JOSIANE CECÍLIA DAROLT TRANSCRIÇÃO DE GENES DE ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ EM Diaphorina citri E PREVALÊNCIA BACTERIANA EM D. Citri E EM LARANJEIRA DOCE COM ‘Ca. L. asiaticus’ E ‘Ca. L. americanus’ Orientador: Prof. Dr. Nelson Arno Wulff Araraquara 2021 Tese apresentada ao Instituto de Química da Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia Bibliotecária Responsável: Ana Carolina Gonçalves Bet - CRB8/8315 FICHA CATALOGRÁFICA D224t Darolt, Josiane Cecília Transcrição de genes de 'Candidatus Liberibacter asiaticus' em Diaphorina citri e prevalência bacteriana em D. citri e em laranjeira doce com 'Ca. L. asiaticus' e 'Ca. L. americanus' / Josiane Cecília Darolt. – Araraquara - SP : [s.n.], 2021 144 f. : il. Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Nelson Arno Wulff 1. Transcriptoma. 2. Expressão gênica. 3. Laranja - Doenças e pragas. 4. Infecções bacterianas gram-negativas. 5. Inseto como transmissor de doenças. I. Título. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo http://www.iq.unesp.br/#!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ: 48.031.918/0027-63. CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA TESE: " TRANSCRIÇÃO DE GENES DE ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ EM Diaphorina citri E PREVALÊNCIA BACTERIANA EM D. citri E EM LARANJEIRA DOCE com ‘Ca. L. americanus’ e ‘Ca. L. asiaticus’ “ AUTORA: JOSIANE CECÍLIA DAROLT ORIENTADOR: NELSON ARNO WULFF Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em BIOTECNOLOGIA, pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. NELSON ARNO WULFF (Participaçao Virtual) Departamento de Pesquisa e Desenvolvimento / Fundo de Defesa da Citricultura - FUNDECITRUS - Araraquara Profa. Dra. MARIA CELIA BERTOLINI (Participaçao Virtual) Departamento de Bioquímica e Química Orgânica / Instituto de Química - UNESP - Araraquara Profª. Drª. TAICIA PACHÊCO FILL (Participaçao Virtual) Departamento de Química Orgânica / Instituto de Química - UNICAMP - Campinas Prof. Dr. FERNANDO LUIS CÔNSOLI (Participaçao Virtual) Departamento de Entomologia e Acarologia / Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - USP - Piracicaba Prof. Dr. JESUS APARECIDO FERRO (Participaçao Virtual) Departamento de Tecnologia / Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias - UNESP - Jaboticabal Araraquara, 12 de março de 2021 DocuSign Envelope ID: CCFA26E0-DCB9-46E4-B647-422ACF6572FD http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo http://www.iq.unesp.br/#!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ: 48.031.918/0027-63. DocuSign Envelope ID: CCFA26E0-DCB9-46E4-B647-422ACF6572FD http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ DADOS CURRICULARES Nome: Josiane Cecília Darolt Nome em citações bibliográficas: DAROLT, J. C.; DAROLT, JC; Josiane C. Darolt; JC Darolt Endereço Profissional Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Química de Araraquara. Rua Prof. Francisco Degni, 55 – Quitandinha – Araraquara/SP, CEP 14800-060 Fundo de Defesa da Citricultura – FUNDECITRUS. Av. Dr. Adhemar Pereira de Barros, 201 – Araraquara/SP, CEP 14807-040 Formação Acadêmica / Titulação MESTRADO EM CIÊNCIAS Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais (2016) GRADUAÇÃO EM AGRONOMIA Universidade Federal de Santa Catarina (2014) Publicações DAROLT, JOSIANE CECÍLIA; FASSINI, CAMILA GIÁCOMO; WULFF, NELSON ARNO; DI PIERO, ROBSON MARCELO. Gene expression of salicylic acid and jasmonic acid pathways and photosynthesis parameters of sweet orange trees in response to acibenzolar-S-methyl. Tropical Plant Pathology, v. Jun/20, p. 01-13, 2020. DAROLT, JOSIANE CECÍLIA; ROCHA NETO, ARGUS CEZAR DA; DI PIERO, ROBSON MARCELO. Effects of the protective, curative, and eradicative applications of chitosan against Penicillium expansum in apples. Brazilian Journal of Microbiology (Impresso), v. 126, p. 1-6, 2016. Trabalhos recentes apresentados em congressos internacionais F. M. M. BENTO; J. C. Darolt; B. MERLIN; WULFF, N. A.; F. L. CONSOLI. Candidatus Liberibacter asiaticus gene expression in gut of nimphs and adults of Diaphorina citri. In: Molecular Insect Science, 2019, Barcelona. Anais do Eighth International Symposium on Molecular Insect Science, 2019. Trabalhos recentes apresentados em congressos nacionais DAROLT J.C.; BENTO F.M.M.; MERLIN B.; WULFF N.A.; F.L. CÔNSOLI. Differential gene expression from Candidatus Liberibacter asiaticus during earlier Diaphorina citri bacterium gut colonization. In: 51° Congresso Brasileiro de Fitopatologia, Recife-PE. 2019. DAROLT, J. C.; FASSINI, C. G.; WULFF, N. A.; PIERO, R. M. Gene expression in sweet orange (Citrus sinensis) treated with Acibenzolar-S-Methyl and inoculated with Candidatus Liberibacter asiaticus'. In: 50° Congresso Brasileiro de Fitopatologia, 2017, Uberlândia-MG. Anais do 50º Congresso Brasileiro de Fitopatologia, 2017. Participação em eventos científicos: V Simpósio Mastercitrus. 2017. Araraquara-SP (Simpósio). 50º Congresso Brasileiro de Fitopatologia- Uberlândia-MG. 2017. 2nd São Paulo XanthoMeeting. São Paulo- SP. 2018. (Simpósio). 7° ENCITROS- Encontro Técnico e Científico de Citros. Araraquara-SP. 2019. 51º Congresso Brasileiro de Fitopatologia- Recife-PE- 2019. Formação complementar: Ferramentas Avançadas de Diagnose. (Carga horária: 4h). Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Brasil. Introdução às técnicas de RNAi, CRISPR e análise de microRNAs. (Carga horária: 48h). Universidade de São Paulo, USP, Brasil. Aspectos bioquímicos e moleculares da indução de resistência em plantas a patógenos. Promovido pela CBAB (80 horas). Atuação como docente no curso. UFSC, Florianópolis-SC, Brasil. (Curso). 2017/2018. DEDICATÓRIA Aos meus amados pais Florindo e Rosenilde, e aos meus irmãos Dedico! AGRADECIMENTOS Ao CNPq e ao Fundecitrus pela concessão das bolsas durante o andamento do Doutorado. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio financeiro (2015/07011-3). À Universidade Estadual Paulista e ao Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Aos meu orientador, o professor Nelson Arno Wulff, pela disponibilidade, pela paciência e valiosos ensinamentos. Ao Fundecitrus pela oportunidade de desenvolvimento deste trabalho. Também a equipe do laboratório do Departamento de Diagnóstico de Doenças e Biotecnologia, Laboratório de Ecologia Química e Comportamento de Insetos e Equipe de doenças bacterianas, sem o apoio técnico e amizade de vocês não seria possível à realização desse trabalho. À banca examinadora. Ao meu parceiro e companheiro de vida Haroldo X. L. Volpe. Agradeço a todos que de alguma forma contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigada! TRANSCRIÇÃO DE GENES DE ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ EM Diaphorina citri E PREVALÊNCIA BACTERIANA EM D. citri E EM LARANJEIRA DOCE COM ‘Ca. L. asiaticus ’E ‘Ca. L. americanus’ RESUMO A produção de laranja doce do Brasil se destaca no cenário mundial. Dentre as diversas doenças que acometem a cultura, a de maior importância é o Huanglongbing (HLB), que tem como agentes causais bactérias gram- negativas restritas aos vasos do floema do gênero Candidatus Liberibacter spp.; O psilídeo asiático dos citros Diaphorina citri, vetor de Ca. Liberibacter asiaticus (Las) e Ca. L americanus (Lam), está disseminado no Brasil e exige esforços intensivos e conjuntos para o seu controle. A não existência de variedades comerciais de citros resistentes ao HLB, nem medidas curativas para o manejo desta doença impactam negativamente a produção, resultando em perdas econômicas, bem como o aumento dos custos de produção. O manejo do inseto vetor e da fonte de inóculo é viável, mas dependente de ações internas e externas à propriedade. Uma abordagem factível para o controle da doença é o uso de biotecnologia para gerar plantas geneticamente modificadas com resistência a D. citri e/ou à bactéria. Para isso, faz-se necessário gerar informações sobre genes alvos a serem empregados em estratégias biotecnológicas contra ambos os organismos, bactéria ou inseto vetor. No presente trabalho foi reportado 95% dos genes expressos por Las durante o processo inicial da colonização da bactéria em D. citri além da presença de genes do profago PJXGC-3 na estirpe brasileira de Las. Além disso foi analisada a aquisição de Las e Lam pelo inseto em condição de infecção simples, sequencial, bem como durante a fase assintomática da doença em laranjeira doce. Finalmente foi demonstrado que Las se sobressai à Lam durante a aquisição pelo psilídeo e que ocorre a prevalência de Las em relação a Lam em laranjeira doce com dupla infecção bacteriana. Paravas chaves: Huanglongbing; Liberibactérias; psilídeo asiático dos citros, profagos. TRANSCRIPTION OF GENES OF ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ IN Diaphorina citri AND BACTERIAL PREVALENCE IN D. citri AND IN SWEET ORANGE PLANTS WITH 'Ca. L. asiaticus ’AND ‘Ca. L. americanus’ ABSTRACT Brazil's sweet orange production stands out on the world scenario. Among the various diseases that affect the citriculture, the most important is Huanglongbing (HLB), whose causative agents are gram-negative bacteria of the genus Candidatus Liberibacter spp and restricted to phloem vessels; The Asian Citrus Psyllid (ACP) Diaphorina citri, vector of Ca. Liberibacter asiaticus (Las) e Ca. L americanus (Lam), is widespread in Brazil and requires intensive and joint efforts for its control. The absence of commercial varieties of citrus resistant to HLB, nor curative measures for the management of this disease, negatively impact the citrus production, resulting in economic losses, as well as in increases on production costs. The management of the insect vector and the inoculum source is possible, but dependent on internal and external actions to the management of citrus groves. A feasible approach to the disease control is the use of biotechnology to generate genetically modified plants resistant to ACP and/or bacteria. For that, it is necessary to generate information related to target genes to be used in biotechnological strategies against both organisms, bacteria or ACP. In this study, we report 95% of the genes expressed by Las during the initial process of bacterial colonization in ACP, as well as the presence of prophage PJXGC-3 key genes in the Brazilian Las strain. Moreover, we analyzed ACP acquisition of Las and Lam under simple and sequential infection, as well as during the asymptomatic phase of the disease in sweet orange plants. Finally, we demonstrated that Las stands out Lam during ACP bacterial acquisition and that the prevalence of Las in relation to Lam occurs in sweet orange plants with double bacterial infection. Key words: Huanglongbing; Liberibacteria; Asian Citrus Psyllid, prophages. LISTA DE FIGURAS INTRODUÇÃO Figura 1. Levantamento do progresso temporal da incidência de plantas com sintomas de HLB no estado de São Paulo.........................................................22 Figura 2. Fases do desenvolvimento de D. citri: ovo, ninfa (1º a 5º instares) e adulto.................................................................................................................23 Figura 3. Proporção de amostras de citros positivas para Ca. L. asiaticus (Las), Ca. L. americanus (Lam), Fitoplasma do grupo 16SrIX e do grupo 16SrIII no serviço de diagnóstico de HLB (103 mil amostras, 2004 a 2020) .......................28 Capítulo 2 - O GENOMA DE Candidatus Liberibacter asiaticus É ALTAMENTE TRANSCRITO QUANDO INFECTA O INTESTINO DE Diaphorina citri Figura 1. Diagrama de Venn dos genes de Candidatus Liberibacter asiaticus com leituras mapeadas (isolado JXGC, NZ_CP019958.1) em amostras de intestinos de Diaphorina citri após 1/2 (Las I), 3/4 (Las II), ou 5/6 (Las III) dias de acesso à aquisição.............................................................................................56 Figura 2. Abundância de leituras mapeadas para genes de Candidatus Liberibacter asiaticus (isolado JXGC, NZ_CP019958.1) expressos em amostras de intestinos de Diaphorina citri após 1/2 (Las I) (A), 3/4 (Las II) (B), ou 5/6 (Las III) (C) dias de acesso à aquisição.....................................................................58 Figura 3. Distribuição dos agrupamentos de grupos ortólogos em Candidatus Liberibacter asiaticus (isolado JXGC, NZ_CP019958.1) em amostras de intestinos de Diaphorina citri após 1/2 (Las I) (A), 3/4 (Las II) (B), ou 5/6 (Las III) (C) dias de acesso a aquisição...........................................................................59 Figura 4. Nível de expressão de genes ao longo do cromossomo de Candidatus Liberibacter asiaticus. Agrupamentos flagelares (COG N: I, II e III), “Família Flp do tipo IVb de pilina” (COG U), transferases (COG M), proteínas ribossomais e NADH-quinonas são individualmente mostrados em sua posição no cromossomo. Abundância de leitura (log2FPKM) obtidas de bibliotecas de intestinos de Diaphorina citri 5/6 dias após acesso à aquisição e mapeadas na linhagem JXGC (NZ_CP019958.1) ...................................................................61 Figura 5. Leituras mapeadas nos profagos SC1 (tipo 1), SC2 (tipo 2) do isolado Las UF506 (HQ377374) e PJXGC-3 (tipo 3) do isolado Las JXGC (KY661963). Setas azuis indicam genes mapeados em pelo menos duas bibliotecas. Setas vermelhas indicam genes sem leituras mapeadas. Asteriscos indicam o gene com maior número de leituras mapeadas. O quadro de linhas pontilhadas (preto) indica a região altamente conservada de genes tardios entre os profagos de Las. O nível de expressão foi obtido de bibliotecas de intestinos de Diaphorina citri após 5/6 dias (Las III) de alimentação em laranjeiras doce infectadas com Las.....................................................................................................................63 Capítulo 3 - Candidatus Liberibacter asiaticus E Candidatus Liberibacter americanus EM COINFECÇÃO EM CITROS E AQUISIÇÃO POR Diaphorina citri Figura 1. Esquema da instalação e condução dos experimentos de aquisição de Candidatus Liberibacter americanus por Diaphorina citri em plantas de laranjeira doce com folhas maduras, sintomáticas e qPCR positivas para Lam. DAA: dias de acesso à aquisição. ......................................................................................94 Figura 2. Esquema representativo dos experimentos de aquisição de Ca. L americanus (Lam) por Diaphorina citri criados em plantas fontes para Ca. L. asiaticus e transferidas para plantas com Lam com fluxos vegetativos naturais contendo predominantemente folhas maduras sintomáticas. ............................96 Figura 3. Esquema representativo dos ensaios de aquisição de Candidatus L. americanus (Lam) por Diaphorina citri criados em plantas positivas para Ca. L. asiaticus e transferidas para plantas positivas para Lam com brotações jovens induzidos por poda manual. Avaliação das gerações de F1 e F2 de Diaphorina citri. ....................................................................................................................98 Figura 4. Esquema da instalação e condução dos experimentos de aquisição de Diaphorina citri nas gerações F1 e F2, a partir de psilídeos criados em plantas positivas para Ca. L americanus e transferidos para plantas sadias...................99 Figura 5. Esquema da instalação e condução dos experimentos de aquisição de psilídeos nas gerações F1 e F2, a partir da criação dos insetos em plantas positivas para Ca. L asiaticus e transferidos para plantas sadias.....................100 Figura 6. Esquema da instalação e condução dos experimentos de aquisição de psilídeos nas gerações F1 e F2, a partir da criação dos insetos em plantas positivas para Ca. L asiaticus e Ca. L. americanus. .........................................102 Figura 7. Porcentagem média (A) e Ct médio (B) de Candidatus Liberibacter americanus em adultos de Diaphorina citri com 12 dias de acesso à aquisição (DAA) em planta fonte de Ca. L. americanus com folhas maduras e sintomáticas. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Kruskal Wallis/Dunn a 5% de probabilidade. ................................................................107 Figura 8. Porcentagem (A e C) e Ct médio (B e D) no experimento 2.1 (A e B) e no experimento 2.2 (C e D), de Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) e Candidatus Liberibacter americanus (Lam) em adultos de Diaphorina citri gerados em plantas fonte de Las (geração F1) e posteriormente confinados e mantidos por 12 dias em planta fonte de Lam contendo folhas maduras e sintomáticas. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Kruskal Wallis/Dunn a 5% de probabilidade...................................................109 Figura 9. Porcentagem (A e C) e Ct médio (B e D) de Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) e Candidatus Liberibacter americanus (Lam) em adultos de Diaphorina citri criados (geração F1) em plantas fonte de Ca. L. asiaticus e posteriormente confinados e mantidos por 12 dias em planta fonte de Ca. L americanus contendo folhas maduras e sintomáticas (A e B). Psilídeos adultos da geração F2 (C e D) que tiveram acesso à aquisição assintomática (experimento 3.1). Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Kruskal Wallis/Dunn a 5% de probabilidade.............................................111 Figura 10. Porcentagem (A e C) e Ct médio (B e D) de Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) e Candidatus Liberibacter americanus (Lam) em adultos de Diaphorina citri criados (geração F1) em plantas fonte de Ca. L. asiaticus e posteriormente confinados e mantidos por 12 dias em planta fonte de Ca. L americanus contendo folhas maduras e sintomáticas (A e B). Psilídeos adultos da geração F2 (C e D) que tiveram acesso à aquisição assintomática (experimento 3.2). Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Kruskal Wallis/Dunn a 5% de probabilidade.............................................113 Figura 11. Porcentagem (A) e Ct médio (B) de Candidatus Liberibacter americanus (Lam) em adultos de Diaphorina citri criados (geração F1) em plantas fonte de Ca. L. americanus’ e posteriormente confinados e mantidos por 12 dias em brotos de plantas sadias. Psilídeos adultos da geração F2 que tiveram acesso à aquisição assintomática (experimento 4). Médias seguidas de mesma letra, em cada experimento, não diferem entre si pelo teste Wilcoxon- Mann-Whitney a 5% de probabilidade..............................................................115 Figura 12. Porcentagem (A) e Ct médio (B) de ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ (Las) em adultos de Diaphorina citri criados (geração F1) em planta fonte de Ca. Liberibacter asiaticus e posteriormente confinados e mantidos por 12 dias em brotos de plantas sadias. Psilídeos adultos da geração F2 que tiveram acesso à aquisição assintomática (experimento 5). Médias seguidas de mesma letra, em cada experimento, não diferem entre si pelos testes Kruskal Wallis/Dunn (B) e Wilcoxon-Mann-Whitney (D) a 5% de probabilidade........................................116 Figura 13. Porcentagem (A e C) e Ct médio (B e D) de Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) e Candidatus Liberibacter americanus (Lam) em adultos de Diaphorina citri criados (geração F1) em plantas fonte em ramos com coinfecção de Ca. L. asiaticus e Ca. L. americanus e posteriormente confinados e mantidos por 12 dias em plantas sadias contendo brotos (A e B). Psilídeos adultos da geração F2 (C e D) que tiveram acesso à aquisição assintomática (experimento 6). Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste Kruskal Wallis/Dunn a 5% de probabilidade..................................................................118 Figura 14. Curva da evolução temporal da aquisição de Candidatus Liberibacter americanus por Diaphorina citri na geração F1. NS= Valores médios de Ct não significativos por Kruskal Wallis/Dunn a 5% de probabilidade..........................119 Figura 15. Porcentagem de prevalência das Liberibactérias em plantas de laranjeira doce ao longo de 3 anos no experimento I (A) e 2,5 anos no experimento II (B). nd = Não detectado; Lam Candidatus Liberibacter americanus e Las: Candidatus Liberibacter asiaticus. ........................................................122 LISTA DE TABELAS Capítulo 2 - O GENOMA DE Candidatus Liberibacter asiaticus É ALTAMENTE TRANSCRITO QUANDO INFECTA O INTESTINO DE Diaphorina citri Tabela 1. Concentração de RNA (ng/µL) e qualidade (260/280) mensuradas espectrofotometricamente e detecção de Diaphorina citri (DC) e Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) (HLBaspr) por qPCR em amostras de RNA preparadas a partir de intestinos de D. citri, antes do tratamento com DNAse e sequenciamento das bibliotecas. Amostras de intestinos dissecados de D. citri criados em plantas de citros sadias (H) ou Las em diferentes períodos acessos de aquisição (PAA) (Las I, II e III). ......................................................................52 Tabela 2. Mapeamento de leituras de Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) contra o isolados JXGC (NZ_CP019958.1) em bibliotecas sequenciadas a partir de amostras intestinos de Diaphorina citri que se alimentaram em brotos de citros sadios (H) ou Las positivos, em diferentes períodos de acesso a aquisição (PAA) (Las I, II e III). .....................................................................................................54 Capítulo 3 - Candidatus Liberibacter asiaticus E Candidatus Liberibacter americanus EM COINFECÇÃO EM CITROS E AQUISIÇÃO POR Diaphorina citri Tabela 1. Porcentagem e Ct médio de Candidatus Liberibacter americanus em fluxos vegetativos de laranjeira-doce entre os estádios de desenvolvimento V1 a V6. ...................................................................................................................120 Tabela 2. Médias de Ct das Liberibactérias em amostragens semestrais nos ramos ao longo de 36 meses no experimento I e 30 meses no experimento II, em laranjeiras doce sadia, fonte de Candidatus Liberibacter americanus, plantas sadias inoculadas por psilídeos infectivos com Ca. L. asiaticus e plantas fonte de Ca. L. americanus que foram inoculadas por psilídeos infectivos com Ca. L. asiaticus e coinfectadas, gerando ramos com infecção simples e ramos com dupla infecção (Ca. L. americanus e Ca. L. asiaticus). ....................................125 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Ct - do inglês ‘Cicle threshold’, ou ciclo limiar PCR - Reação em cadeia da polimerase qPCR – PCR quantitativo em tempo real RNA - Ácido ribonucleico DNA - Ácido desoxirribonucleico cDNA - fita de DNA complementar ORF - fase de leitura aberta (do inglês ‘open reading frame’) DNAse - Enzima que degrada o DNA PAA - Período de acesso à aquisição ACP- psilídeo asiático dos citros; do inglês: ‘Asian citrus psyllid’ DAA - Dias após a aquisição PAI - período de acesso à inoculação PAA - período de acesso à aquisição HLB - Huanglongbing Ca. L. asiaticus ou Las – Candidatus Liberibacter asiaticus Ca. L. americanus ou Lam – Candidatus Liberibacter americanus SUMÁRIO 1- INTRODUÇÃO ........................................................................................... 19 1.1 A citricultura brasileira ................................................................................ 19 1.2 Huanglongbing (HLB) ................................................................................. 19 1.3 O inseto vetor Diaphorina citri .................................................................... 22 1.4 Interação entre as Liberibactérias do HLB e seus hospedeiros ................. 27 1.5 Profagos e Liberibactérias .......................................................................... 29 1.6 Atualidade e perspectivas para o manejo do HLB e de Diaphorina citri ..... 31 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 34 CAPÍTULO 2 .................................................................................................... 43 O GENOMA DE Candidatus Liberibacter asiaticus É ALTAMENTE TRANSCRITO QUANDO INFECTA O INTESTINO DE Diaphorina citri .......... 43 RESUMO.......................................................................................................... 43 ABSTRACT ...................................................................................................... 44 1 INTRODUÇÃO ........................................................................................... 45 2 MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................... 47 2.1 Obtenção das amostras ...................................................................... 47 2.2 Extração do RNA total das amostras de intestino do psilídeo, detecção da presença de Las e tratamento com DNAse ............................................. 48 2.3 Enriquecimento do mRNA das amostras e avaliação da qualidade .... 49 2.4 Sequenciamento do cDNA via plataforma Illumina ................................. 49 2.5 Análise do sequenciamento e mapeamento das leituras no genoma de referência ...................................................................................................... 50 3 RESULTADOS .......................................................................................... 51 3.1 Presença de Candidatus Liberibacter asiaticus em amostras de intestino do psilídeo Diaphorina citri ............................................................................ 51 3.2 Mapeamento das leituras de Candidatus Liberibacter asiaticus ............. 53 3.3 Mapeamento dos profagos SC1, SC2 e PJXGC-3 de Las no intestino de ACP ............................................................................................................... 62 4 DISCUSSÃO ................................................................................................. 64 5 CONCLUSÕES ............................................................................................. 74 REFERÊNCIAS ................................................................................................ 75 CAPÍTULO 3 .................................................................................................... 84 Candidatus Liberibacter asiaticus E Candidatus Liberibacter americanus EM COINFECÇÃO DE LARANJEIRA DOCE ......................................................... 84 E NA AQUISIÇÃO POR Diaphorina citri .......................................................... 84 RESUMO.......................................................................................................... 84 ABSTRACT ...................................................................................................... 85 1 INTRODUÇÃO .............................................................................................. 86 2 OBJETIVOS .................................................................................................. 89 2.1 Objetivo geral .......................................................................................... 89 2.2 Objetivos específicos: ............................................................................. 89 3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................. 89 3.1 Condições dos ensaios de aquisição em plantas sintomáticas e plantas assintomáticas .............................................................................................. 90 3.1.1 Criação de Diaphorina citri ................................................................... 90 3.1.2 Plantas fonte com Candidatus Liberibacter asiaticus ou Ca. L. americanus ................................................................................................ 91 3.1.3 Plantas de laranja doce para a aquisição assintomática de Candidatus Liberibacter asiaticus ou de Ca. L. americanus com a progênie infectiva de Diaphorina citri ........................................................................................... 91 3.1.4 Detecção de Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. L. americanus em Diaphorina citri ........................................................................................... 92 3.1.5 Condições ambientais dos ensaios de aquisição de Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. L. americanus por Diaphorina citri e nomenclatura para classificação da geração dos psilídeos ....................... 93 3.2 Ensaios de aquisição de Candidatus Liberibacter americanus e Ca. L. asiaticus por Diaphorina citri ......................................................................... 93 3.2.1 Experimento 1: Aquisição de Candidatus Liberibacter americanus por adultos sadios de Diaphorina citri .............................................................. 94 3.2.2 Experimento 2: Aquisição sequencial de Candidatus Liberibacter americanus por uma progênie de Diaphorina citri gerada em planta fonte de Ca. L. asiaticus .......................................................................................... 95 3.2.3 Experimento 3: Aquisição sequencial de Candidatus Liberibacter americanus por uma progênie de Diaphorina citri gerada em planta fonte de Ca. L. asiaticus e aquisição assintomática de Ca. L. asiaticus e/ou Ca. L. americanus pela progênie F2 de D. citri .................................................... 96 3.2.4 Experimento 4: Aquisição de Candidatus Liberibacter americanus por uma progênie de Diaphorina citri gerada em planta fonte de Ca. L. americanus e aquisição assintomática de Ca. L. americanus pela progênie F2 de D. citri .............................................................................................. 98 3.2.5 Experimento 5: Aquisição de Candidatus Liberibacter asiaticus por uma progênie de Diaphorina citri gerada em planta fonte de Ca. L. asiaticus e aquisição assintomática de Ca. L. asiaticus pela progênie F2 de D. citri 100 3.2.6 Experimento 6: Aquisição de Liberibacter por uma progênie de Diaphorina citri gerada em planta fonte com Candidatus Liberibacter asiaticus e Ca. L. americanus e aquisição assintomática de Liberibacter pela progênie F2 de D. citri.............................................................................. 101 3.2.7 Experimento 7: Curva de aquisição de ‘Candidatus Liberibacter americanus’ pela progênie de Diaphorina citri desenvolvida em planta fonte ao longo do tempo ................................................................................... 103 3.2.8 Análise dos dados........................................................................... 104 3.3 Amostragem de fluxos vegetativos de laranjeira doce positivas para Candidatus Liberibacter americanus ........................................................... 104 3.4 Prevalência de Candidatus Liberibacter americanus e Candidatus Liberibacter asiaticus em plantas fonte de Ca. L. americanus, após inoculação de Ca. L. asiaticus por progênie de Diaphorina citri gerada em planta fonte de Ca. L. asiaticus ................................................................... 105 4 RESULTADOS ............................................................................................ 107 4.1 Ensaios de aquisição de Candidatus Liberibacter americanus e Ca. L. asiaticus por Diaphorina citri ....................................................................... 107 4.1.1 Experimento 1: Aquisição de Candidatus Liberibacter americanus por adultos sadios de Diaphorina citri em laranjeira-doce ............................. 107 4.1.2 Experimento 2: Aquisição cruzada de Candidatus Liberibacter americanus por Diaphorina citri: criação em laranjeiras-doce positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus e transferidos para fluxos vegetativos naturais de laranjeiras-doce positivas para Ca. L. americanus: análise da geração F1 ............................................................................................... 108 4.1.3 Experimento 3: Aquisição cruzada de Candidatus Liberibacter americanus por Diaphorina citri: criação em laranjeiras-doce positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus e transferência para brotações induzidas por poda em laranjeiras doce positivas para Ca. L. americanus: análise das gerações F1 e F2 ..................................................................................... 110 4.1.4 Experimento 4: Aquisição por Diaphorina citri sadio em brotações induzidas (poda manual) de laranjeiras-doce positivas para Candidatus Liberibacter americanus: análise das gerações F1 e F2.......................... 114 4.1.5 Experimento 5: Aquisição por Diaphorina citri sadio em brotações induzidas de laranjeiras-doce positivas para Candidatus Liberibacter asiaticus: análise das gerações F1 e F2 .................................................. 115 4.1.6 Experimento 6: Aquisição por Diaphorina citri sadio em brotações e fluxos vegetativos naturais de laranjeiras-doce com dupla infecção (Candidatus Liberibacter asiaticus e Candidatus Liberibacter americanus): análise das gerações F1 e F2 .................................................................. 117 4.1.7 Experimento 7: Curva de evolução da aquisição de Candidatus Liberibacter americanus na geração F1 de Diaphorina citri ..................... 119 4.2 Amostragem temporal de fluxos vegetativos de laranjeira doce positivas para Candidatus Liberibacter americanus ................................................... 120 4.3 Prevalência de Candidatus Liberibacter americanus e Candidatus Liberibacter asiaticus em laranjeiras doce inicialmente inoculadas com borbulhas Ca. L. americanus e posteriormente inoculadas com Ca. L. asiaticus por meio de fitofagia de adultos de Diaphorina citri ..................... 121 5 DISCUSSÃO ............................................................................................... 126 6 CONCLUSÕES ........................................................................................... 137 REFERÊNCIAS .............................................................................................. 138 APÊNDICES ................................................................................................... 143 19 1- INTRODUÇÃO 1.1 A citricultura brasileira O suco de laranja é uma das mais importantes commodities do Brasil, (NEVES, 2016). O cinturão citrícola, que compreende o estado de São Paulo e o Triângulo Mineiro, concentra a maior região produtora de laranja e exportadora de suco do país. Fatores como o desenvolvimento industrial, a proximidade com os portos e centros de pesquisa contribuíram para o desenvolvimento da atividade nesta região. A cadeia citrícola paulista possui alta capacidade de produção, bem como eficiência nos processos, com 408 mil hectares de pomares (FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA, 2020a), representando 34% da produção de laranja do mundo. Esses dados torna o Brasil o maior exportador de suco de laranja, responsável por 85% das exportações globais deste produto, além disso, atende a um pequeno, porém crescente mercado interno (NEVES & TROMBIN, 2017). No agronegócio brasileiro, o setor citrícola destaca-se por gerar um produto interno bruto (PIB) de 6,5 bilhões de dólares em todos os elos de sua cadeia produtiva e empregar direta e indiretamente 230 mil pessoas (NEVES et al., 2015). Entretanto, a concentração dos pomares citrícolas acarretou na maior incidência de pragas e doenças, com impacto econômico e social, assim como no desenvolvimento da pesquisa científica e avanços tecnológicos. 1.2 Huanglongbing (HLB) Dentre as diversas pragas e doenças que acometem a cultura, o Huanglongbing (HLB), conhecido também como greening, é considerado a doença mais devastadora e a maior ameaça à produção de citros. Devido ao alto 20 potencial de disseminação e por não haver cura para a doença, gera perdas na produção de frutas e aumenta o custo do manejo, agravado por não haver variedades comerciais de citros resistentes a doença (BOVÈ, 2006; LOPES & FRARE, 2008; BASSANEZI et al., 2020; ZHOU, 2020; GRAHAM et al., 2020). Embora o HLB seja uma doença cítrica de relato recente no estado de São Paulo, em 2004, e na Flórida em 2005 (COLETA-FILHO et al., 2004; HALBERT, 2005), essa doença tem ocasionado prejuízos e colocado em risco a atividade citrícola (BOVÈ, 2006), por perdas de até 100% na produtividade de pomares comerciais (BASSANEZI et al., 2012). O HLB está associado a bactérias gram-negativas e restritas ao floema, pertencentes ao grupo das alfa-proteobactérias e ao gênero Candidatus Liberibacter spp. (LAFLÉCHE & BOVÉ, 1970; JAGOUEIX et al., 1994). Foram identificadas três espécies associadas ao HLB: Candidatus Liberibacter africanus (Laf) – restrita ao continente africano, Candidatus Liberibacter asiaticus (Las) - cosmopolita e Candidatus Liberibacter americanus (Lam) - restrita ao Brasil (TEIXEIRA et al., 2005a; BOVÉ, 2006; TEIXEIRA et al., 2010). No mais, fitoplasmas estão associados aos sintomas de HLB, porém com ocorrência ocasional (TEIXEIRA et al., 2008; CHEN et al., 2009; WULFF et al., 2019). No campo, as plantas doentes apresentam inicialmente sintomas em um ou mais ramos, sendo mais comum sua observação no outono e início do inverno (BOVÉ, 2006. As folhas presentes nestes ramos perdem a coloração verde e apresentam-se parcialmente amareladas e verdes, sintoma denominado ‘mosqueado’, que é o sintoma mais característico da doença. O mosqueado tem sido observado em todos os locais onde a doença foi descrita (BOVÉ, 2006; BELASQUE JUNIOR et al., 2010). Posteriormente, as plantas podem apresentar 21 outros sintomas como folhas de ramos sintomáticos curvadas, de tamanho reduzido, nervuras salientes e escurecidas. Os frutos produzidos em ramos sintomáticos possuem tamanho reduzido, são assimétricos e de maturação irregular, caem prematuramente, com uma redução da produção de até 100% dependendo da proporção da copa que é afetada (BASSANEZI et al, 2012). Outra característica que pode ser observada nos frutos é a presença de sementes abortadas e vasos escurecidos (BOVÉ, 2006; BELASQUE JUNIOR et al., 2010). O primeiro levantamento oficial da incidência da doença no Brasil foi realizado no ano de 2008 e mostrou que 0,61% das árvores estavam infectadas. Esse número foi aumentando ao longo dos anos, e em 2015 atingiu 17,89% (FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA, 2020b). Entre 2015 e 2020, a curva de progressão do HLB foi se estabilizando devido ao aprendizado do setor em relação ao manejo do inseto vetor, tais como: monitoramento da presença do inseto, inspeção e erradicação de plantas doentes, pulverizações frequentes na propriedade, ações externas de pulverização e erradicação de plantas, manejo regional, entre outros (BASSANEZI et al., 2020). De acordo com o levantamento realizado em 2020, a doença está presente em 20,87% das laranjeiras do cinturão citrícola de São Paulo e triângulo mineiro (FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA, 2020b) (Figura 1). 22 Figura 1. Levantamento do progresso temporal da incidência de plantas com sintomas de HLB no estado de São Paulo. (Fonte: Fundecitrus, 2020) 1.3 O inseto vetor Diaphorina citri As bactérias associadas ao HLB são transmitidas entre plantas cítricas pelo psilídeo-asiático-dos-citros (ACP) Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae), inseto vetor de Ca. L. asiaticus (CAPOOR et al., 1967; CHEN et al., 1973) e Ca. L. americanus (YAMAMOTO et al., 2006) e por Trioza erytreae Del Guercio (Hemiptera: Triozidae), inseto vetor de Ca. L. africanus (MCCLEAN & OBERHOLZER, 1965). Psilídeos são hemimetábolos: os insetos adultos podem medir cerca de 2 a 3 mm de comprimento, possuindo asas amarronzadas. Os ovos têm formato oval e coloração amarela clara, quando recém depositados. Os psilídeos passam por cinco instares para completar o seu ciclo de desenvolvimento e as ninfas são 23 achatadas e de coloração laranja-amareladas (FRENCH et al., 2001), em ambiente controlado, o tempo decorrente entra as fases ninfais até que o psilídeo chegue na fase adulta é de aproximadamente 19 dias. (Figura 2). Figura 2. Fases do desenvolvimento de D. citri: ovo, ninfa (1º a 5º instares) e adulto. (Fonte: Fundecitrus, 2021) Os estádios iniciais são menos móveis, movendo-se somente quando perturbados ou quando há competição por espaço, porém as ninfas mais desenvolvidas e os adultos deslocam-se com maior facilidade e são alados (HALL et al., 2012). As fêmeas de D. citri, após desenvolvimento de seu aparelho reprodutor, tornam-se férteis por toda sua vida, com intensidades de oviposição variadas, dependendo da temperatura, umidade relativa (UR) do ambiente e planta hospedeira (HALL et al., 2012; NAVA et al., 2007). De forma geral, as posturas de fêmeas jovens iniciam-se um ou dois dias após o acasalamento (WENNINGER & HALL, 2008). Em todas as fases de vida os psilídeos produz uma substância excretora branca, conhecida como ‘honey-dew’ (TSAI & LIU, 2000). 24 A ocorrência de D. citri é reportada no Brasil desde a década de 1940 (LIMA, 1942), enquanto era considerada uma praga secundária para a citricultura e seu controle era realizado apenas sob altas infestações. O primeiro relato de HLB no Brasil foi em julho de 2004 no município de Araraquara, São Paulo (COLETTA-FILHO et al., 2004; TEIXEIRA et al., 2005a) e D. citri tornou- se uma das principais pragas da citricultura. Está presente nos pomares durante o ano todo, com pico populacional nos períodos quentes e úmidos e durante os fluxos vegetativos das plantas hospedeiras da família Rutaceae, principalmente plantas de citros e murta (Murraya paniculata (L.) Jack (Rutaceae)) (YAMAMOTO et al., 2001), o que proporciona condições adequadas para reprodução desse inseto vetor, que ocorre preferencialmente em brotos (CIFUENTES-ARENAS et al., 2018). A disseminação do HLB nos pomares brasileiros e outros países está associada a dois mecanismos espaciais de dispersão do psilídeo, a curtas e longas distâncias. A dispersão a curtas distâncias, em um raio de aproximadamente 50 metros, ocorre infecções secundárias da doença, ou seja, dentro do mesmo talhão e entre plantas próximas. Já a longas distâncias (até 3,5 km da fonte de inóculo) ocorrem infecções primárias do HLB, ou seja, transmissão da doença por psilídeos infectivos oriundos de fontes externas à propriedade (BASSANEZI et al., 2020). A infecção primária é a mais preocupante para os produtores de citros, haja visto que, as propriedades comerciais que adotam o manejo do HLB corretamente realizam o controle do inseto vetor em intervalos máximos de 15 dias, período este inferior ao ciclo ovo-adulto de D. citri. Esse manejo impede que gerações sucessivas do inseto ocorram no interior da propriedade, 25 reduzindo a infecção secundária (BASSANEZI et al., 2013). TOMASETO et al. (2015) verificou que a presença de brotações nas plantas cítricas resulta em menor dispersão de D. citri, devido ao fato de ser o local adequado para alimentação e oviposição, contudo, na ausência de brotações, o inseto tende a se dispersar por distâncias até três vezes maiores. Uma característica importante em relação ao comportamento de dispersão do psilídeo é a maior concentração do inseto nas plantas da periferia dos pomares e talhões, que se reduz gradativamente à medida que se avança para o interior dos talhões (ASATO, 2018). BOINA et al. (2009) quantificou a dispersão de D. citri por meio da técnica de imunomarcadores, e observaram que do total de insetos migrantes capturados em armadilhas adesivas amarelas, 60 a 66% foram capturados nas plantas localizadas na primeira linha de plantio presente na borda de talhões vizinhos, 19 a 24% a 40 m da borda e 10 a 21% a 90 m da borda. Estes gradientes na população de psilídeo e na infestação de brotos, demonstram resultados semelhantes ao estudo de SÉTAMOU & BARTELS (2015), que encontraram maiores níveis de infestação em brotos assim como maiores densidades populacionais do inseto nas plantas da periferia dos talhões, seguidas pelas plantas adjacentes a cerca de 7 m de distância, reduzindo em 50% nas plantas no interior do talhão, a cerca de 40 m da periferia. Esses resultados corroboram ao levantamento de greening realizado em 2020, onde verificou-se que 76% das plantas doentes estavam presentes nas bordas do pomar, correspondendo a uma distância de até 100 metros das divisas da propriedade (FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA, 2020b). Um gargalo no manejo do HLB, é o fato de que ainda na fase assintomática da doença pode ocorrer a aquisição de Ca. L. asiaticus pelo 26 psilídeo, acelerando a ciclo de disseminação (LEE et al., 2015), e o período decorrente entre a introdução do inóculo em laranjeiras e o aparecimento dos sintomas é variável, levando entre quatro meses a um ano para que seja possível a detecção visual dos sintomas (BOVÉ, 2006; FOLIMONOVA & ACHOR, 2010). A relação das Liberibactérias com o ACP é persistente e propagativa, ou seja, a bactéria possui a capacidade de se multiplicar no interior do inseto e coloniza-o de maneira sistêmica, ocorrendo a sua multiplicação em órgãos como glândulas salivares, canal alimentar e intestino (AMMAR et al., 2016), com maior título bacteriano no canal alimentar e nas glândulas salivares (XU et al., 1988; AMMAR et al., 2011a, b). A infecção e multiplicação da bactéria no inseto ocorrem desde os estágios ninfais (4º e 5º instares), até a fase adulta (HUNG et al., 2004). Ninfas adquirem a bactéria com maior eficiência em relação aos adultos, e adultos que adquiriram a bactéria nas fases de ninfa transmitem com maior sucesso a bactéria em relação à aquisição na fase adulta (AMMAR et al., 2016; INOUE et al., 2009; PELZ-STELINSKI et al., 2010). A capacidade de multiplicação da bactéria dentro do inseto está diretamente relacionada a transmissão (XU et al., 1988; INOUE et al., 2009; PELZ-STELINSKI et al., 2010). Resultados preliminares obtidos no Fundecitrus têm demonstrado altas taxas de aquisição de Las por adultos de D. citri, diferente do relatado por PELZ-STELINSKI et al. (2010) e AMMAR et al. (2016), muito provavelmente pela utilização de tecidos mais tenros nas pesquisas do Fundecitrus, bem como do estágio vegetativo V3 e em temperatura adequada de aquisição e multiplicação da bactéria (Lopes, SA. Fundecitrus, comunicação pessoal). Assim, a aquisição de Las por D. citri na forma ninfal e adulta é passível de ser estudada, com relação aos aspectos moleculares do presente estudo. 27 1.4 Interação entre as Liberibactérias do HLB e seus hospedeiros Diversos aspectos referentes à infecção e multiplicação de Liberibacter em D citri, bem como em laranjeira doce, permanecem desconhecidos (INOUE et al., 2009; HAAPALAINEN, 2014). Sabe-se que bactérias patogênicas em plantas geralmente apresentam alterações em níveis transcricionais no hospedeiro (CHOWDHURY & SAHU., 1996), entretanto, são poucos os trabalhos de interação entre Liberibacter e seus hospedeiros, com foco nas Liberibactérias. YAN et al. (2013) compararam a expressão global de 381 genes de Las em psilídeos adultos e em plantas. Ademais, a expressão foi avaliada por RT-qPCR e não de forma global, como é passível de se avaliar utilizado ferramenta de sequenciamento de nova geração (NGS), como em análise transcriptômica. Quando o HLB foi relatado no Brasil, havia predomínio de Lam e menor porcentagem de plantas afetadas por Las (TEIXEIRA et al., 2005b). A partir de 2007 correu uma mudança na prevalência, com predominância de Las em detrimento de Lam (Figura 2; LOPES et al., 2009a), sendo que atualmente mais de 99,9% das amostras de campo com HLB são causadas por Las (BASSANEZI et al., 2020). 28 Figura 3. Proporção de amostras de citros positivas para Ca. L. asiaticus (Las), Ca. L. americanus (Lam), Fitoplasma do grupo 16SrIX e do grupo 16SrIII no serviço de diagnóstico de HLB (103 mil amostras, 2004 a 2020). (Fonte: Nelson A. Wulff/Fundecitrus) A mudança na prevalência de Las e de Lam pode estar associada a fatores ambientais, hospedeiros ou comportamentais das bactérias: i) Las atinge concentrações dez vezes maior em relação a Lam em laranjeira doce (LOPES et al., 2009a). Este fator pode influenciar a aquisição de Las por D. citri e favorecer sua dispersão em relação a Lam; entretanto, afirma-se que ii) Las e Lam possuem taxas semelhantes de aquisição pelo psilídeo (NASCIMENTO, 2010). Adicionalmente, há diminuição na concentração de Lam quando a planta está a 32 °C, inclusive com remissão de sintomas, enquanto em Las somente há redução da detecção de Lam a 38 ºC (LOPES et al., 2009b). Mesmo assim, a diminuição progressiva da população de Lam nos pomares ocorreu em todas as 29 regiões citrícolas do estado de São Paulo, mesmo com a variação de temperatura existente entre as regiões sul, centro e norte. Bactérias podem evoluir conjuntamente com os organismos que habitam, ou dominar outras espécies que ocupam o mesmo nicho e competindo pelo pool de recursos (nutrientes) ou espaço (HIBBING et al., 2010). Além disso, existe a competição ativa, como a produção de toxinas antimicrobianas que favorece a dominância ou sobrevivência de algumas cepas. Um exemplo é a produção de colicina por Escherichia coli, uma proteína tóxica, conferindo uma vantagem a bactéria em relação à outras espécies (KERR et al., 2002), O conhecimento dessa interação pode auxiliar na compreensão da emergência ou declínio de algumas espécies. É o caso da possível interação entre Ca. L. asiaticus e Ca. L. americanus, podendo haver vantagem competitiva de uma espécie em relação a outra, notadamente onde a coinfecção ocorra, seja ela em laranjeiras, ou no inseto. 1.5 Profagos e Liberibactérias Bacteriófagos são vírus que infectam bactérias, sendo comuns em bactérias fitopatogênicas (VARANI et al., 2013) e quando tem seu genoma integrado no cromossomo bacteriano são então denominados profagos (CASJEANS et al., 2003). Em muitos genomas bacterianos os profagos influenciam a patogenicidade e na formação de biofilme bacteriano (BOYD e BRÜSSOW, 2002). No genoma de Ca. L. asiaticus foram caracterizados inicialmente dois profagos, SC1 e SC2 (tipos 1 e 2) (ZHANG et al., 2011) e posteriormente foi identificado outro profago, denominado de tipo 3 (ZHENG et al., 2018). A 30 ocorrência de profagos em Las foi amplamente estudada na China (ZHENG et al., 2016, 2018) e no Brasil (SILVA et al., 2019). YAN et al. (2013) identificaram genes de Las com expressão diferencial no psilídeo e na planta, mas somente três genes dos fagos de Las foram avaliadas. A participação de genes dos profagos das Liberibactérias na patologia do HLB foi investigada (JAIN et al., 2015). Fato marcante é a sua presença nas Liberibactérias associadas a doenças de plantas: profagos de mesmo tipo, com diferentes graus de sintenia e conteúdo gênico foram descritos em Ca. L. asiaticus (DUAN et al., 2009; ZHENG et al., 2018; LIU et al., 2020) em Ca. L. solanacearum (LIN et al., 2011), Ca. L. americanus (WULFF et al., 2014) e Ca. L. africanus (LIN et al., 2015). Resquícios de profagos (tipo 4) também são encontrados nestes genomas (DOMINGUEZ-MIRAZO et al., 2019; THAPA et al., 2020; WULFF et al., 2014), inclusive na linhagem Las Ishi-1 que não tem os profagos dos tipos 1, 2 e 3, mas não são encontrados em L. crescens (LEONARD et al., 2012). Notadamente, L. crescens é cultivável in vitro, mas não é associada a nenhuma doença, muito embora tenha sido isolada de mamoeiro (FAGEN et al., 2014). Há relatos de genes de profagos infectando bactérias e que modulam sua competitividade: Clavibacter michiganensis hospeda os profagos CMP1 e CN77 que produzem uma endolisina específica para a parede celular desta bactéria, sem afetar outras espécies (WITTMANN et al., 2010). Bacteriocinas são proteínas antibacterianas que atuam em linhagens proximamente relacionadas, formando poros na membrana interna ou atuando como nuclease nas bactérias alvo. O bacteriófago φCTX de Pseudomonas aeruginosa codifica uma citotoxina formadora de poro que funciona como bacteriocina (NAKAYAMA et al., 1999). É 31 notável a presença em Las de uma possível bacteriocina com semelhança a ‘colicina Ia’ no profago SC1 (gp_060), enquanto um gene para uma proteína de imunidade à colicina ocorre no profago SC2 (gp_255) (ZHANG et al., 2011). Para as bactérias fastidiosas como Liberibacter e Xylella fastidiosa, o patógeno pode obter vantagem com a expressão de bacteriocinas e sobressair frente às outras populações da espécie, de espécies proximamente relacionadas, ou frente às populações de endofíticos (ARAÚJO et al., 2002) ou endossimbiontes e outras bactérias nos insetos vetores. Nossa linha de pesquisa busca identificar genes dos profagos expressos pela bactéria no inseto vetor via sequenciamento de bibliotecas de RNA (RNA-Seq), como forma de gerar conhecimento da fase inicial de infecção por Las no psilídeo, bem como informações sobre a expressão de genes dos profagos em Las no Brasil. 1.6 Atualidade e perspectivas para o manejo do HLB e de Diaphorina citri O fator que mais dificulta o controle e consequente dispersão do HLB é o tempo que decorre entre a inoculação da bactéria, e a manifestação dos primeiros sintomas foliares. A manifestação dos sintomas depende do modo de inoculação do patógeno – ao redor de quatro meses quando a inoculação é feita por enxertia de ramos doentes (LOPES & FRARE, 2008) e cinco meses quando a inoculação é feita por psilídeos infectivos (CANALE et al., 2019). Este longo e variável período de incubação dificulta a detecção de plantas doentes no campo e a adoção das práticas eficazes de manejo (LOPES & FRARE, 2008). Como medida de supressão da doença, é recomendado o manejo regional do HLB e de D. citri somado às medidas individuais adotadas pelos citricultores. Dentro deste contexto, recomenda-se: intensificar as pulverizações 32 nas bordas dos pomares comerciais, pois é a área com maior incidência de D. citri; manter as plantas bem nutridas; eliminar plantas doentes que servem como fonte de inóculo dos pomares e nas cercanias destes; plantar mudas sadias provenientes de viveiros telados e certificados; realizar o planejamento e renovação do plantio em locais com baixa incidência de HLB; fazer parcerias com vizinhos para controle do inseto vetor e pulverizações de inseticidas de forma sincronizada entre propriedades próximas; inspeção visual frequente para detecção das plantas doentes e D. citri; monitorar insetos adultos por meio de armadilhas adesivas amarelas; realizar o controle químico por aplicações via drench com inseticidas sistêmicos e foliares com inseticidas recomendados para a cultura e praga alvo; liberação do ectoparasitoide Tamarixia radiata (Waterston) (Hymenoptera: Eulophidae) em locais livres de pulverizações, áreas abandonadas e quintais com plantas hospedeiras e a participação dos produtores no manejo regional do HLB (FUNDO DE DEFESA DA CITRICULTURA, 2020B). Estudos visando novas táticas para o manejo de D. citri se intensificaram devido aos impactos e perdas ocasionadas pelo HLB no mundo (GRAFTON CARDWELL et al., 2013). Neste sentido, diversas táticas de manejo de D. citri vêm sendo estudadas, como o controle físico por meio de mulching refletivo (CROXTON & STANSLY, 2013), aplicação de caulim processado nas bordas dos pomares (MIRANDA et al., 2018), controle biológico com adoção de fungos entomopatogênicos (PADULLA, 2007; PINTO et al., 2012; KUMAR et al., 2017), utilização de murta como planta-isca (TOMASETO et al., 2019), uso de inseticida botânico a base de Piper aduncum (VOLPE et al., 2015) e controle biológico em áreas externas com liberações massais de T. radiata (MARIN, 2019; DINIZ et al., 33 2020). Porém, mesmo com diversas táticas de controle conhecidas, o controle químico é a ferramenta mais eficiente adotada pelos citricultores para o combater o inseto vetor e manejo do HLB (MIRANDA & AYRES, 2020). O último possibilita a seleção de populações resistentes, contaminação de água e lençol freático, bem como do colaborador responsável pelo preparo de calda e pulverizações Para mitigar ações de manejo que causam impactos ambientais, uma solução seria o desenvolvimento de estratégias biotecnológicas voltadas ao melhoramento de plantas hospedeiras e resistentes ao HLB e/ou ACP (BASSANEZI et al., 2020). No entanto, há escassez de informações sobre variedades cítricas resistentes ao HLB (FOLIMONOVA et al., 2009), o que têm dificultado tanto o manejo mais sustentável, bem como o melhoramento genético. São relatadas que algumas espécies de Rutaceae possuem determinado grau de resistência ou tolerância (RAMADUGU et al., 2016; ALVES et al., 2021; HUANG et al., 2021). No contexto trófico planta hospedeira de ACP/HLB e epidemiologia da doença, uma alternativa factível é o uso de plantas cítricas comerciais hospedeiras do inseto vetor resistentes a bactéria e/ou ACP. Diante do contexto apresentado, objetiva-se melhorar o entendimento da relação/prevalência das Liberibactérias na planta. Além disso, procuramos investigar como se dá sua interação com inseto, principalmente em fases iniciais da infecção. As atividades desenvolvidas aqui fornecerão dados que potencialmente auxiliarão na identificação de alvos para transformação genética em laranjeira doce e/ou outros hospedeiros do inseto vetor. 34 REFERÊNCIAS ACHOR, D.S.; ETXEBERRIA, E.; WANG, N.; FOLIMONOVA, S.Y.; CHUNG, K.R.; ALBRIGO, L.G. (2010). Sequence of anatomical symptom observations in citrus affected with Huanglongbing disease. J. Plant Pathol., 9: 56-64. AMMAR, E.D.; ROBERT, G.; SHATTERS, J.R.; LYNCH, C.; HALL, D.G. (2011a). Detection and relative titer of Candidatus Liberibacter asiaticus in the salivary glands and alimentary canal of Diaphorina citri (Hemiptera: Psyllidae) vector of citrus Huanglongbing disease. Ann. Entomol. Soc. Am., 104: 526-533. AMMAR, E.D.; SHATTERS, JR. 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Liberibacter asiaticus’ carries an excision plasmid prophage and a chromosomally integrated prophage that becomes lytic in plant infections. Mol. Plant Microbe Interact., 24: 458-468. ZHENG, Z.; BAO, M.; WU, F.; CHEN, J.; DENG, X. (2016). Predominance of Single Prophage Carrying a CRISPR/cas System in “Candidatus Liberibacter asiaticus” Strains in Southern China. PLoS ONE, 11 (1): e0146422. ZHENG, Z.; BAO, M.; WU, F.; VAN HORN, C.; CHEN, J.; DENG, X. (2018). A type 3 prophage of ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ carring a restricition- modification system. Phytopathol., 108: 454-461. 43 CAPÍTULO 2 O GENOMA DE Candidatus Liberibacter asiaticus É ALTAMENTE TRANSCRITO QUANDO INFECTA O INTESTINO DE Diaphorina citri RESUMO O psilídeo-asiático dos citrus, Diaphorina citri, é o vetor da bactéria Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), associada com a mais devastadora doença dos citros, o Huanglongbing. Com a finalidade de explorar as interações moleculares desta bactéria com D. citri durante o processo de aquisição do vetor, nós sequenciamos bibliotecas de cDNA obtidas do intestino de psilídeos adultos confinados em brotos saudáveis (S I, S II e S III) e em brotos jovens infectados por Las (Las I (1/2 dias), Las II (3/4 dias), e Las III (5/6 dias)) em plataforma Illumina. Cada tempo de amostragem foi formado por três repetições biológicas para cada condições e foram coletados cem intestinos por amostra, totalizando 18 bibliotecas enriquecidas em mRNAs. As leituras foram filtradas por qualidade e mapeadas contra a linhagem chinesa JXGC Las (NZ_CP019958.1) e a linhagem da Flórida UF506 (HQ377374.1) para a análise da atividade do genoma Las e dos profagos SC1, SC2 e tipo 3 da linhagem Las estudada. A atividade dos genes foi considerada apenas se fossem obtidas leituras mapeadas em pelo menos 2 bibliotecas para cada período de acesso à aquisição contra os genomas selecionados, o que resultou em coberturas de 44,4, 79,9 e 94,5% das sequências de codificação previstas para o isolado JXGC em Las I, Las II e Las III, respectivamente. Esses genes foram classificados principalmente nas seguintes categorias funcionais: produção de energia, metabolismo de aminoácidos, tradução de sinais, parede celular e replicação e reparo de material genético. Pilinas estavam entre os genes mais expressos, independentemente do tempo de aquisição. Além disso, a região do profago teve uma cobertura maior de leituras para os profagos SC1 (tipo 1) e PJXGC-3 (tipo 3), e baixa cobertura na região tardia de SC2 (tipo 2). Em resumo, esta pesquisa apresenta a primeira análise descritiva do transcriptoma de Las nas etapas iniciais da colonização do intestino de D. citri. Palavras-chave: Huanglongbing, Candidatus Liberibacter asiaticus, psilídeo, metatranscritoma, Diaphorina citri, profago. 44 THE GENOME OF Candidatus Liberibacter asiaticus IS HIGHLY TRANSCRIBED WHEN INFECTING THE GUT OF Diaphorina citri ABSTRACT The Asian Citrus Psyllid, Diaphorina citri, is the vector of the bacterium ‘Candidatus Liberibacter asiaticus’ (Las), associated with the devastating, worldwide citrus disease Huanglongbing. In order to explore the molecular interactions of this bacterium with D. citri during the vector acquisition process, we sequenced cDNA libraries obtained from the gut of adult psyllids confined in healthy (SI, SII, and SIII) and in Las-infected young shoots (Las I (1/2 days), Las II (3/4 days), and Las III (5/6 days)) on Illumina platform. In each sampling time three biological replicates were collected, containing one-hundred guts each, totaling 18 libraries enriched in bacterial mRNAs. Reads were quality-filtered and mapped against the Chinese JXGC Las strain (NZ_CP019958.1) and the Floridian strain UF506 (HQ377374.1) for the analysis of the activity of the Las genome and prophages SC1, SC2 and type 3 of the studied Las strain. Gene activity was considered only if reads of at least 2 replicates for each acquisition access period mapped against the selected genomes, which resulted in coverages of 44.4, 79.9 and 94.5% of the JXGC predicted coding sequences in Las I, Las II, and Las III, respectively. These genes were mostly classified in the following functional categories: energy production, amino acid metabolism, signal translation, cell wall, and replication and repair of genetic material. Pilins were among the most highly expressed genes regardless of the acquisition time. Furthermore, the prophage region had a greater coverage of reads for the SC1 (type 1) and PJXGC-3 (type 3) prophages, and low coverage in SC2 (type 2), mostly in the late region. In short, this research presents the first descriptive analysis of Las transcriptome in the initial steps of the D. citri gut colonization. Keywords: Greening, HLB, Candidatus Liberibacter asiaticus, Asian citrus psyllid, metatranscriptome, Diaphorina citri, prophage. 45 1 INTRODUÇÃO Candidatus Liberibacter asiaticus (Las), uma bactéria Gram-negativa pertencente ao grupo das α-proteobactérias (GARNIER et al., 1984; JAGOUEIX, et al., 1994), é o principal agente associado ao Huanglongbing (HLB) (BASSANEZI et al., 2020). O inseto vetor de Las é o psilídeo asiático dos citros (ACP) Diaphorina citri Kuwayama (Hemiptera: Liviidae) (CAPOOR et al., 1967; CANALE et al., 2017) e o vetor frequentemente adquire Las em plantas infectadas em áreas adjacentes aos pomares comerciais sadios, com a consequente migração do psilídeo gerando infecções primárias (BERGAMIN FILHO et al., 2016), resultando em danos econômicos por afetar a produção (BASSANEZI et al., 2020). Devido à importância da doença e por não haver métodos curativos para o controle do HLB, a bactéria e o psilídeo são considerados, atualmente, as principais pragas para a citricultura mundial (MIRANDA & AYRES, 2020). A aquisição de Las pelo psilídeo, além de ocorrer em plantas sintomáticas, também pode ocorrer em plantas assintomáticas durante a fase ninfal, logo após a inoculação de Las na planta por psilídeos infectados (HUNG et al., 2004; PELZ-STELINSKI et al., 2010; CANALE et al., 2017) e a aquisição assintomática durante o estágio de ninfa, dentro de 15 dias após a inoculação por psilídeos infectados, foi descrita como uma forma de dispersão nova e altamente ameaçadora (LEE et al., 2015). A transmissão de Las pelos psilídeos requer, entretanto, um período latente de 16 a 18 dias (CANALE et al., 2017) e sua relação com o psilídeo é persistente e propagativa (AMMAR et al., 2011a; INOUE et al., 2009; CANALE et al., 2017). A aquisição da bactéria pelo psilídeo tem implicação direta na sua eficiência de transmissão e consequentemente na sua disseminação (INOUE et al., 2009; PELZ-STELINSKI et al., 2010; CANALE et al., 2017). O intestino representa a primeira barreira celular que o liberibacter precisa atravessar no psilídeo, para ter acesso à hemolinfa e migrar para as glândulas salivares, permitindo o processo de inoculação e a sua disseminação. Estudos de expressão gênica mostram um padrão 46 de respostas no intestino, na hemolinfa e nas glândulas salivares de D. citri frente à infecção com Las (KRUSE et al. 2017, 2018; LIU et al., 2020). Há estudos exploratórios que relatam alterações transcricionais nas plantas em função da presença de Las em Catharanthus roseus (LIU et al., 2019), em folhas (FU et al., 2016; HU et al., 2017; ARCE- LEAL et al., 2020) e frutos de Citrus spp. (MARTINELLI et al., 2012), entretanto, nestas interações não foram geradas informações sobre transcritos de Las. A análise transcricional de Las está restrita a avaliação da expressão gênica via RT-qPCR em psilídeos e em citros, com alterações na expressão de genes relacionados à regulação da transcrição, transporte, secreção, montagem do flagelo, em vias metabólicas e resistência ao estresse, pela avaliação de um grupo selecionado de genes (YAN et al., 2013; PRASAD et al., 2016; THAPA et al., 2020) ou associado a estudos funcionais (FLEITES et al., 2014 JAIN et al., 2015; LI et al., 2017). O transcriptoma de Ca. L. solanacearum (Lso) via RNA-Seq em Bactericera cockerelli indica uma alta porcentagem de genes expressos, particularmente de possíveis genes envolvidos na transcrição e modificação pós-transcricional, metabolismos de proteínas e chaperonas (IBANEZ et al., 2014). O sequenciamento de bibliotecas de cDNA via RNA-Seq têm sido uma importante ferramenta para estudos de alterações transcricionais bacterianas (CROUCHER & THOMSON, 2010; HAAS et al., 2012; CREECY & CONWAY, 2015). Neste trabalho realizamos a análise transcricional de genes de Las, em amostras de intestino de D. citri que se alimentou em citros infectados com Las, evidenciando a expressão da quase totalidade dos genes de Las, como forma de gerar conhecimento da fase inicial de infecção por Las no psilídeo. 47 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Obtenção das amostras A colônia estoque de D. citri livre de Las foi mantida em gaiolas em plantas de Murraya paniculata L. (Jack), conforme descrito por CARMO-SOUZA et al. (2020). Foram selecionados adultos com idade entre 7 e 10 dias para a etapa de aquisição de Las. Mudas de laranja doce [Citrus x sinensis (L.) Osbeck], enxertadas em limoeiro cravo [(Citrus x limonia (L.) Osbeck)] foram mantidas em casa de vegetação em sacolas de 4 L e crescidas em substrato de casca de pinus decomposto (Plantmax citrus, Eucatex, Paulínia, SP, Brasil). A infecção por Las foi confirmada por qPCR (LI et al., 2006) e as plantas apresentavam sintomas de mosqueado. Plantas sadias nas mesmas condições de idade e cultivo foram utilizadas como controle negativo. O isolado de Las empregado neste trabalho tinha perfil de marcadores moleculares microssatélites e perfil de profagos idêntico ao apresentado pelo isolado Las 9PA (SILVA et al., 2019; 2021). As plantas receberam uma poda drástica e foram mantidas em condições controladas com temperatura de 26 °C ± 2, umidade relativa a 70%; e fotoperíodo de 14/10 h de claro/escuro. Os psilídeos adultos provenientes de colônias sadias foram confinados em gaiolas de voil cobrindo brotos no estágio vegetativo V2/V3 de plantas de laranja doce sadias e infectadas com Las (CIFUENTES-ARENAS et al., 2018). Antes do confinamento dos insetos, realizou-se uma amostragem dos brotos para a confirmação da presença da bactéria (LI et al., 2006). A dissecação dos psilídeos para a amostragem dos intestinos ocorreu após diferentes períodos de acesso à aquisição: 24, 48, 72, 96, 120 e 144 horas, equivalentes a intervalos de 1 a 6 dias de aquisição. Os psilídeos foram retirados individualmente das plantas e dissecados em etanol 70% com dietil pirocarbonato (DEPC) 1 %, com auxílio de agulha sob microscópio estereoscópico. Foram realizadas três repetições para cada 48 um dos períodos de aquisição em plantas sadias ou infectadas, cada uma composta por 100 intestinos. Cada amostra foi processada em aproximadamente 2 horas. Durante a dissecação dos psilídeos, os intestinos eram imediatamente acondicionados em RNA Later (100 µL por amostra) (Invitrogen/ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, EUA). 2.2 Extração do RNA total das amostras de intestino do psilídeo, detecção da presença de Las e tratamento com DNAse A extração do RNA total das amostras do intestino dissecados foi feita com o kit SV RNA Isolation System (Promega, Madison, USA). Amostras suspensas em 30 µL de água livre de nucleases foram avaliadas em relação à concentração do RNA total por espectrofotometria em NanoDrop V 3.8.1 (ThermoFisher Scientific). A detecção de Las (LI et al., 2006) foi realizada previamente ao tratamento das amostras com DNAse. Nas reações de qPCR, utilizou-se o Kit TaqMan qPCR Master Mix (Ambion/ThermoFisher Scientific), monitorando-se a presença do 16Sr DNA de Las com iniciador/sonda HLBaspr (5’FAM/3’BHQ1, Macrogen, Seul, Coréia do Sul) e do gene wingless com iniciador/sonda DCP (5’HEX/3’BHQ1, Macrogen) para o DNA de D. citri (MANJUNATH et al., 2008). O threshold das sequências alvo foi ajustado manualmente no software StepOnePlus versão 2.3 (ThermoFisher Scientific). A qPCR foi realizada em duplicata e as amostras foram consideradas positivas para a presença de Las quando os valores de Ct foram iguais ou inferiores a 35.0 e negativas quando acima deste valor. A presença de DNA de D. citri produz valores de Ct iguais ou abaixo de 36.0. Amostras de DNA de psilídeo com e sem Las foram utilizados como controle positivo e negativo, respectivamente. As amostras de RNA total selecionadas foram tratadas com TurboTM DNAse (2 U/µl) (Ambion/ThermoFischer Scientific). A confirmação da ação da DNAse em clivar o 49 DNA residual foi aferida pela qPCR com o gene wingless para D. citri (MANJUNATH et al., 2008). 2.3 Enriquecimento do mRNA das amostras e avaliação da qualidade Nesta etapa as amostras foram agrupadas em: H = plantas sadias ou Las = plantas fonte de Las. H I e Las I = 1 e 2 dias de alimentação em citros; H II e Las II = 3 e 4 dias; H III e Las III = 5 e 6 dias. Cada período e fonte com três repetições biológicas. Em seguida, foram submetidas ao enriquecimento do mRNA com Ribo-Zero Gold rRNA Removal Kit (Illumina, Sand Diego, CA, USA). Dois microlitros foram utilizados para a quantificação em leitor de multidetecção Synergy (Biotec Synergy Winooski, EUA; software Gen5) para verificar a concentração e qualidade do mRNA. As amostras com concentrações totais de mRNA entre 80 e 200 ng foram utilizadas para o sequenciamento. 2.4 Sequenciamento do cDNA via plataforma Illumina As amostras enriquecidas em mRNA foram submetidas ao protocolo de preparação da biblioteca de cDNA TruSeq RNA Library Prep Kit (Illumina) seguindo a estratégia paired-end (2 ×100 bp), que consiste na fragmentação do RNA enriquecido com mRNA em sequências de 200 nucleotídeos, seguida da ligação a iniciadores randômicos para a transcrição reversa e construção das bibliotecas de cDNA. O cDNA foi sintetizado e purificado pela utilização de esferas magnéticas e lavagens com etanol. Em seguida, as extremidades foram reparadas e adicionadas adenosinas nas extremidades 3’ de cada fragmento. Na sequência foi realizada a ligação dos adaptadores e as amostras submetidas à amplificação via PCR. O sequenciamento de bibliotecas de cDNA foi realizado em plataforma Illumina HiScanSQ (Illumina), no Centro Multiusuário de Biotecnologia Agrícola do Departamento de Zootecnia da ESALQ/USP (Piracicaba, SP, Brasil). 50 2.5 Análise do sequenciamento e mapeamento das leituras no genoma de referência As leituras obtidas no sequenciamento das bibliotecas de cDNA foram analisadas no programa FastQC (ANDREWS, 2010) para a verificação da qualidade. Adaptadores remanescentes foram removidos e as sequências trimadas seguindo o parâmetro SLIDINGWINDOW 4:22 para o início (LEADING:3) e final (LEADING:3) das leituras, que determinou o score de qualidade mínimo (22) para grupos de 4 nucleotídeos analisados no programa Trimmomatic 0.36 (BOLGER et al., 2014), onde também foram excluídas sequencias inferiores a 25 nucleotídeos. Foram obtidas leituras das triplicatas dos 6 tratamentos, tempos I, II e III para adultos sadios e adultos infectados com Las, totalizando 18 bibliotecas. O mapeamento das leituras presentes no intestino de ACP no genoma referência foi realizado através da contagem de fragments per kilobase million (FPKM) presentes em pelo menos duas de três das bibliotecas sequenciadas para cada um dos períodos de acesso à aquisição (Las I, Las II e Las III) e conversão do valor médio de FPKM das bibliotecas de cada período para log2 (log2FPKM). A linhagem JXGC (NZ_CP019958; ZHENG et al., 2018) foi a referência para o mapeamento e contagem das leituras (reads) no genoma de Las e, consequentemente, determinação dos genes transcritos. Foram desconsideradas as sequências mapeadas aos RNA ribossomais, pseudogenes e tRNAs, esses últimos devido ao seu tamanho. Adicionalmente, para a análise dos profagos SC1 e SC2 foi utilizada a sequência da linhagem Las UF506 (HQ377374.1; ZHANG et al., 2011), assim como o profago do tipo 3 (PJXGC-3) de Las JXGC (KY661963; ZHENG et al., 2018). Estas análises empregaram os seguintes parâmetros: “mismatches cost”: 2; “insertion cost”: 3; “deletion cost”: 3; “length fraction”: 0,8; “similarity fraction”: 0,8; “strand specific”: “both”; “maximum number of hits for a read”: 2, realizadas no programa CLC Genomics v. 12.0 (Qiagen, Hilden, Germany). 51 A anotação funcional das leituras (Agrupamento de grupos ortólogos de proteínas (Cluster of Orthologous Groups of proteins – COG’s)), gerados pelo mapeamento nos genes de Las foi realizada de acordo com TATUSOV et al., (2000). Foram utilizados 3 genomas de referência, duas α-proteobactérias: Candidatus Liberibacter solanacearum (isolado CLso-ZC1), Rhizobium leguminosarum bv. viciae (isolado 3841) e Escherichia coli (O157:H7 strain Sakai). A montagem dos gráficos foi realizada utilizando o GraphPad Prism versão 8.0.0 (Windows GraphPad Software, San Diego, CA, USA), e o diagrama de Venn foi montado utilizando-se o ‘Draw Venn Diagram’ (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/) como ferramenta. 3 RESULTADOS 3.1 Presença de Candidatus Liberibacter asiaticus em amostras de intestino do psilídeo Diaphorina citri A análise dos brotos de citros através de qPCR confirmou a presença de Las (Ct 20,71) somente nas plantas infectadas. Em todas as amostras de RNA dos intestinos foi detectada a presença de DNA do psilídeo (Tabela 1). O valor médio da qPCR para o gene wingless de D. citri foi de 30.7 (Tabela 1), corroborando a necessidade de tratamento com DNase antes da síntese de cDNA. A presença de DNA permitiu, porém, monitorar a presença de DNA de Las, como forma de validar a presença da bactéria nos intestinos dissecados de D. citri, previamente à realização do transcriptoma. Detectou-se a presença de Las através de qPCR somente em amostra de RNA vindos de intestinos cujos insetos alimentaram-se em brotos de plantas infectadas com Las (Tabela 1): nas bibliotecas Las I e Las II o valor médio de Ct para o gene 16Sr DNA de Las foi de 30.6 e 30.8, respectivamente, enquanto para as bibliotecas de Las III o valor de Ct foi de 27.3. Pa