UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO RAFAEL SPLENDORE DE BORBA Taxonomia molecular e filogeografia de Hypostomus strigaticeps (Teleostei: Loricariidae) na bacia do Alto rio Paraná Rio Claro 2011 Ciências Biológicas RAFAEL SPLENDORE DE BORBA TAXONOMIA MOLECULAR E FILOGEOGRAFIA DE Hypostomus strigaticeps (TELEOSTEI: LORICARIIDAE) NA BACIA DO ALTO RIO PARANÁ Orientador: ANDERSON LUIS ALVES Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Instituto de Biociências da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau de Bacharel e Licenciado em Ciências Biológicas. Rio Claro 2011 Borba, Rafael Splendore de Taxonomia molecular e filogeografia de Hypostomus Strigaticeps (teleostei: loricariidae) na bacia do Alto Rio Paraná / Rafael Splendore de Borba. - Rio Claro : [s.n.], 2011 45 f. : il., figs., gráfs., tabs., fots., mapas Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ciências Biológicas Integral) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro Orientador: Anderson Luis Alves 1. Filogenia. 2. mtDNA. 3. ATPase. 4. Siluriformes. 5. Biogeografia. I. Título. 591.38 B726t Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP Campus de Rio Claro/SP Agradecimentos Em primeiro lugar agradeço aos meus pais, Silvia e Antonio, por todo apoio e confiança que depositaram em mim, durante toda a minha vida, e por todo apoio e confiança que ainda está por vir, obrigado. Agradeço ao Drº Anderson Luis Alves, por toda orientação nestes últimos quatro anos de trabalho, por todos os seus ensinamentos que contribuíram muito em minha formação e principalmente pela amizade e confiança que sempre depositou em mim em todo este período de convivência. Agradeço a Profª Drª Patrícia Pasquali Parise-Maltempi pela amizade, paciência e confiança, e principalmente por todo apoio técnico e intelectual que ofereceu para o desenvolvimento deste e de outros trabalhos. Agradeço a Profª Drª Carmem Silvia Fontanetti Christofoletti pelos seus conselhos e orientações em determinados momentos neste ano. Ao Profº Drº Claudio Oliveira, agradeço pelo fornecimento de amostras para o desenvolvimento do trabalho. E ao Profº Drº Claudio Henrique Zawadzki pelo fornecimento de amostras, pelo seu auxílio como taxonomista, pela sua grande contribuição no desenvolvimento do artigo referente a este trabalho e também pela amizade e incentivo. Agradeço ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPQ) pelo auxílio financeiro para o desenvolvimento do projeto. Agradeço a todos os amigos do departamento, Bairral, Lari, Cintia, Simone, Franco, Thiago, Keteryne, Mariana, Gabi, Dalia, Carol e Play, pela ótima convivência durante todas as semanas de trabalho. Um agradecimento especial a Matraca, Tamaris, Tati, Josi e Edson, pela amizade que vou levar para sempre, por todo apoio, jantas, cafés da tarde, visitas de domingo, e principalmente pelas risadas, que proporcionam mais prazer em todos os dias de trabalho. Agradeço novamente a Carol e a Matraca, por sempre estarem comigo desde o começo, pelas noites e madrugadas de estudo, e pelos “cafés” na casa da Carol depois de todo este estudo. Agradeço novamente ao Edson, pela grande amizade que temos, pelos conselhos, pela ajuda nas horas complicadas, pela paciência, pelas cervejas, pelas palhaçadas e por tudo mais que não caberia aqui nestes agradecimentos, mas principalmente, agradeço por você ser um grande amigo. Obrigado Edson. Agradeço a todos os amigos do CBI 2007, por todos estes anos de convívio, especial a Nery, pela amizade desde o começo, pelas bobagens que falamos, pela sinceridade, pelo carnaval em Olinda, e por tudo que passamos de bom nestes anos. Outro agradecimento especial a Bis, Larva, Ricota, Clara, Moyra, Annie, Mentira, Mariana, Pedrita, Pedó, Reto, Fi, Priscila, Curiosa, Paulinha e Liu, pela amizade que vamos levar para sempre. E por fim agradeço a todos que de alguma forma contribuíram com conselhos ou críticas, idéias ou ensinamentos, os quais foram de grande importância para meu crescimento e minha formação. Obrigado!! Resumo Buscando identificar marcadores populacionais que indiquem supostos mecanismos de isolamento entre as populações, no presente trabalho foram realizadas análises filogenéticas e filogeográficas em populações de Hypostomus strigaticeps, com base em sequências de DNA mitocondrial do gene ATPase 8/6. Um total de 32 exemplares provenientes de 11 populações de quatro sub-bacias: rio Mogi-Guaçu (duas), rio Paranapanema (cinco), rio Tietê (três) e Rio do Peixe (um), tiveram DNA extraído e o gene ATPase 8/6 completamente amplificado (840 pares de base) e sequenciado. As sequências obtidas foram alinhadas com o programa Bioedit, as análises filogenéticas foram realizadas no programa MEGA 5.0 através do método de Neighbor-Joining, Máxima Parcimônia e Minimun-Evolution, com 1000 réplicas de boostrap. Para as análises filogeográficas as sequências foram analisadas no programa TCS. As análises filogenéticas mostraram que a espécie forma uma unidade monofilética composta por duas linhagens: “TG” com representantes das populações dos rios Tietê, Mogi-Guaçu e Rio do Peixe, e “PC” com representantes dos rios Paranapanema e reservatório de Chavantes. A divergência genética da linhagem “TG” é de 0,1% e da linhagem “PP” é de 0,2%, enquanto a divergência genética entre as duas linhagens é de cerca de 1%. Na análise filogeográfica observou-se a existência de seis haplótipos (A-H), sendo o haplótipo A considerado ancestral para as populações analisadas. Apenas os representantes da bacia do Tietê possuem o haplótipo ancestral. Os haplótipos A, B e F possuem a maior frequência (18,51%). Os resultados obtidos para uma população do Mogi-guaçu (Cachoeira de Emas), mostram que estes peixes são muito distantes das demais populações de H. strigaticeps, tanto no ponto de vista filogenético quanto no ponto de vista fitogeográfico. Tais resultados são conclusivos para determinar que a distribuição da espécie não está restrita apenas a bacia do rio Tietê, porém a dispersão de H. strigaticeps para as outras sub-bacias deve ter ocorrido a partir deste rio. Palavras-chave: DNA mitocondrial, ictiofauna neotropical, filogenia, Siluriformes. SUMÁRIO 1. Introdução.........................................................................................................7 1.1 A ictiofauna de riachos.....................................................................................7 1.2 A bacia do Alto rio Paraná...............................................................................8 1.3 Genes mitocondriais em estudos de evolução e conservação..........................9 1.4 Filogeografia em peixes.................................................................................10 1.5 Ordem Siluriformes........................................................................................11 1.6 Família Loricariidae.......................................................................................12 1.7 Gênero Hypostomus.......................................................................................13 1.8 Distribuição de Hypostomus strigaticeps......................................................14 2. Objetivo.............................................................................................................16 3. Metodologia......................................................................................................17 3.1 Materiais........................................................................................................17 3.2 Métodos.........................................................................................................19 3.2.1 Extração de DNA...................................................................................19 3.2.2 Amplificação e sequenciamento.............................................................20 3.2.3 Análises Filogeográficas........................................................................22 3.2.4 Análises Filogenéticas e Relógio Molecular..........................................22 4. Resultados.........................................................................................................23 5. Discussão...........................................................................................................31 5.1 História evolutiva de Hypostomus strigaticeps no Alto rio Paraná...............31 5.2 Divergência genética de H. strigaticeps na Cachoeira de Emas...................32 5.3 Biogeografia de H. strigaticeps no Alto rio Paraná.......................................33 6. Conclusão..........................................................................................................35 7. Referências........................................................................................................36 1- Introdução 1.1 A ictiofauna de riachos A ictiofauna Neotropical de água doce se apresenta extremamente rica em relação à quantidade de espécies de peixes presentes na região, possuindo cerca de 71 famílias e 4475 espécies validas de peixes (REIS et al. 2003). Os peixes de pequeno porte, geralmente com menos de 15cm de comprimento, correspondem a cerca de 50% das espécies de peixes de água doce descritas na América do Sul mostrando um elevado grau de endemismo (CASTRO et al. 2003). Estes peixes apresentam uma distribuição geográfica restrita e pouco ou nenhum valor comercial. Estas espécies são dependentes da vegetação ripária para a alimentação, abrigo e reprodução, de modo que as atividades antrópicas como desmatamento, uso de fertilizantes e praguicidas associados a atividades agrícolas intensivas, resultam na redução da divercidade destas especies, devido a destruição do seu habtat natural, deixando-as em risco de extinção (CASTRO et al. 2003; CASTRO et al. 2005). Nesse sentido, de acordo com Castro et al. (2005) as pesquisas derecionadas a divercidade na ictiofauna de riachos são extremamente urgentes e necessarias. O estudo da sistemática, evolução e ecologia das espécies de pequeno porte é o grande desafio da ictiologia Neotropical do século 21 (CASTRO et al. 2003; CASTRO et al. 2005). Apesar dos esforços, pouco se conhece sobre esta ictiofauna, um bom exemplo são as sub-bacias de drenagem do Alto rio Paraná no Estado de São Paulo, onde cerca de 70% dos riachos desta região não tinham sido exploradas satisfatoriamente em termos científicos (CASTRO et al. 2003; CASTRO et al. 2004). A partir deste conjunto de trabalhos emerge a necessidade de estudos morfológicos, citogenéticos e genético-moleculares enfocando aspectos da biologia, ecologia, filogeografia e da filogenia dos peixes de riachos, principalmente, da bacia do Alto rio Paraná. Estes estudos são importantes ferramentas para a identificação de novas espécies numa área de reconhecido endemismo e subestimativa da ictiofauna, além de caracterizar a diversidade de espécies da região justificando a elaboração da presente proposta. 1.2 A bacia do Alto rio Paraná A bacia hidrográfica do Alto rio Paraná pertence à região ictiofaunística do Paraná, que inclui o sistema dos rios da Prata, Uruguai, Paraná e Paraguai, e representa o segundo maior sistema de drenagem na América do Sul, com 3,2 milhões de km2 (LOWE-MCCONNELL, 1999). O Alto rio Paraná corresponde à porção da bacia do rio Paraná situada a montante de Sete Quedas (agora inundada pelo Reservatório de Itaipu), abrigando grandes tributários como os rios Grande, Paranaíba, Tietê e Paranapanema (CASTRO et al. 2003). A drenagem do Alto rio Paraná possui aproximadamente 900.000 km2, incluindo o norte do Estado do Paraná, sul do Mato Grosso do Sul, a maioria do Estado de São Paulo (a oeste da Serra do Mar), sul de Minas Gerais, sul de Goiás e uma área pequena do Paraguai oriental, adjacente ao Mato Grosso do Sul. Esta região é caracterizada pela presença de domínios morfoclimáticos como: Florestas Estacionais Semideciduais, Cerrados, Florestas Ombrófilas Mistas, Campos Rupestres e Matas de Galeria (HUECK e SEIBERT, 1981) Os principais rios da margem esquerda do rio Paraná nascem a partir da Serra do Mar enquanto que aqueles da margem direita nascem nas Serras de Maracaju e do Carapó (SOUZA FILHO e STEVAUX 1997). A porção sudeste do Escudo Cristalino Brasileiro abriga as cabeceiras dos rios Grande, Paranaíba, Paranapanema e Tietê, bem como as cabeceiras de bacias adjacentes, tais como dos rios Tocantins-Araguaia, Doce, Paraíba do Sul, Ribeira de Iguape, São Francisco e diversas drenagens litorâneas menores. O Alto Paraná tem passado por atividades tectônicas desde o inicio do Terciário o que torna esta região muito complexa no que diz respeito a sua biogeografia (AB’SABER 1998). Além das atividades tectônicas, a região também é caracterizada por um complexo sistema de falhas, este cenário pode ter resultado em diversos eventos de captura de cabeceiras, como ocorrido entre os rios Tietê e Paraíba do Sul (CASTRO et al. 2003), e que foram responsáveis pela distribuição de algumas de suas espécies também em drenagens vizinhas, tais como: rios Paraíba do Sul, Ribeira de Iguape e algumas drenagens litorâneas menores (SERRA et al. 2007). 1.3 Genes mitocondriais em estudos de evolução e conservação Os estudos envolvendo sequências de DNA se converteram em excelentes ferramentas para auxiliar na taxonomia e conservação de diversas espécies. O DNA além de ser responsável por mudanças evolutivas carrega o registro diversos eventos ocorridos no passado, como a fragmentação geográfica, fenômenos de vicariância e processos de dispersão (KALINOWSKI, 2004). Desse modo, conhecer a diversidade genética dentro e entre espécies se torna fundamental para biologia evolutiva e para definir estratégias de manejo e conservação. O estudo da variabilidade genética populacional, e entre espécies tem sido possível devido ao desenvolvimento de vários marcadores moleculares, principalmente daqueles baseados no polimorfismo do DNA, que tem permitido o acesso a variabilidade de qualquer organismo. De acordo com Sunnucks (2000), marcadores genéticos ou moleculares são caracteres simples herdáveis com múltiplos estados para cada caráter. Esses marcadores têm sido aplicados em muitos estudos biológicos como mapeamento genético, genética de populações, reconstruções filogenéticas, testes de paternidade, aplicações forenses e, sobretudo em estudos de manejo e conservação genética (SCHLOTTERER, 2004). Recentemente, as sequencias de DNA têm sido o foco de estudo de várias instituições que se dedicam em elucidar problemas relativos à genética de populações, à sistemática e a conservação de recursos. Entre os marcadores mais comumente utilizados nestes estudos estão os genes mitocondriais. O tamanho do genoma mitocondrial (mtDNA) é bastante variável, apresentando valores em torno de 16 quilobases (kb) nos vertebrados até 570 kb em algumas espécies de plantas (LEWIN, 1994). Apresenta-se altamente conservado nos animais, variando de 14 a 26 kb (BILLINGTON e HEBERT, 1991), sendo representado por 2 genes que codificam RNAs ribossômicos (12S e 16S do rRNA), 22 genes que codificam RNAs transportadores (tRNA) e 13 genes que codificam proteínas envolvidas no transporte de elétrons e na síntese de ATP. A molécula de mtDNA possui uma região controle, de cerca de 1kb, que é rica em sequências AT e desprovida de genes, embora exerça importante papel no início da replicação do mtDNA e da transcrição do RNA. Esta região controle é conhecida como “D-loop” (displacement loop). Em peixes, são vários os exemplos da utilização de haplótipos de mtDNA na resolução de problemas taxonômicos, de relações filogenéticas, populacionais e conservacionistas (BERMINGHAM e MARTIN, 1998; KOTLIK e BERREBI, 2002; PATERNELLO et al., 2003; FALK et al., 2003; PERDICES et al., 2004; STRECKER et al., 2004; WANG et al., 2004; BATISTA E ALVES-GOMES, 2006; WILLIS et al., 2007; HUBERT et al., 2007). 1.4 Filogeografia em peixes Determinadas atividades humanas, como a construção de barragens e hidroelétricas, podem causar grandes impactos sobre as redes hidrográficas, e consequentemente afetar a estrutura populacional da ictiofauna local. Dentro deste quadro, os estudos relacionados à análise de sequências de DNA se mostram como uma importante ferramenta para determinar a estrutura genética dessas populações afetadas. A filogeografia e a filogenia têm dado importantes contribuições para o entendimento da evolução das populações, espécies e comunidades de peixes em distintos ambientes neotropicais (PIORSKI et al. 2008), sendo este um campo de estudo que leva em questão os princípios e processos que governam a distribuição geográfica de linhagens genealógicas (AVISE 2004), que permite examinar questões como as origens das zonas híbridas (HEWITT 2001) e os limites das espécies (MARTÍNEZ- ORTEGA et al. 2004). Tais inferências, principalmente as relacionadas às reconstruções das espécies e a genealogias de populações, são baseadas principalmente em sequências de genes do DNA mitocondrial (DNAmt) (LOVEJOY e DE ARAÚJO 2000). Baseado em aspectos da divergência de sequências de mtDNA, Avise (2000) propôs cinco categorias filogeográficas. Na categoria I, estão incluídos os casos em que as linhagens são bastante divergentes (valores superiores a 1-2%), ocupando áreas geográficas distintas (Alopatria). A categoria II, é composta por linhagens divergentes que ocorrem na mesma área geográfica (Simpatria). Na categoria III, ocorrem linhagens com baixos valores de divergência de sequências (menores que 1%), ocupando áreas geográficas distintas (Alopatria). Na categoria IV, estão as linhagens com divergência muito baixas ou praticamente nulas e que estão geograficamente localizados (Simpatria, com grande área de distribuição). Na categoria V, são encontradas linhagens pouco divergentes exibindo uma separação espacial parcial, sendo intermediária entre as categorias III e IV. De maneira geral, a presença de clones de mtDNA filogeneticamente próximos, reflete a ocorrência de fluxo gênico (ao menos, via materna), ou a presença de barreiras recentes, enquanto descontinuidades genéticas mais profundas podem evidenciar separações populacionais historicamente mais antigas (AVISE, 2000). Com o desenvolvimento desse método de estudo, a filogeografia foi revelando a história natural da diversidade de peixes de água doce na região neotropical, relacionando-a aos eventos envolvidos no estabelecimento final dos rios da América do Sul entre 15 e 10 milhões de anos atrás (LUNDBERG et al. 1998). Segundo Avise (2000), cerca de 56% (27) das espécies de peixes de água doce já analisadas apresentam padrão filogeográfico de estruturação populacional da Categoria I, enquanto 17 espécies apresentam o padrão filogeográfico da categoria III a V e apenas 4 espécies apresentam o padrão filogeográfico da categoria II. As 48 espécies listadas por Avise (2000) estão distribuídas em sistemas hidrográficos de vários continentes, principalmente Europa e América do Norte. No entanto, estudos filogeográficos em peixes Neotropicais de água doce são ainda raros perto do elevado número de espécies deste grupo. Na ordem Siluriformes apenas duas espécies do gênero Amazônico Brachyplatystoma: B. rousseauxii (BATISTA e ALVES-GOMES, 2006) e B. vaillantii (RODRIGUES 2009) apresentam estudos referentes as relações filogeográficas de suas populações, enquanto em Loricariidae nenhum trabalho esta disponível quanto ao enfoque filogeográfico. 1.5 Ordem Siluriformes A ordem Siluriformes compreende um grupo de peixes extremamente grande, diverso e amplamente distribuído nas regiões tropicais de todo o mundo (Burges, 1989). A ordem é formada por peixes ósseos que somam algo em torno de três quartos de todas as espécies de peixes de água doce, sendo o foco de muitos estudos devido a sua grande diversidade ecológica (FINK e FINK 1981, DE PINNA 1998, BRITTO 2003). Atualmente a ordem é formada por 37 famílias, 416 gêneros e mais de 2500 espécies (DE PINNA 1998, DIOGO 2003). Na região Neotropical são conhecidas atualmente 15 famílias formadas por 1648 espécies (REIS et al. 2003). Estes números tendem a aumentar significativamente devido a evolução dos conhecimentos das relações filogenéticas e filogeográficas entre os grupos. Os peixes que compõem a ordem geralmente habitam o fundo dos rios e riachos permanecendo escondidos entre as rochas e a vegetação. Possuem formas e tamanhos variados, com hábitos geralmente crepusculares e noturnos (PAXTON e ESCHMEYER 1995). Nestes peixes ocorre à total ausência de escamas sobre o corpo, sendo este revestido por uma pele espessa (couro) ou placas ósseas. Geralmente possuem três pares de barbilhões e frequentemente apresentam um forte e pungente acúleo à frente do primeiro raio das nadadeiras dorsal e peitorais (BURGES 1989). A maioria das espécies habita as regiões Tropicais e Neotropicais, sendo poucas as espécies que alcançam o extremo sul da América do Sul ou o extremo norte da América do Norte (NELSON 1994). Apesar de se tratar de um grupo de grande importância científica e econômica, os Siluriformes ainda apresentam inúmeros problemas sistemáticos e taxonômicos, sendo que a própria classificação da família foi definida recentemente (DE PINNA 1998, BRITTO 2003). Um exemplo disso é mostrado no estudo realizado por PINNA (1998) numa análise da sistemática de representantes de todos os principais grupos dessa ordem, mostrando a existência de um grande número de famílias polifiléticas, ainda que vários grupos tradicionais realmente representem grupos monofiléticos. Recentemente, Britto (2003) elaborou uma nova hipótese filogenética para grupos da ordem Siluriformes elevando à família representantes de grupos considerados polifiléticos por de Pinna (1998), sendo esta a hipótese mais aceita atualmente. 1.6 Família Loricariidae Dentro da ordem Siluriformes, a família Loricariidae, pertencente à superfamília Loricarioidea, é considerada um grupo monofilético. A família é composta por cerca de 90 gêneros e 683 espécies sendo dessa forma uma das famílias mais representativas da ordem. Estes peixes, vulgarmente conhecidos como “cascudos”, são caracterizados pela presença de um “escudo ósseo” que recobre todo corpo e sua cabeça possui pequenas estruturas ósseas em forma de espinho chamadas de odontódios e possui uma boca suctória com projeções carnosas. A família é subdividida em seis subfamílias: Hypostominae (386 espécies), Loricariinae (209 espécies), Hypoptomatinae (79 espécies), Neoplecostominae (sete espécies), Delturinae (sete espécies) e Lithogeneinae (uma espécie) de acordo com Reis et al. (2006). Porém estudos recentes conduzidos por Armbruster (2004) e Reis et al. (2006) afirmam que esta divisão deve ser reavaliada, devido a descrição de novas tribos e subfamílias para Loricariidae. 1.7 Gênero Hypostomus O gênero Hypostomus é o mais representativo na família, possuindo cerca de 126 espécies (HOLLANDA CARVALHO et al. 2010, ZAWADZKI et al. 2010), apresentando uma distribuição desde a América Central até o sul da América do Sul (WEBER 2003). Os exemplares representantes dessa subfamília se diferem das outras pela ausência de odontódios, pedúnculo caudal comprimido ou cilíndrico e características osteológicas do esqueleto caudal (ARMBRUSTER 2004). O gênero também é caracterizado por apresentar espécies com relativa plasticidade fenotípica o que diminui os intervalos morfológicos entre várias espécies tornando difícil a obtenção de caractéres diagnósticos para o grupo (ARMBRUSTER 2004). Essa ampla variação morfológica reflete na diversidade genética entre espécies do gênero, onde a variação do número diplóide é de 2n = 52 em Hypostomus emarginatus (ARTONI e BERTOLLO 2001) a 2n = 84 em Hypostomus sp. (CEREALI et al. 2008). Recentemente os grupos de pesquisa voltaram sua atenção para o uso de novas técnicas de análise, para caracterização de espécies e populações e para identificação e caracterização dos padrões de relacionamento entre grupos de organismos. Entre estas técnicas, a mais amplamente empregada envolve a análise de sequências de DNA. Os estudos dessa natureza com peixes ainda são pouco explorados em relação à extensão do grupo, porém os resultados obtidos são bastante promissores (STOK et al. 1991, KOCHER e STEPIEN 1997, MONTOYA-BURGOS 2003, HARDMAN, 2004). Para o gênero Hypostomus, Montoya-Burgos et al. (1998) elaboraram uma filogenia molecular para cerca de 50 espécies da família Loricariidae, utilizando segmentos de genes 12S e 16S do rRNA mitocondrial. O estudo mostrou que a família é monofilética, porém a subfamília Hypostominae e o gênero Hypostomus formaram grupos polifiléticos. Recentemente Montoya-Burgos (2003), elaborou uma filogenia molecular baseada em sequências do gene D-loop do DNA mitocondrial e de regiões espaçadoras transcritas internas dos genes ribossomais principais, mostrando que as espécies H. emarginatus e H. squalinus teriam maior relação com espécies de outros gêneros de Hypostominae. As demais espécies de Hypostomus formariam um clado monofilético. Tais agrupamentos são confirmados por análises de isoenzimas em espécies de Hypostomus realizadas por Zawadzki et al. (2004). Uma nova hipótese filogenética para o gênero foi proposta por Martinez (2009), onde estava incluindo populações de H. strigaticeps dos rios Tietê, Paranapanema e Mogi-Guaçu, num total de 09 indivíduos. Os resultados mostraram que a população do rio Mogi-guaçu diverge da população dos Tietê e do Paranapanema, que formam um clado. No entanto, não foi estimada a distância genética entre as populações e as relações filogenéticas se mostraram pouco resolutivas devido ao baixo número de exemplares analisados. Nesse sentido, emerge a necessidade de uma revisão taxonômica no grupo H. strigaticeps, onde a inclusão de dados moleculares, sobretudo de filogeografia e de relações filogenéticas de um número consideravelmente relevante de populações e indivíduos desta espécie, possa auxiliar na identificação de novas unidades taxonômicas ou na ampliação da área de distribuição geográfica da espécie. 1.8 Distribuição de Hypostomus strigaticeps Hypostomus strigaticeps (Figura 1), foi descrito por Regan (1908) e de acordo com Weber (2003) e Reis et al. (2003) a espécie é restrita a bacia do rio Tietê, porém, em H. strigaticeps é observada uma variação do número diplóide de acordo com a distribuição geográfica, as populações já analisadas citogeneticamente que pertencem a bacia do rio Mogi-guaçu possuem 2n=74, enquanto as populações dos rios Tietê (incluindo da localidade tipo) e do rio Paranapanema apresentam 2n=72. Esta variação cromossômica e a ocorrência desta espécie fora da área original de distribuição já indicam a existência de uma possível nova espécie no grupo. Existem divergências em relação à identificação de algumas populações de H. strigaticeps na bacia do Alto Paraná, devido a sua distribuição restrita a bacia do rio Tiete (WEBER 2003). Evidências morfológicas sugerem que estas populações, fora da área de distribuição, possam representar novas espécies no gênero (ZAWADZKI comunicação pessoal). Desta forma estabelecimento das relações filogenéticas e filogeográficas destas populações contribuirão para a compreensão dos padrões de evolução e distribuição de H. strigaticeps ao longo do Alto rio Paraná. Figura 1: Dorso e ventre de Hypostomus strigaticeps da bacia do rio Paranapanema. LGP 1048, (coleção ictiológica LGP, Rio Claro) 137,00 mm. 2- Objetivo A presente proposta se insere em um estudo da ictiofauna de riachos da bacia do Alto rio Paraná, sob o ponto de vista da Taxonomia Molecular e Filogeografia, realizado no Laboratório de Genética de Peixes do Departamento de Biologia da UNESP, Campus de Rio Claro. Este projeto pretendeu abordar questões acerca dos padrões de distribuição e classificação da espécie H. strigaticeps (Teleostei: Loricariidae), utilizando sequências de DNA mitocondrial. Além disso, contamos com a colaboração do Dr. Claudio Zawadzki (UEM, Maringá, PR) que realizará revisão taxonômica da espécie. Objetivos principais: - Estabelecer as relações filogeográficas de populações de H. strigaticeps pertencentes às bacias do Tietê, Paranapanema, Peixe e rio Grande (rio Mogi- Guaçu); - Testar a hipótese de que as populações estudadas fora da área de distribuição da espécie possam representar novas espécies do gênero. 3- Metodologia 3.1 Materiais Foram amostrados exemplares da espécie H. strigaticeps em quatro bacias no sistema do Alto rio Paraná (Figura 2): Tietê (incluindo a localidade tipo na bacia do rio Piracicaba), Paranapanema, Peixe e Grande (Mogi-Guaçu), representando cerca de 60 amostras. Os exemplares estão depositados na coleção do Laboratório de Genética de Peixes (LGP), UNESP de Rio Claro, no Laboratório de Biologia e Genética de Peixes (LBP), UNESP de Botucatu e no Laboratório de Ictiologia (NUPELIA) da UEM, Maringá. Os exemplares foram obtidos das coleções ictiológicas destas respectivas instituições. No presente trabalho foram utilizados 32 exemplares identificados como H. strigaticeps provenientes de quatro sub-bacias do Alto rio Paraná totalizando 12 populações: três do rio Tietê, cinco do rio Paranapanema, duas do rio Mogi-Guaçu e uma do Rio do (Tabela 01). Como grupo irmão para as análises filogenéticas foram utilizadas as espécies H. ancistroides, H. paulinus e H. iheringii provenientes da bacia do Alto Paraná, e Rhamdia quelen (Heptapteridae) foi utilizada como outgroup, num total de 31 indivíduos analisados. Figura 2: Rede hidrográfica da bacia do Alto rio Paraná, evidenciando os pontos onde as amostras foram coletadas. Tabela 1. Amostragens dos indivíduos analisados e seus respectivos pontos de coleta. Exemplares Bacia Sub-bacia Rios 1092 Alto Paraná Paranapanema Chavantes 1093 Alto Paraná Paranapanema Chavantes 1098 Alto Paraná Paranapanema Chavantes 1051 Alto Paraná Paranapanema Pirapó 1052 Alto Paraná Paranapanema Pirapó 14130 Alto Paraná Paranapanema Hortelã 14133 Alto Paraná Paranapanema Hortelã 14131 Alto Paraná Paranapanema Hortelã 31518 Alto Paraná Paranapanema Hortelã 31517 Alto Paraná Paranapanema Hortelã 10982 Alto Paraná Paranapanema Maringá 10983 Alto Paraná Paranapanema Maringá 10984 Alto Paraná Paranapanema Maringá 29800 Alto Paraná Paranapanema Taquará 10671 Alto Paraná Tietê Araguá 10672 Alto Paraná Tietê Araguá 10667 Alto Paraná Tietê Araguá 10669 Alto Paraná Tietê Araguá 10903 Alto Paraná Tietê Corumbataí 10882 Alto Paraná Tietê Corumbataí 19385 Alto Paraná Tietê Conchas 25930 Alto Paraná Mogi-guaçu Água Boa 1060 Alto Paraná Peixe Peixe 1061 Alto Paraná Peixe Peixe 1062 Alto Paraná Peixe Peixe 1063 Alto Paraná Peixe Peixe 1064 Alto Paraná Peixe Peixe 1553 Alto Paraná Mogi-guaçu Cachoeira de Emas 1554 Alto Paraná Mogi-guaçu Cachoeira de Emas 1555 Alto Paraná Mogi-guaçu Cachoeira de Emas 1556 Alto Paraná Mogi-guaçu Cachoeira de Emas 1557 Alto Paraná Mogi-guaçu Cachoeira de Emas Hypostomus paulinus Alto Paraná Paranapanema Pirapó Hypostomus iheringii Alto Paraná Rio do Peixe Rio do Peixe Hypostomus ancistroides Alto Paraná Tietê Ribeirão Claro Rhamdia quelen Alto Paraná Tietê Ribeirão Claro 3.2 Métodos 3.2.1 Extração de DNA: O DNA total foi obtido a partir de amostras de fígado, músculo ou brânquia, utilizando a técnica de Fenol-Clorofórmio-Álcool isoamílico (SAMBROOK 2001). 1. Preparar uma solução de lise contendo: Soluções Volume TNE 1x 300μL Tris-HCl 1M (pH 8,0) 30μL SDS 10% 20μL Proteinase K (20mg/mL) 25μL Volume final 3345μL 2. Inserir as amostras de tecido em eppendorfs contendo solução de lise recém preparada, em seguida agitar os tubos no vórtex por 15 segundos; 3. Deixar os tubos overnight em uma estuga a 37ºC, em seguida, adicionar 8μL de RNase 10mg/mL; 4. Deixar os tubos com RNase por 1 hora em uma estufa a 37ºC, agitando os tubos no vórtex a cada 30 minutos; 5. Levar os tubos para uma capela e adicionar 400μL de fenol: clorofórmio: álcool isoamílico (25: 24: 1); 6. Agitar os tubos no vórtex por 30 segundos, e em seguida centrifugá-los a 14.000 rpm por 10 minutos; 7. Transferir o sobrenadante (fase aquosa contendo o DNA) para outro tubo correspondente; 8. Adicionar 60μL de acetato de sódio 3M (pH 5,3), e misturar a solução; 9. Adicionar 600μL de etanol absoluto gelado e inverter o tubo algumas vezes; 10. Centrifugar os tubos a 14.000 rpm por 30 minutos, e descartar o sobrenadante sempre verificando se o precipitado de DNA continua aderido ao tubo; 11. Adicionar 150μL de etanol 70% a temperatura ambiente, e centrifugar o tubo a 14.000 rpm por 30 minutos; 12. Descartar o sobrenadante, e verificar novamente se precipitado continua aderido ao tubo; 13. Repetir os passos 11 e 12; 14. Secar os tubos contendo DNA em estufa a 37ºC por 30 minutos; 15. Ressuspender o DNA com 100μL de água Milli Q autoclavada, agitando os tubos delicadamente; 16. Manter o material em estufa a 37ºC por 30 minutos, e posteriormente transferi-los para geladeira (4ºC) e mante-los overnight para completa ressuspensão; 17. Armazenar as amostras em freezer (-20ºC). As amostras foram aplicadas em gel de agarose 1% corados com 2μL de SAYBER Safe (10.000X) (Invitrogen®), as amostras foram aplicadas juntamente com 1μL de tampão de corrida blue juice. A quantificação e avaliação da qualidade das foram realizadas através da visualização das bandas em um transiluminador de luz ultravioleta (Figura 3). Figura 3: Foto do gel de agarose 1%, evidenciando a qualidade das bandas de DNA extraído pela técnica Fenol-Clorofórmio-Álcool isoamílico. 3.2.2 Amplificação e sequenciamento A reação de amplificação por PCR do gene ATP sintetase 6 e 8 (ATPase 6/8) foi obtida a partir de um volume de 13,5μL de uma solução contendo: Solução Volume Mix PCR* (Quiagen) 6,25μL Água Milli Q 5,25μL Primer F 10μM 0,5μL Primer R 10μM 0,5μL DNA 1,0μL Volume final 13,5μL * Na solução de MIX PCR estão contidos os reagentes Taq DNA polimerase 5U, Tampão da enzima 10X, MgCl2 1,5 mM e dDNTP (dideoxidonucleotídeo trifosfato) 200μM. Para os genes ATPase 6/8 o programa de PCR consiste de um ciclo inicial de desnaturação a 94ºC por 40s, seguido de 35 ciclos a 94ºC por 30s, 55ºC por 40s para anelamento dos primers, 68ºC por 2 minutos, estendendo a cadeia, uma extensão final de 72ºC por 5 minutos, a reação foi realizada em um termociclador (EPPENDORF™) . A porção do gene amplificada corresponde aos primers L8331 (5’- AA GCR TYR GCC TTT TAA GC-3’) e H9236 (5’- GTT AGT GGT CAK GGG CTT GGR TC-3’), inclui sequências conservadas de tRNA (RNA transportadores) que flanqueiam este complexo de genes. Os segmentos de DNA amplificados nas reações de PCR foram visualizados em gel de agarose 1% corados com 2μL de SAYBER Safe (10.000X) (Invitrogen®), as amostras foram aplicadas juntamente com 1μL de tampão de corrida blue juice. As bandas foram visualizadas em um transiluminador de luz ultravioleta, e a quantificação do produto gênico foi realizada com marcadores de peso molecular Lambda ( ) DNA 50ng e 30ng (Figura 4). Figura 4: Foto do gel de agarose 1%, evidenciando a quantificação do produto de PCR ( 50 e 30) para o gene ATPase 6/8. Para o sequenciamento, foram utilizadas as amostras que possuíam por volta de 50ng de DNA/μL, estas amostras passaram pelo tratamento com a enzima EXOSAP (GE Healthcare) de acordo com o seguinte protocolo: 1. Adicionar em um tubo eppendorf 10μL de produto de PCR, 2μL da enzima EXOSAP e 2μL de água Milli Q autoclavada; 2. Levar os tubos ao termociclador em um ciclo de 1 hora a 37ºC e 15 minutos a 80ºC; 3. Manter as amostras no freezer (-20ºC). O DNA purificado foi enviado para sequenciamento na empresa MacroGen. As sequências obtidas foram analisadas e alinhadas através do programa BioEdit. 3.2.3 Análises Filogeográficas: A identificação da rede de haplótipos (nested clade) para avaliar a associação entre haplótipos e sua distribuição geográfica, foram inferidas pelo programa ANECA v.1.1 (Automation of Nested Clade Phylogeographic Analysis) (PANCHAL 2007). Neste programa automatizado foi incorporado o programa TCS v1.18 (CLEMENT et al. 2000). O programa TCS é utilizado para gerar redes de haplótipos usando parcimônia estatística (TEMPLETON et al. 1987). 3.2.4 Análises Filogenéticas e Relógio Molecular: A análise de saturação dos dados foi realizada no programa DAMBE 4.5.8 (XIA e XIE, 2001) plotando-se as transições (s) e transversões (v) contra a divergência genética estimada pelo modelo de evolução de sequências “Felsenstein 84”. As análises filogenéticas foram conduzidas através do programa MEGA 4.0 (Molecular Evolucionary Genetics Analysis) (TAMURA et al. 2007), neste programa foram determinadas as composições nucleotídicas das sequências obtidas, as distâncias genéticas e as árvores filogenéticas. Para a elaboração das árvores filogenéticas foram empregados os métodos de Neighbor-Joining (NJ), Maximum Parsimony (MP) e Minimun Evolution (ME), o teste de bootstrap (FELSENSTEIN 1985) foi empregado utilizando 1000 réplicas para cada método, este teste foi utilizado para dar suporte aos clados obtidos nas árvores filogenéticas. Para os métodos NJ e ME foi utilizado o modelo evolutivo Kimura 2-parametros (K2P) (KIMURA, 1980), para o método MP o modelo utilizado foi o tree by random addition (TBR). O cálculo da distância genética não corrigida “p” entre as sequências foi realizado no programa MEGA 4.0, possibilitando o cálculo da divergência entre as mesmas. A calibração relógio molecular foi realizada utilizando a taxa de evolução do gene ATPase 6/8 em peixes que corresponde a 1,3% de divergência nucleotídica por milhão de ano (Ma) (BERMINGHAM et al. 1997, PERDICES et al. 2002). 4- Resultados O alinhamento das sequências do gene ATPase 6/8 para as populações de H. strigaticeps mostrou a ocorrência de 842 pares de bases, sendo 789 são conservadas e 53 variáveis, 40 informativas para análise de Máxima Parcimônia. As sequências geradas possuem a seguinte composição média de nucleotídeos: 28,7(T), 29,5 (C), 30 (A) e 11,8 (G), estes resultados se enquadram na composição nucleotídica mais frequente para genes mitocondriais, onde a quantidade de guanina (G) é menor do que as outras bases. A análise de saturação mostrou que os dados referentes às transições e transversões não estão saturados (Figura 5). Figura 5: Gráfico de transição (linha “s”) e transversão (linha “v”), mostrando que os dados não se apresentam saturados. As análises filogenéticas mostraram que as populações de H. strigaticeps formam uma unidade monofilética composta por duas linhagens: “TG”, com representantes das populações dos rios Tietê, Mogi-guaçu e Rio do Peixe; e a linhagem “PP”, com representantes pertencentes ao rio Paranapanema. O clado H. strigaticeps tem como grupo irmão H. paulinus + H. iheringii, sendo H. ancistroides o grupo irmão primitivo do grupo analisado. Os exemplares provenientes da Cachoeira de Emas (Mogi-guaçu) se apresentam filogeneticamente mais distantes do clado H. strigaticeps do que o grupo H. paulinus + H. iheringii (Figuras 6, 7 e 8) As árvores geradas pelos diferentes métodos utilizados nas análises de NJ, ME e MP possuem topologia semelhantes, diferindo apenas nos valores de bootstrap e na posição de alguns clados. Na árvore filogenética gerada pelo método NJ na linhagem “PP” foram observados três diferentes clados: o clado “a” encontra-se os indivíduos provenientes dos pontos de Maringá e Pirapó, no clado “b” os indivíduos de Taquará e Chavantes e no clado “c” os indivíduos do rio Hortelã. Na linhagem “TG” também são observados três diferentes clados: ”d” com os indivíduos provenientes dos pontos de Corumbataí e Mogi-guaçu, o clado “e” com os indivíduos de Araguá e o clado “f” com os indivíduos provenientes do Rio do Peixe (Figura 5). Para o método ME a topologia observada para a linhagem “PP” é congruente a observada para o método NJ. Já a linhagem “TG” possui uma topologia diferente, no clado “d” encontram-se os indivíduos provenientes do Rio do Peixe, no clado “e” estão os indivíduos do Corumbataí e Mogi-guaçu e o clado “f” com os indivíduos do Araguá (Figura 6). A árvore gerada pelo método de MP possui topologia bastante distinta das árvores obtidas pelos outros métodos quando observadas as posições dos clados. Na linhagem “PP” são observados os clados “a” com os indivíduos do rio Hortelã, o clado “b” com os indivíduos de Taquará e Chavantes e o clado “c” com os indivíduos de Maringá e Pirapó. A linhagem “TG” é forma da pelos clados “d” formado pelos indivíduos do Rio do Peixe, clado “e” com os indivíduos do Corumbataí e Mogi-guaçu e pelo clado “f” com os indivíduos do Araguá (Figura 7). Figura 6: Árvore filogenética gerada no programa MEGA 4.0 utilizando o método NJ, evidenciando as linhagens “PP” e “TG” com seus respectivos clados. Figura 7: Árvore filogenética gerada no programa MEGA 4.0 utilizando o método ME, evidenciando as linhagens “PP” e “TG” com seus respectivos clados. Figura 8: Árvore filogenética gerada no programa MEGA 4.0 utilizando o método MP, evidenciando as linhagens “PP” e “TG” com seus respectivos clados. A distância genética “p” observada para as linhagens “PP” e “TG” foi de 0,2% e 0,1% respectivamente. Enquanto a distância genética entre estas duas linhagens foi de aproximadamente 1%. Em relação aos outros grupos as linhagens “PP” e “TG” apresentaram os valores de distância genética esperados para diferentes espécies de um mesmo gênero, que é por volta de 4% de divergência, como mostra a Tabela 2. Os indivíduos provenientes da Cachoeira de Emas apresentaram valores de divergência muito grandes em relação às linhagens “PP” e “TG”, 4,4% e 4,3% respectivamente, sendo que a divergência dentro deste grupo é de 0,6%. Tabela 2. Valores de divergência genética (%) entre cada grupo. 1. 2. 3. 4. 5. 1. TG - - - - - 2. PP 1% - - - - 3. Cachoeira de Emas 4,4% 4,3% - - - 4. H. paulinus + H. iheringii 4,1% 4% 2,4% - - 5. H. ancistroides 5% 4,7% 6,2% 6% - A análise filogeográfica mostrou a ocorrência de oito haplótipos (A-H), sendo o haplótipo “A” considerado ancestral para os exemplares analisados (Figura 9), neste haplótipo encontram-se os representantes de duas populações (Araguá e Conchas), ambas pertencentes à bacia do rio Tietê. Os haplótipos A, C e F possuem a maior frequência (18,51%). Dos oito haplótipos encontrados, cinco (D, E, F, G e H) estão na sub-bacia do Paranapanema, dois (A e C) estão na sub-bacia do Tietê, um (B) exclusivo da sub-bacia do Rio do Peixe e um (C) na sub-bacia do rio Grande (rio Mogi-guaçu) (Tabela 3). Figura 9: Rede de haplótipos gerada no programa TCS, identificando suas correspondentes sub-bacias, em evidência o haplótipo “A” considerado ancestral para as populações analisadas. Tabela 3. Distribuição dos haplótipos, nas sub-bacias e o número de indivíduos em cada haplótipo. Haplótipos Mogi-guaçu Tietê Peixe Paranapanema Total A - 5 - - 5 B 1 2 - - 3 C - - 5 - 5 D - - - 3 3 E - - - 4 4 F - - - 5 5 G - - - 1 1 H - - - 1 1 Total 1 7 5 14 27 Os indivíduos amostrados em Cachoeira de Emas formaram uma rede haplótipos separada dos outros H. strigaticeps (Figura 10). Esta rede é forma da por quatro haplótipos (1-4) sendo que o haplótipo 1, com dois indivíduos, é considerado ancestral, sendo que os demais haplótipos possuem um indivíduo cada. O haplótipo “4” se apresentou relativamente distante dos demais, apresentando um valor de divergência de 1,3% dos demais indivíduos. Figura 10: Rede de haplótipos gerada no programa TCS, dos exemplares provenientes de Cachoeira de Emas, em evidência o haplótipo “1” considerado ancestral para o grupo. O calculo do relógio molecular foi calculado levando em consideração os valores de divergência genética obtidos para cada grupo (Tabela 4). A análise mostrou que a separação das linhagens “PP” e “TG” ocorreu a cerca de 769 mil anos no período quaternário, em relação os demais grupos, as duas linhagens se mostraram separadas por um intervalo de tempo maior do que 3Ma durante o período quaternário. Tabela 4. Valores (em milhões de anos) obtidos com o cálculo do relógio molecular, para os valores de divergência genética encontrados, considerando a taxa de mutação de 1,3%/Ma para ATPase 6/8. 1. 2. 3. 4. 5. 1. TG - - - - - 2. PP 0,769 - - - - 3. Cachoeira de Emas 3,3 3,3 - - - 4. H. paulinus + H. iheringii 3 3 1,8 - - 5. H. ancistroides 3,8 3,6 4,6 4,6 - 5- Discussão 5.1 História evolutiva de Hypostomus strigaticeps no Alto rio Paraná A grande semelhança morfológica existente entre os representantes do gênero Hypostomus evidencia a importância dos estudos relacionados aos marcadores moleculares voltados a identificação e a caracterização de espécies e populações deste gênero. Em H. strigaticeps a hipótese da existência de um complexo de espécies não foi corroborada, para os exemplares amostrados nas sub-bacias do Paranapanema, Tietê e Mogi-guaçu (Água Boa), o que é evidenciado pelo baixo valor da distância genética entre as populações analisadas no presente trabalho. Este resultado indica que os indivíduos das populações analisadas correspondem à espécie em questão. As análises filogenéticas mostraram que estas populações formam duas linhagens monofiléticas, as linhagens “TG” com exemplares das sub-bacias do rio Tietê, Mogi-guaçu e Peixe, e a linhagem “PP” com exemplares da sub-bacia do Paranapanema, tais resultados são embasados no alto valor de bootstrap na raiz da árvore, obtidos nos programas NJ, ME e MP. Estes resultados foram reforçados pela análise filogeográfica que mostrou a ocorrência de dois clados, os exemplares pertencentes a estes clados (Tietê e Paranapanema) correspondem aos exemplares encontrados nas linhagens “TG” e “PC” da análise filogenética. Ainda na análise filogeográfica, pode-se observar a existência de uma população ancestral pertencente ao rio Tietê, indicando que este foi o ponto inicial de dispersão das populações analisadas neste trabalho para as demais sub-bacias do Alto rio Paraná. Os resultados observados, tanto na análise filogenética, quanto na análise filogeográfica são correspondentes, uma vez que a separação de determinadas populações em duas linhagens, “PP” e “TG”, foi observada em ambas as análises. Sendo que na rede de haplótipos estas duas linhagens foram separadas por seis haplótipos que não puderam ser identificados nas populações analisadas. Um aumento do número amostral permitiria a identificação destes haplótipos. A análise do relógio molecular, considerando que a taxa de mutação para o gene ATPase 6/8 em peixes é de 1,3%/Ma (BERMINGHAM et al. 1997, PERDICES et al. 2002), mostrou com a divergência genética de 1% entre as duas linhagens, “TG” e “PP”, que a separação destas linhagens provavelmente ocorreu a cerca de 769 mil anos durante o período do Quaternário. Tais resultados indicam que H. strigaticeps forma uma unidade monofilética na região do Alto rio Paraná. Em relação às outras espécies do gênero analisadas, H. strigaticeps apresentou uma divergência genética de cerca de 4% do grupo H. iheringii + H. paulinus. Tais valores indicam que a separação de H. strigaticeps destas duas espécies ocorreu no período Terciário a cerca de 3.3 milhões de anos. Em relação à H. ancistroides, H. strigaticeps apresentou uma divergência genética de 5 %, o que indica que a separação destas espécies ocorreu também no Terciário, porém a cerca de 3,8 milhões de anos. 5.2 Divergência genética de H. strigaticeps na Cachoeira de Emas A divergência genética dos exemplares identificados como H. strigaticeps na região de Cachoeira de Emas (Mogi-guaçu) com os demais exemplares analisados, é relativamente grande, 4,4%. Este alto valor de divergência poderia sugerir que os peixes provindos desta região, não corresponderiam à espécie H. strigaticeps. Os resultados também indicam que os peixes desta região são geneticamente mais próximos do grupo H. iheringii + H. paulinus, sendo que a divergência genética entre estes grupos foi de apenas 2,4%. A hipótese de que os peixes da região de Cachoeira de Emas não correspondem a H. strigaticeps, pode ser reforçada pelas análises filogenéticas e fitogeográficas. Observando a topologia das árvores filogenéticas pode-se observar que o grupo pertencente à Cachoeira de Emas se apresentou como grupo irmão dos exemplares provenientes das outras sub-bacias, não tendo uma relação próxima com as linhagens, “PP” e “TG”, formadas pelos peixes das outras sub-bacias. Na análise fitogeográfica os peixes de Emas formaram uma rede de haplótipos totalmente separada dos demais exemplares, o que evidencia ainda mais a baixa relação entre estes grupos. No trabalho realizado por Martinez (2009), foram encontradas divergências no número diplóide de exemplares identificados como H. strigaticeps na sub-bacia do Mogi-guaçu em Pirassununga (Cachoeira de Emas). O número diplóide destes exemplares variou de 2n=72 e 2n=74. Os resultados obtidos no presente trabalho para este grupo de peixes em Cachoeira de Ema podem explicar as divergências encontradas por Martinez (2009), de forma que a ocorrência desta variação de número diplóide pode ter ocorrido por se tratar de duas espécies distintas. Na análise fitogeográfica realizada para o grupo de Cachoeira de Emas, o haplótipo “4” se apresentou relativamente distante dos demais, estando separados por outros nove haplótipos e apresentando um valor de divergência de 1,3%. Estes dados indicam que mesmo dentro deste grupo, alguns indivíduos ainda apresentam altos valores de divergência entre si, desta forma uma maior amostragem na região de Cachoeira de Emas e uma refinada revisão taxonômica para este grupo se torna necessária, para a correta compreensão dos padrões filogenéticos e filogeográficos deste grupo de peixes nesta região, assim como determinar o seu correto status taxonômico. 5.3 Biogeografia de H. strigaticeps no Alto rio Paraná O sistema do rio Paraná teve seu crescimento inicial pelo norte, capturando parte da bacia Amazonas-Orinoco, sendo que o divisor moderno que separou estas drenagens foi estabelecido a cerca de 30 milhões de anos (LUNDBERG et al. 1998). Em relação ao gênero Hypostomus, o estudo biogeográfico realizado por Montoya-Burgos (2003), mostrou que a ocorrência do gênero, na bacia do Alto rio Paraná, ocorreu a cerca de 11 milhões de anos, sendo que estes indivíduos ainda não formariam uma unidade monofilética, o que indica que esta região não sofreu colonizações de outras bacias. Eventos como o encurtamento e o alargamento das placas tectônicas podem ter afetado as margens continentais e consequentemente favorecido a cisão ou a conexão das bacias adjacentes (LUNDBERG et al. 1998), tais eventos são ditos como vicariantes, pois afetam a distribuição e a diversidade de peixes da região neotropical, incluindo as drenagens pertencentes ao Alto Paraná. Dessa forma, as divergências genéticas encontradas entre as populações de H. strigaticeps do Alto Paraná, principalmente que ocorrem na sub-bacia do rio Paranapanema (linhagem PP), podem ter ocorrido devido a fenômenos de vicariância que ocorreram nesta localidade, fazendo com que ocorresse a divergência da espécie em duas linhagens isoladas PP e TG. A hipótese de que a distribuição da espécie está restrita a sub-bacia do rio Tietê, conforme foi citado em Weber (2003), não pode ser validada, com os dados obtidos no presente trabalho. Isto é embasado tanto nos resultados obtidos pela análise filogenética, que mostram que todas as populações das quatro sub-bacias analisadas correspondem à H. strigaticeps, quanto pelos resultados da análise filogeográfica, que mostram que apesar da população ancestral corresponder à população do rio Tietê, ocorreu uma distribuição da espécie para outras sub-bacias do Alto rio Paraná. Com isto, pode-se concluir que H. strigaticeps ocorre não somente na sub-bacia do rio Tietê, mas está distribuída de forma mais abrangente na bacia do Alto rio Paraná. A rede de Haplótipos gerada reflete a geografia da rede hidrográfica do Alto rio Paraná, a população ancestral iniciou seu processo de dispersão para as sub-bacias do rio Grande (rio Mogi-guaçu) e Peixe, em seguida colonizando a sub-bacia do Paranapanema. 6- Conclusão - Os resultados obtidos no presente trabalho, mostram que as populações analisadas nas sub-bacias do Paranapanema, Tietê e Mogi-guaçu (Água Boa), correspondem à espécie Hypostomus strigaticeps. - As populações analisadas formam uma unidade monofilética no Alto rio Paraná, composta por duas linhagens. - A distribuição da espécie abrange toda a bacia do Alto Paraná, não sendo restrita ao rio Tietê. - Os resultados obtidos para os exemplares provenientes de Cachoeira de Emas, sugerem que este grupo não corresponda à espécie H. strigaticeps. De modo que se torna necessária uma maior amostragem para estabelecer as relações dos peixes desta região, assim como uma revisão taxonômica para este grupo. 7- Referências AB’SABER, N.A. Megageomorfologia do território brasileiro. In Geomorfologia do Brasil (S.B. Cunha e A.J.T. Guerra, eds.). Bertand Brasil, Rio de Janeiro, p. 71-106, 1998. ARMBRUSTER, J.W. Phylogenetic relationships of the sucker-mouth armored catfishes (Loricariidae) with particular emphasis on the Hypostominae and Ancistrinae. Zoological Journal of the Linnean Society, v. 141: 1-80, 2004. ARTONI, R.F.; e BERTOLLO, L.A.C. Trends in the karyotype evolution of Loricariidae fish (Siluriformes). Hereditas, v. 134: 201-210, 2001. AVISE, J.C. Phylogeography: the history and formation of species. Harvard University Press, London, 2000. AVISE, JC. Molecular markers, natural history and evolution. 2 ed. Massachusetts: Sinauer Associates, p. 541, 2004. BATISTA, J.C. e ALVES-GOMES, J. 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