 2) e outros compostos: 30 g L-1 de NaCl (SAROJ et al., 2015); 3 mg L-1 de extrato de malte e NaOH para ajuste do pH para 8,0 (BONUGLI-SANTOS et al., 2016). Os corantes foram cedidos pela empresa TEXPAL 34 QUÍMICA (Valinhos, SP) e foram escolhidos por serem amplamente utilizados pelas indústrias têxteis nacionais e devido à recalcitrância dos mesmos. Tabela 2. Efluentes Têxteis Sintéticos (ETS) preparados com diferentes concentrações de corantes. Fonte: Elaborado pela autora. Corante Azul Índigo Marinho Reativo Preto Sulfuroso ETS A 50 mg L-1 50 mg L-1 50 mg L-1 ETS B 100 mg L-1 100 mg L-1 100 mg L-1 ETS C 200 mg L-1 200 mg L-1 200 mg L-1 A solução do corante Marinho Reativo foi esterilizada por filtração em membrana de 0,22 µm. Entretanto, os outros dois corantes ficaram retidos no filtro e essa técnica de esterilização não pôde ser utilizada. A solução de Preto Sulfuroso, por apresentar pH 12 e impossibilitar o crescimento de micro-organismos (fato verificado em placas com meio de cultura) não foi esterilizada. A solução de Azul Índigo foi apenas passada por filtro comum. Os demais componentes dos efluentes foram autoclavados por 20 min a 120 oC e 1 atm. Nos experimentos utilizando o consórcio microbiano (três estratégias diferentes) e no planejamento experimental a solução do corante Azul Índigo foi autoclavada (20 min, 120 oC e 1 atm) e seu perfil na UV-Vis foi verificado antes e após autoclavação, não apresentando alterações. Os fungos foram testados com os três efluentes, em três réplicas, e foram mantidos em incubadoras de agitação durante 7 dias a 140 rpm e 28 ºC na ausência de luz. Como controles negativos foram utilizados os ETS A, B e C (separadamente) na ausência dos fungos. Como controles positivos foram utilizados meio de cultivo (malte) sem adição dos corantes. 4.2.1. Biomassa seca Foram medidas as massas de tubos de fundo cônico, previamente secos em estufa a 105 oC por 18 h. Os cultivos dos diferentes experimentos foram centrifugados por 15 min a 10.000 rpm e 4 oC nos tubos previamente secos. O sobrenadante foi reservado para as outras análises e a massa fúngica foi seca em estufa a 105 oC por 18 h. A massa seca (tubo e micélio secos) foi novamente medida. A biomassa seca foi determinada pela diferença entre a massa final (tubo e fungos secos) e a massa inicial do tubo seco. Nos controles contendo apenas o efluente foi feito o mesmo procedimento, pois houve formação de um precipitado após a centrifugação. Sendo assim, a massa desse precipitado foi descontada de cada bioensaio. 35 4.2.2. Teste de toxicidade com Artemia sp. Os ovos de Artemia sp. foram colocados em aquário contendo 800 mL de água do mar artificial (ASW), contendo em g L-1 de água destilada: MgCl2.6H2O (10,83), CaCl2.2H2O (1,51), SrCl2.6H2O (0,022), NaCl (23,93), Na2SO4 (4,01), KCl (0,68), NaHCO3 (0,20), KBr (0,1), H3BO3 (0,03) (KESTER et al., 1967). O aquário foi recoberto com papel pardo para evitar a entrada de luz e deixado com um lado exposto sob luz artificial por 48 h. Após esse período, as larvas eclodidas foram utilizadas nos ensaios de toxicidade da seguinte maneira: 30 larvas foram colocadas em contato com 10 mL de amostra (após o bioensaio) e com o ETS não tratado. Controles contendo apenas água do mar artificial, na ausência dos efluentes sintéticos, também foram testados. Após 24 h, foi verificada a porcentagem de larvas sobreviventes. Todos os ensaios foram realizados em triplicata. 4.3. Determinação do fungo com melhor capacidade de destoxificação Foi estruturado um experimento a fim de selecionar o melhor fungo destoxificador do ETS. Para isso, os fungos associados ao ambiente marinho: Peniophora sp., Marasmiellus sp., isolado LAMAI 659 e Tinctosporellus sp. foram utilizados. O pré-inóculo de cada fungo foi preparado como descrito no experimento anterior, bem como o ETS, porém para esta etapa a concentração utilizada foi de 200 mg L-1 de cada corante (item 4.2). Os fungos foram inoculados separadamente em frascos Erlenmeyer com 50 mL do ETS preparado e permaneceram sob agitação de 140 rpm a 28 oC por 7 dias. Passado este período, foram realizadas as análises de biomassa seca (assim como no item 4.2.1) e toxicidade aguda utilizando o equipamento Microtox® (item 4.3.1). 4.3.1. Teste de toxicidade com A. fischeri A toxicidade foi analisada utilizando o equipamento Microtox®. A técnica consiste na exposição da bactéria bioluminescente A. fischeri a uma amostra, a qual acusa a toxicidade de acordo com a quantidade de luz emitida pela bactéria. Com o auxílio do equipamento Microtox® é possível detectar a concentração efetiva (EC50) que diminui em 50% a quantidade de luz emitida pela bactéria. Para tanto, foi feita uma suspensão inicial da bactéria liofilizada em tampão de reativação (108 células mL-1). Posteriormente, foi feita uma primeira diluição da bactéria, sendo 150 μL transferidos para 1.500 μL de NaCl 2%. A partir dessa diluição, 100 μL foram transferidos para cubetas e verificados a luminescência da bactéria (T0). Um volume de 2.500 μL da amostra em diferentes concentrações foi misturada com 250 μL de NaCl 22 %, e a mistura foi utilizada para a confecção de diluições seriadas (1:1). Para o 36 controle foi utilizado NaCl 2 %. As diluições (900 μL) foram transferidas para as cubetas contendo 100 μL de bactéria. A leitura em luminômetro foi realizada em tempos de 5, 15 e 30 min. Os resultados da leitura da luminescência da bactéria A. fischeri foram avaliados em programa específico do equipamento Microtox®, onde foram gerados dados de dose-resposta e determinado o EC50. 4.3.2. Atividade das enzimas ligninolíticas frente ao ETS Após o período de 7 dias, as amostras foram centrifugadas por 15 min a 10.000 rpm e 4 oC. O sobrenadante foi utilizado (caldo enzimático) para a determinação das atividades das enzimas ligninolíticas lignina peroxidase, manganês peroxidase e lacase, de acordo com os protocolos abaixo descritos. Lignina Peroxidase (LiP): A atividade da LiP foi avaliada por espectrofotometria UV/Vis a partir do aldeído veratrílico produzido (ε310nm= 9300M-1 cm-1) na oxidação do álcool veratrílico, usado como substrato. A mistura foi composta de 0,8 mL de tampão tartarato de sódio 125 mM pH 3,0; 0,5 mL de álcool veratrílico 10 mM; 0,5 mL de peróxido de hidrogênio 2 mM e 0,5 mL do caldo enzimático. A reação foi iniciada adicionando o peróxido de hidrogênio e o aparecimento do aldeído veratrílico foi determinado lendo-se a absorbância a 310 nm, após 10 min de reação (ARORA; GILL, 2001). Manganês Peroxidase (MnP): Esta atividade foi quantificada pelo método modificado de Wariishi, Valli e Gold (1992) com a adição de 50 μL de H2O2 (2 mM) em 0,8 mL de tampão malonato de sódio (60 mM; pH 4,5), 50 μL de MnSO4 (10 mM), e 0,1 mL de caldo enzimático. A formação do complexo Mn+3-malonato foi acompanhada a 270 nm (ε = 11590 M-1 cm-1), após 5 min de reação. Lacase: A atividade enzimática de lacase foi determinada pela oxidação do 2,2-azino-bis- etilbenthiazolina (ABTS): a mistura foi composta de 0,3 mL de tampão acetato de sódio 0,1 M (pH 5,0), 0,1 mL de solução de ABTS (ε = 36000 M-1 cm-1) a 0,03 % e 0,6 mL do caldo enzimático (BUSWELL; CAI; CHANG, 1995). A oxidação do ABTS foi medida pelo monitoramento do aumento da absorbância a 420 nm, após 10 min de incubação a 37 °C. Uma unidade enzimática (U) é definida como a quantidade de enzima necessária para oxidar 1 μmol de substrato por minuto. A atividade enzimática foi expressa em U L-1 do caldo 37 enzimático e os cálculos realizados a partir da equação descrita abaixo, derivada da Lei de Beer-Lambert: U L-1 = ∆A x V x 106 / ɛ x R x t, onde: ∆A Diferença entre a absorbância final e a inicial V Volume da reação (0,001 L em todos os casos) 106 Converte os mols de ɛ para μmols ɛ Coeficiente de extinção (M-1 cm-1) R Quantidade de caldo enzimático (L) T Tempo de reação (min) 4.4. Destoxificação utilizando consórcios microbianos Após ter sido selecionado o fungo com o melhor resultado de destoxificação, foi feito um novo experimento utilizando as bactérias B. subtilis e D. maris. As bactérias foram mantidas em placas de Petri contendo Agar Nutriente (peptona 5 g L-1, extrato de carne 3 g L- 1 e Agar 15 g L-1). Após dois dias de crescimento foi preparado o pré-inóculo utilizando uma alçada de bactérias em 15 mL de meio nutriente líquido, o qual foi colocado sob agitação de 140 rpm a 28 oC por 2 dias. O experimento consistiu em adicionar 0,4 mL de cada bactéria, lavada em solução de NaCl 0,9%, na absorbância de 0,4 (leitura no comprimento de onda de 600 nm) no ETS (200 mg L-1 de cada corante), preparado como mencionado no item 4.2. Após dois dias, foi adicionado o fungo com o melhor resultado de destoxificação, o qual permaneceu por 7 dias sob agitação de 140 rpm a 28 oC e ausência de luz. Ao término do experimento foram feitas as análises de biomassa seca (conforme item 4.2.1) e de toxicidade aguda utilizando o equipamento Microtox®, da mesma forma relatada no item 4.3.1. 4.5. Destoxificação e descoloração utilizando consórcios microbianos em duas estratégias diferentes Com base nos resultados obtidos nos experimentos anteriores foi feito outro experimento utilizando duas estratégias diferentes. A primeira estratégia consistiu em utilizar as duas bactérias juntas ou separadas por dois dias e posteriormente colocar o fungo por 7 dias (como feito no experimento anterior). Na segunda estratégia o fungo foi colocado por 7 dias e depois as bactérias foram acrescentadas juntas ou separadas por mais dois dias. Ambos os experimentos totalizaram nove dias com os micro-organismos em contato com o efluente. O ETS (200 mg L-1 de cada corante) utilizado neste experimento foi preparado conforme o item 38 4.2. Além disso, foi testado apenas o fungo selecionado, sem as bactérias, e controles contendo apenas o ETS. A biomassa seca das amostras foi determinada (de acordo com o item 4.2.1) e diferentemente dos outros experimentos, a destoxificação foi avaliada utilizando sementes de C. sativus. 4.5.1. Teste de toxicidade com C. sativus O teste utilizando C. sativus foi conduzido em placas de Petri baseado no estudo de Wang et al. (2001), com modificações. Foram colocadas em papel filtro 15 sementes sem agrotóxicos e 5 mL do efluente de cada bioensaio diluído em água (25% de cada amostra). Após o preparo, as placas foram envoltas individualmente por filme plástico para evitar a evaporação de água, e acondicionadas em BOD a 24 ºC ao abrigo de luz, por 5 dias. O controle negativo foi composto por solução de ZnSO4 0,05 M e o controle positivo por água destilada. Ao final do período de exposição foram tomadas as medidas da raiz, onde foram consideradas as sementes que apresentaram crescimento maior ou igual a 5 mm. O cálculo de inibição de crescimento radicular foi realizado utilizando-se a seguinte equação: % de inibição = média do controle positivo − média do bioensaio média do controle positivo x 100 4.5.2. Descoloração do ETS A descoloração de cada bioensaio foi avaliada de acordo com Bonugli-Santos, Durrant e Sette (2012). Para isso, após a centrifugação, os sobrenadantes foram diluídos em água destilada na proporção 1:10 e as absorbâncias medidas em amplo espectro (190 nm a 1100 nm). Tanto para o controle, contendo o ETS, quanto para os sobrenadantes dos tratamentos. O percentual de descoloração foi avaliado no comprimento de onda 589 nm, onde há o pico de absorbância máxima do efluente preparado, de acordo com a seguinte fórmula: Descoloração (%) = Absorbância inicial − Absorbância final Absorbância inicial x 100 4.5.3. Adsorção do ETS pela biomassa Os fungos foram cultivados conforme item 4.2 e as bactérias conforme item 4.4. Ao final de dois dias de pré-inóculo os micro-organismos foram autoclavados, separadamente, 39 por 45 min, 120 °C e 1 atm para inativação fúngica e enzimática. Após a adição do ETS, o experimento foi conduzido da mesma forma como descrito no item 4.5. Os cultivos foram centrifugados, o sobrenadante diluído na proporção 1:10 e as absorbâncias medidas em amplo espectro (190 nm a 1100 nm), tanto para o controle, contendo o ETS, quanto para os fungos inativados. No pico de absorbância máxima do ETS (589 nm) foi avaliado o percentual de adsorção pela biomassa, de acordo com a seguinte fórmula: Adsorção (%) = Absorbância inicial − Absorbância final Absorbância inicial x 100 4.6. Otimização da destoxificação e descoloração do ETS Foram realizados planejamentos experimentais para investigar o efeito de diferentes variáveis no processo de descoloração e destoxificação do ETS, bem como obter as condições necessárias para essa finalidade (condição otimizada). Para isso, foram empregados dois planejamentos do tipo Plackett-Burman (PB) (PLACKETT; BURMAN, 1946) e um DCCR (Delineamento Composto Central Rotacional). A capacidade de destoxificação de todos os ensaios dos planejamentos e do DCCR foi avaliada utilizando C. sativus como bioindicador, de acordo com o método descrito no item 4.5.1. A descoloração do ETS foi determinada para todos os ensaios de acordo com o item 4.5.2, sendo o controle constituído de água deionizada e corante (nas mesmas concentrações empregadas em cada ensaio). Os ensaios dos planejamentos experimentais não contêm réplicas, exceto os pontos centrais, que foram avaliados em triplicata. A avaliação do efeito das diferentes variáveis independentes empregadas nos planejamentos experimentais Plackett-Burman, assim como no DCCR frente à destoxificação e descoloração (variáveis dependentes) do ETS foi realizada utilizando o programa STATISTICA 8.0® (STATSOFT, INC. 2007), sendo empregado p-valor < 0,1. 4.6.1. Planejamento experimental Plackett-Burman 1 (PB1) O primeiro planejamento experimental foi composto por 11 variáveis independentes em uma matriz PB16 (Apêndice A), totalizando 19 ensaios. As variáveis independentes e as suas respectivas concentrações estão apresentadas na Tabela 3. Em todos os ensaios foi utilizado NaCl 30 g L-1 e o pH inicial foi ajustado para 7,0. Pensando na estratégia de bioestimulação, foram utilizadas algumas variáveis de modo que houvesse fontes de carbono (extrato de malte e sacarose), nitrogênio (extrato de levedura e sulfato de amônio) e fósforo 40 (fosfato de potássio). Foi utilizado carbonato de sódio para mimetizar um efluente têxtil real e também cloreto de cálcio, o qual já foi reportado como indutor para descoloração (DAWKAR et al., 2009). O ETS também foi colocado como variável para que se analisasse novamente a melhor concentração que os micro-organismos atuariam. Os micro-organismos também foram colocados como variáveis a fim de obter as melhores quantidades de inóculo para a destoxificação e descoloração do ETS. Tabela 3. Variáveis utilizadas no planejamento experimental 1 (PB16) e as concentrações de cada uma. Fonte: Elaborado pela autora. Variáveis Nível inferior -1 Ponto central 0 Nível superior +1 1. Inóculo Marasmiellus sp. (cilindros de 0,5cm de diâmetro) 1 3 5 2. Inóculo B. subtilis (UFC mL-1) 0,5 x 107 1 x 107 1,5 x 107 3. Inóculo D. maris (UFC mL-1) 0,5 x 107 1 x 107 1,5 x 107 4. Extrato de malte (g L-1) 0 3 6 5. Sacarose (g L-1) 0 3 6 6. Extrato de levedura (g L-1) 0 0,5 1 7. (NH4)2SO4 (g L-1) 0 0,5 1 8. KH2PO4 (g L-1) 0 1 2 9. CaCl2 (mM) 0 1 2 10. NaCO3 (mM) 0 1 2 11. Concentração de cada corante (mg L-1) 100 200 300 4.6.2. Planejamento experimental Plackett-Burman 2 (PB2) Os resultados do PB1 foram tomados como base para a estruturação do segundo planejamento experimental, no qual nove variáveis independentes (Tabela 4) foram utilizadas em uma matriz PB12 (Apêndice B). Em todos os ensaios foi utilizado o ETS na concentração de 200 mg L-1 (de cada corante), NaCl 30 g L-1 e o pH inicial foi ajustado para 7,0. Os pontos centrais foram em triplicata. As variáveis extrato de levedura e carbonato de sódio não foram mantidos neste planejamento. 41 Tabela 4. Variáveis utilizadas no planejamento experimental 2 (PB12) e as concentrações de cada uma. Fonte: Elaborado pela autora. Variáveis Nível inferior -1 Ponto central 0 Nível superior +1 1. Inóculo Marasmiellus sp. (cilindros de 0,5cm de diâmetro) 1 3 5 2. Inóculo B. subtilis (UFC mL-1) 0,5 x 107 1,0 x 107 1,5 x 107 3. Inóculo D. maris (UFC mL-1) 0,5 x 107 1,0 x 107 1,5 x 107 4. Extrato de malte (g L-1) 3 6 9 5. Sacarose (g L-1) 0 3 6 6. (NH4)2SO4 (g L-1) 0 1 2 7. KH2PO4 (g L-1) 0 1,5 3 8. CaCl2 (mM) 0 1,5 3 4.6.3. Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) Após os resultados do PB2 frente à descoloração e destoxificação do ETS, foi estruturado um DCCR considerando duas variáveis independentes: extrato de malte e cloreto de sódio. O DCCR foi composto pelos níveis inferior e superior, o ponto central, bem como os pontos axiais (Apêndice C), os quais estão apresentados na Tabela 5, com suas respectivas concentrações para as variáveis analisadas. Para esse planejamento foram fixadas as seguintes variáveis: ETS na concentração de 200 mg L-1 (de cada corante), 5 cilindros de Marasmiellus sp., 1,5 x 107de B. subtilis, 0,5 x 107 de D. maris, além dos parâmetros fixos desde o primeiro planejamento: NaCl 30 g L-1 e pH inicial 7,0. Tabela 5. Níveis das variáveis estudadas no DCCR. Fonte: Elaborado pela autora. Variáveis Ponto axial inferior -1,41 Nível inferior -1 Ponto central 0 Nível superior +1 Ponto axial superior +1,41 1. Extrato de malte (g L-1) 4,50 5,67 9,00 12,33 13,50 2. CaCl2 (mM) 1,00 1,58 3,00 4,42 5,00 42 4.7. Validação experimental 4.7.1. Primeira validação A validação experimental consistiu em repetir os dois ensaios que apresentaram a melhor condição de destoxificação e descoloração do ETS ao longo dos planejamentos realizados, para confirmar a resposta obtida. Além dos bioensaios, foram analisados controles constituídos pelas mesmas condições dos bioensaios, porém sem os micro-organismos. Todas as condições (bioensaio e controles) foram realizadas em quadruplicata. Os experimentos da validação foram cultivados a 28 oC e 140 rpm por 3, 5, 7 e 9 dias em contato com o fungo Marasmiellus sp. e mais dois dias finais com as bactérias B. subtilis e D. maris. A biomassa seca dos experimentos de validação foi determinada conforme descrito no item 4.2.1. O caldo enzimático resultante dos experimentos de validação foi avaliado quanto à descoloração e adsorção pela biomassa (somente dos ensaios de 7 dias), de acordo com os itens 4.5.2 e 4.5.3, respectivamente. A atividade enzimática de lacase, lignina peroxidase e manganês peroxidase) foi quantificada, segundo os protocolos descritos no item 4.3.2. Quanto à destoxificação, foi feito experimento com as sementes de C. sativus (conforme item 4.5.1) e com a bactéria A. fischeri (conforme item 4.3.1), sendo que com a bactéria foram avaliados apenas os experimentos dos 7 e 9 dias de cultivo. 4.7.2. Segunda validação De acordo com os resultados de destoxificação com as sementes de C. sativus, obtidos na primeira validação experimental, foi necessário fazer outra validação experimental. Sendo assim, foram escolhidos outros ensaios dos PB1 e PB2 para esta nova validação. Desta vez, foram repetidos três bioensaios avaliando os resultados após 7 dias em contato com o fungo e mais dois dias com as bactérias a 28 oC e 140 rpm. Além disso, foram feitos os controles (sem micro-organismos) e todas as condições avaliadas em quintuplicata, a fim de diminuir o desvio padrão obtido nos experimentos passados. Ao término dos bioensaios foram avaliados a biomassa seca (conforme item 4.2.1), descoloração (conforme item 4.5.2) e atividade enzimática (conforme item 4.3.2). Além disso, a destoxificação, foi avaliada utilizando as sementes de C. sativus, de acordo com o item 4.5.1, e foi feito ensaio com a bactéria A. fischeri (conforme item 4.3.1). Por fim, o sobrenadante dos bioensaios foi submetido à análise em FTIR, de acordo com o método descrito a seguir. 43 4.7.3. FTIR (Fourier Transform Infrared Spectroscopy) As análises de FTIR (Shimadzu FTIR-8300) foram realizadas para se obter, qualitativamente, informações sobre a possível degradação do ETS, após o processo de biodegradação pelo consórcio microbiano na validação experimental. Este método é útil para analisar os metabólitos formados nos processos de biodegradação de corantes (ALMEIDA; CORSO, 2014). Assim, para as análises de FTIR, as amostras foram colocadas em estufa a 60 oC por e secas em dessecador por dois dias. O KBr foi macerado em contato com a amostra em uma proporção de 10 mg da amostra: 150 mg de KBr. Essa mistura foi compactada em discos e as análises foram executadas em região média de infravermelho (400–4000 cm-1), com 32 scans e resolução de 4 cm-1. 4.7.4. Análise estatística Os resultados da biomassa seca, descoloração e destoxificação (C. sativus e A. fischeri) das duas validações experimentais foram submetidos a análise estatística utilizando o programa Minitab 17®. A significância das variações foi analisada pela variância simples (One-way ANOVA). Só foram considerados os resultados paramétricos para o Teste de Tukey (p<0,05), ou seja, os dados de descoloração da primeira validação e de biomassa seca da segunda validação. Os resultados não paramétricos não foram submetidos ao Teste de Tukey. 44 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Determinação da concentração do ETS Os resultados da biomassa seca do isolado LAMAI 659 e Peniophora sp. na presença e ausência dos ETS A, B e C estão apresentados na Figura 7. O bioensaio com o fungo Peniophora sp. apresentou maior quantidade de biomassa nos ETS B (0,268 g) e C (0,291 g), quando comparado ao crescimento do fungo sem ETS (0,095 g), ou seja, o controle positivo. Enquanto que, para o isolado LAMAI 659, a resposta foi oposta obtendo maior quantidade de biomassa na ausência de ETS. A diminuição do crescimento do isolado LAMAI 659 pode estar relacionada a toxicidade do efluente. Figura 7. Medidas de biomassa seca dos bioensaios utilizando o isolado LAMAI 659 e Peniophora sp., após 7 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm, na presença e ausência do ETS A (50 mg L-1 de cada corante), ETS B (100 mg L-1 de cada corante) e ETS C (200 mg L-1 de cada corante). Fonte: Elaborado pela autora. ETS A ETS B ETS C Fungo sem ETS B io m a s s a s e c a ( g ) 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 Peniophora sp. LAMAI 659 Os resultados da análise de toxicidade em Artemia sp. podem ser vistos na Tabela 6. Analisando os ETS antes do bioensaio nota-se que as três concentrações influenciaram negativamente no percentual de sobrevivência. Além disso, é possível notar que quanto maior a concentração do ETS, menor a taxa de sobrevivência (ETS A 78,89%, ETS B 44,33 e ETS C 36,66%). Indicando assim, a toxicidade do efluente para o microcrustáceo nas concentrações testadas. Já nas amostras tratadas com o fungo Peniophora sp. pode-se 45 verificar taxas de sobrevivência maiores, tanto no ETS B quanto no C (61,67% e 80,56%), respectivamente. Esses resultados, analisados concomitantemente aos de biomassa (Figura 7) sugerem que o fungo Peniophora sp. pode ter utilizado os corantes como fonte de carbono para o crescimento e duplicação celular, diminuindo assim, a toxicidade no meio. Analisando o bioensaio do ETS A com o isolado LAMAI 659, não foi observada alteração da toxicidade. Com os outros efluentes, não foi possível avaliar a toxicidade após o bioensaio com o isolado LAMAI 659 devido ao baixo pH. Conforme os resultados apresentados na Tabela 6, em pH abaixo de 4,95 a taxa de sobrevivência do indicador de toxicidade Artemia sp. foi de 0%. Provavelmente, os produtos do metabolismo dos fungos tornaram o efluente ácido, impossibilitando a sobrevivência do microcrustáceo. Tabela 6. Percentual de sobrevivência de Artemia sp. e registro do pH dos ETS A (50 mg L-1 de cada corante), ETS B (100 mg L-1 de cada corante) e ETS C (200 mg L-1 de cada corante) antes e após o bioensaio com os isolados LAMAI 659 e Peniophora sp. cultivados por 7 dias a 28 ºC e 140 rpm. Fonte: Elaborado pela autora. Efluente Ensaios Sobrevivência (%) Desvio padrão pH ETS A ETS antes do bioensaio LAMAI 659 Peniophora sp. 78,89 81,11 0,00 ±1,92 ±16,19 0,00 6,70 6,23 4,95 ETS B ETS antes do bioensaio LAMAI 659 Peniophora sp. 43,33 0,00 61,67 ±5,77 0,00 ±16,50 6,75 4,91 5,27 ETS C ETS antes do bioensaio LAMAI 659 Peniophora sp. 36,66 0,00 80,56 ±3,33 0,00 ±2,55 6,50 4,77 5,80 Controle Artemia sp. 97,78 ±3,33 8,00 Considerando o fato de que a Artemia sp. apresentou uma porcentagem de sobrevivência de 36,66% mesmo na maior concentração de ETS testada (200 mg L-1 de cada corante), foi feita uma análise de rastreamento utilizando concentrações mais altas do ETS, preparado da mesma forma como já descrito anteriormente, com proporções iguais de cada corante. Como pode ser verificado na Figura 8, as concentrações totais 535 mg L-1, 650 mg L- 46 1 e 720 mg L-1 foram pouco tóxicas para o microcrustáceo. Enquanto que as concentrações 1.285 mg L-1 e 2.000 mg L-1 foram letais para sobrevivência dos mesmos. Além da concentração do ETS afetar a sobrevivência do bioindicador, o pH também interferiu neste índice. Na Tabela 6 nota-se que no ETS C antes do bioensaio (concentração total de 600 mg L-1 e pH 6,5) a sobrevivência não condiz com o resultado apresentado na Figura 8 para a concentração de 650 mg L-1 e pH 8,0. Esse resultado indica que além da concentração do corante, o pH também afetou diretamente a sobrevivência da Artemia sp. Figura 8. Análise de toxicidade em Artemia sp. (percentual de indivíduos vivos) submetida a diferentes concentrações do efluente, com proporções iguais dos corantes. O pH foi ajustado para 8,0 com a utilização de hidróxido de sódio, em todas as amostras. Fonte: Elaborado pela autora. Concentração do ETS (mg L -1 ) 535 650 720 975 1084 1187 1285 2000 S o b re v iv ê n c ia ( % ) 0 20 40 60 80 100 Considerando a interferência do pH, foi feita a análise de sobrevivência de Artemia sp. utilizando água do mar em diferentes pH (6,0; 6,5; 7,0; 7,5; 8,0). A taxa de sobrevivência em todos os pH analisados foi próxima a 100%. Indicando assim, que é a combinação do ETS com os pH mais baixos que interferem na sobrevivência do microcrustáceo. Apesar da interferência do pH, o melhor resultado de destoxificação foi obtido no ETS com a maior concentração de corantes, após o bioensaio utilizando Peniophora sp. (Tabela 6). Portanto, considerando a tolerância do fungo Peniophora sp. (conforme os resultados de 47 biomassa seca e toxicidade) a concentração de ETS (200 mg L-1, de cada corante) foi escolhida para dar continuidade aos experimentos. 5.2. Determinação do fungo com melhor capacidade de destoxificação Os resultados das medidas de biomassa seca do experimento utilizando os fungos LAMAI 659, Tinctosporellus sp., Peniophora sp. e Marasmiellus sp. estão apresentados na Figura 9. Conforme o gráfico, o fungo Marasmiellus sp. apresentou a maior quantidade de biomassa (0,174 g). Figura 9. Medidas de biomassa seca do bioensaio utilizando os fungos LAMAI 659, Tinctosporellus sp., Peniophora sp. e Marasmiellus sp., após 7 dias de cultivo a 28ºC e 140 rpm, na presença do ETS (200 mg L-1 de cada corante). Fonte: Elaborado pela autora. B io m a s s a s e c a ( g ) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 0,14 0,16 0,18 0,20 Marasmiellus sp.Peniophora sp.Tinctosporellus sp.LAMAI 659 Levando em consideração os resultados anteriores de sensibilidade da Artemia sp. às variações de pH, a bactéria A. fischeri foi utilizada nesta etapa para a análise da toxicidade aguda. A concentração efetiva, após 30 minutos de exposição, foi maior utilizando o fungo Marasmiellus sp. (12,16%) (Tabela 7). Este resultado indica redução da toxicidade do ETS para A. fischeri após o bioensaio, já que foi necessária uma concentração maior para inibir a bioluminescência da bactéria em 50%. Enquanto foi preciso uma concentração muito menor (0,31%) do ETS antes do bioensaio para atingir a EC50. Esse resultado corrobora com a maior biomassa observada para este mesmo fungo (Figura 9). 48 Tabela 7. Concentração efetiva (EC50) de A. fischeri, após 30 min de exposição utilizando as amostras contendo ETS (200 mg L-1 de cada corante), antes e após bioensaio com os fungos LAMAI 659, Tinctosporellus sp., Peniophora sp. e Marasmiellus sp. Fonte: Elaborado pela autora. LAMAI 659 Tinctosporellus sp. Peniophora sp. Marasmiellus sp. ETS antes do bioensaio 𝐄𝐂𝟓𝟎 (%) 0,35 0,28 0,34 12,16 0,31 Desvio padrão ±0,12 ±0,05 ±0,10 ±3,49 ±0,03 Após o bioensaio com cada um dos quatro fungos foi realizado ensaio enzimático para determinação de lacases nas amostras de acordo com a metodologia descrita no item 4.2.2. Contudo, não foi detectada atividade enzimática em nenhuma amostra utilizando ABTS como substrato. 5.3. Destoxificação utilizando consórcios microbianos Visto que o fungo Marasmiellus sp. apresentou o melhor resultado de destoxificação (Tabela 7) e a maior quantidade de biomassa (Figura 9), ele foi selecionado para formar os consórcios, juntamente com as bactérias B. subtilis e D. maris. A biomassa seca deste experimento utilizando o fungo Marasmiellus sp. e as bactérias B. subtilis e D. maris está apresentada na Figura 10. Nota-se que as biomassas secas dos consórcios (0,074 g, 0,067 g e 0,043 g) foram menores do que a apresentada no experimento utilizando apenas o fungo Marasmiellus sp. (0,174 g, Figura 9). Além disso, no experimento utilizando apenas as duas bactérias não houve crescimento de biomassa, detectada em peso seco. 49 Figura 10. Medidas de biomassa seca dos bioensaios utilizando consórcios microbianos formados pela(s) bactéria(s) (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) por mais 7 dias, na presença do ETS (200 mg L-1 de cada corante). Além do experimento contendo apenas as bactérias (9 dias). Os cultivos foram realizados a 28ºC e 140 rpm. (MB) Marasmiellus sp. e B. subtilis; (MD) Marasmiellus sp. e D. maris; (MBD) Marasmiellus sp., B. subtilis. e D. maris; (BD) B. subtilis e D. maris. Fonte: Elaborado pela autora. MB MD MBD BD B io m a s s a s e c a ( g ) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 Os resultados da toxicidade utilizando a bactéria A. fischeri estão apresentados na Tabela 8. É possível notar que o melhor resultado foi na presença do fungo Marasmiellus sp. e da bactéria B. subtilis, o qual apresentou 6,7% de EC50 comparado a 0,51% do ETS antes do bioensaio. Tabela 8. Concentração efetiva (EC50), após 30 minutos de exposição, das amostras contendo ETS (200 mg L-1 de cada corante) antes e após bioensaio utilizando a(s) bactéria(s) (B. subtilis e D. maris) durante dois dias, seguido pelo fungo (Marasmiellus sp.) por mais 7 dias. Além do experimento contendo apenas as bactérias (9 dias). Os cultivos foram realizados a 28ºC e 140 rpm. Fonte: Elaborado pela autora. 𝐄𝐂𝟓𝟎(%) Desvio padrão ETS antes do bioensaio 0,51 ±0,36 Marasmiellus sp. e B. subtilis 6,70 ±3,13 Marasmiellus sp. e D. maris 2,26 ±2,26 Marasmiellus sp., B. subtilis. e D. maris 1,47 ±0,37 B. subtilis e D. maris 0,52 ±0,03 50 Os resultados referentes aos ensaios enzimáticos para detecção de lacase e manganês peroxidase nas amostras tratadas com os consórcios, indicaram presença de lacase (3 U L-1) apenas no bioensaio contendo Marasmiellus sp. e B. subtilis. 5.4. Destoxificação e descoloração utilizando consórcios microbianos e duas estratégias diferentes Pela análise dos dados de biomassa do ETS antes do bioensaio (controle negativo sem micro-organismos) concluiu-se que o ETS estava contaminado por apresentar biomassa que passou de 0,036 g para 0,05 g. Desta forma o experimento (estratégia 1) foi repetido utilizando o ETS esterilizado. Em adição, foi utilizada a estratégia de inocular o fungo antes das bactérias para verificar se a interação entre os micro-organismos seria diferente e consequentemente, os resultados também (estratégia 2). Os resultados das medidas de biomassa seca (utilizando as duas estratégias diferentes) estão apresentados na Figura 11. Primeiramente, é possível notar que houve maior crescimento da biomassa de todos os consórcios utilizados na estratégia 1 comparado ao experimento anterior (Figura 10). Isto foi provavelmente devido ao fato do ETS não apresentar contaminação. Além disso, todas as amostras utilizando o fungo primeiramente (estratégia 2) apresentaram biomassa seca maior em comparação com a outra estratégia, onde a(s) bactéria(s) foi(foram) primeiramente inoculada(s) no efluente sintético (estratégia 1). Provavelmente, houve inibição do fungo pelas bactérias, as quais estavam em maior quantidade após dois dias em contato com o ETS. 51 Figura 11. Medidas de biomassa seca após bioensaio com ETS (200 mg L-1 de cada corante) utilizando consórcios microbianos em duas estratégias diferentes. Além do bioensaio utilizando apenas Marasmiellus sp. após 9 dias de cultivo de cultivo a 28ºC e 140 rpm. Estratégia 1: Bactéria(s) cultivada(s) por 2 dias e fungo por mais 7 dias; Estratégia 2: Fungo cultivado por 7 dias e adição da(s) bactéria(s) por mais 2 dias; (MB) Marasmiellus sp. e B. subtilis; (MD) Marasmiellus sp. e D. maris; (MBD) Marasmiellus sp., B. subtilis. e D. maris; (M) Marasmiellus sp. Fonte: Elaborado pela autora. MB MD MBD M B io m a s s a s e c a ( g ) 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 Estratégia 1 Marasmiellus sp. Estratégia 2 Nesta etapa foram utilizadas as sementes de C. sativus como bioindicador de toxicidade, a fim de baratear o custo dos experimentos. Levando em conta que os materiais para utilização do equipamento Microtox® são onerosos, optou-se por utiliza-lo nas etapas finais do trabalho. Nesta etapa, foi determinada a porcentagem de descoloração desconsiderando a adsorção dos corantes do ETS pelo micélio do fungo (Tabela 9). O resultado mais relevante de descoloração menos a adsorção (30,32%) foi observado no experimento utilizando o fungo inicialmente e as duas bactérias posteriormente (estratégia 2). Sendo que a adsorção correspondeu a 10,90% e a descoloração com os micro-organismos ativos foi de 41,22%. Quanto ao experimento de destoxificação, os resultados mais relevantes foram vistos nos ensaios utilizando B. subtilis inicialmente (71,05%), B. subtilis e D. maris inicialmente (70,74%) e B. subtilis. e D. maris após 7 dias com o fungo (72,49%) (Tabela 9). Esses resultados indicam que os três micro-organismos atuam no processo de descoloração e destoxificação do ETS. 52 Tabela 9. Descoloração