ALINE MIRANDA PRIETO Avaliação de Reparo de DNA e Atividade Antioxidante do Extrato Etanólico e Substâncias Isoladas de Casearia sylvestris Tese apresentada à Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade Estadual Paulista - UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia. Orientadora: Profa. Dra. Christiane Pienna Soares Coorientadora: Profa. Dra. Eliana Aparecida Varanda Coorientadora: Profa. Dra. Valéria Valente Araraquara - SP 2012 Ficha Catalográfica Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas UNESP – Campus de Araraquara Prieto, Aline Miranda P494a Avaliação de Reparo de DNA e Atividade Antioxidante do Extrato Etanólico e Substâncias Isoladas de Casearia sylvestris / Aline Miranda Prieto. – Araraquara, 2012 155 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia Orientador: Christiane Pienna Soares Coorientador: Eliana Aparecida Varanda Coorientador: Valéria Valente 1. Casearia sylvestris. 2. Casearinas. 3. Cometa. 4. Reparo de DNA. 5. Antioxidante. I. Soares, Christiane Pienna, orient. II. Varanda, Eliana Aparecida, coorient. III. Valente, Valéria, coorient. IV. Título. CAPES: 40300005 AGRADECIMENTOS RESUMO Trabalhos demonstraram que derivados da planta Casearia sylvestris protegem o DNA de danos. Dessa forma, este trabalho visa avaliar por quais mecanismos essa proteção ocorre. Os produtos naturais avaliados foram o extrato etanólico das folhas de C. sylvestris e os diterpenos clerodânicos obtidos deste extrato: casearinas B, D e X e caseargrewiina F. Para a avaliação dos efeitos propostos foram utilizadas como modelo as linhagens celulares HepG2, MRC5, XP4PA e Hepa 1c1c7. Primeiramente, os produtos naturais foram avaliados com relação à sua atividade citotóxica pelo teste do MTT e ensaio de sobrevivência clonogênica nos tempos de 24 e 48 h, obtendo-se o IC50 e o IC20. Em seguida, foi realizado o ensaio de genotoxicidade do cometa no tempo de 24 h utilizando-se incubação com a enzima FPG nas linhagens HepG2, MRC5 e XP4PA. Os produtos naturais se mostraram genotóxicos mesmo em pequenas concentrações. Após este ensaio, foi avaliada a antigenotoxicidade dos produtos naturais já nas concentrações pouco genotóxicas e não citotóxicas por 24 h. Para tanto, as células HepG2 foram expostas ao mutágeno peróxido de hidrogênio (H2O2 - 1mM) e pré e pós-tratadas com os produtos naturais. E, as linhagens MRC5 e XP4PA foram expostas à radiação ultravioleta C (UVC) e pré e pós-tratadas com os produtos naturais. Para a linhagem HepG2, o extrato etanólico, as casearinas B e D apresentaram inibição de danos fortes nas maiores concentrações testadas. Já para a linhagem MRC5 somente a casearina B foi capaz de produzir inibição moderada na concentração de 0,04 μM. Adicionalmente, foi verificada a resposta antiapoptótica dos produtos naturais pelo método da anexina-V-FITC/PI nas linhagens submetidas aos mesmos mutágenos do ensaio do cometa, aplicando-se o protocolo de pós-tratamento com os produtos naturais. Os diterpenos clerodânicos aumentaram porcentagem de células vivas e diminuíram a porcentagem de células apoptóticas nas maiores concentrações para a linhagens HepG2. Na linhagem MRC5, foi possível observar o mesmo efeito antiapoptótico somente para a casearina B (0,04 μM). Já para a linhagem XP4PA não foi observada alteração no perfil de morte celular. Ainda, foi avaliada a atividade antioxidante ex-vivo através de ensaio com DCFDA (diacetato de diclorfluoresceína) em células HepG2 previamente tratadas com os produtos naturais e em seguida, expostas ao H2O2 (1mM). O extrato etanólico as casearinas B e X e a caseargrewiina F reduziram significativamente a quantidade de ROS (espécies reativas de oxigênio) quando comparados com o controle de veículo, entretanto, não foram tão potentes quanto a quercetina, um antioxidante derivado de produto natural. Dentre os produtos naturais, aquele que foi mais eficaz no ensaio de atividade antioxidante foi a casearina B. Adicionalmente, foi realizado o ensaio de indução da enzima quinona redutase na linhagem Hepa 1c1c7. Nenhum dos produtos naturais se mostrou capaz de induzir a quinona redutase em níveis significantes. Pode-se concluir que os produtos naturais apesar de exibirem característica genotóxica, também são capazes de auxiliar na remoção de danos ao DNA, e em baixas concentrações foram capazes de reduzir os níveis de ROS gerados pelo H2O2. ABSTRACT Studies have shown that Casearia sylvestris derivatives protect DNA from damage. Thus, the aim of this study was to evaluate the mechanisms through which this protection occurs. The samples used in this study were the ethanolic extract of C. sylvestris leaves and the clerodane diterpenes obtained from this extract, including casearins B, D and X, and caseargrewiin F. The following cell lines were used: HepG2, MRC5, XP4PA and Hepa 1c1c7. First, all samples were assessed for their cytotoxic activity by using both the MTT assay and the clonogenic survival assay after 24 and 48 h of exposure, yielding the IC50 and IC20. Afterwards, the genotoxicity of the samples was assessed within 24 h following incubation with the samples using the FPG enzyme in the cell lines HepG2, MRC5 and XP4PA. The compounds proved to be genotoxic at all concentrations tested. Subsequently, the antigenotoxicity of the samples was assessed at concentrations that were at very low levels of cytotoxic or genotoxic after 24 h. HepG2 cells were exposed to the mutagen hydrogen peroxide (H2O2, 1 mM) and either pre or post-treated with the samples. Additionally, the cell lines MRC5 and XP4PA were exposed to ultraviolet C (UVC) and either pre or post-treated with the compounds. For the ethanolic extract in the HepG2 cell line, the casearins B and D showed strong inhibition of damage at the highest concentrations tested. In the MRC5 cell line, only casearin B was able to produce moderate inhibition (at 0.04 mM). Additionally, the anti-apoptotic response of the samples was assessed by an anexinV-FITC/PI assay in cell lines that were exposed to the same mutagens used in the comet assay, followed by post-treatment with the samples. The clerodane diterpenes, at high concentrations, increased the percentage of live cells and decreased the percentage of apoptotic cells in HepG2 cells. In MRC5 cells, it was possible to observe the same anti-apoptotic effect only for casearin B (0.04 mM). In XP4PA cells, no change was observed in the cell death profile. In addition, antioxidant activity was assessed by using DCFDA (dichlorofluorescein diacetate) in HepG2 cells pre-treated with the samples and then exposed to H2O2 (1 mM). The ethanolic extract, the casearins B and X, and caseargrewiin F significantly reduced the amount of ROS when compared with the vehicle control; however, none of the samples were as potent as quercetin, an antioxidant derived from natural products. Among the samples, the one that was the most effective as an antioxidant was casearin B. Additionally, the induction of the quinone reductase enzyme in the Hepa 1c1c7 cell line was assessed; however, none of the samples significantly induced quinone reductase levels. It can be concluded that, although the samples are genotoxic, they are also able to assist in the removal of DNA damage, and, at low concentrations, they are capable of reducing ROS levels produced by H2O2. LISTA DE FIGURAS Capítulo 1 Figura 1: Casearia sylvestris ............................................................................................................................... 20 Figura 2: Fórmula estrutural dos diterpenos clerodânicos obtidos do extrato etanólico de C. sylvestris utilizados neste trabalho ................................................................................................................................ 22 Figura 3: Exemplos de modificações oxidativas encontradas nas bases nitrogenadas de DNA de mamíferos . 26 Figura 4: Fotolesões encontradas no DNA após irradiação com UV .................................................................. 30 Figura 5: Algumas proteínas envolvidas na via de NER ...................................................................................... 32 Figura 6: Classificação dos tipos celulares presentes no ensaio de apoptose por anexina-V-FITC/PI ............... 45 Figura 7: Genotoxicidade dos produtos naturais de C. sylvestris pelo ensaio do cometa ................................. 52 Figura 8: Antigenotoxicidade dos produtos naturais de C. sylvestris em células HepG2 ................................... 54 Figura 9: Antigenotoxicidade dos produtos naturais de C. sylvestris em células MRC5 sem incubação com S956 Figura 10: Antigenotoxicidade dos produtos naturais de C. sylvestris em células MRC5 com incubação com S957 Figura 11: Antigenotoxicidade dos produtos naturais de C. sylvestris em células XP4PA sem incubação com S958 Figura 12:Antigenotoxicidade dos produtos naturais de C. sylvestris em células XP4PA com incubação com S959 Figura 13: Imagem ilustrativa dos nucleóides obtidos no ensaio do cometa e de sua análise pelo programa Tritek CometScore® ......................................................................................................................................... 60 Figura 14: Ensaio de apoptose pelo método da anexina-V – Iodeto de Propídeo em células HepG2 expostas ao H2O2 (1mM) e pós tratadas 24h com os produtos naturais de C. sylvestris .............................................. 61 Figura 15: Ensaio de apoptose pelo método da anexina-V – Iodeto de Propídeo em células MRC5 expostas ao UVC (26,5 J/m2) e pós tratadas com os produtos naturais de C. sylvestris .................................................... 62 Figura 16: Ensaio de apoptose pelo método da anexina-V – Iodeto de Propídeo em células XP4PA expostas ao UVC (3,59 J/m2) e pós tratadas com os produtos naturais de C. sylvestris ............................................... 63 Figura 17: Avaliação da atividade antioxidante na linhagem celular HepG2 tratada por 24 h com o extrato etanólico de C. sylvestris frente às ROS geradas pelo H2O2 (1mM) utilizando-se o fluoróforo DCFDA .......... 64 Figura 18: Avaliação da atividade antioxidante na linhagem celular HepG2 tratada por 24 h com a casearina B frente às ROS geradas pelo H2O2 (1mM) utilizando-se o fluoróforo DCFDA .................................................. 65 Figura 19: Avaliação da atividade antioxidante na linhagem celular HepG2 tratada por 24 h com a casearina D frente às ROS geradas pelo H2O2 (1mM) utilizando-se o fluoróforo DCFDA .................................................. 66 Figura 20: Avaliação da atividade antioxidante na linhagem celular HepG2 tratada por 24 h com a caseargrewiina F frente às ROS geradas pelo H2O2 (1mM) utilizando-se o fluoróforo DCFDA ...................... 67 Figura 21: Avaliação da atividade antioxidante na linhagem celular HepG2 tratada por 24 h com a casearina X frente às ROS geradas pelo H2O2 (1mM) utilizando-se o fluoróforo DCFDA .................................................. 68 Capítulo 2 Figura 1: Epidemiologia do câncer de pulmão com relação ao consumo de cigarros nos EUA de 1900 a 2000 ................................................................................................................................................................ 98 Figura 2: Fórmula estrutural das substâncias utilizadas neste estudo ............................................................. 100 Figura 3: Sistema de exposição ao fumo Teague Entreprises .......................................................................... 104 Figura 4: Níveis de adutos de DNA no pulmão de camundongos adultos Swiss ICR(CD-1®) expostos dede o nascimento à fumaça de cigarro em variáveis concentrações de PT por 28 dias ........................................ 113 Figura 5: Dano oxidativo avaliado em termos de 8-hydroxy-2’-deoxyguanosine (8-oxo-dGuo), no pulmão de camundongos Swiss ICR(CD-1®) expostos desde o nascimentos a diferentes concentrações de PT por 28 dias ................................................................................................................................................................ 114 Figura 6: Ensaio de MTT para os produtos naturais testados nos ensaios de quimioprevenção frente ao CS em células H727.................................................................................................................................................. 115 Figura 7: Resposta de viabilidade dos quimiopreventivos sem e com associação às nanopartículas em células H727 através do ensaio de MTT ................................................................................................................... 116 Figura 8: Ensaio do cometa para avaliação da resposta ao dano de DNA de NAC sozinho e associado às nanopartículas em células H727................................................................................................................... 117 Figura 9: Ensaio do cometa para avaliação da resposta ao dano de DNA de PEITC sozinho e associado às nanopartículas em células H727................................................................................................................... 118 Figura 10: Ensaio do cometa para avaliação da resposta ao dano de DNA de Resveratrol sozinho e associado às nanopartículas em células H727 .............................................................................................................. 119 Figura 11: Nucleóides obtidos no ensaio de genotoxicidade ........................................................................... 120 Figura 12: Ensaio de morte celular com NAC em células H727 ........................................................................ 120 Figura 13: Ensaio de morte celular com PEITC em células H727...................................................................... 121 Figura 14: Ensaio de morte celular com Resveratrol em células H727 ............................................................ 122 Figura 15: Análise da expressão relativa de DICER frente ao GAPDH, realizando-se o silenciamento do gene e tratamento com CS ....................................................................................................................................... 123 LISTA DE TABELAS Capítulo 1 Tabela 1: Comparação entre as concentrações inibitórias obtidas no tempo de 24 h para os produtos naturais derivados de C. sylvestris nas linhagens HepG2, MRC5 e XP4PA ..................................................... 49 Tabela 2: Comparação entre as concentrações inibitórias obtidas no tempo de 48 h para os produtos naturais derivados de C. sylvestris nas linhagens HepG2, MRC5 e XP4PA ..................................................... 50 Tabela 3: Ensaio de indução da enzima quinona redutase em células Hepa 1c1c7 tratadas com os produtos naturais de C. sylvestris por 48 h .................................................................................................................... 69 Capítulo 2 Tabela 1: Concentração de particulado total administrado aos diferentes grupos de camundongos ............ 113 Tabela 2: Qualidade dos RNAs extraídos para o ensaio de silenciamento de DICER e resposta frente ao CS em células H727.................................................................................................................................................. 123 ABREVIAÇÕES UTILIZADAS - comprimento de onda -MEM – meio mínimo essencial de Eagle modificação alfa μCi – micro Curie 6-4 PPs - (6,4) fotoprodutos 7-AD - 7-amino-actinomicina D 8-oxo-dGuo - 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina ANOVA – análise de variância AP - sítios apurínicos ou apirimidínicos ARE - elemento de resposta antioxidante B – casearina B BER – reparo de DNA por excição de bases cDNA – DNA complementar CN – controle negativo CPD - dímero de pirimidina ciclobutano ou dímero de ciclobutano dipirimidina cpm - contagens por minuto CS - condensado de fumaça de cigarro CV – controle de veículo cv – cristal violeta D – casearina D DCFDA - diacetato de diclorfluoresceína DMEM – meio de Eagle modificado por Dulbecco DMSO – dimetilsulfóxido DNA - ácido desoxirribonucleico E – extrato etanólico de C. sylvestris EDTA - ácido etilenodiamino tetra-acético EFS - extração em fase sólida EP – erro padrão F – caseargrewiina F FITC – isotiocianato de fluoresceína FPG - DNA glicosilase formamidopirimidina GAPDH - gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase GGR – reparo de DNA global do genoma IC20 - concentração inibitória de 20 % IC50 - concentração inibitória de 50 % IR – índice de redução J - joules Keap1 - Kelch-like proteína associada à ECH KH2PO4 – fosfato básico de potássio miRNAs – micro RNAs mM – milimolar mRNA – RNA mensageiro MTT - brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio] NAC - N-acetilcisteína NADP – nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato NADPH - nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato hidrogenada NER - reparo de DNA por excisão de nucleotídeos Nrf2 – Fator nuclear relacionado à E2 fator 2 OptiMEM - meio reduzido de soro – modificação do meio mínimo essencial de Eagle PBS - phosphate buffered saline (solução salina tamponada com fosfato) PCR – reação em cadeia da polimerase PEITC - Feniletil-isotiocianato pH - potencial hidrogeniônico PI – iodeto de propídeo PT - particulado Q – quercetina qPCR – PCR quantitativa em tempo real QR – quinona redutase RAD23B – proteína do reparo de excisão de DNA homóloga B RES - Resveratrol RNA – ácido ribonucleico ROS – espécies reativas de oxigênio RPMI – meio do instituto e memorial Roswell Park SC – sobrevivência clonogênica siRNA – pequeno RNA de interferência TCR – reparo de DNA acoplado à transcrição TFIIH – fator de transcrição II H TLC - cromatografia em camada fina multidirecional U – unidades UV – ultravioleta UVA – ultravioleta A UVB – ultravioleta B UVC - ultravioleta C V – volts v – volume X – casearina X x g – número de vezes do valor da gravidade XP - Xeroderma pigmentosum XPC – proteína de Xeroderma pigmentosum deficiente no grupo de complementação C XPE – proteína de Xeroderma pigmentosum deficiente no grupo de complementação E SUMÁRIO Capítulo 1 ........................................................................................................................................................... 19 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................. 20 1.1. Casearia sylvestris ........................................................................................................................................ 20 1.1.2. Diterpenos clerodânicos de C. sylvestris .................................................................................................. 21 1.1.3. Produtos naturais extraídos de C. sylvestris e seus efeitos no DNA ........................................................ 23 1.2. Mecanismos de antimutagênese ................................................................................................................ 24 1.3. Agentes causadores de danos ao DNA e mecanismos de redução ou remoção desses danos .................. 24 1.3.1. Dano oxidativo ao DNA ............................................................................................................................ 25 1.3.2. Produtos naturais e enzimas com atividade antioxidante ....................................................................... 27 1.3.3. Combate às lesões oxidativas no DNA ..................................................................................................... 28 1.3.4. Danos no DNA provocados por radiação UV ............................................................................................ 29 1.3.5. Reparo de lesões ocasionadas por UV - Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) ............................... 30 1.4. Apoptose e reparo de DNA .......................................................................................................................... 32 1.5. Ativação da enzima quinona redutase ........................................................................................................ 33 2. OBJETIVO GERAL ............................................................................................................................................ 33 2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................................................. 33 3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................................................................. 34 3.1. Obtenção do extrato etanólico de C. sylvestris ........................................................................................... 34 3.2. Obtenção dos diterpenos clerodânicos de C. sylvestris .............................................................................. 35 3.3. Solubilização dos produtos naturais ............................................................................................................ 35 3.4. Cultura de células ........................................................................................................................................ 36 3.5. Avaliação da citotoxicidade ......................................................................................................................... 37 3.5.1. Ensaio do MTT .......................................................................................................................................... 37 3.5.2. Ensaio de sobrevivência clonogênica ....................................................................................................... 38 3.6. Ensaio do cometa ........................................................................................................................................ 39 3.6.1. Cálculo da concentração do peróxido de hidrogênio ............................................................................... 40 3.6.2. Atividade genotóxica dos produtos naturais de C. sylvestris ................................................................... 41 3.6.3. Atividade antigenotóxica dos produtos naturais de C. sylvestris ............................................................. 42 3.7. Ensaio de morte celular – Anexina-V-FITC/PI .............................................................................................. 43 3.8. Análise da atividade antioxidante em células HepG2 utilizando DCFDA .................................................... 45 3.9. Análise da indução da enzima quinona redutase ........................................................................................ 46 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................................................................... 47 5. RESULTADOS .................................................................................................................................................. 48 5.1. Avaliação da citotoxicidade pelos ensaios de MTT e sobrevivência clonogênica ....................................... 48 5.2. Ensaio de genotoxicidade dos produtos naturais de C. sylvestris ............................................................... 50 5.3. Ensaio de antigenotoxicidade dos produtos naturais extraídos de C. sylvestris ......................................... 53 5.4. Ensaio de morte celular - Anexina-V-FITC/PI ............................................................................................... 60 5.5. Atividade antioxidante em células HepG2 utilizando DCFDA ..................................................................... 64 5.6. Ensaio de quinona redutase ........................................................................................................................ 69 6. DISCUSSÃO .................................................................................................................................................... 70 7. CONCLUSÕES ................................................................................................................................................. 78 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................................................... 80 Capítulo 2 ........................................................................................................................................................... 95 ESTÁGIO DE DOUTORADO NO EXTERIOR .......................................................................................................... 96 APLICAÇÃO DE MÉTODOS PARA ANÁLISE DE QUIMIOPREVENÇÃO in vivo E ex vivo CONTRA MUTÁGENOS DA FUMAÇA DE CIGARRO .................................................................................................................................... 96 1. INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................. 98 1.1. Câncer de pulmão e o fumo de derivados do tabaco.................................................................................. 98 1.2. Mecanismos de quimioprevenção .............................................................................................................. 99 1.3. Quimiopreventivos quimiopreventivos ..................................................................................................... 100 1.4. Nanopartículas........................................................................................................................................... 101 1.5. O papel do gene DICER no processamento de miRNAs ............................................................................ 101 2. OBJETIVO GERAL .......................................................................................................................................... 102 2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................................ 102 3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................................................................... 103 3.1. Avaliação de biomarcadores intermediários em tecidos de pulmão de camundongos Swiss ICR (CD-1®) expostos à fumaça de cigarro ....................................................................................................................... 103 3.1.1. Exposição dos camundongos à fumaça de cigarro ................................................................................. 103 3.1.2. Tratamentos ........................................................................................................................................... 103 3.1.3. Detecção dos adutos de DNA ................................................................................................................. 104 3.1.4. Análise da 8-Hidroxi-2’-Deoxiguanosina em células de pulmão de camundongos................................ 105 3.2. Quimioprevenção dos danos causados pelo condensado da fumaça de cigarro em células H727 utilizando nanopartículas ............................................................................................................................. 106 3.2.1. Substâncias ............................................................................................................................................. 106 3.2.2. Nanopartículas lipossômicas catiônicas ................................................................................................. 107 3.2.3. Cultura de células ................................................................................................................................... 107 3.2.4. Protocolo de quimioprevenção .............................................................................................................. 108 3.2.5. Ensaio de MTT ........................................................................................................................................ 108 3.2.6. Ensaio do cometa ................................................................................................................................... 109 3.2.7. Ensaio de morte celular – Anexina-V-APC/7-AD .................................................................................... 110 3.3. Regulação da expressão do gene de DICER por CS em células H727 ........................................................ 111 3.3.1. Silenciamento de DICER ......................................................................................................................... 111 3.3.2. PCR em tempo real (qPCR) ..................................................................................................................... 112 4. RESULTADOS ................................................................................................................................................ 113 4.1. Avaliação de biomarcadores intermediários em tecidos de pulmão de camundongos Swiss ICR (CD-1®) expostos à fumaça de cigarro. ...................................................................................................................... 113 4.1.1. Quantificação de particulado total (PT) nos diferentes grupos de camundongos ................................. 113 4.1.2. Detecção de adutos de DNA em pulmão de camundongos expostos à fumaça de cigarro................... 113 4.1.3. Análise da 8-Hidroxi-2’-Deoxiguanosina em células de pulmão de camundongos................................ 114 4.2. Quimioprevenção dos danos causados pelo condensado da fumaça de cigarro em células H727 utilizando nanopartículas ............................................................................................................................. 115 4.2.1. Ensaio de MTT para determinação do IC20 dos quimiopreventivos usados no teste de quimioprevenção em células H727. .......................................................................................................................................... 115 4.2.2. Ensaio de MTT para comparação da resposta de viabilidade dos quimiopreventivos não associados e associados às nanopartículas. ...................................................................................................................... 116 4.2.3. Ensaio do cometa de genotoxicidade e antigenotoxicidade frente ao CS com os quimiopreventivos NAC, PEITC e Resveratrol em células H727. ................................................................................................. 117 4. 2.3.1. Ensaios de genotoxicidade e antigenotoxicidade com o quimiopreventivo NAC .............................. 117 4.2.3.2. Ensaios de genotoxicidade e antigenotoxicidade com o quimiopreventivo PEITC ............................. 118 4.2.3.3. Ensaios de genotoxicidade e antigenotoxicidade com o quimiopreventivo Resveratrol ................... 119 4.2.4. Ensaio de morte celular – AnexinaV/7-AD para avaliação comparativa dos efeitos dos quimipreventivos em células H727. .......................................................................................................................................... 120 4.2.4.1. Ensaio de morte celular para o quimiopreventivo NAC ...................................................................... 120 4.2.4.2. Ensaio de morte celular para o quimiopreventivo PEITC .................................................................... 121 4.2.4.3. Ensaio de morte celular para o quimiopreventivo Resveratrol .......................................................... 122 4.3. Avaliação do efeito da expressão de DICER frente ao CS em células H727 previamente silenciadas para este gene. ..................................................................................................................................................... 123 5. DISCUSSÃO .................................................................................................................................................. 124 5.1. Avaliação de biomarcadores intermediários em tecidos de pulmão de camundongos Swiss ICR (CD-1®) expostos à fumaça de cigarro ....................................................................................................................... 124 5.2. Quimioprevenção dos danos causados pelo condensado da fumaça de cigarro em células H727 utilizando nanopartículas. ............................................................................................................................ 125 5.3. Avaliação do efeito da expressão de DICER frente ao CS em células H727 previamente silenciadas para este gene. ..................................................................................................................................................... 129 6. CONCLUSÕES ............................................................................................................................................... 130 7. CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................................................. 130 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ....................................................................................................................... 131 Capítulo 3 ......................................................................................................................................................... 137 Capítulo 1 20 1. INTRODUÇÃO Atualmente é notável a gama de estudos que buscam investigar produtos naturais isolados de plantas que protejam o DNA de danos, e, adicionalmente, elucidando os possíveis mecanismos pelos quais estes danos ao DNA são reduzidos. Desta forma, há trabalhos que avaliam a ativação de enzimas detoxificadoras como a quinona redutase (QR) (HOSHINO et al., 2010), atividade antigenotóxica (SKANDRANI et al., 2010) e/ou antimutagênica (MALINI et al., 2010), atividade antioxidante (MIGUEL et al., 2010), ativação de vias de reparo de DNA (DUARTE et al., 2009) entre outras atividades. 1.1. Casearia sylvestris Casearia sylvestris, Swartz (Salicaceae) (CHASE et al., 2002) é uma árvore ou arbusto amplamente distribuída no Brasil desde o Amapá até o Rio Grande do Sul, sendo encontrada tanto no Cerrado, Mata Atlântica e Floresta Amazônica. Seu nome popular mais conhecido é guaçatonga (Figura 1). Em terras internacionais é possível encontrar C. sylvestris no México e Antilhas (BASILE et al., 1990). Figura 1: Casearia sylvestris. A) Imagem da árvore que possui de dois a seis metros de altura; B) Detalhe com maior aproximação das folhas. A B 21 Os produtos naturais de C. sylvestris são conhecidos por sua atividade antiinflamatória, propriedades cicatrizantes e antiúlcera (BASILE et al., 1990; BORGES et al., 2000; SERTIÉ et al., 2000). Outros estudos comprovaram a atividade citotóxica em células tumorais (BOLZANI et al., 1995; ORBELIES et al., 2002), atividade antifúngica (ORBELIES et al., 2002), e efeito dislipidêmico (SCHOENFELDER et al., 2008). Adicionalmente, um estudo recente demonstrou que entre diversos extratos avaliados de C. sylvestris, o extrato hexânico derivado de vários órgãos da planta foi o que apresentou maior caráter citotóxico apresentando IC50 abaixo de 30 μg/mL em células de leucemia e carcinoma mamário (MESQUITA et al., 2009). Ainda com relação à atividade citotóxica, um estudo utilizando dois derivados de ácido gálico da C. sylvestris demonstrou atividade antitumoral e citotóxica in vitro utilizando o modelo de tumor de Erlich em camundongos e células de câncer de pulmão (SILVA et al., 2009). Derivados do ácido elágico a partir do extrato aquoso de C. sylvestris demonstraram atividade anti-fosfolipase A2, bloqueando alguns efeitos tóxicos de venenos de cobra (SILVA et al., 2008). 1.1.2. Diterpenos clerodânicos de C. sylvestris Substâncias isoladas de plantas podem ser responsáveis por atividades biológicas específicas, desta forma, existe um grande interesse no isolamento destes metabólitos e na elucidação de seus efeitos biológicos. Os diterpenos são metabólitos secundários encontrados na C. sylvestris. Estas substâncias recebem em sua maioria a denominação de casearinas A-Y (FERREIRA et al., 2011). Algumas atividades biológicas das casearinas já foram estudadas, entre elas pode- se citar as atividades citotóxica e antifúngica (FERREIRA et al., 2011). As casearinas A-R tiveram sua configuração absoluta determinada, enquanto para as casearinas S-Y apenas 22 a configuração relativa foi confirmada. Este estudo avaliou as casearinas B, D e X e a caseargrewiina F (Figura 2). Figura 2: Fórmula estrutural dos diterpenos clerodânicos obtidos do extrato etanólico de C. sylvestris utilizados neste trabalho. A) casearina B; B) casearina D; C) casearina X; D) caseargrewiina F. Com relação às casearinas B, D e X, e à caseargrewiina F há um estudo que descreve a atividade citotóxica desses produtos naturais e os produtos de degradação da casearina X. Tanto a casearina X, como as casearinas D e B são relatadas pelo mesmo estudo como um pó branco. A atividade citotóxica foi avaliada nas seguintes linhagens celulares: MOLT-4 (leucemia), MDA-MB-435 (câncer de mama), HCT-8 (câncer de colo), and SF-295 (glioblastoma), e L-929 (fibroblastos). Dentre essas substâncias, a caseargrewiina F se mostrou a mais citotóxica, apresentando IC50 em concentração menor que 0,2 μM para a maioria das linhagens celulares (SANTOS et al., 2010). Ainda, um 10 H O 171 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 20 19 18 O O O O O OH O 10 H O O O O OH 17 O O O 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 20 19 18 10 H O HO O 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 20 19 18 O OH O O O O 10 H O O O 17 1 2 3 4 5 6 7 8 9 11 12 13 14 15 16 20 19 18 O O O O O O O A B C D 23 estudo atual mostra que a casearina X foi capaz de induzir apoptose em células CEM e HL-60, derivadas de leucemia (FERREIRA et al., 2010). Adicionalmente, a caseargrewiina F, foi descrita como um produto natural sólido, incolor e amorfo (KANOKMEDHAKUL et al, 2007). O mesmo estudo verificou que a caseargrewiina F não foi citotóxica para células de carcinoma epidermal. Entretanto, apresentou citotoxicidade em células de câncer de mama humano e células tumorais de pulmão (KANOKMEDHAKUL et al, 2007). 1.1.3. Produtos naturais extraídos de C. sylvestris e seus efeitos no DNA Mais especificamente com relação aos efeitos no DNA, há trabalhos que relataram a ausência de atividade genotóxica do extrato etanólico extraído das folhas de C. sylvestris no DNA das células HTC (hepatoma) e V79 (células pulmonares de hamster chinês) através método do cometa (MAISTRO et al., 2004). Já o óleo essencial das folhas demonstrou ausência de efeito mutagênico, quando avaliado pelo método de aberração cromossômica em células HTC (SOUSA et al., 2007). Um estudo, utilizando camundongos, demonstrou que o extrato etanólico de C. sylvestris e um de seus diterpenos clerodânicos a caseargrewiina F, foram capazes de proteger o DNA contra danos em baixas concentrações e apresentaram efeito genotóxico e mutagênico em altas concentrações (OLIVEIRA et al., 2009) . Recentemente, outro estudo, que utililizou Tradescantia pallida e camundongos como modelo, demonstrou que a casearina X, extraída do extrato etanólico de C. sylvestris, foi capaz de proteger o DNA contra danos provocados pelo extrato isolado de poluentes obtidos da fuligem oriunda da queima da cana-de-açúcar (PRIETO et al., 2012). 24 1.2. Mecanismos de antimutagênese Segundo Morita et al (1978), os derivados de produtos naturais podem proteger o DNA de danos atuando como desmutagênicos, ou seja, agindo diretamente nos mutágenos ou em seus precursores. O principal mecanismo de ação de produtos naturais com estas características é a inativação química ou enzimática, ou seja, os produtos naturais atuam inibindo a ativação metabólica de pró-mutágenos ou inativando mutágenos já ativados através do mecanismo de scavenging. De forma complementar, Kada (1983) propôs que os danos ao DNA podem ser reduzidos através de produtos naturais que atuam diretamente no processo de replicação ou na ativação do reparo de DNA, ficando estes produtos naturais conhecidos como bioantimutagênicos. Portanto, trabalhos recentes visam elucidar os mecanismos de prevenção a danos no DNA ocasionado por produtos naturais através da avaliação atividade antioxidante (ZEGURA et al., 2011, FRANKIC et al., 2008); ativação de enzimas detoxificadoras de fase II, como é caso da glutationa-S transferase (PETERMANN et al., 2009) ou quinona redutase (DIETZ et al., 2005); ativação do sistema de reparo de DNA (DUARTE et al., 2009), ou até mesmo pela análise da expressão gênica global indicando possíveis genes responsáveis pelo efeito protetor previamente observado (KING et al., 2007). 1.3. Agentes causadores de danos ao DNA e mecanismos de redução ou remoção desses danos O DNA de células vivas pode ser lesado quando exposto a uma variedade de produtos naturais químicos e a um pequeno número de agentes físicos. A maioria dos danos são causados por agentes presentes no meio ambiente (danos ambientais), e 25 outros, são consequentes da própria fisiologia celular (danos espontâneos). Muitas vezes, é difícil distinguir os danos espontâneos dos danos ambientais, existindo a possibilidade de determinados danos serem classificados como espontâneos pelo fato de seu agente ambiental ainda não ter sido identificado. Cada modificação na estrutura molecular do material genético é designada com um dano ao DNA. Sendo que, os agentes desses danos podem ser classificados em agentes químicos ou físicos (FRIEDBERG et al., 2006). Este estudo enfoca o dano químico causado por espécies reativas de oxigênio (ROS) e o dano físico causado por ultravioleta (UV). 1.3.1. Dano oxidativo ao DNA Existem inúmeras fontes intra e extracelulares de ROS. A maior fonte intracelular de ROS está provavelmente associada com a redução do oxigênio à água, durante a respiração mitocondrial. As espécies altamente reativas incluem o radical hidroxila, o ânion superóxido, o peróxido de hidrogênio (H2O2), o oxigênio molecular singlet, assim como o hipoclorito, o radical de óxido nítrico e o peroxinitrito (CHANCE et al., 1979). Já as fontes extracelulares incluem radiação (radiação ionizante e a luz UV - principalmente de 320 a 380 nm), calor, várias drogas e produtos naturais químicos (FRIEDBERG et al., 2006). Os radicais livres podem remover elétrons de resíduos de macromoléculas orgânicas de acordo com a seguinte reação geral: RH2 + OH → RH + H2O Desta forma, os radicais livres são capazes de iniciar uma reação em cadeia que resulta em danos ao DNA a distâncias consideráveis da reação inicial (SARAN e BORS, 1990). A meia vida e a difusão dos radicais gerados são parâmetros importantes que podem influenciar no potencial para a geração do dano ao DNA. Os radicais peroxil (ROO ) 26 e alcolxil (RO ) são os maiores intermediários de reações em cadeia, enquanto os peróxidos (ROOH e H2O2) e resíduos hidroxilados (ROH) e carbonilados (HR=O) normalmente são produtos finais. O H2O2 é provavelmente o mais significante em termos de difusão. Apesar do H2O2 por si só ser relativamente inerte, ele pode dar origem a radicais hidroxila ( OH) em um processo catalisado por íons de metais de transição, como é o caso do Fe2+. Esta reação é conhecida como a reação de Haber-Weiss ou reação de Fenton (COHEN, 1985). Mais especificamente no DNA, a reação de Fenton pode ser representada da forma a seguir: DNA[Fe2+] + H2O2 → DNA[Fe3+] + OH + OH- O ataque ao DNA por ROS gera uma variedade de produtos. Por exemplo, o radical hidroxila pode agir sobre o DNA originando quebras de simples fita e/ou quebra de dupla fita, assim como, lesões nas bases purínicas e pirimidínicas, afetando a integridade do genoma. A maioria dos produtos de dano oxidativo ao DNA foram identificados como: timina glicol, 5,6-dihidroxiuracila, 8-hidroxiadenina, 4,6-diamina-5-formamida-pyrimidina, 5- hidroxicitosina, 5-hidroxiuracila, 8-hidroxiguanina, 2,6-diamina-4-hidroxi-5-formamida- pirimidina (CROTEAU e BOHR, 1997) (Figura 3). Figura 3: Exemplos de modificações oxidativas encontradas nas bases nitrogenadas de DNA de mamíferos (CROTEAU e BOHR, 1997). timina glicol 5,6-dihidroxiuracila 8-hidroxiadenina 4,6-diamina-5-formamida- pyrimidina 5,6-dihidroxicitosina 5,6-hidroxiuracila 8-hidroxiguanina 2,6-diamina-4-hidroxi-5- formamida-pirimidina 27 1.3.2. Produtos naturais e enzimas com atividade antioxidante Atualmente, o termo antioxidante vem sendo amplamente popularizado e ganhou publicidade entre a população como sendo sinônimo de benefícios à saúde (HUANG et al., 2005). Uma definição mercadologicamente relevante de antioxidante é: produto natural sintético ou natural que é adicionado a produtos, a fim de prevenir ou retardar sua deterioração pela ação do oxigênio do ar. Já em bioquímica e medicina, os antioxidantes são enzimas ou substâncias orgânicas, como a vitamina E e o β-caroteno, que são capazes de combater os efeitos deletérios da oxidação em tecidos animais (HUANG et al., 2005). A atividade antioxidante está associada à diminuição do dano ao DNA, à redução da peroxidação lipídica e à inibição da proliferação de células tumorais in vitro. Ainda, pode-se associar produtos naturais antioxidantes com a diminuição epidemiológica de alguns tipos de câncer e doenças degenerativas como isquemia cardíaca e catarata (SIES e STHAL, 1995). Essa proteção aos tecidos biológicos se dá pelo combate às ROS. Dentre os mecanismos responsáveis pela diminuição de ROS pode-se citar: a) remoção catalítica de ROS por agentes como a catalase, superóxido dismutase, peroxidase e antioxidantes tióis-específicos; b) ligação de proteínas (transferrina, metalotioneina, haptoglobinas, ceruloplasmina) a íons pró-oxidantes, como os íons de ferro e cobre; c) proteção contra danos macromoleculares por proteínas de estresse ou de choque térmico; d) redução dos radicais livres por doadores de elétrons como a glutationa S-transferase, vitamina E (tocoferol), vitamina C (ácido ascórbico) bilirrubina e ácido úrico (HALLIWELL e GUTTERIDGE, 1999). Há inúmeras ferramentas utilizadas para a avaliação da atividade antioxidante. Reações químicas que avaliam a capacidade antioxidante direta da molécula baseiam-se em características da substância em ser uma boa seqüestradora de elétrons. Dentre as 28 principais características pode-se citar a presença de ligações duplas conjugadas ou a presença de anéis benzênicos poliidroxilados. A capacidade antioxidante de um produto natural também pode estar relacionada à ativação de proteínas celulares que auxiliam na eliminação de ROS. Dessa forma, torna-se necessário avaliar os dois tipos de interações dos produtos naturais, a fim, de verificar se eles apresentam ou não caráter antioxidante. (HUANG et al., 2005). 1.3.3. Combate às lesões oxidativas no DNA O sistema de reparo de DNA é fundamental para a manutenção da estabilidade genética e consequentemente para a manutenção da vida. Ainda, a importância do reparo do DNA é evidente, visto o enorme investimento feito pelas células em enzimas de reparo (ALBERTS et al., 2008). Uma vez que a vida animal depende de oxigênio, são gerados constantemente nos organismos vivos, agentes oxidantes derivados do próprio metabolismo, como por exemplo, radicais superóxido, peróxido de hidrogênio e etc. Adicionalmente, radicais livres podem ser gerados frente a diversas patologias como o câncer, doenças cardiovasculares e etc. Dessa forma, os animais desenvolveram um complexo mecanismo enzimático antioxidante. Porém, este mecanismo não é perfeito, e alguns agentes oxidantes acabam encontrando uma forma de atingir algumas moléculas dentro das células, entre elas, o DNA. Já foi estimado que o genoma humano recebe cerca de 10000 “ataques” oxidativos por dia, que em sua maioria são removidos pelas DNA glicosilases (FRIEDBERG, 1995). O reparo por excisão que é iniciado pelas glicosilases é chamado de reparo por excição de bases (BER). Este evento enzimático inicial durante BER, geralmente origina outro tipo de dano ao DNA, pois resulta na formação de sítios abásicos, conhecidos como 29 sítios apurínicos ou apirimidínicos (AP). O reparo de sítios AP requer a ocorrência de outros eventos bioquímicos a fim de que se complete BER, que é um processo produto natural de diversas etapas (FRIEDBERG, 1995). 1.3.4. Danos no DNA provocados por radiação UV O espectro de radiação UV é dividido em três diferentes bandas de comprimento de onda: UVA (400 a 315 nm), UVB (315 a 280 nm) e UVC (280 a 100 nm). A radiação solar consiste majoritariamente em raios UVA e UVB, uma vez que a camada de ozônio é capaz de barrar luz em comprimento de ondas inferiores a 285 nm. Entretanto, alguns estudos utilizam a luz germicida UVC de comprimento de onda aproximado de 260 nm (correspondente ao pico de absorção da molécula de DNA), uma vez que, lesões no DNA idênticas às causadas por UVA e UVB são induzidas mais eficientemente pela radiação UVC (FRIEDBERG et al., 2006). Quando o DNA é exposto a radiações UV, pirmidinas adjacentes se ligam covalentemente formando estruturas em forma de anel conhecidas como dímero de pirimidina ciclobutano (CPD) ou dímero de ciclobutano dipirimidina (LOVE et al., 1986). Tradicionalmente, os CPDs geram a distorção da hélice de DNA obrigando a parada da replicação, como consequência, há uma distorção que provoca instabilidade nas pontes de hidrogênio do DNA e nenhuma base pode ser adicionada nessas condições (CHAN et al., 1985). O DNA irradiado com UV também pode apresentar sítios álcali-lábeis na região de citosinas (e muito menos frequentemente, timinas), localizadas na extremindade 3’ de nucleosídeos de pirimidina. Essas lesões são conhecidas como pirimidina-pirimidona (6,4) fotoprodutos (6-4 PPs). Esse tipo de dano é altamente prejudicial ao DNA, uma vez que induz uma forte distorção na estrutura de dupla hélice (TAYLOR et al, 1988) (Figura 4). 30 Figura 4: Fotolesões encontradas no DNA após irradiação com UV. 1.3.5. Reparo de lesões ocasionadas por UV - Reparo por excisão de nucleotídeos (NER) A via de reparo mais comumente ativada em casos de danos induzidos por radiação UV é a via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER). O evento que define NER é a excisão do dano de um oligonucleotídeo através da quebra da fita lesada no mesmo lado da lesão de DNA (FRIEDBERG et al., 2006). As lesões reparadas por NER são aquelas que basicamente formam aductos de DNA, podendo ser citados CPDs ou o 6,4-PP provocados por radiação UV, ou então os ligações cruzadas entre fitas que podem ser causados tanto por ROS ambientais como endógenos (DRONKERT e KANAAR, 2001; NOLL et al., 2006). O sistema NER em mamíferos consiste em duas vias: reparo global do genoma (GGR) e o reparo acoplado à transcrição (TCR). O último é especializado em remover timinas adjacentes CPD 6-4 PP 31 lesões da fita de DNA de genes ativos transcricionalmente. Em contraste, o reconhecimento do dano pelo GGR é dependente da ligação de complexos protéicos que possuem afinidade específica pelo DNA lesado. Dois produtos dos genes relacionados ao Xeroderma pigmentosum (XP), XPC e DDB2 (XPE) estão envolvidos no processo inicial de detecção do dano pela via de GGR (FRIEDBERG et al., 2006). De forma geral, esses aductos de DNA causam alguma distorção local ou deformidade incomum na hélice. Esse tipo de distorção parece ser a primeira alteração estrutural reconhecida em células de mamíferos que geralmente requer a ligação do complexo XPC-RAD23B. Este complexo por sua vez, se liga ao DNA lesado em dois diferentes estágios. O primeiro, ocorre rapidamente através da ligação a regiões que não possuem ligação de hidrogênio na dupla fita de DNA por meio de dois domínios que possuem hairpins em XPC (TREGO e TURCHI, 2006; CAMENISCH et al., 2009), seguidos de um ancoramento mais forte a uma região não lesada da fita que contém o aducto (CAMENISCH et al., 2009). A ligação de XPC à região do DNA simples fita que possui poucas bases facilita o transporte de TFIIH ao sítio distorcido (ARAÚJO et al, 2001). Posteriormente, o complexo XPC-RAD23B interage fortemente com TFIIH que procura a menor distância do sítio lesado para se ancorar juntamente com outras proteínas do complexo pré-incisão (SUGASAWA et al., 2009). Em seguida é dada continuidade ao o reparo de DNA por NER com excisão da região lesada e polimerização da nova fita de DNA reparada (Figura 5). 32 Figura 5: Algumas proteínas envolvidas na via de NER. (CLEAVER et al., 2009) 1.4. Apoptose e reparo de DNA Uma vez que ocorre um dano ao DNA, mecanismos de checkpoint são ativados desencadeando uma resposta celular que proporciona uma pausa no ciclo celular. Em seguida, dependendo do tipo e da severidade da lesão ao DNA e do estado fisiológico da célula, a resposta celular pode seguir dois caminhos: o primeiro, é a ativação do sistema de reparo de DNA, resultando na restauração de sua estrutura química original. Entretanto, se os danos ao DNA são muito severos, e portanto, não são reparados, a célula opta por se auto-eliminar através do processo de morte programada conhecido como apoptose (MASLOV e VIJG, 2009). 33 1.5. Ativação da enzima quinona redutase Como já foi citado anteriormente, produtos naturais conhecidos como desmutagênicos podem reduzir danos ao DNA através da detoxificação dos mutágenos pela indução de enzimas detoxificadoras, como é o caso da enzima quinona redutase. A redução de quinonas eletrofílicas pela QR é uma via de detoxificação importante que converte quinonas a hidroquinonas e reduz a formação de agentes oxidativos.Os indutores enzimáticos podem ser classificados em dois tipos: monofuncionais e bifuncionais. Os indutores bifuncionais aumentam a expressão tanto de enzimas de fase I como de enzimas de fase II. Já os indutores monofuncionais induzem seletivamente enzimas de fase II que são responsáveis por ativar o elemento de resposta antioxidante (ARE) via indução de Keap1 e Nrf2. Uma vez que enzimas de fase I podem ativar procarcinógenos, é desejável que produtos naturais com atividade quimiopreventiva apresentem caráter monofuncional, ou seja, induzam apenas enzimas de fase II (DINKOVA-KOSTOVA et al., 2002; EGGLER et al., 2000) 2. OBJETIVO GERAL Avaliar os possíveis mecanismos de proteção aos danos no DNA assim como a genotoxicidade e citotoxicidade do extrato etanólico e substâncias isoladas de C. sylvestris. 2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1) Avaliar a citotoxicidade dos produtos naturais através do ensaio de MTT e sobrevivência clonogênica nas linhagens HepG2, MRC5 e XP4PA nos tempos de 24 h e 48 h; 34 2) Avaliar a genotoxicidade dos produtos naturais nas linhagens HepG2 (hepatocarcinoma humano), MRC5 (fibroblasto de pulmão humano) e XP4PA (fibroblasto humano deficiente na proteína XPC de NER) no tempo de 24 h; 3) Avaliar a antigenotoxicidade dos produtos naturais frente ao mutágeno peróxido de hidrogênio na linhagem HepG2 pré e pós-tratada com os produtos naturais durante 24 h; 4) Avaliar a antigenotoxicidade dos produtos naturais frente ao mutágeno UVC nas linhagens MRC5 e XP4PA pré e pós-tratadas com os produtos naturais durante 24 h a fim de verificar uma possível atuação no mecanismo de NER; 5) Avaliar a possível inibição da apoptose pelos produtos naturais na linhagem celular HepG2 exposta ao mutágeno peróxido de hidrogênio através do método da anexina-V- FITC/PI; 6) Avaliar a possível inibição da apoptose pelos produtos naturais nas linhagens celulares MRC5 e XP4PA expostas ao mutágeno UVC através do método da anexina-V-FITC/PI; 7) Avaliar a possível atividade antioxidante através do pré-tratamento com os produtos naturais de C. sylvestris utilizando o fluroróforo DCFDA em células HepG2 expostas ao peróxido de hidrogênio; 8) Avaliar a possível indução da enzima quinona redutase pelos produtos naturais na linhagem Hepa 1c1c7 (hepatocarcinoma murino). 3. MATERIAIS E MÉTODOS 3.1. Obtenção do extrato etanólico de C. sylvestris As folhas de C. sylvestris Swartz (Salicaceae) foram coletadas no Parque Estadual Carlos Botelho (São Paulo) e as excicatas de 3 indivíduos (AGS13, AGS19 e AGS23) 35 foram depositadas no herbário estadual "Maria Eneida P. Kaufmann", do Instituto Botânico de São Paulo. As folhas secas de C. sylvestris (20,5 kg) foram extraídas por maceração com etanol absoluto (2 x 100.0 L; 40 °C; tempo total de 23 h) e a solução obtida foi submetida à evaporação sob pressão reduzida e posterior secagem sob fluxo de ar em dessecador fornecendo o extrato etanólico seco. O extrato etanólico de C. sylvestris assim como as substâncias puras, foram fornecidos pelo Prof. Alberto José Cavalheiro, Departamento de Química Orgânica, do Instituto de Química de Araraquara (UNESP), juntamente com o Prof. Dr. André Gonzaga dos Santos, Departamento de Princípios Ativos Naturais e Toxicologia, Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (UNESP). 3.2. Obtenção dos diterpenos clerodânicos de C. sylvestris O fracionamento do extrato etanólico foi realizado por extração em fase sólida (EFS), obtendo-se 3 frações. O fracionamento da fração 2 da EFS, por cromatografia em coluna, conduziu a obtenção 41 frações, que foram purificadas por cromatografia líquida de alta eficiência, resultando nas substâncias estudadas: casearina B, casearina D, caseargrewiina F e casearina X. Detalhes sobre o fracionamento em Santos et al., 2010. 3.3. Solubilização dos produtos naturais Os produtos naturais foram solubilizados em DMSO puro e mantidos a -20°C até o momento do uso. As concentrações das soluções-mãe preparadas foram as seguintes: extrato etanólico: 116 μg/mL, casearina B: 3,6 mM, casearina D: 18,2 mM, casearina X: 41,0 mM e caseargrewiina F: 4,5 mM. Posteriormente, essas soluções-mãe foram diluídas em solução de Hanks (KCl (5,4mM), KH2PO4 (0,4 mM), Na2HPO4 (0,3 mM), NaHCO3 (4,2 36 mM), Glicose (5,6 mM), NaCl (0,1 M)) resultando em outras soluções-mãe menos concentradas, que foram adicionadas ao meio de cultura de células (DMEM) para a realização dos experimentos. A segunda diluição em solução de Hanks foi feita a fim de atenuar a toxicidade do DMSO, uma vez que, se fosse feita outra diluição em DMSO, possivelmente teria-se que adicioná-lo em concentração superior a 1% nas células o que é sabidamente citotóxico. Adicionalmente, esta segunda diluição em Hanks tornou possível uma tomada de volume acessível às micropipetas, sem que houvesse um efeito citotóxico, genotóxico ou alteração da osmolaridade pelo veículo. Já que ao final, resultou em um veículo contendo no máximo 2% de solução de Hanks e 0,05% de DMSO diluídos nos meios de cultura de células utilizados nesse estudo, DMEM ou α-MEM. 3.4. Cultura de células As células HepG2 (hepatocarcinoma humano, que possui níveis indutíveis de enzimas detoxificadoras como a catalase, glutationa S tranferase entre outras.) foram adquiridas do banco de células do Rio de Janeiro, as linhagens XP4PA (fibroblasto humano deficiente na proteína XPC do reparo por excisão de nucleotídeos – NER) e MRC5 (fibroblasto de pulmão humano, linhagem selvagem da XP4PA) foram gentilmente cedidas pelo Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck – Universidade de São Paulo – Instituto de Ciências Biomédicas – Departamento de Microbiologia e a linhagem Hepa 1c1c7 (hepatocarcinoma murino que possui níveis indutíveis de quinona redutase) foi gentilmente cedida pelo Prof. Dr. John M. Pezzuto, Universidade do Havaí, EUA. As linhagens HepG2, XP4PA e MRC5 foram cultivadas em meio de cultura DMEM (Sigma®) e Hams-F10 (1:1) (Sigma®), já a linhagem Hepa 1c1c7 foi cultivada em meio -MEM (Sigma®), todos suplementados com 10% de soro fetal bovino (v:v) (Cultilab®) e solução de antibiótico antimicótico - Sigma® (1000U de penicilina, 100 μg/mL de sulfato de 37 streptomicina e 0.25 μg/mL de anfoterecina B), Sulfato de kanamicina - Sigma® (100 μg/mL). As culturas foram mantidas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2. 3.5. Avaliação da citotoxicidade 3.5.1. Ensaio do MTT Esse método foi aplicado a todas às linhagens celulares HepG2, MRC5 e XP4PA e foi realizado com o intuito de determinar concentrações que matem no máximo 20% das células, IC20. Adicionalmente foram determinados os IC50 dos produtos naturais, a fim de comparar os resultados com os resultados já descritos na literatura. Os ensaios de citotoxicidade foram avaliados em 24 h e 48 h de tratamento para a determinação, respectivamente, do efeito concentração-resposta e tempo-resposta, e dessa forma, foi estabelecido o protocolo de tratamento das linhagens celulares, com os derivados de C. sylvestris (extrato etanólico e substâncias puras). Foram realizados três experimentos independentes em triplicata. Para um primeiro rastreamento de concentrações, foram utilizadas diluições em escala exponencial que variavam de 10-3 a 102 μM. A partir dos resultados de citotoxicidade obtidos nesse ensaio preliminar, foram testados os produtos naturais entre as faixas citotóxicas e não citotóxicas. Foram avaliadas no mínimo cinco concentrações para cada produto natural e quando necessário, foram testadas mais concentrações, sendo que as concentrações testadas para a célula HepG2 foram: extrato etanólico: de 0,3 a 5,0 μg/mL, casearina B: de 0,7 a 10,0 μM, caseargrewiina F (0,8 a 12 ,0μM), casearina D (0,08 a 10,0 μM), casearina X (0,2 a 28,0 μM). Já para a célula MRC5, as concentrações testadas foram: extrato etanólico (0,3 a 5,0 μg/mL), caseargrewiina F (0,002 a 1,2 μM), casearina D (0,2 a 10,4 μM), casearina B (0,02 a 10,0 μM) e casearina X (0,2 a 28,0 μM). 38 Na linhagem XP4PA foram testadas as seguintes concentrações: extrato etanólico (0,04 a 0,6 μg/mL), caseargrewiina F (0,05 a 0,8 μM), casearina D (0,08 a 1,3 μM), casearina B (0,2 a 2,5 μM) e casearina X (0,2 a 3,5 μM). Dessa forma, foram determinadas as concentrações máximas não citotóxicas. Como controle positivo foi empregada doxorrubicina 27 μM e controle de veículo 2% de solução de Hanks e 0,05% de DMSO diluídos em DMEM. Após o tratamento com os produtos naturais, o meio de cultura foi removido e o protocolo do MTT foi realizado segundo Mosmann (1983). Inicialmente, 5 mg/mL de MTT (brometo de [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio]) em PBS foram adicionados em cada poço da microplaca com 96 poços, as células na microplaca foram incubadas a 37ºC, ao abrigo da luz durante 3 h para observação da presença dos cristais violetas de formazana. Para a solubilização dos cristais de formazana, 100 μL de DMSO foram adicionados a cada poço e a leitura espectrofotométrica da absorbância foi realizada em comprimento de onda de 590 nm, em leitor de placas. A porcentagem de células vivas foi calculada em relação ao controle negativo, representando a viabilidade de cada tratamento. % células vivas = (Absorbância do teste/Absorbância do Controle negativo) x 100 3.5.2. Ensaio de sobrevivência clonogênica Esta técnica foi transmitida através de estágio realizado pela aluna no laboratório do Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck (ICB, USP). Foram realizados três experimentos independentes nas linhagens HepG2, XP4PA e MRC5 nos tempos de 24 h e 48 h. Como controle positivo, foi utilizada doxorrubicina 27 μM e controle de veículo 2% de solução de Hanks e 0,05% de DMSO diluídos em DMEM. Neste ensaio, as células foram tratadas já com uma concentração acima do IC20, concentração igual ao IC20 e uma concentração 39 abaixo do IC20 obtido previamente no teste do MTT. Dessa forma, foram avaliadas no mínimo três concentrações para cada produto natural, nos tempos de 24 h e 48 h nas linhagens celulares XP4PA, MRC5 e HepG2. Este experimento foi realizado segundo Ballal et al (2009) com algumas modificações. O tratamento das células foi realizado exatamente como foi feito no ensaio de MTT. Foram plaqueadas 2,5 x 105 células/mL e então as células foram tratadas. Após os tempos de tratamento, as células foram contadas em câmara de Neubauer, a fim de obter o volume que contivesse 1000 células. Posteriormente esse volume foi adicionado a placas de 60 mm que continham previamente 4mL de DMEM. As células foram deixadas para se multiplicarem por 6 dias, permitindo assim que formassem colônias suficientes para a análise posterior. Em seguida, as placas foram fixadas com formol 10% por 20 min, e depois coradas com cristal violeta por mais 20 min. Decorrido esse tempo, as placas foram enxaguadas em água corrente e após secarem, as colônias com mais de 15 células foram contabilizadas em estereomicroscópio no aumento de 16X. A porcentagem de colônias que proliferaram foi calculada da seguinte forma: Eficiência de Plaqueamento (EP)= (N colônias contadas)/(N de colônias plaqueadas) % sobrevivência = [(N colônias do teste/N de colônias do Controle negativo) x (EP)]x100 3.6. Ensaio do cometa Para este teste, as células foram tratadas como descrito posteriormente para os ensaios de genotoxicidade e antigenotoxicidade. Cada tratamento foi realizado em triplicata segundo o protocolo previamente estabelecido por Singh et al. (1988). Lâminas limpas pré-tratadas com agarose ponto de fusão normal, receberam uma mistura de 40 agarose baixo ponto de fusão (37 ºC) juntamente com as células (2,5x104). Posteriormente, foi colocado 100μL entre lâmina e lamínula, após a solidificação, a lamínula foi retirada da lâmina, mergulhando a lâmina em solução de lise (NaCl (2,4 M), EDTA (100 mM), Tris (10 mM), DMSO (10%) e Triton X-100 (1%)), overnight. Em seguida, as lâminas foram lavadas 3 vezes por 5 minutos com tampão da enzima FPG, e, posteriormente, incubadas por 30 minutos com a enzima FPG (1:3000 – v:v) em câmara úmida a 37°C. Em continuidade, a eletroforese alcalina foi realizada a 4 °C, cobrindo as lâminas em cuba de eletroforese com tampão de corrida (NaOH (300 mM), EDTA (1 mM), pH>13), correndo por 20 minutos, a 25 V. Depois, as lâminas foram lavadas em solução de neutralização (Tris (0.4 M), pH = 7.5), por fim fixadas em etanol absoluto. As lâminas foram coradas com brometo de etídio e lidas em um microscópio de fluorescência com filtro de 516-560 nm, e barreira de 590 nm em aumento total de 400X. Foram capturadas imagens de 50 nucleóides por alíquota de células e analisadas pelo software TriTek CometScore® versão 1.5. O parâmetro adotado no presente estudo foi a porcentagem de DNA na cauda. Os experimentos foram realizados em triplicata e dois experimentos independentes. 3.6.1. Cálculo da concentração do peróxido de hidrogênio Para os experimentos do cometa, foi utilizado peróxido de hidrogênio (H2O2) da Merck®, padrão analítico que fica armazenado na geladeira em frasco plástico protegido da luz. Foi realizado o cálculo de sua concentração através de leitura espectrofotométrica, segundo método descrito por Brestel (1985). Primeiramente foi adicionado 11 μL de peróxido em 4989 μL de água miliQ, homogeneizados e em seguida foi realizada a leitura de absorbância a 230 nm. Para calcular a concentração de peróxido foi empregada a seguinte fórmula: 41 Concentração = Absorbância/ 230= 80 M-1cm-1 230 = constante para a absorbância de 230nm 3.6.2. Atividade genotóxica dos produtos naturais de C. sylvestris Foi realizada a atividade genotóxica dos produtos naturais em concentrações abaixo de seu IC50 previamente determinado pelo ensaio do MTT. Primeiramente as células aderiram durante 24 h em placas de 24 poços. Em seguida, as soluções dos produtos naturais foram diluídas na razão de 1:2 ou 1:4 (v:v), utilizando-se no mínimo 5 concentrações, sendo que as concentrações testadas para HepG2 foram de extrato etanólico: 0,3 a 4,6 μg/mL, substâncias puras 0,3 a 4,6 μM. Na linhagem MRC5 a concentração de extrato etanólico foi de 0,01 a 2,50 μg/mL, e substâncias puras: 0,01 a 2,50 μM. Por fim, a linhagem XP4PA foi exposta às seguintes concentrações dos produtos naturais: extrato etanólico (0,01 a 1,50 μg/mL); substâncias puras (0,01 a 1,50 μM). Adicionalmente foram realizados: controle negativo (células com DMEM, ou seja, meio de cultura, usado nas células a fim de verificar a resposta das células em seu estado de cultivo corriqueiro), controle de veículo (DMSO 0,05% e Hanks 2% diluídos em DMEM) e controle positivo, a fim de verificar a resposta genotóxica das células frente a um mutágeno clássico (células tratadas com o mutágeno e DMEM). No caso da linhagem HepG2 o mutágeno utilizado foi o H2O2 - 1mM. Para a linhagem MRC5 foi utilizado UVC a 26,45 J/m2 para a linhagem XP4PA a dose de UVC foi de 3,59 J/m2. As concentrações dos mutágenos utilizados, tanto no ensaio de genotoxicidade como de antigenotoxicidade, foram previamente padronizadas baseadas na sua capacidade de induzir significativamente danos genotóxicos através do ensaio do cometa. Ressaltando que sempre que as células foram irradiadas, as mesmas eram lavadas com 42 PBS por duas vezes e, em seguida, cerca de 2 mL de PBS era adicionado para a realização da irradiação. 3.6.3. Atividade antigenotóxica dos produtos naturais de C. sylvestris Neste ensaio foi realizado o pré e o pós-tratamento com os produtos naturais frente aos mutágenos. No caso da linhagem HepG2, o mutágeno utilizado foi o H2O2 (1mM) e os ensaios foram realizados em placas de 24 poços. Entre cada tratamento, foram realizadas lavagens das células com solução de Hanks. A linhagem MRC5 foi irradiada com UVC a 26,45 J/m2 e para a linhagem XP4PA a dose de UVC utilizada foi de 3,59 J/m2 e estes ensaios foram realizados em placas de 35 mm de diâmetro a fim de obter uma irradiação uniforme dos tratamentos. As concentrações escolhidas para este ensaio foram abaixo do IC20, previamente obtido nos ensaios de MTT e sobrevivência clonogênica; quando os IC20 variavam de um ensaio para o outro, as células foram tratadas na concentração do menor IC20 obtido. Foram avaliadas no mínimo 5 concentrações para cada produto natural. Portanto, foram testadas as seguintes concentrações na linhagem HepG2: extrato etanólico (0,02 a 0,30 μg/mL), substâncias puras (0,02 a 0,30 μM); para a linhagem MRC5: extrato etanólico (0,0002 a 0,04 μg/mL), substâncias puras (0,0002 a 0,04 μM) e para a linhagem XP4PA: extrato etanólico (0,001 a 0,02 μg/mL) e substâncias puras (0,001 a 0,02 μM). Para as linhagens MRC5 e XP4PA foi realizado o ensaio, com e sem a incubação, dos produtos naturais com o pool de enzimas S9 (Moltox®) na concentração não citotóxica de 0,01 mg de proteína/mL de meio, a fim de verificar se a metabolização dos produtos naturais influenciava na possível atividade antigenotóxica. Adicionalmente, foram realizados: controle negativo (células sem tratamento mantidas em DMEM), controle positivo (células tratadas com o mutágeno e pré ou pós-tratadas com DMEM) e controle de 43 veículo com mutágeno (células tratadas com o mutágeno e pré ou pós-tratadas com DMSO 0,05% e Hanks 2% diluídos em DMEM). Em seguida foram realizados os procedimentos já descritos para o ensaio do cometa com utilização da endonuclease específica para danos oxidativos, FPG (New England® - 1:3000 – v:v) para a linhagem HepG2, e endonuclease específica para CPDs, T4-endonuclease V (gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Carlos Frederico Martins Menck – 1:5000 – v:v), no caso de ensaios com as linhagens XP4PA e MRC5. Após a lise celular, as lâminas foram lavadas com o tampão específico de cada enzima (3 lavagens de 5 min), e, posteriormente, incubadas a 37°C durante 30 min em câmara úmida. Adicionalmente, a porcentagem de inibição de danos para todas as concentrações foi calculada seguindo a fórmula proposta por Hosseinimehr e Karami (2004), e em seguida foi classificada como: forte (acima de 60%), moderada (41-60%), fraca (21-40%) e negligenciável (0-20%) (CALOMME et al., 1996). Inibição (%) = (1- (Teste/Controle de Veículo)) x 100 3.7. Ensaio de morte celular – Anexina-V-FITC/PI Primeiramente, a concentração dos mutágenos e o tempo que a célula leva para entrar em apoptose foram padronizados. O princípio do método se baseia no fato de que em células saudáveis, o fosfolipídeo fosfatidilserina está localizado na face interna da membrana celular, entretanto, frente a um estímulo de morte celular, este fosfolipídeo é prontamente externalizado. A anexina-V é uma proteína que apresenta elevada atividade anticoagulante dependente de íons Ca2+ e com uma alta afinidade por aminofosfolipídeos, ou seja, alta afinidade pela fosfatidilserina. Já o iodeto de propídeo (PI) é prontamente transportado para o interior das células que estão em estado avançado de morte, uma vez 44 que estas células tem a integridade de sua membrana citoplasmática prejudicada (OTSUKI, 2000). Portanto, segundo Otsuki (2000), utilizando-se anexina-V conjugada com o isotiocianato de fluoresceína (FITC) e o fluoróforo PI é possível distinguir os seguintes tipos celulares: células vivas (baixa concentração de anexina-V e baixa concentração de PI), apoptose precoce (elevada concentração de anexina-V e baixa concentração de PI), apoptose tardia/necrose (elevada concentração de anexina-V e elevada concentração de PI) (Figura 6). Dessa forma, as células foram pós-tratadas com os produtos naturais nas condições descritas a seguir. A densidade celular utilizada neste ensaio foi de 2,5 x 105 células/mL em três experimentos independentes. Foram realizados controle negativo (células sem tratamento, mantidas em DMEM), controle positivo (células tratadas com o mutágeno e pós-tratadas com DMEM) e controle de veículo com mutágeno (células tratadas com o mutágeno e pós- tratadas com DMSO 0,05% e Hanks 2% diluídos em DMEM). Foram avaliadas no mínimo 5 concentrações para este ensaio. A linhagem HepG2 foi submetida ao H2O2 (1mM) e pós- tratada com os produtos naturais durante 24 h nas concentrações: extrato etanólico (0,08 a 0,3 μg/mL) e substâncias puras (0,08 a 0,3 μM). Já a linhagem MRC5 foi irradiada com UVC (Vilber-Lourmat®, Alemanha) (26,5 J/m2) e tratada com os produtos naturais por 24 h nas concentrações: extrato etanólico (0,003 a 0,04 μg/mL) e substâncias puras (0,003 a 0,04 μM). Por fim, a linhagem XP4PA foi irradiada com UVC (3,59 J/m2) e tratada com os produtos naturais nas concentrações: extrato etanólico (0,001 a 0,005 μg/mL) e substâncias puras (0,001 a 0,005 μM). O sobrenadante das células foi recolhido em tubos de centrífuga de 2 mL; em seguida, as células foram lavadas com PBS, que também foi recolhido, e posteriormente tripsinizadas. Os tubos foram levados para centrifugação a 200 x g por 3 minutos e o sobrenadante foi removido. Depois, o ensaio de apoptose foi executado utilizando-se o kit de anexina-V-FITC/PI para detecção de apoptose 45 (eBioscience®). As células foram ressuspendidas em 190 μL de tampão de ligação, foram adicionados 5 μL da solução de anexinaV-FITC e incubado por 10 min, em seguida foram adicionados 10 μL da solução de PI e procedeu-se a leitura no aparelho de citometria de fluxo BD FACSCanto®. Figura 6: Classificação dos tipos celulares presentes no ensaio de apoptose por anexina-V- FITC/PI segundo Otsuki (2000). 3.8. Análise da atividade antioxidante em células HepG2 utilizando DCFDA Foram plaqueados 100 μL de suspensão de HepG2 (5x104 células/mL) em placas pretas de 96 poços, estéreis. Em seguida, as células foram tratadas com os produtos naturais em três concentrações: 0,04; 0,08 e 0,15 μg/mL para o extrato etanólico e 0,04; 0,08 e 0,15 μM para as substâncias puras (casearinas B, D e X e caseargrewiina F), durante 24 h. As concentrações dos produtos naturais foram escolhidas baseando-se nos resultados de citotoxicidade e genotoxicidade previamente obtidos. Ainda, para o experimento foram feitos os seguintes controles: 1) controle negativo (CN) (células mantidas em meio de cultura - DMEM); 2) controle de veículo com mutágeno (CVM) (células tratadas com DMEM acrescido de DMSO 0,05% em Hanks 2%); 3) controle de quercetina (Q), um antioxidante derivado de produto natural (40 μM) por 24 h. Depois do 1 2 3 4 Background Apotose tardia/ necrose Apotose precoce vivas 46 tratamento, os poços foram lavados com solução de Hanks duas vezes. Em seguida foi adicionada 100 μL de uma solução de DCFDA a 5 μM também diluída em Hanks e houve incubação por 30 minutos a 37°C protegidos da luz. Posteriormente, adicionou-se peróxido de hidrogênio 1mM, por 10 minutos, que após esse tempo foi removido. Os poços foram lavados por duas vezes com Hanks e em seguida, adicionou-se 100 μL de Hanks em cada poço para a leitura em fluorímetro. A leitura foi realizada durante 30 minutos a cada 1 minuto. Os comprimentos de onda ( ) utilizados foram: excitação: 485 nm, emissão: 528 nm. (Nakajima et al., 2009). Os experimentos foram realizados em triplicata sendo três independentes. 3.9. Análise da indução da enzima quinona redutase O método foi realizado segundo descrito por Prochascka e Santamaria (1988). Para o ensaio foi utilizada a linhagem Hepa 1c1c7, 200 μL de uma suspensão celular na concentração de 1x104 células/mL, foram plaqueados em placas de 96 poços. Vale a pena ressaltar que, foram realizados três experimentos independentes, cada um com duas placas, uma para o ensaio de QR e outra para testar a viabilidade dos produtos naturais através do ensaio de cristal violeta (cv). As células foram incubadas com os produtos naturais por 48 h e, em seguida, foi realizado o ensaio de QR. O meio foi removido e foram adicionados 50 μL da solução de lise composta por digitonina por 10 min a 37°C e 5% CO2, em seguida, a placa foi submetida agitação por 10 min a 25°C. A QR citosólica foi mensurada pela conversão de glicose 6-fosfato+NADP a 6-fosfogluconato+NADPH pela 6- fosfato desidrogenase. Posteriormente, foi adicionada menadiona que reagiu com NADPH, formando menadiol+NADP. Esta última reação foi catalisada pela QR e a formação do menadiol foi detectada pela redução do sal de MTT, o que mensura indiretamente a 47 atividade da QR. Depois de 5 min, foi realizada leitura a 595 nm em leitor de placas. Em paralelo, foi feita uma placa de células tratadas na mesma condição do experimento e posteriormente coradas com solução de cv 0,2%, seguidas de adição de 5% de SDS em 50% de etanol, por fim foi realizada a leitura a 595 nm em leitor de placas. Dessa forma, estimou-se a citotoxicidade dos produtos naturais na linhagem Hepa 1c1c7. Foram realizados o controle branco, o controle de veículo tratado com DMSO 0,05% e Hanks 2% em α-MEM e o controle positivo tratado com ϐ-naftoflavona (0,1 μM) que é um potente indutor da quinona redutase. As concentrações dos produtos naturais utilizadas foram baseadas no IC20 obtido na linhagem HepG2, uma vez que a mesma possui características semelhantes à Hepa 1c1c7, para o tempo de 48 h como segue: extrato etanólico (0,04 a 0,70 μg/mL), casearina B (0,04 a 0,61 μM), casearina D (0,01 a 0,21 μM), caseargrewiina F (0,03 a 0,44 μM) e casearina X (0,006 a 0,09 μM). Em seguida, foi calculado o índice de redução (IR) do menadiol que indiretamente mede a atividade da quinona redutase, comparando os grupos teste e controle positivo com o controle de veículo, todos descontados do controle branco. O produto natural é considerado um bom indutor de quinona redutase quando seu IR é maior ou igual a 2. A viabilidadee dos produtos naturais foi obtida através da seguinte fórmula: % células vivas = (Absorbância do teste/Absorbância do Controle negativo) x 100 4. ANÁLISE ESTATÍSTICA Para os ensaios de citotoxicidade os IC20 e IC50 foram calculados através da análise de regressão das curvas concentração-resposta, utilizando-se o programa OriginLab® 8.0 Pro (Massachussets, EUA). Já para o ensaio do cometa, a avaliação estatística foi realizada através da análise da porcentagem de DNA na cauda. Uma vez que as 48 freqüências baseadas na cauda do cometa não apresentam distribuição normal (BAUER et al., 1998), foi aplicado o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn para comparação entre os grupos tratados e o controle de veículo (genotoxicidade) e veículo com mutágeno (antigenotoxicidade). Para o ensaio de morte celular por anexina- V/PI e para o ensaio de atividade antioxidante, os grupos tratados foram comparados com o controle de veículo com mutágeno através do teste One-way ANOVA pós-teste de Dunnett. Para todos os testes o nível de significância adotado foi de p<0,05. O software utilizado para a análise estatística foi o programa GraphPad Prism® 5.0 (California, EUA). Especificamente para o ensaio de atividade antioxidante, foi plotada a curva da intensidade de fluorescência em função do tempo e a partir dessa curva, calculou-se a intensidade de fluorescência total para cada tratamento através da obtenção da integral de cada curva (área sob a curva), utilizando-se o programa OriginLab 8.0. 5. RESULTADOS 5.1. Avaliação da citotoxicidade pelos ensaios de MTT e sobrevivência clonogênica Na tabela 1 pode-se observar a comparação dos ICs obtidos nas diferentes linhagens celulares no tratamento de 24 h. Verifica-se que todos os produtos naturais foram menos citotóxicos para a linhagem HepG2 se comparada com as demais linhagens. Comparando as células XP4PA e MRC5, no geral, os produtos naturais foram mais citotóxicos para a linhagem XP4PA. Dentre as substâncias puras, aquela que se demonstrou mais citotóxica para a linhagem HepG2 foi a casearina D, (IC50 de 4,11 μM). Já a caseargrewiina F foi a mais citotóxica para a linhagem MRC5 (IC50 = 0,15 μM), com um alto efeito antiproliferativo observado pelo ensaio de sobrevivência clonogênica (IC20 = 0,006 μM). Na linhagem XP4PA observou-se maior citotoxicidade na casearina B (IC50 = 0,61 μM) e elevado efeito antiproliferativo na caseargrewiina F (IC20 = 0,005 μM). 49 Tabela 1: Comparação entre as concentrações inibitórias obtidas no tempo de 24 h para os produtos naturais derivados de C. sylvestris nas linhagens HepG2, MRC5 e XP4PA. HepG2 MRC5 XP4PA MTT SC MTT SC MTT SC IC20 IC50 IC20 IC20 IC50 IC20 IC20 IC50 IC20 E ( μg/mL) 0,82 9,2 0,82 1,29 2,19 1,29 0,08 0,21 0,08 B (μM) 2,3 5,93 2,3 0,68 0,78 0,34 0,18 0,61 0,09 D (μM) 1,45 4,11 1,45 1,50 5,15 1,50 0,36 1,13 0,36 F (μM) 2,55 4,92 2,55 0,09 0,0015 0,006 0,18 0,90 0,005 X (μM) 2,62 5,05 2,62 2,45 2,90 1,23 0,46 3,00 0,46 B = casearina B, D = casearina D, E = extrato etanólico, F = caseargrewiina F, X = casearina X, SC = sobrevivência clonogênica Na tabela 2 tem-se demonstrada a comparação dos ICs obtidos nas diferentes linhagens celulares testadas no tratamento de 48 h. De modo geral, os produtos naturais foram menos citotóxicos na linhagem HepG2 se comparados com a MRC5 e a XP4PA. O produto natural mais citotóxico para a linhagem HepG2 entre as substâncias puras foi a casearina X (IC50 = 0,81 μM), sendo que o produto natural que apresentou o maior efeito antiproliferativo avaliado pelo ensaio de sobrevivência clonogênica foi a casearina X (IC20 = 0,09 μM). Já na linhagem MRC5, a caseargrewiina F se mostrou a mais citotóxica (IC50 = 0,06 μM) e a com maior efeito antiproliferativo (IC20 = 0,0015 μM), apresentando resultados de IC20 diferentes entre os experimentos de MTT e sobrevivência clonogênica. Já para a linhagem XP4PA, a caseargrewiina F foi a mais citotóxica (IC50 = 0,77 μM), enquanto que a casearina B apresentou o maior efeito antiproliferativo (IC20 = 0,03 μM). 50 Tabela 2: Comparação entre as concentrações inibitórias obtidas no tempo de 48 h para os produtos naturais derivados de C. sylvestris nas linhagens HepG2, MRC5 e XP4PA HepG2 MRC5 XP4PA MTT SC MTT SC MTT SC IC20 IC50 IC20 IC20 IC50 IC20 IC20 IC50 IC20 E ( μg/mL) 0,70 1,39 0,70 0,78 1,09 1,56 0,17 0,52 0,17 B (μM) 0,61 1,52 0,61 0,33 0,56 0,17 0,51 1,40 0,03 D (μM) 0,21 1,08 0,21 1,17 3,13 1,17 0,52 1,30 0,26 F (μM) 1,76 2,46 0,44 0,03 0,06 0,0015 0,12 0,77 0,12 X (μM) 0,37 0,81 0,09 0,89 1,25 0,06 0,84 0,95 0,84 B = casearina B, D = casearina D, E = extrato etanólico, F = caseargrewiina F, X = casearina X, SC = sobrevivência clonogênica. 5.2. Ensaio de genotoxicidade dos produtos naturais de C. sylvestris Este experimento foi realizado para avaliar a genotoxicidade dos produtos naturais em concentrações inferiores ao IC50 previamente determinado pelo ensaio de MTT, com a finalidade de posteriormente realizar o ensaio de antigenotoxicidade em concentrações não genotóxicas e pouco citototóxicas (abaixo do IC20 previamente determinado pelos ensaios de MTT e sobrevivência clonogênica). Vale a pena ressaltar que este experimento foi conduzido utilizando incubação com a enzima FPG que auxilia na detecção de possíveis danos oxidativos provocados pelos produtos naturais. Portanto, na figura 7 estão demonstrados os resultados de genotoxicidade nas linhagens HepG2, MRC5 e XP4PA tratadas por 24 h com os produtos naturais de C. sylvestris. Pode-se observar que para todas as linhagens os produtos naturais foram genotóxicos em todas as concentrações 51 testadas, apresentando padrão concentração-resposta. Ainda, ressalta-se que foram feitos experimentos com duas concentrações menores do que as apresentadas nos gráficos e que as mesmas não foram genotóxicas, entretanto, não foram plotadas a fim de facilitar a visualização dos resultados. Em geral, o produto natural que se mostrou mais genotóxico na linhagem HepG2, foi o extrato etanólico seguido da casearina B. Já para a linhagem MRC5, a caseargrewiina F foi a mais genotóxica, e claramente, a casearina X a menos genotóxica. Na linhagem XP4PA observa-se uma alta genotoxicidade do extrato etanólico a partir da concentração de 0,38 μg/mL, sendo que os produtos naturais casearina B e caseargrewiina F apresentaram elevada genotoxicidade na concentração de 1,5 μM. Ao se fazer uma comparação entre o potencial genotóxico dos produtos naturais nas maiores concentrações testadas para cada linhagem celular, obtem-se os seguintes resultados em ordem crescente de genotoxicidade: linhagem HepG2 (4,6 μM/ μg/mL): casearina D < caseargrewiina F < casearina X < casearina B < extrato etanólico. Linhagem MRC5 (2,5 μM/ μg/mL) casearina X < casearina B < casearina D < extrato etanólico < caseargrewiina F. Linhagem XP4PA (1,5 μM/ μg/mL): casearina D < casearina X < caseargrewiina F < extrato etanólico < casearina B. 52 Fi gu ra 7 : G en ot ox ic id ad e do s pr od ut os n at ur ai s de C . s yl ve st ris p el o en sa io d o co m et a – tra ta m en to d e 24 h e in cu ba çã o co m e nz im a FP G . A ) cé lu la s H ep G 2; B ) cé lu la s M R C 5; C ) cé lu la s XP 4P A . E = e xt ra to e ta nó lic o, B = c as ea rin a B , D = c as ea rin a D , F = c as ea rg re w iin a F, X = c as ea rin a X, C N = c on tro le n eg at iv o (c él ul as n ão tr at ad as , m an tid as c om D M E M ); C V = c on tro le d e ve íc ul o (D M S O 0 ,0 5% e H an ks 2 % d ilu íd os e m D M E M ).a p< 0, 05 ; b p< 0, 01 e c p< 0, 00 1. K ru sk al -W al lis p ós -te st e D un n co m pa ra do c om C V . a b b a b c c c c a a a c c c c b c a a c c c b A B C a 53 5.3. Ensaio de antigenotoxicidade dos produtos naturais extraídos de C. sylvestris Os ensaios de antigenotoxicidade foram realizados a fim de verificar a possível atividade protetora dos produtos naturais de C. sylvestris frente à mutágenos específicos. As concentrações dos produtos naturais de C. sylvestris foram escolhidas a partir dos resultados de genotoxicidade e citotoxicidade, e foram analisadas concentrações inferiores àquelas que mostraram baixa resposta genotóxica e citotóxica. Para esse trabalho, foram utilizados os mutágenos H2O2 (HepG2) e UVC (MRC5 e XP4PA). Dessa forma, as células foram pré e pós-tratadas com os produtos naturais frente aos mutágenos. No caso do controle positivo foi realizado pré ou pós-tratamento com DMEM frente aos mutágeno. Já o controle de veículo tinha por objetivo verificar se a concentração máxima veículo com mutágeno (DMSO 0,05% e Hanks 2% diluídos em DMEM) em que os produtos naturais estavam diluídos e que foi utilizada no ensaio, não interferia na resposta antigenotóxica. Portanto, para o controle de veículo as linhagens foram pré ou pós-tratadas com DMSO 0,05% e Hanks 2% diluídos em DMEM frente aos mutágenos. Como controle negativo as células foram tratadas somente com DMEM que é o meio de cultura de crescimento das células. Na figura 8 estão demonstrados os experimentos de antigenotoxicidade com pré e pós-tratamento dos produtos naturais de C. sylvestris na linhagem HepG2 frente ao mutágeno H2O2 (1mM), assim como a porcentagem de inibição dos produtos naturais frente aos danos. Pode-se observar um efeito concentração-resposta dos produtos naturais, sendo que os produtos naturais que apresentaram inibição forte (>60%) foram o extrato etanólico a partir de 0,08 μg/mL e a casearina D a partir de 0,15 μM, enquanto que a casearina B apresentou inibição moderada (entre 40 e 60%) na concentração de 0,3 μM. Já no pós-tratamento foram observadas inibição forte pelas casearinas B e D, e moderada pela casearina X e caseargrewiina F. 54 Fi gu ra 8 :A nt ig en ot ox ic id ad e do s pr od ut os n at ur ai s de C . s yl ve st ris e m c él ul as H ep G 2. A ) P ré -tr at am en to d e 24 h c om o s pr od ut os n at ur ai s, s eg ui do d e 5 m in d e ex po si çã o co m H 2O 2 ( 1m M ); B ) P or ce nt ag em d e in ib iç ão d os d an os a o D N A re la tiv o ao tr at am en to d es cr ito e m A . C ) P ós -tr at am en to d e 24 h d as c él ul as c om o s pr od ut os n at ur ai s ap ós ex po si çã o ao H 2O 2 (1 m M ) p or 5 m in ut os . D ) P or ce nt ag em d e in ib iç ão d os d an os a o D N A re fe re nt e ao tr at am en to d es cr ito e m C . E = e xt ra to e ta nó lic o, B = c as ea rin a B , D = ca se ar in a D , F = c as ea rg re w iin a F, X = c as ea rin a X , C N = c on tro le n eg at iv o (c él ul as n ão tr at ad as , m an tid as c om D M E M ); C V M = c on tro le d e ve íc ul o co m m ut ág en o (H 2O 2 (1 m M ) e p ré o u pó s- tra ta m en to c om D M SO 0 ,0 5% e H an ks 2 % d ilu íd os e m D M EM ). a p< 0, 05 ; b p< 0, 01 e c p< 0, 00 1. K ru sk al -W al lis p ós -te st e D un n co m pa ra do c om C V M . ne gl ig en ci áv el ne gl ig en ci áv el fra ca fra ca m od er ad a m od er ad a fo rte fo rte c c c c c c c c a a a a b a a b c b c b c A B C D C V M C V M 55 Os experimentos de antigenotoxicidade com as linhagens MRC5 e XP4PA foram realizados com e sem incubação dos produtos naturais com o pool de enzimas microssomais S9 para verificar se a metabolização dos mesmos poderia alterar o possível efeito protetor de danos ao DNA. Uma vez que a linhagem HepG2 naturalmente expressa enzimas metabolizadoras, o pool de S9 não foi utilizado para a mesma. Nas figuras 9 e 10 estão demonstrados os experimentos de antigenotoxicidade com pré e pós-tratamento dos produtos naturais de C. sylvestris na linhagem MRC5 frente ao mutágeno UVC (26,45 J/m2), com e sem a incubação por S9. De forma geral é possível notar que não houve diferença na inibição dos danos ao DNA, induzidos pelo UVC, pelos produtos naturais incubados e não incubados com S9. O único produto natural que apresentou inibição moderada (entre 40 e 60%) tanto no pré como no pós tratamento sem incubação com S9 e no pós-tratamento com incubação com S9 foi a casearina B na concentração de 0,04 μM. Os demais produtos naturais apresentaram inibição fraca (entre 20 e 40%) ou negligenciável (de 0 a 20%). Já na linhagem XP4PA, (Figuras 11 e 12) o produto natural que apresentou maior inibição frente ao mutágeno UVC (3,59 J/m2) foi a caseargrewiina F, sendo que esta foi no máximo fraca (20%), enquanto que os outros produtos naturais apresentaram inibição negligenciável dos danos. Ainda, não foi observada diferença significante entre os resultados obtidos com e sem incubação com S9. 56 Fi gu ra 9 : A nt ig en ot ox ic id ad e do s pr od ut os n at ur ai s de C . s yl ve st ris e m c él ul as M R C 5 se m in cu ba çã o co m S 9. A ) P ré -tr at am en to d e 24 h c om o s pr od ut os n at ur ai s, s eg ui do d e U V C ( 26 ,4 5 J/ m 2 ). B ) P or ce nt ag em d e in ib iç ão d os d an os a o D N A r ef er en te a o tra ta m en to d es cr ito e m A . C ) P ós -tr at am en to d e 24 h d as c él ul as c om o s pr od ut os n at ur ai s ap ós U V C ( 26 ,4 5 J/ m 2 ). D ) P or ce nt ag em d e in ib iç ão d os d an os a o D N A r ef er en te a o tra ta m en to d es cr ito e m C . E = e xt ra to e ta nó lic o, B = c as ea rin a B , D = c as ea rin a D , F = c as ea rg re w iin a F, X = c as ea rin a X, C N = co nt ro le n eg at iv o (c él ul as n ão tr at ad as , m an tid as c om D M E M ); C V M = c on tro le d e ve íc ul o co m m ut ág en o (U V C (2 6, 45 J /m 2 ) e p ré o u pó s- tra ta m en to c om D M S O 0 ,0 5% e H an ks 2 % d ilu íd os em D M E M ). a p< 0, 05 ; b p< 0, 01 e c p< 0, 00 1. K ru sk al -W al lis p ós -te st e D un n co m pa ra do c om C V M . ne gl ig en ci áv el ne gl ig en ci áv el fra ca fra ca m od er ad a m od er ad a fo rte fo rte a c c c b b c a a a a A B C D C V M C V M 57 Fi gu ra 1 0: A nt ig en ot ox ic id ad e do s pr od ut os n at ur ai s de C . s yl ve st ris e m c él ul as M R C 5 co m in cu ba çã o co m S 9. A ) P ré -tr at am en to d e 24 h c om o s pr od ut os n at ur ai s, s eg ui do de U V C (2 6, 45 J /m 2 ). B ) P or ce nt ag em d e in ib iç ão d os d an os a o D N A re fe re nt e ao tr at am en to d es cr ito e m A . C ) P ós -tr at am en to d e 24 h d as c él ul as c om o s pr od ut os n at ur ai s ap ós U V C ( 26 ,4 5 J/ m 2 ). D ) P or ce nt ag em d e in ib iç ão d os d an os a o D N A r ef er en te a o tra ta m en to d es cr ito e m C . E = e xt ra to e ta nó lic o, B = c as ea rin a B , D = c as ea rin a D , F = ca se ar gr ew iin a F, X = c as ea rin a X , C N = c on tro le n eg at iv o (c él ul as n ão tr at ad as , m an tid as c om D M E M ); C V M = c on tro le d e ve íc ul o co m m ut ág en o ( U V C (2 6, 45 J /m 2 ) e p ré o u pó s- tra ta m en to c om D M SO 0 ,0 5% e H an ks 2 % d ilu íd os e m D M EM ). a p< 0, 05 ; b p< 0, 01 e c p< 0, 00 1. K ru sk al -W al lis p ós -te st e D un n co m pa ra do c om C V M . ne gl ig en ci áv el ne gl ig en ci áv el fra ca fra ca m od er ad a m od er ad a fo rte fo rte a a b a a a a a a b a D C B A c c C V M C V M 58 Fi gu ra 1 1: A nt ig en ot ox ic id ad e do s pr od ut os n at ur ai s de C . sy lv es tri s em c él ul as X P4 P A se m in cu ba çã o co m S 9. A ) P ré -tr at am en to d e 24 h c om o s pr od ut os n at ur ai s, se gu id o de U VC (3 ,5 9 J/ m 2 ). B ) P or ce nt ag em d e in ib iç ão d os d an os a o D N A re fe re nt e ao tr at am en to d es cr ito e m A . C ) P ós -tr at am en to d e 24 h d as c él ul as c om o s pr od ut os na tu ra is a pó s U VC (3 ,5 9 J/ m 2 ). D ) P or ce nt ag em d e in ib iç ão d os d an os a o D N A re fe re nt e ao tr at am en to d es cr ito e m C . E = e xt ra to e ta nó lic o, B = c as ea rin a B, D = c as ea rin a D , F = c as ea rg re w iin a F, X = c as ea rin a X , C N = c on tro le n eg at iv o (c él ul as n ão tr at ad as , m an tid as c om D M EM ); C V M = c on tro le d e ve íc ul o co m m ut ág en o (U V C