JAFF RIBEIRO DA SILVA Avaliação da ação de peptídeos oriundos da hidrólise da proteína do feijão-caupí sobre a atividade da enzima HMG-CoA redutase Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia. Orientador: Prof. Dr. Eduardo Maffud Cilli Co-orientador: Prof. Dr. Ederlan de Souza Ferreira Araraquara 2020 Bibliotecária Responsável: Ana Carolina Gonçalves Bet - CRB8/8315 FICHA CATALOGRÁFICA S586a Silva, Jaff Ribeiro da Avaliação da ação de peptídeos oriundos da hidrólise da proteína do feijão-caupí sobre a atividade da enzima HMG- CoA redutase / Jaff Ribeiro da Silva. – Araraquara : [s.n.], 2020 115 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Eduardo Maffud Cilli Coorientador: Ederlan de Souza Ferreira 1. Feijão-de-corda. 2. Dislipidemias. 3. Aterosclerose. 4. Hipercolesterolemia. 5. Peptídeos. I. Título. DADOS CURRICULARES Nome Jaff Ribeiro da Silva Nome em citações bibliográficas SILVA, J. R.; Silva, Jaff R. da; Silva, Jaff R.; Silva, Jaff Ribeiro da; DA SILVA, JAFF RIBEIRO; DA SILVA, JAFF R. Endereço profissional Universidade Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia, Departamento de Análises Bromatológicas Avenida Barão de Geremoabo s/n Ondina - Salvador 40170290, BA - Brasil Endereço eletrônico jaff_ribeiro@yahoo.com.br jrdsilva@ufba.br Formação acadêmica/titulação 2016 Doutorado em Biotecnologia Instituto de Química/UNESP - Araraquara, São Paulo, Brasil Título: Avaliação da ação de hidrolisados proteicos e peptídeos obtidos do feijão-caupí sobre a atividade da HMG-CoA redutase Orientador: Eduardo Maffud Cilli Co-orientador: Ederlan de Sousa Ferreira 2006 - 2008 Mestrado em Ciência de Alimentos Faculdade de Farmácia/UFBA - Salvador, Bahia, Brasil Título: Desenvolvimento e validação de metodologia para a determinação de resíduos do antibiótico cloranfenicol em diferentes matrizes alimentícias, Ano de obtenção: 2009 Orientador: Janice Izabel Druzian Bolsista do(a): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia 2001 - 2005 Graduação em Farmácia. Universidade Federal da Bahia/UFBA, Salvador, Bahia, Brasil Formação complementar 2017 - 2017 Curso de curta duração em Como estruturar, submeter e revisar o seu artigo original de pesquisa. (Carga horária: 4h). Editage, Brasil 2013 - 2014 Espanhol. (Carga horária: 680h). Universidade Federal da Bahia, UFBA, Salvador, Brasil 2014 - 2014 Curso de curta duração em Moodle para professores: a educação online na UFBA. (Carga horária: 60h). Universidade Federal da Bahia, UFBA, Salvador, Brasil 2013 - 2013 Espanhol. (Carga horária: 90h). Universidade Federal da Bahia, UFBA, Salvador, Brasil 2012 - 2012 Curso de curta duração em Treinamento Técnico Perkin Elmer. (Carga horária: 3h). Perkin Elmer, Brasil 2011 - 2011 Inglês Instrumental. (Carga horária: 150h). Universidade Federal da Bahia, UFBA, Salvador, Brasil 2010 - 2010 Curso de curta duração em Planejamento de Experimentos e Otimização de Processos. (Carga horária: 32h). PROTIMIZA, Brasil 2007 - 2009 Inglês. (Carga horária: 408h). Universidade Federal da Bahia, UFBA, Salvador, Brasil 2008 - 2008 Curso de curta duração em Cromatografia Gasosa. (Carga horária: 16h). Perkin Elmer, Brasil 2008 - 2008 Curso de curta duração em TotalChrom de Cromatografia Gasosa. (Carga horária: 8h). Perkin Elmer, Brasil 2008 - 2008 Curso de curta duração em CLAE e Cromatografia Iônica. (Carga horária: 16h). Dionex, Brasil 2007 - 2007 Curso de curta duração em Eletrônica Básica. (Carga horária: 60h). SENAI, Salvador, Brasil 2007 - 2007 Curso de curta duração em Treinamento Operacional no Software Turbomass CGMS. (Carga horária: 24h). Perkin Elmer, Brasil 2006 - 2006 Curso de curta duração em Espectrometria de Massa Acoplada a LC e GC. (Carga horária: 24h). SENAI, Salvador, Brasil 2006 - 2006 Curso de curta duração em Traing Course in Clarus 600 and Clarus 600MS. (Carga horária: 32h). Perkin Elmer, Brasil 2006 - 2006 Curso de curta duração em Programa de treinamento do portal de periódicos. (Carga horária: 12h). CAPES, Brasília, Brasil 2004 - 2004 Curso de curta duração em Treinamento Operacional em HPLC. (Carga horária: 16h). Perkin Elmer, Brasil 2004 - 2004 Curso de curta duração em Treinamento Operacional CP3800 e Workstation 6.2. (Carga horária: 8h). Varian, Brasil 2004 - 2004 Curso de curta duração em Treinamento Operacional em GC - MS. (Carga horária: 24h). Perkin Elmer, Brasil 2004 - 2004 Curso de curta duração em Curso Empreendedor Nota 10. (Carga horária: 60h). FAPESB, Salvador, Brasil 2003 - 2003 Curso de curta duração em Os Mais Recentes Avanços na Cromatografia Líquida. (Carga horária: 4h). Faculdade de Farmácia/UFBA, Brasil Atuação profissional 1. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho - UNESP 2016 - Atual Vínculo: Aluno, Enquadramento funcional: Doutorando, Regime: Dedicação exclusiva Atividades 02/2016 - Atual Pesquisa e Desenvolvimento, Instituto de Química de Araraquara Linhas de pesquisa: Biotecnologia 2. Universidade Federal da Bahia - UFBA 2011 - Atual Vínculo: Servidor público, Enquadramento funcional: Farmacêutico 2010 - 2010 Vínculo: Bolsista DTI 2 CNPq, Enquadramento funcional: Bolsista Pesquisador 2008 - 2009 Vínculo: Trabalho Temporário, Enquadramento funcional: Professor Substituto. Outras informações: Professor substituto com foco nas áreas de Cromatografia Instrumental e Ciência de Alimentos. Com carga de 8 horas/aula semanais. 2006 - 2008 Vínculo: Estudante, Enquadramento funcional: Mestrando 2002 - 2006 Vínculo: Estudante, Enquadramento funcional: Iniciação Científica Atividades 10/2016 - Atual Pesquisa e Desenvolvimento, Faculdade de Farmácia Linhas de pesquisa: Bioquímica dos Alimentos 01/2010 - Atual Pesquisa e Desenvolvimento, Faculdade de Farmácia, Laboratório de Pescados e Cromatografia Aplicada/Lapesca Linhas de pesquisa: Análises cromatográficas 03/2008 - 12/2009 Aperfeiçoamento Disciplinas ministradas: Métodos Físicos de Análises Aplicadas 03/2008 - 12/2009 Aperfeiçoamento Disciplinas ministradas: Bioquímica e Análise de Alimentos, Métodos Físicos de Análises Aplicadas 03/2008 - 12/2009 Graduação, Farmácia Disciplinas ministradas: Bromatologia Geral, Métodos Físicos de Análises Aplicadas 08/2007 - 01/2009 Outra atividade técnico-científica, Faculdade de Farmácia, Mestrado em Ciência de Alimentos Especificação: Bolsa FAPESB - Mestrado 09/2006 - 09/2008 Conselhos, Comissões e Consultoria, Faculdade de Farmácia, Colegiado do Programa de Pós-graduação em Ciências de Alimentos Especificação: Representante Estudantil do Mestrado em Ciências de Alimentos - UFBA 09/2006 - 09/2008 Conselhos, Comissões e Consultoria, Faculdade de Farmácia, Colegiado do Programa de Pós-graduação em Ciências de Alimentos Especificação: Membro da Comissão de Bolsas do Colegiado do Programa de Pós-graduação em Ciência de Alimentos - UFBA 08/2006 - 06/2007 Outra atividade técnico-científica, Faculdade de Farmácia, Mestrado em Ciência de Alimentos Especificação: Bolsa CAPES Quota Pró-Reitoria - Mestrado 08/2005 - 07/2006 Outra atividade técnico-científica, Faculdade de Farmácia, Laboratório de Pescados e Cromatografia Aplicada/Lapesca Especificação: Bolsa Iniciação Científica PIBIC/CNPq 08/2004 - 07/2005 Outra atividade técnico-científica, Faculdade de Farmácia, Laboratório de Pescados e Cromatografia Aplicada/Lapesca Especificação: Bolsa Iniciação Científica PIBIC/CNPq 11/2002 - Atual Pesquisa e Desenvolvimento, Faculdade de Farmácia, Laboratório de Pescados e Cromatografia Aplicada/Lapesca Linhas de pesquisa: Ciência de Alimentos Projetos de pesquisa 2016 - Atual Avaliação da ação de hidrolisados proteicos e peptídeos obtidos do feijão-caupí sobre a atividade da HMG-CoA redutase 2013 - 2015 Avaliação de bioativos e contaminantes em cascas de uvas procedentes do Vale são Francisco-Ba 2013 - 2013 Análises de Micotoxinas em Matrizes alimentícias para Humanos e Animais 2004 - 2006 Avaliação de Resíduos do Antibiótico Cloranfenicol em Camarão - Convênio Geden nº 447 Banco do Nordeste do Brasil / UFBA / Empresa Bahia Pesca / FAPEX 2002 - 2006 Implantação de um Laboratório Referência no Estado para Qualificação de Pescados. Convênio FAPESB/UFBA/FAPEX 222/2002. DOU 14 nov. 2002, no 18.125. Projetos de desenvolvimento tecnológico 2013 - Atual Desenvolvimento de filmes flexíveis biodegradáveis para embalagem primária de matrizes zeolíticas contendo rincoroforol 2009 - Atual Desenvolvimento de embalagens antioxidantes e antimicrobianas para aumentar vida de prateleira de produtos lácteos: estudo de transposição de escala 2009 - 2011 Transformação da glicerina do biodiesel em biopolimero e biofilmes: otimização dos processos e aplicação dos bioprodutos Prêmios e títulos 2011 Diploma de Honra ao Mérito, Sociedade Brasileira de Analistas de Alimentos Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos 1. DE JESUS ASSIS, DENILSON; SANTOS, JOANA; DE JESUS, CRISTIANE SANTOS; DE SOUZA, CAROLINA OLIVEIRA; COSTA, SAMANTHA SERRA; MIRANDA, ANDRÉA LOBO; DA SILVA, JAFF RIBEIRO; OLIVEIRA, MARIA BEATRIZ PRIOR PINTO; DRUZIAN, JANICE IZABEL. Valorization of crude glycerol based on biological processes for accumulation of lipophilic compounds. INTERNATIONAL JOURNAL OF BIOLOGICAL MACROMOLECULES. v.129, p.728 - 736, 2019. 2. VEIGA-SANTOS, PRICILA; SILVA, LUCIANA T.; DE SOUZA, CAROLINA O.; DA SILVA, JAFF R.; ALBUQUERQUE, ELAINE C. C.; DRUZIAN, JANICE I. Coffee-cocoa additives for bio-based antioxidant packaging. FOOD PACKAGING AND SHELF LIFE. v.18, p.37 - 41, 2018. 3. SILVA, MARIANA BARROS DE CERQUEIRA E; SOUZA, CAIO ALEXANDRE DA CRUZ; PHILADELPHO, BIANE OLIVEIRA; CUNHA, MARIANA MOTA NOVAIS DA; BATISTA, FABIANA PACHECO REIS; SILVA, JAFF RIBEIRO DA; DRUZIAN, JANICE IZABEL; CASTILHO, MARCELO SANTOS; CILLI, EDUARDO MAFFUD; FERREIRA, EDERLAN S. In vitro and in silico studies of 3-hydroxy-3-methyl- glutaryl coenzyme A reductase inhibitory activity of the cowpea Gln- Asp-Phe peptide. FOOD CHEMISTRY. v.259, p.270 - 277, 2018. 4. FIGUEIREDO, TAMIRIS V. B.; CAMPOS, MÁRCIO I.; SOUSA, LUCIANE S.; SILVA, JAFF R. DA; DRUZIAN, JANICE I. Production and characterization of polyhydroxyalkanoates obtained by fermentation of crude glycerin from biodiesel. QUIMICA NOVA. v.37, p.1111 - 1117, 2014. 5. MELO, F. V. S. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; COSTA, C. N.; ABREU, R. D. Composição centesimal e perfil de ácidos graxos em Bijupirás (Rachycentron canadum) juvenis selvagens e cultivados. ENCICLOPÉDIA BIOSFERA. v.8, p.458 - 465, 2012. 6. COSTA, CAROLINA NUNES; SILVA, JAFF RIBEIRO DA; MELO, FULVIO VIEGAS TEIXEIRA DE; HISANO, HAMILTON; DRUZIAN, JANICE IZABEL; PORTZ, LEANDRO. Incorporação de ômega-3 no tecido muscular da tilápia do Nilo alimentada com dietas contendo silagem de cabeça de camarão. CIENCIA RURAL. v.42, p.172 - 177, 2012. 7. SOUZA, CAROLINA O.; SILVA, LUCIANA T.; SILVA, JAFF R.; LOPEZ, JORGE A.; VEIGA-SANTOS, PRICILA; DRUZIAN, JANICE I. Mango and Acerola Pulps as Antioxidant Additives in Cassava Starch Bio-based Film. JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY. v.59, p.2248 - 2254, 2011. 8. SILVA, J. R.; SILVA, LUCIANA T.; DRUZIAN, JANICE I. Otimização e validação intralaboratorial de método para análise de resíduos de cloranfenicol em leite caprino por cromatografia gasosa com detecção por captura de elétrons (CG/DCE). QUIMICA NOVA. v.33, p.90 - 96, 2010. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo) 1. SOUZA, C. A. C.; SILVA, M. B. C. E.; PHILADELPHO, B. O.; CUNHA, M. M. N.; BATISTA, F. P. R.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; CILLI, E. M.; CASTILHO, M.; FERREIRA, E. S. Análise do acoplamento de peptídeos oriundos da proteína beta-vignina do feijão-caupí, com o sítio ativo da HMG-CoA, in silico. In: Congresso de Pesquisa, Ensino e Extensão da Universidade Federal da Bahia, 2018, Salvador. 2. SOUZA, V.; PHILADELPHO, B. O.; SILVA, M. B. C. E.; SILVA, J. R.; CILLI, E. M.; DRUZIAN, J. I.; CASTILHO, M.; FERREIRA, E. S. Estudo de peptideos derivados da beta-vignina do feijão adzuki sobre a atividade da HMG-CoA redutase in silico. In: Congresso de Pesquisa, Ensino e Extensão da Universidade Federal da Bahia, 2018, Salvador. 3. SILVA, J. R.; SILVA, M. B. C. E.; CASTILHO, MARCELO SANTOS; FERREIRA, E. S.; CILLI, E. M. Peptide derived from the cowpea ß- vignin with HMG-CoA reductase inhibitory activity. In: 47th Annual Meeting of the Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology, 2018, Joinville. 4. SILVA, M. B. C. E.; SOUZA, C. A. C.; CUNHA, M.; PHILADELPHO, B.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; CASTILHO, M.; CILLI, E. M.; FERREIRA, E. S. In silico peptides screening derived of the beta vignin from cowpea with inhibitory capacity over the HMG-CoA reductase. In: 12 SLACA - Simpósio Latino Americano de Ciência de Alimentos, 2017, Campinas. 5. MELO, F. V. S. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; COSTA, C. N.; PORTZ, L. Proximate composition in cobia (Rachyncentron canadum) juveniles and adults of wild. In: World Aquaculture, 2011, Natal. 6. ASSIS, D. J.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; CONCEICAO, E. K.; GOMES PACHECO, G. V. Comparativo da produção e caracterização reológica de goma xantana obtida com diferentes linhagens e fontes de carbono. In: XXII Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2010, Salvador. 7. DRUZIAN, J. I.; SILVA, J. R.; INOMATA, M.; COSTA, L. A. S. Determinação do peso molecular de goma xantana obtida a partir do resíduo de sisal. In: XXII Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2010, Salvador. 8. DRUZIAN, J. I.; SILVA, J. R.; INOMATA, M.; COSTA, L. A. S. Obtenção de xantana a partir do extrato aquoso de casca de camarão pela Xanthomonas campestris cepa 254: Produção e caracterização do biopolímero. In: XXII Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2010, Salvador. 9. MELO, F. V. S. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; TAVARES, A. C.; CONCEICAO, E. K.; PORTZ, L. Perfil de ácidos graxos em ossos da cabeça de beijupirás (Rachycentron canadum) adultos criados em cativeiro. In: 47ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2010, Salvador. 10. MELO, F. V. S. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; CONCEICAO, E. K.; TAVARES, A. C. Perfil de ácidos graxos em ossos da cabeça de beijupirás (Rachycentron canadum) juvenis selvagens. In: 47ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Zootecnia, 2010, Salvador. 11. COSTA, L. A. S.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; INOMATA, M. Produção e caracterização de goma xantana a partir de extrato aquoso de casca de camarão. In: XXII Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2010, Salvador. 12. GALDINO, F. S. S.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; MIRANDA, M. S.; MACIEL, L. F. Determinação de metanol em cachaças produzidas na Bahia por CG-DIC. In: 12º Congresso Latino-Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas - XII COLACRO, 2008, Florianópolis. 13. MELO, F. V. S. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, JANICE I.; PORTZ, L.; COSTA, C. N. Teor de lípídios totais, EPA e DHA do Rachycentron canadum cultivado com ração comercial. In: Aquaciencia, 2008, Maringá. 14. SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; GALDINO, F. S. S.; ROSÁRIO, A. S. Validação de método para análise de 5-hidrometilfurfural e furfural em cachaças produzidas na Bahia por CLAE. In: 12º Congresso Latino- Americano de Cromatografia e Técnicas Relacionadas – XII COLACRO, 2008, Florianópolis. 15. SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; BISPO, E. S.; CARVALHO FILHO, C. D.; SANTOS, P. Q.; ALVAREZ, R. C.; MENEZES, J. D. de S.; CONCEIÇÃO, M. F. Aproveitamento industrial da casca de cacau (Theobroma cacao L.) como fonte de fibra alimentar na produção de biscoito tipo cookie. In: 7° Simpósio Latino Americano de Ciência de Alimentos, 2007, Campinas. 16. DRUZIAN, J. I.; SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; SOUZA, C. O.; GALDINO, F. S. S. Ácidos graxos trans de alimentos consumidos em Salvador- BA. In: XX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2006, Curitiba. 17. SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I. Determinação de resíduos de antibióticos em camarão cultivado. In: XXV Seminário Estudantil de Pesquisa - UFBA, 2006, Salvador. 18. DRUZIAN, J. I.; SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; SOUZA, C. O.; GALDINO, F. S. S. Teor de ácido fólico em farinhas de milho enriquecidas e comercializadas em Salvador-BA In: XX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2006, Curitiba. 19. SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I. Avaliação de resíduos do antibiótico cloranfenicol em camarão. In: VI Simpósio Latino Americano de Ciência de Alimentos, 2005, Campinas. 20. SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I. Avaliação de resíduos do antibiótico cloranfenicol em camarão cultivado. In: XXIV Seminário Estudantil de Pesquisa (XXIV SEMEP), 2005, Salvador. 21. SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I.; SOUZA, C. O.; HORA, L. Composição físico-química e de ácidos graxos de cabeça de tilápia (Oreochromis niloticus). In: XIV Encontro Nacional de Analistas de Alimentos - XIV ENAAL, 2005, Goiânia. 22. SILVA, L. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; ANDRADE, G. Q. Teores de colesterol nos peixes mais consumidos na Bahia. In: XXIV Seminário Estudantil de Pesquisa (XXIV SEMEP), 2005, Salvador. 23. SILVA, L. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; ANDRADE, G. Q. Teores de colesterol nos peixes mais consumidos na Bahia. In: VI Simpósio Latino Americano de Ciência de Alimentos, 2005, Campinas. 24. SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I.; SIEDEL, JOSEFINA F. F. Avaliação do teor de EPA e DHA de cápsulas de óleo de peixe comerciais. In: XXIII Seminário Estudantil de Pesquisa (XXIII SEMEP), 2004, Salvador. 25. SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I.; SIEDEL, JOSEFINA F. F. Avaliação do teor de EPA e DHA em cápsulas de óleo de peixe comerciais. In: IV Seminário Interno de Pesquisa da Faculdade de Farmácia da UFBA, 2004, Salvador. 26. SILVA, L. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I. Composição centesimal e teor de cafeína de obi (Cola acuminata). In: I Fórum e Salão do Alimento Inteligente, 2004, São Paulo. 27. SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I.; HORA, L. Composição físico-quimica e de ácidos graxos de cabeças de tilápias (Oreochromis Niloticus). In: XXIII Seminário Estudantil de Pesquisa (XXIII SEMEP), 2004, Salvador. 28. SILVA, L. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I. Composição centesimal e teor de cafeína de obi (Cola acuminata). In: XXII Seminário Estudantil de Pesquisa (XXII SEMEP), 2003, Salvador. 29. SILVA, L. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I. Composição centesimal e teor de cafeína de obi (Cola acuminata). In: V Simpósio Latino Americano de Ciência de Alimentos-V SLACA, 2003, Campinas. 30. SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; VELOSO, E. S. Influência do método de extração na determinação de cafeína de obi (Cola acuminata) por HPLC-UV. In: V Simpósio Latino Americano de Ciência de Alimentos- V SLACA, 2003, Campinas. 31. SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; VELOSO, E. S. Influência do método de extração na determinação de cafeína de obi (Cola acuminata) por HPLC-UV. In: XXII Seminário Estudantil de Pesquisa (XXII SEMEP), 2003, Salvador. Trabalhos publicados em anais de eventos (resumo expandido) 1. PASCOAL, D. R. C.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; ASSIS, D. J.; PINHO, L. S.; MOURA, L. E. Study fingerprint the cassava flour produced in the Copioba Valley. In: XIX Encontro Nacional e V Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2015, Natal. 2. RIBEIRO, M. S.; SILVA, J. R.; MACIEL, L. F.; MACHADO FILHO, G. C.; SOARES, S. E.; BISPO, E. S. Avaliação da composição centesimal e atividade de água durante o processo de torração de amêndoas de cacau Theobroma cacao L. In: XVIII Encontro Nacional e IV Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2013, São Paulo. 3. RIBEIRO, M. S.; SILVA, J. R.; CARVALHO, R. D. S.; MACIEL, L. F.; BISPO, E. S. Avaliação dos aspectos físicos-químicos de vinhos tintos procedentes da agricultura convencional e orgânica comercializados na cidade de Salvador-BA. In: XVIII Encontro Nacional e IV Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2013, São Paulo. 4. MACIEL, L. F.; SILVA, J. R.; RIBEIRO, M. S. Avaliação dos compostos bioativos de vinhos tintos procedentes da agricultura convencional e orgânica comercializados na cidade de Salvador-BA. In: XVIII Encontro Nacional e IV Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2013, São Paulo. 5. RIBEIRO, M. S.; SILVA, J. R.; MACIEL, L. F.; CARVALHO, R. D. S. Cafeína em bebidas energéticas: Determinação e avaliação de risco. In: XVIII Encontro Nacional e IV Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2013, São Paulo. 6. DRUZIAN, J. I.; SILVA, J. R.; INOMATA, M.; COSTA, L. A. S.; ASSIS, D. J. Caracterização das gomas xantana obtidas a partir de resíduos agroindustriais. In: XVII Encontro Nacional e III Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2011, Cuiabá. 7. SILVA, L. T.; SOUZA, C. O.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I. Eficácia antioxidante e caracterização de filmes ativos formulados com fécula de mandioca, cacau e café. In: XVII ENAAL e III Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2011, Cuiabá. 8. MIRA, I.; SILVA, J. R.; MACIEL, L. F.; MIRANDA, M. S.; BISPO, E. S. Estudo comparativo entre propriedades de textura de amostras de pão de forma tradicional comercializadas no município de Salvador - BA. In: XVII Encontro Nacional e III Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2011, Cuiabá. 9. MIRA, I.; SILVA, J. R.; MACIEL, L. F.; MIRANDA, M. S.; BISPO, E. S. Propriedades de textura de amostras de pão de forma comercializadas no município de Salvador - BA. In: XVII Encontro Nacional e III Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2011, Cuiabá. 10. MIRA, I.; SILVA, J. R.; MACIEL, L. F.; MIRANDA, M. S. Influência de diferentes sistemas de cultivo no teor de compostos fenólicos totais e flavonóides em salsa (Petroselinum crispum). In: XVI Encontro Nacional e II Congresso latino-americano de analistas de alimentos, 2009, Belo Horizonte. 11. SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I.; JESUS, L. B.; TAVARES, A. C.; CONCEICAO, E. K. Influência do estágio de maturação na composição centesimal e teor de compostos fenólicos do jamelão (Syzygium cumini). In: XVI Encontro nacional e II Congresso latino- americano de analistas de alimentos, 2009, Belo Horizonte. 12. MELO, F. V. S. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; SANTOS, L. G.; CARVALHO, Z. S.; SANTOS, A. R. Influência do fósforo e boro no rendimento de óleo e proteína em sementes de girassol. In: XVI Encontro nacional e II Congresso latino-americano de analistas de alimentos, 2009, Belo Horizonte. 13. SILVA, J. R.; MELO, F. V. S. T.; DRUZIAN, J. I.; COSTA, C. N.; PORTZ, L. Perfil de ácidos graxos dos bijupirás juvenis (Rachyncentron canadum) selvagens. In: XXI Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos e XV Seminário Latino-Americano e do Caribe de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2008, Belo Horizonte. 14. GOMES, I. S.; SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I.; SIEDEL, J. F. F. Ácidos graxos trans em cápsulas de óleo de peixe marinho. In: XII Congresso Latino-americano de Óleos e Gorduras, 2007, Florianópolis. 15. SILVA, J. R.; COSTA, C. N.; MELO, F. V. S. T.; DRUZIAN, J. I.; PORTZ, L. EPA e DHA de tilápias nilóticas alimentadas com silagem do resíduo do camarão. In: XV ENAAL e Congresso Latino Americano de Analistas de Alimentos, 2007, Fortaleza. 16. SILVA, L. T.; SILVA, J. R.; DRUZIAN, J. I.; SOUZA, C. O.; GALDINO, F. S. S.; CARVALHO, R. D. S.; RIBEIRO, M. S. Teores de ácido fólico e ferro em flocos de milho enriquecidos comercializados em Salvador/BA. In: XLVI Congresso Brasileiro de Química CBQ, 2006, Salvador. 17. SILVA, J. R.; SILVA, L. T.; DRUZIAN, J. I.; SIEDEL, JOSEFINA F. F. Avaliação do teor de EPA e DHA de cápsulas de óleo de peixe comerciais. In: XIX Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2004, Recife. Assessoria e consultoria 12/2006 - 12/2010 Consultoria e assistência técnica em sistemas de cromatografia instrumental da Perkin Elmer do Brasil Ltda. Consultoria no desenvolvimento e implantação de metodologias com técnicas de cromatografias instrumentais. Desenvolvimento de treinamentos operacionais e soluções para rotina em softwares cromatográficos para geração, controle e gerenciamento de dados analíticos. Assistências técnicas preventivas e corretivas em cromatógrafos. Organização de evento 1. I Workshop de Inovação Tecnológica e Empreendedorismo: Aplicações das Ferramentas da Propriedade Industrial na Biotecnologia, 2012. 2. XXII Congresso Brasileiro de Ciência e Tecnologia de Alimentos, 2010. Dedico e agradeço aos meus pais, Maria e Juarez, aos meus irmãos, James (in memoriam) e Jussara, e a minha amada esposa Bruna, por todo exemplo, apoio e confiança que sempre recebi de todos. AGRADECIMENTOS A Deus por todo alento e força recebidos nos momentos de dificuldades. Aos meus pais e meus irmãos que sempre me incentivaram e apoiaram para que eu alcançasse meus objetivos. À minha esposa que sempre foi a melhor companheira e me passou muita força, equilíbrio e serenidade para que eu pudesse transpassar pelos obstáculos que surgiram. Ao meu orientador, Eduardo Maffud Cilli (o “chefe”), e ao meu coorientador, Ederlan de Souza Ferreira (Alvim), que me abriram as portas da área de peptídeos, mostrando-me a magnitude desta e fazendo com que o meu caminho profissional tomasse um novo rumo pelo qual, hoje, sou fascinado. A toda equipe do LASEBio: Júlia (Jujuba), Norival (Nonô), Paulo (Lolô), Carolina (Monstro), Mariana (Dobby), Mateus (Teteu), Natália (Gary), Teresa (Teka), João (Jão Canário) e as novatas (Marina, Natália, Sarah e Letícia); por toda colaboração e por manter um ambiente tão agradável para o trabalho. A todos os funcionários do Instituto de Química, por serem tão solícitos e gentis em todos os momentos em que necessitei de vossas colaborações. Aos muitos amigos que Araraquara me deu, pelos momentos de descontração e apoio quando a sobrecarga exigia um descanso. Aos amigos soteropolitanos que, mesmo com a distância, continuaram presentes e atuantes em minha vida. A todos aqueles que de algum modo colaboraram para a realização deste trabalho, mesmo sendo com um simples “Olá...” ou um belo sorriso, que forneciam mais força para prosseguir. Muito Obrigado! Jaff Ribeiro da Silva "Talvez não tenhamos conseguido fazer o melhor, mas lutamos para que o melhor fosse feito. Não somos o que deveríamos ser, não somos o que iremos ser mas, graças a Deus, não somos o que éramos". Martin Luther King RESUMO Estudos recentes demonstram que a proteína do feijão-caupí (Vigna unguiculata) exerce efeitos benéficos sobre o metabolismo lipídico, tanto in vitro quanto in vivo. Embora o mecanismo de ação dessas proteínas ainda permaneça pouco esclarecido, a hipótese defendida é que os peptídeos derivados da digestão gastrointestinal destas proteínas poderiam modular o metabolismo lipídico. Neste trabalho, foram identificados peptídeos naturais, a partir da hidrólise enzimática da proteína do feijão-caupí, e desenhados análogos que possuem atividade de inibição da enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase (HMGR) responsável pela biossíntese do colesterol. Inicialmente, foram realizadas triagens in silico, selecionando os peptídeos com melhor potencial para a inibição. Por meio das técnicas de síntese de peptídeo em fase sólida, cromatografia líquida de alta eficiência e espectrometria de massas, foi possível obter os peptídeos com rendimentos em torno de 70% e purezas acima de 95%. Foram identificados os peptídeos naturais, QGF (100 μM) e GCTLN (100 μM), com capacidade de inibir a atividade da HMGR em, aproximadamente, 38% e 18%, respectivamente. Seguidamente, foram desenhados e obtidos dois novos peptídeos, o pGlu-GF (100 μM) e GSTLN (100 μM), com capacidade de inibir a enzima em, respectivamente, 54% e 27%. Os peptídeos desenhados também foram avaliados de modo combinado entre si e com o fármaco pravastatina. Os resultados dos ensaios de inibição combinados foram: pGlu-GF (50 μM) + GSTLN (50 μM) = 55%; pGlu-GF (100 μM) + pravastatina (16,7 ηM) = 54% e; GSTLN (100 μM) + pravastatina (16,7 ηM) = 65%. Esses valores foram maiores do que o obtido para a pravastatina (16,7 ηM) que foi de aproximadamente 46%. A capacidade de ação dos peptídeos de modo combinado, pode vir a contribuir com soluções para problemas relacionados aos efeitos adversos das estatinas. Este estudo mostrou que os peptídeos originados da hidrólise enzimática da proteína do feijão-caupí possuem atividade inibitória da enzima HMGR. Os peptídeos desenhados, pGlu-GF e GSTLN, são moléculas promissoras para desenvolvimento de novos fármacos e terapias combinadas para o tratamento de dislipidemias. ABSTRACT Recent studies show that cowpea bean proteins (Vigna unguiculata) possess beneficial effects in the lipid metabolism, in vitro and in vivo. Although the mechanism of action is still unclear, the hypothesis that is affirmed is that the derived peptides during the gastrointestinal digestion can modulate the lipid metabolism. In this work, natural peptides obtained from enzymatic hydrolysis of the protein from cowpea bean were identified and analogous peptides were drawed, which had inhibition activity of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (HMGR), responsible for endogenous cholesterol synthesis. Firstly, in silico screening was performed, selecting the peptides with the best potential for inhibition. It was possible to obtain the peptides with yields around 70 % and purities above 95 %, using techniques of solid phase peptide synthesis (SPPS), high performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS). Were identified the natural peptides, QGF (100 μM) and GCTLN (100 μM), whit capacity of in vitro inhibiting the action of HMGR in, approximately, 38 % and 18 %, respectively. Then, two new analogous peptides, pGlu-GF (100 μM) and GSTLN (100 μM), were drawed and identified with capacity of HMGR’s inhibiting in 54 and 27 %, respectively. The drawed peptides also were evaluated in combination with each other and with the commercial drug pravastatin. The results of the combined inhibition tests were pGlu-GF (50 μM) + GSTLN (50 μM) = 55 %; pGlu-GF (100 μM) + pravastatin (16.7 ηM) = 54 % and; GSTLN (100 μM) + pravastatin (16.7 ηM) = 65 %. These values were higher than those obtained for pravastatin (16.7 ηM), which was approximately 46 %. The ability of peptides to act in combination may contribute to solutions of therapeutic problems related to the adverse effects of statins’s use. This study showed that peptides obtained from enzymatic hydrolysis of cowpea bean protein have a good inhibitory activity of the HMGR enzyme. The drawed peptides, pGlu-GF and GSTLN, are promising molecules for development of new drugs and combined therapies for the treatment of dyslipidemias. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Percentual de mortes por doenças crônicas não-transmissíveis no mundo e no Brasil. Dados brutos extraídos de WHO, 2018 e SBC, 2019. .................................................................. 34 Figura 2. Processo de formação da placa aterosclerótica. ......................................................... 35 Figura 3. Rota biossintética do colesterol a partir do acetil-CoA. ............................................... 38 Figura 4. Esquema de transporte de lipídios pelo organismo mediado pelas lipoproteínas plasmáticas. ................................................................................................................................. 41 Figura 5. Comparação entre as estruturas de 4 estatinas e o HMG-CoA. .................................. 45 Figura 6. Produção mundial média de feijão-caupí no período de 1994 a 2017. ....................... 51 Figura 7. Esquema simplificado da síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS). ....................... 56 Figura 8. Sequência primária de aminoácidos da subunidade-1 da β-vignina (7S) (NCBI/GenBank Blast: AM905848; UniProtKB: A8YQH5_VIGUN). .............................................. 59 Figura 9. Alinhamento da sequência primária da subunidade-1 da β-vignina do feijão-caupí (ID: A8YQH5_VIGUN) com a subunidade 7S da globulina do feijão-azuqui (ID: A4PI98_PHAAN) e a subunidade α da β-conglicinina da soja (ID: GLCAP_SOYBN). .................................................... 60 Figura 10. Superposição do volume ocupado dos peptídeos triados (estrutura primária) com o espaço ativo de sinvastatina (PDB 1HW9) na HMGR. (A) QGF com sinvastatina; (B) MPNY com sinvastatina. ................................................................................................................................ 64 Figura 11. Acoplamento entre o sitio ativo da HMGR (PDB ID: 1HW9) com os peptídeos: (A) QGF e (B) MPNY. ......................................................................................................................... 65 Figura 12. Acoplamento do peptídeo MPNY com o sitio ativo (PDB 1HW9) da HMGR usando o software AutoDock-VINA®. (A) Melhor pose selecionada para a sinvastatina (amarelo) sobreposta a melhor posição do peptídeo MPNY (cinza); (B) Previsão do perfil de ligação do MPNY no sítio ativo. .................................................................................................................... 66 Figura 13. Acoplamento do peptídeo QGF com o sitio ativo (PDB 1HW9) da HMGR usando o software AutoDock-VINA®. (A) Melhor pose selecionada para a sinvastatina (amarelo) sobreposta a melhor posição do peptídeo QGF (cinza); (B) Previsão do perfil de ligação do QGF no sítio ativo. ............................................................................................................................... 68 Figura 14. Peptídeo MPNY: (A) Cromatograma do peptídeo bruto sintetizado; (B) Cromatograma do peptídeo purificado; (C) Espectro de massas do peptídeo purificado. ........ 70 Figura 15. Peptídeo QGF: (A) Cromatograma do peptídeo bruto sintetizado; (B) Cromatograma do peptídeo purificado; (C) Espectro de massas do peptídeo purificado. .................................. 71 Figura 16. Reação de formação do ácido piroglutâmico (pGlu) a paritr de uma glutamina (Q) e de um ácido glutâmico (E). .......................................................................................................... 73 Figura 17. Acoplamento do peptídeo pGlu-GF com o sitio ativo da HMGR (PDB 1HW9) usando o software AutoDock-VINA®. (A) Melhor posição selecionada para a sinvastatina (amarelo) sobreposta a melhor posição do peptídeo pGlu-GF (cinza); (B) Previsão do perfil de ligação do pGlu-GF no sítio ativo. ................................................................................................................. 77 Figura 18. Cromatogramas dos novos peptídeos puros, originados de modificações do MPNY. (A) DM-PNY; (B) PNY; (C) SPNY e (D) SPQY. Em detalhe destacam-se as respectivas razões m / z. ..................................................................................................................................................... 78 Figura 19. Cromatogramas dos peptídeos: (A) Peptídeo QGF evidenciando o segundo pico correspondente ao produto de degradação (pGlu-GF); (B) Peptídeo pGlu-GF purificado a partir do QGF e (C) Peptídeo pGlu-GF sintetizado e purificado. Em detalhe destacam-se as respectivas razões m / z. ................................................................................................................................ 80 Figura 20. Interação proposta do peptídeo GCTLN por MARQUES e colaboradores (2015b). (A) Tetrâmero da HMGR e o sítio de interação previsto para o peptídeo GCTLN. (B) Interação do GCTLN com o domínio-S próximo ao sítio ativo. ......................................................................... 84 Figura 21. Diagrama em fitas do tetrâmero da HMGR humana. (A) Vista frontal. (B) Vista lateral. ......................................................................................................................................... 84 Figura 22. Diagrama em fitas da estrutura terciária do monômero da HMGR humana. ........... 85 Figura 23. Cromatogramas do peptídeo puro GCTLN e de seus derivados: (A) GCTLN; (B) GSTLN; (C) GCTLN-NH2 e; (D) GSTLN-NH2. Em detalhe destacam-se as respectivas razões m / z. .................................................................................................................................................. 86 Figura 24. Cromatograma do extrato proteico do feijão-caupí obtido por GPC Sepharose CL-6B (100 x 1,0 cm), eluição isocrática com tampão fosfato de potássio (10 mmol/L) contendo NaCl (0,5 mol/L) e azida sódica (0,01 %) sob um fluxo de 0,45 mL/min. Detecção UV a 280 nm..... 111 Figura 25. Perfis SDS-PAGE do feijão-caupí. (a) Resultados obtidos neste estudo. (b) Figura extraída de Ferreira (2013). ...................................................................................................... 111 Figura 26. Cromatogramas dos peptídeos obtidos da hidrólise da proteína 7S do feijão-caupí obtido por CLAE Analitíco C18 (15 x 0,46 cm), detecção UV a 220 nm. (a) Perfil bruto dos peptídeos menores de 3 kDa. (b) Perfil isolado correspondente ao pico de 3,2 min. (c) Perfil isolado correspondente ao pico de 5,4 min. (d) Perfil isolado correspondente ao pico de 7,3 min. ........................................................................................................................................... 113 Figura 27. Espectro de massas deconvoluído do peptídeo purificado obtido da análise por CL/EM do extrato purificado do peptídeo de 7,3 min obtido pela hidrólise da proteína 7S do feijão-caupí. ............................................................................................................................... 114 Figura 28. Espectro de fragmentação (MS/MS) do peptídeo purificado com massa molar de 386 Da. ...................................................................................................................................... 114 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Peptídeos obtidos da hidrólise in silico da subunidade-1 da proteína β-vignina do feijão-caupí e dados iniciais da interação com a HMGR. ............................................................ 63 Tabela 2. Principais interações no sítio ativo da HMGR com o substrato HMG-CoA e o inibidor comercial sinvastatina. ................................................................................................................ 66 Tabela 3. Dados da síntese dos peptídeos originados após a triagem in silico da β-vignina. .... 72 Tabela 4. Atividade de inibição da HMGR in vitro pelos peptídeos MPNY e QGF. .................... 74 Tabela 5. Dados da síntese dos peptídeos modificados obtidos a partir do MPNY. .................. 79 Tabela 6. Atividade de inibição da HMGR in vitro pelos novos peptídeos sintetizados. ............ 81 Tabela 7. Dados da síntese peptídeo GCTLN e seus derivados. ................................................. 87 Tabela 8. Atividade de inibição da HMGR in vitro pelo peptídeo GCTLN e seus derivados. ...... 87 Tabela 9. Determinação do IC50 dos peptídeos com maior atividade inibitória sobre a HMGR. 89 Tabela 10. Estudo dos efeitos combinados entre os peptídeos pGlu-GF, GSTLN e o fármaco pravastatina, obtidos por ensaios de inibição in vitro da enzima HMGR. .................................. 91 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 11S - Leguminas 7S - Vicilinas ACC - American College of Cardiology Acetil-CoA - Acetil-coenzima A ACN - Acetonitrila C - Colesterol CE - Ésteres de colesterila CL/EM - Cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas CLAE - Cromatografia líquida de alta eficiência C-terminal - Extremidade carboxi-terminal da cadeia polipeptídica DAC - Doenças arteriais coronarianas DCM - Diclorometano DCV - Doenças cardiovasculares DIC - N,N’-Diisopropilcarbodiimida DMF - N,N-Dimetilformamida EDT - 1,2-etanoditiol FDA - United States Food and Drug Administration FFA - Free Fatty Acids - Ácidos graxos livres Fmoc - 9-fluorenilmetiloxicarbonil, grupo protetor α-amino GPC - Gel Permeation Chromatography - Cromatografia de permeação em gel HDL - High Density Lipoprotein - Lipoproteínas de alta densidade pobre em colesterol HepG2 - Linhagem celular de câncer de fígado humano HF - Hipercolesterolemia familiar HMG-CoA - β-hidroxi-β-metilglutaril-coenzima-A HMGR – Enzima 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase HOBt – 1-Hidroxibenzotriazol IC50 – Concentração necessária para inibição de 50 % da atividade IDL - Intermediary Density Lipoprotein - Lipoproteínas de densidade intermediária LDL - Low Density Lipoprotein - Lipoproteínas de baixa densidade rica em colesterol mRNA – RNA mensageiro MS/MS - Tandem Mass Spectrometry - Espectrometria de massa em tandem NADP - Nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato NADPH - Forma reduzida da nicotinamida adenina dinucleotideo fosfato NCDs - Noncommunicable Diseases - Doenças crônicas não transmissíveis NCEP - National Cholesterol Education Program NPC1-L1 - Proteína Niemann-Pick C1-like 1 N-terminal - Extremidade amino-terminal da cadeia polipeptídica OMS - Organização Mundial da Saúde PRScore - Peptide Ranker Score R² - Coeficiente de determinação RMSD - Root Mean Square Deviation - Desvio médio dos átomos de uma estrutura X, relativamente a uma segunda estrutura Y S - Coeficiente de sedimentação SPFS - Síntese de peptídeos em fase sólida SR-B1 - Scavenger Receptor class B type 1 - Receptor sequestrador de classe B tipo 1 SREBP2 - Sterol regulatory element-binding proteins - Proteína de ligação ao elemento regulador de esterol 2 TAG - Triacilglicerídeos ou triglicérides tBu - t-butil, grupo protetor das cadeias laterais TFA - Ácido trifluoracético TG - Triacilglicerídeos ou triglicérides TIS - Triisopropilsilano tR - Tempo de retenção VLDL - Very Low Density Lipoprotein - Lipoproteínas de muito baixa densidade LISTA DE AMINOÁCIDOS Ala (A) - Alanina Arg (R) - Arginina Asn (N) - Asparagina Asp (D) - Ácido aspártico Cys (C) - Cisteína DMet (DM) - Metionina na configuração D Gln (Q) - Glutamina Glu (E) - Ácido Glutâmico Gly (G) - Glicina His (H) - Histidina Ile (I) - Isoleucina Leu (L) - Leucina Lys (K) - Lisina Met (M) - Metionina pGlu - Ácido piroglutâmico Phe (F) - Fenilalanina Pro (P) - Prolina Ser (S) - Serina Thr (T) - Treonina Trp (W) - Triptofano Tyr (Y) - Tirosina Val (V) - Valina SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 31 2. OBJETIVOS .............................................................................................. 33 2.1. Objetivo Geral ....................................................................................... 33 2.2. Objetivos Específicos .......................................................................... 33 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ..................................................................... 34 3.1. Doenças Cardiovasculares .................................................................. 34 3.2. Colesterol .............................................................................................. 36 3.3. Dislipidemias ........................................................................................ 42 3.3.1. Tratamentos farmacológicos ........................................................... 43 3.3.2. Tratamentos não farmacológicos .................................................... 46 3.4. Proteínas vegetais ................................................................................ 47 3.5. Feijão-caupí ........................................................................................... 50 4. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................... 52 4.1. Triagem in silico ................................................................................... 52 4.2. Ensaios de acoplamento molecular .................................................... 53 4.3. Síntese dos peptídeos ......................................................................... 54 4.4. Reação de clivagem ............................................................................. 55 4.5. Purificação e caracterização dos peptídeos ...................................... 57 4.6. Ensaio de inibição da HMGR in vitro .................................................. 57 4.7. Análise estatística ................................................................................ 58 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO ................................................................ 58 5.1. Peptídeos originados da β-vignina (7S) ............................................. 58 5.1.1. Ensaios in silico ................................................................................ 59 5.1.2. Síntese, purificação e caracterização dos peptídeos triados ....... 69 5.1.3. Ensaios in vitro de inibição da HMGR ............................................. 73 5.1.4. Modificações estruturais dos peptídeos ativos da β-vignina ....... 75 5.1.5. Simulações in silico dos peptídeos modificados ........................... 76 5.1.6. Síntese, purificação e caracterização dos peptídeos modificados 78 5.1.7. Ensaios in vitro com os novos peptídeos originados da β-vignina 81 5.2. Peptídeo GCTLN do feijão-caupí ......................................................... 83 5.2.1. Modificações estruturais do peptídeo GCTLN................................ 83 5.2.2. Síntese, purificação e caracterização do peptídeo GCTLN e seus derivados ........................................................................................................ 86 5.2.3. Ensaios in vitro de inibição da HMGR pelo peptídeo GCTLN e seus derivados ........................................................................................................ 87 5.3. Determinação da concentração dos peptídeos para 50 % de inibição da HMGR (IC50)................................................................................................ 89 5.4. Avaliação do efeito combinado entre os novos peptídeos desenhados e o fármaco pravastatina ......................................................... 90 6. CONCLUSÕES ......................................................................................... 94 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 95 APÊNDICES .................................................................................................. 110 APÊNDICE A – Estudos preliminares para obtenção de peptídeos da 7S do feijão-caupí, posteriormente substituídos pelas simulações in silico. ....................................................................................................................... 110 31 1. INTRODUÇÃO As doenças crônicas não-transmissíveis (NCDs – Noncommunicable Diseases) têm representado a principal causa de morte nas últimas duas décadas no mundo. O aumento na prevalência das NCDs tem sido considerado o resultado da convergência entre saúde, crescimento econômico e desenvolvimento, estando fortemente atrelado às tendências universais como o envelhecimento populacional, avanço da urbanização e um estilo de vida menos saudável, todos como revérbero da globalização (WHO, 2011). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS) as NCDs foram responsáveis por 41 das 57 milhões de mortes no mundo em 2016 (WHO, 2018). No Brasil, estimasse que em 2016 houveram quase 350 mil mortes decorrentes de doenças cardiovasculares (DCV) (SBC, 2019). Estudos apontam que a dieta, o sedentarismo e o uso do tabaco, juntos, são responsáveis por 80 % dos episódios coronarianos e cerebrovasculares decorrente da aterosclerose (WHO, 2011, 2018). O National Cholesterol Education Program (NCEP), desde 2002, reconhece a hipercolesterolemia como o pré-requisito para a aterosclerose, sendo que a redução da lipoproteína de baixa densidade (LDL) é fundamental para a diminuição do risco de eventos cardiovasculares (NCEP, 2002). A American College of Cardiology (ACC) corrobora que mudanças no estilo de vida e na dieta devem ser associadas às terapias medicamentosas para o melhor controle das dislipidemias (STONE et al., 2014). Uma relação direta entre o consumo de proteínas de origem animal e o desenvolvimento de DCV tem sido descrita na literatura. Isso se deve, principalmente, a dois fatores: primeiro, proteínas de origem animal carreiam junto a si ácidos graxos saturados e colesterol, o que não acontece no consumo de proteínas vegetais; em segundo, para as proteínas de origem vegetal tem sido atribuído efeitos benéficos por ação farmacológica dos peptídeos originados da digestão destas (SCARAFONI et al., 2007; CONSONNI et al., 2011; TACO, 2011; FERREIRA et al., 2015; FROTA et al., 2008; SILVA et al., 2018; MARQUES et al., 2018). Estes dados indicam a vantagem da substituição da fonte proteica de origem animal pela fonte vegetal, a fim de promover diversos 32 benefícios à saúde, principalmente aqueles envolvidos no desenvolvimento de doenças cardiovasculares. Nesse cenário, estudos tem destacado o papel das leguminosas no metabolismo e na prevenção da hipercolesterolemia, hipertrigliceridemia e hiperglicemia. Estudos em animais (PAK et al., 2006; PAK et al., 2012; FERREIRA et al., 2015) e em humanos (SIRTORI et al., 2009) têm sugerido que a proteína de soja apresenta uma capacidade de reduzir os níveis séricos de colesterol total e de LDL. Assim como a proteína da soja, outras espécies de leguminosas, tais como feijões, ervilhas e tremoço também têm mostrado capacidade de alterar o metabolismo do colesterol, porém, estas têm recebido menor atenção (SCARAFONI et al., 2007). A literatura aponta um efeito hipocolesterolemizante em animais (FROTA et al., 2008; FERREIRA et al., 2015; KAPRAVELOU et al., 2015; LIYANAGE et al., 2018) e humanos (FROTA et al., 2015) quando alimentados com uma dieta tendo como fonte de proteína o isolado proteico do feijão-caupí. Apesar do mecanismo de ação dessas proteínas ainda não esteja totalmente esclarecido, indícios apontam que os peptídeos derivados da digestão gastrointestinal destas proteínas poderiam atuar modulando o metabolismo lipídico. Essa ação poderia ser por diversos meios, tais como: alterações na absorção, síntese, excreção, indução e/ou supressão de transcrição de receptores e inibição de enzimas da via biossintética do colesterol (FERREIRA, 2013). Assim, estudar a hipótese na qual a proteína do feijão-caupí possa originar peptídeos, seja a partir da hidrólise enzimática in vitro ou ainda por métodos in silico, e que estes venham a apresentar capacidade de agir no metabolismo do colesterol, representa o desafio de avançar no sentido de esclarecer quais os possíveis mecanismos de ação envolvidos. Além disto, possibilita a criação de pressupostos para o desenvolvimento futuro de novos fármacos. 33 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo Geral Investigar a ação de peptídeos obtidos da hidrólise enzimática da proteína do feijão-caupí sobre atividade da 3-hidroxi-3-metilglutaril coenzima A redutase (HMGR). 2.2. Objetivos Específicos  Triar peptídeos por dois caminhos: (1) a partir da hidrólise in silico da subunidade-1 da fração proteica 7S, que já está sequenciada e descrita na literatura; (2) produzir derivados do peptídeo GCTLN do feijão-caupí, já triado e descrito na literatura.  Avaliar, por ensaios in silico, os peptídeos obtidos acima em relação à possível atividade inibitória da HMGR;  Produzir derivados sintéticos dos peptídeos ativos caracterizados nos ensaios in silico;  Avaliar in vitro a capacidade de inibição da HMGR pelos peptídeos sintetizados;  Desenhar e sintetizar novos derivados dos peptídeos com atividade comprovada, a fim de incrementar sua atividade;  Avaliar in vitro a capacidade de inibição da HMGR dos novos peptídeos sintetizados;  Determinar a IC50 dos peptídeos que possuam maior capacidade de inibição da HMGR. 34 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Doenças Cardiovasculares No último século, houve uma transição epidemiológica com relação às causas de mortes no mundo, sendo que, na atualidade, as doenças crônico- degenerativas tomaram o lugar das infectocontagiosas. Estudos epidemiológicos estabelecem as NCDs como um notório desafio neste século não apenas para as questões de saúde pública, mas também ao crescimento econômico global. O aumento na prevalência das NCDs está intimamente ligado ao desenvolvimento socioeconômico do mundo globalizado, sendo hoje a principal causa de morte da sociedade moderna (WHO, 2011; PRÉCOMA et al., 2019). A maioria destas mortes foram causadas por quatro NCDs, sendo a principal delas as doenças cardiovasculares (DCV) (44 %), seguido dos casos de cânceres (22 %), doenças respiratórias crônicas (9 %) e diabetes (4 %) (Figura 1) (WHO, 2018). No Brasil, este cenário não é diferente, entre 2004 e 2014, o percentual de mortes relacionadas às DCVs foi de 28,73 %, neoplasias 15,62%, doenças respiratórias 10,5% e diabetes 4,61% (Figura 1) (SBC, 2019). Figura 1. Percentual de mortes por doenças crônicas não-transmissíveis no mundo e no Brasil. Dados brutos extraídos de WHO, 2018 e SBC, 2019. Fonte: Próprio autor. 35 A incidência das DCVs está intimamente ligada a aterogênese. A ideia de que a aterosclerose seja simplesmente um lento e passivo processo de deposição de gordura na parede dos vasos sanguíneos está ultrapassada. Atualmente, a doença é vista como uma inflamação crônica de origem multifatorial, devido uma resposta do organismo a uma agressão ao endotélio (SWIRSKI e NAHRENDORF, 2013; FALUDI et al., 2017). A placa aterosclerótica origina-se por uma lesão no endotélio vascular que, por sua vez, pode ser causada diversos fatores, dentre esses as dislipidemias e a hipertensão arterial. Essa agressão ao endotélio culmina em um aumento da permeabilidade às lipoproteínas de baixa densidade ligadas ao colesterol (LDL) que ficam retidas no espaço subendotelial. As partículas de LDL retidas sofrem oxidação gerando epítopos e desse modo tornam-se imunogênicas. A cascata de eventos imunológicos culmina na migração de monócitos para o subendotélio que, uma vez depositados nos vasos, diferenciam-se em macrófagos e passam a captar moléculas de LDL oxidadas (Figura 2) (NELSON e COX, 2014; FALUDI et al., 2017). Esse evento mostra que a aterogênese está diretamente relacionada com os índices plasmáticos de LDL. Os macrófagos não podem limitar a captação de esteróis, e com este acúmulo passam a ser chamados de células espumosas. Com isso, o acúmulo de colesterol nas células espumosas induz a apoptose e o extravasamento de fluídos potencializa a resposta inflamatória (Figura 2) (NELSON e COX, 2014; FALUDI et al., 2017). Figura 2. Processo de formação da placa aterosclerótica. Fonte: Figura extraída de NELSON e COX, 2014. 36 Hoje sabe-se que a aterosclerose possui uma fisiopatologia complexa e dependente de múltiplos fatores sejam estes adquiridos ou congênitos, que interagem com o meio ao qual esse indivíduo está exposto. Dentre esses fatores, as dislipidemias constituem um grande fator de risco de DCVs, sendo a hipercolesterolemia a mais relevante. A hipertensão arterial, o diabetes e a síndrome metabólica também ganham destaque no aumento significativo da incidência das doenças arteriais coronarianas (DAC). O diabetes pode elevar em até quatro vezes a probabilidade da manifestação de DAC. No caso da hipertensão arterial, o risco é potencializado por se tratar de uma doença assintomática, o que dificulta o diagnóstico e o seu tratamento. Soma-se a isso, as mudanças nos padrões nutricionais e de atividades físicas da sociedade moderna, intimamente relacionadas com as transições econômicas, sociais e demográficas, que tornaram o ambiente propício para o desenvolvimento do sobrepeso e da obesidade (BAIK et al., 2013; FALUDI et al., 2017; PRÉCOMA et al., 2019). Em 2019, a Diretriz Brasileira de Prevenção da Sociedade Brasileira de Cardiologia, atualizou os fatores de risco tradicionais indicando a agregação de novos fatores que envolvem questões socioeconômicas, ambientais e até mesmo de espiritualidade. A diretriz aponta que fatores psicossociais, tais como o estresse, depressão e ansiedade, bem como questões econômicas e culturais, aumentam o risco para hipertensão arterial e, por consequência, das DCVs. Ao que tange à espiritualidade, esta é considerada um recurso valioso devido ao impacto no paciente para o enfrentamento de doenças e do sofrimento. A diretriz indica que ao dar relevância e prover um suporte espiritual adequado, tanto o paciente quanto a equipe de tratamento são beneficiados (PRÉCOMA et al., 2019). 3.2. Colesterol De um modo geral os lipídios possuem uma constituição química bem diversificada, sendo definidos pela sua característica universal de insolubilidade em água. Sob a ótica fisiológica, quatro classes de lipídios são os mais importantes: os fosfolipídios, os ácidos graxos, os triglicérides (TG) e o colesterol. Os fosfolipídios são moléculas anfipáticas e essenciais para formar a estrutura básica das membranas celulares. Os ácidos graxos junto com os TGs, 37 constituem a mais importante forma de armazenamento de energia no organismo, estando estes depositados nos tecidos adiposos e musculares. No caso do colesterol, este também é um constituinte das membranas celulares dando a elas fluidez, além de ser precursor dos ácidos biliares, da vitamina D e dos hormônios esteroides (FALUDI et al., 2017). O colesterol é essencial para vida dos seres humanos, entretanto não é necessário seu consumo na dieta, pois o organismo é plenamente capaz de sintetizá-lo em quantidades adequadas. Sua biossíntese tem início a partir da condensação de três moléculas de acetil-Coenzima A (acetil-CoA), gerando o composto β-hidroxi-β-metilglutaril-CoA (HMG-CoA). Seguidamente, é formado o ácido mevalônico pela ação da enzima HMG-CoA redutase (HMGR) (Figura 3). Este é um ponto crucial para regulação da biossíntese do colesterol, tanto a curto prazo pela ação de hormônios ou medicamentos, estimulando ou inibindo a atividade da HMGR; quanto a longo prazo, em resposta as concentrações celulares de colesterol, mediadas pela regulação da transcrição do gene da HMGR (WIERZBICKI, 2004; CAMPO e CARVALHO, 2007). A condensação de três moléculas do composto intermediário pirofosfato de isopentenila, gerado a partir do ácido mevalônico, forma o pirofosfato de farnesila com 15 átomos de carbono. Seguidamente, duas moléculas do pirofosfato de farnesila ligam-se cabeça com cabeça, com a eliminação de ambos os grupos pirofosfato, formando o esqualeno com 30 átomos de carbono. Então, uma reação de epoxidação, catalisada pela esqualeno-monoxigenase, converte o esqualeno em lanosterol. Por fim, em uma sequência de aproximadamente 20 etapas, o lanosterol é convertido em colesterol (Figura 3) (WIERZBICKI, 2004; CAMPO e CARVALHO, 2007). Nos humanos a síntese do colesterol ocorre principalmente no fígado. A maior parte do colesterol produzido nos hepatócitos é distribuída de três formas: o colesterol, os ácidos biliares e os ésteres de colesterila. Quando já distribuído nos tecidos, o colesterol pode ser convertido nos hormônios esteroides e em vitamina D. Os ácidos biliares e seus sais são derivados considerados hidrofílicos, também produzidos no fígado, que juntos compõe a bile que é um importante adjuvante para a digestão de gorduras no intestino. Já os ésteres de colesterila são formas mais hidrofóbicas do colesterol, formados pela junção enzimática de um ácido graxo ao grupo hidroxil do colesterol. Esta forma mais 38 hidrofóbica previne que o colesterol entre nas membranas, além disso exigem a presença de partículas lipoproteicas que executem o transporte no plasma (CAMPO e CARVALHO, 2007; NELSON e COX, 2014). Os TGs e o colesterol também podem ser adquiridos pela ingestão de gorduras. Neste caso, os TGs são hidrolisados pelas lipases pancreáticas e solubilizados pela ação dos sais biliares na luz intestinal, facilitando assim seu processo de absorção. Por outro lado, o colesterol obtido pela alimentação é absorvido pela ação da proteína Niemann-Pick C1-like 1 (NPC1-L1), que compõe um transportador da membrana apical dos enterócitos (FALUDI et al., 2017). Figura 3. Rota biossintética do colesterol a partir do acetil-CoA. Fonte: Figura extraída de CAMPO e CARVALHO, 2007. 39 Devido a hidrofobicidade, o transporte dos lipídios dos tecidos de origem para os tecidos onde serão consumidos ou armazenados, é feito pelas lipoproteínas plasmáticas. Essas são complexos esféricos de macromoléculas constituídos por proteínas transportadoras específicas, denominadas apolipoproteínas, e combinações distintas dos lipídios. Essas distintas combinações produzem partículas com diferentes densidades, sendo quatro os principais tipos: 1. Quilomícrons que tem origem intestinal, maiores, menos densos e ricos em TG; 2. VLDL (do inglês, Very Low Density Lipoprotein) que são lipoproteínas de densidade muito baixa, também ricas em triglicérides, mas de origem hepática; 3. LDL (do inglês, Low Density Lipoprotein), as lipoproteínas de baixa densidade que são ricas em colesterol e ésteres de colesterila; 4. HDL (do inglês, High Density Lipoprotein) que correspondem as lipoproteínas de alta densidade que são ricas em apolipoproteínas. Ainda existe uma classe de lipoproteínas intermediárias, são as chamadas IDL (do inglês, Intermediary Density Lipoprotein) que se formam nos capilares na transição da VLDL para LDL. Os diferentes tipos de lipoproteínas exercem papéis específicos no organismo, sendo que estes variam em função do local de origem, da composição lipídica e dos tipos de apolipoproteínas que as constituem. As apolipoproteínas garantem a especificidade das lipoproteínas para determinados tecidos, bem como ativam enzimas que atuam sob as mesmas (NELSON e COX, 2014; FALUDI et al., 2017). Os quilomícrons tem origem nos retículos endoplasmáticos dos enterócitos, sendo absorvidos pelo sistema linfático e são responsáveis pela chamada via de absorção exógena do colesterol. Cabe a eles transportar os ácidos graxos obtidos na dieta para os locais onde esses serão consumidos ou armazenados, tais como tecidos musculares, adiposos e glândulas mamárias. O conteúdo remanescente (TG e colesterol) é captado pelo fígado por endocitose e os quilomícrons são degradados nos lisossomos dos hepatócitos (NELSON e COX, 2014). O excedente de lipídios obtidos pela dieta que chega ao fígado é então convertido em triacilgliceróis e ésteres de colesterila, sendo esses empacotados 40 com apolipoproteínas, gerando assim as partículas de VLDL. Estas novas lipoproteínas emergem do fígado liberando ácido graxos livres (FFA, do inglês, Free Fatty Acids) nos tecidos musculares e adiposos. Após essa liberação a partícula de VLDL é convertida em IDL que continua distribuindo FFAs no organismo até sua transformação na partícula de LDL, agora rica em colesterol e ésteres de colesterila. Por sua vez, a LDL distribui o colesterol para as glândulas suprarrenais, gônadas, músculos e adipócitos. Além disso, nesse trajeto as partículas de LDL podem ser captadas por macrófagos em formações ateroscleróticas gerando células espumosas (NELSON e COX, 2014). A LDL remanescente na circulação sanguínea é captada na membrana plasmática dos hepatócitos via receptores de LDL por endocitose. Desse modo, a partícula é destruída e o colesterol liberado pode ser incorporado nas membranas, convertido em ácidos biliares ou reesterificados para armazenamento na forma de gotículas lipídicas citosólicas. À essa via metabólica do colesterol, envolvendo a exportação da VLDL e a captação da LDL, dá-se o nome de via endógena do colesterol (FALUDI et al., 2017). Um outro caminho do colesterol no organismo é o chamado transporte reverso pela HDL. As HDLs têm origem hepática e no intestino delgado e são ricas em proteínas. Elas são responsáveis por captar o colesterol remanescente dos quilomícrons, das VLDLs, dos macrófagos e das células espumosas, e assim contribuem para a proteção do leito vascular contra a aterogênese. Após a captação, a HDL retorna ao fígado, sendo que o colesterol é liberado da lipoproteína para os hepatócitos pela ação do receptor SR-B1 (do inglês, Scavenger Receptor class B type 1). Seguidamente, a HDL se dissocia do receptor e reinicia seu ciclo voltando a circular na corrente sanguínea (FALUDI et al., 2017). Os sais biliares também fazem um ciclo de reabsorção hepática e nova liberação pela vesícula biliar, sendo este denominado de circulação êntero- hepática. Todas a quatro vias que envolvem a distribuição do colesterol e seus derivados pelas lipoproteínas plasmáticas, podem ser observadas na figura 4 (NELSON e COX, 2014). 41 Figura 4. Esquema de transporte de lipídios pelo organismo mediado pelas lipoproteínas plasmáticas. Onde se vê: C: Colesterol; CE: Ésteres de colesterila; SR-B1: Receptor sequestrador classe B tipo 1; HDL: Lipoproteína de alta densidade; LDL: Lipoproteína de baixa densidade; IDL: Lipoproteína de densidade intermediária; VLDL: Lipoproteína de densidade muito baixa; FFA: Àcidos graxos livres; TAG: Triacilglicerídeos ou triglicérides. Fonte: Figura extraída e adaptada de NELSON e COX, 2014. 42 3.3. Dislipidemias As dislipidemias são doenças metabólicas diretamente relacionadas com os índices das lipoproteínas plasmáticas, e representam um importante fator de risco de DCVs. Segundo a Diretriz Brasileira de Dislipidemias e Prevenção da Aterosclerose (FALUDI et al., 2017), as dislipidemias podem ser classificadas de acordo com sua etiologia e pela fração lipídica alterada. Quando são categorizadas etiologicamente, podem ser: • Primárias: quando o distúrbio lipídico é de origem genética; • Secundárias: quanto os distúrbios originam-se decorrentes do estilo de vida inadequado, de condições de morbidade ou pelo uso de medicamentos. A segunda classificação refere-se à fração lipídica que está alterada, sendo estas: • Hipercolesterolemias: quando apenas o LDL está elevado (LDL ≥ 160 mg/dL); • Hipertrigliceridemias: onde somente os TGs estão aumentados (TG ≥ 150 mg/dL ou ≥ 175 mg/dL, se a amostra for obtida sem jejum); • Hiperlipidemias mistas: neste caso, tanto o LDL quanto os TGs estão acima dos índices considerados normais; • HDL baixo: onde os índices de HDL estão abaixo da normalidade (homens < 40 mg/dL e mulheres < 50 mg/dL), de um modo isolado ou ainda associado a valores de LDL ou dos TGs elevados. Independentemente de sua origem primária ou secundária, as dislipidemias relacionadas aos níveis elevados de LDL são as mais importantes, isso devido ao aumento significativo do risco de DCVs. A hipercolesterolemia secundária está diretamente relacionada a fatores como a dieta, o sedentarismo e o uso do tabaco. Instituições como a Organização Mundial da Saúde e a American College of Cardiology atestam que juntos esses fatores são os principais causadores de problemas cardiovasculares (STONE et al., 2014; WHO, 2018). As dislipidemias primárias são mais raras. Entretanto, a hipercolesterolemia familiar (HF) aumenta o risco para uma doença 43 aterosclerótica prematura. Isto ocorre, pois, a HF é uma condição genética onde os níveis de LDL podem estar extremamente elevados, independentemente de fatores externos, podendo se manifestar até mesmo na infância (PRÉCOMA et al., 2019). 3.3.1. Tratamentos farmacológicos O tratamento de dislipidemias deve ser iniciado por mudanças no estilo de vida com a adoção de hábitos mais saudáveis, todavia, devido ao risco cardiovascular, a terapia medicamentosa também deve ser adotada. A farmacoterapia consisti no uso regular de drogas hipolipemiantes, tais como: fibratos, niacina, resinas captadoras de ácidos biliares e inibidores de absorção ou da síntese endógena do colesterol (STONE et al., 2014; OLIVEIRA et al., 2017). Os fibratos e a niacina são direcionados, principalmente, ao tratamento das hipertrigliceridemias. Os fibratos agem estimulando a lipólise dos TGs nas VLDLs e nos quilomícrons, além de reduzir a síntese das VLDLs. Desse modo, além de reduzir os níveis de triglicérides, também pode reduzir os níveis de LDL, sendo assim adjuvantes nos tratamentos de hipercolesterolemias (XAVIER, 2005; FERREIRA, 2008). A niacina, também conhecida como ácido nicotínico e vitamina B3, atua reduzindo a ação da lipase tecidual nos adipócitos, dessa maneira leva a uma menor liberação de ácidos graxos livres para a corrente sanguínea, culminando numa redução da síntese de triglicérides pelos hepatócitos (WIERZBICKI, 2004; FALUDI et al., 2017). Para o tratamento das hipercolesterolemias tem-se, principalmente, três modos de ação: os sequestradores de ácidos biliares; os inibidores de absorção intestinal; e os inibidores da síntese endógena. Os sequestradores de ácidos biliares são resinas que atuam fixando-os na luz intestinal. Desse modo, impedem a reabsorção dos sais biliares pela via êntero-hepática, culminando num aumento compensatório na síntese hepática dos mesmos. Para tanto, o fígado aumenta a expressão de receptores de LDL e consequentemente a captação da LDL para assim obter mais moléculas de colesterol e produzir novos sais biliares. Desta forma, obtém-se uma redução de 10 a 15 % da LDL plasmática. Uma reação adversa das resinas é o estímulo da produção endógena de partículas de VLDL e colesterol, consequentemente, 44 eleva os níveis de triglicérides. Em vista disso, as resinas sequestrantes de sais biliares não são indicadas no tratamento de hiperlipidemias mistas. Alguns efeitos colaterais são observados no aparelho digestivo por interferirem na motilidade intestinal. Além disso, as resinas diminuem a absorção intestinal de vitaminas lipossolúveis e do ácido fólico (WIERZBICKI, 2004; FALUDI et al., 2017). A ezetimiba é o atual fármaco que age inibindo a absorção intestinal de colesterol. Seu mecanismo de ação é sobre a proteína transportadora NPC1-L1, que está presente na borda em escova dos enterócitos, e é responsável pela absorção do colesterol obtido pela dieta. Assim, os níveis de colesterol hepáticos são reduzidos e ocorre um estímulo à síntese de receptores de LDL. Como consequência, há uma maior captação da LDL, reduzindo seus níveis plasmáticos de 10 a 25 %. Este fármaco é uma opção terapêutica para pacientes com intolerância às estatinas ou ainda pode ser utilizado em associação com elas, a fim de reduzir as doses e alcançar níveis que diminuam os efeitos adversos nos pacientes (WIERZBICKI, 2004; FLORENTIN et al., 2008). Por sua vez, as estatinas atuam como inibidores da síntese endógena do colesterol, sendo os medicamentos de primeira escolha para o tratamento de hipercolesterolemias, isso devido as evidências relacionadas ao seu uso e a redução da mortalidade associadas a DCVs. As estatinas são fármacos com estrutura similar ao precursor do colesterol, o HMG-CoA (Figura 5), e agem inibindo a ação da enzima HMGR, limitando a síntese de colesterol nos hepatócitos. Com isso, há uma depleção intracelular dos níveis de colesterol, seguida de um estímulo da expressão dos receptores de LDL e, como consequência, há um aumento da captação da LDL pelo fígado. Em virtude disso, os fármacos inibidores da HMGR possuem grande eficácia para a redução dos índices de LDL plasmático, pois apresentam uma dupla ação, reduzindo a síntese endógena de colesterol e aumentando a captação da LDL circundante (MCKENNEY, 2003; PRÉCOMA et al., 2019). 45 Figura 5. Comparação entre as estruturas de 4 estatinas e o HMG-CoA. Fonte: Figura extraída e adaptada de NELSON e COX, 2014. Contudo, muitos efeitos adversos têm sido relacionados ao uso das estatinas, tais como: dor abdominal, diarreia, cefaleia, náuseas, dispepsia, mialgia, fadiga, hepatotoxicidade, rabdomiólise, dentre outros. Os mais graves são a hepatotoxicidade e a rabdomiólise. Considerando que os locais de ação das estatinas são os hepatócitos, a toxicidade hepática deve ser considerada e bem avaliada em pacientes tratados com estes fármacos. Assim, deve-se ter maior atenção em pacientes com histórico de doenças hepáticas ou que fazem uso concomitante de outras substancias tóxicas ao fígado. Outro fator importante é que as estatinas são catabolizadas pelo sistema do citocromo P450, também localizado no fígado, o que ressalta a necessidade de atenção aos possíveis efeitos hepatotóxicos (MANCINI et al., 2016; THOMPSON et al., 2016; FALUDI et al., 2017). As miopatias induzidas pelo uso de estatinas, são as responsáveis por reduzir significativamente a aderência dos pacientes ao tratamento. Segundo Faludi e colaboradores (2017), as queixas musculoesqueléticas respondem por cerca de 65 % dos casos de perda de adesão ao tratamento. Além disso, as miopatias podem evoluir para um quadro de rabdomiólise que é caracterizado por uma necrose muscular que, por sua vez, libera para 46 circulação sanguínea a mioglobina presente em células musculares. Dentre os sintomas da rabdomiólise apresentam-se mialgia, fraqueza muscular e urina escura. Soma-se a isso, o fato de que a mioglobina presente no sangue passa a lesar os rins, podendo culminar num quadro mais grave de insuficiência renal aguda. Ressalta-se que o uso concomitante de estatinas com fibratos, ciclosporinas, antibióticos macrolídeos e antifúngicos azólicos aumentam o risco de desenvolvimento de miopatias mais graves, tais como a rabdomiólise. Isto limita seu uso, por exemplo, em casos de hiperlipidemias mistas, onde se faz necessário o uso concomitante dos fibratos. Em casos de portadores da hipercolesterolemia familiar, o tratamento é sintomático e contínuo, sendo assim o risco de miopatias pode ser potencializado (GULUM e HUME, 2015; MANCINI et al., 2016; MONIZ et al., 2017). 3.3.2. Tratamentos não farmacológicos Em associação com as terapias medicamentosas, o tratamento das dislipidemias deve vir acompanhado por mudanças no estilo de vida. Uma terapia nutricional adequada, acompanhada com a prática de exercícios físicos e da perda de peso devem ser incentivadas aos pacientes. O abandono do sedentarismo com a prática regular de atividades aeróbicas, está associado a redução da morbidade e mortalidade cardiovascular. Além disso, sabe-se que o tabagismo interfere na vasodilatação do endotélio em artérias coronárias e nos leitos microvasculares, aumentando o risco de lesões e do desenvolvimento da doença aterosclerótica (FALUDI et al., 2017; PRÉCOMA et al., 2019). As mudanças nos padrões nutricionais vieram como uma consequência da evolução social. As referências alimentares devem ser resgatadas para uma alimentação saudável destacando-se a seleção dos alimentos, o modo de preparo, a quantidade consumida e as possíveis substituições alimentares. Um bom exemplo é a substituição do consumo excedente de carboidratos, gorduras saturadas e ácidos graxos trans por ácidos graxos poli-insaturados, reduzindo assim o risco cardiovascular. O elevado consumo de carboidratos eleva a glicemia, estimulando a liberação de insulina que, por sua vez, ativa a síntese de ácidos graxos e TG, elevando os níveis séricos destes. Os ácidos graxos trans induzem lesão de endotélio e aumentam as concentrações de LDL. Uma alternativa são os suplementos de ácidos graxos poli-insaturados ômega 3, 47 que podem reduzir a concentração plasmática dos TGs em até 30 % (FALUDI et al., 2017). O consumo de óleos vegetais, cereais, grãos e demais vegetais são fontes de fitosteróis, que possuem uma estrutura parecida à do colesterol. Devido a isso, o consumo destes reduz a absorção intestinal do colesterol, reduzindo os níveis plasmáticos de LDL (CABRAL e KLEIN, 2017). As fibras solúveis sequestram os ácidos biliares no lúmen intestinal, interferindo no ciclo êntero-hepático, e assim estimulam a produção dos mesmos no fígado, reduzindo os níveis de colesterol. Alguns exemplos incluem a aveia, o psyllium, a pectina e a goma-guar, todos esses podem auxiliar na redução dos níveis séricos de LDL (BERNAUD e RODRIGUES 2013; FALUDI et al., 2017). Desde a década de 40, estudos apontam que o consumo elevado de proteínas de origem animal aumenta o risco de DCVs, pois estas trazem junto a si gorduras saturadas e colesterol. Além disso, para as proteínas de origem vegetal tem sido atribuído efeitos benéficos por uma ação farmacológica dos peptídeos originados após sua digestão (SCARAFONI et al. 2007; FERREIRA, 2008; TACO, 2011; PADHI e RAMDATH, 2017). A literatura indica, por exemplo, que o consumo diário de 15 a 30 g de proteína de soja está associado à uma redução ao redor de 5 % de LDL, um aumento em torno de 3 % de HDL e uma redução de até 11 % dos TGs (ANDERSON e BUSH, 2011). Em suma, as indicações são para um consumo moderado de gorduras, eliminado os ácidos graxos trans e controlando o consumo de saturados, sendo priorizada a ingestão de mono e poli-insaturados; a redução do consumo de carboidratos; e a inclusão de carnes magras, leguminosas, frutas e hortaliças na dieta. 3.4. Proteínas vegetais Tradicionalmente, é atribuído ao reino vegetal alegações de saúde, sendo estas relacionadas a diferentes componentes alimentares, tais como: vitaminas, minerais, flavonoides, carotenoides, fibras, lipídios e, em menor proporção, às proteínas e peptídeos. Em sua maioria as propriedades terapêuticas têm sido atribuídas a atividades antioxidantes e anti-inflamatórias. Entretanto, em meio este contexto, as proteínas vegetais, bem como os peptídeos originados da hidrólise destas, tem ganhado destaque por suas propriedades farmacológicas 48 mais complexas, atuando por diversos mecanismos (SCARAFONI et al., 2007; CONSONNI et al., 2011; FERREIRA et al., 2015; PADHI e RAMDATH, 2017; SILVA et al., 2018; MARQUES et al., 2018; AMENGUAL, 2019). Em se tratando do metabolismo lipídico, as proteínas das leguminosas ganham destaque pelo potencial farmacológico diante das dislipidemias. A proteína de soja, por exemplo, foi a mais amplamente estudada, tanto em ensaios em animais (PAK et al., 2006; FASSINI et al 2012; PAK et al., 2012; FERREIRA et al., 2015) quanto em humanos (SIRTORI et al., 2009), sendo comprovado sua capacidade de auxílio no tratamento de hipercolesterolêmias. Devido a isto, o FDA (1999) passou a recomendar a ingestão diária de 25 g de proteína de soja, a fim de reduzir os riscos de DCVs. A fração proteica das leguminosas são constituídas por duas classes principais: as albuminas e as globulinas. Juntas, estas duas classes podem representar até 80 % do total de proteínas, sendo de 8 a 20 % albuminas e de 40 a 60 % globulinas. As globulinas, por sua vez, são subdivididas em duas principais frações: as leguminas e as vicilinas. Essas também são classificadas de acordo com seu coeficiente de sedimentação (S), sendo as leguminas denominadas como 11S e as vicilinas como 7S. As vicilinas constituem-se de oligômeros heterogêneos com uma massa molar compreendida entre 140 e 200 kDa. De modo geral, as 7S possuem de três a quatro subunidades com massa molar entre 40 e 60 kDa cada uma. Dados da literatura apontam que diferentes espécies de leguminosas têm demonstrado frações 7S com características físicas e químicas análogas, tais como: sequência de aminoácidos, digestibilidade, reconhecimento imunológico e atividade biológica (LOURENÇO, 2000; SCARAFONI et al., 2007; FERREIRA, 2013). Estudos apontam que a fração proteica responsável pela atividade hipocolesterolêmica da soja é a 7S, também chamada de β-conglicinina. Dados genéticos postulam que as 7S de diferentes espécies apresentam genes ancestrais comuns. As evidências mostram que algumas 7S possuem grande semelhança na composição e sequência de aminoácidos, sugerindo que suas similaridades decorrem de uma evolução convergente. Isso é demonstrado na forte homologia entre as estruturas primárias da faseolina, vicilina e β- conglicinina, sendo estas, respectivamente, globulinas 7S das espécies 49 Phaseolus vulgaris, Pisum sativum e Glycine max (DOYLE e LUCKOW 2003; SCARAFONI et al., 2007; FERREIRA, 2013). Embora o efeito hipocolesterolêmico tenha sido inicialmente proposto a partir das proteínas de soja, especialmente a vicilina (7S), é possível que esta fração proteica também presente em outras espécies de leguminosas possa desempenhar uma ação semelhante. Outras espécies de leguminosas, tais como: feijões, ervilha, tremoço e grão-de-bico também têm mostrado a capacidade de alterar o metabolismo do colesterol, porém, estas têm recebido menor atenção embora possam exercer efeito semelhante na prevenção das desordens lipídicas (FROTA et al., 2008; RIGAMONTI et al, 2010; FONTANARI et al, 2012; AMARAL et al., 2014; AMARAL et al., 2017). Quando se tratam das 7S dos feijões caupí e azuqui, as mesmas são denominadas de β-vignina (JAYATHILAKE et al. 2018). Ferreira e colaboradores (2015) avaliaram os efeitos das vicilinas isoladas da soja e dos feijões caupí e azuqui, os autores constataram uma importante atividade hipocolesterolêmica, frente ao metabolismo lipídico de ratos dislipidêmicos, quando comparada à droga comercial sinvastatina. A despeito de que o mecanismo de ação dessas proteínas ainda não esteja totalmente elucidado, existem evidências de que os peptídeos originados da digestão gastrointestinal dessas proteínas seriam os responsáveis por suas propriedades biológicas (FERREIRA et al. 2015; SILVA et al. 2018). A literatura sugere que os efeitos terapêuticos estão ligados a peptídeos pequenos, com 3 a 20 resíduos de aminoácidos, gerados após a digestão. Estes peptídeos podem modular o metabolismo lipídico de diferentes modos, tais como: alterações nos mecanismos de absorção e excreção; controle da síntese endógena; alterar a expressão de receptores e; agir sobre enzimas enredadas com o metabolismo lipídico. Contudo, sua atividade está intrinsecamente ligada com a composição e sequência dos aminoácidos presentes nesses peptídeos (AMARAL et al., 2014; MARQUES et al. 2015a; FERREIRA et al. 2015; MARQUES et al. 2015b; AWIKA e DUODU, 2017; HERNANDEZ e MEJIA 2017; SILVA et al. 2018). À vista disso, várias patentes têm sido depositadas com indicações de novas moléculas peptídicas para controlar hipercolesterolemias por diversos mecanismos de ação, tais como: 50 • Inibição da atividade da HMGCoA redutase (CN103739665-A; CN103739666-A) (YANG et al., 2013a; YANG et al., 2013b); • Redução da expressão da HMGCoA redutase (WO2008034117- A2) (GALVEZ, 2006); • Modulação via sistema imunológico (WO2019033040-A1; WO2019136307-A1) (CHEN e CHEN, 2017; WAGNER et al., 2017); • Vacinas (EP3409770-A2; WO2015128287-A1; WO2018189705- A1) (BRUNNER et al., 2012; GALABOVA et al., 2014; JAIN et al., 2017); • Modulação via sistema endócrino (WO2011048614-A2; WO2017210100-A1) (BAHEKAR et al., 2009; DIMARCHI et al.,2016); • Estimulação do efluxo do colesterol (WO2006049597-A1; WO2008156873-A2; WO2009129263-A1; WO2011139819-A2; WO2014144708-A1; WO2016044177-A1; WO2016019333-A1) (SIRCAR et al, 2004; BIANCHI et al., 2007; AMAR e REMALEY, 2008; BIELICKI e JOHANSSON, 2010; BIELICKI et al., 2013; BIELICKI e JOHANSSON, 2014; REMALEY et al., 2014); • Inibição da absorção do colesterol (JP2003238590-A) (NAGAOKA e KANAMARU, 1999). 3.5. Feijão-caupí O feijão-caupí tem origem africana e foi introduzido no Brasil pela colonização portuguesa na Bahia (FREIRE FILHO et al., 2011). No Brasil, o Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento considera feijão apenas os grãos provenientes das espécies Phaseolus vulgaris (L.) e Vigna unguiculata (L.), denominadas de feijão-comum e feijão-caupí, respectivamente (BRASIL, 2008). Contudo, existem várias variedades de feijão-caupí, sendo encontrados grãos com diferentes cores, tamanhos e formatos. Devido a isto, popularmente ele é conhecido por diversos nomes, tais como: feijão-macassa, feijão-de-corda, feijão-de-praia, feijão-da-colônia, feijão-miúdo, feijão-manteiguinha, feijão- fradinho, dentre outros nomes. A variedade feijão-fradinho é a utilizada para o 51 preparo do acarajé, do abará e do feijão-tropeiro, todos pratos típicos da culinária baiana (BRITO et al., 2008; FREIRE FILHO et al., 2011; BASTOS et al., 2016). O caupí possui um teor proteico médio de 25% com um perfil de aminoácidos típico das leguminosas, ricos em lisina e com baixas concentrações de aminoácidos sulfurados. Também é rico em minerais e fibras, sendo um importante componente nutricional das populações rurais e urbanas das regiões Norte e Nordeste do Brasil (IQBAL et al., 2006; BRITO et al., 2008; BASTOS et al., 2016). No Brasil inexistem informações oficiais sobre a produção de feijão-caupí, devido aos órgãos de pesquisas estatísticas publicarem os dados das duas espécies, Phaseolus vulgaris (L.) e Vigna unguiculata (L.), de forma conjunta. Isto impede o conhecimento de forma direta sobre qual a participação de cada espécie na produção total de feijão do país (BASTOS et al., 2016). O continente africano produz por cerca de 95 % da produção mundial de feijão-caupí (Figura 6), sendo os três maiores produtores a Nigéria, o Níger e o Burkina Faso (FAO, 2019). Figura 6. Produção mundial média de feijão-caupí no período de 1994 a 2017. Fonte: Figura extraída e adaptada de FAO, 2019. 52 Além da sua importância nutricional e socioeconômica, o caupí tem ganhado destaque devido os efeitos protetores contra DCVs, vindos de suas proteínas e seus respectivos peptídeos. Ferreira e colaboradores (2015) avaliaram ratos com uma dieta hipercolesterolêmica e tratados, via oral, com a 7S do feijão-caupí e com sinvastatina. Quando avaliados os níveis de colesterol total, VLDL e LDL foi constatado que os animais que receberam a 7S obtiveram uma maior redução dos valores séricos, quando comparados com os animais tratados com a sinvastatina. Além disso, àqueles tratados com a fração proteica do caupí obtiveram um aumento significativo do HDL, o que não ocorreu com os animais tratados com a sinvastatina. Recentemente, Marques e colaboradores (2018) constataram que a fração < 3 kDa originada da hidrólise de proteínas totais do feijão-caupí interfere na absorção intestinal do colesterol. Sua ação foi comprovada pela inibição em células Caco-2 da expressão do mRNA da NPC1-L1, uma das proteínas responsáveis pela absorção intestinal do colesterol. Neste mesmo estudo, foi constatado que o peptídeo de sequência MELNAVSVVHS do feijão-caupí atuou em células HepG2 reduzindo a expressão do mRNA do fator SREBP2. O SREBP2 é uma família de proteínas de ligação aos elementos reguladores de esterol (SREBP, de sterol regulatory element-binding proteins) que modulam a expressão da HMGR e dos receptores de LDL (NELSON e COX 2014). Em suma, os estudos apontam que os peptídeos originados da digestão gastrointestinal da proteína do feijão-caupí são permeáveis ao intestino e podem atuar por diferentes vias para modular o metabolismo do colesterol. Contudo, é necessário identificar quais são esses peptídeos bioativos e seus modos de ação. 4. MATERIAIS E MÉTODOS 4.1. Triagem in silico Os ensaios efetuados para a triagem in silico foram adaptados e realizados a partir do protocolo descrito por Siow e colaboradores (2017). Inicialmente, foram obtidas nos bancos de dados NCBI (CLARK et al., 2016) e UniProt (UniProt, 2017) as sequências primárias da: 53 • Subunidade-1 da 7S do feijão-caupí (NCBI/GenBank Blast: AM905848; UniProtKB: A8YQH5_VIGUN); • Subunidade-1 7S do feijão-azuqui (NCBI/GenBank Blast: AB292246.1; UniProtKB: A4PI98_PHAAN); • Subunidade α’ da β-conglicinina da soja (NCBI/GenBank Blast: AY221105.1; UniProtKB: GLCAP_SOYBN). Seguidamente, as sequências foram alinhadas e comparadas com auxílio da ferramenta ClustalW (LARKIN et al., 2007), a fim de avaliar a homologia sequencial. Após a avaliação da homologia, a subunidade-1 da β-vignina do caupí foi submetida a um processo de hidrólise virtual por ação sequencial das enzimas pepsina (EC 3.4.23.1), tripsina (EC 3.4.21.4) e quimiotripsina (EC 3.4.21.1), com o auxílio do programa BIOPEP (MINKIEWICZ et al. 2008). Os peptídeos gerados pela hidrólise in silico foram então avaliados quanto a probabilidade de apresentarem alguma bioatividade, para tanto foi utilizado o programa PEPTIDE RANKER (MOONEY et al. 2012). Assim, foi obtido o PRScore, variando de 0,000 a 1,000, sendo que foi tomado como ponto de corte dos peptídeos com potencial bioativo, aqueles que obtiveram um score ≥ 0,500. Posteriormente, os peptídeos que apresentaram score (PRScore) igual ou superior a 0,500 foram avaliados quanto a possibilidade de ligação na HMGR, para tanto foi utilizado o programa PEPSITE2 (TRABUCO et al. 2012). Foram utilizadas as estruturas cristalográficas da HMGR com os inibidores comerciais no sítio ativo, sendo estes: 1HW9 (Sinvastatina); 1HW8 (Mevastatina); 1HWL (Rosuvastatina); 1HWK (Atorvastatina); 1HWI = (Fluvastatina); 1HWJ = (Cerivastatina); 1T02 (Estatinas De Classe II). A previsão de ligação do peptídeo foi determinada pelo p-value, considerando que valores compreendidos entre 0,00 a 0,25 prevê a ligação do peptídeo avaliado sobre a estrutura da enzima HMGR. 4.2. Ensaios de acoplamento molecular As estruturas dos peptídeos triados e do fármaco sinvastatina foram desenhadas no software MarvinSketch (MARVIN, 2019). Sequencialmente, os volumes das moléculas dos peptídeos foram comparados com a molécula da 54 sinvastatina utilizando o programa PyMOL (PyMOL, 2019), a fim de avaliar as dimensões da caixa de busca para viabilizar o estudo de acoplamento molecular. Os cálculos de acoplamento molecular foram realizados no programa AutoDock-VINA (TROTT e OLSON, 2010), utilizando o protocolo de encaixe por ajuste induzido. A região de interação foi definida nas coordenadas cristalográficas (X = 3,93; Y = -9,20; Z = -11,33) correspondentes ao sitio ativo da estrutura do cristal da HMGR com a sinvastatina (PDB ID: 1HW9). As dimensões da caixa de busca foram definidas entre 10 e 14 Å, utilizando como critério de escolha das posições mais próximas daquela observada da sinvastatina no cristal, um valor de RMSD ≤ 2,0 Å. Por fim, as 4 melhores posições foram selecionadas na etapa de análise visual. 4.3. Síntese dos peptídeos Os peptídeos triados pelos ensaios in silico e os novos derivados desenhados foram sintetizados manualmente utilizando a metodologia de síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS), com o protocolo Fmoc/tBu (Fmoc: 9-fluorenilmetiloxicarbonil, grupo protetor α-amino; tBu: t-butil, grupo protetor das cadeias laterais). Esse método fundamenta-se na adição de resíduo por resíduo para o crescimento da cadeia peptídica que, por sua vez, está presa covalentemente pelo seu aminoácido C-terminal aos sítios reativos existentes em um suporte sólido (resina), por meio de seu grupo carboxila (MERRIFIELD, 1963; PICCOLI, 2019). Dois tipos de resinas foram empregadas com o intuito de obter peptídeos com diferentes características na sua porção C-terminal. O primeiro tipo empregado foi a resina Wang para obtenção de peptídeos com a carboxila C- terminal livre e; o segundo tipo foi a resina Rink Amida, a fim de obter peptídeos com uma carboxamida na extremidade C-terminal. Para os acoplamentos foram utilizados Fmoc-aminoácidos e, como reagentes de ativação dos grupos carboxilas, foram utilizados N,N- diisopropilcarbodiimida (DIC) e 1-Hidroxibenzotriazol (HOBt). Todos os Fmoc- aminoácidos e reagentes foram utilizados com 2 vezes de excesso em relação à quantidade de grupos reativos na resina inicial. Os grupos protetores Fmoc são base-lábeis, assim sendo foram removidos pela lavagem com 20% 4-metil-piperidina/DMF durante 1 e 20 min. 55 Após cada etapa de acoplamento e desproteção foram efetuadas lavagens intercaladas com N,N-dimetilformamida (DMF) e diclorometano (DCM), para eliminação do excesso de reagentes e subprodutos. Para atestar que o acoplamento e a desproteção foram eficientes, foi realizado o teste de ninidrina após cada etapa. Este reagente, a altas temperaturas, reage com grupos amino livres, produzindo um composto de cor azulada (KAISER et al., 1970). 4.4. Reação de clivagem Após a síntese, os peptídeos foram retirados do suporte sólido por uma reação de clivagem. Foram utilizadas diferentes soluções as quais continham: o ácido trifluoracético (TFA), responsável pela clivagem e; o triisopropilsilano (TIS), o 1,2-etanoditiol (EDT) e a água ultrapura, como supressores de reações colaterais. Para os peptídeos que continham resíduos de Cys ou Met foi utilizada uma mistura na proporção de 94 % TFA : 2,5 % Água : 2,5 % EDT : 1 % TIS. Os outros peptídeos foram clivados com a seguinte proporção 95 % TFA : 2,5 % Água : 2,5 % TIS. As misturas foram submetidas a agitação branda por 2 h em temperatura ambiente. Após 2 h, uma solução contendo água ultrapura e acetonitrila (ACN) (50:50, v/v) foi adicionada, seguida de centrifugação para separar a resina do peptídeo. Por fim, o sobrenadante contendo o peptídeo bruto foi liofilizado. Todo o procedimento de síntese dos peptídeos em fase sólida e clivagem pode ser observado resumidamente na figura 7. 56 Figura 7. Esquema simplificado da síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS). Fonte: Esquema extraído de PICCOLI, 2019. 57 4.5. Purificação e caracterização dos peptídeos Os peptídeos sintetizados foram purificados e caracterizados utilizando as técnicas de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) e espectrometria de massas. A purificação do peptídeo bruto foi realizada em CLAE em modo semipreparativo utilizando coluna de fase reversa C12 Jupiter Proteo Phenomenex® (25 cm x 10 mm; partícula de 10 μm), com solução A (água contendo 0,045% TFA) e solução B (acetonitrila contendo 0,036% TFA), com um fluxo de 5 mL/min; e detecção UV em 220 nm. A pureza foi determinada em CLAE no modo analítico com coluna de fase reversa C18 (15 cm x 4,6 mm; partícula de 5 μm); o gradiente utilizado foi de 5 a 95% de solução B em 30 min com um fluxo de 1 mL/min; a detecção foi obtida com UV em 220 nm. A determinação da massa molar foi obtida utilizando um espectrômetro de massas com ionização electrospray, atuando no modo de ionização positiva e analisador de massas do tipo Ion Trap. 4.6. Ensaio de inibição da HMGR in vitro Por meio de ensaios in vitro, os peptídeos sintetizados foram avaliados, em triplicata, quanto à capacidade de inibição da HMGR, de acordo com metodologia proposta por Hulcher e Oleson (1973), utilizando kit HMG-CoA reductase assay (Sigma-Aldrich®). O princípio do ensaio está na medição espectrofotométrica da redução da absorbância em 340 nm. Este decréscimo representa a oxidação do NADPH pela ação da subunidade catalítica da HMGR na presença do substrato HMG-CoA. A leitura da absorbância (340 nm) foi realizada utilizando um espectrofotômetro UV/Vis, marca Perkin Elmer, modelo Lambda 1050 com duplo feixe. Os ensaios foram realizados no modo de leitura cinética, medindo a absorbância a cada 5 segundos durante 5 minutos. A pravastatina foi utilizada como controle positivo de inibição. Os resultados foram calculados pela atividade específica em μmol/mim/mg-proteína (U/mgP) e expressos em percentuais de inibição. A reação da HMGR segue o seguinte esquema: HMG-CoA + 2NADPH + 2H+ → Mevolanato + 2NADP+ + CoA-SH 58 Após determinar quais os peptídeos com maiores atividades inibitórias, foram obtidas curvas analíticas com diferentes concentrações de cada peptídeo, relacionando o logaritmo da concentração pelo percentual de inibição. Seguidamente, foram avaliados os coeficientes de determinação (R²), e por fim obtidas as respectivas equações das retas para cálculo da concentração para 50 % da inibição (IC50). 4.7. Análise estatística Todos os resultados foram obtidos em duplicata de ensaios, sendo que de cada replicata foram obtidos 3 percentuais de inibição, calculados em faixas de tempo distintas. Ao total 6 percentuais de inibição (3 de cada replicata) foram utilizados para os cálculos estatísticos. Os dados foram tratados no software Statistica 7.1. A avaliação da normalidade da distribuição foi realizada pelo Shapiro-Wilk W test, seguidamente, foi aplicado o Tukey HSD Test para avaliar as diferenças estatísticas entre as médias. O intervalo de confiança definido foi de 95%. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO Inicialmente a estratégia adotada para obtenção dos peptídeos do feijão- caupí seguia técnicas clássicas de isolamento, hidrólise, fracionamento e sequenciamento dos peptídeos a