1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” CÂMPUS DE ILHA SOLTEIRA NELSON CÂMARA DE SOUZA JÚNIOR PRODUTIVIDADE DA SOJA EM FUNÇÃO DA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE MAGNÉSIO FOLIAR E RIZOBACTÉRIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO PARA MITIGAÇÃO DO ESTRESSE TÉRMICO EM CONDIÇÕES DE CAMPO Ilha Solteira - SP 2025 NELSON CÂMARA DE SOUZA JÚNIOR PRODUTIVIDADE DA SOJA EM FUNÇÃO DA PRESENÇA OU AUSÊNCIA DE MAGNÉSIO FOLIAR E RIZOBACTÉRIAS PROMOTORAS DE CRESCIMENTO PARA MITIGAÇÃO DO ESTRESSE TÉRMICO EM CONDIÇÕES DE CAMPO Dissertação apresentada à Universidade Estadual Paulista (UNESP), Faculdade de Engenharia, campus de Ilha Solteira, para obtenção do título de Mestre em Agronomia. Área de Concentração: Sistemas de Produção Orientador: Prof. Dr. Marcelo Andreotti Coorientadora: Prof. Drª. Liliane Santos de Camargos Ilha Solteira - SP 2025 IMPACTO POTENCIAL DESTA PESQUISA Esta pesquisa pode auxiliar diretamente na segurança alimentar, visto que as mudanças climáticas são iminentes e representam constantes perdas produtivas, os ganhos constatados podem vir a ser destaque para o refinamento da produção agrícola. POTENTIAL IMPACT OF THIS RESEARCH This research can directly contribute to food security, as climate change is imminent and represents constant production losses. The observed gains could become a highlight for refining agricultural production. Dedico este trabalho à minha mãe Raquel Santos, que sempre acreditou nos meus sonhos. AGRADECIMENTOS Primeiramente, agradeço a Deus que me ajuda em todos os momentos e me dá forças para continuar lutando e perseverando para conquistar as coisas que almejo. Agradeço a UNESP (Faculdade de Engenharia de Ilha Solteira), e todos os funcionários da Fazenda de Ensino e Pesquisa (FEPE) pelo carinho e empenho para condução desse projeto de pesquisa. Aos amigos do grupo de pesquisa Equipe Andreotti, pelo empenho e dedicação em auxiliar em todas as etapas de condução desse experimento. Sem sua ajuda constante, esse trabalho não poderia ser realizado. Agradeço a minha amiga Vitória Almeida Moreira Girardi pelo auxílio e empenho constante para auxiliar na condução desse projeto, o qual sem sua ajuda não se realizaria. Minha eterna gratidão por fazer parte do meu sonho. Meu carinho e minha gratidão ao meu orientador e amigo Marcelo Andreotti. Sou grato pela ideia do projeto e possibilidade de condução do mesmo. Obrigado por confiar em mim, por ser um pilar para realização desse experimento e pela confiança depositada em todas as atividades. A minha coorientadora Liliane Santos de Camargos e todos os alunos do Laboratório de Morfofisiologia os quais contribuíram grandemente para realização dessa pesquisa. Minha eterna gratidão a minha mãe Raquel Santos (in memoriam), que sempre me incentivou a realizar esse sonho. Ela me fez lembrar que a vida é feita de sonhos, os quais as vezes demoram a se realizar, mas que com coragem e um pouco de fé podem ser sempre reais. Essa conquista é dela e sempre será para ela. Esse projeto de pesquisa foi financiado pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), com número de concessão 88887.904424/2023-00. “Se podemos sonhar, também podemos tornar nossos sonhos realidade”. Tom Fitzgerald https://www.pensador.com/autor/tom_fitzgerald/ RESUMO As bactérias promotoras de crescimento de plantas, aliadas a nutrição mineral adequada têm se mostrado essenciais para aumentar a produtividade agrícola. Com as mudanças climáticas, as plantas enfrentam estresses, o que prejudica a produção. O presente trabalho teve como objetivo avaliar o efeito da inoculação de rizobactérias, bem como aplicação de magnésio via foliar, como bioestimulante fisiológico e seus efeitos na produtividade de grãos de soja. A pesquisa foi conduzida em campo, em solo de cerrado sob sistema plantio direto, que tem o histórico de combinar técnicas de manutenção de palhada no solo e rotação de culturas por treze anos. O delineamento experimental adotado foi em blocos ao acaso, em esquema fatorial 3x2, onde foram avaliados três tratamentos com bactérias (Bradyrhizobium japonicum nas sementes (controle), combinação de B. japonicum nas sementes + Bacillus subtilis + Bacillus megaterium no sulco; B. japonicum nas sementes + B. subtilis + B. megaterium nas sementes), com presença ou ausência de magnésio via foliar, tendo como fonte o sulfato de magnésio na dose padrão de 8 kg ha-1, em estádio V6 da soja. Os resultados comprovaram que a aplicação de magnésio foi capaz de auxiliar na fisiologia fotossintética de modo geral, além de proporcionar aumentos na produção de grãos. A interação com a coinoculação via sementes foi capaz de aumentar a fotossíntese e eficiência instantânea do uso da água, além de número de grãos e de vagens por planta. Pela análise dos componentes principais (PCA), foi constatado que aliar a coinoculação via sementes e a aplicação de Mg via foliar pode melhorar a fisiologia fotossintética e reduzir indicadores de estresse na soja. PALAVRAS-CHAVE: Bacillus subtilis; Bacillus megaterium; fisiologia vegetal; Glycine max L.; refinamento da produção. ABSTRACT Plant growth-promoting bacteria, combined with proper mineral nutrition, have proven essential in increasing agricultural productivity. With climate change, plants face stresses that hinder production. The present study aimed to evaluate the effect of rhizobacteria inoculation, as well as foliar magnesium application as a physiological biostimulant, and their effects on soybean grain productivity. The research was conducted in the field on cerrado soil under a no- till system, which has a history of combining techniques for maintaining crop residue in the soil and crop rotation for thirteen years. The experimental design adopted was a randomized block design, in a 3x2 factorial scheme, where three treatments with bacteria were evaluated (Bradyrhizobium japonicum on seeds (control), a combination of B. japonicum on seeds + Bacillus subtilis + Bacillus megaterium in the furrow; B. japonicum on seeds + B. subtilis + B. megaterium on seeds), with the presence or absence of foliar magnesium application, using magnesium sulfate at the standard dose of 8 kg ha-1 at the V6 stage of soybean. The results showed that magnesium application helped overall photosynthetic physiology, as well as providing increases in grain production. The interaction with co-inoculation via seeds was able to increase photosynthesis and instantaneous water use efficiency, in addition to the number of grains and pods per plant. Principal component analysis (PCA) revealed that combining seed co-inoculation with foliar Mg application could improve photosynthetic physiology and reduce stress indicators in soybeans. KEYWORDS: Bacillus subtilis; Bacillus megaterium; plant physiology; Glycine max L., production refinement. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Localização da área experimental no município de Selvíria - MS, Brasil .............. 29 Figura 2 – Dados meteorológicos de temperatura máxima, mínima e precipitação pluvial, no município de Selvíria – MS, Brasil, 2023/24, durante o período de condução do experimento .................................................................................................................................................. 30 Figura 3 – Instalação, aplicação e avaliações na cultura da Soja no munícipio de Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 ................................................................................................................. 32 Figura 4 – Desdobramento para variáveis Taxa fotossintética (A), Carbono interno (CI) e Eficiência instantânea do uso da água (EIUA) na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, Selvíria-MS, Brasil, safra 2023/24. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas dentro de inoculação/coinoculação e minúsculas dentro de aplicação do Mg não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05). ......................................................................... 41 Figura 5 – Desdobramento para variável Número de vagens por planta (NVP) Número de grãos por planta (NGP) na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas dentro de inoculação/coinoculação e minúsculas dentro de aplicação do Mg não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05)..................................................................................................................... 44 Figura 6 – Análise de componentes principais (PCA) em função da aplicação ou não de magnésio sob os parâmetros fisiológicos e produtivos da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, no munícipio de Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 ........................................ 46 Figura 7 – Análise de componentes principais (PCA) em função da inoculação ou coinoculação de rizobactérias sob os parâmetros fisiológicos e produtivos da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, no munícipio de Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 ........................ 47 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Caracterização química do solo na camada de 0-0,20 em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 ..................................................................................................................................... 31 Tabela 2 – Análise de variância para as variáveis clorofila a, clorofila b, clorofilas totais, carotenoides e feofitina na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 ......................................................................................... 37 Tabela 3 – Análise de variância para as variáveis ureídeos, malondialdeído (MDA), proteína, peróxido, aminoácidos (AA) e índice relativo de clorofila (SPAD) na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 ........................ 38 Tabela 4 – Análise de variância para as variáveis Taxa fotossintética (A), Transpiração (E), Condutância estomática (GS), Carbono interno (CI) e Eficiência instantânea do uso da água (EIUA) na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS .................................................................................................................................................. 40 Tabela 5 – Análise de variância para as variáveis Altura de planta (AltP), Altura de inserção da primeira vagem (AIPV), População de plantas (Pop), Número de vagens por planta (NVP), Número de grãos por vagem (NGP), Massa de 100 grãos (M100) e Produtividade de grãos (Prod), para cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 ................................................................................................................. 42 Tabela 6 – Dados de correlação para análise de componentes principais (PCA) na cultura da soja sob presença ou ausência da pulverização de magnésio foliar e rizobactérias promotoras de crescimento, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 ......................................................... 45 LISTA DE QUADROS Quadro 1 – Estágios de desenvolvimento vegetativo da cultura da soja .................................. 19 Quadro 2 – Estágios de desenvolvimento reprodutivo da soja ................................................. 19 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS A - Taxa fotossintética AIPV - Altura de inserção da primeira vagem Al - Alumínio. AltP - Altura de planta CI - Carbono interno CONAB - Companhia Nacional de Abastecimento. E - Transpiração EIUA - Eficiência instantânea do uso da água EMBRAPA - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária EROs - Espécies reativas de oxigênio FBN - Fixação biológica de nitrogênio GS - Condutância estomática I - Inoculação MDA - Malondialdeído M100 - Massa de cem grãos NGP - Número de grãos por planta NVP - Número de vagens por planta O - Oxigênio P - Pulverização Pig - Pigmentos fotossintetizantes (SPAD) Perox - Peróxido de hidrogênio POP - População de plantas. PROD - Produtividade de grãos Prot - Proteínas RBPCP - Rizobatérias promotoras de crescimento de plantas. Rubisco - Ribulose 1,5 bifosfato carboxilase/oxigenasse. SPD - Sistema plantio direto URED - Ureídeos SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 14 2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 17 2.1 Cultura da Soja ........................................................................................................... 17 2.2 Magnésio ...................................................................................................................... 20 2.3 Estresses abióticos e mudanças climáticas ................................................................ 23 2.4 Espécies reativas de oxigênio ..................................................................................... 24 2.5 Bactérias promotoras de crescimento de plantas e fixadoras de nitrogênio ......... 25 3 OBJETIVOS ................................................................................................................ 28 3.1 Objetivo Geral ............................................................................................................. 28 3.2 Objetivos Específicos .................................................................................................. 28 4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................ 29 4.1 Características da área e do local .............................................................................. 29 4.2 Instalação e Condução do Experimento ................................................................... 31 4.3 Avaliações fisiológicas ................................................................................................. 33 4.3.1 Avaliação de trocas gasosas ........................................................................................ 33 4.3.2 Pigmentos fotossintetizantes ...................................................................................... 33 4.3.3 Caracterização do metabolismo de nitrogênio e mecanismo de tolerância ao estresse ......................................................................................................................... 33 4.4 Avaliações dos componentes da produção e produtividade da soja ....................... 35 4.5 Análise estatística ........................................................................................................ 36 5 RESULTADOS ............................................................................................................ 37 6 DISCUSSÃO ............................................................................................................... 48 7 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 53 REFERÊNCIAS .......................................................................................................... 54 14 1 INTRODUÇÃO O magnésio (Mg) desempenha importante papel em processos fisiológicos das plantas, visto que é o íon central da molécula de clorofila. Além disso, desempenha importância na síntese de enzimas como a Ribulose 1,5-Bifosfato carboxilase/oxigenase (Rubisco) e Fosfoenolpiruvato carboxilase (PEPcase), enzimas vitais para o processo fotossintético, além de atuar como elemento essencial para a produção de trifosfato de adenosina (ATP) (Taiz et al., 2017). Todas essas funções tornam a adubação com Mg essencial para garantir produtividade em plantas de metabolismo C3 e C4. Estudos com aplicações foliares de Mg, em fases onde a eficiência de absorção radicular passa a diminuir, tem indicado que a aplicação do nutriente é capaz de proporcionar ganhos em produtividade, pelo fato de melhoria do aparato fotossintético das plantas (Wang et al., 2020). Como o Mg auxilia em processos fotossintéticos vitais, colaborando para que a Rubisco atue como carboxilase, e pelo fato de que cerca de 85% das espécies do planeta serem plantas de metabolismo C3, altamente propensas a perdas por estresses (Taiz et al., 2017), além do aumento considerável da temperatura anual, o que aumenta a temperatura foliar, favorecendo a fotorrespiração e afetando a relação CO2/O2, as pesquisas com o nutriente são indispensáveis em projetos de inovação científica que visam refinar a produção agrícola e auxiliar a planta em parâmetros fisiológicos. Mesmo em sistema plantio direto (SPD) consolidado por anos, resultados mostram que culturas como soja e milho, quando receberam aplicações foliares de Mg, apresentaram algo similar a um “efeito de indução de resistência ou efeito vacina”, onde parâmetros fotossintéticos foram afetados positivamente, o que acarretou para culturas ganhos consideráveis em produtividade (Altarugio et al., 2017; Branquinho, 2020; Rodrigues et al., 2021). Com a crescente demanda mundial por alimentos, atrelado às mudanças climáticas, técnicas que proporcionem ganhos de produção ganham cada vez mais destaque e merecem foco em pesquisa científica mundial. As ondas de calor e secas severas tem afetado o potencial produtivo das culturas, o qual só poderá ser atingido se todas as condições necessárias (água, luz, temperatura, nutrição) para desenvolvimento vegetal forem satisfatórias. Pesquisas que visem auxiliar na mitigação de estresses abióticos nas culturas são fundamentais, visto que estes podem afetar negativamente a segurança alimentar. Déficits hídricos e temperaturas extremas, são fatores climáticos incontroláveis presentes na vida de produtores rurais. Temperaturas altas provocam danos diretos nas plantas, ocasionando aquecimento de tecidos, podendo causar também efeitos indiretos como o déficit hídrico, o que pode reduzir a turgescência das células. Além disso, 15 plantas sob estresse térmico podem ter sua expressão gênica diretamente afetada, pois a planta tende a preservar suas reservas para completar seu ciclo de vida, o que reduz diretamente a produção. O aumento da fotorrespiração, além da produção de compostos EROs (espécies reativas de oxigênio), também são vitais para diminuir a produção, com danos na produção de proteínas e redução direta no metabolismo fotossintético, que aparecem como resultado ao estresse térmico (Pretty; Bharucha 2014; Taiz et al., 2017; Hasanuzzaman et al., 2020). A resposta da planta para qualquer tipo de estresse irá variar de espécie para espécie, porém à medida que a planta percebe qualquer efeito estressante, ela produz uma resposta metabólica conhecida como “espécies reativas de oxigênio” ou “EROs”. Essas moléculas servem para planta como uma espécie de sinalizador, indicando que algo de errado está acontecendo, com reflexo direto na diminuição do metabolismo, afetando a produção de compostos essenciais como proteínas, lipídeos e ácidos nucléicos (Taiz et al., 2017). Sendo assim, quanto aos estresses abióticos, o reflexo principal na planta é a diminuição do seu metabolismo, fechamento estomático, enrolamento das folhas, menores taxas fotossintéticas, desenvolvimento de cutícula e tricomas na superfície foliar, para minimizar perdas de água, com o objetivo principal de terminar seu ciclo de vida (Taiz et al., 2017; Broetto et al., 2017). Sendo assim, estratégias que visem afetar diretamente o metabolismo fotossintético dessas plantas tornam-se indispensáveis, visto o constante aumento de fatores estressantes, resultado das mudanças climáticas globais. Toma-se como destaque as ondas de calor extremas, que fizeram a temperatura média do planeta aumentar cerca de 1,45°C no ano de 2023 (Organização das Nações Unidas, 2024). Para auxiliar na mitigação desses estresses abióticos iminentes, outro aliado comum utilizado na agricultura são as rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RBPCP), que auxiliam no crescimento de raízes, melhorando a exploração do solo, beneficiando a absorção de água e nutrientes (Poudel et al., 2021; Armanhi et al., 2021). Em soja, o gênero Bradyrhizobium é comumente difundido, pelo papel preponderante na fixação biológica de nitrogênio (FBN), o que aumenta consideravelmente parâmetros de produção da cultura, e faz a soja brasileira ser altamente produtiva, sem necessidade do uso do adubo nitrogenado (Hungria et al., 2001; Hungria; Nogueira 2020). As bactérias do gênero Bacillus também se destacam como RBPCP, comumente empregadas em práticas de coinoculação (misturas de diferentes espécies e gêneros de bactérias), auxiliando na defesa de plantas contra estreses bióticos, como no ataque de patógenos e de pragas, e abióticos como tolerância à déficits hídricos, sendo que essas também 16 atuam no crescimento das plantas e absorção de nutrientes, síntese de fitormônios, produção de sideróforos e melhorias nas condições microbiológicas e na fertilidade do solo, auxiliando na solubilização de nutrientes (Kumar et al., 2009; Taha et al. 2016; Ribeiro et al. 2016; Duca; Glick, 2020). Em estudos com a combinação de espécies do gênero Bacillus megaterium e Bacillus subtilis, tem sido observado ganhos em produtividade nas culturas, explicados pela maior solubilização de fósforo não lábil pelas bactérias e pelo sistema radicular bem desenvolvido, capaz de aumentar a quantidade de pelos radiculares, o que incrementa na absorção de água e nutrientes (Gupta et al., 2015; Furmam et al., 2019). A soja é uma das culturas agronômicas de maior destaque no Brasil e no mundo, e, segundo dados da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2024), a estimativa de produção da safra brasileira de soja em 2023/24 chegou a 147,35 milhões de toneladas, um decréscimo de aproximadamente 7 milhões de toneladas, reflexo dos estresses abióticos, principalmente déficit hídrico, em ocasião da falta de chuvas, e ondas de calor em meados de novembro a fevereiro, durante o período de produção. O Brasil é hoje o maior produtor mundial de soja, segundo o relatório da CONAB, e a cultura é uma das mais propensas a efeitos de estresses, justamente por ser uma planta de metabolismo C3, altamente influenciada pelo fotoperíodo, ou seja, pela duração dos períodos sob luz (Taiz et al., 2017). Portanto, pela sua importância na agricultura mundial, estratégias que visem aumentar a produção de maneira sustentável, são indispensáveis para garantir a segurança alimentar mundial, além de que são bem-vistas pelo mercado consumidor e por produtores. O Mg, aliado à coinoculação de rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RBPCP), pode contribuir para a melhoria do metabolismo fotossintético da soja, resultando em benefícios, mesmo em solos com fertilidade corrigida. Essa otimização fotossintética favorece a planta, permitindo que, mesmo diante de estresses abióticos, como as oscilações térmicas, haja impacto positivo em ganhos produtivos da cultura. 17 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 Cultura da Soja Atualmente, as principais cultivares comerciais de soja apresentam um caule espesso, que é pouco ramificado. Sua raiz possui um eixo principal, com raízes laterais bastante ramificadas. A planta é uma leguminosa oleaginosa, que forma vagens e possui flor autógama de coloração roxa. Suas vagens possuem de 1 a 3 sementes, variando de 5 a 11 mm e pesando cerca de 120 a 180 mg por semente. A altura das plantas varia de 60 a 110 cm de comprimento e é uma cultura altamente influenciada pelo ambiente. A soja pode ser considerada uma planta de dias curtos. Seus grãos são altamente ricos em óleos e proteínas, por isso há um interesse grande em sua produção em caráter mundial (Larcher, 2006; Mundo Ecologia, 2019; Silva, 2023). A planta é de metabolismo C3, o que indica que a espécie é altamente susceptível à altas temperaturas, pois a enzima que catalisa a conversão do CO2 (Ribulose-1,5-bifosfato carboxilase/oxigenase, ou, RUBISCO) em carboidratos, pode agir como oxigenase (alta afinidade com o O2), em condições de estresse, o que afeta os parâmetros fotossintéticos e consequentemente diminui a produção. A soja é uma espécie fotossensível de dia curto (necessita de um mínimo de horas no escuro para que possa florescer), sendo induzida ao florescimento quando os valores de fotoperíodo no ambiente de produção passam a ser inferiores ao valor do fotoperíodo crítico da cultivar. Em geral, para manter suas taxas fotossintéticas adequadas para o desenvolvimento, pesquisadores afirmam que a soja suporte até aproximadamente 30°C, sendo que a temperatura de 27°C é ideal para fotossíntese e assimilação de nutrientes, e temperaturas entre 20 e 22°C, são ideais na fase reprodutiva, sendo altamente prejudicada pela concentração de Al no solo (Cakmak, Horst, 1991; Larcher, 2006; Taiz et al., 2017). A soja apresenta grande interesse comercial em caráter humano e animal, sendo que além da produção de óleo de cozinha, o grão pode ser usado para produção de leite de soja, tofu, proteína de soja - no caso da alimentação humana e biocombustíveis. Para produção animal, o coproduto da produção de soja, denominado de bolo ou torta (uma espécie de resíduo que é obtido após a extração do óleo e da água da semente), serve para produção de rações animais, por conta de sua alta concentração de proteínas. Além disso, a produção de biodiesel, como um coproduto da produção de soja, tem comumente sido desenvolvida ao redor do mundo (Mundo Ecologia, 2019; Nepomuceno et al., 2021; Santos; Debiasi, 2021). 18 Por sua alta importância quanto cultura, a soja tem sido cada vez mais explorada e cultivada no país. Segundo informações do Canal Rural (2019) e da Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB, 2021), a soja é a principal cultura do país, sendo grande responsável pela balança comercial - o que atrai o interesse de produtores, pois a rentabilidade da cultura e sua produção é altamente significativa. Segundo os órgãos, há 26 anos, desde que o Brasil possui dados mais confiáveis de suas exportações, a cultura da soja vem liderando o saldo da balança comercial. A CONAB reporta que, a área de soja no país passou de 11,3 milhões de hectares, para pouco mais de 43,5 milhões em 2021. Com uma produção média de 58,7 sacas por hectare, o que gera uma produção anual de aproximadamente 150 milhões de toneladas de soja. Em 2024, os dados observados foram diferentes, pois a produção de soja nacional chegou a 147,3 milhões de toneladas. Vale destacar que, esse número representou uma redução de 7,2 milhões de toneladas em relação à safra anterior em produção total, o que acarretou uma produção média de 53,4 sacas ha-1 (CONAB, 2024). Pesquisadores destacam que essa queda é um reflexo iminente das mudanças climáticas que causam estresses consideráveis nas plantas. O Brasil exerce protagonismo quando o assunto é exportação, pois cerca de 101 milhões de toneladas na safra 2022/23 e pouco mais de 92 milhões de toneladas na safra 2023/24 de grãos foram exportadas do país (CONAB, 2024). Segundo as pesquisas científicas realizadas pela EMBRAPA, o país tem se destacado ainda mais no cenário mundial, e a utilização de novas técnicas e pesquisas altamente rigorosas para aumento de produtividade da cultura, são de extrema importância para que o Brasil se coloque no atual patamar em que se encontra, principalmente com técnicas que visem auxiliar na mitigação de estresses, que acarretam perdas consideráveis para a cultura (Hirakur; Lazzarotto, 2014; Silva, 2023). A pesquisa científica tem sido um aliado na produção de soja no país, e inúmeros pesquisadores afirmam que o aumento de produtividade da soja só se dá por novas técnicas de manejo. Isso faz com que a cultura seja uma das mais tecnificadas no mundo. Novas técnicas de manejo e conservação do solo, aplicação de rizobactérias, melhoramento genético e conhecimento de manejo e tratos culturais, tem sido destaque na pesquisa para que a soja venha a ocupar tal patamar (Tavares, 2021). A fenologia da cultura subdivide-se em duas grandes fases: a primeira vegetativa (dividida em pelo menos cinco estádios, a qual será responsável por iniciar a emergência da plântula, formar a primeira folha trifoliada, encerrando a fase com a formação da última folha trifoliada), e a fase reprodutiva (dividida em pelo menos oito estádios, a qual é responsável pela formação de flores, vagens e grãos). A duração desses estádios fenológicos da cultura, vai variar 19 de acordo com condições ambientais e também com a cultivar escolhida. De forma geral, o ciclo da soja, pode variar de 90 até 150 dias, sendo que os principais fatores que afetam essa relação serão a latitude, o fotoperíodo e a temperatura (acúmulo de graus dia). O manejo integrado de pragas (MIP), práticas de monitoramento em campo, adequadas práticas de cultivo, como rotação de culturas e plantio direto, e uso de irrigação, podem afetar os estágios de desenvolvimento da cultura. Nesse caso, boas práticas e bom uso de tecnologias são essenciais para atingir altas produtividades (Silva, 2023). Nos quadros 1 e 2 são apresentados os estádios fenológicos que descrevem melhor o desenvolvimento da cultura da soja. Quadro 1 – Estágios de desenvolvimento vegetativo da cultura da soja Fases: Identificação: VE Emergência da plântula, onde os cotilédones ficam acima do solo. VC Fase cotiledonar, destacada pelo desenvolvimento dos cotilédones e folhas unifoliadas que não se tocam mais. V1 Formação da primeira folha trifoliada. V2 Formação da secunda folha trifoliada. V3...Vn Formação da terceira folha trifoliada, até a formação da última folha trifoliada antes do florescimento. Fonte: Adaptado de Trentin et al. (2013); Silva (2023). Quadro 2 – Estágios de desenvolvimento reprodutivo da soja Fases: Identificação: R1 Início do florescimento, onde encontra-se ao menos uma flor aberta. R2 Florescimento pleno, onde há uma flor aberta na parte superior da planta. R3 Início do enchimento das vagens. R4 Enchimento pleno das vagens. R5 Início do enchimento dos grãos. R6 Enchimento pleno dos grãos. Nessa fase, a planta irá atingir o peso máximo dos grãos e inicia-se o processo de senescência foliar. R7 Início da maturação. R8 Maturação plena, onde 95% das vagens estão maduras. Fonte: Adaptado de Trentin et al. (2013); Silva (2023). 20 É notório que em relação a fenologia da cultura, Trentin et al. (2013), ainda subdividem as cultivares em 13 estágios de maturação, os quais são: 000, 00, 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 e 10, onde os cultivares 000, 00, 0; são mais adaptadas as condições frias. Trabalhos da EMBRAPA Soja (2021) e Silva (2023), ainda classificam a soja quanto a sua maturação como super- precoce, precoce, normal e tardia, e avaliam que para melhor desenvolvimento da cultura, é necessário que a época de semeadura, adoção do sistema plantio direto, manejo do solo, práticas de adubação, investimento em tecnologia e semeadura adequada, devem ser observados para escolha de uma cultivar adequada para cada local. 2.2 Magnésio O magnésio (Mg) é um macronutriente de plantas associado a diversas funções vitais do desenvolvimento. O íon Mg2+ está ligado em atividades fisiológicas como a fotossíntese, pois é constituinte da molécula de clorofila, sendo seu átomo central. Além disso, este macronutriente atua como ativador enzimático, sendo o nutriente mineral que mais ativa enzimas na planta. Outras importantes funções do Mg na planta são observadas no auxílio do metabolismo do nitrogênio, e também contribui para a síntese de proteínas e aminoácidos e sinergismo na absorção de fósforo. Como os solos brasileiros são altamente ácidos e intemperizados, há baixa disponibilidade de nutrientes, o que explica os baixos teores de magnésio em solos tropicais e que pode implicar em uma baixa produtividade. Nesse caso, práticas agrícolas que visem aumentar e manter altos teores de nutrientes no solo ou na planta são indispensáveis para que se possa ter uma maior produtividade (Raij et al., 2001; Malavolta, 2006). Hoje, a prática da calagem em solos tropicais, além de ser usual para correção da acidez dos solos é vital para o fornecimento de Mg para planta (Malavolta, 2006). O principal papel do Mg na planta tem a ver com a formação da molécula de clorofila. Em geral, pesquisas descrevem que a clorofila precisa de 15 a 20% do teor total de magnésio na planta para que possa otimizar a absorção de luz e transferir energia para os centros de reação da fotossíntese. Pode-se afirmar que, sem o magnésio as plantas teriam dificuldades para produzir energia (ATP) e assim crescer de maneira adequada. O nutriente também pode auxiliar no crescimento e melhor desenvolvimento das raízes de plantas, o que resulta incremento de absorção de água e nutrientes, fazendo com que a planta se torne mais vigorosa. Trabalhos com utilização de magnésio também têm comprovado que sua aplicação pode melhorar a qualidade pós colheita de frutos, com incremento do teor de açúcar e qualidade da parede celular (Chen et al., 2018). 21 O nutriente é considerado como móvel na planta, nesse caso a deficiência irá ocorrer em folhas mais velhas, na forma de clorose internerval. Além de importante na fotossíntese, sua concentração na planta para realização do processo é vital, visto que ele auxilia na ativação de numerosas enzimas, incluindo a ribulose- 1,5- bifosfato carboxilase/oxigenase ou Rubisco, utilizada no Ciclo de Calvin, responsável pelo primeiro grande passo da fotossíntese, a catalização de carbono (Parry et al., 2008). Estima-se que, em média, 75% do magnésio presente nas folhas esteja envolvido na síntese proteica, o que pode implicar na cadeia produtiva de grãos (White; Broadley, 2009). Além deste fato, o magnésio é considerado um nutriente de alta demanda na dieta humana (encontra-se entre os sete principais), o que implica em sua utilização na biofortificação de alimentos para ajudar muito a nutrição humana. Em geral, as plantas agricultáveis precisam de cerca de 1,5 a 3,5 gramas de magnésio por quilo de matéria seca para crescerem de forma saudável. Um valor considerado baixo, mas que deficiente pode afetar e muito o desenvolvimento e a produção das culturas. A soja, é uma cultura considerada como acumuladora de magnésio, assim o suprimento adequado gira em torno de 40% do teor de nutriente nos grãos, em uma faixa de variação de 31,7 até 57,9%, em base seca (Pipolo et al., 2015). Avaliando trabalhos na área, é possível observar que o magnésio vem sendo comumente utilizado com o intuito de incrementar a taxa fotossintética das plantas. Tem se observado que a presença de magnésio pode aumentar os teores de clorofila, desde que utilizada dose ótima da fonte do nutriente via solo e/ou foliar. No trabalho de Mógor et al. (2013), estudando doses de magnésio via foliar em tomateiro, observou-se que há aumento nos teores de clorofila na cultura em relação às doses de magnésio testadas. O aumento da clorofila pode significar melhor utilização de meios para reações fotossintéticas, o que pode significar em maior produtividade para a cultura. No trabalho de Tränkner et al. (2016), utilizando plantas de cevada deficientes em Mg verificou-se que essas apresentaram aumento do estresse oxidativo, indicando prejuízos no ganho de carbono e redução da produção de biomassa. Isso mostra que trabalhos com utilização de magnésio como nutriente, seja via solo ou foliar, são de extrema importância, visto que sua carência pode significar prejuízos para molécula de clorofila, processo fotossintético, atividade enzimática, o que poderá gerar uma redução da produtividade das culturas. Estudos com diferentes culturas agrícolas evidenciam que, aplicações foliares de Mg na fase de maturação, em que a atividade radicular vai diminuindo, tem possibilitado ganhos de 22 produtividade e qualidade dos produtos colhidos. O que se tem observado é que o transporte de carboidratos tem relação direta com o status do elemento na planta, assim como a ativação de enzimas de transporte na membrana que podem estimular o carregamento de sacarose no floema. Outro ponto visto é que o magnésio vem sendo utilizado como atenuador (“vacina”) do estresse luminoso. Este vem a ocorrer quando o excesso de intensidade luminosa, que é absorvido pela planta, supera a capacidade da maquinaria fotossintética de converter luz em açúcares. Assim, também estresse térmico irá afetar o metabolismo vegetal, devido ao seu efeito sobre a estabilidade de proteínas e reações enzimáticas. Portanto, torna-se indispensável sempre considerar a presença do magnésio nos programas de nutrição de culturas, visto o cenário atual de mudanças climáticas e aquecimento global (Cakmak, 2013). Em trabalho realizado por Cecatto Júnior et al. (2021), com aplicação de magnésio foliar em milho, foi observado que além de melhor estruturação visível nas plantas, houve aumento de massa seca de raízes e também massa seca da parte aérea. Segundo os autores, isso possibilitou maior ganho em termos de produtividade, haja vista possibilidade de maior absorção de água, de outros nutrientes e também na interceptação da luz. Trabalhando com a cultura da soja, Deliboran et al. (2011), avaliando doses de magnésio juntamente com fósforo constataram que a aplicação de magnésio foliar resultou em incremento de produtividade de 204 kg ha-1 na menor dose, sendo possível atingir incremento de 675 kg ha-1 de grãos na maior dose. Esses autores também observaram que o teor de clorofila na folha foi maior com aumento das doses de magnésio, bem como a massa seca da parte aérea e das raízes. No trabalho de Rodrigues et al. (2021), com soja e milho, e aplicação de magnésio foliar, a aplicação do Mg+2 resultou em aumento de sua concentração na soja (10,4%) e no milho tanta na primeira, quanto na segunda safra (13,3 e 14,4%, respectivamente). Neste trabalho a aplicação de magnésio fez com que o desempenho de trocas gasosas aumentasse em ambas as culturas, além de aumentar os valores da taxa fotossintética líquida e também da condutância estomática (incrementos de 49 % e 21% para soja e 29% e 47% para o milho). Em suma, plantas que receberam a dose de magnésio foliar foram mais eficientes fotossinteticamente e transformando gás carbônico em esqueletos de carbono (açúcar), assim perdendo menos água durante o processo. O trabalho mostrou que como resultado, tanto a cultura da soja, quanto a do milho, converteram o açúcar produzido pela fotossíntese em maior número de grãos por planta. O magnésio é absorvido pelas plantas principalmente em sua forma catiônica (Mg+2), ocorrendo após o contato direto entre o íon presente na solução do solo e a raiz da planta 23 (Malavolta, 2006). Outra via de absorção do íon é a foliar, onde o principal adubo utilizado é o sulfato de magnésio. Vale destacar que o magnésio pode ser perdido no solo por lixiviação e/ou erosão, por isso métodos de cultivo sustentáveis, como o SPD, podem auxiliar na disponibilidade do nutriente (Rosolem, 2002). 2.3 Estresses abióticos e mudanças climáticas O estresse é definido como qualquer fator ou condição ambiental que possa fazer com que a planta não expresse o seu potencial genético. Por exemplo, a falta de água no ciclo das plantas pode prejudicar o crescimento e a produção. Para conseguir passar por essa condição adversa, uma alternativa encontrada pelas plantas é fechar os estômatos para minimizar a perda de água por transpiração, entretanto, reduz a captação de CO2 para fotossíntese (Taiz et al., 2017). O potencial genético das plantas apenas poderá ser atingido se todos os fatores ambientais estiverem adequados. Cada vez mais a ocorrência de fenômenos como a seca, ondas de calor, veranicos, radiações ultravioletas têm afetado o rendimento das culturas agrícolas. O principal resultado das mudanças climáticas nas plantas tem sido a elevação na produção de espécies reativas do oxigênio, que em concentrações elevadas pode ocasionar a morte das células e afetar o desenvolvimento normal das plantas. Desse modo, a pesquisa de novas técnicas que visem mitigar o efeito dos estresses em plantas é de grande importância, pois as mudanças climáticas podem ameaçar a segurança alimentar global e mesmo em sistemas conservacionistas do solo, estes fatores podem acarretar perdas consideráveis de produtividade (Chakraborty et al., 2015; Hasanuzzaman et al., 2020). Seca é um fator climático que pode ser definido como a ausência de água por um longo período, ou ainda podendo afetar as plantas em períodos em que a disponibilidade hídrica é extremamente importante. Como a maioria das plantas possuem na constituição de sua matéria fresca cerca de 85-90% de água, a importância da disponibilidade hídrica no solo é fundamental. Como os veranicos são constantes, principalmente em condições do Cerrado brasileiro, prever hoje uma data adequada para semeadura passa a ser um constante desafio para produtores, visto que com o aquecimento global e as mudanças climáticas, o escalonamento pluvial e climático ao longo do ano não tem sido mais sazonal e previsível (Taiz et al., 2017; Hasanuzzaman et al., 2020). 24 No campo, a temperatura é outro fenômeno climático incontrolável da natureza e o que mais necessita de pesquisas, visto o aquecimento global com ondas de calor é uma realidade para os sistemas de produção agropecuários. O estresse térmico, por conta de altas temperaturas, é definido como aquele que é capaz de causar danos irreparáveis ao crescimento e desenvolvimento de plantas. Em geral, o aumento de temperaturas é capaz de acelerar a taxa do desenvolvimento reprodutivo, fazendo com que a planta reduza seu ciclo, diminuindo a taxa fotossintética e sua contribuição para formação de sementes e frutos, o que irá resultar em menor produtividade. Temperaturas altas provocam danos diretos por conta do aquecimento de tecidos e podem causar efeitos indiretos como o do déficit hídrico, o que pode reduzir a turgescência das células (Pretty e Bharucha, 2014; Taiz et al., 2017). Uma das alternativas importantes para mitigar o efeito de estresse vem sendo a utilização de rizobactérias. A população microbiana é capaz de liberar sinalizadores, como resposta ao efeito de estresses nas plantas, desencadeando reações em diferentes vias, pois sabe-se que a planta é capaz de utilizar esses microrganismos como auxiliadores no processo de redução de estresses (Zolla et al, 2013, Singh, 2014; Taiz et al., 2017). 2.4 Espécies reativas de oxigênio A descoberta do oxigênio atmosférico (O2) ocorreu por volta dos anos de 1774, pelos pesquisadores Carl Wilhelm Scheele e Joseph Priestley. Apenas em 1778, o famoso pesquisador Antoine Laurent Lavoisier publicou um estudo em que descreveu o mecanismo de oxidação através de experimentos com fogo e mercúrio. Lavoisier entendeu que um gás mantinha a combustão da chama da vela acesa, e que a falta desse gás ocasionava a extinção da chama. Para esse gás, o pesquisador deu o nome de oxigênio (O) e em pesquisas afirmou que cerca de 21% de todo o gás contido na atmosfera é formado por O (Hasanuzzaman et al., 2020). Ao longo dos anos, foi constatado que existem formas mais reativas do que o O2 no seu estado basal. Essas espécies foram denominadas como espécies reativas de oxigênio (EROS), onde se foi constatado que a formação do complexo EROS se inicia a partir de reações de redução do O2, através da incorporação de um elétron ao oxigênio molecular. Os complexos EROS podem ser produzidos tanto nas células animais, quanto nas células vegetais, comumente estudadas e de grande importância para pesquisa. Essas EROS podem ser do tipo radicais livres como o radical superóxido (O2 -) e o radical hidroxila (OH-), que são espécies que possuem um ou mais elétrons desemparelhados, o que torna essas altamente reativas e instáveis. É importante destacar que também existem EROS que não possuem elétrons desemparelhados, e 25 que mesmo assim, ainda podem ser bastante reativas, como o peróxido de hidrogênio (H2O2), ou as moléculas de oxigênio singleto (1O2), que também podem ser reativas (Taiz et al., 2017; Hasanuzzaman et al., 2020). Por serem altamente reativas às estruturas e complexos da planta, a formação das EROS pode desencadear respostas que podem afetar diferentes estruturas das células por reações de oxidação com diversas moléculas (lipídios, carboidratos, proteínas e ácidos nucleicos), ou seja, pela remoção de elétrons destas substâncias. Vale ressaltar que esses complexos EROS são produzidos em diferentes locais das estruturas da planta, como os cloroplastos, mitocôndrias, membrana plasmática, peroxissomo, parede celular, entre outras. As EROS são sintetizadas tanto em condições normais, como em estresse, porém em estresse, sua produção é contínua, agindo como sinalizador (Taiz et al., 2017; Mehla et al., 2017) Por serem compostos altamente reativos, as moléculas podem levar à oxidação de componentes celulares importantíssimos para a planta, como a membrana celular, lipídeos, proteínas e até mesmo o material genético. Dessa forma, a literatura moderna define as EROS como moléculas sinalizadoras de grande importância, sendo que sua presença e concentração na célula pode indicar que a planta está passando por algum tipo de estresse, seja ele biótico ou abiótico. Toda a planta, ao passar por períodos de estresse e produção dos compostos, tende a diminuir suas taxas metabólicas e consequentemente plantas de importância agrícola tendem a diminuir a produção. Fatores comuns que acontecem em plantas sob estresse são: fechamento estomático, gravitropismo radicular, tolerância à deficiência de oxigênio, fortalecimento da parede celular, senescência, produção de fitoalexinas, fotossíntese, abertura estomática e no controle do ciclo celular (Taiz et al., 2017; Singh et al., 2019). Para minimizar a ação das EROS, as plantas desenvolveram mecanismos antioxidantes enzimáticos e não enzimáticos. O mecanismo antioxidante enzimático é composto pela superóxido dismutase (SOD), ascorbato peroxidase (APX), catalase (CAT) e glutationa redutase (GR) dentre outras, enquanto ácido ascórbico glutationa, ácidos fenólicos, alcalóides, flavonóides e α tocoferol dentre outras, são antioxidantes não-enzimáticos. A produção desses mecanismos auxilia a planta em altas concentrações dos compostos EROS (Hasanuzzaman et al., 2020). 2.5 Bactérias promotoras de crescimento de plantas e fixadoras de nitrogênio Nos últimos anos, a utilização de novas técnicas que visam aumentar a produção de maneira sustentável tem sido difundida e pesquisada. Dentre essas técnicas, o uso de 26 rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RBPCP) margeia como uma alternativa forte e eficaz para melhorias de técnicas agrícolas e de baixo custo (Oliveira et al., 2012). As RBPCP são encontradas na rizosfera e podem estar em associação com as raízes, sendo responsáveis por potencializar o crescimento da planta, além de serem responsáveis pelo controle de patógenos, melhorar a absorção de nutrientes nas raízes e maior disponibilidade de nutrientes nas folhas, além de serem agentes biocontroladores na eliminação de pragas e/ou doenças (Galdiano Júnior, 2011; Melo, 2021). As rizobactérias podem ser usadas para aplicação em tratamento de sementes, mudas, tubérculos e raízes. Dentre os estudos com essas RBPCP, o gênero Bacillus tem se destacado em termos de pesquisa e resultados. Além de promotor de crescimento em plantas e com aumento da produtividade, trabalhos recentes mostram que o tratamento com Bacillus subitilis pode aumentar a formação de galhos e agir como biocontrolador de nematoides do solo. Segundo pesquisas, pode se verificar que as endotoxinas produzidas pela bactéria podem influenciar o ciclo de vida do nematoide e assim promover seu controle (Alves, 2018; Furmam et al., 2019; Melo, 2021). O Bacillus subtilis é uma bactéria encontrada no solo em associação com as raízes das plantas, de origem gram-positiva e aeróbica. O Bacillus megaterium é uma bactéria gram- positiva, aeróbica, tolerante a altas temperaturas, salinidade e pressão osmótica. Também é encontrada na rizosfera, em associação com as raízes das plantas, atuando na maior disponibilidade de nutrientes, como o fósforo e o potássio, e agindo de maneira direta na fixação biológica do nitrogênio. Essas bactérias irão atuar na defesa de plantas contra estresses bióticos, como no ataque de patógenos e de pragas, e abióticos (tolerância à déficits hídricos), sendo que essas também atuam no crescimento das plantas e fixação de nutrientes minerais, síntese de fitormônios e melhorias nas condições do solo, os quais são importantes no ciclo de vida das plantas. Trabalhos recentes com a utilização de Bacillus das espécies subtilis e megaterium proporcionaram níveis altos de produtividade, o que viabiliza a sua utilização na agricultura (Franchi, 2022; Furmam et al., 2019). As bactérias do gênero Bradyrhizobium spp., destacam-se pela fixação de N, sendo bactérias gram-negativas de vida livre, com estruturas em geral oval e regular, que em contato com as raízes de plantas, são capazes de formar nódulos e assim auxiliar na fixação biológica de N2 (FBN). Comumente, a bactéria também é chamada de rizóbio, e a infestação dela no sistema radicular, acontece inicialmente pelo contato e reconhecimento dessas bactérias, aderindo assim a estrutura da raiz e seus pelos radiculares. Após a invasão do pelo radicular, ocorre a formação do hilo que é o canal de infecção, onde a bactéria irá se deslocar. Ao chegar 27 à raiz, ocorre o processo de diferenciação celular que inicia o processo de fixação, sendo ele contínuo, e que resulta na formação do nódulo. Desta forma bactérias do gênero podem contribuir para menor uso de adubos nitrogenados, aumentar a produtividade da cultura e possibilitar aumento da fertilidade em solos (Hungria et al., 2007; Hungria et al., 2012). As Bradyrhizobium ssp. são comumente utilizadas em solos de clima tropical, por serem bactérias mais resistentes a flutuação de temperaturas que ocorre em geral nesses tipos de solo e por se adaptarem muito bem às culturas desse tipo de clima. Este fator em geral é um dos mais limitantes a utilização de RBPCP em solos tropicais, uma vez que as camadas de 0-10 cm e 10-20 cm, onde ocorrerá nodulação, são altamente prejudicadas pela flutuação de temperaturas, ocorrendo elevado aumento ao decorrer do dia e variação em diferentes meses do ano. Na soja brasileira, a inoculação de bactérias do gênero Bradyrhizobium ssp. gera aumento da produtividade e é capaz de minimizar ou mesmo zerar a aplicação de adubos nitrogenados, visto que a rotação de culturas, uso de adubos verdes e manutenção da palhada, junto com as bactérias é capaz de suprir essa demanda. Trabalhos com coinoculação de Bradyrhizobium ssp. e Bacillus ssp. tem mostrado incrementos significativos em produção, por aumentar o espectro de ação dessas bactérias e principalmente pelo gênero Bacillus ssp. contribuir com a melhoria do sistema radicular e favorecer a exploração do perfil do solo, absorvendo maiores contingentes de nutrientes minerais (Alves et al., 2003; Campo; Hungria, 2007; Hungria et al., 2012; Furmam et al., 2019; Franchi, 2022). Entretanto, Souto (2020) discute que as principais dificuldades de uso desses microrganismos na agricultura são o não conhecimento de características do meio, ou seja, não saber como na dinâmica do solo essas bactérias se comportariam em diferentes meios, e sem competição rizosférica entre espécies, o que poderia gerar efeitos antagônicos e não sinérgicos. Em outro trabalho na área, realizado por Mendonça et al. (2020), houve a constatação de que essas RBPCP podem favorecer o desenvolvimento da planta, e elas podes suportar estresses do meio, como por exemplo estresses abióticos, diminuindo os efeitos relacionados a falta de água e também as altas temperaturas, o que justificaria pesquisas relacionadas ao uso de tal técnica, em virtude das mudanças climáticas globais. 28 3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo Geral • Avaliar o efeito da inoculação de rizobactérias, bem como aplicação de Mg via foliar, em parâmetros fotossintéticos e seus efeitos na produtividade da cultura da soja em condições de campo. 3.2 Objetivos Específicos • Verificar a influência de rizobactérias em diferentes formas de coinoculação em solos com fertilidade corrigida em SPD de longa duração; • Analisar o comportamento da soja quanto à fisiologia do estresse e taxa fotossintética na combinação de rizobactérias e uso ou não do Mg foliar; • Mensurar indicadores de qualidade fisiológica da soja em técnicas de refinamento da produção agrícola. 29 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Características da área e do local O projeto de pesquisa foi conduzido em campo, na Fazenda de Ensino, Pesquisa e Extensão (FEPE), da Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho (UNESP- FEIS), localizada na cidade de Selvíria- MS, nas coordenadas geográficas de 20°18’S e 51°22’W e altitude de 370 m (Figura 1). Figura 1 – Localização da área experimental no município de Selvíria - MS, Brasil Fonte: Autoria própria. Observando a classificação internacional de Köppen, pode-se afirmar que o clima do Município de Selvíria apresenta o subtipo Aw- tropical úmido, mesotérmico, com um inverno seco e verão quente, e irregularidade da precipitação anual das chuvas. A área de alocação do experimento pode ser considerada como plana, e os índices pluviométricos na região de Selvíria-MS, podem variar de 1200 até 1500 mm por ano (Sanesul, 2022). Os dados de precipitação, temperatura máximo e mínima durante o período de condução do experimento em campo são apresentados na Figura 2. 30 Figura 2 – Dados meteorológicos de temperatura máxima, mínima e precipitação pluvial, no município de Selvíria – MS, Brasil, 2023/24, durante o período de condução do experimento Fonte: Autoria própria. Nota: Dados de temperatura e pluviosidade: Clima Unesp (2023/2024). Na área experimental, o solo em questão é classificado como um LATOSSOLO VERMELHO Distrófico típico de textura argilosa (52% de argila no horizonte A) (SANTOS et al, 2018). Essa área tem um histórico de utilização em cultivos sob sistema plantio direto (SPD) por mais de 13 anos, e experimentos instalados anualmente com métodos conservacionistas (manutenção de palhada, rotação de culturas), cuja cultura antecessora foi o sorgo granífero em consórcio com capim Piatã (Urochloa brizantha). Na área de realização do projeto, foram realizadas coletas de solo, com o objetivo de avaliar sua fertilidade. Foram realizadas coletas de solo na camada de 0-0,20 para obtenção de uma amostra composta, e posteriormente essa amostra foi analisada no Laboratório de Fertilidade do Solo da UNESP de Ilha Solteira. Os dados da fertilidade do solo na camada de 0-0,20 m são apresentados na Tabela 1. 0 20 40 60 80 100 120 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 8 15 30 45 60 75 90 105 121 Pl uv io si da de (m m ) Te m pe ra tu ra (° C ) Dias após a semeadura Pluviosidade média acumulada T° Máxima T° Mínima Pico das ondas de calor Pico das ondas de calor V6 R2 31 Tabela 1 – Caracterização química do solo na camada de 0-0,20 em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 Camada m Presina MO pH K Ca Mg H+Al Al SB CTC V mg dm-3 g dm-3 CaCl2 ....................mmolc dm-3........................ % 0-0,20 50 24 5,3 2,5 32 23 34 0 57,5 91,5 63 Fonte: Autoria própria. Nota: fósforo (P), matéria orgânica do solo (MO), acidez (pH), potássio (K), cálcio (Ca), magnésio (Mg), acidez potencial (H+Al), alumínio (Al), soma de bases (SB), saturação por bases (V%). 4.2 Instalação e Condução do Experimento Na última semana de outubro de 2023, a flora daninha foi dessecada com herbicida gliphosate (1,56 kg ha-1 do ingrediente ativo), e a soja semeada em 16 de novembro de 2023 (Figura 3). A cultivar escolhida foi a 80HO190 IPRO, de crescimento indeterminado, com alto potencial produtivo e resistente ao acamamento. O espaçamento adotado foi de 0,50 m entrelinhas com 14,5 sementes por metro, visando uma população de 220 mil plantas ha-1. O experimento foi conduzido em delineamento de blocos ao acaso, em esquema fatorial 3 x 2, com 4 repetições, perfazendo um total de 24 parcelas experimentais. Foram avaliados 3 tratamentos com bactérias (Bradyrhizobium japonicum nas sementes (controle), combinação de B. japonicum nas sementes + Bacillus subtilis + Bacillus megaterium no sulco; B. japonicum nas sementes + B. subtilis + B. megaterium nas sementes), com ou sem a pulverização foliar do Mg. As sementes foram tratadas previamente com produto comercial a base de pirazol, estrubirulina e benzimidazol, sendo utilizado 100 mL do produto comercial para cada 50 kg de sementes. A aplicação das RBPC seguiu a recomendação de cada produto (Bradyrhizobium e Bacillus). Para a inoculação com B. japonicum (estirpes Semia 5079 e 5080) via sementes, foi utilizado o inoculante líquido na dose recomendada pelo fornecedor (Soja – 2,0 x 109 UFC/mL). Para coinoculação com o Bacillus foi utilizado produto comercial (mistura de B. subtilis e B. megaterium na concentração de 4,0 x 109 UFC/mL) na dose recomendada pelo fabricante no tratamento de sementes e duas vezes a dose comercial para pulverização no sulco de semeadura. Para aplicação do produto a base de Bacillus na semente foi utilizada a dose padrão comercial de 100 mL do produto para cada 50 kg de sementes. Na aplicação via sulco, essa dose foi dobrada para 200 mL, aplicada com pulverizador costal, com volume de calda de 50 L ha-1 diretamente sob sulco com vasão controlada. Os produtos comerciais utilizados foram aplicados 32 nas sementes a sombra, momentos antes da semeadura, e para pulverização no sulco, juntamente com a operação de semeadura pela manhã. A aplicação do Mg foi realizada no estádio V6 da soja (Figura 3) visto que a partir de V5 pode-se definir o potencial de nós que a planta pode ter, e pelo considerável aumento de taxas metabólicas. O Mg foi aplicado via pulverização mecânica com velocidade reduzida nas primeiras horas do dia (7h00-9h30), com uma vazão do tanque estipulada em 250 L ha-1. As avaliações fisiológicas na cultura, foram realizadas no estádio R2, tendo em vista que esse estádio é de florescimento pleno, haja vista que a partir daí a necessidade de clorofila para fotossíntese é maior. Para não mascarar o real efeito do Mg, nas parcelas sem aplicação do MgSO4, foi aplicado no mesmo dia, enxofre elementar (S), via foliar, na mesma dose equivalente de S do MgSO4. O produto escolhido para fornecimento de Mg foi o sulfato de magnésio (MgSO4), em uma dose padrão de 8 kg ha-1 ajustada a partir de diferentes trabalhos da literatura (Rodrigues et al. 2020; Deliboran et al. 2011; Branquinho et al. 2017). Para adubação de semeadura foram utilizados 300 kg ha-1 do formulado 08-28-16 (N-P2O5-K2O), segundo recomendação baseada na análise de solo e na metodologia de Quaggio et al. (2022). Figura 3 – Instalação, aplicação e avaliações na cultura da Soja no munícipio de Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 Fonte: Autoria própria. Cada parcela experimental, foi constituída por 16 linhas de 10 m de comprimento, com espaçamento entrelinhas de 0,5 m, perfazendo 80 m2. Para controle da flora daninha e de pragas, foram utilizados herbicidas e inseticidas seguindo as necessidades observadas em campo. A colheita das 24 parcelas experimentais para avaliação foi feita em 16/03/24, e no mesmo dia as avaliações dos componentes da produção e da produtividade de grãos. 33 4.3 Avaliações fisiológicas 4.3.1 Avaliação de trocas gasosas Na época da avaliação (estádio fenológico R2), a 3° folha recém expandida da haste principal da soja em 10 plantas por parcela, foi utilizada para avaliar as trocas gasosas pela manhã (7 até 11 h) com um analisador de gás infravermelho (LI-6400; LI-COR Inc., Lincoln, NE, EUA) sob densidade de fluxo de fótons fotossintéticos de 1.800 μmol m− 2 s−1 e concentração de CO2 no ar de 380 μmol mol−1, na temperatura de 21 a 25 °C (REIS et al., 2018). A taxa de assimilação de CO2 (A), condutância estomática, taxa de transpiração (E), pigmentos totais (Pig) e a concentração interna de dióxido de carbono (Ci) foram determinadas. A partir disso, foi possível calcular o nível de eficiência instantânea do uso da água da folha (EIUA), dividindo os valores de A por E (Martineau et al., 2017). 4.3.2 Pigmentos fotossintetizantes Nas mesmas folhas de avaliação das trocas gasosas, foram analisados os pigmentos fotossintetizantes, quantificando os conteúdos de Clorofila a (Cla), b (Clb), totais (Clt) e carotenoides (CAR) utilizando como agente extrator o dimetilsulfóxido (DMSO). Uma fração de tecido vegetal foi coletada e cortada em fragmentos de 1 mm até obter 50 mg e incubado com 7mL de DMSO no escuro em banho-maria a 65oC por 30 min. (Hiscox; Israelstam, 1979). Além disso foi realizada a avaliação do índice SPAD para as mesmas folhas usadas para determinação dos pigmentos, usando-se o clorofilômetro SPAD-502. 4.3.3 Caracterização do metabolismo de nitrogênio e mecanismo de tolerância ao estresse Através do método descrito por Bieleski e Turner (1966), os compostos nitrogenados foram extraídos das folhas de soja para as análises posteriores, conforme a descrição a seguir: Para 1 g de material fresco, acrescentou-se 10 mL de solução MCW (60% mL Metanol, 25% mL Clorofórmio, 15% mL H2O). O material foi triturado e em seguida centrifugado. Após centrifugação, acrescentou-se 1 mL de Clorofórmio + 1,5 mL de H2O, para cada 4 mL de sobrenadante. Armazenou-se 24 h em geladeira, para separação de fases e utilizou-se a fase hidrossolúvel para análise de ureídeos. 34 4.3.3.1 Determinação dos teores de aminoácidos Foi utilizado 100 µL do extrato hidrossolúvel + 900 µL de H2O + 500 µL de tampão citrato + 200 µL de ninhidrina 5% em metil glicol + 1 mL de solução KCN 0,0002 M, seguido de aquecimento a 100 ºC por 20 minutos e resfriamento em temperatura ambiente para posterior inclusão de 1 mL de etanol 60%. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a λ = 570 nm. A curva padrão de solução leucina foi utilizada para determinar a concentração de aminoácidos solúveis totais (Yemm; Cocking; Ricketts, 1955). 4.3.3.2 Determinação dos teores de ureídeos A primeira fase iniciou-se pela adição de 250 µL do extrato hidrossolúvel + 500 µL H2O destilada + 1 gota de fenilhidrazina + 250 µL de NaOH 0,5 M, seguido de aquecimento a 100° C durante 8 minutos e resfriado à temperatura ambiente. Para quantificação de ácido alantóico, a hidrólise alcalina da etapa anterior foi suprimida. Na segunda fase, foi adicionado 250 µL de HCl 0,65 N, seguido de aquecimento a 100 °C durante 4 minutos. Após resfriamento à temperatura ambiente, foi adicionado 250 µL de tampão fosfato pH 7,0 0,4 M e 250 µL de solução de fenilhidrazina 0,33%. Após 5 minutos à temperatura ambiente, colocou-se as amostras em banho de gelo por 5 minutos e, em seguida, adiciona-se 1250 µL de HCl concentrado previamente gelado e 250 µL de solução de ferrocianeto de potássio 1,65%. Retirou-se do banho de gelo e, após 15 minutos à temperatura ambiente, foi realizada a leitura em espectrofotômetro a λ = 535 nm. A concentração de ureídeos foi mensurada utilizando curva padrão de solução de alantoína (Der Drift; De Windt e Vogels, 1970). 4.3.3.3 Determinação dos teores de proteínas totais solúveis nas folhas Os teores de proteínas solúveis totais nas folhas foram mensurados por meio da reação com azul de coomassie (Bradford, 1976), para o ensaio foram utilizados 50 µL do extrato alcalino (fração hidróxido de sódio) + 2500 µL da solução de Bradford + 5 minutos em repouso. Em seguida, foi realizada a determinação em espectrofotômetro a λ = 595 nm. A concentração de proteínas foi mensurada utilizando a curva padrão de solução BSA. 35 4.3.3.4 Peróxido de hidrogênio A quantificação dos teores de peróxido de hidrogênio foi realizada de acordo com o método descrito por Alexieva et al. (2001). Aproximadamente 250 mg de folhas foram maceradas em N líquido e homogenizadas em 3 mL de solução 0,1% de TCA (m/v) com 20% de PVPP (m/m). O homogenizado foi dividido em dois microtubos de 1,5 mL e centrifugado a 12100 g por 5 minutos; 0,2 mL do sobrenadante foi transferido a um novo microtubo o qual recebeu 0,8 mL de solução 1 M de KI e 0,2 mL de solução 100 mM de tampão fosfato de potássio pH 7,5; essa mistura foi posteriormente incubada no gelo e no escuro por 1 hora, após esse período foi realizada a leitura em espectrofotômetro a 390 nm. 4.4 Avaliações dos componentes da produção e produtividade da soja As avaliações realizadas foram: População de Plantas (POP): foram contadas as plantas que compunham 4 m das quatro linhas centrais de cada parcela, e posteriormente com esse valor obteve-se o número de plantas por hectare (planta ha-1). Altura de Plantas (AltP): realizada na área útil de cada parcela, analisando-se dez plantas consecutivas na linha. A planta foi medida desde sua extremidade inferior no solo, até a parte superior e o valor convertido em metros. Altura da inserção da primeira vagem (AIPV): a medição se realizou na mesma área utilizando-se as mesmas plantas que foram usadas para mensurar a altura. Foi realizada medindo-se a planta desde o solo, até a primeira vagem. Número de Vagens por Planta (NVP): mensurada utilizando-se o número de vagens de 10 plantas por parcela e realizada a média aritmética desta. Número de grãos por planta (NGP): calculada a partir do número de grãos das mesmas 10 plantas por parcela, e depois disso calculada sua média. Massa de 100 grãos (M100): calculada a partir da separação de quatro amostras de grãos e levadas ao laboratório para contagem no contador eletrônico. A massa dos cem grãos foi feita em balança de precisão (0,01 g) e a umidade do grão corrigida a 13% (base úmida). Produtividade de grãos (PROD): as plantas centrais das parcelas (4 m de 4 linhas) foram colhidas manualmente, trilhadas e os grãos pesados, assim após obtenção da produtividade por parcela, a umidade foi corrigida até 13% e os valores foram transformados em kg ha-1. 36 4.5 Análise estatística Os dados obtidos foram tabulados e analisados com o auxílio do software R versão 4.3.2 (Development Core Team, 2024). Os resultados foram submetidos a análise de variância pelo teste F (p≤0,05). A normalidade dos dados foi avaliada pelo teste de Shapiro Wilk. Constatado resultado significativo pelo teste F, para a presença do inoculante comercial e aplicação de Mg, foi realizada a comparação de médias pelo teste de Tukey (p≤0,05). Além disso, para melhor intepretação e correlação dos dados foi realizada a análise de componentes principais (PCA). Para análise de variância e construção do PCA no software R foram utilizados os pacotes “ExpeDes.pt”, “FactoMineR”, “Shiny”, “FactoInvestigate” e “ggplot2”. Os gráficos das interações foram desenvolvidos a partir do software SigmaPlot versão 15.0 (Systat Software Incorporation, 2023). 37 5 RESULTADOS Na tabela 2, após os resultados terem sido analisados constatou-se que para presença da pulverização foliar do Mg, as médias apresentaram significância nos teores de clorofila a, clorofila b, clorofilas totais, carotenoides e feofitina, indicando que o Mg foi capaz de contribuir com o aumento desses compostos. Com relação à inoculação, foi possível observar médias significativas nos teores de feofitina, sendo que os tratamentos coinoculados tanto via sulco quanto sementes, apresentaram resultados superiores pelo teste (p≤ 0,05). Porém, para feofitina, o tratamento via sulco não diferiu do tratamento controle. Tabela 2 – Análise de variância para as variáveis clorofila a, clorofila b, clorofilas totais, carotenoides e feofitina na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 Clorofila a Clorofila b Clorofilas Totais Carotenoides Feofitina mg/gMF mg/gMF mg/gMF mg/gMF índice Pulverização (P) com Mg 6,31 a 0,85 a 7,36 a 0,74 a 1,53 a sem Mg 5,27 b 0,61 b 5,94 b 0,62 b 1,44 b Inoculação (I) controle 5,80 0,68 6,60 0,64 1,44 b sulco 5,50 0,75 6,55 0,68 1,52 a semente 5,88 0,75 6,79 0,71 1,50 ab Valores de Pr>Fc Pulverização 0,001* 0,001* 0,001* 0,02* 0,001* Inoculação 0,06ns 0,22ns 0,62ns 0,42ns 0,03* P x I 0,80ns 0,37ns 0,63ns 0,91ns 0,88ns Média Geral 5,80 0,73 6,65 0,68 1,48 DMS 0,37 0,08 0,43 0,09 0,05 CV(%) 7,33 13,34 7,40 14,99 3,72 Fonte: Dados de pesquisa do autor. Nota: *significativo p≤0,05; ns não significativo p≤0,05; Mg: magnésio; controle: B. japonicum; sulco: Bradyrhizobium japonicum + combinação de B. subtilis e B. megaterium no sulco; semente: B. japonicum + combinação B. subtilis e B. megaterium nas sementes; Médias seguidas da mesma letra, dentro de Pulverização (P) e Inoculação (I) não diferem estatisticamente a 5 % de significância. Para as análises dos teores de ureídeos e SPAD, é possível observar que as médias foram significativas (p≤0,05) (Tabela 3). Nos resultados para inoculação, o tratamento controle e via sementes, apresentaram médias superiores em relação ao tratamento via sulco para os resultados do teor de ureídeos. A maior média foi no tratamento controle, sendo que esse impacto em ureídeos nos tratamentos com coinoculação pode ser reflexo da competição entre esses 38 microrganismos na rizosfera. Para o índice SPAD, os resultados foram significativos (p≤0,05) tanto para aplicação foliar com Mg, quanto para inoculação. Nos tratamentos que receberam a pulverização do Mg foliar, foi observado um incremento médio de 25,5% em comparação com as parcelas sem aplicação de Mg, devido ao fato de que o nutriente é o íon central da molécula de clorofila, demostrando que ele pode vir a regular a fisiologia fotossintética da planta. Tabela 3 – Análise de variância para as variáveis ureídeos, malondialdeído (MDA), proteína, peróxido, aminoácidos (AA) e índice relativo de clorofila (SPAD) na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 Ureídeos MDA Proteína Peroxido AA SPAD µmoles gMF-1 µmoles gMF-1 µmoles gMF-1 µmoles gMF-1 µmoles gMF-1 Índice Pulverização (P) com Mg 2,40 3,10 3,70 1,10 22,20 97,90 a sem Mg 2,60 2,90 3,80 0,70 20,50 72,90 b Inoculação (I) controle 3,30 a 3,20 3,60 0,70 21,60 74,10 b sulco 1,70 b 2,90 4,20 0,85 21,50 92,30 a semente 2,50 ab 3,00 3,40 1,24 20,90 89,80 ab Valores de Pr>Fc Pulverização 0,52ns 0,29ns 0,67ns 0,25ns 0,22ns 0,0004* Inoculação 0,006* 0,41ns 0,085ns 0,43ns 0,89ns 0,035* P×I 0,89ns 0,88ns 0,59ns 0,08ns 0,95ns 0,16ns Média Geral 2,50 3,02 3,70 0,90 21,30 85,40 DMS 0,74 0,42 0,59 0,85 2,92 11,77 CV(%) 34,40 16,30 18,50 10,00 15,70 15,90 Fonte: Dados de pesquisa do autor. Nota: *significativo p≤0,05; ns não significativo p≤0,05; Mg: magnésio; controle: B. japonicum; sulco: Bradyrhizobium japonicum + combinação de B. subtilis e B. megaterium no sulco; semente: B. japonicum + combinação B. subtilis e B. megaterium nas sementes; Médias seguidas da mesma letra, dentro de Pulverização (P) e Inoculação (I) não diferem estatisticamente a 5 % de significância. Para o fator inoculação com as RBPCP, médias significativas para o índice SPAD foram encontradas nos tratamentos via sulco e sementes, sendo que a aplicação no sulco de semeadura apresentou maiores incrementos. Os resultados médios das parcelas com coinoculação para o tratamento sulco apresentaram cerca de 19,6% maior teor de pigmentos fotossintetizantes do que o controle. Para o tratamento via sementes, o incremento foi de 17,5% em relação ao 39 controle, o que deixa claro que, quando coinoculadas, as RBPCP podem auxiliar numa melhoria metabólica importante. Os resultados mostram que as médias para A, CI e EIUA foram significativas (p≤0,05) para a interação P×I (pulverização × inoculação) (Tabela 4). Com os resultados isolados da inoculação com RBPCP, verifica-se que os tratamentos com aplicação via sulco e sementes, foram capazes de aumentar os índices de E e GS. Para os resultados de E, os tratamentos apresentaram um ganho aproximado de 9% em relação ao tratamento controle. O tratamento via sementes, apresentou a maior média para GS, o que representa um ganho aproximado de 27,85% em relação ao tratamento controle. Mais uma vez, fica claro que a coinoculação é capaz de melhorar índices metabólicos importantes que regulam as taxas fotossintéticas das plantas. Os resultados para o desdobramento das avaliações de A, CI e EIUA, são apresentados na Figura 4. Para A, é possível verificar que o tratamento com Mg potencializou os resultados de inoculação no tratamento com aplicação via sementes. O ganho observado em relação ao tratamento controle foi de 40%, reflexo do aumento do conteúdo de Mg que proporcionou altos resultados de pigmentos fotossintetizantes. Similarmente ao A, para EIUA, verificou-se que o tratamento com Mg associado a coinoculação via sementes, auxiliou em ganhos na EIUA, em torno de 28% se comparado ao controle. Esse resultado mostra a razão da regulação interna do conteúdo de água da planta, o que indica melhor regulação na aplicação conjunta do Mg e coinoculação via sementes. O aumento desse índice, justifica a utilização do Mg e das bactérias como bioestimuladoras fisiológicas. Tal fato está ligado principalmente ao efeito do Mg na fisiologia da planta e a estimulação da promoção do crescimento pelas bactérias. Para o CI, resultados significativos do desdobramento foram constatados com a coinoculação, independentemente se no sulco ou nas sementes. Para Mg, em CI não foram observadas diferenças significativas no desdobramento. Os resultados para A e EIUA demonstram que nas condições climáticas as quais esse experimento foi submetido (Figura 2), aplicar Mg aliado a coinoculação via sementes foi benéfica para cultura da soja, mesmo em solo com fertilidade corrigida e com alto teor de Mg no solo. Essa combinação foi capaz de aumentar consideravelmente os índices de A e EIUA. 40 Tabela 4 – Análise de variância para as variáveis Taxa fotossintética (A), Transpiração (E), Condutância estomática (GS), Carbono interno (CI) e Eficiência instantânea do uso da água (EIUA) na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS A E GS CI EIUA µmol CO2 m-2 s-1 mmol H2O m-2 s-1 mmol H2O m-2 s-1 µmol mol-1 mmol CO2 mol-1 H2O Pulverização (P) com Mg 44,00 11,10 1167,67 279,83 4,00 sem Mg 27,70 11,70 1111,08 237,58 2,40 Inoculação (I) controle 31,50 10,40 b 949,50 b 245,50 2,90 sulco 33,10 11,30 ab 1152,60 ab 262,62 3,20 semente 43,00 11,70 a 1316,00 a 268,00 3,70 Valores de Pr>Fc Pulverização 0,0001* 0,85ns 0,51ns 0,0001* 0,0001* Inoculação 0,0001* 0,026* 0,009* 0,08ns 0,02* P×I 0,0001* 0,48ns 0,06ns 0,04* 0,002* Média Geral 35,90 11,10 1139,40 258,70 3,30 DMS 3,21 0,79 117,00 17,12 0,41 CV(%) 10,30 8,30 17,90 7,60 14,50 Fonte: Dados de pesquisa do autor. Nota: *significativo p≤0,05; ns não significativo p≤0,05; Mg: magnésio; controle: B. japonicum; sulco: Bradyrhizobium japonicum + combinação de B. subtilis e B. megaterium no sulco; semente: B. japonicum + combinação B. subtilis e B. megaterium nas sementes; Médias seguidas da mesma letra, dentro de Pulverização (P) e Inoculação (I) não diferem estatisticamente a 5 % de significância. 41 Figura 4 – Desdobramento para variáveis Taxa fotossintética (A), Carbono interno (CI) e Eficiência instantânea do uso da água (EIUA) na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, Selvíria-MS, Brasil, safra 2023/24. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas dentro de inoculação/coinoculação e minúsculas dentro de aplicação do Mg não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05). Fonte: Dados de pesquisa do autor. Avaliando os componentes biométricos e da produção da soja (Tabela 5), a AltP e a AIPV apresentaram resultados significativos para inoculação (p≤0,05). O tratamento controle 42 apresentou a maior média para AltP, dado o uso de maneira isolada do Bradyrhizobium, sem competição rizosférica com o Bacillus spp. A menor AIPV, foi observada no tratamento com coinoculação via sementes. Tabela 5 – Análise de variância para as variáveis Altura de planta (AltP), Altura de inserção da primeira vagem (AIPV), População de plantas (Pop), Número de vagens por planta (NVP), Número de grãos por vagem (NGP), Massa de 100 grãos (M100) e Produtividade de grãos (Prod), para cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 AltP AIPV Pop NVP NGP M100 Prod m m Plantas ha-1 × 1000 g kg ha-1 Pulverização (P) com Mg 1,30 0,33 169,80 83 155 17,19 3792 a sem Mg 1,30 0,33 161,40 69 131 16,75 2700 b Inoculação (I) controle 1,36 a 0,34 a 163,90 70 116 17,04 3056 sulco 1,30 b 0,33 a 172,20 69 135 16,93 3285 semente 1,24 c 0,30 b 160,80 89 178 16,94 3397 Valores de Pr>Fc Pulverização 0,54ns 0,58ns 0,53ns 0,0046* 0,03* 0,46ns 0,001* Inoculação 0,001* 0,001* 0,76ns 0,002* 0,0005* 0,98ns 0,44ns P×I 0,3ns 0,34ns 0,15ns 0,004* 0,006* 0,11ns 0,3ns Média Geral 1,30 0,33 165,6 76 143 16,97 3246 DMS 0,031 0,015 27,66 9,28 21,74 1,25 462,18 CV(%) 2,80 5,50 19,20 14,00 17,50 8,50 16,4 Fonte: Dados de pesquisa do autor. Nota: *significativo p≤0,05; ns não significativo p≤0,05; Mg: magnésio; controle: controle: B. japonicum; sulco: Bradyrhizobium japonicum + combinação de B. subtilis e B. megaterium no sulco; semente: B. japonicum + combinação B. subtilis e B. megaterium nas sementes; Médias seguidas da mesma letra, dentro de Pulverização (P) e Inoculação (I) não diferem estatisticamente a 5 % de significância. O tratamento com adubação foliar de Mg proporcionou as maiores médias para produtividade (Prod) de grãos de soja (p≤0,05). Em média houve um ganho de 1092 kg ha-1, cerca de 18 sacas, apenas pela aplicação do Mg foliar. Para o fator inoculação, não foram observadas médias significativas, sendo que tal resultado é explicado pela condução do experimento em solo que se encontra em SPD por 13 anos, demonstrando que o mesmo pode 43 ser responsável por adequada nutrição, visto boa ciclagem de nutrientes e perfil fértil do solo. Esse resultado mostra que aliar a pulverização foliar do Mg em áreas que preconizam os preceitos do SPD pode ser uma alternativa para aumento de produção. Devido as condições atuais de mudanças climáticas, que cada vez mais submetem as plantas a situações de estresses, é necessário refinar a produção agrícola, buscando aliar técnicas que mitiguem esses estresses. A alta taxa de A nas plantas com a pulverização de Mg foliar se refletiu em ganhos produtivos importantes. Enquanto que os resultados de NVP e NGP apresentaram médias significativos (p≤0,05) para a interação P × I. Analisando o desdobramento, verifica-se que o tratamento com aplicação do Mg e a coinoculação via sementes proporcionou maior NVP, com aumento de 39 vagens por planta (Figura 5). O desdobramento demonstra que, assim como em NVP, a aplicação do Mg atrelado com a coinoculação via sementes, proporcionou um aumento aproximado de 100 grãos por planta em comparação ao tratamento controle e que não recebeu aplicação do Mg (Figura 5). Esses resultados sugerem que a coinoculação destas rizobactérias é capaz de melhorar o metabolismo das plantas, o que pode ser refletido em ganhos de componentes produtivos. Atrelado a utilização do Mg foliar, verifica-se que há uma potencialização nos ganhos produtivos, o que justifica a coinoculação via sementes e a aplicação do Mg. Os resultados do PCA confirmam o que foi avaliado na estatística descritiva unidirecional. A dimensão 1 representou uma variância de 29,54%, enquanto a dimensão 2 foi responsável por uma variância de 14,93%. Os dados de correlação para o PCA são apresentados na tabela 6. 44 Figura 5 – Desdobramento para variável Número de vagens por planta (NVP) Número de grãos por planta (NGP) na cultura da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24. Médias seguidas das mesmas letras maiúsculas dentro de inoculação/coinoculação e minúsculas dentro de aplicação do Mg não diferem entre si pelo teste de Tukey (p≤0,05) Fonte: Dados de pesquisa do autor. Para a presença ou ausência do Mg foliar, o PCA (Figura 6) indica que os resultados para aplicação de Mg encontram-se a direita do gráfico (dimensão 1) compartilhando resultados significativos para aminoácidos (AA), Pop, CI, Prod, A, EIUA, Pig, NVP e NGP. Destaque-se os altos valores de correlação para A, EIUA e NGP, que na dimensão apresentaram valores respectivos de 0,91; 0,81 e 0,90. É importante destacar que essa dimensão ainda apresentou um baixo valor de correlação para Perox, que é indicativo direto de estresse, mostrando que o Mg é capaz de auxiliar no metabolismo. Além disso também foram observados baixos resultados na correlação para E, mostrando que pelos altos valores de EIUA, as plantas com Mg regulam melhor seu conteúdo de água. Para ausência de Mg, na dimensão 2, foi observado pelos resultados do PCA, uma baixa correlação para o teor de Prot. 45 Tabela 6 – Dados de correlação para análise de componentes principais (PCA) na cultura da soja sob presença ou ausência da pulverização de magnésio foliar e rizobactérias promotoras de crescimento, em Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 PCA PC1 PC2 Autovalor 5,02 2,54 Variância (%) 29,54 14,93 Variância acumulada (%) 29,54 44,47 Variáveis Correlação URED -0.30 0.48 MDA -0.08 0.46 Prot -0.25 -0.04 Perox 0.23 -0.15 AA 0.04 0.48 Pig 0.53 0.05 A 0.91 0.29 E 0.38 -0.21 gs 0.61 -0.31 CI 0.37 0.56 EIUA 0.81 0.41 Pop 0.08 0.12 AIPV -0.45 0.63 AltP -0.58 0.67 NGP 0.90 -0.13 NVP 0.86 0.16 Prod 0.55 0.49 Fonte: Dados de pesquisa do autor. Nota: URED: ureídeos; MDA: malondialdeído; Prot: proteína, Perox: peróxido de hidrogênio; AA: aminoácidos; Pig: Pigmentos fotossintetizantes (SPAD); A: taxa fotossintética; E: transpiração: gs: condutância estomática; CI: carbono interno; EIUA: eficiência instantânea do uso da água; Pop: população de plantas; AltP: altura de planta; NGP: número de grãos por planta; NVP: número de vagens por planta; Prod: produção. 46 Figura 6 – Análise de componentes principais (PCA) em função da aplicação ou não de magnésio sob os parâmetros fisiológicos e produtivos da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, no munícipio de Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 Fonte: Dados de pesquisa do autor. Nota: URED: ureídeos; MDA: malondialdeído; Prot: proteína, Perox: peróxido de hidrogênio; AA: aminoácidos; Pig: Pigmentos fotossintetizantes (SPAD); A: taxa fotossintética; E: transpiração: gs: condutância estomática; CI: carbono interno; EIUA: eficiência instantânea do uso da água; Pop: população de plantas; AltP: altura de planta; NGP: número de grãos por planta; NVP: número de vagens por planta; Prod: produção. Para os resultados do fator inoculação, é possível notar que os valores a direita do gráfico (dimensão 1) representam os resultados da coinoculação via sementes, que apresentou os melhores indicativos (Figura 7). Além disso, esse tratamento foi capaz de diminuir os teores do Perox e de E, indicando mitigação do estresse. Os resultados para o tratamento controle, encontram-se a esquerda do gráfico (dimensão 2), compartilhando altos valores para AltP, AIPV, URED e MDA e baixos valores de Prot. (Figura 7). O tratamento com coinoculação via sulco, a esquerda do gráfico (dimensão 2), apresenta baixa correlação para Prot, Perox, E, gs e NGP. Para esse estudo, a aplicação das RRBPCP’s via sementes foi o que apresentou os melhores resultados na estatística descritiva e também nos resultados do PCA, o que indica e viabiliza sua utilização em trabalhos de campo. 47 Figura 7 – Análise de componentes principais (PCA) em função da inoculação ou coinoculação de rizobactérias sob os parâmetros fisiológicos e produtivos da soja, em função de RBPCP e aplicação foliar de Mg, no munícipio de Selvíria - MS, Brasil, safra 2023/24 Fonte: Dados de pesquisa do autor. Nota: URED: ureídeos; MDA: malondialdeído; Prot: proteína, Perox: peróxido de hidrogênio; AA: aminoácidos; Pig: Pigmentos fotossintetizantes (SPAD); A: taxa fotossintética; E: transpiração: gs: condutância estomática; CI: carbono interno; EIUA: eficiência instantânea do uso da água; Pop: população de plantas; AltP: altura de planta; NGP: número de grãos por planta; NVP: número de vagens por planta; Prod: produção. Sendo assim, os resultados deste trabalho confirmam que o Mg aliado a coinoculação com o produto à base de mix de Bacillus foi capaz de melhorar, consideravelmente, os índices fisiológicos das plantas e refletir em ganhos em componentes produtivos como NVP e NGP. Os resultados do PCA ainda confirmaram que tanto a aplicação do Mg foliar, quando a coinoculação via sementes, foram capazes de mitigar efeitos estressantes pela baixa correlação para Perox e regular melhor seu conteúdo de água (alto EIUA e baixo E). Tais resultados são promissores, representando um avanço considerável na pesquisa cientifica que precisa estar focada nas mudanças climáticas. Além disso, a recomendação desse estudo alia preceitos importantes da sustentabilidade agrícola, essencial para uma agricultura regenerativa e eficiente. Aliar diferentes técnicas e refinar a produção agrícola parece ser o caminho para solucionar os novos desafios de produção agrícola. 48 6 DISCUSSÃO Foi possível notar significativa melhoria na fisiologia das plantas que receberam a aplicação de Mg via foliar, sendo que o destaque vai para teor de clorofilas a e b, clorofila total, carotenóides, feofitina, pigmentos totais, A, CI e EIUA (Tabelas 2, 3, 4). Assim, ficou evidente, o papel deste nutriente, que é o íon central da molécula de clorofila. Portanto, mesmo em solo corrigido, com alto teor de Mg, seu fornecimento via foliar, em momentos críticos, torna-se essencial para suprir a necessidade das plantas (Cakmak, 2013) pelo efeito bioestimulante. Cerca de 15 a 35 % de todo Mg absorvido pelas plantas está ligado aos cloroplastos, principalmente a clorofila (Chen et al. 2018). Trabalhando com a cultura do tomate, Nas e Zengin (2024), também observaram aumento nos teores de clorofila foliar em torno de 85%. Por isso, é notório a melhoria nos parâmetros dos pigmentos de maneira geral, como os verificados nesse estudo, principalmente no teor de clorofila, o que foi revertido na fisiologia fotossintética da planta. O fornecimento de Mg em momentos chaves do desenvolvimento vegetal, é uma alternativa para manter ou aumentar a taxa fotossintética (A), consequentemente aumentando a produção. Para esse trabalho, foi possível notar que ao aplicar Mg em V6 da soja, houve aumento considerável em teores de pigmentos fotossintetizantes nas folhas, pois também Wang et al. (2020), afirmaram que a aplicação de magnésio é capaz de melhorar a capacidade fotossintética, principalmente nos teores de pigmentos fotossintetizantes. Em seu trabalho, os autores constataram que os ganhos médios com aplicação do Mg em plantas no mundo, podem proporcionar um acréscimo médio de até 8,5% em produtividade das culturas, ficando abaixo do obtido nesta pesquisa. As plantas também apresentaram resultados positivos para A, CI, e EIUA, potencializado pela coinoculação via sementes. Os resultados de A e EIUA, chamam atenção e indicam a viabilidade da aplicação foliar do Mg, mesmo em solos corrigidos, visto que as plantas de soja no período de cultivo em Selvíria-MS, passaram por períodos críticos de ondas de calor, chegando a temperaturas médias de 37,5°C e sensações térmicas em torno dos 47°C (Figura 2). Sendo assim, pode se afirmar que a aplicação do Mg via foliar e a coinoculação contribuíram para diminuir perdas produtivas nesse período, visto a melhora na fisiologia fotossintética das plantas. Para EIUA, é possível verificar que plantas que receberam a coinoculação via sementes, combinadas com aplicação do Mg em V6, apresentaram resultados superiores em relação ao controle e coinoculação via sulco. Tal fato é importante porque constatou a capacidade da planta 49 em melhor regular suas taxas metabólicas, e capacidade de suportar estresses, ligado principalmente a promoção de crescimento pelas bactérias e ao efeito do Mg na fisiologia fotossintética. Tais dados corroboram com o trabalho de Rodrigues et al. (2021), com soja e milho e aplicação de Mg foliar. Nesse trabalho foi verificado que a aplicação de Mg resultou em aumento da sua concentração na soja (10,4%) e no milho, tanto na primeira, quanto na segunda safras (13,3 e 14,4%, respectivamente). Os autores ainda verificaram que, a aplicação de Mg fez com que o desempenho de trocas gasosas aumentasse em ambas as culturas, além de incrementar os valores da taxa fotossintética líquida e também da condutância estomática (49 e 21% para soja e 29 e 47% para o milho). Em suma, plantas que receberam a dose de Mg foliar foram mais eficientes fotossinteticamente e na transformação do gás carbônico em esqueletos de carbono (açúcar), assim perdendo menos água durante o processo. Logo, tanto a cultura da soja quanto a do milho, converteram o açúcar produzido pela fotossíntese em maior número de grãos por planta, conforme constatado também para a soja (Tabela 5), o que viabiliza a pesquisa e comprova os resultados. No solo em questão, com fertilidade corrigida e alto teor de Mg, não foi possível notar diferenças nas médias em relação a aplicação do Mg para ureídeos. Como a aplicação foliar forneceu o Mg em estádio V6, acredita-se que para ureídeos a necessidade da planta foi suprida pelo estoque do solo. Porém, estudos de Peng et al. (2018), verificaram que o suprimento adequado de Mg para soja pode auxiliar na nodulação e consequentemente aumentar o metabolismo de ureídeos, influenciando na fixação biológica do nitrogênio (FBN). Quanto mais cedo fornecido o Mg se via solo, mais o metabolismo do nitrogênio pode ser afetado, auxiliando na FBN. Para GS, os resultados de inoculação foram superiores quando coinoculados via sementes. Analisando os resultados de A e GS, é possível verificar que tanto a utilização das RBPCs, quanto a aplicação de Mg foliar, foram essenciais para auxiliar na melhoria das taxas fisiológicas, indicando a adequada capacidade dessas plantas em realizarem trocas gasosas e continuarem seu desenvolvimento, sendo que tal melhoria contribuiu para ganhos produtivos. Portis e Heldt (1976) e Bhat et al. (2017), confirmam que tal eficiência no balanço nutricional de Mg é essencial, pois o elemento também é indispensável para o controle do empilhamento dos tilacóides e para síntese de diversas enzimas no Ciclo de Calvin. Os autores afirmam que um balanço adequado de Mg, irá fazer com que o bombeamento da enzima Rubisco ocorra de forma eficaz, e mais rápida, com maior afinidade pelo CO2. Assim, o fornecimento de Mg para planta, mesmo em solo corrigido, é capaz de modular diferentes reações, aumentando a 50 atividade de várias enzimas incluindo a Rubisco, importantíssima para plantas de metabolismo C3, e o reflexo obtido nesse trabalho prova que essa aplicação reflete no metabolismo de forma geral e na produtividade de grãos de soja (Tabelas 3, 4 e 5). A coinoculação com o produto à base de B. subtilis e B. megaterium também foi interessante no incremento de pigmentos fotossintetizantes (SPAD), seja na aplicação via sulco ou sementes. Bacillus são bactérias capazes de auxiliar na solubilização de fósforo (P), além de auxiliarem como promotoras de crescimento. Com base nisso, estudos mostram que essas bactérias são capazes de formar endósporos, que podem suportar condições abióticas extremas como temperaturas elevadas, pH ácido e radiação (Bahadir et al. 2018). Isso viabiliza a utilização do produto, visto que o cenário atual de mudanças climáticas pode ser um potencializador do uso destas bactérias na mitigação dos estresses abióticos. Moretti et al. (2024), trabalhando com vários metabólitos bacterianos e coinoculação de RBPCs, verificaram que é necessário consorciar bactérias específicas quanto a funcionalidade para cultura. Os autores destacam ainda a necessidade de maiores pesquisas quanto a esses consórcios bacterianos e os resultados positivos em grupos específicos de bactérias quanto a fisiologia e produtividade das culturas. Para o produto à base de B. subtilis e B. megaterium, Oliveira et al. (2020), trabalhando com a cultura do milho, constataram incremento de produtividade de 8,9% nas áreas que receberam o mix. Para soja, os autores verificaram um incremento de cerca de 12 a 16 sacas ha- 1 quando coinoculado Bradyrhizobium + Bacillus. O que justifica também a utilização para coinoculação do mix aliado com a pulverização do Mg foliar são as menores taxas do Perox constatada no PCA nesse estudo (Figuras 6 e 7). Para os ureídeos, o tratamento com B. japonicum exclusivo (controle) apresentou superioridade em relação à coinoculação , pois o essa bactéria auxilia na FBN, e trabalhos com coinoculação mostram que resultados positivos e negativos podem aparecer dependendo da bactéria envolvida na coinoculação , tanto no metabolismo, bioquímica, tipo e quanto à forma de inoculação (via sulco ou sementes), o que pode afetar os parâmetros finais fisiológicos e produtividade (Nogueira et al. 2018; Prando et al. 2020). Ainda assim, o que essas pesquisas mostram é que coinocular apresenta resultados positivos e de ganhos produtivos dependendo do tipo de mistura de organismos, além de ser uma alternativa sustentável para suprir necessidades nutricionais das plantas. Com um melhor balanço metabólico, a planta reflete isso em ganhos na produção. Para os dados de produtividade houve significativo papel no incremento de NVP e NGP, maiores 51 quando da coinoculação via sementes atrelado com aplicação do Mg foliar. De forma geral, foi observado em campo, que plantas que não receberam a pulverização de Mg e não foram coinoculadas, apresentaram maior quantidade de grãos não viáveis (vagens chochas), tal fato atribuído a oscilação térmica no período (Figura 2). Para produtividade de grãos, a aplicação do Mg foliar foi capaz de aumentar consideravelmente o valor final. Também Altarugio et al. (2017), constataram em seu trabalho com soja e milho, que a aplicação foliar do Mg foi capaz de aumentar o índice SPAD da soja, além de componentes produtivos como vagens e massa de 100 grãos quando aplicado no período reprodutivo. Branquinho et al. (2017) verificaram que a aplicação de Mg nos estádios R2-R4 contribuiu no aumento dos componentes da produção e produtividade da soja. Nesse trabalho, com aplicação em V6, os resultados mostraram-se adequados no incremento para os parâmetros fotossintéticos e produtivos da soja, vislumbrando efeito em aplicações mais precoces. Além disso, em trabalho realizado por Cecatto Júnior et al. (2019 e 2021), com aplicação de Mg foliar em milho, foi observado que além de melhor estruturação visível nas plantas, houve aumento de massa seca de raízes e também massa seca da parte aérea. Segundo os autores, isso possibilitou maior ganho em termos de produtividade, haja vista a possibilidade de maior absorção de água, de outros nutrientes e também na interceptação da luz. Para este trabalho, é notório que a aplicação do Mg foliar em V6 juntamente com a coinoculação via sementes é uma alternativa importante para o auxílio na mitigação do estresse térmico, o que pode auxiliar em ganhos produtivos. Trabalhando com a cultura da soja, Deliboran et al. (2011), avaliando doses de Mg juntamente com fósforo, constataram que a aplicação foliar resultou em incremento de produtividade de 204 kg ha-1 na menor dose (4 kg dal-1), sendo possível atingir um incremento de 675 kg ha-1 na maior dose (8 kg dal-1). Esses autores também observaram que o teor de clorofila na folha foi maior com aumento das doses de magnésio, bem como a massa seca da parte aérea e das raízes. Nesse trabalho, o teor de clorofila nas folhas também foi superior em plantas que receberam a aplicação do Mg, e juntamente com os resultados de outros indicativos confirmam melhoria na fisiologia fotossintética. Para coinoculação do mix de Baci