Dissertação de Mestrado EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO AERÓBICO E DIETA HIPERLIPÍDICA NA PRÓSTATA DE CAMUNDONGOS SELVAGEM E PPAR- α -/-: ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS E MOLECULARES Danilo Bianchini Baptista Presidente Prudente, 2019 Dissertação de Mestrado EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO AERÓBICO E DIETA HIPERLIPÍDICA NA PRÓSTATA DE CAMUNDONGOS SELVAGEM E PPAR- α -/-: ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS E MOLECULARES Danilo Bianchini Baptista Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia – FCT/UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em ciência da Motricidade Humana. Orientadora: Profa. Dra. Giovana Rampazzo Teixeira Presidente Prudente, 2019 iii B222e Baptista, Danilo Bianchini EFEITO DO EXERCÍCIO FÍSICO AERÓBICO E DIETA HIPERLIPÍDICA NA PRÓSTATA DE CAMUNDONGOS SELVAGEM E PPAR- -/-: ANÁLISES HISTOPATOLÓGICAS E MOLECULARES / Danilo Bianchini Baptista. -- , 2019 64 p. : il., tabs. + 1 CD-ROM Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara, Orientadora: Giovana Rampazzo Teixeira 1. Exercício físico aeróbio. 2. Dieta hiperlipídica. 3. PPAR . 4. Próstata. 5. Inflamação. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. iv v RESUMO Introdução: A tendência atual de um estilo de vida cada mais sedentário, concomitante com o alto consumo de gordura, provocam inflamação sendo considerada precursora do desenvolvimento do quadro de síndrome metabólica, obesidade, doenças cardíacas, alterações teciduais e desenvolvimento de diversos cânceres, como o câncer de próstata. Objetivo: é verificar a participação do fator de transcrição gênica PPAR-α, como possível regulador nos efeitos protetores do treinamento físico aeróbico através de alterações prostática de camundongos submetidos a dieta padrão e dieta hiperlipídica, analisando as alterações morfológicas e expressão proteica na próstata. Métodos: Foram utilizados deficientes para PPARα (KO) e camundongos controles da linhagem C57BL/6J selvagens (10 semanas de idade). Foram alimentados com dieta padrão, e dieta hiperlipídica (HFD) foi composta por 26% de carboidratos, 59% de lipídios e 15% de proteína. O treinamento físico aeróbio foi realizado em esteira ergométrica a 60% da velocidade máxima, 5 dias por semana, 10m/min durante 60 minutos, por 12 semanas de tratamento. Resultados: A HFD induz alterações teciduais prostáticas, aumento de mastócitos, aumento proteico relacionado com receptores de andrógenos (AR), receptores de glicocorticoides (GR), receptor de morte celular (Fas), linfoma de células B -2 (BCL-2) e BCL-2 associado a proteína X (BAX) interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-a), fator nuclear kappa B (NF-kB). No entanto, o exercício físico aeróbico modulou a próstata reduzindo a ativação de receptores esteroides, e reduzindo a inflamação, independente da ação de PPARa. Conclusão: Nossos achados sugerem que o exercício físico aeróbico suprime as lesões prostáticas induzidas por HFD, reduzindo a inflamação prostática. Palavras-chave: Inflamação, próstata, exercício físico, PPARa vi ABSTRACT Introduction: The current trend of a more sedentary life style, concomitant with the high consumption of fat, provokes inflammation and is considered a precursor of the development of metabolic syndrome, obesity, heart disease, tissue changes and the development of several cancers, such as prostate cancer. Objective: It is to verify the participation of the gene transcription factor PPAR-α, as a possible regulator in the protective effects of aerobic physical training through prostatic changes of mice submitted to standard diet and hyperlipidic diet, analyzing the morphological changes and protein expression in the prostate. Methods: Deficits were used for PPARα (KO) and wild-type C57BL/6J control mice (10 weeks of age). They were fed standard diet, and hyperlipid diet (HFD) was composed of 26% carbohydrates, 59% lipids and 15% protein. The aerobic physical training was performed on treadmill at 60% of the maximum speed, 5 days a week, 10m / min during 60 minutes, for 12 weeks of treatment. Results: HFD induces prostatic tissue changes, mast cell enlargement, androgen receptor (AR), glucocorticoid receptor (GR) receptors, cell death receptor (Fas), B-cell lymphoma (BCL-2) and BCL-2 associated with protein X (BAX) interleukin 6 (IL-6), tumor necrosis factor alpha (TNF-a), nuclear factor kappa B (NF-kB). However, aerobic physical exercise modulated the prostate gland by reducing the activation of steroid receptors, and reducing inflammation, regardless of the action of PPARa. Conclusion: Our findings suggest that aerobic physical exercise suppresses HFD-induced prostatic lesions, reducing prostatic inflammation. Keywords: Inflammation, prostate, exercise, PPARa. vii LISTA DE FIGURAS ARTIGO Figura 1 – Design dos grupos e delineamento experimental ............................................59 Figura 2 – Análise morfológica e quantitativas dos grupos experimentais.....................60 Figura 3 – Expressão imunorreativa e quantitativa de AR, GR, Faz, BCL-2 e BAX......61 Figura 4– Expressão imunorreativa e quantitativa de IL-6, TNF-a e NF-kB..................62 viii LISTA DE TABELAS ARTIGO Tabela 1 – Característica da amostra, peso corporal, peso dos tecidos, níveis séricos de triglicerídeos, colesterol e ácido graxos livres de camundongos WT e PPARα (KO) com consumo de dieta padrão e dieta hiperlipídica.................................................................57 ix LISTA DE ABREVIATURA AR Receptor de andrógeno BAX BCl-2 associado a proteína X BCL-2 B-cell lymphoma 2 BSA Albumina de soro bovino DAB Diaminobenzidina Fas Receptor de morte celular GR Receptor de glicocorticóide HDL Lipoproteína de alta densidade HFD Dieta hiperlipídica IGF Fator de crescimento semelhante a insulina IGFBP Proteína de ligação ao fator de crescimento semelhante de insulina IL-6 Interleucina 6 KO do inglês “knockout” - deficiente KO-HF Animais deficientes em PPAR-α alimentados com dieta hiperlipídica KO-HFT Animais deficientes em PPAR-α alimentados com dieta hiperlipídica e submetidos ao treinamento físico aeróbio LDL Lipoproteína de baixa densidade NF-kB Fator nuclear kappa B PAS do inglês periodic acid schiff PGC-1a Coativador 1 alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama PPARg Receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama PPARα Receptor ativado por proliferador de peroxissoma alfa SD - Animais selvagens alimentados com dieta padrão TNF-a Fator de necrose tumoral alfa x WT do inglês Wild Type - selvagem WT-HF. Animais selvagens alimentados com dieta hiperlipídica WT-HFT Animais selvagens alimentados com dieta hiperlipídica e submetidos ao treinamento físico aeróbio xi SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................... 10 1.1 ESTRUTURA GERAL DO PROJETO DE DISSERTAÇÃO .................................... 10 1.2 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA .............................................................. 10 1.2.1 Modulações prostáticas promovida pelo exercício físico ......................................................... 11 1.2.2 Dieta Hiperlipídica: padrões inflamatórios ............................................................................... 13 1.2.3 PPAR e próstata e possíveis efeitos do exercício físico ............................................................ 16 1.3 OBJETIVOS ................................................................................................................ 22 1.3.1 Objetivo Geral ........................................................................................................................... 22 1.3.2 Objetivo Específico ................................................................................................................... 22 1.4 HIPÓTESE ................................................................................................................... 22 1.5 JUSTIFICATIVAS ...................................................................................................... 23 1.6 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 25 2. RESULTADOS ............................................................................................................ 37 2.1 ARTIGO ............................................................................................................................ 38 10 1. INTRODUÇÃO 1.1 ESTRUTURA GERAL DO PROJETO DE DISSERTAÇÃO A estrutura da presente dissertação foi elaborada conforme modelo alternativo, apresentada no formato de artigo científico, para o programa de Pós-Graduação em Ciências da Motricidade da Universidade Estadual Júlio de Mesquita Filho – UNESP. Sendo assim a dissertação foi elaborada em três capítulos. No primeiro capítulo foi apresentada a contextualização do problema de pesquisa, objetivos (geral e específicos) e a justificativa do estudo. Na sequência o segundo capítulo está apresentado os resultados da pesquisa que foi descrito em um artigo científico intitulado “Ausência de PPAR-ɑ na próstata: modificações morfológicas e moleculares associadas ao exercício físico aeróbico” será encaminhada para avaliação na revista Metabolism Clinical and Experimental, Qualis/CAPES A1, JCR 86 e Fator de Impacto 5,9. 1.2 CONTEXTUALIZAÇÃO DO PROBLEMA O câncer de próstata é um dos cânceres mais comumente diagnosticados (com exceção do câncer de pele) em homens com mais de 50 anos. Estima-se que haverá quase 1,3 milhão de novos casos de câncer de próstata e 359.000 mortes no mundo em 2018, sendo o segundo mais frequente e a quinta principal causa de morte por câncer em homens (BRAY et al., 2018) As taxas de incidência no Brasil estão aumentando, podendo ser parcialmente justificadas pela evolução dos métodos diagnósticos, pela melhora na qualidade dos sistemas de informação do país e pelo aumento da expectativa de vida. Estima-se que 68.220 novos casos de câncer de próstata serão diagnosticados em 2018 com uma mortalidade de 14.484 (INCA, 2018) no Brasil. O câncer de próstata está associado a fatores de risco, incluindo inatividade física e estilos de vida sedentários 11 (TSILIDIS et al., 2016), o consumo excessivo de refeições altamente calóricas e pouco nutritivas (PEISCH et al., 2017) nas taxas de obesidade (HSING; SAKODA; JR, 2007), um aumento na prevalência do tabagismo (RIEKEN et al., 2015). A inatividade física tem sido apontada frequentemente como um dos principais fatores responsáveis pelo desencadeamento de doenças crônico-degenerativas, obesidade e, consequentemente, câncer (SEGUE et al., 2018). Nesse sentido, a realização periódica de exercícios físicos parece atuar como agente não-farmacológico no controle dessas doenças (BAPTISTA et al., 2018). Já é sabido na literatura que, exercícios físicos predominantemente aeróbicos diminua os estoques de gordura corporal (BAE et al., 2017), ao passo que o treinamento de força induz o aumento da massa magra (JAKOVLJEVIC et al., 2018). Atualmente o exercício físico é incentivado e realizado como estratégia para redução de sobrepeso, pois aumenta o gasto energético, reduz o perfil lipídico, o risco de doenças cardiovasculares, previne o desenvolvimento e a progressão da arteriosclerose, traz benefícios para a dislipidemia e é o melhor tratamento para diabetes mellitus tipo 2 (ALVAREZ et al., 2018). Seu mecanismo de ação possibilita a manutenção do peso corporal, o controle da pressão arterial, à resistência insulínica, a estabilização endotelial e a saúde vascular (STUBBS et al., 2019). Existem relatos que o exercício físico muda a progressão do tumor (NOGUCHI; LISS; PARSONS, 2015) e aprimora o bem-estar psíquico e a qualidade de vida dos pacientes com câncer (HASENOEHRL et al., 2015) Assim, estudos têm atribuído ao exercício físico à função terapêutica auxiliar no tratamento do câncer de próstata. Portanto, investigação sobre os mecanismos de ação do exercício físico na próstata são necessárias. 1.2.1 Modulações prostáticas promovida pelo exercício físico 12 Mecanismos de ação prostática do exercício físico ainda é obscuro para ciência. Além disso sabe-se que o aumento da lipogênese prostática pode ser indutor de câncer (LIU et al., 2015). A próstata está inserida no sistema genital masculino e secreta diversa nutriente que compõem o líquido seminal, essencial para a nutrição e motilidade dos espermatozóides (TAYLOR; TOIVANEN; RISBRIDGER, 2010). Nos roedores, estruturalmente, a próstata é constituída por pares de lobos (ventral, lateral e dorsal) de glândulas túbulo acinosas e estroma que circundam a uretra pélvica. A próstata anterior ou de glândula de coagulação localiza-se na face côncava das vesículas seminais (UNTERGASSER; MADERSBACHER; BERGER, 2005). Os ácinos prostáticos são revestidos por epitélio secretor constituído por dois compartimentos morfologicamente distintos: o basal e o luminal ou secretor. Nesses compartimentos localizam três tipos células: a basal, a luminal e/ou secretora e a neuroendócrina (SAKUMA et al., 2016). Essas células podem ser diferenciadas pela expressão e/ou co-expressão diferencial de citoqueratinas (CK) e antígenos de superfície (CD - cluster de diferenciação) (BERRY; MAITLAND; COLLINS, 2008). O estroma prostático é formado por complexo arranjo de células, que incluem células musculares lisas, fibroblastos e miofibroblastos e pela matriz extracelular. Ressalta-se que os elementos estromais fornecem sinais biológicos e exercem influências mecânicas sobre as células epiteliais (CUNHA; MATRISIAN, 2002). Os processos biológicos de morfogênese, manutenção da atividade funcional, proliferação e diferenciação das células prostáticas são regulados por andrógenos (LAMB; MASSIE; NEAL, 2014). A testosterona e a diidrotestosterona (DHT) são os principais andrógenos que estimulam a diferenciação prostática (WANG; HU; WEI, 2016). Além dos andrógenos, outros hormônios como os estrógenos atuam 13 sinergicamente à testosterona, influenciando tanto as funções normais da próstata quanto às alterações patológicas (ZHANG et al., 2011). A resposta proliferativa do tecido à lesão e inflamação é necessária para a sobrevivência do tecido, contudo existe associação entre a inflamação crônica e câncer levando a concluir que essa resposta proliferativa advinda de uma inflamação pode impulsionar o crescimento epitelial em neoplasia (MEDZHITOV, 2008). Tem sido proposto que as transformações neoplásicas resultam da proliferação epitelial em ambiente rico em células inflamatórias, fatores de crescimento, estroma ativado e liberação de agentes promotores de danificação no DNA (JERDE; BUSHMAN, 2009; MEDZHITOV, 2008). Desta forma, mediadores inflamatórios tem papel principal no processo inflamatório e podem contribuir para o desenvolvimento e progressão do tumor. Porém seu efeito sobre a progressão do tumor ainda é considerado colateral não específico. Com base em estudos prévios em nosso laboratório sugerimos que os treinamentos de força em ratos podem modificar o perfil lipídico e hormonal da próstata de ratos (TEIXEIRA et al., 2019). Desta forma faz-se necessário o conhecimento de diferentes possibilidades de intervenção, por meio do exercício físico, seja por meio de treinamento resistido, de exercícios aeróbios, e de seus efeitos sobre diferentes parâmetros, como o perfil metabólico, a composição corporal, em pessoas com fatores de risco para o desenvolvimento de Síndrome Metabólica (SM). 1.2.2 Dieta Hiperlipídica: padrões inflamatórios Caracteriza-se por dieta hiperlipidica (DH) o consumo excessivo de lipídios (40% - 50% da ingestão calórica total) como ácidos graxos saturados, gorduras saturadas e 14 trans-insaturadas (GREENWOOD & WINOCUR, 2005; SCHRAUWEN & WESTERTERP, 2000). Já é bem descrito que este consumo alimentar potencializa diversas doenças como obesidade (LI, et al. 2002), o diabetes-mellitus tipo 2 (GREENWOOD & WINOCUR, 2005) e doenças cardiovasculares (WHITEHEAD 2011). A obesidade associada DH é um percursor do diabetes tipo 2 promovida pela resistência insulínica (KOVACS; STUMVOLL, 2005). Estas condições resultam em mudanças no metabolismo de glicose e lipídios causando um elevado nível sérico de insulina em jejum (VIKRAM; JENA; RAMARAO, 2010). Embora não existem estudos conclusivos entre o alto teor de gordura ingerida e o risco de câncer de próstata o aumento de consumo de gordura animal parece ser indutor de lesões prostáticas (BIANCO et al., 2006). Estudos relatam que altos níveis de gordura saturada na dieta aumenta o crescimento de câncer prostático em célula in vitro, enquanto que dieta com baixo teor de gordura atrasa o crescimento de células cancerígenas prostáticas (PANDALAI et al., [s.d.]; WANG et al., 1995). Inúmeras drogas têm sido desenvolvidas para o tratamento da resistência insulínica entre elas a metformina e o agonista de PPAR-y. A insulina e o IGF-1 são funcionalmente homólogos podendo ativar o mesmo receptor. Essa similaridade funcional tem levado a várias investigações relacionando a atividade de IGF em obesos, diabéticos e pacientes com doenças prostáticas (COHEN; PEEHL; ROSENFELD, 1994; NAM et al., 1997). Alguns dos principais mecanismos envolvidos no crescimento da próstata são potenciais alvos terapêuticos que incluem alterações no estado hormonal, alterações no eixo insulina/IGF/IGFBP, inflamação e alterações no metabolismo resultante da estimulação anormal persistente. O receptor de IGF-1 é expresso predominantemente no epitélio prostático, enquanto que no estroma está expresso o ligante de IGF-1 atuando de forma parácrina no 15 receptor (COHEN; PEEHL; ROSENFELD, 1994; VIKRAM; JENA; RAMARAO, 2010). Células prostáticas epiteliais e do estroma in vitro são sensíveis a IGF-1 e IGFBP relacionando esses fatores a progressão do câncer prostático (COHEN et al., 1993; TENNANT et al., 1996). O desenvolvimento prostático ocorre pobremente em camundongos deficientes de receptores de IGF-1 (HAYWARD; CUNHA, 2000). Tem sido documentado que o aumento de insulina aumenta a proliferação celular na próstata de ratos (VIKRAM; JENA; RAMARAO, 2010). Assim esse número crescente de evidências suporta a ideia que as mudanças no eixo IGF/IGFBP resultantes da obesidade ou diabetes poderiam desempenhar importante papel na regulação do crescimento prostático. A obesidade e o diabetes são doenças sistêmicas complexas. Ambas alteram o metabolismo de hormônios esteroides e podem ser consideradas “pro-inflamatórias” condições pelas quais aumentam a liberação de citocinas que possivelmente podem contribuir para o crescimento prostático (JERDE & BUSHMAN, 2009). Dentre os principais marcadores pró-inflamatórios estão a interleucina-6 (IL-6) e o fator de necrose tumoral alfa (TNF-α) (CESARI et al., 2004). A resposta proliferativa do tecido à lesão e inflamação é necessária para a sobrevivência do tecido, contudo existe associação entre a inflamação crônica e câncer levando a concluir que essa resposta proliferativa advinda de uma inflamação pode impulsionar o crescimento epitelial em neoplasia (MEDZHITOV 2009). Tem sido proposto que as transformações neoplásicas resultam da proliferação epitelial em ambiente rico em células inflamatórias, fatores de crescimento, estroma ativado e liberação de agentes promotores de danificação no DNA (MEDZHITOV 2009; JERDE AND BUSHMAN, 2009). Desta forma, mediadores inflamatórios tem papel principal no processo inflamatório e podem contribuir para o desenvolvimento e 16 progressão do tumor. Porém seu efeito sobre a progressão do tumor ainda é considerado colateral não específico. O ciclo celular prostático pode ser modulado pela secreção de TNF-α, inibindo a apoptose através da ativação de NF-kβ e estimulando proteínas anti-apoptóticas como BCL-2 e BCL-XL (TAMATANI, et. al. 1999). Além disso, a inflamação crônica contribui para o aumento de mediadores como COX-2 e iNOS, que estimulam o aumento da próstata (SHANKAR et. al., 2015). A dieta hiperlipídica pode modular a próstata via ativação inflamatória e alteração na fosforilação de IKK α/β e IkBα, resultando em maior translocação de NF-kβ para o núcleo da célula (SHANKAR et. al., 2015). Ainda o aumento da ação de NF-kβ nas células prostáticas estimula as proteínas BCL-2 e BCL- XL desregulando o ciclo celular (SHANKAR et. al., 2015). 1.2.3 PPAR e próstata e possíveis efeitos do exercício físico Receptor ativado por proliferador de peroxissoma alfa (do inglês, Peroxisome proliferator receptor activated alfa-PPARα) são receptores hormonais nucleares que atuam como fatores de transcrição ativado por ligante responsáveis pelo balanço na regulação do metabolismo celular, metabolismo de lipídios, diferenciação e respostas inflamatórias. Pertencem à família de fatores de transcrição nucleares ativados por ligantes o receptor 9-cis ácido retinóico (RXR) e o receptor trans ácido retinóico (RAR) (JOHNSON et al., 2011). Para que induzam a transcrição dos genes alvos, deve combinar- se com os receptores X retinóide-a (RXR-a), formando um heterodímero que se liga a sequências específicas de reconhecimento (PPREs) na região regulatória dos genes-alvo (BARDOT et al., 1993; KLIEWER et al., 1992). Alterações na atividade desses receptores nucleares tem papel chave em ambas às patologias como hiperplasia prostática benigna e câncer de próstata (JIANG et al., 2010a). 17 Proliferadores de peroxissomos fazem parte do grupo de compostos estruturalmente diversos que inclui drogas hipolipidemicas, herbicidas e plastificantes industriais (MOODY et al., 1991). A administração destes compostos em ratos e camundongos resulta em aumento no tamanho e número de peroxissomos, acompanhados por aumentos na β-oxidação de ácidos graxos peroxissomal (SCHULER et al., 2006) e ώ-hidroxilação microssomal (SHARMA; LAKE; GIBSON, 1988). Adicionalmente o PPARα também são ativados por ácidos graxos e metabólicos de ácidos graxos levando a ativação de vários genes envolvidos no metabolismo assim como a transthietina e α2u- globulina (JIANG et al., 2010a). O papel do PPARα no metabolismo do ácido graxos foi confirmada pela geração de camundongos com alelos nulos para o gene de PPARα (LEE et al., 1995; VAUGHAN et al., 2013a). Estes animais são fenotipicamente normais e tem nível basal de peroxissomos hepáticos, mas não é responsivo a proliferação de peroxissomos e não respondem a indução do gene alvo. No entanto esses camundongos possuem expressão alterada de enzimas mitocondriais para metabolização de ácidos graxos (PETERS et al., 1997). Em humanos, PPARα tem alta expressão no fígado, coração e rins, porém é expressa em níveis mais baixos em outros tecidos (AUBOEUF et al., 1997). Os níveis de PPARα em humanos são significativamente mais baixos quando comparados aos ratos e camundongos, porém possuem atividade funcional (HERTZ; BISHARA-SHIEBAN; BAR-TANA, 1995; VAUGHAN et al., 2013b). A literatura demonstra que o PPARα regula os glicocorticoides (COLLETT et al., 2000a; HEMING et al., 2018), insulina (CORZO; GRIFFIN, 2013), TNF-α (HEMING et al., 2018) e também está descrito a ação deste composto como gene responsivo a andrógenos em células prostáticas e com alta expressão em carcinomas prostáticos (COLLETT et al., 2000b) Verificou-se que os ácidos graxos e glicose ativam a via NF- κB em monócitos, elevando a produção de citocinas pró-inflamatórias (DICKINSON et 18 al., 2008). Por outro lado, a ativação do PPARα e PPAR-γ, contra-regula a atividade do NF-κB, reduzindo a produção de citocinas por monócitos e aumentando a apoptose desse tipo celular, sugerindo que os processos inflamatórios mediados pelo NF-κB estão intimamente relacionados com fatores de transcrição que controlam genes alvos do metabolismo de lipídeos (LEFEBVRE et al., 2006). A via de sinalização do NF-κB desempenha um papel importante nas respostas ao câncer, inflamação e estresse (MCCARTY; HEJAZI; RASTMANESH, 2014). NF-κB é um fator de transcrição encontrado no citoplasma ligado aos chamados inibidores de NF- κB (IκB). A ativação do NF-κB por fatores de crescimento e inflamatórios é mediada através das proteínas quinases IκB (IKKS), que fosforilam IκB, resultando na ubiquitinação IκBα e subsequente degradação proteossômica (CARTER et al., 2016). Como consequência, o NF-κB é liberado do complexo IκB e se transloca para o núcleo, onde se liga em sítios consenso do DNA, ativando a expressão gênica (RAO; LOKESH, 2017). A ampla distribuição dos sítios de ligação do NF-κB no genoma permite regular um vasto número de genes e participar em processos celulares fundamentais, tais como apoptose, proliferação e diferenciação (DE BOSSCHER; VANDEN BERGHE; HAEGEMAN, 2006; FANG et al., 2011). O NF-κB responde a várias moléculas, como IL-1, TNF-α, citocromo P450, melatonina e metaloproteinases de matriz (MMPs) (Pham et al., 2004; Luo et al., 2005). Também, radicais livres são capazes de ativar NF-kβ (Gong et al., 2001, Zhou et al., 2001). Estudos recentes demonstraram que o NF-κB está envolvido com a regulação de genes das enzimas antioxidantes, como a CAT e GSH-Px (MCCARTY; HEJAZI; RASTMANESH, 2014; PRUEITT et al., 2016). Dados de estudos de terapia médica de sintomas prostáticos (MTOPS) sugerem que o risco de doenças prostáticas e retenção urinária são maiores em homens com inflamação prostática (FIBBI et al., 2010). Neste meio complexo de alterações sistêmicas, 19 nós sugerimos que alterações celulares no metabolismo de lipídios e proliferação podem interferir no meio celular prostático. PPARα são receptores hormonais nucleares que atuam como fatores de transcrição ativado por ligante responsáveis pelo balance na regulação do metabolismo celular, metabolismo de lipídios, diferenciação e respostas inflamatórias. Alterações na atividade desses receptores nucleares tem papel chave em ambas patologias como BPH e câncer de próstata (FREEMAN; SOLOMON, 2011). O exercício físico sistematizado com intensidade moderada ou vigorosa, são caracterizados por atividades que aumentam significativamente a demanda energética promovendo alterações agudas e crônicas tanto no metabolismo celular quanto no controle neuroendócrino (FORJAZ et al., 1998). De fato, estas alterações nos sistemas cardiovasculares e autonômicos, após o exercício físico agudo e crônico, têm feito com que o exercício seja fortemente sugerido como uma alternativa não-farmacológica no tratamento de diferentes patologias como a resistência à insulina, o diabetes mellitus e a hipertensão arterial (HSU et al., 2015; MANIO; MATSUMURA; INOUE, 2018; USLU et al., 2018). A prática regular de atividade física e exercícios físicos sistemáticos de forma aeróbica proporciona redução da pressão arterial sistólica e diastólica, melhoras na capacidade funcional, redução de circunferência abdominal, do peso e do percentual de gordura corporal, além de modular o sistema imune de um indivíduo, modificando a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6, TNF-ɑ) e a diferenciação de monócito em macrófagos do tipo M2 (anti-inflamatório) (HEMING et al., 2018; RAO; LOKESH, 2017; SILVEIRA et al., 2018), possibilita ainda de forma direta e indireta, melhoras em fatores psicossociais e, consequentemente, na qualidade de vida (LAVIE; MILANI, [s.d.]). No perfil lipídico, há evidências de que menores concentrações de colesterol total e de LDL colesterol são encontradas em amostras sanguíneas de sujeitos considerados ativos, quando comparados com aqueles sedentários. Da mesma forma, HDL colesterol e 20 triglicérides apresentam maior resposta ao exercício físico, com maior concentração de HDL colesterol e menor de triglicérides (DURSTINE, 2008). Com base em estudos prévios em nosso laboratório sugerimos que os treinamentos de força em ratos podem modificar o perfil lipídico e hormonal da próstata de ratos (TEIXEIRA et al., 2012). Desta forma faz-se necessário o conhecimento de diferentes possibilidades de intervenção, por meio do exercício físico, seja por meio de treinamento resistido, de exercícios aeróbios, e de seus efeitos sobre diferentes parâmetros, como o perfil metabólico, a composição corporal, em pessoas com fatores de risco para o desenvolvimento de Síndrome Metabólica (SM) (ALMEIDA et al., 2012; DA CRUZ FERNANDES et al., 2018). As principais características da obesidade e alto consumo de dieta hiperlipídica são aumento de citocinas inflamatórias como IL-6 e TNF-ɑ que produzem efeitos adversos no organismo, no entanto o exercício físico atua como inibidor destas vias, principalmente por potencializar a produção de citocinas anti-inflamatórias IL-10, IL-4 e IL-6 proveniente dos miócitos (DE AQUINO LEMOS et al., 2013). Além disto as evidencias cientificas demonstrando que a prática de exercício físico regular age sobre o estresse oxidativo, intensificando as vias antioxidantes através da ativação de PGC-1a, AP-1, e diminui o complexo enzimático geradores de superóxidos NADPH-oxidase (SALLAM; LAHER, 2016). Estudos com animais knockout PPAR-ɑ e selvagens, (BATATINHA et al., 2017) verificaram que o exercício físico aeróbico modificou os parâmetros de composição corporal e armazenamento lipídico, em animais obesos, induzidos pela dieta hiperlipídica, e os animais selvagens apresentaram melhora nesses parâmetros em comparação com animais sem PPARa. O exercício físico aumenta as expressões de PPARα no fígado e desta forma atua reduzindo a esteatose hepática não alcóolica causada pela dieta hiperlipídica através do aumento da metabolização dos ácidos graxos acumulado no fígado. Isto ocorre pelo aumento da 21 transcrição de genes responsáveis pela lipólise, estimula AKT, inibe ação de proteínas lipogênicas como FOXO-1(XU; JIANG; DING, 2015). Foi verificado que em mulheres pré-menopausa o treinamento de endurance por 12-14 semanas induziu o aumento da atividade do PPAR-ɑ e das enzimas reguladoras da β-oxidação, elevando a capacidade do músculo esquelético de oxidação de ácidos graxos, reafirmando o papel do exercício físico na regulação do metabolismo lipídico em conjunto com o PPAR-ɑ (HOROWITZ et al., 2000). O exercício aeróbio diminui gordura corporal, regulam o metabolismo de glicose e lipídios (JENKINS et al., 2014; SPRIET, 2014; VIEIRA et al., 2016) e o PPAR-ɑ estimula a ligação de ácidos graxos, resultando em um menor quantidade nos tecidos (Fan et al., 2015; Ren et al., 2018), melhorando a expressão de genes envolvidos na absorção de lipídios (BATATINHA et al., 2017), beta- oxidação (SU et al., 2014) e níveis de HDL, podendo reduzir os risco de aterosclerose e resistência à insulina, agindo como fator terapêutico (ZHANG et al., 2011). E quando relacionado com o exercício físico aeróbio pode acarretar benefícios através, quando aumentando a expressão de PPAR-ɑ, que tem como principal função homeostase celular e balanço energético (TAVARES; HIRATA; HIRATA, 2007). Dados confirmam a ação do exercício físico aeróbio na regulação da próstata de ratos normais e submetidos a suplementações alimentares atuando como regulador do metabolismo lipídico e celular da próstata (JIANG et al., 2010b). (YAKEU et al., 2010) e (THOMAS et al., 2012) sugerem que a ativação PPARα durante o exercício constitui uma nova e potencialmente fator anti-inflamatório e anti-aterogênico modulando o tecido. No entanto, é incipiente os estudos sobre a relação inflamatória e a participação do PPARα, principalmente, nos mecanismos moleculares e fisiológicos modulados pela ausência ou envolvimento com diferentes programas de exercícios físicos. 22 1.3 OBJETIVOS 1.3.1 Objetivo Geral O objetivo deste trabalho foi verificar a participação do fator de transcrição gênica PPAR-α, como possível regulador nos efeitos protetores do treinamento físico aeróbico através de alterações prostática de camundongos submetidos a dieta hiperlipídica. 1.3.2 Objetivo Específico Tais objetivos gerais serão alcançados através dos seguintes objetivos específicos: I. Caracterizar a histopatologia no lobo ventral de camundongos sedentário e treinados, selvagens e/ou nocautes para PPARα; II. Quantificar (imunomarcação) e avaliar as interações funcionais entre o AR, GR e IGF-1. III. Caracterizar e comparar os efeitos da sobre os fatores indutores de lesão celular (TNF-α, IL-6, NF-κB), por imunomarcação; IV. Alterações prostáticas por imunomarcação do conteúdo proteico das enzimas relacionadas ao metabolismo lipídico (FAS total e SREBP-1); 1.4 HIPÓTESE Estamos verificando o efeito da dieta hiperlipídica associada a presença e ausência de PPARα e seus efeitos associados ao exercício físico aeróbico na próstata de camundongos. Buscamos verificar alterações prostáticas promovidas pelo consumo de dieta hiperlipídica associada a ausência do fator de transcrição chamado PPARα e se o 23 exercício físico pode regular ou até mesmos inibir efeitos prejudiciais a próstata. Assim, a dieta hiperlipídica e a ausência de PPARα pode alterar a morfologia e balanço prostático levando a inflamação e crescimento celular e o exercício físico pode regular essas alterações. A hipótese nula pode ser tangenciada a ausência de efeitos da dieta hiperlipídica associada a ausência de efeitos do exercício físico em camundongos selvagens e PPARα ausente. 1.5 JUSTIFICATIVAS A obesidade é um problema de saúde mundial que gera alto custo para o governo atualmente. Esta doença se desenvolve principalmente pela alimentação inadequada da população mundial rica em gorduras. Estar acima do peso pode acarretar um quadro de inflamação crônica responsável por atuar sobre diversos metabolismos do corpo, inclusive no ambiente prostático. Por ser uma glândula importante para o sistema reprodutor masculino, geralmente é alvo de diversas doenças, e os comportamentos que modulam a próstata têm tomado grandes proporções e atenção na comunidade científica. Os estudos sobre os mecanismos moleculares das doenças que acometem esta glândula tornam-se essenciais para entender a complexidade das interações que podem desencadear, prevenir ou tratar as doenças. O baixo grau de eficácia das terapias contra as lesões prostáticas proliferativas pode estar relacionado aos efeitos dessas terapias sobre os mecanismos de reparo tecidual, angiogênese, enzimas antioxidantes e inflamação. Em muitos cânceres, a natureza das inflamações que amplifica a lesão primária não é conhecida. Desta forma, torna-se difícil o planejamento correto de estratégias com propriedades eficientes para eliminação direta do gatilho para as lesões provocadas por esses diversos fatores. 24 Pesquisas em nosso laboratório apontam que o treinamento físico pode alterar o metabolismo prostático dos receptores hormonais e desta forma minimizar as alterações do ciclo celular na próstata de ratos. Para melhor entendimento desta vertente avaliaremos o perfil metabólico, inflamatório, assim como o fenótipo (pró ou anti- inflamatório) das células prostáticas enfatizando o papel central do PPARα como fator de transcrição gênica nas alterações inflamatórias. Desta forma, faremos uma melhor compreensão dos mecanismos envolvidos na ação do exercício físico aeróbio e seu impacto na elucidação das questões relacionadas à dislipidemia, bem como, o desenvolvimento de novas terapias envolvidas no processo inflamatório. Diante do exposto, enfatizamos que na literatura especializada não há trabalhos correlacionando fatores metabólicos com os fatores de inflamação, receptores hormonais com dieta hiperlipídica e exercício físico aeróbio no controle das lesões prostáticas. Portanto, a associação entre inflamação e o treinamento físico pode ser considerada uma promissora combinação para agir de forma terapêutica e preventiva. 25 1.6 REFERÊNCIAS ACKERMAN, S. E. et al. Insights into the Link Between Obesity and Cancer. Current Obesity Reports, v. 6, n. 2, p. 195–203, jun. 2017. ALMEIDA, J. et al. Determination of the Maximal Lactate Steady State in Obese Zucker Rats. International Journal of Sports Medicine, v. 34, n. 03, p. 214–217, set. 2012. 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RESULTADOS Os resultados desta dissertação estão detalhados em forma de artigo científico intitulado “Ausência de PPAR-ɑ na próstata: modificações morfológicas e moleculares associadas ao exercício físico aeróbico” será encaminhada para avaliação na revista Metabolism Clinical and Experimental, Qualis/CAPES A1, JCR 86 e Fator de Impacto 5,9. 38 2.1 ARTIGO AUSÊNCIA DE PPAR-ɑ NA PRÓSTATA: MODIFICAÇÕES MORFOLÓGICAS E MOLECULARES ASSOCIADAS AO EXERCÍCIO FÍSICO AERÓBICO RESUMO Objetivo: é verificar a participação do fator de transcrição gênica PPAR-α, como possível regulador nos efeitos protetores do treinamento físico aeróbico através de alterações prostática de camundongos submetidos a dieta padrão e dieta hiperlipídica, analisando as alterações morfológicas e expressão proteica na próstata. Métodos: Foram utilizados deficientes para PPARα (KO) e camundongos controles da linhagem C57BL/6J selvagens (10 semanas de idade). Foram alimentados com dieta padrão, e dieta hiperlipídica (HFD) foi composta por 26% de carboidratos, 59% de lipídios e 15% de proteína. O treinamento físico aeróbio foi realizado em esteira ergométrica a 60% da velocidade máxima, 5 dias por semana, 10m/min durante 60 minutos, por 12 semanas de tratamento. Resultados: A HFD induz alterações teciduais prostáticas, aumento de mastócitos, aumento proteico relacionado com receptores de andrógenos (AR), receptores de glicocorticoides (GR), receptor de morte celular (Fas), linfoma de células B -2 (BCL-2) e BCL-2 associado a proteína X (BAX) interleucina 6 (IL-6), fator de necrose tumoral alfa (TNF-a), fator nuclear kappa B (NF-kB). No entanto, o exercício físico aeróbico modulou a próstata reduzindo a ativação de receptores esteroides, e reduzindo a inflamação, independente da ação de PPARa. Conclusão: Nossos achados sugerem que o exercício físico aeróbico suprime as lesões prostáticas induzidas por HFD, reduzindo a inflamação prostática. Palavras-chave: Inflamação, próstata, exercício físico, PPARa. 39 1. Introdução A obesidade é uma doença multifatorial caracterizada pelo aumento da gordura visceral e subcutânea, também está associada com os níveis hormonais alterados, mudanças metabólicas e teciduais [1,2]. Considerada uma epidemia mundial, com cerca de 2,1 bilhões de pessoas no mundo obesas, principalmente em países desenvolvidos, tornando-se um problema de saúde pública [3], além de ser um percursor da diabetes mellitus tipo 2 promovida pela resistência insulínica [4,5], condições estas que resultam em mudanças no metabolismo de glicose e lipídios causando um elevado nível de insulina em jejum [6]. Obesidade está relacionada ao estilo de vida, a prática insuficiente de atividade física, alcoolismo, tabagismo e consumo constante de gorduras, podem provocar danos teciduais prostáticos [7,8]. Os ácidos graxos, provindos da dieta hiperlipídica (HFD), possuem uma importante função na ativação de vias inflamatórias, contribuindo para a promoção da inflamação crônica tecidual [9], aumentando o índice de gordura corporal, consequentemente levando a obesidade. Estudos relatam que a alta incidência do consumo de lipídios, baixo consumo de nutrientes e prática insuficiente de atividade física, podem estimular as vias pró-inflamatórias, aumentando o risco de lesões prostáticas [10–12]. Alguns dos principais mecanismos envolvidos no crescimento da próstata são potenciais alvos terapêuticos que incluem alterações no estado hormonal, alterações no eixo insulina/IGF/IGFBP, inflamação e alterações no metabolismo resultante da estimulação anormal persistente [6]. Evidencias sugerem que a obesidade pode mudar o eixo Hipotálamos-Hipófise-Gônada e reduzir os níveis circulantes de andrógenos promovendo feedback negativo e aumento do receptor de andrógeno prostáticos [13]. 40 O receptor ativado por proliferador de peroxissoma alfa (PPARa), é da família de receptores hormonais nucleares, expressos principalmente em órgão como o fígado, coração e músculo estriado esquelético. O PPARa atua como fatores de transcrição ativados por ligante responsáveis pela regulação do metabolismo de lipídios e glicose, diferenciação celular e respostas inflamatórias [14,15]. Alterações negativas na atividade desses receptores nucleares possuem um papel chave na hiperplasia prostática benigna e no câncer de próstata [16,17]. O PPARa pode regular vias inflamatórias interferindo inibindo a ativação do fator nuclear kappa B (NF-kB), e consequentemente reduzindo a expressão de fator de necrose tumoral alfa (TNF-a) e interleucina 6 (IL-6) [18,19]. O aumento da resposta inflamatória promove alterações metabólicas, interferindo em diversas alterações teciduais como alguns tipos de canceres [20], induzindo danos no DNA, estimulando o aumento da proliferação celular, inibição da apoptose e desenvolvimento da angiogênese [21,22]. Estudos experimentais em animais e epidemiológicos em humanos sugerem que a prática regular de exercício físico reduz os riscos de danos prostáticos [23,24], embora os mecanismos pelo qual o exercício possa atuar sejam obscuro, as pesquisas demonstram que a prática de exercício físico regular auxilia na progressão de neoplasias malignas [24,25], além de modular o sistema imunológico modificando a secreção de citocinas pró- inflamatórias como NF-kB, IL-6, TNF-a [26]. Com base em estudos do nosso laboratório, sugerimos que o treinamento de força em ratos modula o perfil lipídico e hormonal da próstata de ratos Wistar [27]. Outro achado confirmou que o exercício físico realizado de forma combinada (aeróbio e anaeróbio na mesma sessão de treinamento), foi capaz de reduzir a inflamação prostática em ratos [28]. No entanto, é incipiente os estudos sobre a relação inflamatória e a participação do PPARα principalmente nos mecanismos moleculares e fisiológicos modulados pela ausência ou envolvimento com protocolo de 41 treinamento físico. Contudo o objetivo do presente estudo é verificar a participação do fator de transcrição gênica PPAR-α, como possível regulador nos efeitos protetores do treinamento físico aeróbico através de alterações prostática de camundongos submetidos a dieta padrão e dieta hiperlipídica, analisando as alterações morfológicas e expressão proteica na próstata. Materiais e Métodos Animais e dieta Os procedimentos experimentais deste estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal ICB/USP (Protocolo CEUA 112/13). Camundongos (background C57BL/6J) machos do tipo selvagens (WT) e deficientes em PPARα (KO), mantidos em ciclo claro/escuro de 12h (23± 2ºC), com dieta normal (ração Nuvital da Nuvilab, Colombo, PR) e água ad libitum até o início dos tratamentos (30-40 dias de idade). Os animais deficientes de PPARα foram fornecidos pelo Laboratório de Sinalização Celular do Departamento de Fisiologia e Biofísica da USP. Grupos experimentais Os camundongos WT e KO foram divididos em 8 grupos: animais selvagens alimentados com dieta padrão (SD); animais selvagens alimentados com dieta hiperlipídica (WT-HF); animais selvagens alimentados com dieta hiperlipídica e submetidos ao treinamento físico aeróbio (WT-HFT); animais deficientes em PPAR-α alimentados com dieta hiperlipídica (KO-HF); animais deficientes em PPAR-α alimentados com dieta hiperlipídica e submetidos ao treinamento físico aeróbio (KO- HFT) 42 Os animais foram suplementados com as dietas durante 12 semanas. A dieta hiperlipídica foi composta por 26% de carboidratos, 59% de lipídios e 15% de proteína. Os animais do grupo SD foram mantidos com a dieta balanceada que consiste em 76% de carboidratos, 9% de lipídios e 15% de proteína (Figura 1) Protocolo de treinamento físico aeróbio Foi realizado o teste capacidade máxima para determinar a carga de treinamento, onde os animais aqueceram por 5 minutos na esteira rolante com velocidade de 10 metros/minuto (m/m), início do teste a partir do sexto minuto, aumentando a velocidade em 3m/m a cada minuto. A exaustão se deu por alterações biomecânicas na corrida do animal. Após o teste, o treinamento físico aeróbio foi realizado em esteira ergométrica a 60% da velocidade máxima, 5 dias por semana, 10m/min durante 60 minutos, da 5ª a 12ª semana de dieta [29]. Na 4ª semana de suplementação da dieta, os animais foram adaptados na esteira rolante por 5 dias, e o teste máximo foi realizado na 4ª semana, antes do início do treinamento para determinar a carga máxima, na 8ª semana para o ajuste da carga de trabalho e na 12ª semana para verificar se houveram alterações. Análises antropométricas e perfil metabólico Os animais foram pesados semanalmente durante o estudo para obtenção do peso corporal e ganho de peso, a próstata foi pesada após a coleta para calcular o peso relativo e absoluto. O índice adiposo foi composto pela soma total dos tecidos adiposos retro peritoneal, epidídimal e subcutâneo. Foram coletadas amostras sanguíneas para análises dos níveis de colesterol total, glicose, ácidos graxos livre e triglicerídeo. As lipoproteínas de alta densidade (HDL) e de baixa densidade (LDL) foram analisadas pelo método colorimétrico, obtido da Labtest, Brasil. O colesterol total, níveis de triglicerídeo, ácidos 43 graxos e glicose foram determinados por métodos enzimáticos (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil). Análises histológicas Após 12 semanas de experimento, os animais foram sacrificados, a próstata ventral foi coletada, pesada e processada para análises histopatológicas e imunohistoquímicas. Posteriormente foi fixada em solução bouin, lavadas ao álcool 70%, desidratados, diafanizado, emblocada em paraplástico e cortada em 5 µm de espessura. Para a análise histológica, foi utilizada a coloração de hematoxilina & eosina (H&E). Para a análise de tecido conjuntivo foi utilizada a coloração de tricômico de masson, e a identificação do volume tecidual na próstata ventral foi realizada por análise estereológica de Weibel, (1963). Foram quantificadas 10 secções dos tecidos, ampliados em 40x, por animal, de cada grupo. O software Stepanizer Stereology Tool 1.0 foi utilizado para a quantificação do volume prostático. A quantidade de mastócitos foi realizada em cinco animais por grupo experimental e os valores foram apresentados em células/mm2. Imagens aleatórias de 12 campos por grupo, foram capturadas usando a objetiva de 40x, com cada campo cobrindo uma área de 0,085 mm2 [31]. A análise de glicogênio tecidual prostático foi realizada pela coloração de ácido periódico-Schiff (PAS), dez campos com aumento de 40x por animal foi utilizado para quantificação no software Image-J. As imagens obtidas foram fotografadas pelo microscópio Zeiss AxioCam ECR5s (Zeiss, Munich, Germany). Imunohistoquímica Amostras prostáticas de cinco animais de cada grupo experimental foram utilizadas para as imunomarcações. De acordo com as características de cada antígeno, a 44 recuperação antigênica foi realizada por incubação dos cortes em tampão citrato, PH=6,0 em microondas ou por panela de pressão. Para o bloqueio da peroxidase endógena os cortes foram submetidos a solução de peróxido de hidrogênio ou metanol 3%. Posteriormente, o bloqueio proteico foi utilizado em solução bloqueadora com albumina soro bovino (BSA 3%,) diluido em TBS-T (1% Triton X‐100, 100 mM of Tris, pH 7.4). Na etapa seguinte, as secções foram submetidas aos anticorpos primários específicos AR (clone n-20, Santa Cruz Biotechnology, 816), GR (clone m-20, Santa Cruz Biotechnology, 1004), Fas (clone x-20, Santa Cruz Biotechnology, 1024), IL-6 (clone M- 19, Santa Cruz Biotechnology, 1265), TNF-a (clone N-19, Santa Cruz Biotechnology, 1350), NF-kB p65 (clone A, Santa Cruz Biotechnology, 109) e incubadas em câmera úmida durante a noite em geladeira. Posteriormente, após lavagem com tampão TBS-T, os cortes foram incubados com anticorpo secundário 1:200 anti-rabbit (IgG-HRP: sc- 2030 conjugado), e anticorpo secundário anti-goat (IgG-HRP: sc-2354 conjugado) em temperatura ambiente, revelados com diaminobenzidina (DAB), contracorados com hematoxilina de Harris, e avaliados no fotomicroscópio Zeiss Axiophoto. Os cortes prostáticos foram avaliados através do precipitado acastanhado de DAB, que indica a imunorreatividade dos anticorpos. Quantificação do imunopreciptado A intensidade da imunomarcação dos antígenos BAX, BCL-2, Fas, NF-kB, IL-6 e TNF-a foram examinadas em 10 campos por animal/antígeno, sendo 5 animais por grupo, usando o software ImageJ (versão 1.50i). A marcação celular de AR e GR, foram quantificadas em 1000 células por animal, cinco animais por grupo, assim, o percentual para de células marcadas foi utilizado. 45 Análises estatísticas As análises estatísticas foram realizadas através do software Sigma Plot 12.0, e os dados foram considerados significativos quando p≤0,05, apresentados em média ± erro padrão da média, analisados com teste One Way ANOVA, com pós teste de Tukey, utilizados o software Graph Pism 6 para confecção dos gráficos. Resultados Dados antropométricos e perfil metabólico A eficiência da HFD para induzir obesidade foi confirmada pelo aumento de peso em ambas linhagens. Os animais WT aumentaram o ganho de peso quando comparado aos animais nocaute PPAR-ɑ (Tabela 1). O ganho de peso foi acompanhado pelo aumento do índice de tecido adiposo, colesterol e ácidos graxos livres (Tabela 1), porém os animais WT-HFT apresentaram maior redução de colesterol em relação aos animais do grupo KO- HFT. Não houve diferenças significativas entre o peso da próstata entre os grupos, todavia, o exercício físico foi eficiente na redução do ganho de peso corporal, colesterol, ácidos graxos livres e índice adiposo em ambas linhagens de animais (Tabela 1). Análises Histológicas Nós investigamos o papel do PPARa associado a HFD na morfologia prostática e observamos que os animais dos grupos WT apresentaram epitélio menos espesso, com invaginações acinares e estroma envolta dos ácinos (Fig. 2 A-E). Os animais KO apresentaram maior quantidade de estroma diferente dos grupos WT, e o epitélio mais espesso. Contudo animais WT e KO submetidos ao treinamento apresentaram redução do tamanho epitelial (Fig. 2 A-E). O volume epitelial do grupo WT-HFT foi significativamente menor quando comparado ao grupo SD e WT-HF (Fig. 2U). No 46 entanto, os animais KO apresentaram redução do volume do epitélio associado com a HFD comparado ao grupo KO-HFT e SD (Figura 2U). O volume do estroma não apresentou diferença significativa entre os grupos (Fig. 2V). O volume da luz dos ácinos prostáticos não apresentou diferenças significativas entre os grupos contudo camundongos KO HFT apresentaram maiores valores de luz (Figura 2X). A quantificação de mastócitos localizados no estroma prostáticos demonstrou a diferença entre os camundongos selvagens e deficientes para PPARa. Todos os grupos submetidos a HFD apresentaram aumento da quantidade de mastócitos comparados ao grupo SD (Figura 2W). Os animais KO-HF apresentaram melhores valores de mastócitos comparado a WT-HF (Fig. 2W).O grupo WT-HFT apresentou menores valores de mastócito total quando comparado ao grupo WT-HF (Fig. 2Y). A quantificação de glicogênio prostático, demostrou que animais KO alimentados com HFD apresentaram menores valores de glicogênio citoplasmático comparado ao grupo SD (Fig. 2Y). O grupo KO-HF apresentou menores valore de glicogênio comparado a WT-HF (Fig. 2Y). Expressão dos receptores esteroides, pró e anti-apoptóticos A Fig. 3 demonstra a imunomarcação de receptores de andrógeno na próstata de camundongos WT e KO. Os grupos WT-HF e KO-HF apresentaram maiores expressão de AR comparada ao grupo SD. O grupo WT_HFT e KO-HFT reduziram a expressão de AR quando comparado a WT-HF e KO-HF respectivamente (Fig. 3P). A imunomarcação do receptor de glicocorticoide na próstata foi maior nos grupos WT-HF e KO-HF comparado ao grupo SD, não havendo diferença entre WT e KO, contudo o treinamento físico reduziu a expressão de GR sem diferenças significativas (Fig .3Q). A expressão de BCL-2 foi reduzida nos grupos KO em relação aos grupos WT (Fig. 3AC). O grupo KO-HFT apresentou menores valore de BCL-2 quando comparado 47 ao grupo WT-HFT e SD (FIg. 3 AC). A imunomarcação da proteína BAX foram menos expressas nos grupos KO HF e HFT respectivamente em relação ao grupo WT-HF e HFT (Fig.3 AD). Influência do PPARa associado a HFD e exercício físico na inflamação prostática O grupo WT-HFT reduziu a imunomarcação da citocina IL-6 na próstata comparado ao grupo WT-HF (Fig. 4P). O grupo KO-HF apresentou menores valores de IL-6 comparado ao grupo WT-HF (Fig. 4P). A expressão de IL-6 não apresentou diferenças significativas entre os grupos KO-HF e KO-HFT, mas apresentaram menores valores comparado ao grupo SD (Fig.4P). A Fig.4Q apresenta os valores de expressão de TNF-a na próstata de camundongos WT e KO. O grupo WT-HFT apresentou aumento na expressão de TNF-a quando comparado aos demais grupos (Fig. 4Q). O grupo KO- HFT reduziu a expressão de TNF-a comparado ao grupo KO-HF, mas não houve diferença significativa. A expressão de NF-kB está demonstrado na Fig.4 k-O. A HFD aumentou os valores de NF-kB nos grupos WT-HF e KO-HF quando comparado aos demais grupos (Fig. 4R). O treinamento físico nos grupos WT-HFT e KO-HFT reduziram os valores de NF-kB comparado aos grupos WT-HF, KO-HF e SD, respectivamente (Fig. 4R). Discussão No presente estudo objetivamos entender a ação da dieta hiperlipídica e as consequências da ausência do fator de transcrição gênica PPARα na próstata de camundongos submetidos ao treinamento físico aeróbio. Os principais achados deste estudo foram: 1) os animais KO reduziram o ganho de peso, índice adiposo, melhoras na morfologia prostática, porém aumentou os concentrações de ácidos graxos sanguíneos; 48 2) a dieta hiperlipídica aumentou o ganho de peso, colesterol, índice adiposo e a expressão de AR, GR, Fas e citocinas pró- inflamatórias em ambas linhagens; 3) o treinamento físico aeróbio reduziu o índice do tecido adiposo, os níveis de colesterol total, o peso corporal final dos animais bem como a expressão de AR, GR, IL-6, NF-kB e FAS nas linhagens WT e KO. A obesidade é caracterizada por alterações metabólicas que englobam aumento de peso corporal, índice adiposo, dislipidemias e hiperglicemia [32]. No presente estudo a HFD foi suficiente para induzir a obesidade evidenciado consideravelmente no ganho de peso e índice adiposo comparado aos animais alimentados com dieta padrão. Nós observamos que PPARa KO suprime o peso corporal, índice adiposo e ganho de peso em camundongos alimentado com HFD comparados aos WT. PPARa é predominantemente expresso no fígado, onde desempenha um papel crucial no desenvolvimento das funções fisiológicas, assim como, na manutenção dos ácidos graxos e metabolismo de triglicerídeos [33], este fator de transcrição é supra regulado em condições de estresse e controla as expressões de genes necessários para a β-oxidação de ácidos graxos e redução de ácidos graxo sanguíneos [34]. Desta forma, a administração de agonistas de PPARα aumentam os genes envolvidos na oxidação de ácidos graxos, bem como modulam os níveis de glicose [35,36]. Camundongos KO apresentaram níveis reduzidos de glicogênio prostático em comparação aos grupos SD e WT. O metabolismo energético durante o exercício físico aeróbio é influenciado pela intensidade e frequência do treinamento físico. Nossos resultados demonstraram que o treinamento físico em esteira em camundongos WT e associado a PPARα KO reduziu o ganho de peso e tecido adiposo e colesterol. Dados do presente estudo sugerem que a dieta hiperlipídica pode ser considerada indutor de lesões prostáticas promovendo indução a hiperplasia prostática benigna e 49 demais lesões teciduais [37]. O aumento de estroma e espessura do epitélio está associado a alterações teciduais [1] acarretando diversos problemas na qualidade de vida [38,39]. Em nossos resultados observamos que os animais WT suplementados com HFD tiveram maiores porcentagens de estroma e epitélio em comparação com os animais KO. Refaier et al., [40] correlacionou baixos níveis de PPARα com o crescimento celular prostáticos e redução de caspase 3 clivada. Consideramos desta forma, que o PPARα pode regular processos biológicos que alteram a expressão de genes que promovem alterações histológicas. O PPARα pode ser regulado por glicocorticoides [41], insulina [42], TNF-α [43] e responsivo a andrógenos [44]. No presente estudo, foi possível observar que a HFD promoveu aumento dos receptores de AR e GR prostáticos tanto em camundongos WT quanto em KO. Mariano et al., [45] verificou o aumento da expressão de GR em respostas a HFD foi acompanhada pelo aumento de citocinas inflamatórias. O receptor de glicocorticoide aciona a expressão de proteína de ativação 1 (AP-1) e consequentemente o NF-kB, induzindo o aumento de genes relacionado com a proliferação celular e sobrevivência. Nossos resultados demostram que os grupos WT-HF e KO HF apresentaram maior porcentagem de epitélio e estroma também apresentam maior expressão de BCL-2 e BAX reduzido relacionado com maior expressão de AR e GR. O mecanismos pelo qual o treinamento físico pode mediar atividades anti-androgênicas na próstata ainda é pouco discutido, contudo o exercício físico pode reduzir proliferação e aumentar a apoptose [27,28]. Nesta premissa, conseguimos dimensionar que os efeitos do exercício físico na próstata são independentes da ativação de PPARα. Para confirmar o envolvimento do exercício físico aeróbio na próstata verificamos os efeitos anti-inflamatórios relacionado com a ausência de PPARα. A inflamação tecidual é morfologicamente evidenciada pela quantidade de mastócitos [46] e expressão 50 proteica de citocinas pró-inflamatórias [47]. Evidenciamos o aumento de mastócitos na próstata influenciado pela HFD nos animais WT, enfatizando o potencial inflamatório com aumento da expressão de NF-kB e IL-6. Tem sido mostrado que a ativação de PPARα é um regulador da homeostase de lipídios e inibidor da inflamação [48]. Estudos verificam que concentrações de ácidos graxos e glicose elevadas ativam a via inflamatória ativada por NF-kB em monócitos aumentando a produção de citocinas pró- inflamatórias [49], contudo, o aumento expressivo de PPARα e PPARg podem reduzir a atividade de NF-kB, sugerindo que processos inflamatórios mediados por NF-kB estão relacionados aos fatores de transcrição que regulam o metabolismo de lipídios [50,51]. A ausência de PPARα na próstata reduziu a expressão de NF-kB comparado ao grupo WT- SD (Dados não mostrado) e a HFD potencializou o efeito inflamatório em camundongos WT e KO. Possivelmente a ausência de PPARα promoveu o aumento de genes de PPARg, sugerindo uma compensação do PPARα deficiente nas células prostáticas. Batatinha et al., [52] verificou que a ausência de PPARα no fígado de camundongos foi compensada pelo aumento da expressão PPARg. Este aumento compensatório pode ser estimulado pelos ácidos graxos e fosfolipídios considerados ligantes fisiológicos de PPARg [53]. A literatura relata mecanismos pela qual o exercício físico pode reduzir a inflamação [54–56]. Um fator de grande relevância é o aumento expressivo do coativador 1 alfa do receptor ativado por proliferador de peroxissoma gama (PGC-1α), estimulando a biogênese mitocondrial após treinamento físico aeróbio [57]. O PGC-1α é coativador de PPARα e desta forma regulador da via inflamatória por reduzir a fosforilação de NF- kB [58]. Desta forma, o exercício físico reduz o estresse oxidativo e aumenta a expressão de PGC-1α regulando o fator de transcrição via PPARg em camundongos nocautes para PPARα contribuindo para a redução expressiva de NF-kB e consequentemente IL-6 prostático. Esta discussão ressalta a complexidade da interação metabólica entre a 51 regulação molecular promovida pelo exercício físico e o aumento metabólico de genes lipolíticos e energéticos relacionado a HFD na próstata. Mais estudos necessitam ser empregados para evidenciar os possíveis mecanismo de adaptação molecular relacionado ao exercício físico e sua relevância clínica como potencial terapêutico na próstata. Referências [1] Tewari R, Rajender S, Natu SM, Dalela D, Goel A, Goel MM, et al. Diet, obesity, and prostate health: Are we missing the link. J Androl 2012;33:763–76. doi:10.2164/jandrol.111.015578. [2] Asle Mohammadi Zadeh M, Kargarfard M, Marandi SM, Habibi A. Diets along with interval training regimes improves inflammatory & anti-inflammatory condition in obesity with type 2 diabetes subjects. J Diabetes Metab Disord 2018;17:253–67. doi:10.1007/s40200-018-0368-0. [3] Smith KB, Smith MS. Obesity Statistics. Prim Care Clin Off Pract 2016;43:121–35. doi:10.1016/J.POP.2015.10.001. 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