i UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA TESTES OFTALMOLÓGICOS EM CALOPSITAS (NYMPHICUS HOLLANDICUS): PRODUÇÃO LACRIMAL, MICROBIOTA CONJUNTIVAL E TONOMETRIA JULIANA PINATTI BARDELLA Botucatu – SP 2022 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA TESTES OFTALMOLÓGICOS EM CALOPSITAS (NYMPHICUS HOLLANDICUS): PRODUÇÃO LACRIMAL, MICROBIOTA CONJUNTIVAL E TONOMETRIA JULIANA PINATTI BARDELLA Dissertação apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Animais Selvagens para a obtenção do título de Mestre. Orientadora: Profa. Titular Cláudia Valéria Seullner Brandão iii FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 Bardella, Juliana Pinatti. Testes oftalmológicos em Calopsitas (Nymphicus hollandicus) : produção lacrimal, microbiota conjuntival e tonometria / Juliana Pinatti Bardella. - Botucatu, 2022 Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia Orientador: Cláudia Valéria Seullner Brandão Capes: 50501003 1. Aves. 2. Cacatuas. 3. Tratamento oftalmológico. 4. Microbioma. 5. Aparelho lacrimal. 6. Efeito rebote. Palavras-chave: Ave; Lacrimal; Microbioma; Rebote; Tonometro. iv Nome do autor: Juliana Pinatti Bardella TÍTULO: TESTES OFTALMOLÓGICOS EM CALOPSITAS (NYMPHICUS HOLLANDICUS): PRODUÇÃO LACRIMAL, MICROBIOTA CONJUNTIVAL E TONOMETRIA COMISSÃO EXAMINADORA Profª Titular Cláudia Valéria Seullner Brandão Presidente e Orientadora Departamento de Cirurgia Veterinária e Reprodução Animal FMVZ/UNESP - Botucatu - SP. Prof. Titular Márcio Garcia Ribeiro Membro Departamento de Produção Animal e Medicina Veterinária Preventiva FMVZ/UNESP - Botucatu - SP Dra Cintia Sesso Perches Membro Médica Veterinária Autônoma Data do exame: 26 de setembro de 2022 v Agradecimentos Agradeço primeiramente aos meus pais Vlademir Bardella e Ercília Pinatti Bardella por todo incentivo, suporte e amor. Vocês são as minhas maiores inspirações e base que tornou a continuidade dos meus estudos possíveis. Juntamente agradeço aos meus irmãos Fabio Pinatti Bardella e Henrique Pinatti Bardella, que juntos formamos uma corrente de força e união inseparável. Ao membro mais novo da nossa família, agradeço a Morena Bardella Calil por me permitir aprender sobre o amor de tia, e espero poder incentivá-la a todas as suas ambições, assim como foi feito comigo por minha família. Ao meu namorado, Rafael Costa, agradeço por todo companheirismo, amor, carinho, amizade, cumplicidade e incentivo que me da todos os dias desde o momento que nos conhecemos. Juntos aprendemos a cada dia o que é o amor e continuaremos assim por todo tempo que nos for dado. A minha professora e orientadora Cláudia Valéria Seullner Brandão, que me acompanha desde a graduação por meio de iniciação científica, estágios, treinamentos de vivência, aulas e finalmente orientação no mestrado. Agradeço imensamente, por todo conhecimento transmitido e por tornar todos os trabalhos possíveis. Agradeço a todos meus colegas pós-graduandos e ex-pós- graduandos do ambulatório de oftalmologia veterinária, que juntos formaram uma equipe capacitada, incentivada pelo amor a profissão e especialmente pela oftalmologia veterinária. Gostaria de agradecer especialmente minhas amigas Caroline Medeiros Geraldini e Juliana Marques Sousa, que seguem comigo desde o momento que entramos na graduação e continuamos nossa jornada como profissionais e companheiras na pós-graduação de oftalmologia veterinária. Carol que além de amiga é minha colega de moradia, deixando nosso lar sempre animado e com cheiro de incenso. Ju que foi minha grande parceira na realização dos testes deste trabalho, sem pestanejar diante das dificuldades do mesmo. vi Também devo meu agradecimento a todos as pessoas a qual fiz amizade em Botucatu, que estiveram do meu lado nos momentos mais felizes assim como nos mais difíceis, principalmente minhas amigas e amigo da República Topa Tudo agradeço por toda a parceria. Mesmo não morando mais juntos, sei que posso contar com vocês para qualquer coisa em qualquer momento. Sinto uma saudade imensa de poder estar todos os dias com vocês. Juntamente agradeço a todos os amigos que participam da minha vida além de Botucatu e também meu amigo Dr. Fabricio Meccheri, que se dispôs a me ajudar com as correções do meu trabalho. Ao professor Márcio Garcia Ribeiro e ao técnico de laboratório Fernando Jose Paganini Listoni, pela ajuda com as análises microbiológicas e disponibilidade em me receber nos momentos de dúvida. Ao professor Carlos Roberto Padovani pelos ensinamentos e por ter desenvolvido a análise estatística desse trabalho. Ao veterinário residente de animais selvagens do CEMPAS, Gabriel C. de Camargo que auxiliou e passou seu conhecimento sobre calopsitas para realização desse trabalho. Minha gratidão aos meus cães, Dora, Nina e especialmente o Theo, que é meu maior companheiro desde que me mudei para Botucatu. Agradeço aos meus pacientes e a seus tutores, que atendi no Ambulatório de Oftalmologia Veterinária, por me ensinarem e serem fundamentais a minha formação profissional. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Finalmente agradeço e dedico esse trabalho a minha calopsita Titi, que entrou na minha vida quando esse trabalho já estava em andamento. Ela me ensinou da maneira mais inocente e simples o quão amável é essa espécie, tornando esse trabalho ainda mais especial. vii Sumário LISTA DE TABELAS....................................................................................... viii Resumo............................................................................................................ ix Abstract............................................................................................................ x CAPÍTULO 1..................................................................................................... xi 1 INTRODUÇÃO................................................................................................2 2 REVISÃO DA LITERATURA..........................................................................5 2.1 Calopsitas............................................................................................5 2.2 Olhos e visão...................................................................................... 6 2.3 Testes oftalmológicos..........................................................................9 2.3.1 Reflexos oftalmológicos.....................................................................10 2.3.2 Avaliação da produção lacrimal.........................................................11 2.3.3 Pressão intraocular............................................................................13 2.2.5 Microbiota conjuntival.........................................................................16 3 OBJETIVOS..................................................................................................20 4 REFERÊNCIAS ............................................................................................22 CAPÍTULO 2.................................................................................................29 TESTES OFTALMOLÓGICOS EM NYMPHICUS HOLLANDICUS............31 INTRODUÇÃO..............................................................................................32 MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................33 Animais, local e temperatura....................................................................................33 Critérios de inclusão e exclusão...............................................................................33 Contenção.................................................................................................................34 Avaliação ocular e testes oftalmológicos..................................................................34 Cultivo microbiológico e MALDI-TOF MSTM............................................................37 Análise estatística.....................................................................................................38 RESULTADOS..............................................................................................36 DISCUSSÃO..................................................................................................37 CONCLUSÃO................................................................................................42 REFERÊNCIAS.............................................................................................42 APÊNDICE....................................................................................................46 viii Lista de Tabelas Tabela 1. Valores dos testes oftalmológicos de produção lacrimal e pressão intraocular (mmHg) em calopsitas(n=15), segundo o olho............ 37 Tabela 2. Valores médios gerais (n=30 olhos), representados em média e desvio padrão, da PIO em calopsitas pelo tonômetro de rebote Icare® TONOVET Plus , segundo o modo............................................... 37 Tabela 3. Medida de associação linear de Pearson da PIO entre os diferentes modos do tonômetro Icare® TONOVET Plus utilizados na mensuração em calopsitas..................................................................... 38 ix BARDELLA, J.P Testes oftalmológicos em Calopsitas (Nymphicus hollandicus): Produção lacrimal, microbiota conjuntival e tonometria. Botucatu, 2022. 58p. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. RESUMO Faz-se necessária a descrição de valores de normalidade em testes diagnósticos oftalmológicos para Calopsitas (Nymphicus hollandicus), ave exótica cada vez mais inserida no ambiente urbano e adquirida como “pet” no meio doméstico, aumentando assim a importância de atendimento veterinário especializado para essa espécie. Foram avaliadas 15 calopsitas, totalizando 30 olhos, provenientes de criadores domésticos, adultos e saudáveis ao exame clínico e oftalmológico. As aves foram contidas fisicamente e realizada a avaliação de produção lacrimal, coleta de microbiota conjuntival com ponta de papel endodôntica padronizada (PPEP), e pressão intraocular com tonometro de rebote (Icare® Tonovet plus). Os resultados obtidos foram: PPEP 10,73 ± 2,59 mm/min; pressão intraocular Tonovet plus modo cão (11,87 ± 1,43 mmHg), modo gato ( 6,73 ± 1,36 mmHg), modo coelho (13,13 ± 1,85 mmHg) e modo cavalo (9,50 ±1,28 mmHg). Na microbiota conjuntival verificou-se predomínio de bactérias gram-positivas. A tonometria de rebote, avalização de produção lacrimal e coleta de microbiota conjuntival com PPEP são métodos de fácil execução e acurados para utilização nas calopsitas, são mais indicados devido ao tamanho dos olhos. Os resultados auxiliarão os médicos veterinários oftalmologistas no diagnóstico e tratamento de doenças oculares em calopsitas, além de contribuir para pesquisas na área de visão. Palavras-chave: ave; lacrimal; microbioma; rebote; tonômetro. x BARDELLA, J.P. Ophtalmic diagnostic tests in Cockatiels (Nymphicus hollandicus): Tear production, Conjunctival microbiota and Tonometry. Botucatu, 2022. 58p. Dissertation (Masters) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista. ABSTRACT This study aimed to describe normal values in ophthalmological diagnostic tests for cockatiels (Nymphicus hollandicus), an exotic bird increasingly inserted in the urban environment and acquired as a "pet" in the domestic environment, thus increasing the importance of specialized veterinary care for this species. Fifteen cockatiels from domestic breeders, adults, and healthy, were subjected to a complete ophthalmic examination. The birds were physically restrained for the tests. The tear production and conjunctival microbiota were performed by a standardized endodontic absorbent paper point tear test (PPTT), and intraocular pressure with a rebound tonometer (icare® tonovet plus). Species of microorganisms isolated were identified by mass spectrometry. The results obtained were: PPTT 10.73 ± 2.59 mm/min; intraocular pressure Tonovet plus dog mode (11.87 ± 1.43 mmhg), cat mode (6.73 ± 1.36 mmhg), rabbit mode (13.13 ± 1.85 mmhg) and horse mode (9.50 ± 1.36 mmhg). In the conjunctival microbiota, gram-positive bacteria were predominant. Rebound tonometry, tear production assessment, and conjunctival microbiota collection with PPTT are easy and accurate methods for use in cockatiels; they are indicated due to the size of the eyes. The results will help veterinary ophthalmologists diagnose and treat eye diseases in cockatiels, in addition to contributing to research in the area of vision. Key words: bird; lacrimal; microbiome; rebound; tonometer xi CAPÍTULO 1 1 INTRODUÇÃO 2 1 INTRODUÇÃO A calopsita (Nymphicus hollandicus) é uma ave da ordem Psittaciformes, constituída pela família Cacatuidae (cacatuas, calopsitas) e Psittacidae (araras, papagaios, periquitos, maritacas) (GRESPAN & RASO, 2014; GALETTI et al., 2002; CUBAS, 2006). Segundo Cubas (2006), as aves desta ordem estão distribuídas no mundo todo, sobretudo nos neotrópicos. O maior número de espécies se concentra na América do Sul e Austrália. O Brasil é o país com a maior diversidade de psitacídeos. Em geral, os Psittaciformes são aves diurnas e arborícolas. São caracterizados por grande diversidade de tamanhos, formas e cores. As calospsitas são originárias da Austrália, pesam de 80 a 102g e têm expectativa de vida em cativeiro de 10 a 12 anos. Os Psittaciformes são aves extremamente populares pela natureza sociável, inteligência, coloração exuberante e capacidade de imitar sons, o que os torna, de modo geral, as aves mais frequentemente mantidas como animais de estimação no mundo, e com o desenvolvimento desse mercado, é exigido cada vez mais capacitação do médico veterinário de aves (CUBAS, 2006). Enquanto a oftalmologia de mamíferos nas espécies domésticas já está bem estabelecida, nota-se que ainda existe a necessidade de informação sobre parâmetros básicos de diferentes espécies de animais selvagens, tais como a mensuração da camada aquosa do filme lacrimal, medidas oculares aferidas com paquímetro convencional, espessura corneal, pressão intraocular e sensibilidade da superfície corneal. Tais limitações em exames prejudicam a qualidade dos procedimentos clínicos e cirúrgicos da oftalmologia dos animais selvagens (CARVALHO, 2018; LANGE, 2012). Neste contexto, considerando o crescente atendimento oftalmológico especializado para animais exóticos e selvagens, e a 3 escassez de publicações nesta área, foi idealizado o presente estudo visando descrever valores de referência de variáveis no exame oftalmológico das calopsitas (Nymphicus hollandicus), relacionadas à mensuração da produção lacrimal e pressão intraocular, usando o tonômetro de rebote Tono Vet® plus bem como identificar a microbiota conjuntival. Particularmente para o tonômetro de rebote Tono Vet® plus, pretende-se avaliar os diferentes modos para a espécie, visto que o aparelho não possui o modo aves, calibrado para o modo cão, gato, cavalo e coelho. 4 REVISÃO DA LITERATURA 5 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Calopsitas Segundo Tarciano (2010), a criação de calopsitas (Nymphicus hollandicus) tem se intensificado recentemente, em virtude de características próprias como baixo custo de aquisição, facilidade de manejo, dispensa de registro comercial pelo IBAMA e ótima adaptação aos locais de criação. Com o crescente interesse pela comercialização dessas aves, torna-se de fundamental importância estudos com a fisiologia e patologia desses animais, com o intuito de auxiliar os veterinários nos diagnósticos das possíveis doenças que acometem as calopsitas. Conforme Benez (2001), em 1838, John Gould, ornitólogo inglês, autor bem sucedido de livros sobre história natural, enfocando principalmente aves, visitou a Austrália objetivando conhecer sua fauna, ainda pouco descrita. Nas suas publicações em 1840 destacou a beleza das aves daquele continente, em especial a calopsita. Essas aves têm seu nome derivado da palavra alemã "kakatielje", que significa "pequena cacatua" e o nome científico é Nymphicus hollandicus, que significa "Deusa da Nova Holanda", antigo nome da Austrália (entre 1700-1800). Ainda é creditado ao pesquisador John Gould como sendo o primeiro a levar calopsitas para fora da Austrália, contribuindo decisivamente para a divulgação da espécie (BENEZ, 2001). Na natureza, as calopsitas possuem o chamado padrão silvestre ou normal, mas quando surgem aves mutantes, ostentando outras combinações de cores, elas dificilmente sobrevivem por se apresentarem como vítimas mais fáceis de predadores, visto a coloração destacada promover identificação rápida da ave (RUPLEY, 1999). 6 Segundo RUPLEY (1999), em cativeiro, o sistema social é bastante complexo. Os adultos apresentam comportamento social pouco gregário, ao contrário dos jovens que tendem à aglomeração, comumente permanecendo em grupos compactos como forma de defesa. Além disso, se forem amansadas desde filhotes, adquirem comportamento dócil, podem assobiar e algumas chegam até a “falar”. Os machos têm essa capacidade, sendo que as fêmeas apenas assobiam. Conforme Cubas (2006), a maioria das espécies de psitacídeos é considerada generalista quanto à dieta, envolvendo sementes, brotos, castanhas, coquinhos, frutas, flores e outros vegetais. Determinadas espécies consomem também insetos e pequenos animais. Outras se alimentam de frutos verdes, que contêm grande quantidade de taninos potencialmente tóxicos e, para eliminar os efeitos prejudiciais, comem argila de barrancos de rios, material que atua como suplemento de sais minerais. 2.2 Olhos e visão A visão é de vital importância para as aves. Assim entender a anatomia e fisiologia específica do olho e seu diferencial, comparado com outras espécies, é crucial para firmar o diagnóstico preciso da doença ocular (WILLIAMS, 2012). Nos papagaios os olhos são posicionados lateralmente na cabeça, com pouca sobreposição em seus campos visuais. Esta característica resulta em visão mais abrangente, explicando o giro frequente da cabeça lateralmente, objetivando melhor visão dos objetos (MARTIN, 2021). Machado et al. (2006) descreveram em detalhes a variação interespécies na estrutura óssea orbital de aves psitaciformes, classificados em dois grupos. Um grupo tinha uma órbita óssea completa formada pela junção dos processos orbital e pós-orbital formando um arco suborbital. O segundo grupo não tinha o arco suborbital e tinha uma órbita óssea incompleta aberta típica de aves mais evoluidas; mesmo neste grupo, processo orbital e pós-orbital estavam presentes. O grupo que 7 possuia órbita completa, representado por: periquito (Melopsittacus undulates), calopsita (Nymphicus hollandicus) e cacatua (Cacatua sulfurea), tinham uma característica distintiva adicional. O processo zigomático desses crânios aderiu ao processo pós-orbital e ao arco suborbital, resultando em um pequeno forame localizado entre essa estrutura fundida e a fossa temporal. Os bulbos oculares das aves são grandes e apresentam-se de três formas: plana, globosa ou tubular, sendo a forma plana a mais comum, um eixo antero-posterior curto e uma região ciliar pacialmente côncava (HOLMBERG, 2008). A maioria das aves, incluindo passeriformes e psitaciformes, apresenta um bulbo anterior- posteriormente um pouco achatado, formando um esferóide oblato com um segmento posterior hemisférico (WILLIAMS, 2012). Segundo Holberg (2008) a forma do bulbo é mantido pela cartilagem escleral hialina, juntamente com 10 a 18 ossículos esclerais, que contribuem para a acomodação, tornando-se um suporte para a ação do músculo ciliar na lente. Os seis músculos extraoculares comuns aos mamíferos estão presentes: quatro retos e dois oblíquos, mas são pouco desenvolvidos, o que limita a movimentação do bulbo ocular. O músculo retrator do bulbo está ausente, mas é substituído pelos músculos piramidal e quadrado, que são responsáveis pelo movimento da terceira pálpebra. As aves têm pálpebras superiores e inferiores, sendo a inferior mais móvel e as glândulas meibomianas estão ausentes. Nas aves, a membrana nictitante ou terceira pálpebra, é bem desenvolvida, ativamente móvel, 90% transparente, fina e coberta por uma camada papilar de epitélio. Origina-se na órbita dorsomedial, cobre o globo e estende-se ventrolateralmente. A borda da terceira pálpebra atua coletando e distribuindo o filme lacrimal ao longo da superfície da córnea (HOLMBERG, 2008; GELATT, 2014). O filme lacrimal é produzido pela glândula lacrimal, localizada inferotemporalmente, e glândula de Harder, adjacente a esclera, próxima a base da membrana nictitante, mas não pertence a mesma (HOLMBERG, 2008; GELATT, 2014). A glândula de Harder é a principal 8 fonte lacrimal nas aves (WILLIS e WILKIE, 1999; BAYÓN, 2007). A drenagem de lágrima ocorre através do ducto nasolacrimal (HOLMBERG, 2008). Na maioria das espéciesde aves, a córnea é relativamente fina (CANDIOTO, 2011; WILLIAMS, 2012), com exceção de algumas aves de rapina diurnas e aves aquáticas (CANDIOTO, 2011). Possui cinco camadas (epitélio, membrana de Bowman, estroma, membrana de Descemet e endotélio) (WILLIS & WILKIE, 1999). Segundo Kafarnik et al. (2007), após avaliação por microscopia confocal in vivo (MCIV) em 37 cães, 34 gatos e cinco Psittaciformes, concluiram que aves apresentaram várias diferenças estruturais em suas córneas. As células do epitélio exibiam núcleos muito maiores e de formato irregular. A membrana de Bowman apresentou-se como uma camada acelular com refletividade homogênea e estrutura semelhante à dos primatas. Os ceratócitos tinham núcleos radiais e se localizavam de forma estritamente paralela. As células endoteliais mantinham forma hexagonal uniforme. A câmara anterior da maioria dos olhos das aves é consideravelmente mais rasa em comparação aos mamíferos, exceto nas corujas que têm uma câmara anterior profunda (WILLIAMS, 2012). Conforme Holberg (2008) a musculatura da íris é predominantemente estriada, embora apresente quantidade limitada de músculo liso e mioepitélio dentro do músculo dilatador. A acomodação do olho das aves é realizada por meio de três mecanismos: mudança na curvatura da córnea, deformação e movimento anterior da lente, também denominada cristalino. Três músculos estão envolvidos na acomodação: músculo de Crampton, músculo de Brücke e o músculo de Müller. Para permitir a acomodação mais rápida, a lente aviária é mais macia e maleável que a dos mamíferos, sendo relativamente esférica nas espécies noturnas e achatadas anteriormente nas espécies diurnas (HOLMBERG, 2008). Sua deformação é também causada pela pressão do músculo circunferencial da íris, que abaula a porção central da lente aumentando seu poder de refração (WILLIAMS, 2012). 9 O ângulo iridocorneal é bem desenvolvido e apresenta dois canais anulares de drenagem (GELATT, 2014). Possui malhas trabeculares extensas e ligamentos pectinados bem desenvolvidos; em algumas aves é possível observar essa conformação, sem auxílio da lente para gonioscopia (RODARTE ALMEIDA et al., 2013). O fundo do olho aviário caracteriza-se por ser um dos mais interessantes entre as espécies. Na oftalmoscopia indireta revela um grande pecten vascular pigmentado, apresentando tamanho variável, estendendo-se no vítreo (HOLMBERG, 2008, GELATT, 2014); este cobre o disco óptico, obscurecendo sua visão (GELATT, 2014). O pecten é relacionado com a nutrição da retina, participação da produção e movimentação de fluidos intraoculares e, consequentemente, da pressão intraocular (BELLHORN, 1997; FERREIRA et al., 2016). As três formas de pecten descritas são as plissadas, encontradas na maioria das espécies, em forma de asa ou palhetas, presente nos avestruzes e cônico no kiwi (HOLMBERG, 2008). A retina das aves é atapetal e a maioria das espécies apresentam uma fóvea distinta (WILLIAMS, 2012). A fóvea apresenta-se como uma pequena depressão central na retina onde existe um denso arranjo de células receptoras e no centro é obtida maior acuidade visual, devido à ausência de outras camadas da retina sobre os fotorreceptores. Como consequência, esta região apresenta alta capacidade de resolução (CANDIOTO, 2011). 2.3 Testes oftalmológicos Diagnóstico precoce e correto das afecções oculares é essencial para um resultado clínico de sucesso e um tutor satisfeito. Depende quase completamente de sistema ordenado e exame ocular completo (MAGGS, 2008). De acordo com Bayón et al. (2007) o exame oftalmológico em aves é semelhante ao que é realizado em mamíferos, com algumas peculiaridades derivadas de suas diferenças anatômicas e fisiológicas. 10 Inicialmente, deve-se obter dados da história clínica completa, bem como um estudo do habitat e nutrição. O exame é realizado em etapas e segue uma ordem de realização para não comprometer alguns resultados; a sequência correta inclui inspeção, avaliação de reflexos, teste de produção lacrimal, coleta de amostras, avaliação do segmento anterior com feixe de luz, tonometria, teste de fluoresceína, indução de midríase e avaliação do segmento posterior com auxílio de oftalmoscopia direta ou indireta (MAGGS, 2008). Segundo Willis e Wilkie (1999), é importante a avaliação da aparência geral da cabeça, região periocular, posição ocular, mobilidade e simetria do globo, tamanho e simetria das pupilas. Observar também as penas perioculares e quaisquer descargas oculares, incluindo descarga das narinas, que podem indicar infecção concomitante do trato respiratório superior. O exame do segmento anterior e estrutura periocular são realizados por meio de um feixe de luz de um biomicroscópio de lâmpada de fenda, necessário para examinar os olhos pequenos de algumas espécies de aves, pois permite a ampliação e visualização de pequenas lesões (MAGGS, 2008). 2.3.1 Reflexos oftalmológicos Segundo Gelatt (2014), as respostas das aves aos reflexos relacionados aos olhos diferem dos mamíferos em alguns aspectos. A resposta palpebral eatá presente com a pálpebra inferior cobrindo o bulbo mais extensivamente do que a pálpebra superior; os movimentos da membrana nictante são proeminentes. As respostas de ameaça parecem inconsistentes mesmo em aves com visão evidentemente normal. Assim, a resposta de ameaça ausente tem pouco significado diagnóstico. O reflexo pupilar direto à luz pode ser avaliado com o uso de um feixe de luz em uma sala com pouca iluminação, porém movimentos 11 espontâneos da pupila podem ocorrer em situações de excitação, por conta do controle voluntário. Dessa forma, os reflexos indireto ou consensual não são esperados em aves, devido à interseção completa das fibras do nervo óptico (BAYÓN et al, 2007). No entanto, eventualmente respostas discretas podem ser evidenciadas, já que os olhos são separados pelo delgado septo interorbital (BAYÓN et al, 2007). O comportamento de evitação é um indicador mais confiável de visão do que o reflexo de ameaça (GELATT, 2014). O reflexo corneal não é examinado rotineiramente em aves, quando realizado pode-se observar a resposta pelo movimento de piscar e movimento da terceira pálpebra (BAYÓN et al, 2007). Como os músculos retratores do bulbo estão ausentes nas aves, a retração do bulbo não é uma característica relacionada à resposta de reflexo ocular (GELATT, 2014). 2.3.2 Avaliação da produção lacrimal A fração aquosa do filme lacrimal é um importante parâmetro fisiológico avaliado durante o exame oftálmico (CUBAS, 2007; FOWLER, 2008). Em muitas espécies, o pequeno tamanho do bulbo dificulta o uso de técnicas convencionais para sua aferição, necessitando de técnicas alternativas para as quais não há valor de referência padrão (LANGE, 2014). Os principais métodos quantitativos descritos para a avaliação da porção aquosa do filme lacrimal em aves são: o teste lacrimal de Schirmer (TLS), teste lacrimal de Schirmer modificado (TLSm), teste lacrimal de fenol vermelho (TLFV) e teste lacrimal com ponta de papel endodôntica padronizada (PPEP) (LANGE et al., 2012; LANGE et al., 2014) Segundo Maggs (2008), o teste lacrimal de Schirmer (TLS) é um método semiquantitativo de avaliar a produção da porção aquosa do filme lacrimal. Deve ser realizado antes da instilação de qualquer colírio, porque aumentariam artificialmente, mas temporariamente, o valor do TLS. Procedimentos manipulativos, como raspagens de córnea ou 12 conjuntiva, lavagem do aparelho lacrimal e até mesmo a aplicação de luzes brilhantes em um olho inflamado resultará em valores de TLS artificialmente elevados. Por estas razões, se o TLS for executado, deve ser feito como o primeiro componente do exame oftalmológico. A técnica consiste em inserir a extremidade de uma tira de papel de 0,5 cm de largura por 3,5 cm de comprimento, milimetrada, no saco conjuntival inferior, de modo que toque a córnea e 1 minuto em animais (OLLIVIER et al., 2007). A tira de teste de lágrima de Schirmer é muito larga para ser colocada em muitos olhos de aves e, mesmo que fosse do tamanho certo, a quantidade de lágrimas produzidas em um minuto não seria suficiente para produzir um comprimento mensurável de umedecimento (WILLIAMS, 2012). No teste lacrimal de Schirmer modificado (TLSm) corta-se a tira de papel de filtro longitudinalmente para reduzir pela metade sua largura (KORBEL, 1998). Os problemas desse teste é que existem poucos dados para espécies diferentes de aves sobre qual é a molhabilidade normal de uma tira de teste de meia largura e se tratando de um método de confecção manual e não padronizado, sua acurácia se tornou questionável (WILLIAMS, 2012; SMITH et al., 2015). HOLT et al. (2006) foram pioneiros na utilização de fenol vermelho em aves. O teste consistiu na impregnação de um fio de algodão com um corante amarelo (fenol vermelho). Este corante é sensível ao pH alcalino e quando absorve a lágrima (que é ligeiramente alcalina) torna-se vermelho. O fio de algodão é posicionado sob o rebordo da palpebra com o auxílio de uma pequena pinça. As pálpebras foram mantidas fechadas e o fio removido após 15 s. Todo o comprimento da porção vermelha (área molhada) do fio é medida a partir da ponta (não da dobra) e os resultados registrados em milímetros. As pontas de papel endodônticas padronizadas (PPEP) são feitas de cânhamo de manila (Musa textillis), também conhecida como planta de abacá (LANGE et al., 2012). PPEP são utilizadas em tratamentos odontológicos para secar canais radiculares, aplicar medicamentos e selantes, controlar hemorragias em pulpectomia parcial e 13 obter amostras de culturas microbiológicas intracanal (BOYD, 2019; CUNHA et al., 2008). Esses cones de papel estéril são padronizados com um diâmetro distal de 0,30 mm, permitindo a inserção no fórnice conjuntival mesmo nas menores espécies de interesse do oftalmologista veterinário (LANGE et al., 2012 e LANGE et al., 2014). Devido às suas dimensões e propriedade absorvível, as PPEP ganharam espaço na oftalmologia como um novo método de quantificar a lágrima, principalmente em espécies as quais outros métodos não são uma opção (LANGE et al., 2012 e LANGE et al., 2014). As PPEP tem como objetivo superar as limitações e permitir a comparação entre as espécies (LANGE et al., 2012 e LANGE et al., 2014). Apresentam diferentes dimensões, de acordo com a marca, assim como o poder de absorção. Zipperer, Maillefer e Roeko são as marcas com menor desvio padrão e, portanto, mais usadas em estudos (PUMAROLA-RUNE et al.,1998). Após a inserção da PPEP no fórnice conjuntival inferior lateral, espera-se 1 minuto para a leitura; a porção umedecida se torna flexível e é possível dobrá-la sobre uma régua padrão e determinar seu valor em milímetros (LANGE et al, 2012). KANE et al. (2021) em um estudo com 25 calopsitas (Nymphicus hollandicus), obteve valor médio para fissura palpebral horizontal de 5,45mm e elegeram as PPEP para este estudo devido à pequena fissura palpebral observada em calopsitas. Os autores empregaram um intervalo de 15 segundos de duração no teste, para acomodar o temperamento do paciente e minimizar o estresse associado a uma contenção mais prolongada. Conclui-se que as PPEP foram bem toleradas por grande parte das aves ao longo no estudo. 2.3.3 Pressão intraocular De acordo com Maggs (2008), por muito tempo a tonometria tem sido utilizada simplesmente como um método de diagnóstico de glaucoma. No entanto, também é um método de diagnóstico de uveíte anterior e de confirmação do diagnóstico de todas as outras causas de 14 olho vermelho, como ceratite, conjuntivite, esclerite e celulite orbitária. Para seguir a confirmação de uveíte e glaucoma, a tonometria é um método essencial e talvez o mais importante para monitorar a resposta à terapia. O tonômetro de aplanação é um dos instrumentos mais precisos e confiáveis para diagnosticar doenças intraoculares de animais (JEONG,2007). No entanto, fatores físicos oculares como curvatura e espessura da córnea, rigidez escleral e viscosidade do filme lacrimal podem influenciar a avaliação de PIO por tonometria de aplanação (JEONG,2007). Segundo Maggs (2008), o princípio da tonometria de aplanação é que a força necessária para achatar uma determinada área de uma esfera é igual à pressão dentro da esfera (a lei de Imbert-Fick). Portanto, se a área for conhecida (o tamanho da plataforma) e a força é medida, a pressão pode ser calculada. Apesar de existirem vários tipos de tonômetros de aplanação, a maioria comumente usada na prática veterinária geral e especializada é o Tono-Pen. Antes do uso, é necessária a instilação de uma gota de anestésico tópico na córnea. A mensuração da PIO em animais exóticos é realizada com os mesmos tonômetros utilizados em animais domésticos, contudo, em determinadas espécies de aves, há limitação do uso de alguns aparelhos devido ao tamanho do olho (WILLIAMS, 2012). Em olhos pequenos, o problema é que a tonometria de aplanação usando o Tono-Pen, tem uma plataforma muito grande para olhos com diâmetro da córnea menor que 5 mm, como no caso das calopsitas (WILLIS & WILKIE, 1999; WILLIAMS, 2012). O tonômetro de rebote Tonovet, projetado primeiro para uso em roedores de laboratório, é inestimável em muitas espécies pequenas (WILLIAMS, 2012). A tonometria de rebote (impacto ou dinâmica) usa um diferente princípio mecânico para aferir a PIO (GELATT, 2014). Uma pequena sonda (como um pino de metal com uma extremidade arredondada) é eletromagneticamente impulsionada rapidamente, de uma distância fixa da córnea, para entrar em contato com a córnea antes de retornar 15 (rebote) para o instrumento (GELATT, 2014). O instrumento avalia as características de rebote (desaceleração da sonda): olhos com PIO mais alta causam uma desaceleração mais rápida da sonda e menor tempo de retorno ao instrumento do que aqueles com menor PIO (GELATT, 2014). A técnica é afetada pela tensão da superfície ocular e deve ser realizada idealmente antes da aplicação de qualquer medicamento tópico, incluindo anestésicos tópicos (GELATT, 2014). Apesar dessa recomendação, dois estudos revelaram que os resultados da PIO não foram afetados pela anestesia tópica (GORIG et al., 2006; RUSANEN et al., 2010). A técnica foi desenvolvida há mais de 50 anos e só recentemente passou por um ressurgimento da popularidade devido ao lançamento de um novo tonômetro de rebote, fabricado como Tonovet ou iCare (MAGGS, 2008). Segundo Gloe (2019), o Tono Vet® plus contém atualizações destinadas para melhorar a precisão e a facilidade de uso. Possui configurações específicas para coelhos, gatos, cães e cavalos. Além disso, foram adicionados recursos que garantem que as leituras sejam obtidas apenas quando o tonômetro é mantido a uma distância apropriada e no plano correto em relação à superfície ocular. A mensuração do tonometro de rebote é feita a uma distância de 4 a 8 mm do olho (KONTIOLA, 2000; REUTER et al, 2010; Icare® Tonovet tonometer instruction manual, 2013; Icare® Tonovet Plus tonometer instruction manual, 2016). Tanto para Tonovet ou Tonovet Plus o resultado da PIO é uma média de seis medições, fornecido em mmHg de forma rápida e também possuem desvio padrão indicados no visor e recomendam que a pressão seja refeita em casos de desvios entre 2,5 a 3,5 mmHg (KONTIOLA, 2000; Tono-Pen XL® tonometer user’s guide, 2012, Icare® TONOVET tonometer instruction manual, 2013; Icare® TONOVET Plus tonometer instruction manual, 2016). Vantagens significativas deste método sobre outros incluem portabilidade entre usuários e a capacidade de obter medições in vivo sem anestésicos tópicos (DANIAS, 2003). Outras vantagens do tonometro de rebote são: ter uma ponta de sonda muito pequena (1.3- 1,8 mm) que 16 torna adequado para olhos muito pequenos, como em muitas espécies exóticas, e a ponta é descartável, podendo ser trocada na presença de doenças significativas (GELATT, 2014). Não foram identificados, do conhecimento dos autores, outros estudos da PIO utilizando Tonovet Plus em calopsitas para comparação, nem qual seria o melhor padrão, considerando as espécies disponíveis no tonômetro de rebote (Tonovet Plus), já que ainda não há um modo específico para aves disponível. 2.3.4 Microbiota conjuntival A microbiota ocular é formada pela associação de microorganismos presentes na conjuntiva do hospedeiro, usualmente, encontrados no ambiente em que vivem e interagem com o sistema imune do hospedeiro, mantendo-se estável em animais clinicamente sadios (EICHENBAUM et al., 1987; ANDRADE et al., 2002). Após realizar o exame oftalmológico completo, quando na presença de secreção ocular, o médico deve obter swabs conjuntivais para exame citológico e cultura apropriada (HOLMBERG, 2008). A coleta de amostras para cultivo microbiológico usualmente é realizada utilizando- se swabs estéreis, sem a aplicação de colírio anestésico prévio, que podem inibir o isolamento de microorganismos (LEBER, 2016). O swab é colocado em contato com a conjuntiva ocular, sem tocar nas pálpebras, e inserido no meio de transporte para cultivo até que seja realizado o cultivo mircrobiológico (LEBER, 2016). As PPEP são recomendadas como método de diagnóstico microbiológico de amostras subgengivais, por não ser um método invasivo e serem transportadas de maneira fácil (HARTROTH, 1999). Sessa (2020) descreveu o uso de PPEP para coleta de material microbiológico conjuntival em sagui de tufo preto e concluiu que o método foi eficiente e de fácil uso, tornando-a alternativa na avaliação microbiana conjuntival de animais com aberturas palpebrais pequenas. 17 Ressalta-se, também, que se encontra de forma industrial o material esterilizado, possibilitando amplo acesso. A infecção da conjuntiva ocorre quando há aderência, penetração, invasão, persistência e replicação de microorganismos potencialmente patogênicos (UESUGUI et al., 2002). A conjuntivite é a doença ocular mais comum em aves de cativeiro (HOLMBERG, 2008). Os sinais clínicos geralmente envolvem secreção serosa ou seropurulenta, blefaroespasmos e hiperemia conjuntival (HOLMBERG, 2008). Patógenos oculares induzem conjuntivites, ceratites, endoftalmites e uveítes e quando não tratadas corretamente e precocemente podem ameaçar a visão (BANKS et al., 2019). Zenoble et al. (1983) realizaram estudo da microbiota bacteriana da conjuntiva e córnea em psitacídeos sadios, sendo eles: Papagaio amazona (Amazona spp.), papagaio-cinzento (Psittacus erithacus), papagaio do senegal (Poicephalus senegalus) e cacatua (Cacatua spp.). Em de 151 olhos foram isoladas bactérias em 63% das amostras. A microbiota mais comum presente no saco conjuntival em psitacídeos é constituída por bactérias gram positivas, incluindo Staphylococcus epidermidis (25%), Streptococcus alfa-hemolitico (25%), Corynebacterium sp. (7%.) e Staphylococcus aureus (5%). As bactérias Gram negativas são raras e relatadas em cerca de 1% das amostras. Em levantamento da microbiota bacteriana conjuntival, coletadas com swabs tradicionais, em 65 aves de rapina, Dupont et al. (1994) estabeleceram que as bacterias gram-positivas predominaram sobre as gram-negativas, sendo que 97 (89,0%) de todos os 109 isolados bacterianos foram gram-positivos e Staphylococcus foi o gênero mais frequente (49,5%), seguido de Corynebacterium spp (27,5%). Miller et al. (1995) isolaram 112 bactérias do saco conjuntival de 48 diferentes espécies de grous usando método de coleta swab com mini-ponta de alginato de cálcio umedecida. Relataram que 58% das bactérias isoladas foram gram-positivas, das quais Corynebacterium spp. Staphylococcus spp., Streptococcus spp. e Bacillus spp. foram as mais prevalentes. 18 Monção et al. (2016) realizaram estudo com parâmetros oftalmológicos com araras, e realizaram cultura do fornix conjuntival em 12 aves, utilizando swabs estéreis tradicionais. Dos isolados, 74,28% foram gram-positivos, incluindo: Staphylococcus sp. (37,14%) Micrococcus sp. (11,43%) Staphylococcus epidermidis (11,43%) Staphylococcus aureus (14,28%). Na última década, a utilização da análise proteômica por espectrometria de massas (MALDI-TOF) difundiu-se para a identificação de bactérias, proporcionando diagnóstico molecular de alta precisão, em curto espaço de tempo (MAKITA, 2019). A técnica se fundamenta na ionização de proteínas, cuja proporção de massa por carga e espectro de massa podem ser estimados sob a forma de espectros, únicos para cada agente (SINGHAL et al., 2015). O MALDI-TOF MS é uma tecnologia automatizada, de alto rendimento, aplicável a grande variedade de micro- organismos e indiscutivelmente benéfica para diagnóstico de microbiota clínica (CROXATTO, 2012; PATEL, 2014). 19 OBJETIVOS 20 3. OBJETIVOS Descrever valores de referência de normalidade de produção lacrimal, análise da microbiota conjuntival e pressão intraocular de calopsitas (Nymphicus hollandicus) com o tonômetro de rebote Tono Vet® plus. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1) Avaliar a produção lacrimal com teste de Schirmer (TSL-I), utilizando ponta de papel endodôntica padronizada (PPEP); 2) Analisar a microbiota conjuntival em olhos normais empregando o método de coleta com ponta de papel endodôntica padronizada (PPEP); 3) Avaliar a pressão intraocular das calopsitas com os tonômetros de rebote Tono Vet® plus e definir valores médios para cada modo (cão, gato, cavalo e coelho). 21 REFERÊNCIAS 22 REFERÊNCIAS ANDRADE, A. L. et al. Microbiota conjuntival de cães da cidade de Araçatuba – SP. 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Fifteen 31 cockatiels from domestic breeders, adults, and healthy, were subjected to a 32 complete ophthalmic examination. The birds were physically restrained for the 33 tests. The tear production and conjunctival microbiota were performed by a 34 standardized endodontic absorbent paper point tear test (PPTT), and intraocular 35 pressure with a rebound tonometer (icare® tonovet plus). Species of 36 microorganisms isolated were identified by mass spectrometry. The results 37 obtained were: PPTT 10.73 ± 2.59 mm/min; intraocular pressure Tonovet plus 38 dog mode (11.87 ± 1.43 mmhg), cat mode (6.73 ± 1.36 mmhg), rabbit mode 39 (13.13 ± 1.85 mmhg) and horse mode (9.50 ± 1.36 mmhg). In the conjunctival 40 microbiota, gram-positive bacteria were predominant. Rebound tonometry, tear 41 production assessment, and conjunctival microbiota collection with PPTT are 42 easy and accurate methods for use in cockatiels; they are indicated due to the 43 size of the eyes. The results will help veterinary ophthalmologists diagnose and 44 treat eye diseases in cockatiels, in addition to contributing to research in the area 45 of vision. 46 47 Key words: bird; lacrimal; microbiome; rebound; tonometer 48 49 50 51 52 53 54 55 32 56 57 58 INTRODUÇÃO 59 A calopsita (Nymphicus hollandicus) pertence à ordem Psittaciformes e 60 família Cacatuidae (calopsitas, cacatuas), originária na Australia e amplamente 61 difundida como pet em diversos países, inclusive no Brasil [5, 18, 20]. As 62 caracteristicas de natureza sociável, inteligência, coloração exuberante e 63 capacidade de imitar sons tornam os psittaciformes extremamente populares [20]. 64 O aparelho da visão é especialmente importante em aves devido à 65 influência direta no vôo, alimentação e reprodução [3]. Métodos e equipamentos 66 desenvolvidos para o exame ocular em mamíferos são frequentemente utilizados 67 em aves, embora com as limitações do pequeno tamanho de alguns pássaros [3]. 68 A aferição da produção lacrimal em animais de pequeno porte, com abertura de 69 fenda palpebral diminuta apresenta-se ainda como um desafio no exame 70 oftalmológico [21, 23]. As pontas de papel endodônticas padronizadas (PPEP) 71 podem ser utilizadas como método alternativo, e caracterizam-se por serem 72 estéreis e manter padrão regular [21, 23]. 73 A tonometria é fundamental na avaliação de pressão intraocular (PIO), no 74 diagnóstico oftalmológico e evolução do tratamento de afecções como a uveíte e 75 o glaucoma [12]. Uma nova geração de tonômetro de rebote, o Icare® TONOVET 76 Plus, foi introduzido na prática veterinária. Comparado com o modelo anterior de 77 tonômetro de rebote da mesma empresa, essa tecnologia tem a vantagem de 78 indicar o correto posicionamento do equipamento com uma luz colorida próxima à 79 sonda, presumivelmente aumentando a precisão da medição e sua repetebilidade 80 [6,16]. 81 Para coleta de material de cultura conjuntival, o uso de swabs tradicionais 82 é impraticável em calopsitas, devido a seu fornix conjuntival diminuto. Dessa 83 forma, o uso de ponta de papel endodôntica tamanho 45 se mostra simples e 84 eficaz para essa finalidade [32]. 85 33 Adicionalmente, a disbiose conjuntival predispõem o tecido a patógenos; 86 portanto, a identificação dos microorganismos é importante para determinar o 87 padrão normal e as decisões terapêuticas em infecções [12, 34] 88 A espectrometria de massas (MALDI-TOF MS) representa um dos 89 métodos mais precisos, confiáveis e rápidos para a identificação de espécies 90 bacterianas. Essa tecnologia é automatizada, de alto rendimento, aplicável a 91 ampla gama de bactérias e indiscutivelmente benéfica para diagnóstico de 92 microbiologia clínica [7,28]. 93 A escassez de valores descritos em aves, especialmente nas calopasitas, 94 associado aos fatores acima citados, estimularam o desenvolvimento do estudo 95 da avaliação da produção lacrimal com PEPP em 1min, da tonometria com 96 aparelho de rebote Icare® TONOVET Plus nos modos cão, gato, equino e coelho, 97 bem como da microbiota conjuntival normal, utilizando a análise de proteômica 98 por espectrometria de massa. Pelo conhecimento dos autores, estes metodos 99 ainda não foram descritos em calopsitas. 100 101 MATERIAIS E MÉTODOS 102 A metodologia foi aprovada pela Comissão de Ética no Uso de Animais 103 (CEUA) da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade 104 Estadual Paulista (UNESP) – Botucatu SP-Brasil (processo 0188/2020). 105 106 Animais, local e temperatura 107 Foram utilizados 15 calopsitas (Nymphicus hollandicus), adultas, sem 108 diferenciação de sexo, sadias ao exame clínico, provenientes de criadores 109 domésticos. O estudo foi realizado em horas mais frescas do dia, com 110 temperatura variando entre 21 a 26°C. 111 112 Critérios de inclusão 113 As calopsitas foram avaliadas clinicamente, incluindo o histórico a fim de 114 detectar possíveis comorbidades que pudessem interferir no estudo, incluindo 115 fezes alteradas, apatia, inapetência, exame observacional, escore de condição 116 corporal classificado de 1 a 5 (Apêndice 1)[35]; e a aparência dos membros, bico, 117 asas e penas. A avaliação oftalmológica, conforme descrita a seguir, também foi 118 34 realizada e as aves com alteração no padrão normal para a espécie foram 119 excluídas da pesquisa. 120 121 Contenção 122 As calopsitas foram contidas manualmente, apenas quando necessário 123 com o auxílio de puçás de pano ou luvas de couro, promovendo o mínimo 124 desconforto para as aves. Foram então mantidas em posição vertical e a cabeça 125 da ave imobilizada com o polegar de um lado da mandíbula e o dedo indicador do 126 outro. As asas foram posicionadas junto ao corpo e pés do animal (Figura 1). A 127 região cervical não foi manipulada, a fim de não promover interferência no valor 128 da PIO por pressão venosa mecânica. O exame oftalmológico foi realizado por um 129 único avaliador. 130 131 Avaliação e testes oftalmológicos 132 As aves foram submetidas ao exame oftalmológico nos dois olhos (n=30), 133 seguindo ordem de realização: inspeção de anexos e superfície ocular, teste de 134 produção lacrimal, coleta de amostras, avaliação do segmento anterior com feixe 135 de luz, tonometria e teste de fluoresceína. 136 Na inspeção foram investigadas alterações na conformação da face, 137 disposição e simetria dos olhos, tumefações, secreções, blefaroespasmos e 138 neoformações. 139 O teste de produção lacrimal (Figura 1) foi realizado com a ponta de papel 140 endodôntica padronizada (PPEP) (Roeko 146 Color size 30; Langenau, 141 Germany), a qual era inserida no saco conjuntival inferior temporalmente e ato 142 contínuo, avaliação numérica (mm/min) da parte umedecida após 60 segundos, 143 utilizando-se régua milimetrada padrão. 144 A seguir, foi coletada amostra conjuntival utilizando-se PPEP estéril 145 (Roeko Color size 45; Langenau, Germany) (Figura 2). Com o auxílio de luvas e 146 pinça estéris, foi inserido com movimento suave da ponta de papel no fórnice 147 conjuntival inferior, sem realizar contato com face externa da pálpebra; As 148 amostras foram armazenadas em meio STUART estéril (FIRSTLAB, modelo FL4-149 0102) e submetidas a exames microbiológicos, para a realização e posterior 150 análise por MALDI-TOF. 151 35 Para avaliação da pressão intraocular (Figura 3), foi utilizado o 152 tonômetros de rebote Icare® TONOVET Plus, nos modos cão, gato, equino e 153 coelho. Todas as aferições foram realizadas no centro da córnea, a uma distância 154 de 4 a 8 mm do olho, com a ave na posição vertical. O aparelho disponibiliza o 155 valor médio de 6 mensurações, sendo essa considerada o valor final. A aferição 156 foi repetida apenas nos casos em que o visor do aparelho indicou coloração 157 amarela ou vermelha (desvio padrão entre 2,5 a 3,5 mmHg). 158 159 Cultivo microbiológico e Análise MALDI-TOF MSTM 160 As amostras em PPEP foram imersas em tubos com caldo BHI e mantidas 161 em estufa a 37º C por 20h. Após turvação foram cultivadas em condições de 162 aerobiose no meio de ágar sangue (Oxoid®, São Paulo, Brasil) acrescido de 163 sangue ovino (5-7%), mantidas por 72 horas, a 37oC, e no meio seletivo de 164 MacConkey (Oxoid®, São Paulo, Brasil), nas mesmas condições. Os 165 microorganismos isolados foram classificados de acordo com características 166 morfotintoriais e bioquímicas [30]. 167 Todas as colônias foram submetidas à espectrometria de massas no 168 laboratório de Pesquisa de Qualidade do Leite (QUALILEITE) da FMVZ–USP de 169 Pirassununga- SP, pelo aparelho MALDI-TOF (Matrix-assisted laser desorption 170 ionization time-of-flight mass spectrometry). 171 As culturas bacterianas foram centrifugadas, nas diferentes etapas, 172 inativadas em 75% etanol, e submetidas à extração bacteriana. O sobrenadante 173 foi novamente centrifugado, o líquido remanescente foi removido com auxílio de 174 pipeta e secado à temperatura ambiente durante 5 a 10 min. A seguir, foi 175 adicionada à amostra solução de ácido fórmico a 70% para lisar células 176 bacterianas e liberar as proteínas da célula interna, predominantemente proteínas 177 ribossomais que produzem íons necessários para diagnóstico dos espectros 178 bacterianos pelo aparelho [11,31]. Em seguida foi adicionada solução de ácido 179 fórmico a 70% e acetonitrila a 100% a cada amostra em volumes iguais, 180 produzindo assim um extrato bacteriano na proporção de 1:1. Uma etapa final de 181 centrifugação foi realizada para separar os restos de células bacterianas do 182 sobrenadante contendo as proteínas usadas para a identificação de MALDI-TOF 183 MS. Em sequência, 1µL da solução de cada amostra foi adicionada em placas 184 36 específicas contendo 96 poços (Bruker e DaltonicsTM, Bremen, Alemanha) e 185 secas em temperatura ambiente para posterior preenchimento com 1µL de 186 solução matriz (ácido 2-ciano-4-hidroxicinâmico diluído a 50% de acetromil e 2,5% 187 de ácido trifluoracético). As placas foram dispostas no receptáculo do 188 equipamento MALDI-TOF MSTM (Bruker e DaltonicsTM, Bremen, Alemanha), 189 operado com 337-nm de lazer [2]. 190 O MALDI-TOF MS foi realizado usando Software FlexControl 3.3. Os dados 191 dos espectros foram analisados dentro da faixa de massa de 2.000 a 20.000 m/z. 192 O resultado foi fornecido por meio de pontuação de log com um valor máximo de 193 3,0. Valores de pontuação superiores a 1,7 foram considerados confiáveis para 194 identificação do gênero, e pontuações superiores a 2,0 foram consideradas 195 prováveis para identificação de espécies [2]. 196 197 Análise estatística 198 Foi realizada a análise estatística descritiva; e os dados foram expressos 199 em média, desvio padrão e mediana. O Teste-t de Student foi utilizado para 200 amostras pareadas na comparação entre olhos direito e esquerdo, adotando o 201 nível de 5% de significância (p<0,05) [37]. Para a comparação da PIO nos 202 diferentes modos do tonometro foi utilizada a técnica de análise de variância para 203 modelo de medidas repetidas, completando com o teste de comparações 204 múltiplas de Bonferoni [14]. A correlação linear de Pearlson foi avaliada entre os 205 diferentes modos do tonometro de rebote (cão, gato, cavalo, coelho) [37]. 206 207 208 RESULTADOS 209 Na comparação dos testes oftalmológicos não houve diferença significativa 210 entre olhos direito e esquerdo (Tabela 1) nas variáveis (P>0,05), exceto na PIO 211 com Tonovet Plus modo gato (direito>esquerdo). 212 213 TABELA 1. Valores dos testes oftalmológicos de produção lacrimal e 214 pressão intraocular (mmHg) em calopsitas(n=15), segundo o olho. 215 37 216 Na mensuração quantitativa da lágrima com PPEP, em 30 olhos, obteve-se 217 valores médios de 10,73 ± 2,59 mm/min e mediana de 10,5 (6,00-15) mm/min. 218 As médias gerais da PIO, nos diferentes modos disponíveis no Tonovet 219 plus e a associação linear de Pearson foram apresentadas nas Tabelas 2 e 3 220 respectivamente; verificou-se diferença entre os modos, sendo que o modo 221 coelho> cão> cavalo> gato (P<0,05). Tonovet Plus cavalo x gato foram os modos 222 do Tonovet Plus mais associados (Tabela 3); 223 224 TABELA 2 Valores médios gerais (n=30 olhos), representados em média 225 e desvio padrão, da PIO em calopsitas pelo tonometro de Rebote tonovet plus, 226 segundo o modo. 227 Modo Valor p Cão Gato Coelho Cavalo 11,87 ± 1,43 c 6,73 ± 1,36 a 13,13 ± 1,85 d 9,50 ± 1,28 b P<0,01 Duas médias seguidas de letras diferentes (P<0,05). 228 229 230 231 232 233 234 Variável olho Valor mínimo Mediana Valor máximo Média Desvio padrão Teste lacrimal PPEP (mm/min) Direito 7,00 10,00 15,00 11,13 2,58 Esquerdo 6,00 11,00 14,00 10,33 2,72 Tonovet Plus cão Direito 9,00 12,00 14,00 11,53 1,42 Esquerdo 6,00 11,00 14,00 11,53 1,41 Tonovet Plus gato Direito 6,00 7,00 10,00 7,13 0,99 Esquerdo 4,00 6,00 9,00 6,33 1,59 Tonovet Plus coelho Direito 11,00 13,00 17,00 13,33 1,45 Esquerdo 9,00 13,00 16,00 12,93 2,22 Tonovet Plus cavalo Direito 8,00 10,00 11,00 9,73 1,03 Esquerdo 6,00 9,00 11,00 9,27 1,49 38 TABELA 3. Medida de associação linear de Pearson da PIO entre os 235 diferentes modos do tonômetro Tonovet Plus utilizados na mensuração em 236 calopsitas. 237 * Correlação significativa entre os métodos de avaliação (P<0,05) 238 239 Bactérias foram isoladas em 93,33% dos olhos, enquanto dois olhos da 240 mesma calopsita foram negativos. Em 92,85% dos olhos foram identificadas 241 bactérias gram-positivas. Do total de isolados, 75% foram gram-positivas, com 242 predomínio de: Rothia nasimurium (22,85%), Staphylococcus sciuri (14,28%), 243 Staphylococcus saprophyticus (8,57%), Staphylococcus xylosus (5,71%), 244 Staphylococcus piscifermentans (2,85%), Weissella confusa (2,85%), 245 Staphylococcus kloosii (2,85%), Bacillus subtilis (2,85%), Staphylococcus 246 haemolyticus (2,85%), Lactococcus lactis (2,85%), Staphylococcus schleiferim 247 (2,85%), Kocuria kristinae (2,85%), Staphylococcus pseudintermedius (2,85%) e 248 Staphylococcus hominis (2,85%). Em 25% dos isolados foram identificadas 249 bactérias gram-negativas, incluindo: Acinetobacter sp. (5,71%), Pseudomonas 250 sp. (2,85%), Pseudomonas oryzihabitans (2,85%), Acinetobacter radioresistens 251 (2,85%), Pseudomonas fulva (2,85%). 252 Em 70% dos olhos foi isolada somente uma bactéria, e em 7,2% dos olhos 253 apresentaram unicamente bactérias gram negativas; mais de uma bactéria foram 254 observadas em 23,33% dos olhos. A totalidade dos microorganismos isolados 255 pela espectrometria de massa estão apresentadas no Apendice 2 256 257 DISCUSSÃO 258 Este estudo descreveu valores de normalidade com base em testes 259 oftalmológicos, ferramentas importantes no diagnóstico e tratamento de 260 enfermidades oftalmológicas em calopsitas, ampliando os conhecimentos da área 261 e especificidades das espécies. 262 Associação Coeficiente de correlação Valor p Tonovet Plus cão x gato -0,072 P>0,05 Tonovet Plus cão x coelho 0,072 P>0,05 Tonovet Plus cão x cavalo 0,038 P>0,05 Tonovet Plus gato x coelho 0,438 P<0,05* Tonovet Plus gato x cavalo 0,474 P<0,01* Tonovet Plus coelho x cavalo 0,451 P<0,05* 39 O valor médio descrito para fissura palpebral em calopsitas foi de 5,45 263 mm, portanto o teste de Schirmer com fita padrão milimetrada de 0,5 cm, pela 264 diminuta fissura palpebral, torna sua utilização prática inexequível [15]. 265 Os valores de produção lacrimal encontrados nesta pesquisa foram 266 superiores aos de Kane et al (2021) empregando 25 calopsitas, que obtiveram 267 valor médio de 9.39 (6-14) mm/15s, usando PPEP (iM3 Inc., Vancouver, WA size 268 30). No entanto, os autores utilizaram o tempo de 15 segundos para o teste. O 269 menor tempo utilizado foi com o intuito de minimizar o estresse associado a uma 270 contenção mais prolongada [15]. Diferentemente, deste estudo, que foi 271 padronizado um minuto, durante sua realização foi possível aplicar a PPEP 272 simultaneamente nos dois olhos da ave, reduzindo o tempo total de contenção e 273 de estresse, similar o relato de Lange et al., (2014) [23]. 274 Similar ao presente estudo, a metodologia utilizando a PPEP da marca 275 Roeko no tempo de um minuto, foi descrito em algumas outras aves da ordem 276 Psittaciformes: em araras da espécie azul-de-lear (15,37 ± 1,22mm/min) e 277 canindé (16,74 ± 1,38 mm/min) [26]. 278 Pumarola-suñé (1998) descreveu as propriedades de absorção de pontas 279 de papel endodôntico padronizadas (PPEP) e relatou que as marcas Zipperer, 280 Maillefer e Roeko, no diâmetro de 0,3 mm, apresentaram melhor padronização 281 [29]. 282 Na tonometria ocular, limita-se a reprodutibilidade do uso do Tonopen, por 283 apresentar plataforma muito grande em sua ponta para olhos com diâmetro da 284 córnea entre que 5mm a 9 mm e inviabiliza o uso em córneas com diâmetro 285 menor que 5mm [37]; dessa forma o tonômetro de rebote Tonovet, é inestimável 286 em muitas espécies pequenas como as calopsitas [36]. 287 O tonômetro de rebote tem uma ponta muito pequena (1.3- 1,8 mm), que 288 torna o aparelho adequado a ser utilizado em olhos diminutos, além de a ponta 289 ser descartável, podendo ser trocada na presença de doenças significativas [19]. 290 Este método minimiza erros de aferição, pois se apresenta como 291 examinador não dependente, portabilidade entre diferentes laboratórios, 292 capacidade de obter medições in vivo sem uso de anestésicos tópicos e o contato 293 com a córnea, promovendo apenas impacto sutil e rápido no olho [8, 24]. 294 40 KANE et al (2021), descreveram valores de PIO em calopsitas usando 295 tonômetro de rebote TonoVet ® no modo “p” de 13mmHg ± 3,3 mmHg. Neste 296 estudo, o modo coelho do Tonovet plus foi similar ao descrito, sugerindo que esse 297 pode ser um modo interessante de mensuração em calopsitas. Entretanto, mais 298 estudos nesse campo devem ser estimulados pela importância desse valor 299 durante o exame oftalmológico, considerando a limitação do uso do Tonopen em 300 espécies pequenas e das grandes vantagens que o Tonovet traz pela facilidade e 301 acurácia na avalição da PIO. Uma limitação no presente estudo, impossibilitada 302 por aspectos éticos, seria a mensuração invasiva da PIO e sua comparação entre 303 os modos [15]. 304 MOORE (2019) em beija-flores, apresentando fissura palpebral de 2.59 ± 305 0.19mm; utilizando o tonometro de rebote Tonolab, obtiveram valores de 11,12 ± 306 2,20 mmHg, similarares a PIO com TonoVet plus modo cão encontrado no 307 presente trabalho [27]. 308 Em tucanos-toco [12] com tonômetros de rebote (Icare® Tonovet e 309 Tonovet plus), foram verificados valores maiores da PIO, em todos os modos 310 utilizados, indicando a necessidade de estudos direcionados para a espécie. Os 311 modos mais concordantes em seu estudo [12] com TonoVet plus foram: cão x 312 coelho e gato x cavalo, este último também verificado em neste estudo, acrescido 313 do Tonovet Plus gato x coelho e Tonovet Plus coelho x cavalo. 314 A correlação positiva da associação linear de Pearson entre as PIOs nos 315 diferentes modos do TonoVet Plus, no presente estudo e corroborando a 316 FERREIRA (2021) [12], sugere-se que o TonoVet Plus gato x cavalo tem 317 interessante associação durante a mensuração, podendo eventualmente ser 318 intercambiável. 319 Considerando a dificuldade de inserção de swabs tradicionais no fornix 320 conjunctival para coleta de material, institui-se a metodologia previamente descrita 321 [12,32], utilizando pontas de papel endodônticas tamanho 45 para a avaliação da 322 microbiota normal. A técnica promoveu pouco desconforto ocular as aves, e 323 apresentou-se eficiente, simples, prática e rápida nas calopsitas, podendo ser 324 indicada para outras espécies com abertura de fissuras palpebrais pequenas, de 325 modo similar aos achados de SESSA (2020) e FERREIRA (2021) [12, 32]. 326 41 Na microbiota conjuntival neste estudo houve predominância de bactérias 327 gram-positivas (75%), em 92,85% dos olhos, concordando com os achados de 328 ZENOBLE et al. (1967), após análise de microbiota bacteriana da conjuntiva e 329 córnea em 151 olhos de psitacídeos sadios (Papagaio amazona, papagaio-330 cinzento, papagaio do senegal e cacatua). No presente estudo, foi observado que 331 a microbiota mais frequente presente no saco conjuntival em psitacídeos inclui 332 bactérias gram-positivas: Staphylococcus epidermidis (25%), streptococcus alfa-333 hemolitico (25%), Corynebacterium sp (7%.) e Staphylococcus aureus (5%); 334 enquanto as bactérias gram-negativas foram raras e mais de uma espécie 335 bacteriana foi encontrada em vários olhos [38]. As bactérias mais frequentes 336 neste estudo foram Rothia nasimurium, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus 337 saprophyticus e Staphylococcus xylosus, identificadas por espectrometria de 338 massas. 339 Em estudos similiares com aves de rapina [9], e araras [26], com método 340 de coleta com swab estéril tradicional e em grous [25] com swab de mini-ponta de 341 alginato de cálcio umedecida, realizando a análise das amostras com 342 identificação de acordo com sua morfologia, também foi encontrado 343 predominância no isolamento de bactérias gram-positivas, com diferencial que no 344 presente estudo foi utilizado a espectrometria de massa. 345 A espectrometria de massa (MALDI-TOF) é uma tecnologia inovadora, 346 automatizada e de alta precisão para identifição de bactérias, além de 347 proporcionar diagnóstico molecular em curto espaço de tempo [28]. Não há 348 estudos utilizado o MALDI-TOF na identificação de microbiota conjuntival em aves 349 no conhecimento dos autores. 350 Os resultados obtidos para os importantes testes oftalmológicos auxiliarão 351 médicos veterinários oftalmologistas a diagnosticar enfermidades oculares de 352 maneira mais eficaz e precoce, para manutenção do sentido mais importante para 353 a espécie. Mais estudos devem ser estimulados, objetivando-se obter cada vez 354 mais dados específicos de aves que são mantidas como “pets”, considerando o 355 aumento dessa prática nos últimos tempos que culmina no aumento do 356 atendimento veterinário oftalmológico para tais espécies, além da importância da 357 conservação da fauna. 358 359 42 CONCLUSÃO 360 A utilização da ponta de papel endodôntica foi efetiva na mensuração da 361 produção lacrimal em calopsitas, bem como para a coleta de amostras para a 362 determinação da microbiota conjuntival, apresentando baixo desconforto para as 363 aves e simples execução. 364 A metodologia estabelecida no estudo da microbiota conjuntival de 365 calopsitas possibilitou o isolamento bacteriano na grande maioria das amostras e 366 a cultura bacteriana associada à análise por espectrometria de massas resultou 367 em maior frequência de bactérias gram-positivas na microbiota conjuntival de 368 calopsitas. 369 Uso tonômetro de rebote Tonovet plus, nos diferentes modos, foi factível em 370 calopsitas e os maiores valores disponibilizados no modo coelho. 371 372 REFERÊNCIAS 373 1. Andrade, A. L. D., Stringhini, G., Bonello, F. L., Marinho, M., and Perri, S. 374 H. V. 2002. Microbiota conjuntival de cães sadios da cidade de Araçatuba 375 (SP). Arq. Bras. Oftalmol. 65: 323-336. 376 2. Barreiro, J. R., Ferreira, C. R., Sanvido, G. B., Kostrzewa, M., Maier, T., 377 Wegemann, B., Böttcher, V., Eberlin, M. N., and Dos Santos, M. V. 2010. 378 Identification of subclinical cow mastitis pathogens in milk by matrix-379 assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. J. 380 Dairy Sci. 93: 5661-5667. 381 3. Bayón, A., Almela, R. M., and Talavera, J. 2008. Avian 382 ophthalmology. Eur. J. Companion Anim. Pract. 17: 253-266. 383 4. Bedford, P. G. 1980. The aetiology of canine glaucoma. Vet. Rec. 107: 384 76-82. 385 5. Benez, S. M. 2004. Aves: criaçao-clínica-teoria-prática; silvestres-386 ornamentais-avinhados. Tecmedd, Ribeirão Preto. 387 6. Carvalho, C. M., Rodarte‐Almeida, A. C., Beanes, A. S., Machado, M. T., 388 and Galera, P. D. 2020. 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Reference values for the production of the aqueous fraction of the 447 tear film measured by the standardized endodontic absorbent paper point 448 test in different exotic and laboratory animal species. Vet. Ophthalmol. 17: 449 41-45. 450 24. Leiva, M., Naranjo, C., and Pena, M. T. 2006. Comparison of the rebound 451 tonometer (ICare®) to the applanation tonometer (Tonopen XL®) in 452 normotensive dogs. Vet. Ophthalmol. 9: 17-21. 453 25. Miller, P. E., Langenberg, J. A., and Hartmann, F. A. 1995. The normal 454 conjunctival aerobic bacterial flora of three species of captive cranes. J. 455 Zoo Wildl Med. 26: 545-549. 456 45 26. Monção-Silva, R. M., Ofri, R., Raposo, A. C. S., Libório, F. A., Estrela-457 Lima, A., and Oriá, A. P. 2016. Ophthalmic parameters of Blue-and-yellow 458 Macaws (Ara ararauna) and Lear's Macaws (Anodorhynchus leari). Avian 459 Biol. Res. 9: 240-249. 460 27. Moore, B. A., Maggs, D. J., Kim, S., Motta, M. J., Bandivadekar, R., Tell, L. 461 A., and Murphy, C. 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Descrição dos micro-organismos isolados em conjuntiva de 501 calopsitas pela espectrometria de massas (MALDI-TOF MS). 502 Animal 01: OD: Isolamento de Staphylococcus piscifermentans e Weissella confusa OE: Isolamento de Rothia nasimurium e Enterococcus hermanniensis Animal 02: OD: Isolamento de Staphylococcus saprophyticus OE: Isolamento de Staphylococcus saprophyticus Animal 03: OD: Isolamento de Rothia nasimurium OE: Isolamento de Rothia nasimurium e Staphylococcus sciuri Animal 04: OD: Isolamento de Rothia nasimurium OE: Isolamento de Rothia nasimurium Animal 05: OD: Isolamento de Rothia nasimurium OE: Isolamento de Staphylococcus xylosus Animal 06: OD: Isolamento de Staphylococcus sciuri OE: Isolamento de Acinetobacter sp. Animal 07: OD: Isolamento de Staphylococcus kloosii OE: Isolamento de Staphylococcus sciuri Animal 08: OD: Isolamento de Staphylococcus xylosus e Pseudomonas sp. OE: Isolamento de Staphylococcus sciuri e Pseudomonas oryzihabitans Animal 09: OD: Isolamento de Bacillus subtilis OE: Isolamento de Acinetobacter radioresistens Animal 10: OD: Isolamento de Pseudomonas fulva OE: Isolamento de Rothia nasimurium Animal 11: OD: Isolamento de Staphylococcus saprophyticus OE: Isolamento de Rothia nasimurium Animal 12: OD: Isolamento de Staphylococcus sciuri e Acinetobacter sp. OE: Isolamento de Staphylococcus haemolyticus e Lactococcus lactis Animal 13: OD: Isolamento de Staphylococcus schleiferi 47 OE: Isolamento de Kocuria kristinae Animal 14: OD: Isolamento de Staphylococcus pseudintermedius OE: Isolamento de Staphylococcus hominis Animal 15: OD: Negativo OE: Negativo 503 504 Universidade EStadual Paulista Faculdade de Medicina Veterinária e ZootECNIA Botucatu – SP Agradecimentos Também devo meu agradecimento a todos as pessoas a qual fiz amizade em Botucatu, que estiveram do meu lado nos momentos mais felizes assim como nos mais difíceis, principalmente minhas amigas e amigo da República Topa Tudo agradeço por toda a parceria... Ao professor Márcio Garcia Ribeiro e ao técnico de laboratório Fernando Jose Paganini Listoni, pela ajuda com as análises microbiológicas e disponibilidade em me receber nos momentos de dúvida. Ao professor Carlos Roberto Padovani pelos ensinamentos e por ter desenvolvido a análise estatística desse trabalho. Ao veterinário residente de animais selvagens do CEMPAS, Gabriel C. de Camargo que auxiliou e passou seu conhecimento sobre calopsitas para realização desse trabalho. Minha gratidão aos meus cães, Dora, Nina e especialmente o Theo, que é meu maior companheiro desde que me mudei para Botucatu. Agradeço aos meus pacientes e a seus tutores, que atendi no Ambulatório de Oftalmologia Veterinária, por me ensinarem e serem fundamentais a minha formação profissional. O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) - Código de Financiamento 001. Finalmente agradeço e dedico esse trabalho a minha calopsita Titi, que entrou na minha vida quando esse trabalho já estava em andamento. Ela me ensinou da maneira mais inocente e simples o quão amável é essa espécie, tornando esse trabalho ainda mais ... Sumário This study aimed to describe normal values ​​in ophthalmological diagnostic tests for cockatiels (Nymphicus hollandicus), an exotic bird increasingly inserted in the urban environment and acquired as a "pet" in the domestic environment, thus increasin... CAPÍTULO 1 INTRODUÇÃO 1 Introdução REVISÃO DA LITERATURA 2 REVISÃO DA LITERATURA OBJETIVOS 3. OBJETIVOS Descrever valores de referência de normalidade de produção lacrimal, análise da microbiota conjuntival e pressão intraocular de calopsitas (Nymphicus hollandicus) com o tonômetro de rebote Tono Vet® plus. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1) Avaliar a produção lacrimal com teste de Schirmer (TSL-I), utilizando ponta de papel endodôntica padronizada (PPEP); 2) Analisar a microbiota conjuntival em olhos normais empregando o método de coleta com ponta de papel endodôntica padronizada (PPEP); 3) Avaliar a pressão intraocular das calopsitas com os tonômetros de rebote Tono Vet® plus e definir valores médios para cada modo (cão, gato, cavalo e coelho). REFERÊNCIAS REFERÊNCIAS CAPÍTULO 2 This study aimed to describe normal values ​​in ophthalmological diagnostic tests for cockatiels (Nymphicus hollandicus), an exotic bird increasingly inserted in the urban environment and acquired as a "pet" in the domestic environment, thus increasin...