RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta Tese será disponibilizado somente a partir de 08/12/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas GILMAR HANCK DA SILVA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DO ÁCIDO GÁLICO ENCAPSULADO EM METAL-ORGANIC FRAMEWORKS FUNCIONALIZADOS COM CETUXIMABE NO TRATAMENTO DO CÂNCER DE PRÓSTATA Araraquara-SP 2021 GILMAR HANCK DA SILVA AVALIAÇÃO DO POTENCIAL DO ÁCIDO GÁLICO ENCAPSULADO EM METAL-ORGANIC FRAMEWORKS FUNCIONALIZADOS COM CETUXIMABE NO TRATAMENTO DO CÂNCER DE PRÓSTATA Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos para obtenção do título de Doutor em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Marlus Chorilli Coorientadora: Profa. Dra. Regina Célia Galvão Frem Araraquara-SP 2021 DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Gilmar Hanck da Silva Nome em citações bibliográficas: Silva, G. H.; Hanck-Silva, G. ENDEREÇO PROFISSIONAL Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Departamento de Fármacos e Medicamentos. Rodovia Araraquara-Jaú, Km 01, Laboratório de Pesquisa em Farmacotécnica e Tecnologia Farmacêutica, Sala 227, Campus Ville, CEP: 14801-902 – Araraquara, SP – Brasil FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2017-2021: Doutorado em andamento em Ciências Farmacêuticas Universidade Estadual Paulista, UNESP-Araraquara. com período sanduíche em Instituto Madrileño de Estudios Avanzados Energía, IMDEA Energía (Orientadora: Patricia Horcajada). Tese: Avaliação do potencial do ácido gálico encapsulado em Metal-Organic Frameworks funcionalizados com cetuximabe no tratamento do câncer de próstata. Orientador: Prof. Dr. Marlus Chorilli Coorientadora: Profa. Dra. Regina Célia Galvão Frem Bolsista: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, FAPESP 2013-2015: Mestrado em Química Universidade Federal de Santa Catarina, UFSC Dissertação: Desenvolvimento de sistemas poliméricos nanoparticulados de PS-b-PAA com superfície modificada com derivados de quitosana para a encapsulação de minoxidil. Orientador: Prof. Dr. Edson Minatti Bolsista: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES 2008-2011: Graduação em Farmácia Universidade do Sul de Santa Catarina, UNISUL Iniciação Científica: Desenvolvimento de nanoemulsão contendo óleo de copaíba e extrato rico em limonóides de Melia azedarach para aplicação larvicida. Monografia: Avaliação da estabilidade de medicamentos vencidos pelo teor de princípio ativo. Orientador: Prof. Dr. Patrik Oening Rodrigues Bolsista: Universidade do Sul de Santa Catarina, UNISUL ATUAÇÃO PROFISSIONAL 2019-2020: Estágio Doutorado Internacional Laboratório da Unidade de Materiais Porosos Avançados do Instituto Madrilenho de Estudos Avançados Energia – IMDEA Energia de Móstoles, Madrid, Espanha. 2018-2019: Comissões e Consultoria Representante discente suplente do Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP-Araraquara por um período de 1 ano (agosto 2018/agosto 2019). 2018: Estágio Docência Estagiário na disciplina de Farmacotécnica do curso de Farmácia em um período de 6 meses (1°/2018) na Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara (UNESP). Aula ministrada: Operações Farmacêuticas: divisão de partículas sob a supervisão do Prof. Dr. Marlus Chorilli. 2015-2017: Gerente de Assuntos Regulatórios e Garantia da Qualidade Tauens Farmacêutica Ltda. de Tubarão-SC. 2014-2015: Comissões e Consultoria Representante discente suplente do colegiado do curso de Pós-Graduação em Química do Departamento de Química da UFSC por um período de 1 ano (agosto 2014/agosto 2015). 2014: Estágio Docência Estagiário na disciplina de Físico-Química Experimental B do curso de Química em um período de 6 meses (2°/2014) no Departamento de Química (USFC) sob a supervisão do Prof. Dr. Alfredo Tibúrcio Nunes Pires. 2012-2013: Analista de Assuntos Regulatórios e Garantia da Qualidade Nanovetores Tecnologia S.A. de Florianópolis-SC. 2012: Técnico de Garantia da Qualidade Austen Farmacêutica Ltda. de Tubarão-SC. 2011: Estágio de Graduação Estagiário de Garantia da Qualidade na Austen Farmacêutica Ltda. de Tubarão-SC. 2010: Monitor das disciplinas de Hematologia Monitor da disciplina de Práticas Farmacêuticas I: Sistema Hematopoiético do curso de Farmácia e da disciplina de Hematologia Clínica do curso de Análises Clínicas em um período de 6 meses (2°/2010) na UNISUL. 2010: Estágio Voluntário Estagiário dos Laboratórios Didáticos da Saúde da UNISUL. 2009: Monitor da disciplina de Química Orgânica Monitor da disciplina de Química Orgânica Básica do curso de Farmácia em um período de 1 ano (1°/2009 e 2°/2009) na UNISUL. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFICA Artigos completos publicados em periódicos QUIJIA, C. R.; ALVES, R. C.; HANCK-SILVA, G.; FREM, R. C. G.; ARROYOS, G.; CHORILLI, M. Metal-organic frameworks for diagnosis and therapy of infectious diseases. Critical Reviews in Microbiology, 2021, 47, 1-36. FERNANDES, M. A.; HANCK-SILVA, G.; BAVELONI, F. G.; OSHIRO JUNIOR, J. A.; LIMA, F. T.; ELOY, J. O.; CHORILLI, M. A review of properties, delivery systems and analytical methods for the characterization of monomeric glycoprotein transferrin. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2021, 51, 399-410. FILIPPO, L. D.; SANTOS, K. C.; HANCK-SILVA, G.; LIMA, F. T.; GREMIÃO, M. P. D.; CHORILLI, M. A critical review of biological properties, delivery systems and analytical/bioanalytical methods for determination of bevacizumab. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2021, 51, 445-453. SILVA, P. B.; ARAÚJO, V. H. S.; FONSECA-SANTOS, B.; SOLCIA, M. C.; RIBEIRO, C. M.; SILVA, I. C.; ALVES, R. C.; PIRONI, A. M.; SILVA, A. C. L.; VICTORELLI, F. D.; FERNANDES, M. A.; FERREIRA, P. S.; HANCK-SILVA, G.; PAVAN, F. R.; CHORILLI, M. Highlights regarding the use of metallic nanoparticles against pathogens considered a priority by the World Health Organization. Current Medicinal Chemistry, 2021, 28, 1906- 1956. OSHIRO-JUNIOR, J. A.; ALVES, R. C.; HANCK-SILVA, G.; SATO, M. R.; RODERO, C. F.; ELOY, J. O.; CHORILLI, M. Stimuli-responsive drug delivery nanocarriers in the treatment of breast cancer. Current Medicinal Chemistry, 2020, 27, 2494-2513. HANCK-SILVA, G.; TREVIZAN, L. N. F.; PETRILLI, R.; LIMA, F. T.; ELOY, J. O.; CHORILLI, M. A critical review of properties and analytical/bioanalytical methods for characterization of cetuximab. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2019, 50, 125-135. HANCK-SILVA, G.; FERNANDES, M. A.; TREVIZAN, L. N. F.; LIMA, F. T.; ELOY, J. O.; CHORILLI, M. A critical review of properties and analytical methods for the determination of docetaxel in biological and pharmaceutical matrices. Critical Reviews in Analytical Chemistry, 2018, 48, 517-527. Artigos aceitos para publicação HANCK-SILVA, G.; MINATTI, E. Polystyrene-b-poly(acrylic acid) nanovesicles coated by modified chitosans for encapsulation of minoxidil. Brazilian Journal of Pharmaceutical Sciences, 2020. Trabalhos publicados em anais de eventos científicos HANCK-SILVA, G.; FREM, R. C. G.; CHORILLI, M. One-pot synthesis of gallic acid-loaded ZIF-8 to application in prostate cancer treatment. In: 3rd International Conference on Metal Organic Frameworks and Porous Polymers - EuroMOF, 2019, Paris. HANCK-SILVA, G.; DREYER, J. P.; MINATTI, E. Synthesis of chitosan derivates with hydrophilic and hydrophobic groups for application in the decoration of polystyrene-b- poly(acrilic acid) vesicles. In: 4th French-Brazilian Meeting on Polymers - FBPOL, 2014, Florianópolis. DREYER, J. P.; HANCK-SILVA, G.; MINATTI, E. Electrospinning of poly(ethylene oxide) and cellulose acetate and influence of the incorporation of flavorings in the electrospinning process. In: 4th French-Brazilian Meeting on Polymers - FBPOL, 2014, Florianópolis. SILVA, G. H.; RODRIGUES, P. O. Evaluation expired date concordance with the proportion of active principle of seven expired drugs. In: 8th International Congress of Pharmaceutical Sciences, 2011, Ribeirão Preto. SILVA, G. H.; RODRIGUES, P. O. Avaliação da concordância do prazo de validade com o teor de princípio ativo em medicamentos vencidos. In: XV Farmapolis, 2010, Florianópolis. BRUSTOLIN, S.; SILVA, G. H.; KANIS, L. A.; PROPHIRO, J. S. Desenvolvimento de nanoemulsão contendo óleo de copaíba e extrato rico em limonóides de Melia azedarach para aplicação larvicida. In: V Jornada Unisul de Iniciação Científica - JUNIC e V Seminário de Pesquisa, 2010, Tubarão. Apresentação de trabalhos SILVA, G. H.; RODRIGUES, P. O. Avaliação da estabilidade de medicamentos vencidos pelo teor de princípio ativo. In: Seminários do Curso de Farmácia, 2010, Tubarão. Participação de eventos científicos 1. 3rd International Conference on Metal Organic Frameworks and Porous Polymers - EuroMOF, 2019. 2. EuroMOF 2019 Young Investigator Symposium, 2019. http://lattes.cnpq.br/0376389529708926 http://lattes.cnpq.br/0376389529708926 http://lattes.cnpq.br/0376389529708926 http://lattes.cnpq.br/0376389529708926 http://lattes.cnpq.br/0376389529708926 http://lattes.cnpq.br/0376389529708926 3. VIII Congresso Farmacêutico da UNESP e IV Jornada de Engenharia de Bioprocessose Biotecnologia. Avaliador de resumos e apresentações. 2018. 4. 4th French-Brazilian Meeting on Polymers, 2014. 5. 8th International Congress of Pharmaceutical Sciences, 2011. 6. II Jornada Acadêmica do Curso de Farmácia da Unisul, 2010. 7. I Simpósio Virtual de Farmácia, 2010. 8. V Jornada Unisul de Iniciação Científica - JUNIC e V Seminário de Pesquisa, 2010. 9. XV Farmapolis, 2010. 10. I Jornada Acadêmica do Curso de Farmácia da Unisul, 2009. 11. I Jornada de Virologia e Infectologia da Unisul, 2009. 12. I Oficina FNEPAS Regional da Grande Florianópolis e do Sul de Santa Catarina. 2008. 13. II Seminário Interdisciplinar de Saúde, 2007. Organização de eventos científicos 1. SOLDI, V.; MINATTI, E.; BORSALI, R.; SILVA, G. H.; GAUCHE, C.; ZEPON, K. M.; SOLDI, M. S. 4th French-Brazilian Meeting on Polymers – FBPOL, 2014. 2. SILVA, G. H.; LEAL, A.; FRITZEN, I. R.; NASCIMENTO, M.; BENINCA, M. C.; CANDIDO, T. N. Ciclo de Palestras na Rede Pública de Educação do Município de Lauro Müller-SC com o Tema: Automedicação e Uso Racional de Medicamentos, 2007. http://lattes.cnpq.br/0376389529708926 Dedico este trabalho à minha família, pelo apoio e suporte, sendo sempre o meu porto seguro em todos os momentos necessários. Tudo que faço e conquisto é para vocês! Dedico especialmente ao meu primo Rogério (in memoriam) que infelizmente se tornou estatística neste ano tão caótico. Por fim, dedico para todas as vidas brevemente ceifadas; aos sonhos interrompidos; aos choros incessantes; e às famílias destruídas. Não existem palavras que possam apaziguar a tristeza e a dor incomensurável oriunda da pandemia de COVID-19. AGRADECIMENTOS (A ordem aqui apresentada não representa necessariamente uma ordem de importância hierárquica...). Aqui estou eu, tentando encontrar palavras para agradecer a cada uma das pessoas que, de alguma forma, passaram pela minha vida durante todo este período que se encerra com a entrega desta tese. Independente das experiências, sejam elas boas ou ruins, fizeram-me aprender muito e me permitiram chegar até este exato momento. Tento não esquecer nenhum nome, coisa praticamente impossível para mim, pois quem me conhece sabe que possuo uma memória terrível. Assim que, neste momento, vejo-me fazendo um retrospecto em minha mente, principiando em meados de 2017 e finalizando neste ano de 2021. O primeiro contato que tive com meu orientador Marlus Chorilli, suas palavras de incentivo para prestar a seletiva naquele mesmo ano. O nervosismo que foi apresentar meu pré-projeto quase sem voz, talvez pela ansiedade, fazendo-me entender com todo o esforço possível. Deixar minha família no interior de Santa Catarina e viajar mais de mil quilômetros até Araraquara e depois quase nove mil quilômetros até Móstoles na Espanha, um oceano inteiro e outro hemisfério. Há quem diga que tenha sido uma aventura e sim realmente foi. Uma das experiências mais intensas e produtivas da minha vida, ter sido apresentado ao fascinante mundo das MOFs, as quais me permitiram viajar e conhecer pessoas de toda parte do mundo, trocar experiências e aprofundar conhecimentos que possibilitaram chegar a este momento de conclusão desta tese de doutorado. Diante de tudo, não poderia deixar de expressar meus agradecimentos principalmente para mim, pelo esforço e força de vontade que foram extremamente necessários para a conclusão desta tese, impedindo-me por diversas vezes de desistir frente às dificuldades e momentos de desesperança enfrentadas ao longo deste percurso. Tenho que agradecer muito ao meu orientador Marlus Chorilli, pela oportunidade, orientações, conversas e principalmente pela paciência comigo durante todos estes anos. Pelas palavras de incentivo e pelo apoio nas submissões dos pedidos de bolsas junto à FAPESP, as quais possibilitaram o desenvolvimento deste trabalho. Minha coorientadora Regina Célia Galvão Frem, por abrir as portas do seu laboratório. Aos membros da banca examinadora, os professores Flávio da Silva Emery, Renato Grillo, Sônia Nair Báo e Susana Isabel Fonseca de Almeida Santos Braga, por aceitarem prontamente o convite e principalmente pelas considerações nas arguições. Naturalmente, não poderia deixar de fazer um agradecimento especial para a minha supervisora na Espanha, Patricia Horcajada, a pessoa que eu tive a sorte de conhecer e trabalhar durante este um ano de estágio em seu laboratório de materiais porosos avançados, aprimorando meus conhecimentos sobre as MOFs em colaboração principalmente com a Tania Hidalgo, a “galeguinha” que me auxiliou não somente com o meu “portunhol”, mas também nos vários experimentos realizados. Ambas foram as principais responsáveis pelo sentimento de acolhimento e pertencimento ao grupo “Porosos”, mas sem esquecer dos demais integrantes, Pablo, Giacomo, Gabriel, Antonio, Sara, Ana e Soraya. Muito obrigado por todos os momentos dentro e fora do laboratório. Arrisco-me a dizer em espanhol que “fueron muy buenos los momentos vividos con vosotros. MUCHAS GRACIAS”. Também gostaria de agradecer a todas as pessoas que de alguma forma contribuíram com esta tese, a maioria destacada ao longo do texto com o intuito de evitar esquecimentos por minha parte. Todos os técnicos e colegas de trabalho que me auxiliaram com experimentos, análises e discussões. Mas também os demais colaboradores tanto da UNESP, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, do Instituto de Química e do Instituto IMDEA Energia. Meu muito obrigado se estende também para a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001, pela concessão da bolsa de estudos nos primeiros anos de doutorado. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - Brasil (CNPq). E para a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP), por meio do processo n° 2018/17672-5 e processo n° 2019/14124-0, pelo apoio financeiro fundamental para a realização desta tese. E por fim e mais importante, gostaria de agradecer imensamente toda minha família, principalmente minha mãe Maria Madalena Hanck da Silva, meu pai José da Silva e minha irmã Sandra da Silva, pelo apoio infinito em todos os meus projetos de vida, inclusive este que se encerra agora. Gostaria de agradecer todo esforço e dedicação dos meus pais que nunca mediram esforços para proporcionar o melhor para mim e para minha irmã. Apesar de tudo, podem ter orgulho do primeiro DOUTOR da família! Sinceramente, Obrigado a todos! ¡Gracias a todos! Thank you everyone! “A ciência é mais que um corpo de conhecimento, é uma forma de pensar, uma forma cética de interrogar o universo, com pleno conhecimento da falibilidade humana. ” (Carl Sagan) RESUMO O câncer de próstata é uma das mais comuns neoplasias e uma das principais causas de morte relacionadas ao câncer em homens no Brasil e no mundo, constituindo um sério problema de saúde pública, sendo que a agressividade desta neoplasia está relacionada principalmente com a superexpressão do receptor EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). O ácido gálico (GA), um ácido fenólico natural, tem apresentado vários efeitos biológicos, incluindo atividade anticancerígena, mas seu uso tem algumas limitações principalmente pela alta instabilidade química, levando a uma redução de sua concentração plasmática máxima. Para superar muitos dos problemas de biodisponibilidade, têm-se tornado comum o uso de sistemas de liberação de fármacos (SLF), como as MOFs (Metal-Organic Frameworks), que são polímeros de coordenação inorgânicos porosos sintetizados a partir de íons metálicos e ligantes orgânicos. Neste contexto, vale mencionar as MOFs amorfas (Amorphous Metal-Organic Frameworks), uma subclasse relativamente recente de MOFs construída de maneira bastante semelhante às MOFs convencionais, mas que passam por processos de amorfização físicos ou químicos durante ou após a síntese. Sendo assim, desenvolveu-se uma MOF sintetizada a partir de íons zinco (Zn), um relevante metal e um componente deficiente na próstata acometida pelo câncer, que em seguida foi funcionalizada com cetuximabe (CTX), um anticorpo monoclonal que se liga ao receptor de EGFR, podendo proporcionar a entrega direcionada do GA. O objetivo do presente trabalho foi avaliar o potencial do GA incorporado em MOFs amorfas funcionalizadas com CTX no tratamento do câncer de próstata. Para tanto, sintetizou-se uma MOF híbrida amorfa na presença do GA (aZIF-GA). Após esta etapa, o material foi funcionalizado com CTX (aZIF-GA/CTX) pelo método de conjugação química com os reagentes EDC-NHS. Os materiais obtidos foram devidamente caracterizados, calculada a quantidade de GA incorporado e liberado nos sistemas desenvolvidos (aZIF-GA e aZIF-GA/CTX), onde verificou-se uma eficiência de carga de 81,2% e uma capacidade de carga de 25,6% para o sistema aZIF-GA e de 75,1% e 23,8% para o sistema aZIF-GA/CTX. Os ensaios de liberação foram realizados no meio PBS, com valores de pH 5.0 e 7.4, apresentando maiores taxas de liberação em pH ácido, 88,16% para o sistema não funcionalizado (aZIF-GA) e 81,60% para o sistema funcionalizado (aZIF-GA/CTX). Os estudos de estabilidade demonstraram que os sistemas aZIF-GA e aZIF-GA/CTX possuem excelente estabilidade em meio aquoso. Os ensaios de viabilidade celular 2D, tanto dos precursores quanto dos sistemas (aZIF-GA e aZIF- GA/CTX), foram avaliados em três linhagens celulares de próstata, uma não tumoral (PNT-2) e duas tumorais (PC-3 e DU-145), mostrando maior seletividade para linhagem PC-3. Os ensaios de viabilidade celular 3D foram realizados na linhagem DU-145 e os esferoides apresentaram uma redução da viabilidade de 2,61× para o sistema aZIF-GA e 8,58× para o sistema aZIF-GA/CTX, quando comparados ao GA livre. Os ensaios de internalização celular demonstraram que a morte celular está diretamente relacionada com as alterações celulares oriundas da presença dos compostos testados e o tempo de exposição. Os resultados sugerem o potencial do sistema desenvolvido para o tratamento do câncer de próstata. Palavras-chave: câncer de próstata; MOF; sistema de liberação de fármaco; ácido gálico; cetuximabe. ABSTRACT Prostate cancer is one of the most common neoplasms and one of the main causes of cancer- related death in men in Brazil and worldwide, constituting a serious public health problem, and the aggressiveness of this neoplasm is mainly related to the overexpression of the EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Gallic acid (GA) a natural phenolic acid, has shown several biological effects, including anticancer activity, but its use has some limitations mainly due to its high chemical instability, leading to a reduction in its maximum plasma concentration. To overcome many of the bioavailability problems, it has become common to use drug delivery systems (DDS), such as MOFs (Metal-Organic Frameworks), which are porous inorganic coordination polymers synthesized from metal ions and organic linkers. In this context, it is worth mentioning the amorphous MOFs (Amorphous Metal-Organic Frameworks), a relatively recent subclass of MOFs built in a very similar way to conventional MOFs, but that go through physical or chemical amorphization processes during or after synthesis. Thus, a MOF synthesized from zinc ions (Zn) was developed, a relevant metal and a deficient component in the prostate affected by cancer, which was then functionalized with cetuximab (CTX), a monoclonal antibody that binds to the EGFR receptor, which can provide targeted delivery of the GA. The aim of the present study was to evaluate the potential of GA incorporated in amorphous MOFs functionalized with CTX in the treatment of prostate cancer. Therefore, a new amorphous hybrid MOF was synthesized in the presence of GA (aZIF-GA). After this step, the material was functionalized with CTX (aZIF-GA/CTX) by EDC-NHS conjugation chemistry method. The materials obtained were properly characterized, calculated the amount of GA incorporated and released in the developed systems (aZIF-GA and aZIF-GA/CTX) where was verified a load efficiency of 81.2% and a load capacity of 25.6% for the aZIF-GA system and 75.1% and 23.8% for the aZIF-GA/CTX system. The release assays were performed in PBS medium, at pH 5.0 and 7.4, showing higher release rates in acidic pH, 88.16% for the non-functionalized system (aZIF-GA) and 81.60% for the functionalized system (aZIF- GA/CTX). Stability studies demonstrated that aZIF-GA and aZIF-GA/CTX systems have excellent stability in aqueous media. 2D cell viability assays, both precursors and systems (aZIF-GA and aZIF-GA/CTX), were evaluated in three prostate cell lines, one non-tumor (PNT-2) and two tumors (PC-3 and DU-145), showing higher selectivity for PC-3 line. The 3D cell viability assays were performed in the DU-145 line and the spheroids showed a reduction in viability of 2.61× for the aZIF-GA system and 8.58× for the aZIF-GA/CTX system, when compared to free GA. Cell internalization assays demonstrated that cell death is directly related to cell changes arising from the presence of the tested compounds and exposure time. The results suggest the potential of the system developed for the treatment of prostate cancer. Keywords: prostate cancer; MOF; drug delivery system; gallic acid; cetuximab. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1. Estrutura química básica do ácido gálico (GA) (carbono = cinza, oxigênio = vermelho e hidrogênio = branco). ............................................. Erro! Indicador não definido. Figura 2. Representação esquemática demonstrando a construção (metal = amarelo, ligante orgânico = azul) e topografia simplificada de uma MOF 1D, uma MOF 2D e uma MOF 3D. ................................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 3. Representação tridimensional da ZIF-8 (magenta = zinco, cinza = carbono, azul = nitrogênio, vermelho = oxigênio, branco = hidrogênio e amarelo = representação das cavidades/poros). ....................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 4. A classificação dos anticorpos monoclonais - A) humano, B) humanizado, C) murino e D) quimérico. A estrutura geral é composta por um domínio de cadeia leve (L, vermelho) e um domínio de cadeia pesada (H, azul). O glicano está representado em verde. As cadeias leves têm duas regiões, uma constante (CL) e uma variável (VL). As cadeias pesadas têm quatro regiões (VH, CH1, CH2 e CH3). As regiões de determinantes de complementaridade (CDRs) estão na porção do fragmento variável (Fv) do fragmento de ligação ao antígeno (Fab). Dois Fabs são conectados a um Fc por dobradiças flexíveis (em preto). Pontes dissulfetos (em laranja) estão intercaladas por todo anticorpo para estabilidade adicional. Sítios de clivagem de enzimas e agentes redutores estão destacados em vermelho. ................................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 5. Difratogramas de DRX da ZIF-8 simulada (CIF 602542) e da ZIF-8 experimental. ................................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 6. Difratogramas de DRX da ZIF-8 sintetizada por diferentes métodos, diferindo pelo solvente utilizado, razão metal:ligante, temperatura e tempo de reação. .. Erro! Indicador não definido. Figura 7. Espectros vibracionais na região do infravermelho da ZIF-8 tal como sintetizada (em preto) e ativada (em vermelho), produzidos em pastilhas de KBr. .... Erro! Indicador não definido. Figura 8. Termogramas de TGA (linha preta) e DSC (linha vermelha) da ZIF-8 tal como sintetizada. ................................................................................. Erro! Indicador não definido. Figura 9. Termogramas de TGA (linha preta) e DSC (linha vermelha) da ZIF-8 ativada. ................................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 10. Fotomicrografias de MEV em diferentes magnificações da ZIF-8 sintetizada. As barras de escala são de A) 1 mícron e B) 100 nanômetros. ....... Erro! Indicador não definido. Figura 11. Fotomicrografias de MET em diferentes magnificações da ZIF-8 sintetizada. As barras de escala são de A) 1 mícron e B) 200 nanômetros. ....... Erro! Indicador não definido. Figura 12. Isotermas de N2 (adsorção/dessorção) da ZIF-8 ativada e o valor da área superficial específica calculada pelo modelo BET. ................... Erro! Indicador não definido. Figura 13. Difratogramas de DRX das A) diferentes concentrações de ácido gálico (GA) utilizadas, B) ZIF-8 (preto), GA (vermelho) e aZIF-GA (azul) com intensidade normalizada, C) não normalizada e das D) amostras de aZIF-GA produzidas in situ e pós-síntese. ..... Erro! Indicador não definido. Figura 14. Espectros vibracionais na região do infravermelho da A) aZIF-GA comparado com a ZIF-8, e B) dos demais precursores: ácido gálico (GA), 2-metilimidazol (2-MI) e nitrato de zinco hexahidratado (Zn(NO3)2.6H2O). ................... Erro! Indicador não definido. Figura 15. Termogramas de TGA (linha preta) e DSC (linha vermelha) do ácido gálico (ga). ................................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 16. Termogramas de TGA (linha preta) e DSC (linha vermelha) do sistema aZIF-GA. ................................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 17. Termogramas de TGA da A) aZIF-GA e ZIF-8 e B) detalhes da decomposição térmica da aZIF-GA. ................................................................ Erro! Indicador não definido. Figura 18. Fotomicrografias de MEV das amostras com diferentes concentrações de ácido gálico (GA). A-B) 1,77 mM (ampliações de 20 k e 50 k), C-D) 3,54 mM (ampliações de 10 k e 50 k), E-F) 8,86 mM (aZIF-GA) (ampliações de 20 k e 50 k). As barras de escala são de 1 mícron (A, C, E) e 100 nanômetros (B, D, F). .......................... Erro! Indicador não definido. Figura 19. Fotomicrografia de MET e o modelo gaussiano calculado por meio da medida de tamanho de partícula da aZIF-GA. ........................................... Erro! Indicador não definido. Figura 20. Espectros de emissão de fluorescência da aZIF-GA, ácido gálico (GA) e ZIF-8 obtidos no comprimento de onda de excitação de 280 nm. ....... Erro! Indicador não definido. Figura 21. Diferenças nas colorações da ZIF-8, ácido gálico (GA) e aZIF-GA em pó. . Erro! Indicador não definido. Figura 22. Espectros de RMN de 1H da ZIF-8, ácido gálico (GA) e aZIF-GA digeridas em dCl e solubilizadas em DMSO-d6. ............................................. Erro! Indicador não definido. Figura 23. Isotermas de N2 (adsorção/dessorção) da aZIF-GA e da ZIF-8, com os valores obtidos para as áreas superficiais específicas calculadas pelo modelo BET. ... Erro! Indicador não definido. Figura 24. Estrutura minimizada para a molécula de ácido gálico (GA) sob uma superfície de carga potencial eletrostática. As regiões parcialmente positivas estão em azul e as regiões parcialmente negativas estão em vermelho. .............................. Erro! Indicador não definido. Figura 25. Representação A) das voids da estrutura da ZIF-8, B) das cavidades com potencial para receber o ácido gálico (GA), C) das 10 melhores poses de ancoragem pontuadas obtidas pelo algoritmo PatchDock, e D) da melhor pose pontuada referente ao complexo de interação entre o GA e a ZIF-8 num sistema do tipo hóspede-hospedeiro. ............. Erro! Indicador não definido. Figura 26. Fotomicrografias de MEV com diferentes magnificações para análise morfológica do ácido gálico (GA). As barras de escala são de A-B) 10 micrômetros. C) difratogramas do GA e dos padrões simulados obtidos da base de dados CCDC (CIF 170921) e (CIF 811292) comparando as orientações hkl com base nos principais grupos espaciais encontrados no GA utilizado neste trabalho (P 2/n(13) e C 2/c(15), respectivamente). Erro! Indicador não definido. Figura 27. Representação dos hábitos cristalinos preditos pelo método “BFDH Crystal Morphology” disponível no pacote CSD_materials para os plausíveis polimorfos do ácido gálico (GA). ............................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 28. Classificação dos grupos funcionais do ácido gálico (GA) para a formação de ligações de hidrogênio (LH). Os grupos destacados em azul são doadores de LH e o grupo destacado em laranja é aceitador de LH. ................................... Erro! Indicador não definido. Figura 29. Análise de HBP para a forma anidra do ácido gálico (GA) (esquerda). O valor da área sob a curva ROC para este modelo corresponde a 0,8907. Representações dos perfis das ligações de hidrogênio (LH) (direita) para os respectivos grupos espaciais C 2/c [𝑹𝟐 𝟐(𝟖)] e P 21/c. ............................................................................................ Erro! Indicador não definido. Figura 30. Análise de HBP para a forma monohidratada do ácido gálico (GA) (esquerda). O valor da área sob a curva ROC para este modelo corresponde a 0,8378. Representações dos perfis das ligações de hidrogênio (LH) (direita) para o grupo espacial P 2/n [𝑹𝟒 𝟒(𝟖)]. ..... Erro! Indicador não definido. Figura 31. Difratogramas de DRX da aZIF-GA e da aZIF-GA/CTX. .. Erro! Indicador não definido. Figura 32. Espectros vibracionais na região do infravermelho da ZIF-8, do ácido gálico (GA), da aZIF-GA, do cetuximabe (CTX) e da aZIF-GA/CTX. ........... Erro! Indicador não definido. Figura 33. Termogramas de TGA (linha preta) e DSC (linha vermelha) do cetuximabe (CTX). ....................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 34. Termogramas de A) TGA (linha preta) e DSC (linha vermelha) do sistema aZIF- GA/CTX e B) comparativo entre os termogramas de TGA da ZIF-8, aZIF-GA e aZIF- GA/CTX. ................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 35. Fotomicrografias de MEV A-B) da aZIF-GA (ampliações de 20 k e 50 k) e C) da aZIF-GA/CTX (ampliação de 15 k). As barras de escala são de 1 mícron (A e C) e 100 nanômetros (B). ......................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 36. Espectros de emissão de fluorescência do cetuximabe (CTX), aZIF-GA e aZIF- GA/CTX obtidos no comprimento de onda de excitação de 280 nm. ...... Erro! Indicador não definido. Figura 37. Espectros de RMN de 1H da ZIF-8, ácido gálico (GA), aZIF-GA, cetuximabe (CTX) e aZIF-GA/CTX digeridas em dCl e solubilizadas em DMSO-d6. ..... Erro! Indicador não definido. Figura 38. Isoterma de N2 (adsorção/dessorção) da ZIF-8, aZIF-GA e aZIF-GA/CTX, com a área superficial específica calculada pelo modelo BET. ........ Erro! Indicador não definido. Figura 39. Resultados da distribuição de tamanho de partícula (nm) (na direita) e distribuição de potencial zeta (mV) (na esquerda) realizados por DLS para aZIF-GA e aZIF-GA/CTX avaliados durante 24 h a 37 °C em diferentes meios fisiológicos (água, PBS pH 7.4, PBS pH 5.0 e RPMI). .............................................................................. Erro! Indicador não definido. Figura 40. Cinéticas de liberação do A) ácido gálico (GA) e B) 2-metilimidazol (2-MI) realizadas por CLAE para aZIF-GA avaliada durante 24 h a 37 °C em diferentes meios fisiológicos (água, PBS pH 7.4, PBS pH 5.0 e RPMI). ............. Erro! Indicador não definido. Figura 41. Difratogramas de DRX da aZIF-GA e aZIF-GA/CTX avaliados após 24 h a 37 °C em diferentes meios fisiológicos (água, PBS pH 7.4, PBS pH 5.0 e RPMI). ............... Erro! Indicador não definido. Figura 42. Cromatograma típico do GA (40 µg ml-1) obtido pelo método cromatográfico em solução de metanol. ................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 43. Curva analítica do GA em solução de metanol obtido pelo método cromatográfico. .......................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 44. Cromatograma típico do GA (40 µg ml-1) obtido pelo método cromatográfico em PBS pH 5.0 (linha preta) e PBS pH 7.4 (linha vermelha). ........ Erro! Indicador não definido. Figura 45. Curvas analíticas do GA nos meios pbs obtidas pelo método cromatográfico: A) PBS pH 5.0 e B) PBS pH 7.4. ................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 46. Perfis de liberação do GA livre e nos sistemas desenvolvidos sem e com agente funcionalizante (aZIF-GA e aZIF-GA/CTX, respectivamente) nos meios PBS pH 5.0 e PBS pH 7.4. ....................................................................................... Erro! Indicador não definido. Figura 47. Representação gráfica da viabilidade celular para A) os precursores CTX (verde) e 2-MI (roxo) avaliadas nas linhagens PC-3 e DU-145, para B) a ZIF-8 (preto) avaliada nas linhagens PC-3, DU-145 e PNT-2 e para C) o GA (vermelho) e os sistemas desenvolvidos aZIF-GA (azul) e aZIF-GA/CTX (laranja) usando as linhagens celulares PC-3, DU-145 e PNT-2 em um modelo de cultura 2D tratado por 72 horas. ...... Erro! Indicador não definido. Figura 48. Representação gráfica da viabilidade celular para o GA livre (vermelho) e para os sistemas desenvolvidos aZIF-GA (azul) e aZIF-GA/CTX (laranja) usando a linhagem de células DU-145 em um modelo de cultura 3D tratado por 24 horas. ........ Erro! Indicador não definido. Figura 49. Representação gráfica das células de PC-3 e DU-145 não tratadas (controle negativo) e tratadas com aZIF-GA e aZIF-GA/CTX por 24 horas e analisadas por citometria de fluxo. Representando a morfologia celular (A, C e E em ambos) e internalização celular (B, D e F em ambos) representando células não viáveis (quadrante Q1), células não viáveis internalizadas (quadrante Q2), células viáveis (quadrante Q3) e células viáveis internalizadas (quadrante Q4). .......................................................................... Erro! Indicador não definido. LISTA DE TABELAS Tabela 1. Reagentes e solventes utilizados neste trabalho. ...... Erro! Indicador não definido. Tabela 2. Comparação dos valores de 2θ obtidos para ZIF-8 simulada (CIF 602542) e para a ZIF-8 sintetizada. ...................................................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 3. Principais frequências e atribuições na região do infravermelho da ZIF-8 sintetizada neste trabalho [92], [141], [142], [147]. .................. Erro! Indicador não definido. Tabela 4. Principais frequências e atribuições na região do infravermelho do GA, comparados com a literatura [139], [152]-[155]. ...................... Erro! Indicador não definido. Tabela 5. Principais frequências e atribuições na região do infravermelho do sistema aZIF- GA sintetizado neste trabalho.................................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 6. Porcentagem dos principais elementos presentes na ZIF-8 e aZIF-GA determinado pela técnica de AE e ICP-OES. ................................................. Erro! Indicador não definido. Tabela 7. Parâmetros geométricos, termodinâmicos e eletrônicos obtidos pelo método semi- empírico PM7 para a molécula de ácido gálico (GA). .............. Erro! Indicador não definido. Tabela 8. Principais frequências e atribuições na região do infravermelho do sistema aZIF- GA/CTX sintetizado neste trabalho. ......................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 9. Porcentagem em massa de componentes orgânicos (ligante, fármaco), inorgânicos (óxido de zinco) e cetuximabe (CTX) presentes na ZIF-8, aZIF-GA e aZIF-GA/CTX determinado pela técnica de TGA. ............................................ Erro! Indicador não definido. Tabela 10. Porcentagem dos principais elementos presentes na ZIF-8, aZIF-GA e aZIF- GA/CTX determinados pela técnica de AE. ............................. Erro! Indicador não definido. Tabela 11. Porcentagem em massa dos principais componentes - 2-metilimidazol (2-MI), ácido gálico (GA), cetuximabe (CTX) e zinco (Zn) presentes na ZIF-8, aZIF-GA e aZIF- GA/CTX determinados pelas técnicas de TGA, CLAE, AE e ICP-OES. Erro! Indicador não definido. Tabela 12. Resultados de distribuição de tamanho de partícula (DTP) e potencial zeta (ζ) para ZIF-8, aZIF-GA e aZIF-GA/CTX realizados em DLS com diferentes solventes (metanol, etanol, PBS pH 7.4 e água ultrapura). ....................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 13. Valores das áreas referentes aos picos do GA em solução de metanol nas diferentes concentrações para a elaboração da curva analítica por CLAE-DAD. .............. Erro! Indicador não definido. Tabela 14. Análise de variância dos valores das áreas determinadas para a obtenção da curva analítica do GA em solução de metanol através da técnica de CLAE-DAD. .. Erro! Indicador não definido. Tabela 15. Determinação da precisão intracorrida (repetibilidade) do GA em solução de metanol através da técnica de CLAE-DAD. .............................. Erro! Indicador não definido. Tabela 16. Determinação da precisão intermediária do GA em solução de metanol através da técnica de CLAE-DAD. ............................................................. Erro! Indicador não definido. Tabela 17. Dados referentes a eficiência de carga (DLE) e capacidade de carga (DLC) de diferentes fármacos na ZIF-8. ................................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 18. Valores das áreas referentes aos picos do GA em PBS pH 5.0 e PBS pH 7.4 nas diferentes concentrações para a elaboração das curvas analíticas por CLAE-DAD. ......... Erro! Indicador não definido. Tabela 19. Análise de variância dos valores das áreas determinadas para a obtenção das curvas analíticas do GA em PBS pH 5.0 e PBS pH 7.4 através da técnica de CLAE-DAD. ................................................................................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 20. Determinação da precisão intracorrida (repetibilidade) do GA em meio PBS pH 5.0 e PBS pH 7.4 através da técnica de CLAE-DAD. ............... Erro! Indicador não definido. Tabela 21. Determinação da precisão intermediária do GA nos meios PBS pH 5.0 e PBS pH 7.4 através da técnica de CLAE-DAD....................................... Erro! Indicador não definido. Tabela 22. Valores de R2 referente aos diferentes modelos matemáticos calculados para o estudo de liberação in vitro do GA livre e para os sistemas aZIF-GA e aZIF-GA/CTX nos meios PBS pH 5.0 e PBS pH 7.4. .............................................. Erro! Indicador não definido. Tabela 23. Valores de IC50 dos compostos estudados e seus respectivos valores de índice de seletividade (IS). ........................................................................ Erro! Indicador não definido. LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 2-MI 2-metilimidazol 5-FU 5-fluorouracil AE Análise Elementar ANOVA Análise de variância ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária aMOF Amorphous Metal-Organic Framework aZIF Amorphous Zeolitic Imidazolate Framework BCA Bicinchoninic acid assay BET Brunauer-Emmett-Teller BioMOF Biocompatible Metal-Organic Framework CCDC The Cambridge Crystallographic Data Centre CIF Crystallographic Information File CLAE-DAD Cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos CMD Concentração média determinada CSD The Cambridge Structural Database CTX Cetuximabe CV Coeficiente de variação dCl Ácido clorídrico deuterado DDS Drug delivery system DiO Perclorato de 3,3'-dioctadeciloxacarbocianina DLC Capacidade de carga DLE Eficiência de carga DLS Espalhamento de luz dinâmico DMEM Dulbecco’s modified eagle’s medium DMF Dimetilformamida DMSO Dimetilsulfóxido DMSO-d6 Dimetilsulfóxido deuterado DP Desvio padrão DPR Desvio padrão relativo DRX Difratometria de raios-X DSC Calorimetria exploratória diferencial DTP Distribuição de tamanho de partícula EDC N-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarboiimida EGFR Epidermal growth factor receptor ERO Espécie reativa de oxigênio FBS Soro fetal bovino FL Espectroscopia de fluorescência FTIR Espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier GA Ácido gálico HBP Hydrogen-bonding propensity HKUST Hong Kong University of Science and Technology HPLC High performance liquid chromatography IC50 Concentração inibitória (50% de inibição) ICH International Conference on Harmonisation ICP-OES Espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente IFA Ingrediente farmacêutico ativo IgG Imunoglobulina G IMDEA Instituto Madrilenho de Estudos Avançados INCA Instituto Nacional de Câncer IRMOF Isoreticular Metal-Organic Framework IS Índice de seletividade LH Ligação de hidrogênio MET Microscopia eletrônica de transmissão MEV-FEG Microscopia eletrônica de varredura com canhão de emissão de campo MIL Matériaux de l'Institut Lavoisier MOF Metal-Organic Framework MPM Metaloproteinase de matriz MTT Brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio NHS N-hidroxissuccinimida NP Nanopartículas OMS Organização Mundial da Saúde PBS Tampão fosfato salino PM7 Parametric Method 7 PSA Antígeno prostático específico RMN Ressonância magnética nuclear RPMI Roswell park memorial institute 1640 medium rpm Rotação por minuto SIM Sistema de informação sobre mortalidade SLF Sistema de liberação de fármacos TGA Termogravimetria TNM Tumor nódulo metástase UiO Universitetet i Oslo ULA Ultra-low attachment UNESP Universidade Estadual Paulista vW van der Waals ZIF Zeolitic Imidazolate Framework SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................... 26 2 REVISÃO DA LITERATURA ............................................... Erro! Indicador não definido. 2.1 CÂNCER DE PRÓSTATA ................................................. Erro! Indicador não definido. 2.2 ÁCIDO GÁLICO ................................................................ Erro! Indicador não definido. 2.3 METAL-ORGANIC FRAMEWORKS COMO SLF ............. Erro! Indicador não definido. 2.3.1 Zeolitic Imidazolate Framework ....................................... Erro! Indicador não definido. 2.3.2 MOFs amorfas .................................................................... Erro! Indicador não definido. 2.4 MODIFICAÇÕES DA SUPERFÍCIE DE SLF ................... Erro! Indicador não definido. 2.5 CETUXIMABE ................................................................... Erro! Indicador não definido. 3 OBJETIVOS ............................................................................. Erro! Indicador não definido. 3.1 OBJETIVO GERAL ............................................................ Erro! Indicador não definido. 3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................. Erro! Indicador não definido. 4 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................... Erro! Indicador não definido. 4.1 MATERIAIS ....................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2 MÉTODOS .......................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.1 Síntese da ZIF-8 .................................................................. Erro! Indicador não definido. 4.2.2 Síntese com GA ................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.3 Funcionalização com CTX ................................................. Erro! Indicador não definido. 4.2.4 Caracterizações físico-químicas ........................................ Erro! Indicador não definido. 4.2.4.1 Difratometria de raios-X de pó (DRX) ........................... Erro! Indicador não definido. 4.2.4.2 Espectroscopia de absorção na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ............................................................................ Erro! Indicador não definido. 4.2.4.3 Análises termogravimétrica (TGA) e calorimétrica (DSC) ............ Erro! Indicador não definido. 4.2.4.4 Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (MEV-FEG) .. Erro! Indicador não definido. 4.2.4.5 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) .............. Erro! Indicador não definido. 4.2.4.6 Espectroscopia de fluorescência (FL) ............................ Erro! Indicador não definido. 4.2.4.7 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) ........... Erro! Indicador não definido. 4.2.4.8 Análise elementar (AE) ................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.4.9 Análise de fisissorção de N2 ........................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.5 Estudos in silico ................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.5.1 Ancoragem molecular..................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.5.2 Análise de polimorfos por propensão de ligações de hidrogênio .. Erro! Indicador não definido. 4.2.6 Estudos de estabilidade ...................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.6.1 Estabilidade coloidal ...................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.6.2 Estabilidade química ...................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.6.3 Estabilidade estrutural ................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.7 Avaliação da eficiência e capacidade de carga do GA .... Erro! Indicador não definido. 4.2.7.1 Revalidação do método analítico para quantificação de GA por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjos de diodos (CLAE-DAD) ........ Erro! Indicador não definido. 4.2.7.2 Linearidade ..................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.7.3 Precisão .......................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.7.3.1 Repetibilidade ............................................................. Erro! Indicador não definido. 4.2.7.3.2 Precisão intermediária ................................................ Erro! Indicador não definido. 4.2.8 Ensaio de liberação do GA in vitro .................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.9 Ensaio de citotoxicidade/viabilidade celular pelo modelo de cultura de células 2D ....................................................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.10 Ensaio de citotoxicidade/viabilidade celular pelo modelo de cultura de células 3D ....................................................................................................... Erro! Indicador não definido. 4.2.11 Ensaio de internalização celular por citometria de fluxo ............ Erro! Indicador não definido. 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................. Erro! Indicador não definido. 5.1 CARACTERIZAÇÃO DA ZIF-8 ........................................ Erro! Indicador não definido. 5.1.1 Difração de raios-X de pó (DRX) ...................................... Erro! Indicador não definido. 5.1.2 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ............................................................................. Erro! Indicador não definido. 5.1.3 Análises termogravimétrica (TGA) e calorimétrica (DSC) ........... Erro! Indicador não definido. 5.1.4 Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (MEV-FEG) . Erro! Indicador não definido. 5.1.5 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ................ Erro! Indicador não definido. 5.1.6 Análise de fisissorção de N2 ............................................... Erro! Indicador não definido. 5.2 CARACTERIZAÇÃO DA aZIF-GA .................................. Erro! Indicador não definido. 5.2.1 Difração de raios-X de pó (DRX) ...................................... Erro! Indicador não definido. 5.2.2 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ............................................................................. Erro! Indicador não definido. 5.2.3 Análises termogravimétrica (TGA) e calorimétrica (DSC) ........... Erro! Indicador não definido. 5.2.4 Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (MEV-FEG) . Erro! Indicador não definido. 5.2.5 Microscopia eletrônica de transmissão (MET) ................ Erro! Indicador não definido. 5.2.6 Espectroscopia de fluorescência (FL) ............................... Erro! Indicador não definido. 5.2.7 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) ............ Erro! Indicador não definido. 5.2.8 Análise elementar (AE) ...................................................... Erro! Indicador não definido. 5.2.9 Análise de fisissorção de N2 ............................................... Erro! Indicador não definido. 5.2.10 Estudos in silico ................................................................. Erro! Indicador não definido. 5.2.10.1 Modelagem molecular .................................................. Erro! Indicador não definido. 5.2.10.2 Ancoragem molecular................................................... Erro! Indicador não definido. 5.2.10.3 Análise morfológica ...................................................... Erro! Indicador não definido. 5.2.10.4 Propensão de ligações de hidrogênio .......................... Erro! Indicador não definido. 5.3 CARACTERIZAÇÂO DA aZIF-GA/CTX ......................... Erro! Indicador não definido. 5.3.1 Difração de raios-X de pó (DRX) ...................................... Erro! Indicador não definido. 5.3.2 Espectroscopia vibracional na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ............................................................................. Erro! Indicador não definido. 5.3.3 Análises termogravimétrica (TGA) e calorimétrica (DSC) ........... Erro! Indicador não definido. 5.3.4 Microscopia eletrônica de varredura de alta resolução (MEV-FEG) . Erro! Indicador não definido. 5.3.5 Espectroscopia de fluorescência (FL) ............................... Erro! Indicador não definido. 5.3.6 Espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) ............ Erro! Indicador não definido. 5.3.7 Análise elementar (AE) ...................................................... Erro! Indicador não definido. 5.3.8 Análise de fisissorção de N2 ............................................... Erro! Indicador não definido. 5.4 ESTUDOS DE ESTABILIDADE ....................................... Erro! Indicador não definido. 5.4.1 Estabilidade coloidal .......................................................... Erro! Indicador não definido. 5.4.2 Estabilidade química .......................................................... Erro! Indicador não definido. 5.4.3 Estabilidade estrutural ....................................................... Erro! Indicador não definido. 5.5 AVALIAÇÃO DA EFICIÊNCIA E CAPACIDADE DE CARGA DO GA ............... Erro! Indicador não definido. 5.5.1 Revalidação do método analítico de quantificação de GA por CLAE-DAD em metanol ......................................................................................... Erro! Indicador não definido. 5.5.1.1 Linearidade ..................................................................... Erro! Indicador não definido. 5.5.1.2 Precisão .......................................................................... Erro! Indicador não definido. 5.5.1.2.1 Repetibilidade ............................................................. Erro! Indicador não definido. 5.5.1.2.2 Precisão Intermediária ................................................ Erro! Indicador não definido. 5.5.2 Ensaio de eficiência e capacidade de carga do GA .......... Erro! Indicador não definido. 5.6 AVALIAÇÃO DA LIBERAÇÃO DO GA IN VITRO ........ Erro! Indicador não definido. 5.6.1 Revalidação do método analítico de quantificação de GA por CLAE-DAD em PBS ....................................................................................................... Erro! Indicador não definido. 5.6.1.1 Linearidade ..................................................................... Erro! Indicador não definido. 5.6.1.2 Precisão .......................................................................... Erro! Indicador não definido. 5.6.1.2.1 Repetibilidade ............................................................. Erro! Indicador não definido. 5.6.1.2.2 Precisão Intermediária ................................................ Erro! Indicador não definido. 5.6.2 Ensaio de liberação do GA in vitro .................................... Erro! Indicador não definido. 5.7 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE/VIABILIDADE CELULAR PELO MODELO DE CULTURA DE CÉLULAS 2D ................................................. Erro! Indicador não definido. 5.8 ENSAIO DE CITOTOXICIDADE/VIABILIDADE CELULAR PELO MODELO DE CULTURA DE CÉLULAS 3D ................................................. Erro! Indicador não definido. 5.9 ENSAIO DE INTERNALIZAÇÃO CELULAR POR CITOMETRIA DE FLUXO .. Erro! Indicador não definido. 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS .............................................................................................. 29 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................................. 29 ANEXO ......................................................................................... Erro! Indicador não definido. 1 INTRODUÇÃO Um conjunto de mais de 100 doenças, o câncer compartilha como característica comum a divisão celular descontrolável. Sua propriedade expansionista forma uma massa celular chamada de neoplasia ou tumor com a habilidade de infiltrar e se disseminar para outras regiões do corpo (metástase). Um tumor metastático é também conhecido como neoplasia maligna devido sua considerável celeridade de multiplicação, agressividade e habilidade de penetrar tecidos e órgãos vizinhos ou distantes [1]. Dentre os cânceres existentes, o câncer de próstata destaca-se como o segundo tipo mais frequente entre homens. De acordo com o Instituto Nacional de Câncer (INCA), no Brasil avalia-se que o câncer de próstata teve uma incidência de mais de 65 mil novos casos em 2020, ou 29,2 % do total do número de casos de câncer neste mesmo ano [2]. O tratamento do câncer de próstata metastático, na maioria das vezes, utiliza quimioterápicos; contudo, estes possuem muitas limitações, como o desenvolvimento de resistência e o surgimento de inúmeros efeitos colaterais. Desta forma, é de suma importância o desenvolvimento de novas estratégias para avaliação do potencial uso no tratamento como, por exemplo, a associação de fármacos, o desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos (SLF) e o uso de compostos baseados em plantas ou produtos naturais, os quais, ao contrário dos fármacos quimioterápicos convencionais, possuem vantagens, como a redução ou eliminação dos efeitos tóxicos para as células não tumorais, além de atuarem no combate do câncer por diversas vias [3]. O ácido gálico (GA), um composto polihidroxifenólico natural, é encontrado em uma variedade de plantas e ervas utilizadas na medicina antiga. É também conhecido como ácido 3,4,5-tri-hidroxibenzóico. Seus efeitos benéficos para a saúde são bastante discutidos na literatura, apresentando propriedades antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, antiulcerogênica, antimicrobiana, antifúngica, quimiopreventiva e anticancerígena [4]–[11]. Entretanto, como a maioria dos polifenós, o GA é bastante instável à luz e alguns solventes, principalmente em condições de pH alcalino, além de possuir baixa biodisponibilidade. Embora sua absorção seja rápida, a concentração plasmática máxima alcançada é reduzida [12], [13]. Assim, são necessárias alternativas com o intuito de melhorar estas propriedades físico-químicas desfavoráveis, como o desenvolvimento de SLF, que contribuem para a melhora da estabilidade, biodisponibilidade, farmacocinética e eficácia terapêutica desta molécula [13], [14]. Dentre os diversos SLF existentes, as redes metal-orgânicas (do inglês Metal-Organic Frameworks - MOFs) destacam-se como promissores SLF. As MOFs são uma classe de materiais híbridos porosos sintetizados a partir de íons ou clusters metálicos e ligantes orgânicos, ligados entre si através de ligações de coordenação. Estes sistemas vêm atraindo grande atenção nos últimos anos, devido à sua grande versatilidade de composições (metais, ligantes), e diversidade estrutural (tamanho de poro, topologias), o que possibilita um elevado volume de poros e área de superfície, oferecendo uma elevada capacidade de carga quando comparado com outros SLF. Além disso, permitem a modificação da sua superfície com outros materiais, com o intuito de promover o direcionamento a sítios específicos do organismo, tornando-os ainda mais atraentes como SLF específicos [15]–[22]. As MOFs amorfas ou aMOFs (do inglês Amorphous Metal-Organic Frameworks - aMOFs) são uma relativamente recente subclasse de MOFs produzidas de maneira semelhante às MOFs convencionais, com a diferença que, durante ou após o processo de síntese, são amorfizadas [23], [24]. O processo de amorfização pode ser físico ou químico, possuindo vantagens, como a redução da cinética de liberação de fármacos incorporados; e desvantagens, como a redução da porosidade e área superficial específica [24], [25]. Uma outra estratégia recentemente inserida no desenvolvimento de novos SLF é a modificação de superfície pelo emprego do revestimento e/ou funcionalização com diferentes materiais [26]–[30]. As MOFs permitem esta funcionalização, possibilitando o direcionamento seletivo e o reconhecimento por receptores alvos específicos do organismo, a exemplo dos receptores do fator de crescimento epidérmico (do inglês Epidermal Growth Factor receptor - EGFR), que são comprovadamente receptores superexpressos na maioria dos cânceres, inclusive no câncer de próstata [31], [32]. A ativação e a superexpressão do receptor EGFR no câncer de próstata tem contribuído para a progressão da doença [33], [34]. A inibição deste receptor pode ser uma ferramenta bastante útil no auxílio do tratamento [35], [36]. O uso do anticorpo monoclonal quimérico do tipo IgG1 cetuximabe (CTX) (Erbitux®) pode contribuir uma vez que o CTX se liga seletivamente a domínios extracelulares do EGFR, inibindo a proliferação celular, a angiogênese, a metástase e promovendo a apoptose [34]. Desta forma, a combinação do CTX com outros fármacos antineoplásicos é uma estratégia muito interessante que já é comprovada [34], [37] e a associação com SLF pode potencializar esses benefícios. Diante disso, este trabalho propõe desenvolver um sistema nanocarreador contendo GA incorporado em uma MOF amorfa funcionalizada com CTX, de forma a avaliar o sinergismo fármaco-anticorpo no direcionamento e potencialização do tratamento do câncer de próstata. 2 CONSIDERAÇÕES FINAIS De acordo com o exposto, evidenciou-se que o processo de síntese proposto possibilitou a obtenção de uma MOF híbrida amorfa derivada das ZIFs, denominada aZIF-GA. O sistema obtido foi devidamente caracterizado, com destaque para a sua alta estabilidade aquosa mesmo após o processo de funcionalização com CTX. Sobre o processo de funcionalização, constatou-se principalmente através das técnicas de FTIR, RMN e TGA, que o processo foi efetivo com uma porcentagem de funcionalização de 10,2% sobre a massa total do material final obtido. Os estudos de liberação demonstraram que a liberação foi progressivamente controlada e mais pronunciada em meio de pH mais ácido, evidenciando se tratar de um sistema pH responsivo. Os ensaios de viabilidade celular 2D apresentaram resultados levemente maiores no quesito seletividade para a linhagem celular PC-3, muito embora tenham resultados muito próximos para a linhagem DU-145. Além do mais, a funcionalização com CTX proporcionou uma redução considerável no IC50 para todas as linhagens testadas. Os ensaios de viabilidade celular 3D com esferoides de células de DU-145 apresentaram uma redução de 2,61× para os esferoides expostos a aZIF-GA e de 8,58× para os expostos a aZIF-GA/CTX, quando comparados com o GA livre, evidenciando uma potente ação antitumoral dos sistemas funcionalizados com CTX, havendo possivelmente um direcionamento aos receptores de EGFR como esperado e demonstrado tanto pelos ensaios 2D quanto pelos ensaios 3D realizados. E por fim, apesar de não haver aparente internalização dos sistemas desenvolvidos, observado por citometria de fluxo, as alterações observadas nas células testadas podem estar relacionadas e serem as principais responsáveis pela morte celular. Desta forma, os resultados evidenciaram a potencial aplicação dos sistemas obtidos no tratamento do câncer de próstata. Como perspectivas, a realização de mais ensaios, a exemplo dos ensaios in vivo, pode ser interessante para confirmar a eficácia dos sistemas obtidos, uma vez que infelizmente não foi possível realizar em laboratórios parceiros devido aos problemas gerados pela pandemia de COVID-19. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS [1] INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER (Brasil). O que é o câncer?. Rio de Janeiro: INCA, 2020. Disponível em: . Acesso em: 18 dez. 2020. [2] INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER (Brasil). Estatísticas de câncer. Rio de Janeiro: INCA, 2021. Disponível em: . Acesso em: 10 jul. 2021. [3] NOBILI, S. et al. Natural compounds for cancer treatment and prevention. Pharmacological Research, v. 59, n. 6, p. 365–378, 2009. [4] AGARWAL, C. et al. Gallic acid causes inactivating phosphorylation of cdc25A/cdc25C-cdc2 via ATM-Chk2 activation, leading to cell cycle arrest, and induces apoptosis in human prostate carcinoma DU145 cells. Molecular Cancer Therapeutics, v. 5, n. 12, p. 3294–3302, 2006. 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