RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta Tese será disponibilizado somente a partir de 17/08/2023. Câmpus de Araraquara Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Abordagem integrada de metodologias in vitro e in silico para avaliação da segurança de conservantes antimicrobianos utilizados em cosméticos Gabriela de Oliveira Prado Corrêa Orientadora: Profa. Dra. Vera Lucia Borges Isaac Araraquara 2021 ii Câmpus de Araraquara Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Abordagem integrada de metodologias in vitro e in silico para avaliação da segurança de conservantes antimicrobianos utilizados em cosméticos Gabriela de Oliveira Prado Corrêa Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, para obtenção do Título de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientadora: Profa. Dra. Vera Lucia Borges Isaac Araraquara 2021 iii Câmpus de Araraquara iv Câmpus de Araraquara v Câmpus de Araraquara DEDICATÓRIA Dedico esse trabalho a todos os animais de laboratório que morreram em nome da ciência: vocês nunca serão esquecidos! Somente, graças aos testes em animais, a ciência evoluiu e, hoje, enfim, vislumbramos um futuro totalmente sem testes em animais, muito próximo. #foreveragainstanimaltesting vi Câmpus de Araraquara AGRADECIMENTOS A Deus por me dar forças e proporcionar a realização de mais esse sonho; À minha família pela paciência, auxílio e compreensão, em especial ao meu marido Murilo Corrêa, que sempre esteve ao meu lado me apoiando nos momentos felizes e tristes; À minha orientadora Profª Drª Vera Lucia Borges Isaac pela amizade, companheirismo, paciência, incentivo e a todos os ensinamentos acadêmicos e de vida; Ao Grupo Boticário, em especial à Andrezza Di Pietro Micali Canavez, por toda paciência, ensinamentos e amizade; À técnica de laboratório Ilza Yogui, pela ajuda e colaboração; À Professora Titular Drª Regina Maria Barretto Cicarelli, por ceder seu laboratório para a realização dos ensaios envolvendo cultura celular; Aos alunos da Profa. Vera e do Prof. Marcos, que se tornaram grandes amigos durante essa jornada; À Faculdade de Ciências Farmacêuticas – UNESP e ao Programa de Pós- graduação; vii Câmpus de Araraquara À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa de estudos concedida; À plataforma PReMASUL, do Ministério da Ciência, Tecnologia e Inovações, por oferecer treinamentos para os métodos alternativos ao uso de animais, dos quais tive o prazer de participar de dois; Às empresas Chemyunion, Clariant, Biovital, QuantiQ e Grupo Boticário, que doaram as amostras de conservantes para a realização desse trabalho; Um agradecimento geral a todos que me ajudaram, pois foram muitas pessoas, praticamente nada do que está aqui eu fiz sozinha, tive a sorte de encontrar pessoas incríveis que me ajudaram muito! Obrigada, o mérito desse trabalho também é de vocês. viii Câmpus de Araraquara EPÍGRAFE "Não deseje que as coisas sejam mais fáceis; deseje que você seja melhor!" Jim Rohn ix Câmpus de Araraquara SUMÁRIO DEDICATÓRIA ................................................................................................... V AGRADECIMENTOS ........................................................................................ VI EPÍGRAFE ...................................................................................................... VIII RESUMO.......................................................................................................... XII ABSTRACT .....................................................................................................XIV LISTA DE FIGURAS .......................................................................................XVI LISTA DE TABELAS ......................................................................................XVII LISTA DE QUADROS ...................................................................................XVIII LISTA DE EQUAÇÕES ...................................................................................XIX LISTA DE ABREVIATURAS .............................................................................XX 1. INTRODUÇÃO ............................................................................................. 24 1.1. Revisão da literatura ................................. Erro! Indicador não definido. 1.1.1. Cenário atual do mercado cosméticoErro! Indicador não definido. 1.1.2. Definição e classificação de produtos cosméticosErro! Indicador não definido. 1.1.3. Segurança microbiológica de produtos cosméticosErro! Indicador não definido. 1.1.4. Legislações vigentes para conservantesErro! Indicador não definido. 1.1.5. Propilparabeno e Metilparabeno ..... Erro! Indicador não definido. 1.1.6. Fenoxietanol ................................... Erro! Indicador não definido. 1.1.7. Metilcloroisotiazolinona e metilisotiazolinonaErro! Indicador não definido. 1.1.8. DMDM hidantoína e imidazolidinil ureiaErro! Indicador não definido. 1.1.9. Dehidroacetato de sódio ................. Erro! Indicador não definido. x Câmpus de Araraquara 1.1.10. Álcool benzílico ............................. Erro! Indicador não definido. 1.1.11. Cloreto de benzalcônio ................. Erro! Indicador não definido. 1.1.12. Caprilil glicol.................................. Erro! Indicador não definido. 1.1.13. Benzoato de sódio ........................ Erro! Indicador não definido. 1.1.14. Etilhexilglicerina ............................ Erro! Indicador não definido. 1.1.15. Avaliação de segurança de matérias primas cosméticas ...... Erro! Indicador não definido. 1.1.16. Métodos alternativos ao uso de animaisErro! Indicador não definido. 1.1.17. Metodologias in vitro ..................... Erro! Indicador não definido. 1.1.18. Metodologias in silico .................... Erro! Indicador não definido. 2. OBJETIVOS ......................................... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO. 2.1. Objetivo geral ............................................ Erro! Indicador não definido. 2.2. Objetivos específicos ................................ Erro! Indicador não definido. 3. MATERIAL E MÉTODOS ..................... ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO. 3.1. Material ..................................................... Erro! Indicador não definido. 3.1.1. Amostras ........................................ Erro! Indicador não definido. 3.1.2. Material para rotina celular ............. Erro! Indicador não definido. 3.1.3. Reagentes ...................................... Erro! Indicador não definido. 3.1.4. Equipamentos ................................. Erro! Indicador não definido. 3.2. Métodos .................................................... Erro! Indicador não definido. 3.2.1. Avaliação in vitro ............................. Erro! Indicador não definido. 3.2.1.1. Ensaio de exclusão do corante azul de tripanoErro! Indicador não definido. 3.2.1.2. Avaliação da citotoxicidade por meio das metodologias que utilizam os corantes vitais MTT e NR .... Erro! Indicador não definido. 3.2.1.3. Avaliação de dano ocular (Short Time Exposure – STE) .. Erro! Indicador não definido. xi Câmpus de Araraquara 3.2.2. Avaliação in silico ........................... Erro! Indicador não definido. 3.2.3. Avaliação do perigo ........................ Erro! Indicador não definido. 3.2.4. Avaliação da exposição e caracterização do riscoErro! Indicador não definido. 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ............ ERRO! INDICADOR NÃO DEFINIDO. 4.1. Avaliação in vitro ....................................... Erro! Indicador não definido. 4.1.1. Avaliação da citotoxicidade por meio das metodologias que utilizam os corantes vitais MTT e NR. ...... Erro! Indicador não definido. 4.1.2. Avaliação de dano ocular (Short Time Exposure – STE) ......... Erro! Indicador não definido. 4.2. Avaliação in silico ...................................... Erro! Indicador não definido. 4.3. Avaliação do perigo ................................... Erro! Indicador não definido. 4.4. Avaliação da exposição e caracterização do riscoErro! Indicador não definido. 5. CONCLUSÃO ............................................................................................... 26 6. REFERÊNCIAS ............................................................................................ 27 xii Câmpus de Araraquara RESUMO Os cosméticos, assim como outros produtos que contêm água e compostos orgânicos/inorgânicos, exigem proteção contra a contaminação microbiológica, sendo de grande importância o uso de conservantes antimicrobianos, para prolongar a vida útil dos produtos e garantir a segurança do consumidor. A avaliação de segurança dos cosméticos é, geralmente, determinada a partir do conhecimento da toxicidade dos ingredientes e da compatibilidade dos produtos com a pele. A combinação de métodos in vitro e in silico, além de aplicável à área cosmética, vem ganhando maior espaço na avaliação de parâmetros toxicológicos. Deste modo, o objetivo desse trabalho foi avaliar a segurança dos conservantes propilparabeno (PP), metilparabeno (MP), fenoxietanol (FE), mistura de metilcloroisotiazolinona e metilisotiazolinona (CMI/MI), DMDM hidantoína (DMDMH), imidazolidinil ureia (IMU), dehidroacetato de sódio (SD), álcool benzílico (BA), cloreto de benzalcônio (BAC), caprilil glicol (CG), benzoato de sódio (SB) e etilhexilglicerina (EEG) por meio de uma abordagem integrada de métodos in vitro e in silico. Foram realizados testes in vitro de citotoxidade e avaliação do potencial de irritação ocular, análise in silico dos desfechos de sensibilização da pele, fototoxicidade, toxicidade oral aguda, carcinogenicidade, mutagenicidade, genotoxicidade e atividade endócrina. Os resultados obtidos foram plotados em uma matriz toxicológica para a avaliação do perigo, na qual os conservantes foram classificados em níveis de toxicidade definidos como baixo (B) e alto (A). Na avaliação da exposição, foi estabelecida a concentração máxima segura e a caracterização do risco, que permitiram a integração dos dados e uma conclusão de segurança. Considerando a abordagem de avaliação do perigo, os desfechos mais preocupantes, nos quais grande parte dos conservantes receberam classificação de nível alto de toxicidade, foram a irritação da pele (PP, MP, FE, CMI, MI, DMDMH, IMU, BAC, CG e EEG), sensibilização da pele (MP, FE, CMI, MI, DMDMH, IMU, SD e BA) e toxicidade oral aguda (FE, CMI, MI, DMDMH, SD, BA e BAC). Na avaliação da exposição, apenas dois conservantes (SB e EEG) ficaram com a margem de segurança (MoS) abaixo xiii Câmpus de Araraquara de 100; contudo, reduzindo a concentração utilizada foi possível chegar em uma concentração segura. Considerando os ensaios realizados, é necessária uma abordagem holística que englobe os resultados obtidos in vitro e in silico, pois dados isolados não configuram uma avaliação de segurança. Apesar dos desafios na utilização de métodos in silico, a abordagem integrada de testes proposta permitiu a robustez na avaliação da segurança. Os conservantes antimicrobianos estão presentes em praticamente todos os produtos; portanto, as substâncias que tenham potencial para causar qualquer efeito adverso, devem ser incorporadas, nos cosméticos, em condições consideradas seguras, para garantir a integridade da saúde humana. Palavras-chave: cosméticos, conservantes antimicrobianos, in vitro, in silico, avaliação de segurança. xiv Câmpus de Araraquara ABSTRACT Cosmetics, like other products containing water and organic/inorganic compounds, require protection against microbiological contamination. It is important to use antimicrobial preservatives to prolong the shelf life of products and ensure consumer safety. The safety assessment of cosmetics is generally determined from knowledge of the toxicity of the ingredients and the compatibility of the products with the skin. The combination of in vitro and in silico methods, in addition to being applicable to cosmetic purposes, has been gaining more space in the assessment of toxicological parameters. Thus, the aim of this work was to evaluate the safety of preservatives: propylparaben (PP), methylparaben (MP), phenoxyethanol (FE), mixture of methylisothiazolinone and methylchloroisothiazolinone (CMI/MI), DMDM hydantoin (DMDMH), imidazolidinyl urea (IMU), sodium dehydroacetate (SD), benzyl alcohol (BA), benzalkonium chloride (BAC), caprylyl glycol (CG), sodium benzoate (SB) and ethylhexylglycerine (EEG) through an integrated approach of in vitro and in silico methods. In vitro cytotoxicity tests, evaluation of eye irritation potential and in silico analysis of skin sensitization, phototoxicity, acute oral toxicity, carcinogenicity, mutagenicity, genotoxicity, and endocrine activity endpoints were performed. The results obtained were plotted in toxicological matrices for hazard assessment, where preservatives were classified into toxicity levels defined as low (B) and high (A), exposure assessment, where the maximum safe concentration was established and risk characterization, which allowed for data integration and a safety conclusion. Considering the hazard assessment approach, the endpoints in which most preservatives were rated as high toxicity level were skin irritation (PP, MP, FE, CMI, MI, DMDMH, IMU, BAC, CG and EEG), skin sensitization (MP, FE, CMI, MI, DMDMH, IMU, SD and BA), and acute oral toxicity (FE, CMI, MI, DMDMH, SD, BA and BAC). In the exposure assessment, only two preservatives (SB and EEG) had a safety of margin (MoS) below 100, however, by reducing the concentration used, it was possible to reach a safe concentration. Considering the tests performed, a holistic approach that encompasses the results obtained in vitro and in silico is xv Câmpus de Araraquara necessary, as isolated data do not constitute a safety assessment. Despite the challenges in using in silico methods, the proposed integrated testing approach allowed for robustness in the safety assessment. Antimicrobial preservatives are present in virtually all products; therefore, substances that have the potential to cause any adverse effect must be incorporated into cosmetics under conditions considered safe to ensure the integrity of human health. Keywords: cosmetics, antimicrobial preservatives, in vitro, in silico, safety assessment. xvi Câmpus de Araraquara LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação esquemática da extrapolação do animal para o homem para o cálculo da margem de segurança Erro! Indicador não definido. Figura 2. Cronograma de mudanças no Regulamento Europeu referentes aos testes em animais (Regulamento CE N. 1223/2009)Erro! Indicador não definido. Figura 3. Desenho experimental para o ensaio de citotoxicidade MTT/NR . Erro! Indicador não definido. Figura 4. Desenho experimental para o ensaio de dano ocular STE .......... Erro! Indicador não definido. Figura 5. Curvas de viabilidade celular (Metodologia com o corante MTT) . Erro! Indicador não definido. Figura 6. Curvas de viabilidade celular (Metodologia com o corante NR) ... Erro! Indicador não definido. Figura 7. Placa de 96 poços utilizada na avaliação da citotoxicidade por meio da metodologia com o corante MTT .................... Erro! Indicador não definido. Figura 8. Placa de 96 poços utilizada na avaliação da citotoxicidade dos conservantes por meio da metodologia com o corante NRErro! Indicador não definido. Figura 9. Células HaCaT e HDFa ....................... Erro! Indicador não definido. Figura 10. Célula HepG2 .................................... Erro! Indicador não definido. Figura 11. Célula SIRC ....................................... Erro! Indicador não definido. Figura 12. Layout do software VEGA HUB ......... Erro! Indicador não definido. Figura 13. Layout do software OECD QSAR toolboxErro! Indicador não definido. Figura 14. Exemplo de análise realizada no PRED-SKINErro! Indicador não definido. xvii Câmpus de Araraquara LISTA DE TABELAS Tabela 1. Conservantes e concentrações utilizadas nos ensaios ................ Erro! Indicador não definido. Tabela 2. Parâmetros de avaliação do perigo ..... Erro! Indicador não definido. Tabela 3. Valores percentuais de IC50 (m/v) obtidos nos ensaios de citotoxicidade por meio da metodologia com o corante MTTErro! Indicador não definido. Tabela 4. Valores percentuais de IC50 (m/v) obtidos nos ensaios de citotoxicidade por meio da metodologia com o corante NRErro! Indicador não definido. Tabela 5. Valores percentuais de IC30 (m/v) obtidos nos ensaios de citotoxicidade por meio da metodologia com o corante MTTErro! Indicador não definido. Tabela 6. Valores percentuais de IC30 % (m/v) obtidos nos ensaios de citotoxicidade por meio da metodologia com o corante NRErro! Indicador não definido. Tabela 7. Classificação dos conservantes pela metodologia STE ............... Erro! Indicador não definido. Tabela 8. Resultados das predições in silico para os desfechos de irritação da pele, sensibilização da pele e fototoxicidade....... Erro! Indicador não definido. Tabela 9. Resultados das predições in silico para o desfecho de irritação ocular ............................................................................ Erro! Indicador não definido. Tabela 10. Resultados das predições in silico para o desfecho de toxicidade oral aguda ........................................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 11. Resultados das predições in silico para o desfecho de atividade endócrina............................................................. Erro! Indicador não definido. Tabela 12. Resultados das predições in silico para os desfechos de carcinogenicidade, mutagenicidade e genotoxicidadeErro! Indicador não definido. Tabela 13. Avaliação de perigo ........................... Erro! Indicador não definido. Tabela 14. Avaliação da exposição .................... Erro! Indicador não definido. xviii Câmpus de Araraquara xix Câmpus de Araraquara LISTA DE QUADROS Quadro 1. Lista de conservantes antimicrobianos utilizadosErro! Indicador não definido. Quadro 2. Informações químicas do propilparabeno e metilparabeno ........ Erro! Indicador não definido. Quadro 3. Informações químicas do fenoxietanolErro! Indicador não definido. Quadro 4. Informações químicas de metilcloroisotiazolinona e metilisotiazolinona ............................................... Erro! Indicador não definido. Quadro 5. Informações químicas de DMDM hidantoína e imidazolidinil ureia ............................................................................ Erro! Indicador não definido. Quadro 6. Informações químicas do dehidroacetato de sódioErro! Indicador não definido. Quadro 7. Informações químicas do álcool benzílicoErro! Indicador não definido. Quadro 8. Informações químicas do cloreto de benzalcônioErro! Indicador não definido. Quadro 9. Informações químicas do caprilil glicolErro! Indicador não definido. Quadro 10. Informações químicas do benzoato de sódioErro! Indicador não definido. Quadro 11. Informações químicas da etilhexilglicerinaErro! Indicador não definido. Quadro 12. Métodos alternativos aceitos pelo CONCEA (RN nº 18 e 31) ... Erro! Indicador não definido. Quadro 13. Classificação das substâncias-teste pela metodologia STE ..... Erro! Indicador não definido. Quadro 14. Notação química SMILES ................ Erro! Indicador não definido. Quadro 15. Softwares e modelos preditivos utilizados nas análises in silico ............................................................................ Erro! Indicador não definido. xx Câmpus de Araraquara xxi Câmpus de Araraquara LISTA DE EQUAÇÕES Equação 1. Cálculo de viabilidade celular com corante azul de tripano ...... Erro! Indicador não definido. Equação 2. Cálculo da porcentagem de células mortas para os ensaios MTT/NRU ............................................................ Erro! Indicador não definido. Equação 3. Cálculo da porcentagem de células vivas para os ensaios MTT/NRU ............................................................ Erro! Indicador não definido. Equação 4. Cálculo da viabilidade celular (%) para o ensaio STE .............. Erro! Indicador não definido. Equação 5. Cálculo da SED para avaliação da exposição sistêmica .......... Erro! Indicador não definido. Equação 6. Cálculo da MoS para avaliação da exposição sistêmica .......... Erro! Indicador não definido. xxii Câmpus de Araraquara LISTA DE ABREVIATURAS A: Alto ABDI: Agência Brasileira de Desenvolvimento Industrial ABIHPEC: Associação Brasileira da Indústria de Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos ACFB: Academia de Ciências Farmacêuticas do Brasil ADI: Applicability Domain Index - Índice do domínio de aplicabilidade ANF: Academia Nacional de Farmácia ANVISA: Agência Nacional de Vigilância Sanitária AOP: Adverse Outcome Pathway – Via de desfecho adverso B: Baixo BA: Álcool benzílico BAC: Cloreto de benzalcônio BCOP: Bovine corneal opacity and permeability BraCVAM: Centro Brasileiro de Validação de Métodos Alternativos CAGR: Taxa de crescimento anual composta CAS: Chemical Abstracts Service CE: Comissão Europeia CG: Caprilil glicol CI: Confidence Interval - Intervalo de confiança CIR: Cosmetic Ingredient Review CMI: Metilcloroisotiazolinona CN: Controle negativo CO2: Dióxido de carbono CONCEA: Conselho Nacional de Experimentação Animal COVID-19: Coronavirus Disease – 2019 CP: Controle positivo DA: Domínio de aplicabilidade DCA: Dermatite de contato alérgica DCI: Dermatite de contato irritativa DHA: Ácido dehidroacético xxiii Câmpus de Araraquara DMDMH: DMDM hidantoína DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium DMSO: Dimetilsulfóxido DP: Desvio padrão DNA: Ácido desoxirribonucleico DPRA: Direct Peptide Reactivity Assay EEG: Etilhexilglicerina EHS: Environment, Health and Safety FD: Fora do domínio FE: Fenoxietanol FIOCRUZ: Fundação Oswaldo Cruz GHS: Globally Harmonised System of Classification, Labelling and Packaging of Chemicals HaCaT: Human Immortalized Keratinocytes h-CLAT: Human Cell Line Activation Test HDFa: Human Dermal Fibroblasts, Adult HepG2: Liver Hepatocellular Carcinoma HET-CAM: Hen's Egg-chorioallantoic Membrane HPPC: Higiene Pessoal, Perfumaria e Cosméticos IARC: International Agency for Research on Cancer IATA: Integrated Approaches to Testing and Assessment IC30: Concentração que inibe 30% da viabilidade celular IC50: Concentração que inibe 50% da viabilidade celular ICE: Isolated Chicken Eye IMU: Imidazolidinil ureia INCI name: International Nomenclature of Cosmetic Ingredient INCQS: Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde LC: Lethal concentration – Concentração letal LD: Lethal dose – Dose letal LLNA: Local Lymph Node Assays LSS: Lauril sulfato de sódio MCTIC: Ministério da Ciência, Tecnologia, Inovações e Comunicações xxiv Câmpus de Araraquara MDCK: Madin-Darby Canine Kidney MEM: Minimum Essential Media MI: Metilisotiazolinona MIE: Molecular Initiating Event MN: Micronúcleos MNvit: Teste do micronúcleo in vitro MoA: Mode of Action – Modo de ação MoS; Margin of Safety – Margem de segurança MP: Metilparabeno MTT: Brometo de 3-4,5-dimetil-tiazol-2-il-2,5-difeniltetrazólio NOAEL: No Observed Adverse Effect Level - Nenhum nível de efeito adverso observado NRU: Neutral Red Uptake OD: Densidade óptica OECD: Organisation for Economic Co-operation and Development ONU: Organização das Nações Unidas PBPK: Physiologically-based PharmacoKinetics PBS: Phosphate buffered saline PBTK: Physiologically based ToxicoKinetics pH: Potencial hidrogeniônico PP: Propilparabeno PL: Projeto de lei PLC: Projeto de lei da Câmara QSAR: Quantitative-Structure-Activity-Relationship RDC: Resolução da Diretoria Colegiada RENAMA: Rede Nacional de Métodos Alternativos RhCE: Reconstructed human cornea-like epithelium RhE: Reconstructed human epidermis RN: Resolução normativa RNA: Ácido ribonucleico SB: Benzoato de sódio SCCS: Scientific Committee on Consumer Safety xxv Câmpus de Araraquara SD: Dehidroacetato de sódio SED: Systemic Exposure Dose – Dose de exposição sistêmica SF: Soro fisiológico SFB: Soro fetal bovino SIRC: Statens Seruminstitut Rabbit Cornea SMILES: Simplified Molecular Input Line Entry System STE: Short Time Exposure TER: Resistência elétrica transcutânea TG: Test Guideline UE: União Europeia UN GHS Cat. 1: Categoria 1 UN GHS Cat. 2A: Categoria 2A UN GHS Cat. 2B: Categoria 2B UN GHS Não Cat.: Não categoria USEPA: United States Environmental Protection Agency WoE: Weight of Evidence – Peso de evidência 26 Câmpus de Araraquara 1. INTRODUÇÃO O mercado global de cosméticos tem sofrido desde o início da pandemia do coronavírus (COVID-19). Com o lockdown, muitas lojas fecharam, para nunca mais reabrir; contudo, a indústria cosmética tem se mostrado resiliente, com crescimento constante nos últimos anos. O Brasil possui grande representatividade nesse mercado, ocupando uma das primeiras posições no ranking mundial de consumo de higiene pessoal, perfumaria e cosméticos. Os cosméticos, assim como outros produtos que contêm água e compostos orgânicos/inorgânicos, exigem proteção contra a contaminação microbiológica, sendo de grande importância o uso de conservantes antimicrobianos, para prolongar a vida útil dos produtos e garantir a segurança do consumidor. O uso inadequado de conservantes pode levar à deterioração do produto; por outro lado, o uso excessivo pode aumentar o risco de reações adversas, como a dermatite de contato, além de, possivelmente, contribuir para o aumento da resistência a agentes antimicrobianos. A proibição dos testes em animais na União Europeia, para fins cosméticos, representou um avanço importante para o fim de uma era de testes em animais, em todo o mundo. O banimento cobriu todos os desfechos toxicológicos, independentemente de um conjunto completo de metodologias alternativas estar disponível para substituir os testes em animais correspondentes, trazendo desafios para os pesquisadores e avaliadores de segurança. Neste contexto, novas metodologias para avaliação de segurança de ingredientes cosméticos vêm sendo desenvolvidos e aprimorados nos últimos anos. Metodologias in chemico, in vitro e in silico são utilizados em uma estratégia integrada de teste, com o objetivo de cobrir o maior número de desfechos toxicológicos, buscando garantir a segurança dos consumidores. Atualmente, há muita discussão sobre quais conservantes devem ou não ser utilizados e não existe um consenso. Conservantes tradicionais como os parabenos foram substituídos por outros ingredientes como fenoxietanol e as izotiazolinonas, as quais foram responsáveis por inúmeros casos de dermatite 27 Câmpus de Araraquara de contato alérgica. Hoje, vemos esses mesmos conservantes também sendo substituídos por outras matérias-primas, como um ciclo sem fim. Nada parece bom o suficiente para o marketing, que só tem aumentado a lista de ingredientes para serem incluídos nas alegações de rótulo “free-of” ou “free- from”. Deste modo, foi proposta uma avaliação de segurança integrada, por meio de metodologias in vitro e in silico, a fim de garantir o uso seguro desses ingredientes, em produtos cosméticos. 28 Câmpus de Araraquara 5. CONCLUSÃO Considerando os ensaios realizados, é necessária uma abordagem holística que englobe todos os resultados obtidos in vitro e in silico, pois dados isolados não configuram uma avaliação de segurança. A visão global do cenário foi possível na avaliação do perigo, na qual os desfechos foram categorizados de acordo com o nível de toxicidade. Na avaliação da exposição, na qual foi estabelecida a concentração máxima segura e a na caracterização do risco, que permitiu a integração dos dados e uma conclusão de segurança. Apesar dos desafios na utilização de métodos in silico, a abordagem integrada de testes proposta, permitiu a robustez na avaliação da segurança dos conservantes contemplados neste trabalho. A interpretabilidade e mecanística envolvida no uso de ferramentas in silico permite corroborar para uma estratégia útil na avaliação de ingredientes cosméticos, desde que os resultados sejam adequados, relevantes e confiáveis. Os conservantes antimicrobianos estão presentes em praticamente todos os produtos; portanto, as substâncias que tenham potencial para causar qualquer efeito adverso, devem ser incorporadas nos cosméticos em condições consideradas seguras para garantir a integridade da saúde humana. 29 Câmpus de Araraquara 6. REFERÊNCIAS ABIHPEC. Panorama do Setor – Atualização abril 2021. Disponível em: . Acesso em: 15 jun. 2021. ADRIAENS, E. et al. CON4EI: Short Time Exposure (STE) test method for hazard identification and labelling of eye irritating chemicals. Toxicology in Vitro, CON4EI: Consortium for in vitro Eye Irritation testing strategy. v. 49, p. 65–76, 2018. AERTS, O.; VERHULST, L.; GOOSSENS, A. Ethylhexylglycerin: a low-risk, but highly relevant, sensitizer in ‘hypo-allergenic’ cosmetics. Contact Dermatitis, v. 74, n. 5, p. 281–288, 2016. ÅGERSTRAND, M.; BERONIUS, A. Weight of evidence evaluation and systematic review in EU chemical risk assessment: Foundation is laid but guidance is needed. Environment International, v. 92–93, p. 590–596, 2016. AHUJA, K.; SINGH, S. Cosmetic Preservatives Market Size & Share | Statistics - 2026. Disponível em: . Acesso em: 10 mar. 2021. ALÉPÉE, N. et al. Development of a defined approach for eye irritation or serious eye damage for liquids, neat and in dilution, based on cosmetics Europe analysis of in vitro STE and BCOP test methods. Toxicology in Vitro, v. 57, p. 154–163, 2019. ALMEIDA, A.; SARMENTO, B.; RODRIGUES, F. Insights on in vitro models for safety and toxicity assessment of cosmetic ingredients. International Journal of Pharmaceutics, v. 519, n. 1, p. 178–185, 2017. ALMG. Passa a valer lei que proíbe testes em animais. Disponível em: . Acesso em: 3 abr. 2020. 30 Câmpus de Araraquara ALVES, V. M. et al. A Perspective and a New Integrated Computational Strategy for Skin Sensitization Assessment. ACS Sustainable Chemistry & Engineering, v. 6, n. 3, p. 2845–2859, 2018. ANDERSEN, F. A. Annual Review of Cosmetic Ingredient Safety Assessments: 2007-2010. International Journal of Toxicology, v. 30, n. 5_suppl, p. 73S- 127S, 2011. ANKLEY, G. T. et al. Adverse outcome pathways: A conceptual framework to support ecotoxicology research and risk assessment. Environmental Toxicology and Chemistry, v. 29, n. 3, p. 730–741, 2010. ANSELMI, C. et al. In vitro induction of apoptosis vs. necrosis by widely used preservatives: 2-phenoxyethanol, a mixture of isothiazolinones, imidazolidinyl urea and 1,2-pentanediol. Biochemical Pharmacology, v. 63, n. 3, p. 437– 453, 2002. ANSM (French National Agency for Medicines and Health Products Safety). 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