RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 25/02/2023. I EFEITO DA ALTITUDE NA DIVERSIDADE QUÍMICA E GENÉTICA DE Lychnophora pinaster Mart. ROBERTO DE OLIVEIRA PORTELLA BOTUCATU-SP -2021- Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- Graduação em Ciências Biológicas (Botânica). Área de concentração: Fisiologia e Bioquímica Vegetal Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu Seção Técnica de Pós-Graduação Rua Professor Doutor Antonio Celso Wagner Zanin, s/no, Botucatu, SP – CEP 18618-689 Telefone (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br II UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU EFEITO DA ALTITUDE NA DIVERSIDADE QUÍMICA E GENÉTICA DE Lychnophora pinaster Mart. ROBERTO DE OLIVEIRA PORTELLA PROFA. DRA. MARCIA ORTIZ MAYO MARQUES (Orientador) BOTUCATU-SP -2021- Instituto de Biociências, UNESP, Campus de Botucatu Seção Técnica de Pós-Graduação Rua Professor Doutor Antonio Celso Wagner Zanin, s/no, Botucatu, SP – CEP 18618-689 Telefone (14) 3880-0780 posgraduacao@ibb.unesp.br Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Botânica). Área de concentração: Fisiologia e Bioquímica Vegetal III Palavras-chave: Bioinformática; Cerrado; Genética de populações; Óleos essenciais; Sesquiterpenos. Portella, Roberto de Oliveira. Efeito da altitude na diversidade química e genética de Lychnophora pinaster Mart / Roberto de Oliveira Portella. - Botucatu, 2021 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientador: Marcia Ortiz Mayo Marques Capes: 20303009 1. Biologia computacional. 2. Genética de populações. 3. Cerrados. 4. Óleos essenciais. 5. Sesquiterpenos. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. IV “Minha querida, você ri e não eu, se sabe quão bizarro é assunto que me traz aqui. Aprendi não depreciar a crença dos outros, por mais peculiar que pode ser. Tento manter a cabeça aberta, porque não são coisas corriqueiras da vida que podem fechar, mas coisas insólitas, extraordinários, que fazem duvidar da prória sanidade.” Drácula, Bram Stoker, 1897. Dedico à minha família e aos meus amigos V Agradecimentos Dedico ao Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, proces- sos 2017/24927-7 e 2020/01064-6) e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo fomento fornecido para desenvolvimento desta tese e de demais projetos; Dedico a todas as pessoas do Instituto Agronômico (IAC), do Departamento de Gené- tica da Universidade de Campinas (Unicamp), do Colégio de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo (Esalq/USP), da Agência Paulista de Tecnologia dos Agronegó- cios (APTA), do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA), do Departamento de Bioestatística, Biologia Vegetal, Parasitologia e Zoologia da Universidade Estadual Paulista (UNESP) e da Universidade de Taubaté (UNITAU); pois sem a ajuda e o comprometimento dessas pessoas, a confecção de minha tese não seria uma realidade; Dedico a minha família e aos meus amigos pelo suporte, apoio, conversas agradáveis, conselhos e avisos desde meu início de carreira até hoje; Dedico a minha esposa Karin, pelo compenheirismo nesses últimos doze anos, pela confiança que você sempre teve em mim, pelo apoio nos momentos mais difíceis da minha vida e por acreditar que eu poderia chegar ao fim dessa jornada; e Dedico a minha orientadora, a Dra. Marcia Ortiz Mayo Marques pela confiança depo- sitada em mim, por mostrar que eu seria capaz conduzir meus projetos a seu lado e por me guiar e acreditar em mim nesses últimos dez anos de parceria. VI Sumário Resumo ............................................................................................................................................................................. 13 Abstract ............................................................................................................................................................................ 14 I - Introdução .................................................................................................................................................................. 15 II - Objetivos .................................................................................................................................................................... 26 III - Material e Métodos ............................................................................................................................................... 27 IV - Resultados ............................................................................................................................................................... 40 V - Discussão ................................................................................................................................................................... 69 VI – Conclusão ................................................................................................................................................................ 74 VII - Considerações Finais .......................................................................................................................................... 75 VIII - Referencial Bibliográfico ................................................................................................................................. 76 IX – Anexos ...................................................................................................................................................................... 88 VII Lista de Tabelas Tabela 1. Populações de Lychnophora pinaster, Minas Gerais, Brasil. .................................................... 27 Tabela 2. Composição química média (%) dos óleos essenciais de populações de L. pinaster, Minas Gerais, Brasil. .......................................................................................................................................................................... 43 Tabela 3. Média dos valores dos fatores climáticos das populações de L. pinaster localizadas nas regiões Norte e metropolitana de Belo Horizonte (MrBH), Minas Gerais, Brasil. ................... 46 Tabela 4. Valores de correlação de cada componente principal. ..................................................................... 46 Tabela 5. Diversidade genética das populações de L. pinaster, Minas Gerais, Brasil. .................. 56 Tabela 6. Matriz de distâncias geográficas (km) entre as populações de Lychnophora pinaster Minas Gerais, Brasil. .......................................................................................................................................................................... 67 Tabela 7. Dados espectrais de RMN de 1H (300 MHz), 13C e DEPT (75 MHz) em CDCl3 do sesquiterpeno com índice de retenção de 1506 isolado das folhas de Lychnophora pinaster, população da Serra da Moeda, MG, Brasil). .................................................................................................................... 88 Tabela 8. Dados espectrais de RMN 2D (HSQC e HMBC) do sesquiterpeno com índice de retenção de 1504 isolado das folhas de Lychnophora pinaster, população da Serra da Moeda, MG, Brasil .................................................................................................................................................................................................. 89 VIII Lista de Figuras Figura 1. Localização geográfica das populações de Lychnophora pinaster Mart. no estado de Minas Gerais, Brasil. ................................................................................................................ 28 Figura 2. Fluxograma dos métodos desenvolvidos. ................................................................ 29 Figura 3. Rendimento de produção dos óleos essenciais de Lychnophora pinaster Mart. Os valores do rendimento de extração foram submetidos a análise Kruskal-Wallis (p=1,6.10-11). As letras minúsculas representam as múltiplas comparações expressas pelo teste de Dunn (p>0,05) com correção de Bonferroni. Os pontos em cada boxplot indicam o número e distribuição dos indivíduos de cada população. Diamantina (DI, 0,05 ± 0,02, n=17); Grão- Mogol (GM, 0,05 ± 0,02, n=24); Olhos D`Água (ODMa, 0,18 ± 0,11, n=16); Raposos (RPS, 0,22 ± 0,04, n=14); Serra da Moeda (SM, 0,11 ± 0,05, n=19); e Serra do Rola-Moça (SRM, 0,08 ± 0,08, n=19). ................................................................................................................... 40 Figura 4. Análise de correlação entre as altitudes (m) e o rendimento de produção dos óleos essenciais (%) de cada indivíduo das populações de Lychnophora pinaster Mart. Correlação de Kendall (R=-0,02640 e p=-0.6866). .................................................................................... 41 Figura 5. Análise de componentes principais da composição química dos óleos essenciais de L. pinaster frente os fatores climáticos. a.tuj.m.: α-tujeno; a.pin.m.: α-pineno; X4Z.Hepten.ac.: 4Z-Hepten-1-ol; etilmetilpent.fp.: etil-3-metil pentanoato; sab.m.: sabineno; b.pin.m.: β-pineno; oxlinalool.mo.: óxido de dehidróxi-trans-linalol; o.cim.m.: o-cimeno; lim.m.: limoneno; X1.8.cin.mo.: 1,8-cineol; terp.m.: terpineno; terpinol.m.: terpinoleno; linalo.mo.: linalol; n.non.al.: n-nonanal; trans.pino.mo.: trans-pinocarveol; iso.3.tuj.mo.: iso- 3-tujanol; pinocarv.co.: pinocarvona; terpinen.4.mo.: terpinen-4-ol; a.terpin.mo.: α-terpineol; mirt.mo.: mirtenol; mirtal.al.: mirtenal; n.dec.al.: n-decanal; trans.acpinoc.fp.: acetado de trans-pinocarvila; undec.al.: undecanal; cis.acpin.fp.: acetato de cis-pinocarvila; acger.m.: acetato de geranil; b.elem.s.: β-elemeno; a.cip.s.: α-cipereno; cis.car.s.: cis-cariofileno; trans.car.s.: trans- cariofileno; b.farn.s.: β-farneseno; a.hum.s.: α-humuleno; cumac.s.: cumacreno; tridec.al.: tridecanal; X4.oxo.15.nor.so.: 4-oxo-15-nor-eudesman-11-eno; Z.ner.so.: Z-nerolidol; sesqui03: sesquiterpeno 1; a.copaen.ol.so.: α-copaen-11-ol; decane.ac.: 1,10-decanediol; epi.long.so.: epi-longipinanol; spat.so.: espatulenol; carox..so.: óxido de cariofileno; b.copaen.ol..so.: β-copaen-4α-ol; vir.so.: viridiflorol; trans.carp.fp.: trans- carpacina; sesqui04: sesquiterpeno 2; sesqui06: sesquiterpeno 3; allo.cedren.so.: allo-epóxido de aromadendreno; selina.ol.cedr.so.: cedr-8(15)-en-9-α-ol; X14.trans.car.so.: 14-hidróxi-(Z)- cariofileno; X14.epi.car.so.: 14-hydroxi-9-epi-(E)- cariofileno; germ.so.: germacrona; eudesm.ol.so.: eudesm-7(11)-en-4-ol; acetridec.ac.: acetato de (2E)-tridecenol; X14.a.hum.so.: 14-hidróxi-α-humuleno; X14.hid.dihidro.cari.so.: 14-hidróxi-4,5-dihidro- cariofileno; benzibenz..fp.: benzoato de benzila; curcumen.so.: γ-curcumen-15-al; sesqui7: sesquiterpeno 4; acetoxi.hum..so.: 14-acetóxi-α-humuleno; alt: altitude; cld: cobertura de nuvens; dtr: variação de temperatura diária; pet: potencial de evapotranspiração; pre: precipitação; tmn: temperatura mínima; tmp: temperatura média; tmx: temperatura máxima; vap: pressão de vapor; wet: umidade relativa diária; yield: rendimento dos óleos essenciais..49 Figura 6. Análise hierárquica de Cluster (AHC) das populações de L. pinaster. DI: Diamantina; GM: Grão-Mogol; ODMa: Olhos D`Água; RPS: Raposos; SM: Serra da Moeda; SRM: Serra do Rola-Moça. A AHC foi realizada com Distância Euclideana e enlace de Ward. .................................................................................................................................................. 52 IX Figura 7. Análise de heatmap da composição química dos óleos essenciais de L. pinaster frente aos fatores climáticos. a.tuj.m.: α-tujeno; a.pin.m.: α-pineno; X4Z.Hepten.ac.: 4Z- Hepten-1-ol; etilmetilpent.fp.: etil-3-metil pentanoato; sab.m.: sabineno; b.pin.m.: β-pineno; oxlinalool.mo.: óxido de dehidróxi-trans-linalol; o.cim.m.: o-cimeno; lim.m.: limoneno; X1.8.cin.mo.: 1,8-cineol; terp.m.: terpineno; terpinol.m.: terpinoleno; linalo.mo.: linalol; n.non.al.: n-nonanal; trans.pino.mo.: trans-pinocarveol; iso.3.tuj.mo.: iso-3-tujanol; pinocarv.co.: pinocarvona; terpinen.4.mo.: terpinen-4-ol; a.terpin.mo.: α-terpineol; mirt.mo.: mirtenol; mirtal.al.: mirtenal; n.dec.al.: n-decanal; trans.acpinoc.fp.: acetado de trans- pinocarvila; undec.al.: undecanal; cis.acpin.fp.: acetato de cis-pinocarvila; acger.m.: acetato de geranil; b.elem.s.: β-elemeno; a.cip.s.: α-cipereno; cis.car.s.: cis-cariofileno; trans.car.s.: trans- cariofileno; b.farn.s.: β-farneseno; a.hum.s.: α-humuleno; cumac.s.: cumacreno; tridec.al.: tridecanal; X4.oxo.15.nor.so.: 4-oxo-15-nor-eudesman-11-eno; Z.ner.so.: Z- nerolidol; sesqui03: sesquiterpeno 1; a.copaen.ol.so.: α-copaen-11-ol; decane.ac.: 1,10- decanediol; epi.long.so.: epi-longipinanol; spat.so.: espatulenol; carox..so.: óxido de cariofileno; b.copaen.ol..so.: β-copaen-4α-ol; vir.so.: viridiflorol; trans.carp.fp.: trans- carpacina; sesqui04: sesquiterpeno 2; sesqui06: sesquiterpeno 3; allo.cedren.so.: allo-epóxido de aromadendreno; selina.ol.cedr.so.: cedr-8(15)-en-9-α-ol; X14.trans.car.so.: 14-hidróxi-(Z)- cariofileno; X14.epi.car.so.: 14-hydroxi-9-epi-(E)- cariofileno; germ.so.: germacrona; eudesm.ol.so.: eudesm-7(11)-en-4-ol; acetridec.ac.: acetato de (2E)-tridecenol; X14.a.hum.so.: 14-hidróxi-α-humuleno; X14.hid.dihidro.cari.so.: 14-hidróxi-4,5-dihidro- cariofileno; benzibenz..fp.: benzoato de benzila; curcumen.so.: γ-curcumen-15-al; sesqui7: sesquiterpeno 4; acetoxi.hum..so.: 14-acetóxi-α-humuleno; alt: altitude; cld: cobertura de nuvens; dtr: variação de temperatura diária; pet: potencial de evapotranspiração; pre: precipitação; tmn: temperatura mínima; tmp: temperatura média; tmx: temperatura máxima; vap: pressão de vapor; wet: umidade relativa diária; yield: rendimento dos óleos essenciais; alt: altitude; cld: cobertura de nuvens; dtr: variação de temperatura diária; pet: potencial de evapotranspiração; pre: precipitação; tmn: temperatura mínima; tmp: temperatura média; tmx: temperatura máxima; vap: pressão de vapor; wet: umidade relativa diária. ............................ 53 Figura 8. Dendograma e heatmap da expressão da divergência populacional de L. pinaster baseada no índice de fixação (FST) de Wright. O índice de fixação foi baseado no set completo de marcadores SNP entre as populações de L. pinaster. DI: Diamantina; GM: Grão-Mogol; ODMa: Olhos D`Água; SM: Serra da Moeda; SRM: Serra do Rola-Moça; SB: Serra Branca; SA: Serra da Arnica; e SSa: Serra do Salto. ............................................................................. 57 Figura 9. Análise de erro por validação cruzada (cross-validation) que descreve o melhor valor de K para a estruturação das populações de L. pinaster estudadas. ................................ 58 Figura 10. Estrutura populacional de L. pinaster segundo a estimativa dos valores de K por validação cruzada. DI: Diamantina; GM: Grão-Mogol; ODMa: Olhos D`Água; SM: Serra da Moeda; SRM: Serra do Rola-Moça; SB: Serra Branca; SA: Serra da Arnica; e SSa: Serra do Salto. ......................................................................................................................................... 59 Figura 11. Distribuição dos loci com marcadores SNP segundo o modelo BayeScan expressos de acordo com os índices de fixação (FST). Os pontos cinzas indicam loci sob seleção neutra; os pontos azuis indicam os loci sob seleção balanceadora; e os pontos amarelos indicam loci sob seleção positiva. ............................................................................. 60 Figura 12. Análise de erro por validação cruzada (cross-validation) que descreve o melhor valor de K para a clusterização das populações de L. pinaster estudadas para o set neutro de SNPs. ........................................................................................................................................ 61 X Figura 13. Análise da estrutura populacional de L. pinaster de acordo com o set neutro de marcadores SNP selecionados pelo método BayeScan. DI: Diamantina; GM: Grão-Mogol; ODMa: Olhos D`Água; SM: Serra da Moeda; SRM: Serra do Rola-Moça; SB: Serra Branca; SA: Serra da Arnica; e SSa: Serra do Salto. ............................................................................. 61 Figura 14. Análise de componentes principais (ACP) baseada no set neutro de marcadores SNP selecionados pelo método BayeScan. DI: Diamantina; GM: Grão-Mogol; ODMa: Olhos D`Água; SM: Serra da Moeda; SRM: Serra do Rola-Moça; SB: Serra Branca; SA: Serra da Arnica; e SSa: Serra do Salto. .................................................................................................. 62 Figura 15. Análise da estrutura populacional de L. pinaster de acordo com o set positivo de marcadores SNP selecionados pelo método BayeScan. DI: Diamantina; GM: Grão-Mogol; ODMa: Olhos D`Água; SM: Serra da Moeda; SRM: Serra do Rola-Moça; SB: Serra Branca; SA: Serra da Arnica; e SSa: Serra do Salto. ............................................................................. 63 Figura 16. Análise de componentes principais (ACP) baseada no set neutro de marcadores SNP selecionados pelo método BayeScan. DI: Diamantina; GM: Grão-Mogol; ODMa: Olhos D`Água; SM: Serra da Moeda; SRM: Serra do Rola-Moça; SB: Serra Branca; SA: Serra da Arnica; e SSa: Serra do Salto. .................................................................................................. 64 Figura 17. Análise de componentes principais (A) baseada na seleção de marcadores SNP segundo o modelo PCAdapt. DI: Diamantina; GM: Grão-Mogol; ODMa: Olhos D`Água; SM: Serra da Moeda; SRM: Serra do Rola-Moça; SB: Serra Branca; SA: Serra da Arnica; e SSa: Serra do Salto. B: plot Manhattan; C: plot dos valores de Q-Q; D: plot dos valores de p (p<0,5x10-3). ............................................................................................................................. 66 Figura 18. Estrutura química do sesquiterpeno 4-oxo-15-nor-eudesmano-11-eno isolado no óleo essencial da população Serra da Moeda com índice de retenção linear de 1504 (IRL calc) .................................................................................................................................................. 89 XI Lista de Abreviaturas CG: cromatógrafo a gás EM: espectrômetro de massas CG-EM: cromatógrafo a gás acoplado a espectrômetro de massas CG-DIC: cromatógrafo a gás com detector de ionização de chamas IRL: Índice de retenção linear ACP Análise de Componentes Principais AHC: Análise Hierárquica de Cluster NGS: Sequenciamento de próxima geração ou Next-generation Sequencing GBS: genotyping-by-sequecing SNP: Nucleotídeo de polimorfismo único RMN: Ressonância Magnética Nuclear ODMa: população de Olhos D’Água DI: População de Diamantina GM: População de Grão-Mogol SRM: População da Serra do Rola-Moça SM: Populacão de Serra da Moeda RPS: População de Raposos SA: População de Serra da Arnica SB: População de Serra Branca SSa: População de Serra do Salto MrBH: Região metropolitana de Belo Horizonte CV: Campos das Vertentes π: diversidade nucleotídica Ho: Heterozigosidade observada He: Heterozigosidade esperada XII Ap: Alelos privados P: Frequência alélila dos alelos mais frequenteis por locus FIS: Coeficiente de endogamia intrapopulacional FST: coeficiente de fixação 13 Resumo Lychnophora pinaster Mart. (Asteraceae) é considerada uma espécie endêmica do Cerrado, utilizada na medicina tradicional e distribuída no gradiente de altitude das serras do estado de Minas Gerais. Essas variações de altitude das serras podem modificar os fatores climáticos que moldam os padrões de isolamento geográfico entre as populações e atuam como fatores na seleção natural, interferindo na diversidade genética e na diversidade da composição quí- mica dos óleos essenciais de espécies endêmicas. Diante do trecho descrito anteriormente, o objetivo deste estudo foi avaliar a influência da altitude na diversidade genética e na composi- ção química de óleos essenciais de populações de L. pinaster encontradas em diferentes alti- tudes. Indivíduos de Lychnophora pinaster de cinco populações de duas regiões do estado de Minas Gerais (Norte e Região metropolitana de Belo Horizonte) tiveram seus óleos essenciais analisados, e indivíduos de oito populações encontrados em três regiões (Norte; Região me- tropolitana de Belo Horizonte; e Campo das Vertentes) tiveram seus dados genômicos anali- sados por marcadores SNP. Os principais resultados indicaram que as populações de L. pinas- ter apresentam elevada diversidade genética e química. Os compostos majoritários nos óleos essenciais foram 14-hidróxi-α-humuleno (GM e DI), cedr-8(15)-en-9-α-ol (ODMa), 14- acetoxi-α-humuleno (SRM) e 4-oxo-15-nor-eudesman-11-eno (SM). Além disso, cada popu- lação apresenta uma composição química distinta de óleos essenciais, fortemente determinada por diferentes fatores climáticos. Altitudes elevadas (1366 m e 1498 m) encontradas na Regi- ão metropolitana de Belo Horizonte sofrem com os efeitos da precipitação e da amplitude térmica diurna, expressos na composição química dos óleos essenciais, e as populações en- contradas em baixas altitudes (<900 m) são fortemente influenciadas por temperaturas máxi- mas e mínimas e umidade relativa. Os dados genéticos indicam que as populações de L. pi- naster apresentam segregação espacial alélica, determinada pelas serras de Minas Gerais, de forma que as faixas de altitude determinaram a diversidade genética de L. pinaster. Palavras-chave: arnica, óleos essenciais, sesquiterpenos, genética de populações, Cerrado 14 Abstract Lychnophora pinaster Mart. (Asteraceae) is considered a species endemic to the Cerrado, used in traditional medicine and distributed in the altitude gradient of the mountains of the state of Minas Gerais. Altitudinal variations modify the abiotic factors that shape the patterns of geographic isolation among populations and act as important factors in natural selection, interfering in the genetic diversity and the diversity of the chemical composition of endemic species. Because of the stretch described above, the objective of this study was to evaluate the influence of altitude on the genetic diversity and chemical composition of essential oils from L. pinaster populations found at different altitudes. Individuals of Lychnophora pinaster from five populations in two regions of the state of Minas Gerais (North and Metropolitan region of Belo Horizonte) had their essential oils analyzed, and individuals from eight populations found in three regions (North; Metropolitan region of Belo Horizonte; and Campo das Vertentes) had their genomic data analyzed by SNP markers. The main results indicated that L. pinaster populations have high genetic and chemical diversity. The major compounds in the essential oil were 14-hydroxy-α-humulene (GM and DI), cedr-8 (15)-en-9-α-ol (ODMa), 14- acetoxy-α-humulene (SRM), and 4-oxo-15-nor-eudesman-11-ene (SM). Furthermore, each population has a different chemical composition of essential oils, strongly determined by dif- ferent abiotic factors. High altitudes (1366 m and 1498 m) found in the Metropolitan region of Belo Horizonte have suffered with higher precipitation and daytime thermal amplitude on the chemical composition of essential oils, and populations found at lower altitudes (<900 m) are strongly influenced by maximum and minimum temperatures and relative humidity. The ge- netic data indicate that the populations of L. pinaster show allelic spatial segregation, deter- mined by the different altitudinal patterns of Minas Gerais, and altitudinal ranges of the mountains of Minas Gerais determine the genetic diversity of L. pinaster populations. Keywords: arnica, essential oils, sesquiterpenes, genetics of populations, Cerrado 15 I - Introdução 1. Metabolismo especializado frente a altitude A altitude atua no controle e nos padrões de diversos fatores climáticos, como por exemplo na alteração dos níveis de precipitação, na amplitude térmica diária, na qualidade e composição química do solo, na velocidade dos ventos, na pressão atmosférica, na condição da cobertura de nuvens e na intensidade de radiação (KÖRNER, 1999; ZIDORN, 2010), fato- res os quais em conjunto podem alterar os aspectos morfológicos, fisiológicos, e genéticos das plantas (ANGIONI et al., 2004; RUSSELLO et al., 2015; MEENA et al., 2016; FILATOV et al., 2016; MELITO et al., 2016; SILVA, 2016; CIRAK et al., 2017). Em resposta aos fatores climáticos, as plantas sofrem ajustes moleculares e metabólicos cuja finalidade é a de evitar, tolerar ou até mesmo resistir aos fatores climáticos (SOUZA & LÜTTGE, 2015), culminando com a possibilidade de evolução química e molecular nas plantas. O metabolismo especiali- zado das plantas sofre constantes efeitos dos fatores climáticos provocados pelo gradiente de altitude, conduzindo a diferentes alterações nos perfis químicos das espécies (ANGIONI et al., 2004; DE et al., 2015; CIRAK et al., 2017). Populações de Matricaria chamomilla L., localizada em gradiente altitudinal de 590 m até 2230 m na Austrália, apresentam composição química distinta, de forma que as popula- ções localizadas em altas altitudes apresentam perfil químico distinto das populações que crescem em baixas altitudes (GANZERA et al., 2008). Os autores ainda afirmam que há au- mento de 26% na produção de flavonoides e 31% de fenóis em indivíduos localizados entre 1000m e 2000m de altitude, mostrando que flavonoides e fenóis aumentam significativamente seus teores conforme o aumento da altitude. Extratos etanólicos de populações de Marchantia polymorpha L. localizadas em diferentes altitudes na Índia a oeste do Himalaia, com variação altitudinal de 5800 m a 8202 m, têm suas atividades antibacteriana e antioxidante mais pronunciadas em plantas coletadas em elevadas altitudes (DE et al., 2015). Os autores acreditam que elevadas altitudes apresentam fatores 16 climáticos distintos os quais contribuem para alterar o pool de metabólitos especializados da espécie analisada ao longo da faixa altitudinal. Hypericum androsaemum L. encontrada em variações altitudinais de 113 m a 1161 m e Hypericum polyphyllum Boiss. & Bal. encontrada em variações de altitude entre 500 m e 3250 m na Turquia mostra que H. androsaemum apresentou correlação positiva entre a pro- dução de ácido clorogênico, ácido neoclorogênico, amentoflavona, hiperocida, isoquecitrina, quecitrina e quercetina com o aumento da altitude e H. polyphyllum apresentou correlação positiva entre a produção de hipericina, pseudohipericina, ácido clorogênico, amentoflavona, isoquecitrina, quecitrina, rutina e quercetina com o aumento da altitude (CIRAK et al., 2017). Os autores acreditam que as baixas temperaturas e alta exposição solar encontradas nas regi- ões de elevadas altitudes podem ajustar a produção de metabólitos não-voláteis nessas espé- cies, a fim de promover defesas antioxidantes contra o excesso de luminosidade. Dentre as diversas vias de biossíntese de metabólitos especializados nas plantas, as vi- as de biossíntese dos óleos essenciais são excelentes alvos de estudo pois sofrem constante- mente com as variações ambientais (LORETO & SCHNITZLER, 2010). Óleos essenciais são definidos pela Internacional Organization for Standardization (ISO) como "...produtos obti- dos a partir de matérias primas naturais de origem vegetal por destilação a vapor, por destila- ção a seco, ou pelo uso de processos mecânicos para o epicarpo de frutos cítricos, após a sepa- ração da fase aquosa (se houver), por processos físicos." (ISO, 2013). Os óleos essenciais ge- ralmente apresentam caráter hidrofóbico, com baixa solubilidade em contato com a água e alta solubilidade em contato com solventes orgânicos apolares (SINGH et al., 2002; SIMÕES, 2007; LOBO et al., 2009). Sabe-se que o metabolismo dos óleos essenciais produz inúmeras substâncias químicas necessárias à sobrevivência das plantas. Aponta-se que os fatores bióticos e abióticos são ca- pazes de provocar oscilações metabólicas as quais são identificadas nas alterações dos perfis químicos desses óleos essenciais (ANGIONI et al., 2004; SIMÕES, 2007; LOBO et al., 2009; 17 PORTELLA et al., 2014; De ALMEIDA et al., 2016). Alguns fatores climáticos alteram subs- tancialmente a composição química das plantas, como por exemplo a precipitação, temperatu- ra, sazonalidade (PORTELLA et al., 2014; De ALMEIDA et al., 2016), as condições de solo e geológicas da região (SORO et al., 2016; YAHIA et al., 2019) e a variação na altitude (CHAUHAN et al., 2016; MELITO et al., 2016), contribuindo com o estabelecimento da es- pécie no ambiente. Populações de Rosmarinus officinalis L. localizadas desde ao nível do mar até 1000 m de altitude na Itália apresentam variação na composição química dos óleos essenciais, cujas substâncias β-cariofileno, verbeneno, humuleno, α-terpineol, acetato de bornila e terpinoleno oscilam nas 17 estações naturais e também em quatro regiões distintas, Norte, Sul, Leste e Oeste do país (ANGIONI et al., 2004). Segundo MELITO et al (2016), populações de Heli- chrysum italicum G. Don f. encontradas ao nível do mar e em faixas de altitude entre 600 m e 1250 m apresentaram alterações na produção de substâncias dos óleos essenciais, de forma que italiceno, γ-curcumeno, ar-curcumeno, nerol e geraniol apresentaram correlações positi- vas entre seus altos teores e elevadas altitudes, enquanto limoneno, cariofileno nerolidol e cis- β-guaieno apresentaram correlações negativas entre seus altos teores e elevadas altitudes. É evidente que a variação da altitude modula o metabolismo especializado das plantas, contribuindo com a variação na diversidade química das espécies. Uma espécie que ocorre em diferentes altitudes deve ser investigada, uma vez que a altitude promoveria ajustes metabóli- cos nos indivíduos de diferentes populações. Ainda mais, algumas populações poderiam apre- sentar menor comunicação entre elas, fato que poderá ser amostrado na diversidade química populacional. Contudo, a diversidade química populacional não é relacionada somente com a variação de altitude, mas também com sua diversidade e estrutura genéticas. Ao investigar- mos a diversidade química das espécies, devemos concomitantemente investigar a diversidade genética dessas mesmas populações. 18 2. Ação da altitude na diversidade e na estrutura populacional Considera-se que múltiplos fatores regulam a diversidade genética das populações. Em especial, as taxas de migração, o aparecimento de mutações e a seleção natural regulam a di- nâmica populacional nos ambientes naturais (ALLENDORF et al., 2013; SILVA, 2016). É esperado que a diversidade genética de populações acompanhe o equilíbrio de Hardy- Weinberg (MEIRMANS, 2019), mantendo a variabilidade genética da espécie através do equilíbrio das frequências alélicas e genotípicas, pelo fluxo gênico existente entre as popula- ções e pela manutenção de heterozigotos, mantendo a variabilidade genética da espécie (SÁNCHEZ, 2008; ALLENDORF, 2013). Contudo, em populações naturais as quais sofrem com os efeitos bióticos e abióticos, com a seleção natural e com eventos mutacionais, é obser- vado quedas no fluxo gênico entre as populações, resultando no isolamento espacial de alelos e genótipos intra e interpopulacional, comprometendo a presença de heterozigotos nas popu- lações (SÁNCHEZ, 2008; ALLENDORF, 2013; SILVA, 2016). Sabe-se que espécies endêmicas ocorrem somente em um determinado local (ECHTERNACHT et al., 2011; ALLENDORF, 2013), sendo fortemente selecionadas por fatores climáticos. A ação dos fatores climáticos pode causar o isolamento interpopulacional, contribuindo com a perda de variabilidade genética e aumento da divergência entre as popula- ções, alterando a diversidade genética dessa espécie (SILVA, 2006; HABER, 2008; SILVA, 2016). Populações ficam isoladas pela ação de diferentes fatores, como por exemplo a varia- ção de altitude (ECHTERNACHT et al., 2011; ALLENDORF, 2013). A altitude interfere na diversidade genética de várias espécies (LI et al., 2013; RUSSELLO et al., 2015; MEENA et al., 2016; FILATOV et al., 2016). Conforme apontado pelos pesquisadores, a variação de alti- tude provoca quedas no fluxo gênico, quedas na heterozigosidade interpopulacional, aumento no número de alelos privados entre as populacões e aumento da variabilidade genética intra- populacional, indicando perda da variabilidade genética na espécie. 19 Com a presença do isolamento e da fragmentação populacional, a estrutura populacio- cal é positivamente afetada, expressando a perda da variabilidade genética populacional pelo aumento de endocruzamentos (HABER, 2008). Como consequência desse processo, é espera- do que as populações não se encontrem em equilíbro genético e a espécie possa sofrer deriva genética (ALLENDORF et al., 2013; SILVA, 2016). Uma forma de mensurar a estrutura genética das populações de uma determinada es- pécie é pela estimativa dos índices de fixação, ou estatísticas-F de Wright (WRIGHT, 1951; WRIGHT, 1965). O grau de diferenciação entre as populações (FST) expressa o grau de en- dogamia entre as populações de uma espécie, independente do sistema reprodutivo da espécie (WRIGHT, 1965). De acordo com os valores de FST, é possível descrever o grau de endoga- mia entre as populações, de forma que valores acima de 0,25 indicam grande diferenciação genética (WRIGHT, 1978). Medicago citrina (Font Quer) Greuter é uma planta endêmica do oeste do mediterrâneo que apresenta forte estrutura populacional expressa pelos valores mé- dios de FST à 0,386 (JUAN et al., 2004). Segundo os autores, os valores elevados e FST indi- cam alto grau de isolamento interpopulacional para M. citrina. O índice de endogamia intrapopulacional (FIS) descreve o desvio da panmixia dentro de uma população, levando em conta o seu sistema reprodutivo (WRIGHT, 1965). Os valores de FIS expressam a possibilidade de endogamia em cada populacão analisada, cujos valores positivos de FIS indicam a presença de processos endogâmicos nas populações e valores nega- tivos indicam que cada população está geneticamente equilibrada (PARREIRA et al., 2020). A presença de valores negativos de FIS expôem o menor número de heterozigotos na popula- ção e a presença de alelos únicos com alta frequência (YUAN et al., 2018). Logo, os valores de FIS inferem a perda variabilidade genética de cada população amostrada e seu grau de iso- lamento entre as demais populações (MONTALVO & ELLSTRAND, 2001: CORDEIRO et al., 2019). 20 A altitude confere fatores climáticos ímpares para cada população (MELITO et al., 2016; FILATOV et al., 2016), ocasionando variações de temperatura, intensidade luminosa, presença/ausência de polinizadores e dispersores e interferindo na diversidade e na estrutura genética populacional. Sabe-se que os fatores climáticos alteram estrutura genética populacio- nal (KHADIVI-KHUB et al., 2014; SELSELEH et al., 2019) e a altitude contribui positiva- mente com a estrutura genética e com a elevação da diversidade genética (LIAN et al., 2018), aumentando a habilidade das espécies a se adaptarem aos fatores climáticos locais (ZHAO et al., 2016). Logo, é necessário amostrar a diversidade populacional e a estrutura genética des- sas populações com a finalidade de apontar a variabilidade presente na espécie e se diferentes fatores, como a altitude, podem contribuir com o isolamento inter e intrapopulacional. As técnicas denominadas ômicas têm ampla aceitação na comunidade científica, pro- duzindo materiais científicos cuja investigação se pauta na sinalização químico-molecular das plantas em momentos de estresses ambientais (DUQUE et al., 2013), na dormência de plantas (ANDERSON, 2015), no metabolismo especializado (ZHONG, 2011; WANG et al., 2015), na conservação de espécies nativas, na evolução, na dinâmica populacional, na deriva genéti- ca, na hibridização e na especiação (EMERSON et al., 2015; RUSSELLO et al., 2015). A construção de bibliotecas GBS (genotyping-by-sequencing), visando a descoberta de nucleotídeos de polimorfismo único (SNP) tem por finalidade reduzir a complexidade do ge- noma da espécie amostrada e promover a busca por pequenas variações que não são usual- mente indicadas pelo uso de outros marcadores moleculares (ELSHIRE at al., 2011; POLAND et al., 2012). A investigação de polimorfismos em múltiplos loci de interesse via exploração de SNP aumenta substancialmente a capacidade de análise e associação entre os genes e o metabolismo (EMERSON et al., 2015; RUSSELO et al., 2015; KIM et al., 2016), como também a busca pela associação da diversidade e estrutura genéticas com a altitude. 21 3. Lychnophora pinaster Mart. e regiões de origem da espécie O gênero Lychnophora (Asteraceae) abriga 35 espécies, das quais 23 são encontradas em diferentes fitofisionomias do bioma Cerrado, cujas espécies apresentam ampla variação morfológica descrita pelos portes de arvoreta, arbustos e raramente subarbustos, com ramos caulinares levemente ramificados, folhas alternas sésseis, coriáceas e com inflorescências terminais (SEMIR, 2011; de ANDRADE WAGNER et al., 2014; LOEUILLE et al., 2015; LOEUILLE et al., 2019). O gênero Lychnophora é quimicamente complexo, com produções de substâncias químicas das vias do metil-eritritol-fosfato (MEP), mevalonato (MVA) e via do ácido chiquímico, com grande produtividade de hidrocarbonetos sesquiterpênicos, sesqui- terpenos oxigenados e lactonas sesquiterpênicas utilizados na medicina tradicional (SEMIR, 2011). Lychnophora pinaster Mart. (Asteraceae) se trata de uma espécie endêmica encontrada no cerrado mineiro, cujo seu estabelecimento no ambiente é ditado pelas condições físico- químicas dos solos e pela variação da altitude das serras do estado de Minas Gerais (SEMIR, 1991; SEMIR et al., 2011; SILVA, 2013; SILVA, 2016). L. pinaster ocorre em campos de canga e em campos rupestres localizados na Serra da Caraça, Serra das Carrancas, Serra de Curral d’El Rey, Serra do Curral, Serra d’Itabira do Campo, Serra do Itacolimi, Serra da Lapa, Serra de Lavras Novas, Serra do Mesquita, Serra da Moeda, Serra do Palmital, Serra da Pie- dade, Serra do Rola Moça e entre Virgem da Lapa e Serra do Cipó e nos municípios de Bar- bacena, Belo Horizonte, Belo Vale, Itabirito, Betim, Biribiri, Brumadinho, Cachoeira do Campo, Campos, Caraça, Carrancas, Catas Altas, Chapada Diamantina, Cidade de Minas, Congonhas do Campo, Gandarela, Grão Mogol, Itabira, Itabirito, Itamarandiba, Itumirim, Jardim Nossa Senhora das Graças, Lavras, Lavras Novas, Lavrinha, Mariana, Miguel Burner, Nova Lima, Santa Rita, São Julião, Serra do Ouro Branco e Santa Bárbara (SEMIR, 1991; SEMIR et al., 2011; SILVA, 2016). Esse conjunto de serras pode servir como arreira geo- 22 gráfica natural, segregando as populações de L. pinaster ao longo de sua história de vida, ca- minhando para um histórico de fenótipos químicos distintos. O estado de Minas Gerais é geologicamente antigo, complexo e rico, cujas formações rochosas apresentam alterações desde o período pré-cambriano até o período fanerozóico, sendo geografiamente dividido em regiões, ou macrorregiões (IBGE, 1972; ALKMIM, 2018). L. pinaster é encontrada na região Norte do estado, na Região metropolitana de Belo Horizon- te; e na região denominada Campo das Vertentes, cujas regiões apresentam características geológicas e morfológicas distintas. A região denominada Campo das Vertentes apresenta serras formadas por rochas cristalinas geologicamente antigas, mas também por plateaus com bacias sedimentares importantes para o estabelecimento de fitofisionomias do Cerrado e da Mata Atlântica (BARUQUI et al., 2006). Segundo o autor, há variação de altitude de 400 a 1300 m na região, contribuindo para o estabelecimento de espécies endêmicas. A Região metropolitana de Belo Horizonte abriga o Quadrilátero Ferrífero de Minas Gerais. O Quadrilátero Ferrífero apresenta relevo muito acidentado e geologicamente com- plexo, sendo circundado pela Serra do Curral, com altitudes médias de 1200 m; a Serra da Moeda, com altitudes médias de 1300 m; a Serra do Caçara, conjunto de fortes escarpes com altitudes superiores a 2000 m; e a Serra de Ouro Preto, com altitudes aproximadas a 1400 m (SILVA, 2006; ALKMIM, 2018; BARROS & MAGALHÃES JUNIOR, 2018). A grande variação de altitude no Quadrilátero Ferrífero se dá pelas características lito- lógicas e estruturais do relevo, cuja altimetria elevada ocorre em itabiritos e quartzitos, rochas com maiores resistências a erosão (SILVA, 2006). Além disso, é sabido que esses sistemas de rochas apresentam soerguimento geologicamente antigo (superior a 541Ma), mediano (fane- rozóico, de 541Ma até o presente) e recente, ocorrendo nos períodos Eoceno-Oligoceno (35- 33 Ma), Mioceno (16-13 Ma), Plioceno (7 Ma) e Pleistoceno (1 Ma) (ALKMIM, 2018). A intensa erosão modificou a distribuição fitofisiológica de região, contribuindo com pressões 23 seletivas para o estabelecimento de campos rupestres e florestas estacionais semideciduais, formações vegetacionais do Cerrado e da Mata Alântica (SILVA, 2006; ALKMIM, 2018). A região Norte de Minas Gerais é composta pela Serra do Espinhaço e pela Chapada Diaman- tina (MEYER & FRANCESCHINELLI, 2010). A composição geológica abrange rochas constituídas de quartzitos, arenitos, filitos, itabiritos e dolomitas, cujos diversos processos erosivos promoveram a formação de solos arenosos, ácidos e com baixa capacidade de re- tenção de água (SEMIR, 2011). A Cadeia do Espinhaço apresenta variação de altitude entre 800 e 2000 m (ECHTERNACHT et al., 2011; SEMIR, 2011) e seu auge de soerguimento ocorreu entre 900 e 620 Ma (ALKMIM, 2018). Os mares de morros encontrados no estado de Minas Gerais podem funcionar como barreiras geográficas para as espécies vegetais, contri- buindo com o aparecimento de endemismos, como é o caso do gênero Lychnophora. O mapeamento dos perfis químicos dos óleos essenciais de L. pinaster mostra que po- pulações naturais denominadas Poço Bonito, Estrada Real e Antena de ocorrência nos Campo das Vertentes apresentaram perfil químico distinto entre elas (HABER, 2008). As populações Poço Bonito e Estrada Real apresentaram como substância majoritária o trans-cinamato de metila (variando de 61% a 82%) e para a população Antena o cedr-8(15)-en-9-a-ol (25,2%). Ao analisar os óleos essenciais de duas populações dos Campo das Vertentes (Carrancas-MG) e uma da Região metropolitana de Minas Gerais (Itabirito-MG), foi constatado que o trans- cinamato de metila é componente majoritário nas populações dos Campo das Vertentes e há ausência dessa substância na população da Região metropolitana de Belo Horizonte (SILVA, 2016). Segundo o autor, 92,7% da variação química do óleo essencial de L. pinaster está rela- cionada com a composição química do solo. Com relação a diversidade genética de L. pinaster, Haber (2008), utilizando de marca- dores microssatélites, registrou que as heterozigosidades observadas (Ho) foram menores que as heterozigozidades esperadas (He) em três populações de L. pinaster dos Campo das Ver- tentes, apontando excesso de homozigotos nas populações. A autora também observou que 24 não há grande variação genética entre as três populações expressa pela análise de variância molecular (AMOVA), mas a divergência gênica entre as populações é intermediária (9,43%), resultante da distância geográfica interpopulacional. Além disso, os valores de endogamia entre as populações não foram elevados. Contudo, a população de Antena apresentou elevalos valores de endogamia, evidenciando que o isolamento geográfico dessa população pode con- tribuir com a queda no fluxo gênico entre as populações e favorecer o cruzamento entre indi- víduos aparentados, diminuindo a variabilidade genética da espécie. Silva (2016) amostrou seis populações de L. pinaster das regiões dos Campo das Ver- tentes e uma população da Região metropolitana de Belo Horizonte (Poço Bonito, Serra do Sofá, Serra da Arnica, Serra do Salto, Serra Branca, Areia Branca e Ouro Branco). O autor reporta que, dos alelos investigados nas proporções de Hardy-Weinberg, os valores de He foram maiores que Ho, indicando ocorrência de endogamia. Ainda segundo o autor, é neces- sário investigar um maior número de populações de L. pinaster no estado de Minas Gerais, a fim de comprovar a ação efetiva dos fatores ambientais na diversidade genética dessa espécie. Com as informações apresentadas anteriormente, a espécie apresenta grande potencial de uso farmacológico e medicinal, cujas composições químicas dos óleos essenciais já amos- tradas trazem apenas uma parcela da composição química global da espécie. Além disso, a diversidade e estrutura genética de L. pinaster deve ser amostrada e possivelmente associada com os fatores climáticos e a altitude das serras de Minas Gerais, com a finalidade de buscar padrões químicos e genéticos da espécie os quais sirvam de gatilho para futuros estudos de conservação ambiental e biotecnologia. Logo, é primordial examinar um maior número de populações de L. pinaster encontra- das nas serras de Minas Gerais, fato que contribuirá com a descrição da diversidade química e genética da espécie. Diante dos resultados dos estudos anteriores, foram formuladas as se- guintes perguntas: a) A altitude seria responsável por isolar as populações de L. pinaster ao 25 ponto de alterar significativamente a diversidade química e genética da espécie?; b) Há asso- ciação entre a diversidade química e genética populacional de L. pinaster? De acordo com as perguntas realizadas, chegamos às seguintes hipóteses: H0: A altitude interfere na diversidade química e genética de L. pinaster; e H0: Há associação entre a diversidade química e genética de L. pinaster 75 VII - Considerações Finais Com base em nossos resultados, apontamos que há grande divergência química e ge- nética entre as populações de L. pinaster estudadas; • As populações da Região metropolitana de Belo Horizonte apresentam pools genéticos distintos entre si, indicando que a altitude eleva a diversidade genética da espécie; • Os óleos essenciais das folhas de L. pinaster representam um excelente exemplo de diversidade química sob efeito dos fatores climáticos, de forma que há seleção diferencial na produção de monoterpenos e sesquiterpenos entre as populações investigadas; • Há evidências de seleção química na produção de sesquiterpenos oxigenados entre as populações SRM, SM, RPS, DI, ODMa e GM, mostrando que a variação de altitude, o isolamento geográfico e os fatores climáticos elevam a diversidade química dos óleos essenciais, contribuindo com estudos futuros para programas de conservação de L. pi- naster. 76 VIII - Referencial Bibliográfico ADAMS, R.P., 2017. 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