Veterinária e Zootecnia Vet. Zootec. Supl. 2 ao v.18, n.2, Jun. (2011), p. 1-171 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootencia ISSN 0102 -5716 Botucatu - SP – Brasil 1 Veterinária e Zootecnia ISSN 0102 – 5716 VETERINÁRIA E ZOOTECNIA Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia UNESP – Campus de Botucatu 18618-000 – Dist. Rubião Jr. – Botucatu – SP – Brasil Portal: http://www.fmvz.unesp.br/revista/index.htm E-mail: vetzootecnia@fmvz.unesp.br Tel. 55 14 3811 6270 Fax. 55 14 3811 6075 Publicação quadrimestral Solicita-se permuta / Exchange desired Biblioteca do Campus de Botucatu 18618-000 – Dist. Rubião Júnior – Botucatu – SP - Brasil FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE Veterinária e Zootecnia / Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia. – Vol 1, n. 1(1985)- . – Botucatu, SP: FMVZ, 1985 Texto em português/inglês Descrição baseada em: Supl. ao Vol. 18, n.1, jun. (2011) ISSN 0102-5716 1. Medicina veterinária. 2. Zootecnia. I. Faculdade de Medicina Veterinaria e Zootecnia. Os artigos publicados na Revista VETERINÁRIA E ZOOTECNIA são indexados por: Current Awareness in Biological Sciences; Index Veterinarius; Veterinary Bulletin. PERIÓDICA: Índice de Revistas Latinoamericanas en Ciências; Cambridge Scientífic Abstracts; Biosis; CAB Abstracts. 2 VI CURSO DE ATUALIZAÇÃO EM ONCOLOGIA VETERINÁRIA Realizado em Botucatu nos dias 15 a 17 de outubro de 2010. Resumos expandidos Relatos de casos COORDENAÇÃO Professora Noeme Sousa Rocha Professora Renée Laufer Amorim Professor Júlio Lopes Sequeira ORGANIZAÇÃO Serviço de Patologia Veterinária – FMVZ Unesp campus de Botucatu-SP COMISSÃO CIENTÍFICA Breno Souza Salgado Fabrizio Grandi Fernanda Carmello Figueiroa Isabelle Ferreira Lidianne Narducci Monteiro Marcia Moleta Colodel Mariana Marras Vidali Paulo Ricardo de Oliveira Bersano Raquel Beneton Ferioli APOIO Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – UNESP campus Botucatu Serviço de Patologia Veterinária – FMVZ UNESP campus Botucatu Pró-Reitoria de Extensão – PROEX Associação Brasileira de Patologia Veterinária – ABPV 3 RESUMOS EXPANDIDOS ABORDAGEM CIRÚRGICA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS EM PEQUENOS ANIMAIS: PERFIL DO PACIENTE, COMPORTAMENTON E EPIDEMIOLOGIA TUMORAL – Cecília Bowolo de Campos, Rodrigo dos Santos Horta, Gustavo Carvalho Cobucci, Fabíola Pesarini Regues Botelho, Gleidice Eunice Laval, Geovanni Dantas Cassali 07 AVALIAÇÃO DA INTENSIDADE DE DANO NO DNA DOS CARCINOMAS MAMÁRIOS DAS CADELAS - Yara de Oliveira Brandão, Marcia Moleta Colodel, Isabelle Ferreira, Daisy Maria Favero Salvadori, Noeme Sousa Rocha. 13 AVALIAÇÃO PELO ENSAIO COMETA DE DOIS PROTOCOLOS PARA EXTRAÇÃO DE CÉLULAS MAMÁRIAS NEOPLÁSICAS E NÃO NEOPLÁSICAS DE CADELAS - Marcia Moleta Colodel, Yara de Oliveira Brandão, Isabelle Ferreira, João Ferreira de Lima Neto, Noeme Sousa Rocha. 19 CARACTERIZAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO DE METALOPROTEINASE-9 EM FORMAÇÕES MAMÁRIAS DE CADELAS - Kamila Alcalá Gonçalves, Vanessa de Oliveira Lebrão, Silvia Regina Kleeb, José Guilherme Xavier. 25 CLASSIFICAÇÃO CITOMORFOLÓGICA COMO FATOR PROGNÓSTICO NO TUMOR VENÉREO TRANSMISSÍVEL NA REGIÃO DE BANDEIRANTES/PR - Nazilton De Paula Reis Filho, Celmira Calderón, Alexandre Augusto Arenales Torres, Robson Leite Garcia, Tatiana Jacintho Olenscki, Karina Maria Basso. 30 EXPRESSÃO DA PROTEÍNA P63 EM ADENOMAS E CARCINOMAS MAMÁRIOS METASTÁTICOS E NÃO-METASTÁTICOS DE CADELAS - Erika Maria Terra, Marcela Marcondes Pinto Rodrigues, Geórgia Modé Magalhães, Mirela Tinucci Costa, Renée Laufer Amorim, Noeme Sousa Rocha. 35 ESTUDO RETROSPECTIVO DAS NEOPLASIAS EM CAVIDADE ORAL ATENDIDAS NO SERVIÇO DE CLÍNICA MÉDICA DO HOSPITAL VETERINÁRIO DA FACULDADE UPIS, BRASÍLIA-DF - Carlos Eduardo Fonseca Alves, Aline Gonçalves Correa, Lincoln Eidi Kubota, Robson Alves Moreira, Sabrina Dos Santos Costa. 40 ESTUDO COMPARATIVO ENTRE O PADRÃO DE ADERÊNCIA IN VITRO DE CÉLULAS DA LINHAGEM B16F10 DO MELANOMA MURINO E SUA DISTRIBUIÇÃO METASTÁTICA - Kátia Regina Teixeira de Souza, Elisabeth Martins Silva da Rocha, Maria de Lourdes Gonçalves Ferreira, Roberto Alfonso Arcuri. 44 O USO DO EXAME HISTOPATOLÓGICO NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE TUMOR DE MAMA E DE GLÂNDULA SALIVAR EM RATAS - Isabelle Ferreira, Marcia Moleta Colodel, Noeme Sousa Rocha 48 PREVALÊNCIA DE NEOPLASIAS EM GATOS DOMÉSTICOS EM ARAÇATUBA E REGIÃO: ESTUDO RETROSPECTIVO (1997- 2007) - 4 Augusto Schweigert, Thais Larissa Lourenço Castanheira, Andressa Antunes Machado, Aline Alvarenga Rocha, Daniela Soares Migliolo, Débora Cristina Romero, Gabriela Mayumi Gouveia, Mayara Caroline Rosolem, Milla Bezerra Paiva, Gisele Fabrino Machado. 52 TÉCNICA DE DETECÇÃO DO LINFONODO SENTINELA DA GLÂNDULA MAMÁRIA DE CADELAS UTILIZANDO AZUL PATENTE V E TECNÉCIO 99m Tc - Hugo Enrique Orsini Beserra, Raíssa Vasconcelos Cavalcante, Adriana Wanderley de Pinho Pessoa, Luiz Gonzaga Porto Pinheiro 57 USO DO AZUL DE METILENO NA IDENTIFICAÇÃO DO LINFONODO SENTINELA EM CADELAS COM NEOPLASIAS MAMÁRIAS - Eric Masiero El Khatib, Priscila Fernandes Theophilo de Almeida Pires, Andressa de Fátima Kotleski Thomaz de Lima, Cláudia Sampaio Fonseca Repetti, Rodrigo Prevedello Franco, Alessandre Hataka. 60 USO ORAL DO SULFATO DE CONDROITINA NA PROTEÇÃO DO EPITÉLIO VESICAL DE CÁES DURANTE TRATAMENTO QUIMIOTERÁPICO COM CICLOFOSFAMIDA - Kátia Regina Teixeira De Souza, Elisabeth Martins Silva da Rocha, Carolina Borges Eccard Leal, Maria De Lourdes Gonçalves Ferreira. 66 RELATOS DE CASO ADENOCARCINOMA PROSTÁTICO EM CÃO – RELATO DE CASO - Carlos Eduardo Fonseca Alves, Stephane Cássia Oliveira Rosa Vexenat, Lincoln Eidi Kubota, Nina Miglioranza Velloso. 70 ADENOCARCINOMA HEPATÓIDE EM UMA CADELA OVARIOISTERECTOMIZADA COM HIPERADRENOCORTICISMO – RELATO DE CASO - Rodrigo dos Santos Horta, Gleidice Eunice Lavalle, Antônio Augusto Munhoz Rodrigues, Luiz Carlos Pereira, Rubens Antônio Carneiro 75 ASSOCIAÇÃO DE CIRURGIA, QUIMIOTERAPIA E IMUNOTERAPIA NO TRATAMENTO DE MELANOMA CANINO DE CAVIDADE ORAL – RELATO DE DOIS CASOS - Cecília Bonolo de Campos, Gleidice Eunice Lavalle, Rodrigo Dos Santos Horta, Antônio Augusto Munhoz Rodrigues, Awilson Araújo Siqueira Viana, Rubens Antônio Carneiro. 80 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS EM JARARACA-PINTADA (BOTHROPOIDES PAULOENSIS) MANTIDA EM CATIVEIRO - Maria Isabel Sousa Paiva, Natália Perussi Biscola, Thaís Rosalen Fernandes, Júlio Lopes Sequeira, Rui Seabra Ferreira Junior. 86 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS RETROBULBAR EM UM CÃO - Carlos Eduardo Fonseca-Alves, Stephane Cássia Oliveira Rosa Vexenat, Valéria Trombini Vidotto, Sabrina Dos Santos Costa. 89 CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS VAGINAL EM UMA VACA – RELATO DE CASO - Débora Cristina Romero, Mayara Caroline Rosolem, Aline Alvarenga Rocha, Augusto Schweigert, Milla Bezerra Paiva, Gabriela 5 Mayumi Gouveia, Maria Cecília Rui Luvizotto. 93 CARCINOMA DE GLÂNDULA PARATIREÓIDE EM CÃO – RELATO DE CASO - Mayara Caroline Rosolem, Débora Cristina Romero, Aline Alvarenga da Rocha, Milla Bezerra Paiva, Gabriela Mayumi Gouveia, Maria Cecília Rui Luvizotto, Acácio Duarte Pacheco, Sheila Nogueira Saraiva da Silva, Wagner Luiz Ferreira. 96 CARCINOMA PANCREÁTICO EM UM CÃO-RELATO DE CASO - Janete Madalena da Silva, Débora Cristina Romero, Mayara Caroline Rosolem, Alexandre Lima de Andrade, Flávia de Rezende Eugênio, Maria Cecília Rui Luvizotto. 100 CARCINOMA PROSTÁTICO METÁSTATICO EM CÃO – RELATO DE CASO - Arita de Cássia Marella Cremasco, Rodrigo Garcia Motta, Freddi Bardela de Sousa, Marcela Marcondes Pinto Rodrigues, Jane Megid, Renée Laufer Amorim, Julio Lopes Sequeira. 104 COLANGIOCARCINOMA INTRAHEPÁTICO EM CÃO - RELATO DE CASO - Leonardo Fabrício Pavan, Patrícia Franciscone Mendes, Paulo Roberto Martin, Pedro Pinczowski. 108 DERMATOFIBROSE NODULAR EM CÃO DA RAÇA PASTOR ALEMÃO - RELATO DE CASO - Carlos Eduardo Fonseca Alves, Sabrina dos Santos Costa, Aline Gonçalves Corrêa. 111 EXTENSO FIBROSSARCOMA EM ROTTWEILER JOVEM – RELATO DE CASO - Stephane Cássia Oliveira Rosa Vexenat, Rômulo Santos Adjuto Eloi, Nina Miglioranza Velloso, Gustavo Venezian Rovai, Rodrigo Carvalho Freitas. 115 HEMANGIOSSARCOMA EM TERCEIRA PÁLPEBRA EM GATO – RELATO DE CASO - Simone Scarpin de Sá, Juliana Kahn Pereira Nunes, Alessandre Hataka, Cláudia Sampaio Fonseca Repetti. 119 LINFOMA LÍNGUAL EM UM CÃO – RELATO DE CASO - José Eduardo Silva Lobo Jr., Angela Maria Blotta, Marta Marani, Wilma Dias, Thiago Rinaldi Müller. 123 MASTOCITOMA CUTÂNEO EM UM CÃO DOBERMANN – RELATO DE CASO - Fernando Simonetti, Anderson do Prado Duzanski, Bruno Jacomini Cachone, Mário Henrique Bariani, Tiago Torrecilas Sturion. 126 MULTIPLAS NEOPLASIAS EM UM CÃO DA RAÇA FILA – RELATO DE CASO Augusto Schweigert, Thais Larissa Lourenço Castanheira, Aline Alvarenga da Rocha,Débora Cristina Romero, Gabriela Mayumi Gouveia, Mayara Caroline Rosolem, Milla Bezerra Paiva, Janete Madalena da Silva, Gisele Fabrino Machado. 129 NEOPLASIA LINFÓIDE EM CANÁRIO (SERINUS CANARIUS) - RELATO DE CASO - Taís Cremasco Donato, Ana Angelita Sampaio Baptista, Isabelle Ferreira, Adriano Sakai Okamoto, Julio Lopes Sequeira, Raphael Lucio Andreatti Filho. 133 6 OSTEOPATIA HIPERTRÓFICA EM CADELA COM METÁSTASE PULMONAR DE NEOPLASIA MAMÁRIA – RELATO DE CASO - Táya Figueiredo de Oliveira, Kátia Regina Teixeira de Souza, Cristina Mendes Pliego, Alexandre Coelho de Figueiredo, Lyvia Cabral Ribeiro Carvalho, Ana Maria Reis Ferreira, Maria de Lourdes Gonçalves Ferreira. 137 QUIMIOTERAPIA ADJUVANTE COM LOMUSTINA NO TRATAMENTO DO MASTOCITOMA CANINO DE GRAU III – RELATO DE DOIS CASOS - Rodrigo Dos Santos Horta, Gleidice Eunice Lavalle, Antônio Augusto Munhoz Rodrigues, Cecília Bonolo de Campos, Rubens Antônio Carneiro. 141 REAÇÃO DE HIPERSENSIBILIDADE CUTÂNEA PELA ADMINISTRAÇÃO DE PACLITAXEL NO TRATAMENTO DE METÁSTASES PULMONARES EM UM FELINO – RELATO DE CASO - Talita Mariana Morata Raposo, Andrigo Barboza De Nardi, Rafael Ricardo Huppes, Daniel Kan Honsho. 146 SARCOMA INDIFERENCIADO EM CANÁRIO (SERINUS CANARIUS) - RELATO DE CASO - Taís Cremasco Donato, Isabelle Ferreira, Ticiana Silva Rocha, Adriano Sakai Okamoto, Julio Lopes Sequeira, Raphael Lucio Andreatti Filho. 150 TUMOR BENIGNO DA BAINHA NEURAL PERIFÉRICA EM UM MULA - Débora Cristina Romero, Mayara Caroline Rosolem, Gisele Fabrino Machado, Maria Cecília Rui Luvizotto, Augusto Schweigert, Sérgio da Silva Rocha Junior, Vanessa Justiniano Bermejo, Juliana Regina Peiró. 155 TUMOR VENÉREO TRANSMISSÍVEL CANINO COM LISE OSSÉA DE MANDÍBULA EM BOXER - Fernando Simonetti, Tiago Torrecillas Sturion, Marco Aurélio Torrecillas Sturion, Domingos José Sturion, Mário Henrique Bariani, Freddi Bardela de Souza, Carla Fredrichsen Moya-Araujo, André Luiz Torrecillas Sturion. 159 TUMOR VENÉREO TRANSMISSÍVEL CUTÂNEO PRIMÁRIO: RELATO DE CASO - Nazilton de Paula Reis Filho, Celmira Calderón, Alexandre Augusto Arenales Torres, Robson Leite Garcia, Tatiana Jacintho Olenscki, Karina Maria Basso. 163 USO DA ULTRASSONOGRAFIA COMO MÉTODO AUXILAR NA OBTENÇÃO DE AMOSTRAS POR CITOLOGIA ASPIRATIVA POR AGULHA FINA (CAAF) EM LESÕES LÍTICAS DO ESQUELETO AXIAL EM CÃES – RELATO DE CASO - Danuta Pulz Doiche, Victor José Viera Rossetto, Fabrizio Grandi, Raquel Sartor, Luiz Carlos Vulcano, Maria Jaqueline Mamprim. 168 7 ABORDAGEM CIRÚRGICA DAS NEOPLASIAS MAMÁRIAS EM PEQUENOS ANIMAIS: PERFIL DO PACIENTE, COMPORTAMENTO E EPIDEMIOLOGIA TUMORAL SURGICAL TREATMENT OF MAMMARY TUMORS IN SMALL ANIMALS: PATIENT PROFILE, BEHAVIOR AND EPIDEMIOLOGY TUMOR ABORDAJE QUIRÚRGICA DE TUMORES MAMARIOS EN PEQUEÑOS ANIMALES: PERFIL DEL PACIENTE, EL COMPORTAMIENTO Y LA EPIDEMIOLOGÍA DEL TUMOR Cecília Bonolo Campos 1 Rodrigo dos Santos Horta 2 Gustavo Carvalho Cobucci 2 Fabíola Pesarini Rodrigues Botelho 2 Gleidice Eunice Lavalle 3 Geovanni Dantas Cassali 1 Palavras-chave: Neoplasia mamária, mastectomia, canino, felino. INTRODUÇÃO O tumor mamário é a neoplasia mais freqüente na cadela e a terceira mais freqüente na gata, ocorrendo principalmente em animais de idade avançada. A metastização, geralmente ocorre pela via linfática para os linfonodos, pulmões, pleura, fígado, diafragma, glândulas adrenais, rins e ossos (1). O prognóstico do paciente está relacionado com fatores como: tamanho do tumor, envolvimento de linfonodos, presença de metástases à distância, tipo histológico, nível de diferenciação nuclear, grau de invasão, crescimento intravascular, presença de receptores para estrógeno e progesterona (2). Nas gatas a progressão tumoral parece ser mais rápida e a maioria dos casos encontra-se em estágio avançado com envolvimento múltiplo de glândulas com massas maiores que 3 cm, fixas à pele e ulceradas, com metástases em linfonodos ou à distância (3). A cirurgia é o tratamento de escolha para as neoplasias mamárias. Na cadela a conduta cirúrgica depende da extensão da doença, drenagem linfática, tamanho e localização da 1 Departamento de Patologia Geral – Instituto de Ciências Biológicas – Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Av. Antônio Carlos 6626, Campus Pampulha, Belo Horizonte/MG. Email para correspondência: ceciliabonolo@gmail.com 2 Aluno de graduação em Medicina Veterinária – Escola de Veterinária – Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Av. Antônio Carlos 6626, Campus Pampulha, Belo Horizonte/MG. 3 Médico Veterinário – Hospital Veterinário – Universidade Federal de Minas Gerais (UFMG). Av. Antônio Carlos 6626, Campus Pampulha, Belo Horizonte/MG. 8 lesão (4). Na gata, a mastectomia radical, com remoção de todas as mamas do lado acometido, é sempre preconizada, independente do tamanho e localização das lesões. Isso ocorre, pois nessa espécie, as neoplasias mamárias apresentam um comportamento biológico mais agressivo (5). Este trabalho teve como objetivo avaliar o perfil do paciente, o comportamento e a epidemiologia dos tumores mamários nos animais submetidos ao tratamento cirúrgico. MATERIAL E MÉTODOS No ano de 2009, foram atendidos, no setor de Oncologia do Hospital Veterinário da UFMG, 70 animais que apresentaram tumores de mama. No momento do atendimento clínico foram registradas informações passadas pelo proprietário a respeito do tempo de desenvolvimento da lesão, características do ciclo estral, número de partos, histórico de pseudociese e aborto, utilização de hormônios e métodos de esterilização. Os animais foram submetidos ao tratamento cirúrgico conforme a extensão da doença, drenagem linfática, tamanho e localização da lesão. As técnicas cirúrgicas empregadas foram descritas por Fossum (6). De forma geral, lesões menores que 2 cm, encapsuladas, não invasivas e localizadas na periferia da glândula foram tratadas por lumpectomia. As demais lesões foram tratadas com mastectomia simples, regional ou radical segundo a drenagem linfática. Para minimizar o risco de deiscência da ferida cirúrgica, excesso de dor pós- operatória e perda na qualidade de vida das pacientes, a mastectomia radical, quando necessária nas duas cadeias mamárias, foi feita em duas etapas com intervalos de 15-30 dias. Os linfonodos inguinais foram removidos sempre que foi feita a remoção da mama inguinal correspondente. A exérese de linfonodos axilares só foi realizada quando estes apresentavam alterações quanto ao tamanho, forma e consistência (7). As lesões removidas foram acondicionadas em formol 10% e enviadas para caracterização da lesão e definição do diagnóstico histológico no Laboratório de Patologia Comparada do Instituto de Ciências Biológicas da UFMG. RESULTADOS Dos 70 animais submetidos à exérese de tumor de mama no HV-UFMG, todos eram fêmeas, sendo que aproximadamente 90% destes apresentavam mais de sete anos de idade. Quanto à espécie, apenas quatro indivíduos eram gatos. Os cães foram 9 responsáveis por 94,3% dos atendimentos, sendo a grande maioria animais da raça Poodle (49%). Cães sem raça definida representaram 12% dos atendimentos seguidos pelos cães da raça Cocker (10%) e Pinscher (4%). Foram realizados 95 procedimentos cirúrgicos, pois doze animais foram submetidos a outro procedimento simples no mesmo momento cirúrgico e treze animais necessitaram da realização de procedimentos cirúrgicos extensos em etapas distintas. A lumpectomia foi realizada em 26% das vezes e a mastectomia simples em 13%. A mastectomia regional e a radical corresponderam, respectivamente, a 28 e 33% dos procedimentos realizados. A idade média dos animais submetidos à cirurgia foi de 10,6 anos, mas foi observada uma média inferior nos procedimentos menores como na mastectomia simples e lumpectomia, sendo que a média de idade de aparecimento dos tumores foi 9 anos. Todos os gatos atendidos foram submetidos à mastectomia radical no lado acometido, independente do número e tamanho de lesões. Foi observado um total de onze lesões nas quatro gatas atendidas, sendo oito destas, malignas (72%). Duas das quatro gatas atendidas apresentaram metástase de carcinoma no linfonodo inguinal. Nos cães, 56% das lesões observadas nas mamas eram malignas, 29% benignas e 15% corresponderam a alterações não neoplásicas do tecido mamário como mastite crônica, ectasia e hiperplasia ductal. Dentre os tumores malignos os mais freqüentes foram o carcinoma em tumor misto (27%) e o tumor misto com áreas de carcinoma ―in situ‖ (15%). Dentre as lesões benignas, a mais freqüente foi o tumor misto benigno (21%). Foi observada uma maior porcentagem de neoplasias malignas nas mamas abdominais (42%) e inguinais (35%). Aproximadamente 65% das cadelas com tumores de mama apresentavam histórico de pseudociese. A administração prévia de progestágenos foi relatada em 11,3% das cadelas com neoplasias mamárias, mas não houve correlação com a malignidade ou tipo histológico dos tumores observados. Apesar de ter sido utilizada uma abordagem mais conservadora nas cadelas, optando-se sempre que possível por cirurgias menos extensas como a lumpectomia e mastectomia simples, não foram relatadas recidivas – reaparecimento do tumor sob a cicatriz cirúrgica – num tempo de observação de seis meses, e não foram observadas complicações pós-operatórias. 10 As cadelas que apresentaram metástases ou tumores com diagnóstico histológico compatível com a associação de quimioterapia para complementação terapêutica foram tratadas de acordo com a rotina e protocolos preconizados pelo serviço de oncologia do Hospital Veterinário da UFMG. DISCUSSÃO Assim como observado no estudo, os tumores mamários, em cães, ocorrem com maior freqüência em fêmeas entre sete e doze anos de idade e, embora não haja predisposição racial, observa-se maior incidência nas raças Poodle, Pastor Alemão, Cocker Spaniel e animais sem raça definida (8). Na cadela, cerca de 50% das neoplasias mamárias são malignas (9) e estão localizadas preferencialmente nas mamas abdominais caudais e inguinais (7), no entanto, neste estudo foi observada uma maior incidência de lesões malignas. Dentre as neoplasias mamárias malignas, a mais freqüente foi o carcinoma em tumor misto, que é resultado de uma transformação maligna na porção epitelial do tumor misto benigno, neoplasia responsável por cerca de 40% dos casos de tumores mamários benignos na cadela (10). A abordagem cirúrgica mais agressiva dos tumores mamários em felinos é justificada pelo percentual elevado de lesões malignas encontradas, em concordância com a literatura consultada (5), sendo que duas das quatro gatas atendidas apresentaram metástase em linfonodos regionais, indicando doença com estadiamento avançado. Em animais submetidos a tratamentos cirúrgicos menos agressivos, é freqüente o aparecimento de novas lesões tumorais no tecido mamário remanescente, principalmente em cadelas não ovário-histerectomizadas com histórico de pseudociese e tumores mistos benignos (11). A ausência de recidivas nesse estudo pode estar relacionada à associação de quimioterapia adjuvante, em casos de pior prognóstico, conforme a rotina e protocolos preconizados pelo setor de Oncologia do HV-UFMG. O conhecimento do comportamento tumoral e dos aspectos epidemiológicos das neoplasias mamárias em cães e gatos permite a aplicação de abordagens cirúrgicas diferentes nas duas espécies (4,5). Esse tipo de conduta evita que o animal seja submetido a um tratamento agressivo desnecessário reduzindo o tempo cirúrgico, o risco anestésico e as complicações pós-operatórias. Os resultados encontrados corroboram com um estudo prospectivo realizado com 144 cadelas, no qual não foi 11 observada diferença na taxa de recidiva quando comparadas as técnicas de mastectomia simples e radical (12). CONCLUSÃO É importante que os tumores mamários sejam sempre removidos, independente do tamanho das lesões, pois na gata, as neoplasias geralmente apresentam rápida progressão maligna e na cadela, o tumor benigno mais freqüente é o tumor misto benigno que com o tempo pode sofrer transformação maligna. O aumento da média de idade dos animais submetidos a procedimentos cirúrgicos mais extensos demonstra a importância de se retirar os nódulos enquanto eles ainda apresentam aspecto benigno, com menos de 3 cm, bem circunscritos e não fixos à pele ou musculatura, antes de sofrerem progressão maligna e metástase. Nesse ponto é possível aplicar uma abordagem cirúrgica mais conservadora como a lumpectomia ou mastectomia simples, reduzindo o tempo de cirurgia, o risco anestésico e as complicações pós-operatórias. O conhecimento biológico da doença nas diferentes espécies, o diagnóstico e tratamento precoce permite um bom planejamento terapêutico com intervenções cirúrgicas menos agressivas oferecendo aos animais uma recuperação mais rápida e um pós-cirúrgico menos doloroso com baixa chance de recidiva. REFERÊNCIAS 1. Withrow SJ, Vail DM. Small Animal Clinical Oncology. 4. ed. Philadelphia: Saunders Elsevier. 2007. 846 p. 2. Cavalcanti MF, Cassali GD. Fatores prognósticos no diagnóstico clínico e histopatológico dos tumores de mama em cadelas – revisão. Clín. Vet. 2006, 11(61):54- 64. 3. Kessler M, Vonvomhard D. Mammary tumors in cats: epidemiologic and histologic features in 2,836 cases (1990-1995). Kleintierprax. 1997, 42:459-468. 4. Brodey RS, Goldschmidt MH, Roszel JR. Canine mammary gland neoplasms. J. Am. Anim. Hosp. Assoc. 1983, 19:61-90. 5. Hayes A. Feline mammary gland tumors. Vet. Clin. North Am. 1977, 7:205-212. 6. Fossum TW. Cirurgia de pequenos animais. 2. ed. São Paulo: Roca. 2005. 1390p. 12 7. Morrison WB. Canine and feline mammary tumors. In: Morrison WB, editor. Cancer in dogs and cats: medical and surgical management. 1th ed. Philadelphia: Linppincott Willians & Wikins. 1998. p.591-98. 8. Daleck CR, Franceschini PH, Alesse AC, Santana AE, Martins MIM. Aspectos clínicos e cirúrgicos do tumor mamário canino. Ciênc. Rural, Santa Maria. 1998, 28(1):95-100. 9. DeNardi AB, Rodaski S, Souza RS, Costa TA, Macedo TR, Rodrigheri SM, Rios A, Piekars CH. Prevalência de neoplasias e modalidades de tratamentos em cães, atendidos no Hospital Veterinário da Universidade Federal do Paraná. Arch. Vet. Sci. 2002, 7(2):15-26. 10. Filho JC, Kommers GD, Masuda EK, Marques BMFPP, Fighera RA, Irigoyen LF, Barros CSL. Estudo restrospectivo de 1647 tumores mamários em cães. Pesq. Vet. Bras. 2010, 30(2):177-185. 11. Sorenmo KU, Shofer FS, Goldschmidt MH. Effects of spaying and timing of spaying on survival of dogs with mammary carcinomas. J. Vet. Intern. Med. 2000, 14:266-270. 12. MacEwen EG, Harvey HJ, Patnaik AK, Mooney S, Hayes A, Kurzman I, Hardy WD. Evaluation of effects of levamisole and surgery on canine mammary cancer. J. Biol. Response Modif. 1985, 4:418-426. 13 AVALIAÇÃO DA INTENSIDADE DE DANO NO DNA DOS CARCINOMAS MAMÁRIOS DAS CADELAS ASSESSMENT OF THE INTENSITY OF DNA DAMAGE IN MAMMARY CARCINOMAS OF FEMALE DOG EVALUACIÓN DE LA INTENSIDAD DE DAÑO DEL DNA EN LOS CARCINOMAS MAMARIOS DE LAS PERRAS Yara de Oliveira Brandão 1 Marcia Moleta Colodel 1 Isabelle Ferreira 1 Daisy Maria Favero Salvadori 2 Noeme Sousa Rocha 1 Palavras-chave: Ensaio cometa, carcinoma de mama, cão. INTRODUÇÃO As neoplasias mamárias representam aproximadamente 50% de todos os processos neoplásicos da cadela (1,8). Entre 26 e 73% dessas neoplasias são malignas (8,9), dentre estas, os carcinomas são os mais comuns (5,6). Dependendo dos elementos estruturais histológicos os carcinomas de mama das cadelas podem ser divididos em simples e complexos. Carcinomas simples são compostos por células epiteliais neoplásicas e o carcinoma complexo é composto por células epiteliais neoplásicas e mioepiteliais proliferadas (6). Acredita-se que as células epiteliais estejam diretamente relacionadas com a progressão e disseminação da doença e o componente mioepitelial com a proteção da mama suprimindo a proliferação e a invasão da neoplasia (2,5). Em qualquer uma das fases dos processos neoplásicos os danos no DNA podem ser avaliados pelo Ensaio Cometa (3,7). Esta técnica permite a detecção, em células isoladas, de quebra de fita simples e dupla, sítios álcali-lábeis e ligações cruzadas no DNA, que migram do núcleo da célula durante a eletroforese. Essa migração resulta na formação de uma imagem semelhante a um cometa, com cabeça e cauda. Quanto maior a lesão genômica, mais extensa será a migração. Portanto, medidas como o 1 Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu. Distrito de Rubião Jr., s/n, Botucatu, SP, CEP: 18618-970, e-mail: yara_brandao@hotmail.com 2 Departamento de Patologia, Faculdade de Medicina de Botucatu, UNESP, Botucatu. Distrito de Rubião Jr., s/n, Botucatu, SP. CEP: 18618-970. 14 comprimento total da cauda fornecem dados indiretos sobre o estado do DNA da amostra (7,10). Considerando que a possibilidade de quantificar a lesão genômica pode auxiliar na compreensão do comportamento biológico da neoplasia, o objetivo deste estudo foi avaliar a intensidade de dano no DNA, através do Ensaio Cometa, em células de carcinoma de mama simples e complexo de cadela. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo é parte do projeto aprovado pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da instituição sob protocolo número 42/2009. Foram selecionadas 30 cadelas, sem raça definida, com idade entre sete e 12 anos, atendidas na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo. Ao exame clínico das 30 cadelas, 20 apresentavam neoplasia em mamas inguinais e foram submetidas à mastectomia e 10 não apresentavam neoplasia mamária e foram submetidas à ovariosalpingohisterectomia eletiva. Durante os procedimentos cirúrgicos foram colhidos, por biopsia incisional, dois fragmentos dos nódulos neoplásicos das cadelas com neoplasia em mama e das mamas inguinais das cadelas que não apresentavam neoplasia mamária. Os fragmentos mediam 1 cm 2 e 0,5 cm 2 e foram destinados ao exame histopatológico e ao Ensaio Cometa, respectivamente. Para a análise histopatológica, o fragmento colhido das mamas neoplásicas e não neoplásicas foi fixado em formalina 10%, rotineiramente processado para histopatologia e corado com hematoxilina e eosina. A leitura das lâminas foi realizada sob microscopia de luz em campo claro, seguindo os critérios de classificação das neoplasias mamárias de acordo com a composição celular adotados por Misdorp et al. (6). De acordo com os resultados das análises histopatológicas das amostras foram formados três grupos (I, II, III) com 10 amostras cada. Os Grupos I e II foram formados por amostras de carcinoma simples e carcinoma complexo, respectivamente. O Grupo III (controle) foi formado por amostras mamárias não neoplásicas. Para o Ensaio Cometa das amostras colhidas dos carcinomas (grupos I e II) e das mamas não neoplásicas (Grupo III) seguiu-se a técnica descrita por Singh et al. (10) com modificações. Para tanto, as amostras foram incubadas em solução de tripsina pronta para uso (LGC biotecnologia), a 37°C durante 30 minutos e centrifugadas a 1200 15 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado, o precipitado de células foi ressuspendido com 1 ml de PBS livre de cálcio e magnésio contendo Soro Fetal Bovino, novamente centrifugado 1200 rpm durante 10 minutos e em seguida, foi resuspendido com 1 ml de PBS livre de cálcio e magnésio.Uma alíquota de 30 μl da suspensão foi misturada a 100 μl de agarose de baixo ponto de fusão (0,5 %) e colocada sobre uma lâmina previamente coberta com uma camada de agarose de ponto de fusão normal. Em seguida, a lâmina foi coberta com lamínula e deixada a 4ºC por 5 minutos para solidificar a agarose. Após esse período, a lamínula foi cuidadosamente removida e a lâmina transferida para uma solução de lise (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10mM, lauril sarcosinato de sódio 1 %, pH 10; Triton X-100 1% e DMSO 10%) por 24 horas. As lâminas foram então lavadas em PBS livre de cálcio e magnésio e colocadas em uma cuba horizontal de eletroforese preenchida com tampão alcalino (EDTA 1mM e NaOH 300 mM, pH 13). Após período de 20 minutos, a eletroforese foi conduzida a 25 V e 300 mA por outros 20 minutos. Em seguida, as lâminas foram transferidas para solução de neutralização (Tris 0,4 M, pH 7,5) por 15 minutos e desidratadas em etanol absoluto por 5 minutos. Para análise, os nucleóides (região da célula que contém o material genético) foram corados com Sybr Green (Sigma, St Louis, EUA). Foram analisados 100 nucleóides, em microscópio de fluorescência acoplado ao sistema de análise de imagem (Comet Assay II - Perspective Instruments, Haverhill, Inglaterra). O parâmetro utilizado para mensurar os danos no DNA foi o tail intensity que representa a porcentagem de DNA contida na cauda do cometa. Os dados numéricos da intensidade de danos no DNA foram analisados estatisticamente pela Análise de Variância e as médias dos grupos foram comparadas pelo Teste de Tukey ao nível de significância p≤0,05. RESULTADOS A intensidade de dano no DNA foi maior nas células de mama que apresentavam carcinoma simples em relação às células mamárias não neoplásicas (p=0,015). Entre as células das mamas com carcinoma complexo e as células das mamas não neoplásicas não foram observadas diferenças estatísticas na intensidade de dano no DNA, mas observou-se uma tendência numérica do dano ser maior nas células com carcinoma complexo. Ao comparar as diferenças na intensidade de dano entre os tipos 16 morfológicos dos carcinomas avaliados, observou-se nas células com carcinoma simples uma tendência em ser maior em relação às células com carcinoma complexo, no entanto, as diferenças não foram estatisticamente significativas (Tabela 1). Tabela 1. Média e desvio padrão da intensidade de dano no DNA em células de mama que apresentavam carcinoma simples (Grupo I), carcinoma complexo (Grupo II) e células mamárias não neoplásicas (Grupo III). Intensidade de dano no DNA Grupos Média Desvio padrão I 13,70 a 8,80 II 8,85 ab 4,85 III 5,57 b 0,94 Médias seguidas de letras diferentes na mesma coluna diferem entre si pela Análise de Variância seguida do Teste de Tukey (p=0,015). DISCUSSÃO O Ensaio Cometa envolve a corrida de células únicas em gel de eletroforese, sendo um método muito sensível e de confiança para a detecção de quebras nas fitas do DNA ou índice de dano do DNA ou intensidade de migração do DNA (3,7,10). Com o Ensaio Cometa aplicado às células das mamas neoplásicas e não neoplásicas das cadelas desse estudo, foi possível observar a intensidade de dano no DNA dessas células. Apesar de não ser observada significância estatística, a tendência da maior intensidade de migração do DNA das células mamárias com carcinoma simples em relação às células das mamas com carcinoma complexo e destas em relação às células das mamas não neoplásicas poderia sugerir que quanto maior o dano no DNA, mais agressivo é a neoplasia mamária, uma vez que o carcinoma simples é considerado mais agressivo que o carcinoma complexo (2,5). Considerando que para predizer o prognóstico das neoplasias de mama, vários outros fatores devem ser associados à classificação histopatológica (4), faz-se necessário ampliar os dados até então obtidos, aumentando o número da amostra e incluindo nesse estudo, entre outros fatores, a graduação de malignidade dos carcinomas mamários. Sendo assim, futuras investigações devem ser sustentadas a fim de esclarecer se a intensidade da lesão genômica pode influenciar no comportamento biológico e consequentemente no prognóstico dos carcinomas de mama das cadelas. 17 CONCLUSÃO Sob as condições experimentais propostas e na amostra selecionada para o presente estudo, não há evidência estatística de que as células mamárias com carcinoma simples apresentam maior intensidade de dano no DNA do que as células de mama com carcinoma complexo. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (processo 09/52748-3), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (processo 113802/2009-9) e a Fundação para o Desenvolvimento da UNESP – FUNDUNESP (processo 48509 – 29/05/09) pelo apoio financeiro. REFERÊNCIAS 1. Andrade FHE, Fiqueiroa FC, Bersano PRO, Bissacot DZ, Rocha NS. Malignant mammary tumor in female dogs: environmental contaminants. Diagn Pathol. 2010;5:45. 2. Cavalcanti MF, Cassali GD. Fatores prognósticos no diagnóstico clínico e histopatológico dos tumores de mama em cadelas – revisão. Rev Clin Vet. 2006;61:56- 63. 3. Colleu-Durel S, Guitton N, Nourgalieva K, Legue F, Leveque J, Danic B, Chenal C. Alkaline single-cell gel electrophoresis (comet assay): a simple technique to show genomic instability in sporadic breast cancer. Eur J Cancer. 2004; 40:445-51. 4. Dagli, M.L.Z. The search for suitable prognostic markers for canine mammary tumors: a promising outlook. Vet J. 2008;177:3-5. 5. Karayannopoulou M, Kaldrymidou E, Constantinidis TC, Dessiris A. Histological grading and prognosis in dogs with mammary carcinomas: application of a human grading method. J Comp Pathol. 2005; 133:246-52. 6. Misdorp WR, Else W, Hellmén E, Lipscomb TP. Histological classification of mammary tumors of the dog and the cat. In: Ibid, eds. World Health Organization. International Histological Classification of Tumors of Domestic Animals. 2 nd Series. v.7. Washington, DC: WHO; 1999:11-58. 18 7. Nossoni F. Single-cell gel electrophoresis (comet assay): methodology, potential applications, and limitations in cancer research. MMG 445 Basic Biotech. 2008;4:30- 35. 8. Oliveira LO, Oliveira RT, Loretti A, Rodrigues R, Driemeier D. Aspectos epidemiológicos da neoplasia mamária canina. Acta Sci Vet. 2003;31:105-10. 9. Pérez-Alenza MD, Peña L, Del Castillo N, Nieto AI. Factors influencing the incidence and prognosis of canine mammary tumours. J Small Anim Pract. 2000;41:287-91.10. Singh NP, Mccoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Research. 1988;175:184-91. 19 AVALIAÇÃO PELO ENSAIO COMETA DE DOIS PROTOCOLOS PARA EXTRAÇÃO DE CÉLULAS MAMÁRIAS NEOPLÁSICAS E NÃO NEOPLÁSICAS DE CADELAS EVALUATION BY THE COMET ASSAY OF TWO PROTOCOLS FOR EXTRACTION OF MAMMARY NEOPLASTIC CELL AND NON NEOPLASTIC OF FEMALE DOG EVALUACIÓN DEL ENSAYO COMETA DE DOS PROTOCOLOS PARA LA EXTRACCIÓN DE CÉLULAS MAMARIAS NEOPLÁSICAS Y NO NEOPLÁSICAS DE LAS PERRAS Marcia Moleta Colodel 1 Yara de Oliveira Brandão 1 Isabelle Ferreira 1 João Ferreira de Lima Neto 2 Noeme Sousa Rocha 1 Palavras-chave: Tripsina, citoaspiração, ensaio cometa, carcinoma mamário. INTRODUÇÃO Os danos e mutações no DNA desempenham um papel central nas doenças neoplásicas, inclusive nas neoplasias de mama (1,6). Para avaliar tais danos, em qualquer uma das fases dos processos neoplásicos, pode ser empregado o Ensaio Cometa ou Teste do Cometa (4,7,8). O princípio básico desta técnica é o da lise de membranas celulares, seguida pela indução da migração eletroforética do DNA liberado em matriz de agarose. Quando vista ao microscópio, essa migração adquire a forma de um cometa, com cabeça e cauda. A análise dos cometas baseia-se no grau de fragmentação do DNA e sua migração pela microeletroforese. Medidas como o comprimento total da cauda e a densidade de DNA fornecem dados indiretos do estado do DNA da amostra (2,4,7). Para o Ensaio Cometa podem ser utilizadas células de uma grande variedade de tecidos, desde que possam ser adequadamente isoladas (4,8). Neste sentido, para a extração de células individuais, muitas vezes há a necessidade da ação de enzimas líticas ou de processo mecânico. Esses processos, principalmente o enzimático, podem causar danos adicionais ao DNA (2). 1 Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu. Distrito de Rubião Jr., s/n, Botucatu, SP, CEP: 18618-970, e-mail: mmc@fmvz.unesp.br 2 Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu. Distrito de Rubião Jr., s/n, Botucatu, SP, CEP: 18618-970. 20 Considerando que a adesão celular de algumas neoplasias mamárias e do tecido mamário não neoplásico pode dificultar o processo de extração de células individuais e que não há na literatura um protocolo enzimático definido para a separação dessas células, o objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade celular, através do Ensaio Cometa, da citoaspiração como método mecânico e da tripsina como protocolo enzimático para a extração de células mamárias neoplásicas e não neoplásicas de cadelas. MATERIAL E MÉTODOS Este estudo é parte do projeto aprovado pelo Comitê de Ética e Experimentação Animal da instituição sob protocolo número 42/2009. Foram selecionadas 30 cadelas, sem raça definida, com idade entre sete e 12 anos, atendidas na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, Botucatu, São Paulo. Ao exame clínico das 30 cadelas, 20 apresentavam neoplasia em mamas inguinais e foram submetidas à mastectomia e 10 não apresentavam neoplasia mamária e foram submetidas à ovariosalpingohisterectomia eletiva. Durante os procedimentos cirúrgicos foram colhidos, por biopsia incisional, dois fragmentos dos nódulos neoplásicos das cadelas com neoplasia mamária e das mamas inguinais das cadelas que não apresentavam neoplasia em mamas. Os fragmentos mediam 1 cm 2 e 0,5 cm 2 e foram destinados ao exame histopatológico e ao Ensaio Cometa, respectivamente. Para a análise histopatológica, o fragmento colhido das mamas neoplásicas e não neoplásicas foi fixado em formalina 10%, rotineiramente processado para histopatologia e corado com hematoxilina e eosina. A leitura das lâminas foi realizada sob microscopia de luz em campo claro, seguindo os critérios de classificação das neoplasias mamárias de acordo com a composição celular adotados por Misdorp et al. (3). De acordo com os resultados das análises histopatológicas das amostras foram formados três grupos (I, II, III) com 10 amostras cada. Os Grupos I e II foram formados por amostras de carcinoma simples e carcinoma complexo, respectivamente. O Grupo III (controle) foi formado por amostras mamárias não neoplásicas. Para o Ensaio Cometa as amostras colhidas dos carcinomas (Grupos I e II) e das mamas não neoplásicas (Grupo III) foram submetidas a dois protocolos para extração celular. No primeiro protocolo as amostras foram obtidas por citopunção com aspiração 21 utilizando-se agulha hipodérmica 22 G1 1/4`` acoplada a uma seringa de 10 ml e o material colhido foi ressuspendido com tampão fosfato-salino (PBS) livre de cálcio e magnésio. No segundo protocolo as amostras foram incubadas em solução de tripsina pronta para uso (LGC biotecnologia), a 37°C durante 30 minutos e centrifugadas a 1200 rpm durante 10 minutos. O sobrenadante foi descartado, o precipitado de células foi ressuspendido com 1 ml de PBS livre de cálcio e magnésio contendo Soro Fetal Bovino, novamente centrifugado 1200 rpm durante 10 minutos e em seguida, foi resuspendido com 1 ml de PBS livre de cálcio e magnésio. O Ensaio Cometa das células citoaspiradas ou tratadas com tripsina foi realizado seguindo-se a técnica descrita por Singh et al. (7) com modificações. Para tanto, uma alíquota de 30 μl das suspensões dos dois protocolos foi misturada a 100 μl de agarose de baixo ponto de fusão (0,5 %) e colocada sobre uma lâmina previamente coberta com uma camada de agarose de ponto de fusão normal. Em seguida, a lâmina foi coberta com lamínula e deixada a 4ºC por 5 minutos para solidificar a agarose. Após esse período, a lamínula foi cuidadosamente removida e a lâmina transferida para uma solução de lise (NaCl 2,5 M, EDTA 100 mM, Tris 10mM, lauril sarcosinato de sódio 1 %, pH 10; Triton X-100 1% e DMSO 10%) por 24 horas. As lâminas foram então lavadas em PBS livre de cálcio e magnésio e colocadas em uma cuba horizontal de eletroforese preenchida com tampão alcalino (EDTA 1mM e NaOH 300 mM, pH 13). Após período de 20 minutos, a eletroforese foi conduzida a 25 V e 300 mA por outros 20 minutos. Em seguida, as lâminas foram transferidas para solução de neutralização (Tris 0,4 M, pH 7,5) por 15 minutos e desidratadas em etanol absoluto por 5 minutos. Para análise, os nucleóides (região da célula que contém o material genético) foram corados com Sybr Green (Sigma, St Louis, EUA). Foram analisados 100 nucleóides, em microscópio de fluorescência acoplado ao sistema de análise de imagem (Comet Assay II - Perspective Instruments, Haverhill, Inglaterra). O parâmetro utilizado para mensurar os danos no DNA foi o tail intensity que representa a porcentagem de DNA contida na cauda do cometa. Os dados numéricos da migração do DNA foram analisados estatisticamente pela Análise de Variância e as médias dos grupos foram comparadas pelo Teste t de Student ao nível de significância p≤0,05. 22 RESULTADOS A intensidade de dano no DNA das células das mamas neoplásicas e não neoplásicas citoaspiradas e tratadas com tripsina avaliada através do Ensaio Cometa e está representada na Tabela 1. Não houve diferença estatística significativa na intensidade de dano no DNA entre as células neoplásicas citoaspiradas e as células neoplásicas tratadas com tripsina, tanto para as células com carcinoma simples, quanto para as células com carcinoma complexo. O valor médio da intensidade de dano no DNA das células das mamas não neoplásicas tratadas com tripsina foi de 5,57. No entanto, como não houve a separação das células das mamas não neoplásicas citoaspiradas, não foi possível comparar a intensidade de dano no DNA entre as células mamárias não neoplásicas citoaspiradas com as células mamárias tratadas com tripsina. Tabela 1. Média e desvio padrão da intensidade de dano no DNA em células mamárias com carcinoma simples (Grupo I) ou carcinoma complexo (Grupo II) e de células mamárias não neoplásicas (Grupo III), citoaspiradas ou tratadas com tripsina. * Teste t de Student DISCUSSÃO A possibilidade de extração de células individuais do tecido mamário pode ser de enorme valia para os estudos de dano e regeneração do DNA (4), assim como para cultura de células. O método de separação enzimática das células mamárias para análise do Ensaio Cometa ainda não foi padronizado, mas a equivalência de resultados, observada neste estudo, entre as células citoaspiradas e as células tratadas com tripsina, Grupos Protocolos Intensidade de dano no DNA Média ± desvio padrão Valor de p* I Citoaspirado 12,60 ± 7,98 0,77 Tratado com tripsina 13,70 ± 8,80 II Citoaspirado 8,03 ± 4,35 0,69 Tratado com tripsina 8,85 ± 4,85 III Citoaspirado ---- ---- Tratado com tripsina 5,57 ± 0,94 23 fornecem indícios de que a tripsina é uma alternativa viável para o estudo de células individuais principalmente no caso das células mamárias não neoplásicas, as quais são difíceis de serem extraídas pela citoaspiração. A pequena diferença numérica observada na comparação das células neoplásicas citoaspiradas com as células neoplásicas tratadas com tripsina reforça um dos princípios básicos da experimentação, no qual sempre deve ser respeitada a uniformidade na aplicação dos tratamentos, haja vista que, o não atendimento deste princípio compromete os resultados do ensaio e não podem ser posteriormente corrigidos (5). Devido à adesão das células mamárias não neoplásicas não foi possível a análise celular, através do Ensaio Cometa. Portanto, conforme descrito por Nossoni (4), Singh et al. (7) e Wozniak et al. (8), neste estudo constatou-se que o Ensaio Cometa pode ser considerado um método simples, rápido, barato e sensível para detectar a intensidade de danos no DNA, desde que as células possam ser previamente separadas. O protocolo enzimático seguido para a separação celular mostrou-se de fácil reprodutibilidade, com pequenas repercussões para os animais. CONCLUSÃO Ao avaliar a viabilidade celular, através do Ensaio Cometa, da citoaspiração como método mecânico e da tripsina como protocolo enzimático para a extração de células mamárias neoplásicas e não neoplásicas de cadelas foi possível concluir que: O protocolo mecânico utilizado mostrou-se factível para a extração de células mamárias neoplásicas mas não para as células não neoplásicas. O protocolo enzimático utilizado mostrou-se viável tanto para a extração de células das mamas neoplásicas quanto para as não neoplásicas. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (processo 09/52748-3), ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico – CNPq (processo 113802/2009-9) e a Fundação para o Desenvolvimento da UNESP – FUNDUNESP (processo 48509 – 29/05/09) pelo apoio financeiro. 24 REFERÊNCIAS 1. Colleu-Durel S, Guitton N, Nourgalieva K, Legue F, Leveque J, Danic B, Chenal C. Alkaline single-cell gel electrophoresis (comet assay): a simple technique to show genomic instability in sporadic breast cancer. Eur J Cancer. 2004; 40:445-51. 2. Collins AR, Oscoz AA, Brunborg G, Gaivão I, Giovannelli L, Kruszewski M, Smith CC, Stetina R. The comet assay: topical issues. Mutagenesis. 2008; 23:143-51. 3. Misdorp WR, Else W, Hellmén E, Lipscomb TP. Histological classification of mammary tumors of the dog and the cat. In: Ibid, eds. World Health Organization. International Histological Classification of Tumors of Domestic Animals. 2 nd Series. v.7. Washington, DC: WHO; 1999:11-58. 4. Nossoni F. Single-cell gel electrophoresis (comet assay): methodology, potential applications, and limitations in cancer research. MMG 445 Basic Biotech. 2008; 4:30- 35. 5. Sampaio IBM. Estatística aplicada à experimentação animal. 2. ed. Belo Horizonte: Fundação de Ensino e Pesquisa em Medicina Veterinária e Zootecnia. 2002; 265p. 6. Sánchez P, Peñarroja R, Gallegos F, Bravo JL, Rojas E, Benítez-Bribiesca L: DNA damage in peripheral lymphocytes of untreated breast cancer patients. Arch Med Res. 2004; 35:480-3. 7. Singh NP, Mccoy MT, Tice RR, Schneider EL. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp Cell Research. 1988;175:184-91. 8. Wozniak K, Kolacinska A, Blasinska-Morawiec M, Morawiec-Bajda A, Morawiec Z, Zadrozny M, Blasiak J. The DNA-damaging potential of tamoxifen in breast cancer and normal cells. Arch Toxicol. 2007; 81:519-27. 25 CARACTERIZAÇÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DA EXPRESSÃO DE METALOPROTEINASE-9 EM FORMAÇÕES MAMÁRIAS DE CADELAS IMMUNOHISTOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF MATRIX METALLOPROTEINASE-9 EXPRESSION IN CANINE MAMMARY TUMORS CARACTERIZACIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA DE LA EXPRESIÓN DE LA METALOPROTEINASA-9 EN FORMACIONES MAMARIAS DE LAS PERRAS Kamila Alcalá Gonçalves 1 Vanessa de Oliveira Lebrão 1 Silvia Regina Kleeb 1 José Guilherme Xavier 1 Palavras-chave: Neoplasia mamária; cadelas; metaloproteinase. INTRODUÇÃO As neoplasias de mama de cadelas têm sido utilizadas como modelo de estudo para o tumor de mama nas mulheres, devido às várias características comuns (9,13). No sentido de complementar essas informações, numerosas pesquisas buscam marcadores prognósticos para esses processos (2,14,17). Particularmente relevante na biologia da metastatização está a ação de enzimas, sendo que as principais proteases envolvidas na tumorigênese integram o grupo das metaloproteinases de matriz (MMPs). Dentre as metaloproteinases uma das mais estudadas é a MMP-9, associada à degradação do colágeno IV. Como o colágeno tipo IV é um dos maiores constituintes da membrana basal, maior atenção tem sido focada na MMP-9 por sua provável relevância no potencial de invasão das neoplasias malignas (4). A metaloproteinase-9 (gelatinase B) é o membro da família mais complexo em termos de estrutura de domínio e regulação da atividade (3). Existem evidências de que maior expressão e ativação da MMP-9 são dependentes da densidade das células tumorais, bem como da localização intratumoral (centro ou periferia do tumor) na qual a expressão é mensurada (4). Estudos demonstram a possibilidade de atuação de MMPs como elementos pró ou anti- tumorigênicos, na dependência da etapa de progressão da neoplasia (5,11). No entanto, a expressão de MMPs tem sido utilizada em alguns processos, como marcador prognóstico (10). 1 Departamento de Veterinária – Universidade Metodista de São Paulo – UMESP. Rua Dom Jaime de Barros, 1000, Campus Planalto, São Bernardo do Campo/SP. CEP: 09895-400. E-mail para correspondência: kamila_alcala@hotmail.com 26 Este trabalho objetivou comparar o padrão de imunomarcação de MMP-9, em lesões mamárias hiperplásicas, neoplásicas benignas e malignas de cadelas. MATERIAL E MÉTODOS Foram utilizadas amostras de 14 formações mamárias (hiperplasias, neoplasias benignas, neoplasias malignas) obtidas de cães atendidos junto ao Serviço de Cirurgia do Hospital Veterinário da UMESP, com prévio consentimento dos proprietários. O protocolo experimental, desenvolvido neste estudo, foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos e Animais da Universidade Metodista (protocolo 238/09). As amostras emblocadas em parafina foram submetidas a avaliação histopatológica, sendo classificadas segundo Misdorp et al. (12) e graduadas histologicamente, a partir do protocolo de Elston e Ellis (8). Cortes histológicos passaram por desparafinização, recuperação antigênica pelo calor em panela de vapor a 100°C, contendo solução tampão Dako 10x, incubação com anticorpo policlonal de caprino anti-gelatinase B (Novocastra ® ), e incubação com anticorpo secundário e sistema de amplificação (ADVANCE-HRP ® ). A expressão de MMP-9 foi obtida através de método qualitativo e semi-quantitativo pontuando-se distribuição e intensidade de marcação, gerando escores de 0 a 2, correspondentes, respectivamente, à imunomarcação ausente, fraca e intensa (1,15,16). Os resultados foram submetidos à avaliação estatística (ANOVA/Tukey-Kramer). RESULTADOS Foram avaliadas 5 lesões hiperplásicas, 4 adenomas e 5 carcinomas (Quadro 1). Identificou-se imuno-expressão de MMP-9 em elementos epiteliais em todos os casos, com importante expressão em componentes mesenquimais nos processos malignos. A intensidade e a distribuição da marcação variaram, respectivamente, de leve a intensa, envolvendo de 25% a mais de 75% do corte. O padrão de imunomarcação variou com a natureza dos processos, identificando-se positividade mais restrita e leve em processos hiperplásicos, e mais extensa e intensa em lesões carcinomatosas. Nos adenomas observou-se um padrão heterogêneo de imunomarcação, identificando-se expressões predominantemente moderadas. 27 Quadro 1. Escore de expressão imuno-histoquímica de metaloproteinase-9 em formações mamárias de cadelas atendidas no HOVET-UMESP, considerando-se o diagnóstico histológico, a graduação tumoral, a intensidade e a distribuição da marcação. Caso Classificação Histológica Graduação Histológica Intensidade marcação Distribuição marcação Escore 01 Hiperplasia Lobular - 1 2 I 02 Hiperplasia Lobular - 1 3 I 03 Hiperplasia Lobular - 1 3 I 04 Hiperplasia Lobular - 1 3 I 05 Hiperplasia Lobular - 1 3 I 06 Adenoma Tubular - 2 3 II 07 Aden. Tub. Simples - 2 2 I 08 Aden. Tub. Compl. Misto - 3 2 II 09 Aden. Tub. Simples - 3 3 II 10 Carc.Mucinoso II 3 3 II 11 Carc. Tub. Simples II 4 4 II 12 Carc. Sólido Simples III 4 4 II 13 Carc. Sólido Simples III 3 3 II 14 Carc. Tub. Simples III 2 3 II DISCUSSÃO Um aspecto central na biologia tumoral relaciona-se à caracterização do potencial metastático da neoformação, importante para o desenvolvimento de abordagens terapêuticas apropriadas. Nesse sentido a pesquisa da expressão de metaloproteinases em formações mamárias ganha significado. Neste estudo foram avaliadas 9 formações mamárias benignas (hiperplasias e adenomas), e 5 malignas. O padrão de imunomarcação revelou relação direta entre expressão de MMP-9 e agressividade tumoral, identificando-se diferença estatisticamente significante entre a imunomarcação em hiperplasias e carcinomas (ANOVA/Tukey-Kamer, p<0,001). Em adenomas a imunomarcação mostrou-se heterogênea, variando de moderada a intensa. Nos carcinomas evidenciou-se importante imunopositividade de componentes epiteliais e estromais, sugerindo uma subversão microambiental, favorecendo a expansão neoplásica. Tais resultados reforçam a 28 compreensão da expressão de MMP-9 como um indicador de agressividade tumoral à semelhança do observado em outros estudos (6,7,18), porém devem ser complementados por informações biológicas acerca da evolução das neoplasias visando a aferição de sua utilidade como marcadores prognósticos nesses processos. CONCLUSÃO Identificou-se imunopositividade à MMP-9 em formações mamárias caninas, com diferença estatisticamente significante entre hiperplasias e carcinomas, que exibiram imunomarcação mais extensa e intensa. Tais resultados reforçam a compreensão da expressão de MMP-9 como um indicador de agressividade tumoral em neoplasias mamárias caninas. REFERÊNCIAS 1. Aupperle H, Thielebein J, Kiefer B, Marz I, Dinges G, Schoon HA. An immunohistochemical study of the role of matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors in chronic mitral valvular disease (valvular endocardiosis) in dogs. Vet J. 2009; 180: 88-94. 2. Bostock DE, Moriarty J, Crocker J. Correlation between histologic diagnosis mean nucleolar organizer region count and prognosis in canine mammary tumors. Vet Pathol. 1992; 29: 381-385. 3. Coussens LM, Werb Z. Matrix metalloproteinases and the development of cancer. Chem Biol. 1996; 3: 895-904. 4. Felin IPD, Grivicich I, Felin CR, Fedrigo CA, Rocha AB. Expressão imuno- histoquímica das metaloproteinases 2 e 9 não está associada à progressão do carcinoma de células escamosas de esôfago. J Bras de Patol e Med Lab. 2009; 45: 317-323. 5. Fingleton B. Matrix metalloproteinases: roles in cancer and metastasis. Front Biosci. 2006; 11: 479-491. 6. Hirayama K, Yokotay H, Onai R, Kobayashiy T, Kumatay T, Kihara K, et al. Detection of matrix metalloproteinases in canine mammary tumours: analysis by immunohistochemistry and zymography. J Comp Path. 2002; 127: 249-256. 7. Jobim FC, Schwartsmann G, Xavier NL, Uchoa DM, Saciloto M, Chemello N. Expressão da MMP-9 e do VEGF no câncer de mama: correlação com outros indicadores de prognóstico. Rev Bras Ginecol Obstet. 2008; 30: 287-293. 29 8. Karayannopoulou M, Kaldrimidou E, Constantinidis TC, Dessiris A. Histological grading and prognosis in dogs with mammary carcinomas: aplication of a human grading method. J Comp Path. 2005; 133: 246-252. 9. Madewell BR, Theilen GH. Tumors of the mammary gland. In: Veterinary Cancer Medicine. 2 nd ed. Philadelphia. PA: Lea & Febiger; 1987: 327-344. 10. Martin MD, Matrisian LM. Matrix metalloproteinases as prognostic factors for cancer. Clin Lab Invest. 2005; 28: 16-18. 11. Martin MD, Matrisan LM. The other side of MMPs: Protective roles in tumor progression. Canc Metastasis Rev. 2007; 26: 717-724. 12. Misdorp W, Else RW, Hellmen E, Lipscomb TP. Histological classification of mammary tumors of the dog and the cat. 2 nd ed. Washington, DC: AFIP; 1999. 13. Mottolese M, Morelli L, Agrimi U, Benevolo M, Sciarretta F, Antonucci G, et al. Spontaneous canine mammary tumors.A model for monoclonal antibody diagnosis and treatment of human breast cancer. Lab Invest. 1994; 71: 182-187. 14. Rungsipipat A, Tateyama S, Yamaguchi R, Uchida K, Miyoshi N, Hayashi T. Immunohistochemical analysis of c-yes and c-erbB-2 oncogene products and p53 tumor suppressor protein in canine mammary tumors. J Vet Med Sci. 1999; 61: 21-32. 15. Sampaio-Góes FCG, Oliveira DT, Dorta RG, Nonogaki S, Landman G, Nishimoto IN, et al. Expression of PCNA, p53, BAX, and BCL-X in oral poorly differentiated and basaloid squamous cell carcinoma: relationships with prognosis. Head Neck. 2005; 27: 982-989. 16. Soini Y, Puhakka A, Kahlos K, Säily M, Pääkkö P, Kistinen P, Kinnula V. Endothelial nitric oxide synthase is strongly expressed in malignant mesothelioma but does not associate with vascular density or the expression of VEGF, FLK1 or FLT1. Histopathol. 2001; 39: 179-186. 17. Wakui S, Muto T, Yokoo K, Takahashi H, Masaoka T, Hano H, et al. Prognostic status of p53 gene mutation in canine mammary carcinoma. Anticancer Res. 2001; 21: 611-616. 18. Yokota H, Kumata T, Taketaba S, Kobayashi T, Moue H, Taniyama H, et al. High expression of 92 kDa type IV collagenase (matrix metalloproteinase-9) in canine mammary adenocarcinoma. Biochimica et Biophysica Acta. 2001; 1568: 7-12. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Benevolo%20M%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Sciarretta%20F%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Antonucci%20G%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Takahashi%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Masaoka%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Hano%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Yokota%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Kumata%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Taketaba%20S%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Kobayashi%20T%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Moue%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez?Db=pubmed&Cmd=Search&Term=%22Taniyama%20H%22%5BAuthor%5D&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.Pubmed_ResultsPanel.Pubmed_DiscoveryPanel.Pubmed_RVAbstractPlus 30 CLASSIFICAÇÃO CITOMORFOLÓGICA COMO FATOR PROGNÓSTICO NO TUMOR VENÉREO TRANSMISSÍVEL NA REGIÃO DE BANDEIRANTES/PR CYTOMORPHOLOGICAL CHARACTERIZATION AS A PROGNOSIS FACTOR OF CANINE TRANSMISSIBLE VENEREAL TUMOUR IN THE REGION OF BANDEIRANTES/PR CLASIFICACIÓN CITOMORFOLOGICA COMO FACTOR PRONÓSTICO EM EL TUMOR VENÉREO TRANSMOSIBLE EN LA REGIÓN DE BANDEIRANTES/PR Nazilton de Paula Reis Filho 1 Celmira Calderón 1 Alexandre Augusto Arenales Torres 1 Robson Leite Garcia 1 Tatiana Jacintho Olenscki 2 Karina Maria Basso 3 Palavras-chave: Cão, oncologia, citopatologia, prognóstico. INTRODUÇÃO O tumor venéreo transmissível (TVT) é uma neoplasia contagiosa de células redondas e de ocorrência natural, que acomete com maior frequência a genitália externa, mas também regiões extragenitais (1,2,4,6). O exame citopatológico é uma técnica fácil, rápida, barata e indolor, indicada para diagnóstico do TVT (1,2,4,6). A classificação citológica do TVT baseada na morfologia celular é adotada pelo Serviço de Patologia Veterinária da FMVZ-UNESP, Botucatu/SP, desde 1994, e, consolidado por Amaral et al. (1) em 2007. Segundo essa mesma autora o TVT pode ser classificado em padrão plasmocitóide, linfocitóide e misto, e dados relevantes sobre essa neoplasia foram observados e apontam um comportamento biológico mais agressivo para o padrão plasmocitóide, já que a maioria dos casos que apresentam recidiva tumoral ou metástase são classificados como padrão plasmocitóide (1). 1 Departamento de Patologia Geral, Laboratório de Anatomia Patológica – Universidade Estadual do Norte do Paraná – UENP – Campus Luiz Meneghel. Rodovia BR-369 Km 54 CEP 86360-000 – Bandeirantes-PR. E-mail: nazilton@hotmail.com 2 Hospital veterinário – Universidade Estadual do Norte do Paraná – UENP – Campus Luiz Meneghel. Rodovia BR-369 Km 54 CEP 86360-000 – Bandeirantes-PR. E-mail 3 Departamento de patologia – Universidade do oeste Paulista- UNOESTE - Rua José Bongiovani, 700 - CEP 19050-920 - Presidente Prudente-SP. 31 O tratamento de eleição para essa neoplasia é a quimioterapia com sulfato de vincristina, no entanto, existem relatos de resistência a essa droga (2). O padrão plasmocitóide apresenta grande potencial para expressar resistência, à quimioterapia tal fato foi relacionado devido à maior imunoreatividade à glicoproteína –P (5). A importância da procura por fatores prognósticos no TVT se dá pelo fato de relatos de metástase e resistência ao protocolo quimioterápico convecional. O presente estudo teve por objetivo avaliar as características citomorfológicas como fator prognóstico nos casos de TVT na região de Bandeirantes/PR, correlacionando-os aos casos de cura, recidiva e óbito após tratamento convencional com sulfato de vincristina. MATERIAL E MÉTODOS Foram colhidas 16 amostras de neoformações oriundas de 15 animais com suspeita clínica de Tumor Venéreo Transmissível, provenientes da rotina do Hospital Veterinário da Universidade Estadual do Norte do Paraná (UENP), Bandeirantes/PR. Para confirmar o diagnóstico foi realizado o exame citopatológico pela técnica de citologia aspirativa por agulha fina (CAAF) e as amostras foram coradas pelo método de Giemsa. Após a coloração das lâminas, as amostras foram classificadas segundo Amaral et al. (1) em padrão plasmocitóide, linfocitóide e misto de acordo com o tipo de célula predominante. A avaliação do prognóstico foi realizada através de ligações telefônicas aos proprietários após, no mínimo, três meses e no máximo de dezoito meses após o diagnóstico da neoplasia. Estes foram questionados sobre a realização do tratamento, cura do animal até o presente momento, óbito ou recidiva da neoplasia. RESULTADOS No presente estudo, do total das amostras classificadas (n=16), o TVT plasmocitóide foi o mais frequente, representando 43,75% dos casos (n=7), enquanto o padrão linfocitóide e misto corresponderam a 37,5% (n=6) e 18,75% (n=3) respectivamente. Dentre os casos avaliados, um dos animais acompanhados apresentou duas neoformações, com classificações distintas (padrão linfocitóide em genitália e padrão plasmocitóide em cavidade nasal). Ao avaliar o prognóstico dos animais atendidos (n=15), observou-se que três animais (20%) não foram submetidos ao tratamento. Destes, dois vieram a óbito (13,3%), um 32 devido a opção por eutanásia (neoplasia classificada como padrão plasmocitóide) e outro em decorrência de outras doenças concomitantes (neoplasia classificada como padrão linfocitóide). O terceiro animal encontra-se vivo, porém com a doença em progressão (neoplasia classificada como padrão plasmocitóide). Os demais casos (n=12; 80%) foram tratados com quimioterapia e livres da doença. Em nenhum dos casos observou-se metástase, porém as recidivas ocorreram em 13,3% (n=2) dos casos (ambas neoplasias classificadas como padrão linfocitóide), um deles após três meses do término do tratamento e outro após cinco meses, sendo as duas amostras classificadas como padrão linfocitóide. DISCUSSÃO A classificação citomorfológica do TVT proposta por Amaral et al. (1) é realizada na cidade de Botucatu/SP desde 1994. Esses autores observaram que o padrão plasmocitóide foi mais frequente (52,53%), seguido pelos padrões misto (29,11%) e linfocitóide (18,36%). Do total de neoplasias, observamos em nosso estudo que o número de casos de TVT padrão plasmocitóide apresentou maior incidência, dado semelhante ao encontrado por Amaral et al. (1), entretanto na região da cidade Bandeirantes/PR, o número de casos de TVT padrão linfocitóide superou os casos padrão misto. Tal dado merece especial atenção tendo em vista que existem duas linhagens diferentes de TVT e estes são geograficamente distribuídos (6), o que nos remete a criar uma hipótese onde possa existir maior frequência de determinada linhagem em um local do que em outro, porém estudos mais aprofundados são ainda necessários. Um dos casos apresentou ao mesmo tempo duas neoformações, uma em genitália (padrão linfocitóide) e outra na cavidade nasal (padrão plasmocitóide), portanto citomorfologicamente distintas. A literatura relata que tumores extragenitais podem ser considerados primários decorrentes de transmissão por implante celular e que o padrão plasmocitóide tem maior habilidade de desenvolver em locais extragenitais (1). Dos casos de recidiva, um deles se deu pela possível permanência de células viáveis após o término do tratamento, já que nesse caso não foi realizado exame citopatológico para controle, e no outro caso não é possível descartar um reimplante, pois o animal manteve acesso à rua. Inferimos, portanto, que nesses casos as recidivas não puderam ser associadas a um comportamento mais agressivo da neoplasia. Amaral et al (1) 33 observaram que 6,4% dos animais com TVT apresentaram recidivas e 25% metástases. Essas apresentações clínicas foram denominadas tumores não primários, devido à dificuldade em diferenciar casos de re-infecção de metástases ou recidivas. Nesse mesmo estudo foi observado que tumores ditos não primários, na sua maioria, eram classificados como plasmocitóides. O TVT possui um bom prognóstico para pacientes submetidos ao tratamento (2,3), concordando com nossos dados, já que todos animais tratados com quimioterapia encontram-se vivos e livres da doença. CONCLUSÃO O exame citopatológico se mostrou rápido e fácil no diagnóstico do TVT, permitindo ainda realizar a diferenciação e classificação citomorfológica. No entanto apesar do método diagnóstico ser eficaz e a terapêutica responsiva, nos casos atendidos na região de Bandeirantes/PR, não houve relação entre a classificação citomorfológica com o prognóstico, pois não foi possível observar correlação entre cura, óbito ou recidiva com as diferentes classificações citomorfológicas. Entretanto novas análises devem ser feitas nessa mesma região em relação a resposta ao tratamento, devido à observação que o número de aplicações quimioterápicas pode variar de acordo com a classificação. Além de novos estudos comparando a classificação citológica com a eficiência da modalidade terapêutica. REFERÊNCIAS 1. Amaral AS, Bassani-Silva S, Ferreira I, Fonseca LS, Andrade FHE, Gaspar, L.F.J., et al. Cytomorphological characterization of transmissible canine venereal. Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias. 2007;102:253-260. 2. Das U, Das A. Review of canine transmissible verenal sarcoma. Vet. Res. Commun. 2000;24:545-556. 3. Lorimier LPL, Fan TM. (2007). Canine transmissible veneral tumour. In: Withrow and MacEwen´s Small Animal Clinical Oncology, Withrow SJ, Vail DM, Ed.: Shelly Stringer (ed.) Philadelphia: Saunders Elsevier; 2007:799-803. 4. Santos DES, Silva DT, Toledo-Pinto EA, Lot RFE. Tumor venéreo transmissível (T.V.T.): Revisão de literatura. Revista Científica Eletrônica de Medicina Veterinária. 2008;10:1-7. 34 5. Gaspar LFJ, Amaral AS, Bassani-Silva S, Rocha NS. Imunorreatividade à glicoproteína-p no tumor venéreo transmissível canino. Veterinária em Foco. 2009; 6:140-146 6. Murgia C, Pritchard JK, Kim SY, Fassati A, Weiss RA. Clonal origin and evolution of a transmissible cancer. Cell. 2006;126:477-487. 35 EXPRESSÃO DA PROTEÍNA p63 EM ADENOMAS E CARCINOMAS MAMÁRIOS METASTÁTICOS E NÃO-METASTÁTICOS DE CADELAS p63 PROTEIN EXPRESSION IN ADENOMAS AND METASTATIC AND NON- METASTATIC MAMMARY CARCINOMAS OF FEMALE DOGS EXPRESIÓN DE LA PROTEÍNA p63 EM ADENOMAS Y EN EL CANCER DE MAMA METASTÁSICO E NO METASTÁSICO EN PERRAS Erika Maria Terra 1 Marcela Marcondes Pinto Rodrigues 1 Geórgia Modé Magalhães 2 Mirela Tinucci Costa 3 Renée Laufer Amorim 1 Noeme Sousa Rocha 1 Palavras-chave: Cadela, neoplasia mamária, metástase, p63. INTRODUÇÃO As neoplasias mamárias são os tumores diagnosticados com mais frequência nas cadelas, representando aproximadamente 25 a 50% de todos os tumores diagnosticados, e destes 41 a 53% são de caráter maligno (3,5,11), com incidência de duas a três vezes maior do que a observada na mulher (2). A invasão e a metástase são características biológicas dos tumores malignos que influenciam diretamente no tratamento e no prognóstico do câncer de mama (6). Durante anos, patologistas veterinários têm considerado o grau histopatológico para determinar o prognóstico, no entanto, o aumento da disponibilidade de anticorpos para estudos imuno-histoquímicos tem permitido que critérios adicionais sejam avaliados. Como alterações genéticas são responsáveis por muitos tipos tumorais, a expressão de inúmeros oncogenes e supressores tumorais tem sido determinada nos diferentes tipos histológicos de neoplasias mamárias sendo relacionada com o aumento da malignidade ou prognóstico desfavorável (8). A expressão da p63 é observada no núcleo das células basais do epitélio normal (pele, esôfago, cérvix, vagina e outros) e também em certas populações de células basais em 1 Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP, Botucatu. Distrito de Rubião Jr., s/n, Botucatu, SP, CEP: 18618-970, e-mail:erikamterra@hotmail.com 2 Departamento de Patologia Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Jaboticabal. Via de Acesso Paulo Donato Castellane,s/n, Jaboticabal, SP, CEP: 14884-900 3 Departamento de Clínica Veterinária, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, UNESP, Jaboticabal. Via de Acesso Paulo Donato Castellane,s/n, Jaboticabal, SP, CEP: 14884-900 36 estruturas glandulares da próstata, mama e brônquios. Ela é expressa nas células mioepiteliais da mama e considerada um marcador específico para estas células no tecido mamário normal (4,7). Na mulher, esta proteína é expressa de uma maneira decrescente de lesões mamárias benignas para malignas e sua expressão é muito baixa nos carcinomas invasivos, já que o principal critério para classificação de um carcinoma invasivo é a perda das células mioepiteliais. Entretanto, a perda da p63 nas células mioepiteliais dos ductos mamários não pode ser usada como um marcador único de invasividade para os carcinomas ductais in situ (10,12). Diante do exposto e visto as evidências de participação desta proteína no desenvolvimento e progressão neoplásica foi avaliada a sua expressão e sua relação com o comportamento biológico das neoplasias mamárias caninas. MATERIAL E MÉTODOS O presente estudo teve parecer favorável da Comissão de ética no uso de animais (n. 161/2009 - CEUA). Para isso foram utilizadas 30 cadelas, de diferentes raças com idade entre 3 e 15 anos, da casuística do Hospital Veterinário da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp/Jaboticabal, SP. Três grupos foram formados, sendo: Grupo 1 composto por 10 cadelas com neoplasias mamárias benignas; Grupo 2 composto por 10 cadelas com carcinomas sem metástase e Grupo 3 por 10 cadelas com carcinomas mamários malignos com metástase. As reações de imuno-histoquímica foram realizadas no Serviço de Patologia Veterinária da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia – Unesp/Botucatu, SP, usando-se o anticorpo primário monoclonal anti-p63 humano (1:200, clone 4A4, Dako). Após desparafinização e hidratação, seguiu-se a recuperação antigênica com solução tampão de citrato 10mM, pH 6,0 em banho-maria por 20 minutos. O bloqueio da peroxidase endógena foi realizado com solução de metanol e água oxigenada 8% por 20 minutos e, em seguida solução de leite em pó desnatado (Molico ® ) 3% por 1 hora. As lâminas foram incubadas com o anticorpo primário por 2 horas a 37º C. O complexo secundário utilizado foi o kit EnVision (Dako K4065). Para revelação das reações foi empregada solução pronta para uso de cromógeno DAB (Dako K3468) por cinco minutos. Todas as lâminas foram contra-coradas com Hematoxilina de Harris por dois minutos, lavadas em água corrente por 10 minutos, desidratadas e montadas. 37 Para análise, foram localizados os focos de cada lesão e atribuídas escalas semiquantitativas de marcação que foram: negativo (ausência de marcação), com presença de controle positivo interno na lâmina; (+) 1 a 50% de células mioepiteliais positivas e (++) acima de 50% de células mioepiteliais positivas. A análise estatística foi realizada pelo Teste Exato de Fisher, realizando-se a comparação dos grupos dois a dois e considerando o nível de significância de 5%. RESULTADOS A marcação para p63 foi observada no núcleo das células mioepiteliais do tecido mamário e o percentual de marcação foi decrescente do Grupo 1 para os grupos 2 e 3. A ausência de marcação somente foi observada no Grupo 3, constituído por neoplasias malignas que já apresentavam metástase no momento do diagnóstico. Não houve diferença estatística entre os grupos para a marcação da p63 pelo teste Exato de Fisher (p<0,05), porém observou-se que o grupo que apresentou as menores marcações para a proteína foi o Grupo 3, composto por carcinomas metastáticos (Tabela 1). Ademais, no Grupo 1 observou-se linhas contínuas com forte intensidade de marcação das células basais ao redor dos alvéolos mamários que estava diminuída nos grupos 2 e 3. Tabela 1. Percentuais de amostras negativas, com baixa (+) e alta (++) marcação para o anticorpo anti- p63 nos diferentes grupos experimentais. Marcação Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 0 0 0 10% + 25% 30% 60% ++ 75% 70% 30% DISCUSSÃO A marcação para p63 foi encontrada no núcleo das células mioepiteliais do epitélio glandular, de acordo com estudos prévios em neoplasias mamárias humanas (4,6,7,10). A diminuição da intensidade e da continuidade de marcação das neoplasias benignas para as malignas, inclusive das sem para as com metástase pode realmente indicar destruição da camada basal conforme a progressão da lesão, tendo em vista o que foi sugerido anteriormente por outros autores (9). Ao observar baixos percentuais de marcação para p63 nas neoplasias mamárias malignas humanas Ribeiro-Silva et al. (10) e Stefanou et al. (12) concluíram que a expressão de p63 pode ser usada como um 38 diferencial de lesões in situ para invasivas (10,12). Resultados semelhantes foram encontrados por outros autores em um estudo com neoplasias mamárias mistas de cadelas, no qual as células mioepiteliais formavam linhas contínuas ao redor dos ácinos e ductos e esta marcação também foi diminuída das neoplasias benignas para as malignas (1). CONCLUSÃO No presente estudo a p63 se mostrou um marcador específico para as células mioepiteliais mamárias caninas, uma vez que não houve marcação em outros tipos celulares da mama. No entanto não houve diferença significativa na expressão desta proteína entre adenomas e carcinomas mamários caninos com e sem metástase. Desta forma, mesmo se mostrando um marcador específico para as células mioepiteliais da mama de cadelas, a p63 não deve ser utilizada como marcador prognóstico único, sendo que mais estudos envolvendo um maior número de animais devem ser realizados para atestar seu uso. REFERÊNCIAS 1. Bertagnolli AC, Cassali GD, Genelhu MCLS, Costa FA, Oliveira JFC, Gonçalves PBD. Immunohistochemical expression of p63 and ΔNp63 in mixed tumors of canine mammary glands and its relation with p53 expression. Vet Pathol. 2009; 46: 407-15. 2. Brodey RS, Goldschimidt MH, Roszel, JR. Canine mammary gland neoplasms. J Am Anim Hosp Assoc. 1983; 19: 61-9. 3. Daleck CR, Franceschini PH, Alessi AC, Santana AE, Martins MIM. Aspectos clínico e cirúrgico do tumor mamário canino. Ciência Rur. 1998; 28: 95-100. 4. Di Como CJ, Urist MJ, Babayan I, Drobnjak M, Hedvat CV, Teruya-Feldstein J, Pohar K, Hoos A, Cordon-Cardo C. p63 expression profiles in human and normal tissues. Clin Cancer Res. 2002; 8: 494-501. 5. Fonseca CS, Daleck CR. Neoplasias mamárias em cadelas: influência hormonal e efeitos da ovariohisterectomia como terapia adjuvante. Ciência Rur. 2002; 30: 731-5. 6. Hollier BG, Evans K, Mani SA. The Epithelial-to-Mesenchymal Transition and Cancer Stem Cells: A coalition against cancer therapies. J Mammary Gland Biol Neop. 2009; 14: 29-43. 39 7. Moll UM, Slade N. p63 and p73: roles in development and tumor formation. Mol Cancer Res. 2004; 2: 371-86. 8. Morris J. Improving the diagnoses and treatment of canine mammary tumors: immunohistochemical markers as prognostic tools. Vet J. 2010; 184: 3-4. 9. Polyak K., Hu M. Do myoepithelial cells hold the key for breast tumor progression? J Mammary Gland Biol Neoplasia. 2005; 10: 231-47. 10. Ribeiro-Silva A, Ramalho LNZ, Garcia SB, Zucoloto S. The relationship between p63 and p53 expression in normal and neoplastic breast tissue. Arch Pathol Lab Med. 2003; 127: 336-40. 11. Rodaski S, Piekarz CH. Epidemiologia e Etiologia do Câncer. In: Daleck CR, De Nardi AB, Rodaski S. Oncologia em Cães e Gatos. 1ª ed. São Paulo: Roca, 2008. p. 1- 22. 12. Stefanou D, Batistatou A, Nonni A, Arkoumani E, Agnantis NJ. p63 expression in benign and malignant breast lesions. Histol Histopatho. 2004; l19: 465-471. 40 ESTUDO RETROSPECTIVO DAS NEOPLASIAS EM CAVIDADE ORAL ATENDIDAS NO SERVIÇO DE CLÍNICA MÉDICA DO HOSPITAL VETERINÁRIO DA FACULDADE UPIS, BRASÍLIA-DF RETROSPECTIVE STUDY OF TUMORS OF THE ORAL CAVITY TREATED AT THE SECTION OF SMALL ANIMAL MEDICINE OF THE VETERINARY HOSPITAL OF THE FACULTY UPIS, BRASILIA-DF UN ESTUDIO RETROSPECTIVO DE LOS TUMORES DE LA CAVIDAD ORAL TRATADOS EN LA CLÍNICA MÉDICA DEL HOSPITAL VETERINARIO DE LA FACULTAD DE UPIS, BRASILIA-DF Carlos Eduardo Fonseca Alves 1 Aline Gonçalves Correa 1 Lincoln Eidi Kubota 1 Robson Alves Moreira 1 Sabrina dos Santos Costa 1 Palavras-chave: Neoplasia em cavidade oral, animais, estudo epidemiológico. INTRODUÇÃO A cavidade oral é um local comum para o surgimento de diversas neoplasias benignas ou malignas (1), sabe-se que as neoplasias de cavidade oral em cães compreendem 6% de todas as neoformações encontradas nesta espécie (2). A cavidade oral representa a entrada do sistema digestivo e qualquer anormalidade, doença ou disfunção nessa região, tem capacidade de causar efeitos adversos. Neoplasias orais e das estruturas associadas são comumente encontradas em cães e gatos, correspondendo respectivamente a aproximadamente 5% e 7% dos tumores malignos (1). Nos cães os tumores mais comuns são: melanoma, carcinoma de células escamosas e fibrossarcoma, embora diversos tumores possam ser observados (4) Dados epidemiológicos sobre neoplasias são importantes, visto a crescente evolução da oncologia veterinária. O presente trabalho objetiva descrever a casuística de casos de neoplasias orais atendidas no Hospital Veterinário da faculdade UPIS. MATERIAL E MÉTODOS Foram atendidos no serviço de clínica médica de pequenos animais do Hospital Veterinário da Faculdade UPIS, no período de março de 2008 a agosto de 2010, 15 1 Serviço de Clínica Médica, Hospital Veterinário, Faculdade UPIS, Brasília – DF, Brasil. Email: carloseduardofa@hotmail.com 41 casos de animais com neoplasias de cavidade oral. Os prontuários foram avaliados quanto ao sexo, raça, idade dos animais e tipo histológico dos tumores. Animais com dados clínicos incompletos ou sem diagnóstico histopatológico definitivos foram excluídos do trabalho. Utilizou estatística descritiva para apresentação dos resultados. Para fins diagnósticos, utilizou-se biópsia aspirativa por agulha fina e biópsia excisional dos tumores. Todos os pacientes foram avaliados quanto ao estadiamento clínico, utilizando critérios adaptados de Whitrow e Macewen’s (1). RESULTADOS Dentre os 15 casos atendidos, 10 pacientes (66,66%) apresentavam tumores benignos e cinco malignos (33,34%). A idade média dos cães com tumores orais foi de 7,7 (± 1,3 anos) anos, variando entre dois e 15 anos. Os sinais clínicos descritos foram halitose (10/15), disfagia (8/15) e sialorréia (5/15). Dentre os pacientes, oito (53,33%) eram machos e sete (46,67%) eram fêmeas. Os cães sem raça definida foram os mais afetados, representados por seis casos (40%), seguidos pelos cães da raça Pinscher, com quatro casos (26,66%), Poodle com dois casos (13,33%), Rottweiler com um caso (9,89%), Boxer com um caso (9,89%), Labrador com um caso (9,89%) e Akita com um caso (9,89%). O tumor com maior incidência foi o melanoma, correspondendo a três casos (20%), seguido por três de épulides acantomatoso (20%), três de épulides fibromatoso (20%), três de papiloma (20%), dois de carcinoma de células escamosas (13,33%) e um de fibroma (6,67%). Quanto à localização, três casos de melanoma foram encontrados na região jugal, na língua foram identificados dois casos de carcinoma de células escamosas, na região periodontal foram identificados os casos de épulides acantomatoso e fibroso, além dos três casos de papilomatose e no palato mole identificou-se o caso de fibroma. Em relação ao estadiamento clínico, dois casos de melanoma apresentaram classificação T1N1MX e um caso de melanoma foi classificado como T1N2M1, os dois casos de carcinoma foram classificados com T2N0M0. Os animais com épulides fibromatoso (3/3) e acantomatoso (2/3) foram submetidos ao procedimento cirúrgico e não apresentaram recidiva local. Em um caso de épulides acantomatoso (1/3) animal apresentou novo crescimento de 0,2 cm e optou- se por realizar avaliações clínicas periódicas, sem novo procedimento cirúrgico a pedido do proprietário. Dos animais com melanoma, um animal (1/3) após procedimento cirúrgico apresentou sobrevida de dois meses e os outros animais (2/3) apresentaram 42 sobrevida de quatro e cinco meses respectivamente. Os animais com carcinoma de células escamosas (CCE) submetidos a procedimento cirúrgico, não apresentaram recidivas e foram avaliados quanto à presença de metástase por 18 meses. Os animais com papiloma foram submetidos a administração de vacina autógena (3/3) e não apresentaram recidivas do quadro. O animal com fibroma não apresentou recidiva após realização de exérese cirúrgica. DISCUSSÃO No presente estudo os cães sem raça definida apresentaram maior incidência. Este achado pode ser explicado pela maior procura da população carente pelo hospital universitário (2). A média de idade observada foi menor que a média encontrada em estudo retrospectivo, com 40% dos animais com idade variando de oito a dez anos (1). Segundo a literatura consultada, os sinais clínicos mais comumente observados incluem halitose, perda de peso, aumento da sialorréia, disfagia e perda de dentes (5). Não há predisposição sexual citada na literatura para neoplasias orais, no entanto, alguns autores encontraram maior incidência em cães machos, dados estes corroboram com o presente estudo (1,6). Os tumores malignos encontrados são descritos pela literatura como os mais frequentes em cães (3). Por outro lado, alguns autores relatam que são os tumores benignos mais comuns, correspondendo há aproximadamente 25% dos casos (5). Dentre as neoplasias benignas, os épulides foram o diagnóstico histológico mais comum. Os animais com melanoma apresentaram menor sobrevida. Em um caso pode- se verificar metástase em linfonodo ipsilateral, nos outros dois casos, não foi possível realizar avaliação quanto à metástase esses animais apresentaram sobrevida mediam de três meses. Em contrapartida, alguns autores relataram um caso de melanoma em cavidade oral (língua) que após procedimento cirúrgico não apresentou recidivas (3). Os animais com carcinoma de células escamosas após excisão cirúrgica não apresentaram recidivas no período avaliado. A literatura relata casos de CCE em língua, no entanto, os autores não relataram sobrevida dos animais em seu estudo. Dos animais com neoplasias benignas, somente em um caso (épulides acantomatoso) animal apresentou recidiva local (2). No entanto, a mesma não trouxe transtornos para o animal, optando- se por não realizar reintervenção cirúrgica. 43 CONCLUSÕES A partir dos dados do trabalho, nota-se uma maior ocorrência de tumores orais benignos em cães, mostrando resultado diferente da literatura consultada onde os tumores malignos apresentam incidência superior aos tumores orais benignos. O tumor maligno com maior incidência foi o melanoma, em relação aos tumores benignos o épulides foi o mais incidente. Estudos epidemiológicos em cães são importantes para obter a incidência regional de neoplasias. Os cães são considerados "sentinelas" para agentes carcinogênicos ambientais, uma vez que estes, muitas vezes, dividem o mesmo ambiente que os humanos. REFERÊNCIAS 1. Lipitak JM, Withrow SJ. Cancer of the gastrointestinal tract: oral tumors. In: Witrow SJ. Small animal clinical oncology. 4 ed. St. Louis: W. B. Saunders. Elsevier, 2007. p.455-475. 2. Gomes C, Oliveira LO, Elizeire MB, Oliveira MB, Oliveira RT, Contesini EA. Avaliação epidemiológica de cães com neoplasias orais atendidos no hospital de clínicas veterinárias da universidade federal do rio grande do sul. Ci Anim Bras. 2009; 10: 835-9. 3. Willard MD. Distúrbios da cavidade oral, faringe e esôfago. In: Nelson WW, Yoshida K, Yanai T, Iwasaki T. Clinicapathological study of canine oral epulides. The J Vet Med Sci,1999; 61: 897-902. 4. Fineman LS. Oral tumors in dogs and cats. In: Rosenthal RC. Veterinary oncology secrets. Philadelphia: Hanley et Belfus, INC., 2001. p. 191-194. 5. White RAS. Mast cell tumors. In: Dobson JM, Lascelles BDX. BSAVA: manual of canine and feline oncology. Gloucester: BSAVA, 2003. p. 161-167; 227-213. 6. Salgado BS, Ferreira TS, Carvalho GD, Valente FL, Silva FL, Viloria MIV, et al. Estudo Retrospectivo das Neoplasias orais de cães atendidos no departamento de veterinária da Universidade Federal de Viçosa. Vet Zootec. 2008; 15: 12-14. 44 ESTUDO COMPARATIVO ENTRE O PADRÃO DE ADERÊNCIA IN VITRO DE CÉLULAS DA LINHAGEM B16F10 DO MELANOMA MURINO E SUA DISTRIBUIÇÃO METASTÁTICA COMPARATIVE STUDY OF THE IN VITRO ADHESION PATTERN OF THE STRAIN B16F10 MURINE MELANOMA AND ITS METASTATIC DISTRIBUTION ESTUDIO QUE COMPARA LA NORMA EN LA ADHESIÓN IN VITRO DE LA CEPA B16 MELANOMA F10 Y SU DISTRIBUCIÓN METASTÁSICA Kátia Regina Teixeira de Souza 1,4 Elisabeth Martins Silva da Rocha 2 Maria de Lourdes Gonçalves Ferreira 1 Roberto Alfonso Arcuri 3 Palavras-chave: B16MF10; metástases; aderência in vitro. INTRODUÇÃO O surgimento da neoplasia primária em um indivíduo não é necessariamente o causador de sua morte, mas sim, a disseminação metastática, frequentemente responsável pela falha terapêutica (1). A capacidade das células neoplásicas malignas colonizarem tecidos a distância do foco primário, produzindo novos tumores autônomos, é um processo independente e distinto do mecanismo biológico da formação da neoplasia primária (2). Esse processo envolve etapas complexas, conhecidas como cascata metastática. Existe uma base genética determinante na habilidade da célula neoplásica em formar metástases, conferindo potencial metastático pela expressão anormal de genes que codificam os receptores de residência e proteinases que degradam a matriz extracelular, determinantes da invasão e ancoragem da célula tumoral a um sítio específico (3,4). Através do uso da técnica de aderência de linfócitos in vitro (9) adaptada para a aderência de células tumorais, objetivou-se comparar a distribuição metastática in vivo com a aderência das células da linhagem B16F10 do melanoma murino em diferentes 1 Serviço de Cirurgia e Oncologia do Hospital Universitário de Medicina Veterinária Professor Firmino Mársico Filho, Universidade Federal Fluminense – Niterói/RJ. E-mail: katiaregina.vet@hotmail.com 2 Departamento de Microbiologia e Parasitologia.Instituto Biomédico, Universidade Federal Fluminense – Niterói/RJ 3 Seção de Patologia Experimental do Setor de Pesquisa Básica, Instituto Nacional de Câncer – Rio de Janeiro/RJ. 4 Equalis, Instituto de Ensino e Qualificação Superior – Niterói/RJ 45 tecidos in vitro e determinar se o padrão de aderência acompanha a distribuição das metástases in vivo. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi realizado no setor de Pesquisa Básica do Instituto Nacional de Câncer, após aprovação pela Comissão Ética desta instituição. Para a realização dos experimentos in vitro, foi realizada a técnica de aderência a frio para adesão linfocitária em fragmentos de órgãos linfóides. 4 Foram preparados cortes histológicos em criostato dos pulmões, fígado, linfonodos mesentérico, inguinal e músculo da coxa de camundongos C57Bl/10J. As lâminas foram incubadas com 0,2ml da suspensão celular da linhagem B16F 10 na concentração 2x10 6 células/ml. Posteriormente, os cortes foram lavados em solução salina (NaCl à 0,9%), fixados em gluteraldeído e corados com hematoxilina e eosina para leitura ―as cegas‖. Para os estudos in vivo,os camundongos foram divididos em dois grupos (3 por grupo experimental). No primeiro grupo foi administrado por via endovenosa 0,2mL da suspensão celular de B16F10 na concentração de 2x10 6 células/ml. Os animais do grupo controle foram inoculados com 0,2ml de NaCl à 0,9%. Após 14 dias, foi realizada a necropsia e obtidas amostras teciduais dos pulmões, fígado, linfonodos inguinais, mesentéricos e coração para a quantificação das metástases, realizada através da contagem das formações tumorais, com o auxílio de um microscópio estereoscópico. Os experimentos foram sincronizados de maneira tal que de um mesmo cultivo celular fosse possível retirar células para ambos os modelos experimentais. RESULTADOS Foram realizadas oito experiências sincronizadas, in vitro e in vivo. O comportamento do padrão de aderência in vitro e a disseminação metastática in vivo em diversos órgãos mostrou que a formação de metástases foi exclusivamente pulmonar. In vitro, a aderência das células neoplásicas nos pulmões (7,164,37) foi superior à aderência ao fígado (1,34±0,78). O padrão de aderência ao linfonodo mesentérico (6,31±3,6) mostrou-se semelhante ao padrão pulmonar. A aderência ao músculo e ao linfonodo inguinal foi nula. In vivo, observou-se alto número de metástases pulmonares (108,4±116,1) sem a ocorrência de metástases hepáticas, nodais (inguinais e 46 mesentéricas) e cardíacas. Não ocorreram metástases nos animais pertencentes ao grupo controle. DISCUSSÃO As células da linhagem B16F10 têm a característica de gerar metástases preferencialmente no tecido pulmonar (5). Tanto nos experimentos in vivo quanto in vitro, foi observado que as células administradas por via intravenosa mantiveram esta característica. Ao mostrar um padrão de aderência in vitro semelhante ao fenômeno in vivo, é possível hipotetizar que o fenômeno metastático independe de fatores mecânicos relativos ao espaço vascular, como descrito pela teoria da heterogeneidade celular. Esta teoria sugere que as metástases seriam implantes tumorais formados à distância, baseados em habilidades específicas das células de um tumor primário e das células normais de seu portador (1,6-8), sugerindo a existência de uma estreita relação entre os receptores das células neoplásicas e os receptores da células-alvo. No entanto foi observada adesão celular nos linfonodos mesentéricos nos experimentos in vitro. Uma provável explicação para este fato seria a existência de receptores inespecíficos de aderência com amplo espectro de atividade. Ou seja, receptores nas células capazes de reconhecer diversas estruturas e/ou células, inclusive neoplásicas. A explicação para a não ocorrência de metástases mesentéricas, após injeção intravenosa, seria a necessidade da existência de receptores vasculares para o extravasamento das células tumorais a partir da luz vascular para o sítio de proliferação, além dos receptores das próprias células mesentéricas. Sugere-se a existência de genes envolvidos no processo de metástase que codificariam os receptores de residência, seus ligantes e proteinases para a degradação da matriz extracelular, levando à invasão (9). Desta forma a distribuição das células tumorais não seria um processo aleatório, mas determinado por reconhecimento específico onde as células tumorais se disseminariam em direção a um determinado órgão, após interações entre a superfície das células tumorais e do endotélio vascular do tecido alvo, seguido do fenômeno de aderência e extravasamento (7,10,11). CONCLUSÃO Os resultados observados nas experiências in vitro mostram a aplicabilidade da técnica de aderência linfocitária à aderência de células tumorais, quando usada a linhagem B16F10 do melanoma murino, eletiva para estudos da metástase pulmonar. A utilização 47 da técnica de aderência de células neoplásicas em cortes teciduais pode ser um instrumento útil ao estudo da biologia das metástases. REFERÊNCIAS 1. Leber MF, Efferth T. Molecular principles of cancer invasion and metastasis (review). Int J Oncol. 2009; 34: 881-95 2. Lujambio A, Esteller M. How epigenetics can explain human metastasis: a new role for microRNAs. Cell Cycle. 2009; 8:377-82. 3. Duffy MJ, McGowan PM, Gallagher WM. Cancer invasion and metastasis: changing views. J Pathol. 2008; 214: 283-93. 4. Stamper HB, Woodruff JJ. An in vitro model for lymphocyte homing. I. Characterization of the interection between thoracic duct lymphocytes and specialized high-endhotelial venules of lymph nodes. J Immunol. 1977; 119:772-80. 5. Fidler IJ. Tumour heterogeneity and the biology of cancer invasion and metastasis. Cancer Res. 1978; 38:2651-60. 6. Fidler IJ. Critical determinants of metastasis. Semin Cancer Biol. 2002, 12(2): 89-96. 7. Heppner GH. Tumour heterogeneity. Cancer Res. 1984; 44:2259-65. 8. Nicolson GL. Molecular mechanisms of cancer metastasis: tumours and host properties and the role of oncogenes and suppressor genes. Current Opinion in Oncol. 1991; 3:75-92. 9. Weber GF. Molecular mechanisms of metastasis. Cancer Lett. 2008; 270: 181-9 10. Hart IR. A propagação dos tumores. In: Franks LM, Teich NM. Introdução à Biologia Celular e Molecular do Câncer. 2ª ed. São Paulo: Editora Roca. 1990, p. 25-36. 11. Tarin D. Clinical and experimental studies on the biology of metastasis. Biochem Biophys Acta. 1985; 180:227-35. 48 O USO DO EXAME HISTOPATOLÓGICO NO DIAGNÓSTICO DIFERENCIAL DE TUMOR DE MAMA E DE GLÂNDULA SALIV