RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 21/02/2022. Campus de Botucatu Instituto de Biociências UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Diversidade genética e pesquisa de Escherichia coli, produtoras de β-lactamase de espectro estendido (ESBL), isolada de leite de vacas com mastite clínica. HENRIQUE ORSI Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia de Parasitas e Micro- organismos. Orientadora: Profa. Dra. Vera Lúcia Mores Rall BOTUCATU – SP 2020 Campus de Botucatu Instituto de Biociências UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Diversidade genética e pesquisa de Escherichia coli, produtoras de β-lactamase de espectro estendido (ESBL), isolada de leite de vacas com mastite clínica. HENRIQUE ORSI VERA LÚCIA MORES RALL RODRIGO TAVANELLI HERNANDES Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia de Parasitas e Micro- organismos. Orientadora: Profa. Dra. Vera Lúcia Mores Rall BOTUCATU – SP 2020 AGRADECIMENTOS À minha mãe Rosa Cristina Laurindo Orsi, meu pai Orsini Orsi Filho e minhas irmãs Carolina Orsi e Patricia Orsi, por me proporcionarem um ambiente tranquilo de família e me darem todo o suporte necessário nos dias em que cheguei em casa exausto; Aos meus amigos Gabriel, João e Ulisses por manterem este grupo unido por tantos anos mesmo que tenhamos seguido caminhos diferentes ao terminarmos o ensino médio, por me darem muito apoio e pelas divagações filosóficas; Aos meus colegas de banda Jorge, Lennon, Matheus e Raphael por sempre me motivarem a crescer e me fazerem assumir um posto que eu jamais teria chego sozinho; À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo suporte financeiro; À todos os funcionários do extinto Departamento de Microbiologia e Imunologia, em especial: à Sílvia que sempre manteve tudo limpo e agradável para o nosso dia-a-dia, à Larissa por me aturar toda vez que acabava o TBE e o estoque de gaze da sala de eletroforese, ao Rafael que sempre se dispôs a ajudar, principalmente quando precisávamos transportar algo mais pesado, à Aline por estar sempre disposta a ajudar e muitas vezes fazer mais do que lhe pedi e à Ivana por ser referência nas aulas práticas que participei durante o estágio de docência e me ajudar com PFGE; Aos professores Josias Rodrigues e Adriano Sakai Okamoto por participarem da minha banca de qualificação e contribuírem com o desenvolvimento deste trabalho; Às professoras Sandra de Moraes Gimenes Bosco, Terue Sadatsune e ao professor Ary Fernandes Júnior, que sempre me cederam espaço e equipamentos em seus laboratórios; Ao professor Rodrigo Tavanelli Hernandes que aceitou me co-orientar. Sendo uma grande referência e fonte de inspiração, contribuiu em minha banca de qualificação e sempre me cedeu espaço em seu laboratório. Não fosse o teu conhecimento, este trabalho não teria chego tão longe. Muito obrigado por sanar prontamente minhas dúvidas e me inserir no meio científico no qual você está envolvido; Aos colegas do laboratório do professor Rodrigo: Melissa e Regiane que sempre se prontificaram para me ajudar com os experimentos e em especial o Rodrigo que, além de me ajudar, me aturou todo dia reclamando de algo diferente; Às colegas do laboratório da professora Vera, em especial à Fernanda que praticamente me pegou pela mão e me ensinou a fazer quase tudo e à Bruna, Erika e Stéfani. A convivência com vocês foi crucial para que eu me mantivesse na carreira acadêmica. O ambiente que vocês me proporcionaram foi algo que eu jamais imaginaria que seria possível dentro da universidade em meu período de graduação. Muito obrigado pela convivência e pelos ensinamentos; À minha orientadora Vera Lúcia Mores Rall, que decidiu me acolher como seu aluno mesmo sem termos contato prévio em uma iniciação científica. Seu senso crítico e sua postura como pessoa e como profissional são imensamente admiráveis. Você foi a principal responsável por eu continuar na carreira acadêmica. Muito obrigado pelas oportunidades, sua paciência, ensinamentos e pela motivação que você me proporcionou. Espero no futuro poder lhe mostrar que o seu investimento em meu crescimento não foi em vão. “Se tocarmos Dó e Dó sustenido, pode parecer que tocamos algo errado. Mas ao elevarmos uma oitava do Dó, soa maravilhoso. As mesmas duas notas. Este Dó agora se torna a sétima maior de Dó sustenido, um elemento chave para deixar um acorde maravilhoso. Como pode as mesmas notas soarem ruim em um momento e maravilhoso em outro? Levemos isso para a vida. Quando vemos algo ruim ou horrível na vida, talvez estejamos apenas olhando na oitava errada. Talvez possamos mudar a nossa perspectiva.” Victor Wooten 6 RESUMO 1 A mastite bovina é uma inflamação da glândula mamária, geralmente ocasionada 2 por micro-organismos, que causa grandes prejuízos às fazendas leiteiras, devido ao 3 uso de medicamentos, pagamento aos médicos veterinários, descarte de leite e até 4 do animal e a Escherichia coli é o principal agente etiológico causador da forma 5 clínica dessa doença. Neste trabalho, foram pesquisados genes para a classificação 6 de E. coli diarreiogênica (DEC) ou de E. coli patogênica extra-intestinal (ExPEC), 7 dentro dos grupos filogenéticos, além de genes que codificam fatores de virulência e 8 resistência aos antimicrobianos. Também foram realizados testes de quantificação 9 de produção de biofilme e produção de beta-lactamase de espectro estendido 10 (ESBL). Entre os 161 isolados, dois (1,2%) foram classificados como DEC. 11 Considerando-se os genes pesquisados, os mais frequentes foram fimH (160 = 12 99,3%), traT (126 = 78,3%), ecpA (108 = 67%) e ompT (60 = 37,3%). Em relação 13 aos grupos filogenéticos, a maioria foi classificada nos grupos B1 (52,8%) e A 14 (36,6%). Quanto à produção de biofilme, 68 (42,2%) foram classificadas como não 15 produtoras, 80 (49,7%) como fracas, 11 (6,8%) como moderadas e apenas duas 16 (1,2%) foram fortes produtoras. Apenas dois (1,2%) isolados apresentaram 17 positividade no teste fenotípico de ESBL, com a presença do gene blaCTX-M-15. 18 Considerando-se outros genes de resistência, blaTEM foi encontrado em sete (4,3%) 19 isolados e blaSHV em um (0,6%). Os dois (1,2%) isolados escN+ apresentaram 20 padrão de aderência “localizado-like” em células HeLa e seu potencial de induzir 21 lesão attaching/effacing foi confirmado através de teste de coloração fluorescente da 22 actina (FAS). Em relação ao PFGE, foram encontrados 10 clones, envolvendo tanto 23 animais diferentes quanto o mesmo animal em diferentes períodos de coleta, 24 indicando manejo inadequado. Não foi possível definir um perfil genético 25 característico para as E. coli patogênicas da glândula mamária (MPECs) e, como 26 apenas dois isolados apresentaram genes e padrão de adesão característicos de 27 DEC, parece haver pouco potencial zoonótico para os isolados causadores de 28 mastite bovina clínica. 29 30 Palavras-chave: grupo filogenético, PFGE, biofilme, KPC. 31 32 7 ABSTRACT 33 Bovine mastitis is an inflammation of the mammary gland, usually caused by 34 microorganisms, which causes great damage to dairy farms, due to the use of 35 medicines, payment to veterinarians, disposal of milk and even the animal and 36 Escherichia coli is the main etiologic agent that causes the clinical form of this 37 disease. In this study, genes were searched for the classification of diarrhogenic E. 38 coli (DEC) or extra-intestinal pathogenic E. coli (ExPEC), within the phylogenetic 39 groups, in addition to genes that encode virulence factors and resistance to 40 antimicrobials. Quantification tests of biofilm production and production of extended 41 spectrum beta-lactamase (ESBL) were also performed. Among the 161 isolates, two 42 (1.2%) were classified as DEC. Considering the researched genes, the most frequent 43 were fimH (160 = 99.3%), traT (126 = 78.3%), ecpA (108 = 67%) and ompT (60 = 44 37.3%). Regarding phylogenetic groups, most were classified in groups B1 (52.8%) 45 and A (36.6%). As for the production of biofilm, 68 (42.2%) were classified as non-46 producing, 80 (49.7%) as weak, 11 (6.8%) as moderate and only two (1.2%) were 47 strong producers. Only two (1.2%) isolates were positive in the ESBL phenotypic 48 test, with the presence of the blaCTX-M-15 gene. Considering other resistance genes, 49 blaTEM was found in seven (4.3%) isolates and blaSHV in one (0.6%). The two (1.2%) 50 escN+ isolates showed a “localized-like” adhesion pattern in HeLa cells and their 51 potential to induce attaching/effacing lesion was confirmed through fluorescent actin 52 staining (FAS) test. Regarding PFGE, 10 clusters were found, involving both different 53 animals and the same animal in several periods of collection, indicating inadequate 54 handling. It was not possible to define a characteristic genetic profile for mammary 55 pathogenic E. coli (MPECs) and, as only two isolates had genes and adhesion 56 pattern characteristic of DEC, there is little zoonotic potential for isolates that cause 57 clinical bovine mastitis. 58 59 Keywords: phylogenetic group, PFGE, biofilm, KPC. 60 61 8 LISTA DE FIGURAS 62 63 Figura 1 – Eletroforese em gel de agarose para detecção dos genes arpA (400 pb), chuA (288 64 pb), yjaA (211 pb) e TspE4.C2 (152 pb) para classificação de E. coli isoladas de 65 leite de vacas com mastite clínica nos grupos filogenéticos. Poço 1: 100 pb DNA 66 ladder; poço 2: controle positivo E. coli 042; poço 3: controle positivo E. coli 67 E2348/69; poço 4: branco; poços 5-14: amostras..................................................39 68 Figura 2 – ExPEC aaiA + /aaiC + , sem padrão de adesão definido em células HeLa (A) e E. 69 coli 042, utilizada como referência de padrão negativo (B)..................................42 70 Figura 3 – E. coli C1845 utilizada como referência para o padrão difusamente aderente em 71 células HeLa (A) e E. coli E2348/69 utilizada como referência para o padrão 72 localizado (B).........................................................................................................42 73 Figura 4 – E. coli JPN15 utilizada como referência para padrão “Localizada-like” em células 74 HeLa (A) e amostra portadora do gene escN apresentando o padrão “Localizado-75 like” (B)..................................................................................................................43 76 Figura 5 – Teste de FAS corado com DAPI (evidencia DNA rico em adenina-timina é corado 77 pela molécula de DAPI evidenciando o sítio de adesão das células bacterianas). 78 Figuras (A) E. coli 042, controle negativo, que apresenta padrão de adesão 79 agregativo, sem acúmulo de actina no sítio de adesão; (B) E. coli E2348/69, 80 controle positivo, que exibe padrão de adesão localizado e, por ser uma E. coli 81 enteropatogênica, acumula actina no sítio de adesão; (C) e (D) correspondem a 82 dois isolados de E. coli escN+...............................................................................44 83 Figura 6 – Teste de FAS corado com faloidina (evidencia actina acumulada no sítio de 84 adesão). Figuras (A) E. coli 042, controle negativo; (B) E. coli E2348/69, controle 85 positivo; (C) e (D) correspondem a dois isolados de E. coli escN+......................44 86 Figura 7 – Antibiograma de Escherichia coli com cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima, 87 aztreonam e amoxicilina + ácido clavulânico para verificação de produção de 88 ESBL. Em (A), há a ilustração de um isolado resistente e em (B), um isolado 89 sensível. Em (C) está o resultado do teste confirmatório de produção de ESBL 90 considerados positivos devido à presença de distorção dos halos – “zona 91 fantasma”................................................................................................................45 92 Figura 8 – Produção de biofilme por isolados de E. coli, causadores de mastite clínica 93 bovina, considerando-se os grupos filogenéticos...................................................46 94 9 LISTA DE TABELAS 95 96 Tabela 1 – Genes de virulência e sequências dos iniciadores empregados nas reações de PCR 97 para a pesquisa de fatores de virulência em E. coli diarreiogênicas......................29 98 Tabela 2 – Genes de virulência e sequências dos iniciadores usados na pesquisa de fatores de 99 virulência em E. coli extraintestinal (ExPEC).......................................................30 100 Tabela 3 – Tipos de antimicrobianos, suas concentrações e diâmetro dos halos utilizados 101 como referência para verificação de resistência de E. coli produtoras de ESBL 102 segundo CLSI 2015................................................................................................36 103 Tabela 4 – Sequência de iniciadores utilizados na pesquisa de ESBL.....................................37 104 Tabela 5 – Distribuição dos genes que codificam fatores de virulência em 161 isolados de 105 ExPEC obtidos a partir de leite de vacas com mastite clínica, considerando-se os 106 grupos filogenéticos...............................................................................................41 107 108 10 SUMÁRIO 109 110 1. REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................................12 111 1.1. Mastite bovina....................................................................................................................12 112 1.2. Escherichia coli..................................................................................................................13 113 1.2.1. E.coli diarreiogênica............................................................................................14 114 1.2.1.1. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC).............................................14 115 1.2.1.2. Escherichia coli produtora de toxina de Shiga (STEC)..........................15 116 1.2.1.3. Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC).............................................15 117 1.2.1.4. Escherichia coli enteroinvasora (EIEC).................................................16 118 1.2.1.5. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC)............................................16 119 1.2.1.6. Escherichia coli difusamente aderente (DAEC)....................................17 120 1.2.2. Escherichia coli patogênica extra-intestinal (ExPEC).......................................17 121 1.2.3. Grupos filogenéticos...........................................................................................19 122 1.3. Resistência aos antimicrobianos........................................................................................20 123 1.3. 1. Resistência aos β-lactâmicos..............................................................................21 124 1.3.2. Resistência à colistina.........................................................................................23 125 1.4. Produção de biofilme.........................................................................................................24 126 2. OBJETIVO..........................................................................................................................26 127 3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................................27 128 3.1. Propriedades e coletas das amostras de leite......................................................................27 129 3.2. Isolamento e identificação de E. coli.................................................................................28 130 3.3. Caracterização molecular dos isolados de E. coli..............................................................28 131 3.3.1. Extração do DNA................................................................................................28 132 3.3.2. Identificação de genes associados à patogenicidade...........................................28 133 3.3.3. Identificação de grupo filogenético.....................................................................32 134 3.3.4. Pulsed-Field Gel Electrophoresis........................................................................32 135 3.4. Teste de adesão..................................................................................................................33 136 3.5. Resistência aos β-lactâmicos..............................................................................................35 137 3.6. Pesquisa de genes de resistência........................................................................................36 138 3.7. Produção de biofilme.........................................................................................................37 139 4. RESULTADOS...................................................................................................................39 140 4.1. Caracterização molecular dos isolados de Escherichia coli..............................................39 141 4.2.1 Teste de adesão................................................................................................................42 142 4.2.2 Teste de FAS....................................................................................................................43 143 4.3.1 Resistência aos β-lactâmicos............................................................................................45 144 11 4.3.2 Pesquisa de genes de resistência......................................................................................46 145 4.4. Produção de biofilme.........................................................................................................46 146 5. DISCUSSÃO.......................................................................................................................47 147 6. CONCLUSÃO.....................................................................................................................53 148 REFERÊNCIAS......................................................................................................................54 149 ANEXO 1 ................................................................................................................................69150 12 1. REVISÃO DE LITERATURA 151 152 1.1. Mastite bovina 153 154 A mastite bovina é uma inflamação das glândulas mamárias, geralmente 155 ocasionada por micro-organismos, sendo a doença de maior impacto na pecuária leiteira 156 e causando grandes prejuízos em todo o mundo (DOWN et al., 2017). Estes custos 157 ocorrem principalmente por tratamentos com antimicrobianos e veterinários, perda de 158 produção de leite, pelo descarte e diminuição do seu valor, além do abate de casos 159 crônicos, para evitar a dispersão do patógeno no rebanho. O tratamento com 160 antimicrobianos pode tratar a infecção, mas a glândula mamária pode levar um longo 161 tempo para se recuperar totalmente. Ou seja, além dos custos com a infecção e perda de 162 produção, há ainda o custo dos tratamentos pós-infecção (BLUM et al., 2014). 163 A mastite pode ser classificada em aguda ou crônica, de acordo com sua 164 duração. Os patógenos relacionados à mastite são classificados em contagiosos 165 (Streptococcus agalactiae e Staphylococcus aureus) ou ambientais, como a Escherichia 166 coli (RUEGG, 2012; OLIVEIRA et al., 2015; TOMAZI et al., 2018). Quanto aos 167 sintomas, pode ser classificada em clínica, pelo desenvolvimento de sintomas ou 168 subclínica. No primeiro tipo, dependendo da severidade do caso, os sintomas vão desde 169 apenas mudanças na constituição do leite, apresentando flocos, coágulos e mudanças na 170 cor e consistência, até a manifestação de sintomas no animal, como mudanças na 171 temperatura, taxa de ruminação, apetite, hidratação e comportamento (ADKINS e 172 MIDDLETON, 2018). O diagnóstico final é dado pela cultura positiva, a partir de uma 173 amostra do leite (DUNN, 1994). Em campo, o teste mais prático é o da caneca telada de 174 fundo preto, no qual os três primeiros jatos da ordenha são liberados na caneca, 175 permitindo a visualização de grumos no leite devido ao contraste com o fundo escuro. 176 Este método deve ser realizado antes de cada ordenha (EMBRAPA, 2002). 177 Na mastite subclínica, apesar do animal não apresentar mudanças visíveis que 178 indiquem a presença da doença, há alterações na contagem de células somáticas 179 (BRADLEY, 2002). Na ausência de infecção, os leucócitos compõem 80% das células 180 somáticas do quarto e em um quarto infectado, compõem 99%. Além disso, pode-se 181 notar a diminuição de lactose, a presença de enzimas como lactato desidrogenase e 182 aumento da condutividade elétrica do leite (ADKINS e MIDDLETON, 2018). A forma 183 aguda da doença está normalmente associada aos casos clínicos. O desenvolvimento da 184 13 doença é multifatorial e está relacionado com clima, higiene do ambiente, características 185 intrínsecas da espécie causadora da infecção e da vaca como raça, paridade e meses em 186 lactação (OLIVEIRA et al., 2015). 187 188 1.2. Escherichia coli 189 190 Inicialmente, essa bactéria foi classificada como Bacterium coli commune por 191 Theodor Escherich (ESCHERICH, 1988). O nome Escherichia coli só passou a ser 192 empregado definitivamente a partir de uma publicação no International Bulletin of 193 Bacteriological Nomenclature and Taxonomy (COWAN, 1954). 194 E. coli é um bacilo Gram-negativo, oxidase-negativa, pertencente à família 195 Enterobacteriaceae. É capaz de crescer em ambientes aeróbicos e anaeróbicos, com 196 temperatura ótima de crescimento a 37°C, sendo um micro-organismo mesófilo. Pode 197 apresentar motilidade por flagelos peritríqueos ou serem imóveis (CROXEN et al., 198 2013). 199 Kauffmann propôs a padronização da classificação dos isolados de E. coli a 200 partir de características sorológicas pelos antígenos somático O, flagelar H e capsular K. 201 Isso se mostrou útil na década de 40, quando foi observado que vários isolados 202 associados a casos de gastrenterites possuíam o mesmo tipo de antígeno O 203 (KAUFFMANN, 1947). Alguns isolados não são tipáveis pelo esquema proposto por 204 Kauffmann, levando à necessidade do uso de metodologias alternativas como o Pulsed-205 field Gel Electrophoresis (PFGE), permitindo identificar clones de um mesmo local ou 206 o Multilocus Sequence Typing (MLST), que permite identificar similaridades entre 207 isolados de todo o mundo (CROXEN et al., 2013). 208 O tamanho dos genomas de E. coli podem diferir em um milhão de pares de 209 bases entre isolados comensais e patogênicas, devido à presença dos genes de 210 virulência. Em dados de genômica comparativa, os de E. coli são divididos em um 211 conjunto de genes conservados (housekeeping), chamado de genoma core e um pool 212 genético flexível, que pode se deslocar entre as bactérias através de mecanismos como a 213 conjugação, transformação e transdução, codificada por elementos genéticos móveis, 214 resultando em transferência horizontal de genes. Elementos genéticos móveis como 215 transposons, bacteriófagos podem estar integrados ao cromossomo ou em plasmídeos, 216 que se auto-replicam. 217 14 E. coli pode apresentar diversos genes de virulência que codificam adesinas 218 (fixação à célula hospedeira), invasinas (invasão à célula hospedeira), sideróforos 219 (aquisição de moléculas de ferro) e proteínas de membrana que auxiliam na evasão do 220 sistema imune do hospedeiro. Os fatores de virulência mais característicos encontrados 221 em E. coli patogênicas são derivados de elementos genéticos móveis (CROXEN et al., 222 2013). 223 224 1.2.1. E.coli diarreiogênica 225 A E. coli diarreiogênica (DEC) pode ser dividida em diferentes grupos, 226 baseados em fatores de virulência e padrões de aderência. 227 228 1.2.1.1. Escherichia coli enteropatogênica (EPEC) 229 Foi o primeiro grupo de DEC a ser identificado e agrupam bactérias conhecidas 230 por causar lesão attaching and effacing (A/E) devido à sua habilidade de formar lesões 231 distintas nas superfícies de células intestinais epiteliais. O termo enteropatogênica 232 referido à E. coli foi utilizado pela primeira vez em 1955 (NETER et al., 1955) e, 233 originalmente, o grupo era definido por sorotipo e não por características patogênicas 234 como atualmente (CROXEN et al., 2013). 235 As EPECs podem ser classificadas em típicas (tEPEC) ou atípicas (aEPEC), 236 baseando-se na presença ou ausência do plasmídeo, pEAF (EPEC adherence factor), 237 respectivamente (TRABULSI et al., 2002). A habilidade de causar a lesão A/E está 238 relacionada a um locus genético chamado de região LEE (Locus of Enterocyte 239 Effacement). McDaniel e colaboradores (1995) demonstraram que a região LEE de E. 240 coli é altamente conservada e consistente com a região LEE de Hafnia alvei e 241 Citrobacter freundii, sugerindo que em algum momento da evolução destes micro-242 organismos, a região LEE foi transferida horizontalmente. 243 Embora não seja essencial para a formação de lesões A/E, o plasmídeo EAF 244 aumenta a eficiência, provavelmente devido à presença de um cluster de genes 245 reguladores (perA, perB e perC) (GÓMEZ-DUARTE e KAPER, 1995). Em tEPEC, a 246 fímbria BFP é responsável pelo estabelecimento do padrão de adesão localizada 247 (AL), caracterizado por grupos compactos de bactérias na superfície celular de 248 culturas de células epiteliais (DONNENBERG et al., 1992). As aEPEC não possuem o 249 plasmídeo EAF, exibindo um padrão chamado de adesão localizada-like (AL-L) 250 (RODRIGUES et al., 1996), ou os padrões de aderência difusa (AD), agregativa (AA) 251 15 ou AL após seis horas de interação com células epiteliais (ABE et al., 2009; 252 HERNANDES et al., 2009). 253 254 1.2.1.2. Escherichia coli produtora de toxina de Shiga (STEC) 255 As STECs são definidas como qualquer isolado de E. coli que produza a toxina 256 de Shiga (Stx), pela presença dos genes stx1 e/ou stx2. A toxina Stx possui uma sub-257 unidade A (ativa) que cliva o RNA ribossomal, impedindo a síntese proteica e cinco 258 subunidades B (ligação) que são responsáveis por ligar a toxina ao glicolipídio 259 globotriaosilceramida (Gb3) na superfície da célula alvo. 260 A Stx é produzida no cólon e alcança o rim através da corrente sanguínea, onde 261 causa danos às células endoteliais e oclusões na microvasculatura por uma combinação 262 de toxicidade direta e indução de produção local de citocinas e quimiocinas, levando à 263 inflamação renal, podendo causar a síndrome hemolítica urêmica, que é caracterizada 264 por anemia hemolítica, trombocitopenia e possibilidade de falha aguda renal fatal. Além 265 disso, a toxina pode induzir apoptose em células intestinais epiteliais (KAPER et al., 266 2004). 267 Dentro do grupo de STEC, os que apresentam a região LEE são denominados 268 Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC) e, assim como as EPECs, podem causar a 269 lesão A/E (CROXEN et al., 2013). 270 271 1.2.1.3. Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC) 272 Os primeiros relatos de ETEC surgiram a partir de pacientes com sintomas 273 característicos aos de cólera. Após tentativas de isolar Vibrio cholerae das fezes de 274 pacientes, que apresentavam culturas puras de E. coli, foram feitos testes em coelhos, 275 confirmado este novo patotipo (DE et al., 1956). 276 ETEC é definida por isolados de E. coli que possuam a enterotoxinas 277 termolábil (LT) ou a termoestável (ST). A LT é semelhante fisiologicamente, 278 estruturalmente (uma sub-unidade ativa “A” envolvida por cinco sub-unidades de 279 ligação “B”) e antigenicamente à toxina de cólera e possui mecanismo de ação similar. 280 Após a colonização do intestino delgado, a ETEC libera a LT, fazendo com que as sub-281 unidades LTB se liguem irreversivelmente ao gangliosídio GM1 e a sub-unidade A 282 ativa a enzima adenilato-ciclase, que resulta no aumento de AMP cíclico, o que estimula 283 a secreção de cloreto (carga negativa) nas células crípticas e inibe a absorção de sódio, 284 16 com o aumento da pressão osmótica na luz intestinal e a consequente diarreia (GILL e 285 RICHARDSON, 1980; QADRI et al., 2005). 286 A ST é um grupo de toxinas que contém múltiplos resíduos de cisteína, cujas 287 ligações dissulfeto induzem a termo-estabilidade destas toxinas. A STa se liga à uma 288 enzima na membrana das células intestinais epiteliais e provoca estímulos para secreção 289 de cloreto e/ou inibição da absorção de cloreto de sódio, resultando em secreção de 290 líquido intestinal. A STb induz danos histológicos no epitélio intestinal, levando à perda 291 de células epiteliais com vilosidades e atrofia parcial das vilosidades (NATARO e 292 KAPER, 1998). 293 294 1.2.1.4. Escherichia coli enteroinvasora (EIEC): 295 Os isolados de EIEC são bioquimicamente e patogeneticamente relacionadas 296 com Shigella spp. Normalmente são lisina-descarboxilase negativa, sem motilidade e 297 lactose negativa. No mecanismo de invasão das EIEC, ocorre a penetração em células 298 epiteliais, lise do vacúolo endocítico, multiplicação intracelular, movimentação pelo 299 citoplasma e extensão para células epiteliais adjacentes. Os genes necessários para 300 invasão estão em um plasmídeo denominado pInv, presente em EIEC e alguns sorotipos 301 de Shigella spp. A infecção por EIEC e Shigella costuma estar ligada à ingestão de 302 alimentos ou água contaminados. Como sintoma principal, normalmente manifesta 303 disenteria (NATARO & KAPER, 1998). 304 305 1.2.1.5. Escherichia coli enteroagregativa (EAEC): 306 As EAECs são definidas como Escherichia coli que não secretam as 307 enterotoxinas LT ou ST e aderem às células HEp-2 em padrão agregativo, com 308 morfologia de “tijolos empilhados” (KAPER et al., 2004). É dividida entre EAEC típica 309 ou atípica, de acordo com a presença ou ausência respectivamente, do gene aggR, que 310 atua como regulador para diversos fatores de virulência responsáveis pela aderência e 311 produção de toxinas (CROXEN et al., 2013). 312 As EAECs colonizam a mucosa intestinal e passam a secretar enterotoxinas e 313 citotoxinas, seguida de grande deposição de muco e formação de biofilme envolvendo 314 as bactérias agregadas. Por fim, há produção de mais citotoxinas que causam danos às 315 células intestinais (NATARO e KAPER, 1998). 316 317 318 17 1.2.1.6. Escherichia coli difusamente aderente (DAEC): 319 As DAECs são E. coli que aderem de maneira difusa às células e superfícies, 320 ou seja, não se encaixam nos padrões clássicos de aderência como aderência localizada 321 ou A/E. Podem carregar as adesinas Afa/Dr que, em conjunto com a adesina F1854, se 322 ligam ao fator acelerador de decaimento (DAF), uma molécula altamente expressa na 323 superfície apical de células epiteliais polarizadas responsável por regular o sistema 324 complemento. Após a ligação, o rearranjo do citoesqueleto é induzido, destruindo ou 325 rearranjando parcialmente as microvilosidades (CROXEN et al., 2013). 326 327 1.2.2. Escherichia coli patogênica extra-intestinal (ExPEC): 328 Além das E. coli que causam diarreia, há ainda um grupo que é capaz de causar 329 infecções em outros órgãos, fora do intestino. São denominadas ExPECs, podendo 330 causar desde infecção do trato urinário (Uropathogenic Escherichia coli - UPEC) até 331 meningite neonatal (Neonatal meningitis Escherichia coli - NMEC) (PITOUT, 2012). 332 Não existe um modelo clonal ou fatores de virulência específicos que definam 333 essa categoria, pois as que causam infecção extraintestinal possuem alta diversidade 334 genética entre seus de fatores de virulência, podendo infectar diferentes sítios de 335 diferentes hospedeiros, demonstrando que existem múltiplas estratégias de 336 estabelecimento (RUSSO e JOHNSON, 2000). 337 Dentro da categoria de ExPEC, a E. coli responsável por causar a mastite foi 338 denominada MPEC. Blum e Leitner (2013) observaram que, apesar de MPECs serem 339 parcialmente clonais, não são completamente uniformes geneticamente. Além disso, sua 340 distribuição genotípica foi diferente da população de E. coli residentes no ambiente de 341 fazendas leiteiras, sugerindo que há seleção de isolados capazes de causar a infecção. 342 A E. coli possui relevância na mastite clínica devido a sua capacidade de 343 causar quadros superagudos e, em raras situações, até letais da doença. Os resultados da 344 infecção dependem de particularidades do isolado causador e do hospedeiro. A E. coli 345 ambiental pode se adaptar ao meio intra-mamário, por observações da capacidade da 346 bactéria invadir células mamárias por uma via endocítica, que evita a degradação 347 lisossomal, evadindo do sistema imune e promovendo persistência na glândula mamária 348 (PASSEY et al., 2008). 349 As principais fontes de infecção por E. coli ambiental são a contaminação fecal 350 por práticas sanitárias inadequadas durante a ordenha (ATALHI e HASSAN, 2009; 351 OMBARAK et al., 2016), a manutenção das vacas em local com fezes, pois o orifício 352 18 do teto permanece aberto por um tempo após a ordenha e entra em contato com essa 353 contaminação (GYLES e FAIRBROTHER, 2010) e a idade do animal, já que vacas 354 mais velhas tendem a demorar mais para fechar o esfíncter da glândula mamária. 355 Surtos de E. coli provenientes de leite e seus derivados, incluindo leite 356 pasteurizado, já foram registrados em diversos países (DE BUYSER et al., 2001). O 357 leite não-pasteurizado pode ser um veículo para a bactéria e é consumido por produtores 358 de leites e suas famílias, além de famílias rurais. Também pode ser consumido de 359 maneira indireta, devido à fabricação de queijos utilizando este leite (OLIVER et al., 360 2005). Outro fator que pode levar a uma cascata de contaminação é a capacidade que 361 alguns isolados possuem de formar biofilmes, dependendo da superfície em que aderem 362 e de outros fatores ambientais (WANG et al., 2012). 363 Além disso, por questões culturais, muitas pessoas preferem consumir o leite 364 cru e seus derivados, pois acreditam que o mesmo possui vantagens nutricionais ou 365 oferecem algum benefício em comparação e esses produtos pasteurizados, o que acaba 366 se tornando um problema de saúde pública, visto que o leite contaminado não 367 pasteurizado e não inspecionado pode carrear resíduos de antimicrobianos e atua como 368 vetor não apenas de patógenos, mas também de suas toxinas (ATALHI e HASSAN, 369 2009; RIBEIRO et al., 2009). 370 Para causar a mastite, a primeira barreira a ser superada pela E. coli é o canal 371 do teto. Durante o período seco, o epitélio estratificado do canal forma uma espécie de 372 plugue de queratina. Além da queratina fechar o canal, ela atua se ligando e 373 imobilizando diversas bactérias não-encapsuladas causadoras de mastite (RAINARD e 374 RIOLLET, 2006). Após entrar no canal, a bactéria precisa aderir ao epitélio para não ser 375 eliminada no processo de ordenha. Estima-se que apenas 50 unidades formadoras de 376 colônias já sejam capazes de desencadear a doença (SHPIGEL et al., 2008). 377 Fora do período de lactação, o organismo apresenta um sistema de defesa 378 imune capaz para eliminar a bactéria antes que a mesma provoque alguma doença, 379 como a alta concentração de lactoferrina no sangue, que captura os íons livres de ferro, 380 impedindo que a bactéria os absorva. Já no período periparturiente, as vacas ficam em 381 estado de imunossupressão e apresentam concentração relativamente baixa de 382 lactoferrina (GYLES e FAIRBROTHER, 2010). 383 Vários estudos tentaram caracterizar genes de virulência de E. coli causadora 384 de mastite bovina em diferentes países (GHANBARPOUR e OSWALD, 2010; 385 19 SUOJALA et al. 2011; LIU et al., 2014; KEANE, 2016) mas ainda não foi encontrado 386 um perfil genético que possa classificar apropriadamente estes isolados. 387 388 1.2.3. Grupos filogenéticos 389 390 A classificação filogenética é uma outra maneira de agrupar as E. coli, sendo 391 inicialmente feita por eletroforese de enzima multilocus ou por tipagem do ribossomo. 392 Porém, estes métodos são complexos, laboriosos e demandam muito tempo. Clermont e 393 colaboradores (2000) propuseram a tipagem filogenética através de um PCR triplex, 394 permitindo a classificação dos principais grupos conhecidos até então: A, B1, B2 e D, 395 sendo que o grupo A comportava a maior parte das E. coli comensais e o B2, os 396 isolados causadores de infecções extra-intestinais. O PCR triplex era feito com os genes 397 chuA (transportador de ferro em EHEC O157:H7), yjaA (encontrado a partir do 398 sequenciamento completo da E. coli K-12, porém ainda sem função definida) e o 399 fragmento TspE4.C2, obtido durante a criação de biblioteca de DNA em um estudo 400 anterior. 401 Em 2008, Gordon e colaboradores definiram a função do fragmento TspE4.C2 402 como sendo um gene de esterase lipase putativo com tamanho variando entre 909, 921 e 403 984 pb de acordo com o isolado e testaram a confiabilidade do método de PCR triplex 404 comparando com resultados de MLST e observaram que, apesar do método acertar 95% 405 das vezes nos casos de grupos B1 e B2, era necessário analisar mais um gene para 406 aumentar a precisão do teste (GORDON et al., 2008). 407 Walk e colaboradores (2009) demonstraram diferentes linhagens do gênero 408 Escherichia que eram fenotipicamente indistinguíveis, mas geneticamente distintas de 409 E. coli, dando origem aos clados crípticos de I a V. Considerando os grupos 410 reconhecidos até então e o clado críptico mais próximo (clado I), Clermont e 411 colaboradores (2013) propuseram a introdução do gene arpA, tornando o PCR 412 quadruplex. A presença do gene arpA teria dois propósitos. Primeiramente como 413 controle de qualidade do DNA, já que com sua adição, todas as E. coli e clado I 414 passariam a apresentar pelo menos uma banda no gel. Além disso, permitiria a distinção 415 de isolados pertencentes ao filogrupo F, que antes era erroneamente identificado como 416 grupo D (chuA+, yjaA-, TspE4.C2-), já que esse gene está presente em todas as E. coli 417 exceto nas pertencentes aos filogrupos B2 e F. Neste mesmo trabalho, foram 418 apresentados primers para identificação dos grupos C (trpAgpC+, trpBA+), que poderia 419 20 apresentar perfil semelhante ao grupo A (trpAGP-, trpBA+) e E (arpAgpE+, trpBA+), 420 que poderia apresentar perfil semelhante ao grupo D (arpAgpE-, trpBA+). A partir deste 421 novo método, foi realizada nova comparação com a tipagem por MLST e confirmado o 422 aumento da precisão deste teste. 423 Em 2019, foi caracterizado o grupo G, que se encaixa entre os grupos B2 e F e 424 é raramente isolado de humanos, porém frequentemente encontrados na pecuária, 425 especialmente em ambientes de avicultura. Isolados deste grupo apresentam extensa 426 resistência aos antimicrobianos e um método de rápida identificação do grupo G por 427 PCR já foi proposto (CLERMONT et al., 2019). 428 429 1.3. Resistência aos antimicrobianos: 430 431 Antibióticos são utilizados frequentemente para controlar a mastite, mas seu 432 uso inadequado pode levar ao aumento de resistência, ocasionando futuras falhas de 433 tratamento, sendo importante avaliar essa resistência em nível fenotípico e genotípico. 434 Cada vez mais, a resistência bacteriana está se tornando um problema mundial, 435 requerendo esforços no estudo e análise dos genes de resistência entre patógenos 436 (FAZEL et al., 2019). 437 Os genes de resistência às drogas estão ligados, geralmente, a elementos 438 móveis como bacteriófagos, plasmídeos e transposons, ou seja, podem ser transferidos 439 entre bactérias de diferentes grupos taxonômicos. Estes genes normalmente estão 440 relacionados a um único tipo ou família de antibióticos, porém vários genes 441 relacionados a diferentes drogas podem estar presentes no mesmo micro-organismo. 442 Além deste mecanismo, mutações sequenciais no cromossomo podem levar ao 443 surgimento de resistências de alto nível. E. coli e outras espécies da família 444 Enterobacteriaceae vem adquirindo resistência à fluoquinolonas devido às mutações na 445 topoisomerase (alvo deste antimicrobiano) e pelo aumento da expressão de proteínas de 446 membrana que bombeiam a droga para fora da célula (LEVY e MARSHALL, 2004). 447 O uso prolongado de um único antimicrobiano, ou seja, por mais de 10 dias, 448 pode selecionar bactérias resistentes a este antibiótico e a outros estruturalmente 449 semelhantes, através de resistência cruzada. A partir disto, a microbiota que está sendo 450 atacada pelos antimicrobianos pode ser colonizada por organismos resistentes. Apesar 451 da obtenção de resistência ser rápida, sua perda é exponencialmente lenta (LEVY e 452 MARSHALL, 2004). Em um estudo conduzido na Finlândia, ao notar o alarmante 453 21 crescimento de resistência aos macrolídeos (principalmente eritromicina) por parte de 454 Streptococcus pyogenes isolados de pacientes com infecção cutânea e respiratória, foi 455 instruído a redução do uso desta categoria de antimicrobianos. Após 4 anos, o número 456 de isolados resistentes passou de 15,6% a 8,6% (SEPÄLÄ et al., 1997). 457 Em rebanhos com manejo intenso, vários casos de mastite clínica são cultura-458 negativo ou causados por patógenos com altas taxas de cura espontânea. Nestes locais, 459 muitos antimicrobianos são administrados desnecessariamente, pela falta de 460 conhecimento do proprietário. Tal comportamento pode permitir seleção de patógenos 461 oportunistas que ainda não tiveram a oportunidade de adentrar a glândula mamária das 462 vacas, tornando os tratamentos futuros mais complexos e caros (RUEGG, 2018). 463 Porém, nos casos de mastite clínica, a antibioticoterapia é necessária e nestes 464 casos, os β-lactâmicos (ampicilina, amoxicilina, cloxacilina, cefalotina, cefoperazona, 465 ceftiofur e penicilina G) são os antibióticos de preferência, seguidos pelas tetraciclinas 466 (oxitetraciclina, tetraciclina e clortetraciclina) e pelos aminoglicosídeos (estreptomicina, 467 neomicina e gentamicina) (SANTOS, 2013). 468 469 1.3.1. Resistência aos β-lactâmicos: 470 Os β-lactâmicos são antimicrobianos que atuam impedindo a síntese da parede 471 celular bacteriana. De acordo com a estrutura do anel β-lactâmico, são classificados em 472 penicilinas, cefalosporinas, cefamicinas, carbapenemêmicos, monobactâmicos e 473 inibidores de β-lactamases (FINCH et al., 2012), que são as enzimas responsáveis por 474 quebrar os β-lactâmicos. A hidrólise de β-lactâmicos por β-lactamases é o mecanismo 475 mais comum de resistência para essa classe de antimicrobianos em Gram-negativas de 476 importância clínica. Em 2009, o número de sequências proteicas únicas ultrapassava 477 890 (BUSH e JACOBY, 2010). 478 479 β-lactamases de espectro estendido (ESBL) 480 Além das β-lactamases convencionais, há ainda as de amplo espectro (ESBL), 481 que são enzimas originalmente derivadas ou evoluídas de algum ancestral de espectro 482 estreito e adquiriram a capacidade de inativar um amplo espectro de cefalosporinas, 483 penicilinas e aztreonam, mas não cefamicinas ou carbapenêmicos por atividade 484 hidrolítica, sendo inibidos por inibidores de β-lactamases como o ácido clavulânico 485 (RAHMAN et al., 2018). 486 22 Dentre os tipos de ESBL já descritas, CTX-M, TEM e SHV são as mais bem-487 sucedidas em termos de disseminação e capacidade de interação. Estima-se que a 488 principal estratégia evolutiva para obtenção dessa resistência por Gram-negativos seja a 489 variedade de mutantes com especificidade estendida nos tipos já prevalentes de β-490 lactâmicos TEM e SHV e a aquisição de genes de β-lactamases de amplo espectro de 491 genomas existentes no ambiente (RAHMAN et al., 2018). 492 As enzimas CTX-M foram classificadas em cinco grandes grupos: CTX-M-1, 493 CTX-M-2, CTX-M-8, CTX-M-9 e CTX-M-25, pelo compartilhamento de, pelo menos, 494 94 % de identidade nas sequências de aminoácidos (BRADFORD, 2001; BONNET, 495 2004), conferindo níveis elevados de resistência à cefotaxima e à ceftazidima 496 (BONNET, 2004). Entretanto, já foram observadas diferenças de resistência entre os 497 subtipos de CTX-M, como o CTX-M-15, que pertence ao grupo CTX-M-1 e apresenta 498 atividade catalítica aumentada à ceftazidima (POIREL et al., 2002), em relação aos 499 outros subtipos do mesmo grupo. Até o momento, foram relatadas 172 variantes de 500 CTX-M (RAHMAN et al., 2018) com sequência de aminoácidos e características 501 funcionais distintas, sendo a CTX-M-15 e CTX-M-14, os tipos mais comumente 502 detectados globalmente, seguidas por CTX-M-2, CTX-M-3 e CTX-M-1 (LEVY, 2002). 503 Em casos de mastite bovina, as variantes CTX-M-1, CTX-M-2, CTX-M-3, CTX-M-14, 504 CTX-M-15, CTX-M-32 e CTX-M-55 já foram relatadas (PEHLIVANOGLU et al., 505 2016; ALI et al., 2017; EISENBERGER et al., 2018). 506 Em um relatório da Organização Mundial da Saúde de 2014 (WHO, 2014), E. 507 coli recebeu atenção especial devido à resistência às cefalosporinas de terceira geração e 508 fluoroquinolonas. Os genes de ESBL podem dispersar entre isolados bacterianos através 509 da troca de elementos genéticos móveis, como plasmídeos, que podem ainda abrigar 510 outros genes de resistência. A detecção de E. coli produtoras de ESBL em amostras de 511 leite, principalmente em leite cru e seus derivados, demonstraram que o leite pode atuar 512 como um veículo para a introdução de E. coli produtora de ESBL na teia alimentar 513 (FREITAG et al., 2017). 514 515 β-lactamases tipo AmpC 516 As β-lactamases ampC são capazes de hidrolisar cefalosporinas e cefamicinas, 517 não sendo inibidas por inibidores de β-lactamases como tazobactam e ácido clavulânico. 518 Os genes que conferem este tipo de resistência podem ser tanto cromossomais quanto 519 23 plasmidiais. Até 2016, foram descritas 130 β-lactamases do tipo CMY (POWERS, 520 2016). 521 A expressão de β-lactamase AmpC cromossomal em E. coli parece ser baixa 522 (SIU et al., 2003), mas a variante CMY-2 plasmidial já foi encontrada em isolados de 523 mastite bovina (ENDIMIANI et al., 2012). 524 525 Carbapenemases 526 As carbapenemases impedem a ligação cruzada na síntese do peptoglicano, 527 fazendo com que a estrutura celular enfraqueça e ocorra lise (CODJOE e DONKOR, 528 2018). Dentro do grupo de carbapenemases, a KPC (carbapenemase K. pneumoniae) 529 hidrolisa penicilinas, todas as cefalosporinas, monobactâmicos, carbapenêmicos e 530 inibidores de β-lactamases (PAPP-WALLACE et al., 2010). O primeiro estudo 531 relatando a presença de KPC foi publicado em 2001 (YIGIT et al., 2001), mostrando 532 que uma cepa de Klebsiella pneumoniae nos Estados Unidos era resistente à 533 carbapenêmicos e, desde então, vem sido relatada em outros Gram-negativos e em 534 outros países (MUNOZ-PRICE et al., 2013). E.coli portando o gene blakpc já foram 535 encontradas em fezes de gado de corte, que não haviam sido expostos à antibióticos 536 (VIKRAM e SCHMIDT, 2018), indicando possível risco à saúde pública. 537 A New Delhi Metallo-β-lactamase 1 (NDM-1) também foi encontrada pela 538 primeira vez em um isolado de K. pneumoniae, em 2009, a partir de um paciente com 539 infecção urinária. O gene que confere essa resistência também foi observado em um 540 isolado de E. coli, a partir de fezes do mesmo paciente, levantando-se a hipótese da 541 ocorrência de conjugação in vivo (YONG et al., 2009). Estima-se que a partir de então, o 542 gene de NDM-1 foi transmitido por bactérias ao redor do mundo devido ao trânsito de 543 turistas entre diferentes países (CODJOE e DONKOR, 2018), já sendo encontrada em 544 isolados de E. coli causadora de mastite. Isto é um problema pois pode haver introdução 545 de bactérias portadoras do gene de NDM-1 na teia alimentar a partir do leite (GHATAK 546 et al., 2013). Dezesseis variantes de NDM já foram descritas (YAICI et al., 2016), sendo a 547 NDM-1 a mais prevalente em caso de mastite bovina (GHATAK et al., 2013). 548 549 1.3.2. Resistência à colistina 550 A resistência aos β-lactâmicos tornou necessário o uso de antibióticos mais 551 tóxicos, como a colistina (polimixina E). Seu mecanismo de ação é translocar estruturas 552 presentes na parede de bactérias Gram-negativas, levando à ruptura da membrana 553 24 (NEWTON, 1956). Apesar de ser muito utilizada na medicina veterinária, a colistina 554 não costuma ser usada no tratamento de humanos por ser altamente nefro e neurotóxica 555 (CATRY et al., 2015). 556 Até 2015, o gene responsável por conferir resistência à colistina, o mcr-1, 557 estava exclusivamente associado ao cromossomo, mas Liu e colaboradores (2016) 558 demonstraram a presença de um plasmídeo denominado MCR-1, encontrado em uma E. 559 coli, isolada de suíno, albergando esse gene (LIU et al., 2016). Em 2016, o gene 560 plasmidial mcr-2, foi descrito por XAVIER et al. (2016), que observaram homologia de 561 76,7% nas sequências de nucleotídeos, quando comparado com mcr-1. 562 Em um estudo realizado na China, Liu e colaboradores (2019) encontraram 563 ocorrência concomitante de blaCTX-M-15 e mcr-1 em leite de vacas com mastite clínica. 564 Recentemente, foi encontrado pela primeira vez E. coli multirresistente, produtora de 565 ESBL e mcr-1 causando mastite clínica (FILIOUSSIS et al., 2020). 566 567 1.4. Produção de biofilme 568 569 Durante o início do desenvolvimento do biofilme, a síntese de flagelos é 570 reprimida, já que a adesão da bactéria à superfície faz com que a E. coli se torne séssil. 571 Logo após a adesão, as bactérias se agregam a partir de interação célula-a-célula, tendo 572 início também a produção da matriz extra-celular, tendo-se como os principais 573 exopolissacarídeos o polímero β-1,6-N-acetil-D-glucosamina, que medeia a adesão 574 célula-à-célula e às superfícies, além de atuar como adesina para estabilizar o biofilme, 575 a celulose, que confere rigidez ao biofilme e o ácido colânico, que forma uma cápsula 576 ao redor do biofilme, protegendo-o do ambiente externo e de antimicrobianos. Sabe-se 577 que, em E. coli, o biofilme pode conferir resistência a ampicilina, cefotaxima, 578 norfloxacino e ácido nalidíxico, facilitando a ocorrência de infecções persistentes. Após 579 a maturação, algumas células podem se destacar do biofilme por degradação enzimática, 580 em resposta a pressões ambientais como níveis nutricionais e colonizar outras regiões 581 (SHARMA et al., 2016). 582 A mastite bovina é um dos principais problemas na pecuária leiteira do Brasil e 583 do mundo e a investigação de fatores de virulência, filogenia e resistência aos 584 antimicrobianos nos isolados de MPEC, contribuirá para uma maior compreensão 585 desses patógenos, auxiliando no combate desta enfermidade a campo e na prevenção de 586 possíveis infecções humanas. Além disso, a comparação genotípica desses isolados 587 25 pode permitir a identificação de grupos clonais diferentes, na procura de marcadores 588 específicos dessa doença. 589 590 53 6. CONCLUSÃO 1180 1181 A maior parte das infecções de mastite clínica bovina foi causada por E. coli 1182 comensal e não foi possível definir marcadores moleculares para o grupo MPEC, devido 1183 à alta variabilidade genética encontrada. Com exceção de dois isolados, nenhum outro 1184 apresentou genes nem padrões de adesão que definem os grupos de DEC. Logo, os 1185 isolados de E. coli causadoras de mastite clínica bovina estudados apresentam baixo 1186 potencial zoonótico. 1187 1188 54 REFERÊNCIAS 1189 ABE, C. M. et al. Virulence features of atypical enteropathogenic Escherichia coli 1190 identified by the eae+ EAF-negative stx− genetic profile. Diagnostic Microbiology and 1191 Infectious Disease, v. 64, n. 4, p. 357-365, 2009. 1192 ACIK, M. N. et al. traT and cnf2 genes of Escherichia coli isolated from milk of 1193 healthy cows and sheep. Research in Veterinary Science, v. 77, n. 1, p. 17-21, 2004. 1194 ADKINS, P. R. F; MIDDLETON, J. R. Methods for diagnosing mastitis. 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