UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JULIO DE MESQUITA FILHO" FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS CÂMPUS DE ARARAQUARA Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Lígia de Souza Fernandes DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E COMPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES PARA APLICAÇÃO TÓPICA CONTENDO CURCUMINA: ESTUDOS DE EFETIVIDADE E SEGURANÇA DAS FORMULAÇÕES Araraquara (SP) 2017 LÍGIA DE SOUZA FERNANDES DESENVOLVIMENTO, CARACTERIZAÇÃO E COMPARAÇÃO DE FORMULAÇÕES PARA APLICAÇÃO TÓPICA CONTENDO CURCUMINA: ESTUDOS DE EFETIVIDADE E SEGURANÇA DAS FORMULAÇÕES Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Maria Virgínia Scarpa Coorientador: Prof. Dr. Marcelo Gonzaga de Freitas Araújo Araraquara (SP) 2017 Lígia de Souza Fernandes Dedicatória Lígia de Souza Fernandes Dedico este trabalho, com todo meu amor e carinho, à Deus, minha coragem e esperança; aos meus pais, ao meu irmão e às minhas avós, por todo amor, carinho, paciência, compreensão, incentivo e principalmente por acreditarem em mim. Agradecimentos Lígia de Souza Fernandes AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente à Deus, que sempre iluminou о mеυ caminho. Аоs meus pais, irmão e avós, pоr acreditarem еm mіm e por sempre me ajudarem. Mãe, sеυ carinho e companheirismo sempre me deram esperança pаrа seguir em frente. Pai, você é o meu porto seguro e o meu melhor amigo. Meu irmão, companheiro de tantas brincadeiras, quero agradecer por ser meu grande amigo. Avós, é muito bom ter vocês em minha vida! Sou abençoada com uma linda família! A segurança e a certeza dе qυе vocês estão comigo em todas as minhas caminhadas me ajudaram a cumprir esta etapa e me sinto feliz por compartilhar este momento com vocês. À minha querida profa. Dra. Maria Virgínia Scarpa, pela orientação, paciência, convivência e principalmente pela amizade. Quero agradecer imensamente por ter acreditado em mim e por estar ao meu lado. Hoje, além de orientadora, considero minha amiga! Muito obrigada por todo conhecimento compartilhado, pelas risadas, conselhos, conversas e cafés! Ao prof. Dr. Marcelo Gonzaga de Freitas Araújo, pela coorientação, pela paciência e pelos ensinamentos que contribuíram para meu crescimento científico. À profa. Dra. Ana Marisa Fusco Almeida e Dr. Gustavo Rossanezi, pelas sugestões feitas no exame geral de qualificação, que contribuíram para o aperfeiçoamento do trabalho. À profa. Dra. Leila Aparecida Chiavacci, profa. Dra. Hérida Regina Nunes Salgado, prof. Dr. Anselmo Gomes de Oliveira, prof. Dr. Marcos Antonio Corrêa, prof. Dr. Celso Valentim Santilli e Dr. Selma Gutierrez Antonio por Agradecimentos Lígia de Souza Fernandes disponibilizarem equipamentos e matérias primas de seus laboratórios para a realização de meus experimentos. Às minhas grandes amigas, que conheci durante a realização deste trabalho e que se tornaram muito importantes em minha vida, Bianca Malfará, Fátima Rodrigues e Bianca Rafael Marco Segatto, agradeço muito pela amizade, conversas, conselhos, risadas e incentivo de todas vocês. À Caroline Magnani Spagnol, Bruno Leonardo Caetano, Eloísa Barbel Manaia, Marina Paiva Abuçafy, Felipe Hugo Alencar Fernandes, Márcia Helena Oyafuso, Flávia Lima Ribeiro Maccari, Flávio Alexandre Carvalho, Danubia Gava e Neide Perruci, por toda paciência e conhecimentos compartilhados, que contribuíram com o meu aprendizado. Às funcionárias da Seção de Pós-Graduação Cláudia, Christiane, Aniele e Daniela pela paciência, atenção e apoio. Aos funcionários da Biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara – UNESP. À todos aqueles que caso esqueci de citar e que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigada! À Croda do Brasil Ldta pela doação das matérias primas utilizadas neste trabalho. À CAPES pelo suporte financeiro. Epígrafe Lígia de Souza Fernandes “Nunca se afaste de seus sonhos. Porque se eles forem, você continuará vivendo, mas terá deixado de existir”. (Mark Twain) Lígia de Souza Fernandes LISTA DE FIGURAS Figura 1. Estrutura química da curmina (CAS: 458-37-7). ............................................ 16 Figura 2. Emulsão e tipos de separação em emulsões. ............................................... 19 Figura 3. Ilustração de um diagrama de fases pseudoternário. .................................... 20 Figura 4. Estrutura das microemulsões. ........................................................................ 21 Figura 5. Ilustração esquemática das mesofases líquido-cristalinas: (1) mesofase lamelar, (2A) mesofase hexagonal, (2B) mesofase hexagonal reversa, (3): mesofase cúbica de monoleolato de glicerila-água. ....................................................................... 22 Figura 6. Célula de difusão utilizada para estudos de liberação in vitro. Disponível em: . Acesso em abril 2017. .......................................... 63 Figura 7. Esquema de tratamento do ensaio anti-CVV in vivo. .................................... 68 Figura 8. Classificação visual dos sistemas formados: (A) – Sistema líquido opaco; (B) – Sistema líquido translúcido; (C) – Sistema visoso opaco; (D) – Sistema viscoso translúcido; (E) – Separação de fases. .......................................................................... 73 Figura 9. Diagrama de fases pseudoternário constituído por triglicerídeo cáprico/caprílico (FO), fosfatidilcolina de soja e macrogolglicerol ricinolato - proporção 50:50 (T) e tampão acetato de sódio pH 4,5 (FA); regiões formadas e sistema escolhido para o estudo (ponto F27). ............................................................................. 73 Figura 10. (A) - Fotomicrografia sob luz polarizada da C com aumento de 10x; (B) - Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação C com aumento de 20x; (C) - Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação C_CUR1% com aumento de 10x; (D) - Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação C_CUR1% com aumento de 20x. ......................................................................................................................................... 76 Figura 11. (A) - Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação F27 com aumento de 10x; (B) - Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação F27 com aumento de 20x; (C) - Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação F27_CUR1% com aumento de 10x; (D) - Fotomicrografia sob luz polarizada da formulação F27_CUR1% com aumento de 20x. ..................................................................................................... 77 Figura 12. Difratogramas dos sistemas C e C_CUR1% e seus componentes. ........... 79 Figura 13. Difratogramas dos sistemas F27 e F27_CUR1% e seus components. ...... 81 Figura 14. Curvas de SAXS dos sistemas C, C_CUR1%, F27 e F27_CUR1%. .......... 83 Figura 15. Ensaio de curva de fluxo e de viscosidade em função da taxa de cisalhamento (Hz), à temperatura de 30 ºC ± 1, das formulações C, C_CUR1%, F27 e F27_CUR1%. .................................................................................................................. 86 Figura 16. Ensaio da varredura de tensão à temperatura de 30 ºC ± 1 dos sistemas C, C_CUR1%, F27 e F27_CUR1%. .................................................................................... 91 Lígia de Souza Fernandes Figura 17. Ensaio de varredura de freqüência à temperatura de 30 ºC ± 1 dos sistemas C, C_CUR1%, F27 e F27_CUR1%................................................................. 92 Figura 18. Cromatograma obtido com a injeção da solução preparada a partir de C.. 96 Figura 19. Cromatograma obtido com a injeção da solução preparada a partir de F27. ......................................................................................................................................... 96 Figura 20. Cromatograma obtido com a injeção da fase móvel. .................................. 96 Figura 21. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de C_CUR1%. . 97 Figura 22. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de F27_CUR1%. ......................................................................................................................................... 97 Figura 23. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de C_CUR1% em água, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. .................................. 98 Figura 24. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de F27_CUR1% em água, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ............................ 98 Figura 25. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de C_CUR1% em hidróxido de sódio 0,1 M, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ... 98 Figura 26. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de F27_CUR1% em hidróxido de sódio 0,1 M, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ......................................................................................................................................... 99 Figura 27. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de C_CUR1% em ácido clorídrico 0,1 M, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ........ 99 Figura 28. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de F27_CUR1% em ácido clorídrico 0,1 M, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. .. 99 Figura 29. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra C_CUR1% em peróxido de hidrogênio 10 V, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ....................................................................................................................................... 100 Figura 30. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra F27_CUR1% em peróxido de hidrogênio 10 V, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ....................................................................................................................................... 100 Figura 31. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra C_CUR1% exposta à luz UV por 3 horas em balão volumétrico incolor. ....................................... 100 Figura 32. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra F27_CUR1% exposta à luz UV por 3 horas em balão volumétrico incolor. ....................................... 101 Figura 33. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de C em água, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ........................................... 103 Figura 34. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de F27 em água, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ........................................... 103 Lígia de Souza Fernandes Figura 35. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de C em hidróxido de sódio 0,1 M, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar.................. 104 Figura 36. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de F27 em hidróxido de sódio 0,1 M, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. . 104 Figura 37. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de C em ácido clorídrico 0,1 M, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ............... 104 Figura 38. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra de F27 em ácido clorídrico 0,1 M, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ............... 105 Figura 39. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra C em peróxido de hidrogênio 10 V, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. ............... 105 Figura 40. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra F27 em peróxido de hidrogênio 10 V, após 3 horas de exposição em balão volumétrico âmbar. .......... 105 Figura 41. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra C exposta à luz UV por 3 horas em balão volumétrico incolor. ............................................................. 106 Figura 42. Cromatograma obtido com a injeção da solução amostra F27 exposta à luz UV por 3 horas em balão volumétrico incolor. ............................................................. 106 Figura 43. Curva analítica obtida com injeções de soluções padrão de curcumina diluída em metanol, equação da reta (y) e o respectivo coeficiente de correlação (R2). ....................................................................................................................................... 107 Figura 44. Curva da analítica acrescida das concentrações próximas ao suposto limite de quantificação. ........................................................................................................... 112 Figura 45. Cromatogramas obtidos com a injeção das soluções padrão de curcumina nas concentrações de 0,076; 0,15 e 0,25 µg/mL. ........................................................ 113 Figura 46. Formulção C_CUR1% (A) e formulação F27_CUR1% (B) após teste de centrifugação (3000 rpm por 30 minutos). ................................................................... 116 Figura 47. Fotomicrografia sob luz polarizada do sistema C_CUR1% na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade (análise 15 d), com aumentos de 10x e 20x. ....................................................................................................................................... 118 Figura 48. Fotomicrografia sob luz polarizada do sistema F27_CUR1% na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade (análise 15 d), com aumentos de 10x e 20x. ................................................................................................................................ 119 Figura 49. Ensaio de curva de fluxo em função da taxa de cisalhamento (Hz), à temperatura de 30 ºC ± 1, dos sistemas C_CUR1% e F27_CUR1%, na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar (análise 15 d). .............................. 120 Figura 50. Gráficos de viscosidade em função da taxade cisalhamento à temperatura de 30 ºC ± 1, dos sistemas C_CUR1% e F27_CUR1%, na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar (análise 15 d). ............................................ 121 Lígia de Souza Fernandes Figura 51. Ensaio da varredura de tensão à temperatura de 30 ºC ± 1 dos sistemas C_CUR1% e F27_CUR1%, na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar (análise 15 d). .............................................................................................. 124 Figura 52. Ensaio da varredura de freqüência à temperatura de 30 ºC ± 1 dos sistemas C_CUR1% e F27_CUR1%, na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar (análise 15 d). .......................................................................... 125 Figura 53. Injeção em CLAE do meio receptor selecionado, utilizando as mesmas condições do método previamente validado. ............................................................... 129 Figura 54. Curva analítica obtida com injeções de soluções padrão de curcumina dissolvida em metanol, utilizando as mesmas condições cromatográficas descritas no item 5.3. ......................................................................................................................... 130 Figura 55. Curva analítica obtida com injeções de soluções padrão de curcumina dissolvida no meio receptor escolhido, utilizando as mesmas condições cromatográficas descritas no item 5.3. ......................................................................... 130 Figura 56. Perfil de liberação in vitro (média Q real (µg/cm2) da curcumina nas formulações C_CUR1% e F27_CUR1% (média de n=5)............................................. 133 Figura 57. Secção do epitélio vaginal de ratas submetidas aos tratamentos com os sistemas C_CUR0,01%, C_CUR0,1%, C_CUR1% e seus respectivos controles (aumento 100x). A: grupo infectados e sem tratamento; B: grupo controle (sistema sem curcumina); C: controle positivo (nistatina); D: controle positivo (clotrimazol); E: C_CUR0,01%; F: C_CUR0,1%; G: C_CUR1%; H: grupo sem infecção. .................... 142 Figura 58. Efeito dos sistemas F27_CUR0,01%, F27_CUR0,1% e F27_CUR1% na carga fúngica vaginal de ratas infectadas com Candida albicans e seus respectivos controles. Infectados e sem tratamento (losango preenchido), F27 (triângulo preenchido), controle positivo clotrimazol (círculo). Dose 1: F27_CUR0,01% (círculo preenchido), Dose 2: F27_CUR0,1% (quadrado preenchido), Dose 3: F27_CUR1% (quadrado). Dados estão expressos como media  desvio padrão (n=6). *Diferença estatisticamente significativa comparados aos valores obtidos no dia 1 (p<0.05). ..... 146 Lígia de Souza Fernandes LISTA DE TABELAS Tabela 1. Composição do sistema emulsionado. .......................................................... 44 Tabela 2. Composição das soluções receptoras avaliados. ......................................... 61 Tabela 3. Grupos experimentais e protocolos para avaliação da atividade das formulações desenvolvidas contendo curcumina no tratamento da candidíase vulvovaginal (CVV).......................................................................................................... 69 Tabela 4. Valores de qmáx e razões entre as distâncias interplanares para os sistemas C e C_CUR1%. ............................................................................................................... 83 Tabela 5. Valores de qmáx e razões entre as distâncias interplanares para os sistemas F27 e F27_CUR1%. ........................................................................................................ 84 Tabela 6. Cálculo da área de histerese para as curvas de fluxo, à temperatura de 30 ºC ± 1, dasformulações C, C_CUR1%, F27 e F27_CUR1%. ........................................ 87 Tabela 7. Valores de viscosidade aparente mínima para os sistemas C, C_CUR1%, F27 e F27_CUR1%. ........................................................................................................ 88 Tabela 8. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) dos sistemas estudados. ....................................................................................................................... 89 Tabela 9. Análise mais detalhada dos valores G’ e G’’ do teste oscilatório para as formulações. .................................................................................................................... 93 Tabela 10. Análise quantitativa dos módulos G’ (módulo de armazenamento) e G’’ (módulo de perda) e parâmetros viscoelásticos dinâmicos da mucina 0,15% e das misturas C_CUR1% com mucina 0,15% e F27_CUR1% com mucina 0,15%. ............. 94 Tabela 11. Resultado do teor das amostras C_CUR1% expostas às diferentes condições de estresse. ................................................................................................. 101 Tabela 12. Resultado do teor das amostras F27_CUR1% expostas às diferentes condições de estresse. ................................................................................................. 102 Tabela 13. Dados da linearidade obtida com as injeções de soluções padrão de curcumina em metanol. ................................................................................................. 108 Tabela 14. Resultados obtidos na análise da precisão com amostra C_CUR1%, feita pelo mesmo analista. .................................................................................................... 109 Tabela 15. Resultados obtidos na análise da precisão com amostra F27_CUR1%, feita pelo mesmo analista. .................................................................................................... 109 Tabela 16. Resultados obtidos na análise da precisão intermediária com amostra C_CUR1%, feita por analistas diferentes e em diferentes dias. .................................. 110 Tabela 17. Resultados obtidos na análise da precisão intermediária com amostra F27_CUR1%, feita por analistas diferentes e em diferentes dias. .............................. 111 Lígia de Souza Fernandes Tabela 18. Valores obtidos no ensaio de exatidão utilizando os sistemas C_CUR0,01%, C_CUR0,1% e C_CUR1%. .................................................................. 114 Tabela 19. Valores obtidos no ensaio de exatidão utilizando amostras F27_CUR1%. ....................................................................................................................................... 115 Tabela 20. Áreas de histerese das curvas de fluxo dos sistemas C_CUR1% e F27_CUR1%, na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar (análise 15 d). ............................................................................................................... 121 Tabela 21. Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) dos sistemas C_CUR1% e F27_CUR1%, na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar (análise 15 d). .............................................................................................. 122 Tabela 22. Valores de viscosidade aparente mínima para os sistemas C_CUR1% e F27_CUR1%, na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar (análise 15 d). ............................................................................................................... 122 Tabela 23. Análise quantitativa dos módulos G’ e G’’ para os sistemas C_CUR1%, na análise inicial e após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar (análise 15 d). .... 126 Tabela 24. Resultados do teor de curcumina nas formações C_CUR1% e F27_CUR1% submetidas ao estudo de estabilidade preliminar. ................................ 127 Tabela 25. Resultado da porcentagem solúvel de curcumina nos meios receptores testados por CLAE. ....................................................................................................... 128 Tabela 26. Liberação da curcumina na formulação C_CUR1%. ................................. 131 Tabela 27. Liberação da curcumina na formulação F27_CUR1%. ............................. 132 Tabela 28. Aplicação dos modelos matemáticos de cinética de liberação para o sistema C_CUR1%. ...................................................................................................... 134 Tabela 29. Aplicação dos modelos matemáticos de cinética de liberação para o sistema F27_CUR1%. .................................................................................................. 134 Tabela 30. CIM da curcumina sobre diferentes cepas de Candida sp. ...................... 137 Tabela 31. Atividade antifúngica da curcumina contra C. albicans ATCC 10231 com e sem a presença de ergosterol exógeno. ...................................................................... 138 Tabela 32. Número de animais infectados nos diferentes dias de tratamento com os sistemas C_CUR0,01%, C_CUR0,1% e C_CUR1% e seus respectivos controles. ... 140 Tabela 33. Quantificação da carga fúngica nos fluidos vaginais dos animais tratados com os sistemas C, C_CUR0,01%, C_CUR0,1% e C_CUR1% e seus respectivos controles. ....................................................................................................................... 141 Tabela 34. Número de animais infectados nos diferentes dias de tratamento com os sistemas F27, F27_CUR0,01%, F27_CUR0,1% e F27_CUR1% e seus respectivos controles. ....................................................................................................................... 144 Lígia de Souza Fernandes Tabela 35. Quantificação da carga fúngica nos fluidos vaginais dos animais tratados com os sistemas F27_CUR0,01%, F27_CUR0,1% e F27_CUR1% e seus respectivos controles. ....................................................................................................................... 145 Lígia de Souza Fernandes LISTA DE ABREVIAÇÕES CFM - Concentração fungicida mínima SLT - Sistema líquido translúcido SVT- Sistema viscoso translúcido SLO - Sistema líquido opaco SVO - Sistema viscoso opaco SF - Separação de fases SAXS - Small Angle X-Ray Scattering (Espalhamento de raios-X de baixo ângulo) DRX – Difração de raios-X MPL - Microscopia de luz polarizada CVV - Candidíase vulvovaginal CVVR - Candidíase vulvovaginal recorrente CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência pH - Potencial hidrogeniônico HCL - Ácido clorídrico NaOH – Hidróxido de sódio TCC - Cloreto de trifeniltetrazólio CSD - Caldo Sabouraud Dextrose ASD - Agar Sabouraud Dextrose TCM - Triglicerídeo de cadeia média CIM - Concentração inibitória mínima FDA - Food and Drug Administration DAD - Diode array detector HIV - Vírus da imunodeficiência humana HPLC - High performance liquid chromatography ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária UV - Ultravioleta C - Sistema emulsionado C_CUR0,01% - Sistema emulsionado contendo 0,01% de curcumina C_CUR0,1% - Sistema emulsionado contendo 0,1% de curcumina C_CUR1% - Sistema emulsionado contendo 1% de curcumina CEUA - Conselho de Ética do Uso de Animais Lígia de Souza Fernandes UFC - Unidades formadoras de colônias FO - Fase oleosa FA - Fase aquosa G’ - Módulo de armazenamento G” - Módulo de perda F27 - Sistema pseudoternário F27_CUR0,01% - Sistema pseudoternário contendo 0,01% de curcumina F27_CUR0,1% - Sistema pseudoternário contendo 0,1% de curcumina F27_CUR1,0% - Sistema pseudoternário contendo 1% de curcumina USP - United States Pharmacopoeia 3D - Tridimensional Análise 15 d - Análise após 15 dias de estudo de estabilidade preliminar UV-Vis - Ultravioleta-Visível RE - Resolução UFSJ - Universidade Federal de São João Del-Rei (MG) i.p. - Intraperitonial ANOVA - Análise de variância CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute ATCC - American Type Culture Collection LQ - Limite de quantificação DP - Desvio padrão CV - Coeficiente de variação M - Média FR - Fator resposta C. albicans - Candida albicans GRAS - Generally Recognized As Safe EUA - Estados Unidos da América DNA - Ácido desoxirribonucleico ROS - Espécies reativas do oxigênio EEP - Epitélio estratificado pavimentoso HPV - Human papilomavirus ISO - International Organization for Standardization INMETRO - Instituto Nacional de Metrologia, Qualidade e Tecnologia Lígia de Souza Fernandes ICH - International Conference on Harmonisation Lígia de Souza Fernandes RESUMO A curcumina é o constituinte majoritário encontrado no rizoma da planta Curcuma Longa L., e apresenta diversas atividades farmacológicas. Diversos estudos comprovaram que a curcumina possui excelente atividade antifúngica, sendo um princípio ativo natural promissor para o tratamento de doenças fúngicas. O objetivo específico deste trabalho foi o desenvolvimento de formulações contendo curcumina que possam ter ação contra a candidíase vulvovaginal (CVV). Para a análise estrutural das formulações foram utilizadas as técnicas de microscopia de luz polarizada, espalhamento de raios-X à baixo ângulos, difração de raios-X e comportamento reológico, sendo comprovado que os sistemas desenvolvidos apresentam características adequadas e satisfatórias para a aplicação pretendida e com propriedades mucoadesivas. O método analítico proposto para quantificação da curcumina foi revalidado e utilizado nos ensaios de estabilidade e liberação in vitro. As formulações desenvolvidas foram submetidas ao estudo de estabilidade preliminar, com o objetivo de garantir a segurança e eficácia das mesmas, e foi comprovada a estabilidade das formulações desenvolvidas. Posteriormente foram feitos os testes de liberação in vitro, para verificar a capacidade da curcumina de ser liberada a partir da formulação e exercer sua atividade farmacológica. O sistema emulsionado e o pseudoternário apresentaram taxas de liberação de 0,48% e 0,78% em 12 horas. A atividade farmacológica in vitro deste composto ativo, determinou a concentração inibitória mínima contra a levedura Candida albicans e também a concentração eficaz para ser incorporada nos sistemas. Após estes ensaios, foi realizado a atividade anti-CVV in vivo, as formulações propostas apresentaram resultados satisfatórios e significativos na redução da carga fúngica nos animais infectados. Dessa forma, o promissor agente antifúngico curcumina, incorporado aos sistemas desenvolvidos, podem ser considerados como novas possibilidades na terapia antifúngica. Palavras-chave: antifúngica. Análise estrutural. Candida albicans. Curcumina. Ensaio anti-CVV in vivo. Estabilidade. Liberação in vitro. Validação de método analítico. Lígia de Souza Fernandes ABSTRACT Curcumin is the main active compound found in rhizome of Curcuma Longa L. plant and has several pharmacological activities. Several studies have shown that curcumin has excellent antifungal activity and it is a promising natural active compound for treatment of fungal diseases. The research objective was formulations development containing curcumin that may have action against vulvovaginal candidiasis (VVC). For formulations structural analysis were used techniques as polarized light microscopy, small angle X-ray scattering, X-ray diffraction and rheological behavior, and the developed systems has presented adequate and satisfactory characteristics according with research objective and with mucoadhesive properties. The proposed analytical method for curcumin quantification was revalidated, then used in stability study and in vitro release assays. The formulations were submitted to a preliminary stability study to guarantee its safety and efficacy, this way stability was proven. Subsequently were performed in vitro release tests to verify the curcumin ability of release from formulations and to exert its pharmacological activity. The emulsified and pseudoternary systems presented release rates of 0.48% and 0.78% in 12 hours. With the in vitro pharmacological activity test was determined the minimal inhibitory concentration against yeast Candida albicans and also the effective concentration to be incorporated in the systems. After these tests was performed in vivo anti-VVC activity, the formulations has presented satisfactory and significant results regarding reduction of the fungal load in infected animals. Thus curcumin incorporated in the developed systems can be considered as a new possibility in antifungal therapy. Keywords: Antifungal. Structural analysis. Candida albicans. Curcumin. anti- CVV in vivo assay. Stability. In vitro release. Validation of analytical method. Lígia de Souza Fernandes SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS....................................................................................................VIII LISTA DE TABELAS................................................................................................... XII LISTA DE ABREVIAÇÕES..........................................................................................XV RESUMO...................................................................................................................XVIII ABSTRACT.................................................................................................................XIX 1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................... 1 2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................ 5 2.1 Candida albicans ........................................................................................................ 6 2.2 Candidíase vulvovaginal (CVV) .................................................................................. 7 2.3 Resistência fúngica e importância de novas terapias antifúngicas ......................... 10 2.4 Curcumina ................................................................................................................. 15 2.5 Sistemas de liberação prolongada ........................................................................... 18 2.5.1 Emulsões e sistemas pseudoternários .................................................................. 18 2.6 Microscopia de luz polarizada (MLP) ....................................................................... 24 2.7 Espalhamento de raios-X à baixo ângulo (SAXS) ................................................... 25 2.8 Reologia .................................................................................................................... 27 2.9 Estudo de estabilidade prelimiar (BRASIL, 2004) .................................................... 34 2.9 Validação de metodologia analítica .......................................................................... 35 3 OBJETIVOS ................................................................................................................. 37 3.1 Objetivo geral ............................................................................................................ 38 3.2 Objetivos específicos ................................................................................................ 38 4 MATERIAIS.................................................................................................................. 39 4.1 Padrões, matérias-primas e meios de cultura .......................................................... 40 4.2 Solventes e reagentes .............................................................................................. 41 4.3 Equipamentos e softwares ....................................................................................... 41 5 MÉTODOS ................................................................................................................... 43 5.1 DESENVOLVIMENTO DOS SISTEMAS ................................................................. 44 5.1.1 Preparo do sistema emulsionado .......................................................................... 44 5.1.2 Desenvolvimento do sistema pseudoternário ....................................................... 46 5.1.2.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário ............................................ 46 5.1.2.2 Seleção do sistema pseudoternário a partir do diagrama de fases pseudoternário ................................................................................................................ 48 5.2 ANÁLISE ESTRUTURAL DAS FORMULAÇÕES ESCOLHIDAS ......................... 49 5.2.1 Microscopia de luz polarizada (MLP)..................................................................... 49 5.2.2 Difração de raios-X (DRX) ..................................................................................... 50 5.2.3 Espalhamento de raios-X à baixo ângulo (SAXS)................................................. 50 5.2.4 Comportamento reológico ..................................................................................... 51 5.2.5 Mucoadesão in vitro ............................................................................................... 52 5.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE CURCUMINA NAS FORMULAÇÕES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) ......................................................................................................................................... 54 5.3.1 Especificidade/Seletividade ................................................................................... 55 5.3.2 Linearidade ............................................................................................................ 55 Lígia de Souza Fernandes 5.3.3 Precisão ................................................................................................................. 56 5.3.3.1 Precisão (repetibilidade) ..................................................................................... 56 5.3.3.2 Precisão intermediária ........................................................................................ 56 5.3.4 Exatidão ................................................................................................................. 56 5.3.5 Limite de quantificação .......................................................................................... 56 5.4 ESTABILIDADE PRELIMINAR (BRASIL, 2004) .................................................... 57 5.4.1 Teste de centrifugação .......................................................................................... 57 5.4.2 Estudo de estabilidade preliminar ......................................................................... 58 5.4.2.1 Características organolépticas ........................................................................... 58 5.4.2.2 Determinação do pH ........................................................................................... 58 5.4.2.3 Microscopia de luz polarizada (MLP) ................................................................. 59 5.4.2.4 Comportamento reológico .................................................................................. 59 5.4.2.5 Quantificação da curcumina nas formulações ................................................... 60 5.5 ESTUDO DE LIBERAÇÃO IN VITRO DAS FORMULAÇÕES ESCOHIDAS ........ 60 5.5.1 Determinação da solubilidade da curcumina e escolha da solução receptora .... 60 5.5.2 Preparo da solução tampão acetato de sódio pH 4,5 ........................................... 61 5.5.3 Curva analítica da curcumina na solução receptora ............................................. 61 5.5.4 Ensaio de liberação in vitro e avaliação da cinética de liberação ........................ 62 5.6 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO .................................................................... 63 5.6.1 Microrganismos ...................................................................................................... 63 5.6.2 Avaliação da atividade antifúngica in vitro ............................................................ 64 5.6.2.1 Determinação da Concentração Inibitória Mínima da curcumina (CIM) ............ 64 5.6.2.2 Determinação da Concentração Fungicida Mínima da curcumina (CFM) ........ 65 5.6.2.3 Avaliação do mecanismo de ação: ligação da curcumina ao ergosterol exógeno ......................................................................................................................................... 66 5.7 ENSAIOS EXPERIMENTAIS DE CVV IN VIVO E TRATAMENTOS ..................... 66 5.7.1 C. albicans, condições de crescimento e inóculo ................................................. 66 5.7.2 Preparo das formulações e doses administradas ................................................. 66 5.7.3 Avaliação da atividade anti-CVV dos sistemas desenvolvidos contendo curcumina ........................................................................................................................ 67 5.7.3.1 CVV experimental ............................................................................................... 67 5.7.3.2 Tratamentos com os sistemas desenvolvidos ................................................... 69 5.7.3.3 Análise estatística ............................................................................................... 70 6 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................ 71 6.1 DESENVOLVIMENTO DOS SISTEMAS ................................................................. 72 6.1.1 Preparo do sistema emulsionado .......................................................................... 72 6.1.2 Desenvolvimento de um sistema pseudoternário e nanoestruturado .................. 72 6.1.2.1 Construção do diagrama de fases pseudoternário e seleção da formulação ... 72 6.2 ANÁLISE ESTRUTURAL DAS FORMULAÇÕES ESCOLHIDAS ......................... 74 6.2.1 Microscopia de luz polarizada (MLP)..................................................................... 74 6.2.2 Difração de raios-X (DRX) ..................................................................................... 78 6.2.3 Espalhamento de raios-X à baixo ângulo (SAXS) ................................................ 82 6.2.4 Comportamento reológico ..................................................................................... 85 6.2.5 Mucoadesão in vitro ............................................................................................... 94 6.3 VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE DOSEAMENTO DE CURCUMINA NAS FORMULAÇÕES POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE) ......................................................................................................................................... 95 6.3.1 Especificidade/Seletividade ................................................................................... 95 6.3.2 Linearidade .......................................................................................................... 107 6.3.3 Precisão ............................................................................................................... 109 6.3.3.1 Precisão (repetibilidade) ................................................................................... 109 Lígia de Souza Fernandes 6.3.3.2 Precisão intermediária ...................................................................................... 110 6.3.4 Limite de quantificação ........................................................................................ 111 6.3.5 Exatidão ............................................................................................................... 113 6.4 ESTABILIDADE PRELIMINAR (BRASIL, 2004) .................................................. 115 6.4.1 Teste de centrifugação ........................................................................................ 116 6.4.2 Características organolépticas ............................................................................ 117 6.4.3 Determinação do pH ............................................................................................ 117 6.4.4 Microscopia de luz polarizada ............................................................................. 117 6.4.5 Comportamento reológico ................................................................................... 120 6.4.6 Quantificação de curcumina nas formulações .................................................... 126 6.5 AVALIAÇÃO DO ESTUDO DE LIBERAÇÃO IN VITRO ...................................... 127 6.5.1 Teste de solubilidade e escolha da fase receptora ............................................. 127 6.5.2 Ensaio de liberação in vitro.................................................................................. 131 6.6 ATIVIDADE ANTIFÚNGICA IN VITRO .................................................................. 137 6.6.1 Determinação da concentração inibitória mínima da curcumina (CIM) e determinação da concentração fungicida mínima da curcumina (CFM) ..................... 137 6.6.2 Avaliação da atividade antifúngica sobre a membrana celular: ensaio de ligação da curcumina ao ergosterol exógeno ........................................................................... 138 6.7 ENSAIOS EXPERIMENTAIS DA CVV IN VIVO .................................................... 139 6.7.1 Avaliação da atividade anti-CVV dos sistemas C_CUR0,01%, C_CUR0,1% e C_CUR1% ..................................................................................................................... 139 6.7.2 Avaliação da atividade anti-CVV dos sistemas F27_CUR0,01%, F27_CUR0,1% e F27_CUR1% ................................................................................................................. 144 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 149 8 CONCLUSÃO ............................................................................................................ 153 REFERÊNCIAS ............................................................................................................ 155 APÊNDICE I .................................................................................................................. 173 1 Lígia de Souza Fernandes 1 INTRODUÇÃO Introdução 2 Lígia de Souza Fernandes A Candida albicans é uma espécie polimórfica, ou seja, é capaz de crescer nas formas de levedura, pseudo-hifas e filamentos (hifas), sendo que esta última forma desempenha uma função importante na invasão de tecidos e no estabelecimento de infecções. A espécie Candida albicans é a mais abundante dentre todas as espécies deste gênero e habita de forma comensal os mais variados nichos corporais (MOLERO et al., 1998; BARBEDO et al., 2010; RODRIGUES et al., 2016). A Candida albicans é o princial causador da candidíase vulvovaginal (CVV). Esta infecção representa de 17 a 39% dos casos, sendo que a espécie Candida albicans é responsável por 85 a 90% dos casos (SOBEL, 2015; SANGUINETTI; POSTERARO; LASS-FLORL, 2015; RODRIGUES et al., 2016; RODRIGUES et al., 2016; MANE et al., 2016; MIRÓ et al., 2017). A candisíase vulvovaginal caracteriza-se por prurido, ardor, dor ao ter relações sexuais, coceira, eliminação de corrimento vaginal em grumos, inodoros e com aspecto farináceo quando depositado nas roupas. A vulva e a vagina encontram-se edemaciadas e hiperemiadas ocorrendo ardor ao urinar e sensação de queimadura (PATEL et al., 2004; SOBEL, 2007; POWELL & NYIRJESY, 2014). A Candida albicans tem importância tanto quanto à gravidade de suas infecções e quanto à sua capacidade de desenvolver resistência aos antifúngicos (PRASAD & KAPOOR, 2005; MORACE; PERDONI, BORGHI, 2014; WANG, Y. et al., 2015; WANG, B. et al., 2015; LIU et al., 2015; LO et al., 2015). Como a prevalência da Candida albicans é grande, torna-se preocupante a incidência de cepas de C. albicans resistentes aos antifúngicos “azóis” disponíveis no mercado, gerando problemas para terapia desta infecção, por isso, faz-se necessário o desenvolvimento de novas terapias antifúngicas (PRASAD & KAPOOR, 2005). Diversos estudos mostraram que curcumina se apresenta como um ótimo agente antifúngico contra Candida albicans. A curcumina é o principal composto ativo extraído do rizoma da planta Curcuma Longa L. e além da sua atividade antifúngica, este princípio ativo apresenta diversas propriedades farmacológicas (MARTINS et al., 2009; NEELOFAR et al., 2011; ALSHEHRI et al., 2014; SIVIERO et al. 2015; GUNES, et al. 2016; KÖLLNER et al., 2017). Introdução 3 Lígia de Souza Fernandes No entanto, o uso da curcumina é limitado devido à sua baixa solubilidade aquosa, resultando em restrições farmacotécnicas, como a dificuldade em incorporá-la nas formulações. Os sistemas para aplicação vaginal atualmente disponíveis, como os cremes, géis, óvulos, também possuem limitações, tais como perda de fármaco no local de ação, o que contribui para uma menor exposição ao princípio ativo. Por via oral, a curcumina apresenta baixa biodisponibilidade e rápido metabolismo hepático, pertencendo aos fármacos de classe IV, de acordo com o Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) (AMIDON et al., 1995; CARR et al., 2015). Dessa forma, o emprego de emulsões e sistemas nanoestruturados (como microemulsões e cristais-líquidos), capazes de contornar o problema de baixa solubilidade aquosa da curcumina, e ainda promover uma liberação prolongada do fármaco no sítio de ação são boas estratégias para novas terapias antifúngicas (BHARDWAJ et al., 2012; SIVIERO et al., 2015; CARR et al., 2015; BAJPAI et al., 2015; LU; KELLY; MIAO, 2016; KÖLLNER et al., 2017). Considerando a importância que a curcumina tem enquanto composto bioativo e que a complexidade dos diferentes componentes presentes em preparações farmacêuticas podem interferir na eficácia de seus princípios ativos e estes na estabilidade do veículo, faz-se necessário avaliar a estabilidade da formulação, monitorar a estabilidade organoléptica (aspecto, cor e odor) e físico-química, produzindo informações sobre a confiabilidade e segurança das formulações (PAVELIC et al., 2004; SQUIER et al., 2008). Ao estudar a estabilidade da curcumina nas formulações, é necessário um método analítico confiável e reprodutível. Assim, para dar segurança aos resultados realiza-se a validação do método analítico; os parâmetros avaliados na validação de uma metodologia analítica são: especificidade e seletividade, linearidade, precisão, limite de quantificação, exatidão e robustez (BRASIL, 2003). O método analítico validado também é utilizado nos ensaios de liberação in vitro. Este ensaio é essencial para obter resultados sobre a quantidade de fármaco que é capaz de “sair” da formulação e atingir o sítio alvo. Este ensaio também permite estudar a cinética de liberação do princípio ativo dos sistemas. O desenvolvimento de um sistema, também envolve sua caracterização Introdução 4 Lígia de Souza Fernandes físico-química com o objetivo de conhecer as estruturas e o grau de organização dos arranjos formados, o arranjo estrutural influencia no perfil de liberação do fármaco incorporado e confere diferentes características aos sistemas. A caracterização reológica fornece informações sobre o comportamento reológico desde o momento da aplicação da formulação até até sua permanência no local de ação, também avalia a rede estrutural do sistema e sua influência no perfil de liberação do fármaco. Este trabalho consiste no desenvolvimento de um sistema de liberação prolongada e na comparação com uma emulsão desenvolvida pelo grupo de pesquisa do coorientador deste trabalho. Outros tópicos importantes abordados são: estabilidade físico-química e comprovação da atividade antifúngica in vitro e in vivo contra Candida albicans. Além disso, a avaliação da liberação in vitro da curcumina e a análise estrutural dos sistemas, fornecem informações sobre o perfil de liberação do fármaco. Todos esses aspectos abordados são essenciais no desenvolvimento de novos produtos, com o objetivo de obter novas terapias antifúngicas para o tratamento da CVV. Lígia de Souza Fernandes 2 REVISÃO DA LITERATURA Revisão da literatura 6 Lígia de Souza Fernandes 2.1 Candida albicans A microbiota vaginal normal é rica em Lactobacillus sp produtores de ácido lático, responsáveis por manter a acidez do pH vaginal, o que dificulta a proliferação de outros microrganismos; a sua competição pela adesão ao epitélio vaginal também dificulta a proliferação desses outros microrganismos, no entanto, a levedura Candida albicans é capaz de crescer neste meio e tornar-se patogênico quando ocorre alguma alteração no ambiente vaginal (fungo comensal oportunista), causando a candidíase vulvovaginal (CVV) (ZIARRUSTA et al., 2002; LINHARES et al., 2005; BARBEDO et al., 2010). O gênero Candida sp compreende mais de 200 espécies, no entanto, apenas algumas têm sido correlacionadas às doenças humanas, como: Candida albicans, Candida dubliniensis, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida glabrata, Candida kefyr, Candida lusitaniae, Candida krusei, Candida guilliermondii, Candida util, Candida lipolytica, Candida famata, Candida haemulonii e Candida rugosa (SILVA, 2011; RODRIGUES et al., 2016; ARAÚJO; HENRIQUES; SILVA, 2017). As espécies de Candida sp colonizam de forma frequente a pele e membranas mucosas. A espécie C. albicans é a mais abundante e habita de forma comensal diversos nichos corporais, como orofaringe, mucosa oral, trato gastrointestinal, dobras da pele, secreções brônquicas, vagina, urina e fezes (MOLERO et al., 1998; BARBEDO et al., 2010; RODRIGUES et al., 2016). O espectro de doenças causadas por Candida abrange desde infecções superficiais, como doenças mucocutâneas, até infecções invasivas que podem atingir qualquer órgão levando ao óbito (RODRIGUES et al., 2016). A Candida albicans possui alta capacidade de infestação, pois várias cepas desta espécie podem proliferar em diversas membanas e mucosas de um indívíduo, ao mesmo tempo. Sua rápida proliferação e fixação é um fator preocupante, pois esta levedura possui plasticidade morfogênica, podendo se desenvolver tanto na forma leveduriforme quanto na forma de hifas. Nesta última forma, a proliferação em tecidos do corpo humano ocorre de forma mais abrangente, podendo atingir mucosas e órgãos como fígado, pele e útero (RODRIGUES et al., 2016). Revisão da literatura 7 Lígia de Souza Fernandes A C. albicans é polimórfica, ou seja, apresenta crescimento como levedura a 30 °C, como forma filamentosa (hifas) a 37 °C e como pseudo-hifas. As formas filamentosas proporcionam um aumento da resistência à fagocitose quando comparado com a levedura, assim, a virulência da Candida albicans está estritamente relacionada com a capacidade de formação de hifas, sendo esta transição levedura-hifa primordial para o desenvolvimento da infecção (TSANG et al., 2012; ANGEBAULT et al., 2013). Segundo Kashem et al. (2015), existem cepas mutantes de Candida albicans que são incapazes de formar filamentos e por isso não conseguem estabelecer infecções robustas, o que sugere que a transição de levedura para hifa é um fator importante para desenvolver a infecção. Esta mudança morfotípica é regulado por uma rede complexa de elementos sensores que detectam alterações no microambiente e regulam os fatores de transcrição que codificam a formação de hifas, produção de adesinas, enzimas hidrolíticas prejudiciais ao hospedeiro (proteases, fosfolipases e hemolisina) e formação de biofilme, que confere alta capacidade de aderência. Estes fatores mostram a grande capacidade de se defender contra o sistema imunológico do hospedeiro (SARDI et al., 2013; HOLLAND et al., 2014; RODRIGUES et al., 2016). O biofilme é o tipo de crescimento prevalente na natureza e consistem em uma complexa população de células associadas às superfícies das mucosas, em níveis sistêmicos ou até mesmo em dispositivos médicos, tornando as células mais resistentes aos antifúngicos (RODRIGUES et al., 2016). A espécie Candida albicans possui muita importância na prática clínica, devido ao grande número de infecções e ainda, devido às infecções severas e letais provocadas por esta espécie (KIM et al., 2011). 2.2 Candidíase vulvovaginal (CVV) A candidíase pode ser cutânea, mucosa, mucocutânea, visceral e pode atingir até mesmo níveis sistêmicos (candidemia). Os fungos têm preferência por superfícies quentes e úmidas, sendo frequentes nas regiões vaginais e na boca. Estas são as manifestações mais comuns do estado infeccioso e, apesar de normalmente não apresentarem ameaças à vida do hospedeiro, alguns Revisão da literatura 8 Lígia de Souza Fernandes casos graves da infecção podem alcançar níveis sistêmicos colocando o paciente em risco (NYIRJESY et al., 2008). Quando a infecção se dá na vagina, chama-se de candidíase vulvovaginal (CVV). A CVV pode ser classificada como complicada ou não complicada, de acordo com as manisfestções clínicas, microbiológicas e resposta do paciente à terapia (NAGASHIMA; YAMAGISHI; MIKAMO, 2016). Dentre as vulvovaginites, a CVV é a segunda mais frequente, estimada em 17 a 39% dos casos, atrás somente das vaginoses bacterianas, sendo que a espécie Candida albicans é responsável por 85 a 90% dos casos, seguida pelas espécies C. Glabrata, C. tropicalis, C. krusei e C. parapsilopsis (CONSOLARO et al., 2004; LINHARES et al., 2005; SILVEIRA et al., 2010; BARBEDO et al., 2010; LOCKHART, 2014; SANGUINETTI; POSTERARO; LASS-FLORL, 2015; SOBEL, 2015; RODRIGUES et al., 2016; MANE et al., 2016; MIRÓ et al., 2017). A CVV é a inflamação da vulva e vagina, caracterizada por prurido, ardor e dor à micção causando sensação de queimadura, dispareunia na vagina, coceira, eliminação de corrimento vaginal em grumos, inodoros e com aspecto farináceo quando depositado nas vestes; a vulva e a vagina encontram-se edemaciadas e hiperemiadas, também podem ser observadas fissuras, maceração da vulva e colo do útero recobertos por placas brancas ou branco- acinzentadas; as lesões podem estender-se pelo perínio, região perianal e iguinal (PATEL et al., 2004; SOBEL, 2007; ARAÚJO et al., 2011; GAZETA- JÚNIOR et al., 2011; POWELL & NYIRJESY, 2014; SOBEL, 2015). Esta patologia está relacionada com uma morbidade significativa e afeta mulheres de todas as idades, especialmente na idade adulta, sendo considerada um grande problema de saúde pública. Cerca de 75% das mulheres já tiveram um episódio de CVV aguda durante a vida, sendo que 50% apresentaram outros episódios e 5% a 10% das mulheres desenvolveram candidíase vulvovaginal recorrente (CVVR), definida como quatro ou mais episódios em um ano (SILVEIRA et al., 2010; MIRÓ et al., 2017). É importante ressaltar que os vários episódios da CVV aguda ou a CVVR afetam profundamente a qualidade de vida das mulheres infectadas (SOBEL, 2015), segundo dados epidiomiológicos, a CVVR afeta 138 milhões de mulheres em todo o mundo (MIRÓ et al., 2017). De acordo com Lockhart Revisão da literatura 9 Lígia de Souza Fernandes (2014), a candidemia e candidíase estão entre as mais frequentes infecções relacionadas à assistência de saúde e leva à uma significativa morbidade e mortalidade (PATEL et al., 2004; POWELL & NYIRJESY, 2014; VRZAL; BITTNER; NEPERENY, 2015). Muitos pacientes consideram as infecções vulvovaginais simples e fáceis de tratar e por isso falhas no tratamento e infecções recorrentes ocorrem comumente. Como os sintomas são inespecíficos, o autodiagnóstico e a automedicação são muito comuns (SILVEIRA et al., 2010). Os pacientes com tais infecções são freqüentemente submetidos aos mesmos esquemas ineficazes de tratamento e para a maioria das mulheres com infecções vaginais crônicas ou recorrentes, deveriam haver abordagens e estudos diferenciados para avaliação e tratamento a fim de produzir resultados satisfatórios. A ausência de testes de diagnóstico rápido, simples e de baixo custo continua a resultar em ambos sobrediagnóstico e subdiagnóstico de candidíase vulvovaginal (RODRIGUES et al., 2016; POWELL & NYIRJESY, 2014). É muito importante o diagnóstico correto, pois a falta de dignóstico e tratamento incorreto, devido aos sintomas inespecíficos da CVV (pois diversas infecções causam os mesmos sintomas) levam a um número significativo de mulheres portadoras de infecção vaginal de “repetição”, as quais foram tratadas contra uma patologia que não estava ligada ao agente suspeito (SILVEIRA et al., 2010; MIRÓ et al., 2017). A cultura positiva de levedura permite especiação do organismo causador, que por sua vez pode ter implicações importantes para o tratamento antifúngico. Embora a cultura de células também permite o acesso ao organismo para testes de suscetibilidade aos antifúngicos, tais testes são raramente utilizados. A CVVR (candidíase vulvovaginal recorrente) em algumas mulheres pode ser devido à resistência do microrganismo ao medicamento, por isso essa condição crônica exige tratamento prolongado para obter alívio e resolução dos sintomas (POWELL & NYIRJESY, 2014; MORACE; PERDONI; BORGHI, 2014; WANG, Y. et al., 2015; WANG, B. et al., 2015; LIU et al., 2015; LO et al., 2015). Os fatores que aumentam o risco da CVV são: diabetes mellitus não controlada, pacientes com imunossupressão, gravidez, tratamentos de Revisão da literatura 10 Lígia de Souza Fernandes reposição hormonal, aspectos genéticos, uso de fármacos com amplo espectro de ação e fatores comportamentais, como hábitos de vestuário, higiene pessoal, uso de contraceptivo e práticas sexuais (PATEL et al., 2004; SOBEL, 2007). A modulação ou o desequilíbrio dos hormônios reprodutivos (gravidez, terapia hormonal, uso de anticoncepcionais) e o uso de antibióticos também são fatores que aumentam o risco de incidência da doença (PATEL et al., 2004; FIDEL, 2007; ACHKAR & FRIES, 2010; POWELL & NYIRJESY, 2014; MIRÓ et al., 2017). Esses fatores de risco estão relacionados à disponibilidade de nutrientes para o fungo, por exemplo, pacientes diabéticos, que possuem alto teor de glicose; os elevados níveis de hormônios reprodutivos que aumentam o teor de glicogênio em células epiteliais vaginais e ainda o estrógeno, que aumenta a adesão do fungo na superfície das células (MIRÓ et al., 2017). 2.3 Resistência fúngica e importância de novas terapias antifúngicas A Candida albicans tem importância não só relacionado à gravidade de suas infecções, mas também à sua capacidade de desenvolver resistência aos antifúngicos (PRASAD & KAPOOR, 2005; MORACE; PERDONI; BORGHI, 2014; WANG, Y. et al., 2015; WANG, B. et al., 2015; LIU et al., 2015; LO et al., 2015). Em geral, a maioria das pacientes devem responder de forma imediata ao ratamento realizado com antifúngicos disponíveis no mercado, como o fluconazol, miconazol e nistatina, porém, nos últimos anos esses tratamentos vêm apresentando ineficácia, devido à resistência fúngica aos derivados azólicos; os cremes vaginais à base de anfotericina B também tem sido muito utilizados; no entanto, a utilização a longo prazo deste fármaco apresenta efeitos nefrotóxicos (CHAI et al., 2013). Segundo Sobel (2015), os estudos epidemiológicos da última década revelaram que quase todas as mulheres diagnosticadas com CVVR causada por Candida albicans resistentes ao fluconazol apresentaram uma exposição anterior considerável à este fármaco, o que está associado às pacientes que não aderiram de forma correta aos esquemas de tratamentos com fluconazol, e isso torna-se um fator de risco para o surgimento de cepas resistêntes à este Revisão da literatura 11 Lígia de Souza Fernandes fármaco. Nestes casos, deve ser determinada a resistência cruzada a outros azóis como alternativas de tratamento para fluconazol. Em casos de resistência cruzada, as opções de terapia intensiva são limitadas e deve-se recorrer à terapia a longo prazo utilizando nistatina vaginal ou ácido bórico, no entanto, estes casos possuem poucos dados de eficácia publicados. Como a Candida albicans é responsável pela maioria das infecções, é preocupante a incidência de cepas de Candida albicans resistentes aos antifúngicos “azóis”, que têm aumentado consideravelmente, criando sérios problemas para uma quimioterapia bem-sucedida (PRASAD & KAPOOR, 2005). Estudos mostram que 29 cepas de Candida albicans são resistentes ao fluconazol e freqüentemente é demonstrado resistência cruzada a outros medicamentos “triazóis”. A resistência deve ser suspeitada em pacientes aderentes à terapia, mas com a falta de resposta, e que possuem persistentemente resultado positivo para culturas de leveduras (SOBEL et al., 1998; LOCKHART, 2014). O aumento do uso de antifúngicos, tanto para fins terapêuticos quanto profiláticos, terapias prolongada para CVVR e o aumento do número de pacientes imunocomprometidos, são fatores de risco para o surgimento da resistência aos medicamentos “azóis” em C. albicans (SOBEL et al., 2003; GALLE & GIANINNI, 2004; NUCCI & MARR, 2005; PRASAD & KAPOOR, 2005; DALAZEN et al., 2011; BENEDETTI; FORNARI; SHERVINSK, 2011; SALEHEI; SEIFI; MAHMOUDABADI, 2012; MORACE; PERDONI; BORGHI, 2014; LOCKHART, 2014; WANG, Y. et al., 2015; WANG, B. et al., 2015; LIU et al., 2015; LO et al., 2015; NAGASHIMA; YAMAGISHI; MIKAMO, 2016). Estudos com Candida albicans mostraram vários mecanismos moleculares associados à resistência ao fluconazol, como por exemplo, as alterações genéticas no gene ERG11. O gene ERG11 codifica a enzima lanosterol 14-alfa demetilase, responsável pela biossíntese do ergosterol (componente da membrana celular dos fungos). A lanosterol 14-alfa demetilase é a proteína alvo de atuação dos fármacos “azóis”, a inibição ocorre através da ligação nitrogênio livre do anel “azol” ao átomo de ferro presente na enzima levando à síntese de compostos tóxicos, que não substituem o ergosterol da membrana fúngica. Então, a sobre-expressão deste gene está relacionado à diminuição da eficácia destes fármacos. Segundo Mane (2016) as mutações Revisão da literatura 12 Lígia de Souza Fernandes deste gene provocaram um aumento de mais de quádruplo na CIM do fluconazol. Outro mecanismo de resistência se dá pelo transporte dos fármacos para fora da célula através da membrana celular, diminuindo a concentração dos antifúngicos no interior das células fúngicas. Existem também outros mecanismos de resistência, não esclarecido ainda, mas que não se limitam a alterações na estrutura da membrana plasmática, mas podem estar relacionados com o metabolismo mitocondrial, homeostase do cálcio (SANGUINETTI; POSTERARO; LASS-FLORL, 2015; MANE et al., 2016). A grande maioria dos dados analisados associados à resistência ao fluconazol se originam dos EUA e do Reino Unido, enquanto há escassez de dados na literatura sobre a região asiática e outros países em desenvolvimento (SANGUINETTI; POSTERARO; LASS-FLORL, 2015; RODRIGUES et al., 2016; MANE et al., 2016). Existem também muitos problemas relacionados aos fármacos disponíveis; vários antifúngicos utilizados para o tratamento de CVV apresentam toxicidade elevada, o fluconazol, por exemplo, causa intolerância gastrintestinal, dor de cabeça, e erupção cutânea como efeitos colateriais o que dificulta também a adesão ao tratamento (SOBEL et al., 1998; RAJESHKUMAR & SUNDARARAMAN, 2012). Atualmente existem diversas classes terapêuticas antifúngicas disponíveis com diferentes mecanismos de ação, como os agentes poliênicos, imidazóis, triazóis, alilaminas, equinocandinas, entre outros. Os agentes antifúngicos poliênicos, como a anfotericina B e nistatina, não possuem relatos de resistência fúngica, no entanto, a anfotericina B, fármaco de referência para o tratamento da maioria das infecções fúngicas, teve seu uso restrito à administração sistêmica pois não é absorvida pelo trato gastrintestinal. Apesar de bastante eficaz apresenta elevada toxicidade sistêmica e local, causando significativos efeitos nefrotóxicos e hepatotóxicos. A nistatina também é altamente tóxica quando usada por via sistêmica, o que limita seu uso terapêutico (CAMPOY & ADRIO, 2017; WHALEY et al., 2017) Os agentes antifúngicos azólicos são classificados em imidazólicos e trizólicos. Os agentes imidazólicos são representados principalmente pelo clotrimazol, cetoconazol, miconazol e tioconazol. Revisão da literatura 13 Lígia de Souza Fernandes O clotrimazol também teve seu uso restrito à aplicação externa devido à sua alta toxicidade; o miconazol é pouco absorvido pelo trato gastrintestinal e deve ser administrado por via intravenosa, este fármaco é recomendado para o tratamento das infecções causadas por espécies de Candida sp mas apresenta elevada concentração inibitória mínima in vitro para a maioria das espécies de Candida sp (WHALEY et al., 2017). O cetoconazol apresenta poucos efeitos tóxicos e excelente ação contra a maioria das espécies de Candida sp, mas acredita-se que para o tratamento ser eficaz, o antifúngico deve ser administrado por longos períodos (WHALEY et al., 2017). Os agentes triazólicos, são representados principalmente pelo fluconazol, cetoconazol, itraconazol e voriconazol. O fluconazol possui boa absorção gastrointestinal e é adequado para o tratamento da candidíase superficial (orofaringe, esôfago ou vaginal), apesar de também apresentar efeitos hepatotóxicos. Devido às suas boas propriedades farmacocinéticas e seu amplo espectro de atividade, o fluconazol foi o fármaco de referênia contra doenças fúngicas na década de 90, no entanto, sua prescrição excessiva, tanto para fins profiláticos quanto terapêuticos, ocasionou um aumento da resistência fúngica aos medicamentos “azoís” (CAMPOY & ADRIO, 2017; WHALEY et al., 2017). Quanto à resistência cruzada entre “azóis”, esta pode ocorrer facilmente, sendo causada pela exposição prévia à esses fármacos, por exemplo, ao se induzir resistência ao fluconazol é possível notar a resistência cruzada ao itraconazol (NUNES et al., 2011). O itraconazol, possui um amplo espectro de atividade, no entanto, sua característica hidrofóbica causa maior efeito tóxico que o fluconazol. O fluconazol e o itraconazol apresentam também algumas interações medicamentosas procupantes com os fármacos utilizados na quimioterapia da AIDS. Essas interações podem resultar em uma diminuição da concentração dos medicamentos azólicos ou mesmo em um aumento da toxicidade (GUENNEC et al., 1995). As alilaminas, como a terbinafina, causa hepatotoxicidade e a classe das equinocandinas, utilizadas em casos de infecções fúngicas sistêmicas em pacientes imunocomprometidos, não são bem absorvidas quando Revisão da literatura 14 Lígia de Souza Fernandes administradas oralmente, por isso a administração é intravenosa (WHALEY et al., 2017). Existem outros fármacos disponíveis, como griseofulvina e fluorocitosina, no entanto, também causam hepatotoxicidade. Entretanto, seu maior problema é a alta porcentagem de resistência das cepas de Candida sp, sua resistência geralmente ocorre durante o tratamento (WHALEY et al., 2017). No geral, os agentes antifúngicos são extremamente tóxicos, sendo geralmente associados a muitos efeitos colaterais como nefrotoxicidade, leucopenia, hepatomegalia, letargia, ataxia, anemia entre outros (GUENNEC et al., 1995; CAMPOY & ADRIO, 2017; WHALEY et al., 2017). A resistência fúngica aos fármacos disponíveis é um problema emergente. Considerando que as leveduras possuem diversos mecanismos para driblar a ação dos fármacos. A Candida albicans tem oferecido maior resistência aos antifúngicos, especialmente entre pacientes imunocomprometidos, pacientes transplantados e oncológicos. A resistência fúngica aos medicamentos azóis é cada vez mais relatada e as infecções por Candida sp mais susceptíveis às drogas estão gradativamente sendo substituídas por infecções causadas por cepas mais resistentes (GUENNEC et al., 1995; CAMPOY & ADRIO, 2017). Quanto às aplicações tópicas, os sistemas para aplicação intravaginal atualmente disponíveis, como os cremes, géis, óvulos, também possuem algumas limitações, tais como perda de fármaco no local de ação e mucoadesão restrita, o que contribui para uma menor exposição ao princípio ativo (CARR et al., 2015). A falta de compostos antifúngicos com poucos efeitos colaterais reforça a importância dos produtos naturais como novas terapias antifúngicas, pois apresentam vantagens quando comparados com os fármacos convencionais, como mínimos efeitos colaterais (toxicidade diminuída para as células do hospedeiro) e portanto, maior adesão ao tratamento e baixo custo (RAJESHKUMAR & SUNDARARAMAN, 2012). Considerando todo este cenário, conclui-se que o arsenal terapêutico antifúngico é limitado o que torna necessário novas abordagens terapêuticas. Revisão da literatura 15 Lígia de Souza Fernandes 2.4 Curcumina A curcumina é um princípio ativo extraído do rizoma da planta Curcuma longa L., pertencente à família Zingiberaceae, é amplamente utilizada na culinária e na área da saúde, devido às suas importantes ações farmacológicas (RAMSHANKAR & SURESH, 2008; ASHRAFL et al., 2012; SUETH-SANTIAGO et al., 2015). A curcumina é o principal constituinte ativo da Curcuma longa L., sendo também encontrado em outras espécies de Curcuma spp, é comumente chamado de cúrcuma e caracteriza-se por possuir uma forte pigmentação amarela. Possui origem polifenólica e os flavonoides como metabólitos secundários; a curcumina é considerada o marcador químico para esta espécie. Os outros curcuminóides são encontrados de forma minoritária no rizoma da planta Curcuma longa L. Os curcuminóides são: curcumina (77%), desmetoxicurcumina (17%) e bis-desmetoxicurcumina (3%) (ANSARI et al., 2005; RAMSHANKAR & SURESH, 2008; GANTAIT, BARMAN, MUKHERJEE, 2010; ASHRAFL et al., 2012; SHEN, JI, 2012; PAULUCCI et al., 2013; LESTARI & INDRAYANTO, 2014; SIVIERO et al., 2015). A curmunina também é o composto mais conhecido do grupo dos diarileptanóides, compostos formados por dois anéis aromáticos separados por sete carbonos (LESTARI & INDRAYANTO, 2014). Dentre as propriedades medicinais da curcumina encontram-se: ações anti-inflamatórias, antioxidante, antibactericida, anticoagulante, antitumoral, hipocolesterolemia, antiespasmódica, cicatrizante, possui ações imunomodulátorias, antiprotozoária, anti-diabetes, antiangiogênica, antiartrítica, antisquêmica, hepatoprotetora, anti-alérgica, imunizantes, anti-HIV, anti- fúngica, neuroprotetora, ajuda no tratamento e prevenção de doenças de Alzaimer, doenças respiratórias, depressão e outras aplicações (APLSARLYAKUL, VANITTANAKOM, BUDDHASUKH, 1995; SELVAM et al., 1995; ANSARI et al., 2005; COUSINS et al., 2007; RAMSHANKAR & SURESH, 2008; GANTAIT, BARMAN, MUKHERJEE, 2010; SINGH et al., 2010; ASHRAFL et al., 2012; SHEN, JI, 2012; KORANY et al., 2013; KADAM et al., 2013; PAULUCCI et al., 2013; CAO, XU, LIU, 2014; MEMVANGA et al., 2014; Revisão da literatura 16 Lígia de Souza Fernandes SUETH-SANTIAGO et al., 2015; SILVA-BUZANELLO et al., 2015; SYED et al., 2015; LU, KELLY, MIAO, 2016; TEJADA et al., 2016; GATTOC et al., 2017). O composto fenólico curcumina, quimicamente nomeado como [1,7-bis (4- hidroxi-3-metoxifenil) -1,6- heptadieno-3, 5-diona], possui baixa solubilidade em água, em pH neutro e ácido à temperatura ambiente (11 ng/mL, log P = 3,29; características hidrofóbicas); solúvel em dimetilsulfóxido, acetona, clorofórmio, hexano, etanol, metanol, ácido acético glacial, óleos e em pH básico. Possui três hidrogênios ácidos, sendo os hidrogênios adjacentes às duas carbonilas, os mais ácidos deles (pKa1<1, pKa2 = 8,38, pKa3 = 9,88 e pKa4 = 10,51); a molécula possui isomeria e a cadeia carbônica entre os anéis aromáticos conferem hidrofobicidade e flexibilidade à molécula possibilitando encaixar-se em diversos sítios de ligações, além disso exibem forte absorção entre 420 e 430 nanômetros (comprimentos de onda dentro do espectro de luz visível) quando dissolvida em solvente orgânico (INDIAN PHARMACOPOEIA, 2010; KADAM et al., 2013; XUA et al., 2014; LESTARI & INDRAYANTO, 2014; SUETH-SANTIAGO et al., 2015; CARVALHO et al., 2015; SIVIERO et al., 2015; TEJADA et al., 2016; BHAGYASHREE, ROHIT, SHRINIWAS, 2017). Quanto à degradação, a curcumina é facilmente decomposta quando exposta à luz brilhante, condições de alta temperatura, meios oxidativos e pH alcalino (COUSINS et al., 2007; LU, KELLY, MIAO 2016; TEJADA et al., 2016). A fórmula molecular da curcumina é: C21H20O6, a massa molecular é de 368,91 g/mol e ponto de fusão é 183 oC (GANTAIT, BARMAN, MUKHERJEE, 2010; LESTARI & INDRAYANTO, 2014). Figura 1. Estrutura química da curmina (CAS: 458-37-7). Estudos recentes demonstram que a curcumina apresenta-se como um promissor agente antifúngico contra Candida albicans (ALSHEHRI et al., 2014; SIVIERO et al. 2015; GUNES, et al. 2016; KÖLLNER et al., 2017). Em relação Revisão da literatura 17 Lígia de Souza Fernandes a sua atividade sobre espécies de Candida sp, a curcumina apresentou completa inibição de crescimento das leveduras em concentrações significativas, sendo a Candida albicans a mais susceptível entre as espécies do mesmo gênero, e de acordo com Martins (2009), mostrou-se mais eficiente que o fluconazol na inibição da adesão do microrganismo a células do epitélio bucal (NEELOFAR et al., 2011). Os mecanismos de ação da curcumina sobre Candida albicans já descritos incluem inibição do desenvolvimento de hifas, diminuição da biossíntese de ergosterol, modulação da função de ATPase de membrana plasmática fúngica e efeito na produção de exoenzimas fúngicas (LOGAN- SMITH et al., 2001; SOBEL et al., 2003; GADDIPATI et al., 2003; HONG et al., 2004; PRASAD et al., 2004; CHO et al., 2005; MARTINS et al., 2009; SHARMA et al., 2009; JIN et al., 2014). A curcumina é menos efetiva do que o fluconazol em termos de ação antifúngica propriamente dita, mas suas propriedades de inibição da adesão fúngica nas céulas epiteliais resultam em uma atividade maior que a do fluconazol contra as células fúngicas, o que sugere algum efeito nas propriedades de associação das células fúngicas com as células epiteliais do hospedeiro. O tipo de efeito apresentado pela curcumina depende em parte, da via de administração, nenhum estudo relatou toxicidade com relação ao uso da curcumina. A baixa biodisponibilidade é um dos maiores problemas com relação à sua utilização clínica e é o fator que limita sua aplicação (baixa solubilidade e baixa absorção), a baixa eficácia na administração oral é agravada por sofrer metabolismo hepático de primeira passagem e metabolismo de fase 2, como a conjugação com ácido glicurônico (ANSARI et al., 2005; SUETH-SANTIAGO et al., 2015; SILVA-BUZANELLO et al., 2015; CARVALHO et al., 2015; CARR et al., 2015; TEJADA et al., 2016; LU, KELLY, MIAO, 2016). De acordo com o Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB), que considera que a solubilidade e a permeabilidade gastrintestinal são características específicas do fármaco, pode-se dizer que a curcumina se encaixa na Classe IV; pertencem à esta classe fármacos com baixa solubilidade e baixa permeabilidade, ou seja, fármacos que apresentam Revisão da literatura 18 Lígia de Souza Fernandes problemas para administração oral (AMIDON et al., 1995). Diversos dados sugerem que a resposta imune local, mais que a sistêmica, é importante na proteção durante as vaginites. As vantagens da administração intravaginal é por ser uma rota não invasiva e tão efetiva quanto a administração oral de medicamentos no tratamento de infecções vaginais. Nos estudos clínicos de Mishra & Das (2015), foram demonstrados resultados satisfatórios da aplicação intravaginal de creme contendo curcumina contra o vírus HPV (SRIKRISHNA, CARDOZO, 2013; NAGASHIMA, YAMAGISHI, MIKAMO, 2016). No entanto, o uso da curcumina também fica limitado devido suas características físico-químicas, como a alta lipofilicidade, resultando em restrições farmacotécnicas. Dessa forma, o emprego de sistemas nanoestruturados, nanopartículas, lipossomas e outros, capazes de solubilizar e veicular moléculas lípofílicas e ainda promover uma liberação prolongada do fármaco no sítio de ação podem ser boas estratégias para novas terapias antifúngicas (BHARDWAJ et al., 2012; SIVIERO et al., 2015; CARR et al., 2015; BAJPAI et al., 2015; LU, KELLY, MIAO 2016; KÖLLNER et al., 2017). 2.5 Sistemas de liberação prolongada 2.5.1 Emulsões e sistemas pseudoternários As emulsões são dispersões de duas fases não miscíveis entre si; estes sistemas heterogêneos, formados por uma fase aquosa e uma fase oleosa, tornam-se sistemas mais estáveis na presença de agentes emulsificantes, pois estes agentes atuam reduzindo a tensão interfacial exitente entre as duas fases e por isso, previnem a coalenscência das partículas (SILVA & SOARES, 1996; LEONARDI, 2004; AULTON, 2005). Estes sistemas são utilizados para veicular fármacos lipofílicos e hidrofílicos e também podem formar um sistema de liberação prolongada, no qual o fármaco é liberado por difusão, de acordo com seu coeficiente de partição. Revisão da literatura 19 Lígia de Souza Fernandes Os diâmetros das gotículas de uma emulsão são da ordem de 0,1 a 100 µm; o sistema é termodinamicamente instável, pois primeiramente ocorre a formação da fase dispersa, depois ocorre a coalescência das gotículas e separação de fases, por isso é necessário a utilização do agente emusificante (tensoativos), o tipo e a quantidade desses agentes irão determinar a estabilidade da emulsão, evitando a separação de fases (AULTON, 2005). As emulsões representam um grande número de preparações tópicas utilizadas. No geral, são constituídas por vários componentes, sendo os básicos e principais: agentes doadores de consistência, agentes emolientes, emulsionantes, princípios ativos, água, óleos, conservantes, perfume, corantes ou aditivos especiais (SILVA & SOARES, 1996; LEONARDI, 2004; AULTON, 2005). A separação de fases em uma emulsão é um problema farmacotécnico, é denominada “quebra” e se dá por adição de uma substância imcompatível, crescimento microbiano, mudança de temperatura, entre outros fatores; outros fenômenos de instabilidade são: floculação, coalescência, creaming (a fase dispersa sobe à superfície ou desce até o fundo da emulsão) e separação de fases (AULTON, 2005). Figura 2. Emulsão e tipos de separação em emulsões. (FRANZOL & REZENDE, 2015) Dessa forma, as emulsões, são consideradas formulações simples, que favorecem a aplicação tópica intravaginal e a administração de princípios ativos hidrossolúveis e/ou lipossolúveis com finalidades específicas (ECCLESTON, 1997). Para os sistemas pseudoternários, primeiramente utiliza-se o um método Revisão da literatura 20 Lígia de Souza Fernandes gráfico denominado diagrama de fases pseudoternário. Os diagramas de fases pseudoternários são representados como triângulos equiláteros, nos quais cada vértice corresponde à 100% da fase aquosa, da fase oleosa e do tensoativo (ou mistura de tensoativos). O vértice superior representa o tensoativo, o vértice esquerdo a fase aquosa e, o direito, a fase oleosa. Cada ponto no diagrama mostra a proporção de cada um dos componentes utilizados (OLIVEIRA et al., 2004). Quando se utiliza mais de um agente tensoativo fixando-se a proporção destes, denomina-se diagrama de fases pseudoternário. Ao construir o diagrama, as misturas dos componentes em diferentes proporções podem gerar vários tipos de agregados, formando regiões específicas e delimitadas nesse diagrama. Pode-se então verificar a presença de emulsões, microemulsões, cristais líquidos entre outros arranjos (OLIVEIRA et al., 2004). Figura 3. Ilustração de um diagrama de fases pseudoternário. Fonte: O autor As microemulsões são consideradas sistemas reservatórios na qual o fármaco é compartimentalizado nas gotículas da fase interna, separados por uma interface, por isso, devem atravessar essa interface para serem liberados. Estes sistemas são importantes pois ajudam a contornar problemas de solubilidade de fármacos lipofílicos, modulam a estabilidade, protegem da hidrólise enzimática e melhoram a absorção do fármaco, devido à alta Revisão da literatura 21 Lígia de Souza Fernandes concentração agentes tensoativos (responsáveis por reduzir a tensão interfacial) (LAWRENCE, REES, 2000; OLIVEIRA e SCARPA, 2001; OLIVEIRA e SCARPA, 2002; FORMARIZ et al., 2005). De acordo com Oliveira & Scarpa (2002), as microemulsões são capazes de proporcionar ação prolongada, tropismo diferenciado para tecidos ou órgãos do organismo e podem veicular fármacos com diferentes propriedades físico- químicas e graus de hidrofilia/lipofilia. Gasco et al. (1990), por exemplo, descreve um sistema microemulsionado biocompatível de liberação prolongada contendo hormônio luteizante, por isso estes sistemas possuem as vantagens de aumentar a eficácia terapêutica possibilitando a diminuição da dose administrada e minimizando os efeitos colaterais inerentes ao fármaco. As microemulsões podem solubilizar quantidade considerável de fármacos lipossolúveis no domínio hidrofóbico e/ou fármacos hidrossolúveis na porção hidrofílica. A liberação do fármaco ocorre devido à difusão lenta e contínua do fármaco das gotículas para a fase contínua (GARTI, ANSERIN, 1996). Figura 4. Estrutura das microemulsões. (OLIVEIRA et al., 2004) Os cristais-líquidos também são sistemas pseudoternários (ou ternários, se constituídos por fase aquosa, oleosa e um agente tensoativo) que se posicionam entre os sólidos e líquidos e possuem uma parcial ordem e desordem das espécies atômicas; são chamados também de mesofases, e são classificados como liotrópicos ou termotrópicos. As mesofases liotrópicas são formadas por micelas que se organizam formando regiões hidrofóbicas e hidrofílicas alternadas. Os fármacos incorporados nesses sistemas, podem estar solubilizados nessas duas regiões, dependendo da solubilidade do fármaco. A liberação de fármacos incorporados Revisão da literatura 22 Lígia de Souza Fernandes em sistemas líquido-cristalinos dependerá da estrutura da mesofase formada e das características físico-químicas do fármaco (ERICSON et al., 1991; LARRSON, 1994; GABBOUN et al., 2001). As mesofases líquido-cristalinas são geralmente formadas pela presença de tensoativos da classe dos polioxietilenos, polímeros e lipídeos, como os triglicerídeos. Dependendo da temperatura e da concentração dessas moléculas em água, formam-se agregados bem estruturados, tais como mesofases cúbica, hexagonal ou lamelar (ERICSON et al., 1991; LARRSON, 1994; GABBOUN et al., 2001). A fase lamelar é formada por camadas paralelas e planas de bicamadas de tensoativo separadas por camadas de solvente, formando rede unidimensional. A mesofase hexagonal é constituída por micelas cilíndricas, formadas pelas moléculas agrupadas de tensoativos e a água preenche o volume entre os cilindros; na fase hexagonal reversa a fase oleosa fica ao redor dos cilindros formados por canais de água circundadas pela parte polar do tensoativo. Estes arranjos hexagonais, originam estruturas bidimensionais. As mesofases cúbicas são estruturas mais complicadas e visualizadas com maior dificuldade que as outras. As diferentes estruturas dos sistemas líquido- cristalinos influenciam de forma diferente na velocidade de liberação dos fármacos (ERICSON et al., 1991; LARRSON, 1994; EZRAHI et al., 1999; GABBOUN et al., 2001). Figura 5. Ilustração esquemática das mesofases líquido-cristalinas: (1) mesofase lamelar, (2A) mesofase hexagonal, (2B) mesofase hexagonal reversa, (3): mesofase cúbica de monoleolato de glicerila-água. (EZRAHI et al., 1999; SHAH et al., 2001) Revisão da literatura 23 Lígia de Souza Fernandes Vale ressaltar que além dos sistemas líquido-cristalinos, as microemulsões isotrópicas e emulsões também são consideradas mesofases, pois posicionam-se entre os sólidos e líquidos, no entanto, suas interfaces não possuem nenhuma ordem orientacional. É necessário o conhecimento das estruturas formadas quando se mistura os diferentes componentes, pois cada estrutura provoca um perfil de liberação do fármaco incorporado e dá diferentes características aos sistemas. A caracterização estrutural do sistema, através de técnicas como, espalhamento de raios-x a baixo ângulo (SAXS), microscopia de luz polarizada, difração de raios-x (DRX), comportamento reológico e outras técnicas, são ferramentas para elucidar a estrutura e consequentemente, conhecer o perfil de liberação do fármaco e eficácia dos sistemas. O perfil de liberação de um fármaco depende, na prática, de diversos fatores, como o tipo de fármaco, polimorfismo e cristalinidade, tamanho da partícula, solubilidade, quantidade de fármaco incorporado e os componentes da forma farmacêutica. A composição do veículo pode influenciar de modo significativo na liberação das substâncias ativas. Para os sistemas de liberação prolongada é importante a escolha de um agente apropriado capaz de controlar a liberação do fármaco e manter a ação terapêutica ao longo do tempo e ainda liberar o fámaco em um sítio alvo de ação; é muito comum o uso de um ou mais materiais poliméricos, que possuem a capacidade de modular a liberação dos fármacos a partir das formulações, assim, os sistemas que usam esses agentes também podem ser classificados como sistemas farmacêuticos matriciais. Os sistemas farmacêuticos matriciais são formados por cadeia poliméricas de uma ou várias substâncias químicas que possuem a função de modular a liberação do fármaco, esses materiais podem ser classificados em matrizes insolúveis e inertes, matrizes insolúveis em água e erodíveis e polímeros hidrofílicos. As matrizes insolúveis e inertes, como etilcelulose, polietileno e cloreto de polivinila, são aquelas que mantém sua estrutura constante na presença de água, são formadas por polímeros insolúveis, que formam uma estrutura porosa onde o fármaco está disperso. As matrizes lipídicas também não alteram sua estrutura na presença de água (LOPES, LOBO, COSTA, 2005). Revisão da literatura 24 Lígia de Souza Fernandes As matrizes hidrofílicas, como metilcelulose e hidroxipropilmetilcelulose, quando em contato com o meio de dissolução ou com o fluido aquoso gastrintestinal, absorvem água, através dos poros da matriz. Ocorre a hidratação do sistema e liberação do fármaco existente à superfície, depois, ocorre o intumescimento e relaxamento das cadeias poliméricas, e forma-se uma camada gelatinosa de polímero, essa camada exterior gelatinosa que vai se formando em contato com meio aquoso sofre erosão enquanto o núcleo vai sendo hidratado (LOPES, LOBO, COSTA, 2005). As matrizes insolúveis em água e erodíveis, como triglicerídeos cáprico/carpílico, fosatidilcolina de soja e o óleo de rícino hidrogenado, são matrizes hidrofóbicas (lipídicas) e, o controle da liberação do princípio ativo ocorre principalmente por mecanismos de difusão através dos poros ou por erosão, prevalecendo um ou outro mecanismo de acordo com as propriedades do fármaco e dos componentes utilizados (LOPES, LOBO, COSTA, 2005). 2.6 Microscopia de luz polarizada (MLP) O microscópio utilizado nesta técnica possui dois filtros de polarização, um condensador que permite que todo o feixe de luz propagado se conduza a uma só direção e um analisador, que reconhece a propagação ficando próximo à ocular (CARVALHO et. al., 2009). Se a substância analisada permitir a passagem da luz polarizada incidente sem modificação da sua propagação, tem-se o fenômeno de isotropia, neste fenômeno não ocorre o desvio da luz polarizada, ou seja, não se tem birrefringência, formando um campo escuro, exemplos desses sistemas são as microemulsões e mesofases cúbicas, neste caso são utilizadas outras técnicas de análises para diferenciar estas duas estruturas (CHORILLI et al., 2009). A birrefringência é um fenômeno que consiste na criação de dois raios refratados a partir de um único raio inicial, quando este incide sobre um campo anisotrópico. Este efeito provocado que divide o raio de luz em dois, com velocidades distintas, gera diferentes ângulos de refração. Quanto maior a diferença entre os dois índices de refração, mais birrefringente é o material (BECHTOLD, 2005). Revisão da literatura 25 Lígia de Souza Fernandes Se a amostra desviar o plano da luz incidente, ela é denominada como anisotrópica. Em um campo anisotrópico, a luz polarizada incidente é desviada pelas estruturas presentes que causam birrefringência, dessa forma é possível identificar estruturas típicas de cada mesofase líquido-cristalinas (MÜLLER- GOYMANN, 2004; CALIXTO et. al., 2013). Os cristais líquidos são espécies anisotrópicas (exceto os cristais líquidos de fase cúbica, que são isotrópicos); o arranjo hexagonal apresenta “estrias” (agregados de tensoativo organizados em cilindros formando estruturas parecidas com fibras), já o arranjo lamelar apresenta-se com várias camadas (lamelas) sobrepostas, formando estruturas denominadas "cruzes de malta” (MÜLLER-GOYMANN, 2004). É importante ressaltar que é necessário a análise dos sistemas com e sem a incorporação de princípios ativos. Muitos dados da literatura mostram as modificações nos tipos de mesofases e alterações nas propriedades dos sistemas devido a adição de fármacos e solventes (ENGSTROEM & ENGSTROEM, 1992; CHANG & BODMEIER, 1998; SALLAM et al., 2002; KUMAR et al., 2004; RIZWAN et al, 2009). Segundo Kumar et al. (2004) em seu estudo, a presença do fármaco lipofílico diazepan, favoreceu a formação de mesofase cúbica e hexagonal quando sua concentração foi aumentada no sistema. De acordo com Engstrom & Engstrom (1992) a incorporação de cloridrato de lidocaína promoveu a transição de mesofase cúbica em mesofase lamelar. Chang & Bodmeier (1998) avaliaram o efeito dos fármacos maleato de clorfeniramina e cloridrato de propranolol e solventes na construção do diagrama de fases, os dois fármacos promoveram a transição da mesofase cúbica para mesofase lamelar em altas concentrações e todos os solventes estudados alteraram o diagrama de fases. 2.7 Espalhamento de raios-X à baixo ângulo (SAXS) O espalhamento de raios-X à baixo ângulo é uma técnica analítica não destrutiva, utilizada como uma ferramenta na elucidação estrutural de mesofases. Essas características estruturais são reforçadas através dos estudos reológicos, estudos que proporcionam uma melhor definição sobre o comportamento desses sistemas. Revisão da literatura 26 Lígia de Souza Fernandes Na técnica de SAXS, as nanoestruturas causam um espalhamento da radiação incidente, a radiação incide em ângulos de θ menores que 10°, em ângulos baixos cada distância interplanar gera um espalhamento diferente e correspondente com diferentes estruturas nanométricas, caracterizando, desta forma, os sistemas pelo tamanho médio e a distância entre os objetos espalhadores, como gotículas, micelas ou estruturas cristalinas. Essa técnica também permite avaliar a estrutura de objetos espalhadores mesmo que eles não estejam organizados de forma ordenada (CARVALHO et al., 2012; MANAIA et al., 2012). No caso de sistemas líquido-cristalinos ou sistemas organizados a longas distâncias, a intensidade de espalhamento I(q) produzida exibe forma máxima para valores específicos do vetor de espalhamento q formando picos (picos de Bragg). Ao determinar a razão entre os diversos q em função da posição do primeiro pico (q1), é possível determinar qual o tipo de mesofase presente. Os agregados micelares e microemulsionados são compostos por regiões heterogêneas como regiões hidrofóbicas e hidrofílicas, cada região possui uma densidade eletrônica (não homogênea), assim, a intensidade de espalhamento produzida está relacionada com as diferenças entre as densidades eletrônicas de cada região dos sistemas (CARVALHO et al., 2012; MANAIA et al., 2012). Para estruturas lamelares, a posição relativa dos picos (em relação ao primeiro pico mais intenso) obedece a relação 1:2:3:4 e assim por diante, enquanto que, para estruturas hexagonais a relação é √1:√3:√4 e assim por diate. Para os cristais-líquidos de fase cúbica os valores correlacionados são 1,41÷1,73÷2,82÷3 (HOLMQVIST et al., 1997; YARIV et al., 2010). Em sistemas do tipo micelas e microemulsões, a banda de espalhamento gerada é larga, ou seja, apresenta-se como um pico amplo, associado com a desorganização das micelas (não há ordem orientacional nas interfaces) e portanto, baixa correlação espacial 3D. Já nas mesofases líquido-cristalinas a ordem orientacional nas interfaces é uma condição para a formação desses arranjos (BEAUCAGE et al., 1995). Revisão da literatura 27 Lígia de Souza Fernandes 2.8 Reologia É importante avaliar o comportamento reológico do sistema para verificar se este é satisfatório para a