UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Desenvolvimento de sistemas de “screening” utilizando procedimentos em fluxo para o monitoramento de sulfonamidas em urina e produtos de origem animal. MAYARA REGINA DOS SANTOS RUY Dissertação de Mestrado 2011 MAYARA REGINA DOS SANTOS RUY Desenvolvimento de sistemas de “screening” utilizando procedimentos em fluxo para monitoramento de sulfonamidas em urina e produtos de origem animal. Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química. Orientador: Prof. Dr. Leonardo Pezza Co-orientador: Profª. Drª. Helena Redigolo Pezza Araraquara 2011 DADOS CURRICULARES 1. DADOS PESSOAIS Nome: Mayara Regina dos Santos Ruy Nascimento: 01/08/1985 Nacionalidade: Brasileira Naturalidade: São Paulo-SP Estado Civil: Solteira Filiação: Roberto Ruy e Carmen Regina dos Santos Endereço: Rua Manguari, 501 apto 92-B, Bairro Vila Maria, CEP: 02167-080, São Paulo/SP. 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA 2.1 Graduação: Licenciatura em Química - Instituto de Química da UNESP- Araraquara. Período: 03/2004 a 12/2008 2.2 Pós-graduação: Mestrado em Química - Instituto de Química da UNESP-Araraquara. Período: 08/2009 a 07/2011 3. TRABALHOS APRESENTADOS EM EVENTOS CIENTÍFICOS - Ruy, M. R. S., Maruyama, J. A. Silva DA, C. S., Oliveira, O. M. M. F., Oliveira DE, L. A. A. Desenvolvimento de competências e habilidades: formação de professores e o Centro de Ciências de Araraquara. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, maio de 2007. - Ruy, M. R. S.; Maruyama, J. A.; Silva DA, C. S.; Oliveira, O. M. M. F.; Oliveira DE, L. A. A. Investigando a prática reflexiva na formação inicial de professores por meio de práticas pedagógicas no ensino de Ciências, 31ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, maio de 2008. - Ruy, M. R. S.; Fernandes, F. C. B.; Martins, M. V. N.; Pezza, L.; Pezza, H. R. Determinação de sulfonamidas em leite bovino utilizando Quechers e procedimento de análise em fluxo com detecção espectrofotométrica. 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Florianopólis/SC, maio de 2011. - Ruy, M. R. S.; Fernandes, F. C. B.; Rocha, N. N. B.; Pezza, L.; Pezza, H. R. Determinação de bromoprida em medicamentos e urina humana utilizando um método reflectométrico ambientalmente mais benigno. 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Florianópolis/SC, maio de 2011 4. PARTICIPAÇÕES EM EVENTOS XXXIV Semana da Química, realizada no IQ/CAr, 2004. XXXVI Semana da Química, realizada no IQ/CAr, 2006. IV Evento de Educação em Química, realizada no IQ/CAr, 2006. XIII Encontro Nacional de Ensino de Química, Campinas/SP, 2006. XXXVII Semana da Química, realizada no IQ/CAr, 2007. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia/SP, maio de 2007 31ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia/SP, maio de 2008 34ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Florianópolis/SC, maio de 2011. Eu Dedico este trabalho... Primeiramente a Deus por me amar incondicionalmente. A minha mãe, que sempre me incentiva, apóia, acredita e encoraja a seguir em frente. Ao amor da vida, que me inspira e me faz querer ser cada dia melhor. A minha querida irmã Roberta, cunhado Israel e a sobrinha mais linda Gabriela, pelo amor e apoio sempre. Aos demais da minha família e amigos que torceram pelo meu mestrado. A minha nova família Figueira, por todo carinho e dedicação. AGRADECIMENTOS A Deus, por sua fidelidade e infinita misericórdia. A minha família, que sempre me incentivou, apoiou e acreditou em mim. Amo vocês! Ao meu noivo, pela dedicação, paciência, assessoria, apoio e principalmente pelo amor por mim. Amo você imensamente! Ao professor Leonardo Pezza, pela orientação e ensinamentos. A professora Helena Redigolo Pezza, pela co-orientação e ajuda neste trabalho. Aos professores, Maria Del Pilar Taboada Sotomayor e Alberto Camilo Alécio que participaram do meu exame de qualificação e contribuíram valiosamente com sugestões e ensinamentos. Ao amigo Flávio, por toda ajuda durante este trabalho e principalmente pela amizade construída. A Nayane Borges e a D. Maria, pela incrível amizade conquistada e ajuda nos momentos críticos do trabalho. Aos amigos de laboratório, Sandrinha, Aline, Andréa, Natalia, Carla, Tiago, Vitor, Marquinhos, Zé Renato e Zé Rufino. A minha nova família que me fez sentir como uma filha amada. A todos os funcionários do IQ. Ao CNPq, pela bolsa concedida. A todos, muito obrigada.. Eu poderia falar todas as línguas que são faladas na terra e até no céu, mas se não tivesse amor, as minhas palavras seriam como o som de um gongo ou como o barulho de um sino. Poderia ter o dom de anunciar mensagens de Deus, ter todo o conhecimento, entender todos os segredos e ter tanta fé, que eu poderia tirar as montanhas do seu lugar, mas, se não tivesse amor, eu nada seria. Poderia dar tudo que tenho e até mesmo entregar meu corpo para ser queimado, mas se eu não tivesse amor, isso não me adiantaria nada. 1 Coríntios 13,1-3 RESUMO Este trabalho propõe um método analítico simples, rápido e de baixo custo para screening (qualitativo/semi-quantitativo) de sulfonamidas em amostras complexas, tais como leite bovino e urina. Para o screening de sulfonamidas em urina e leite bovino foi empregado um procedimento de análise por injeção em fluxo em meio micelar com detecção espectrofotométrica (λ = 555 nm), o qual está baseado na reação entre sulfonamidas e p-dimetilaminocinamaldeído em meio ácido. O uso de meio micelar conferiu ao método grande sensibilidade analítica possibilitando sua aplicação no screening dos analitos alvos de acordo com o valor de limite máximo de resíduo permitido (LMRsulfonamidas = 100 ppb). As condições experimentais para o desenvolvimento do método proposto foram otimizadas com auxílio de planejamento de experimentos. Para validação do método desenvolvido foram avaliados os seguintes parâmetros: exatidão, precisão, limite de detecção (LOD = 3 SDBranco / inclinação da curva analítica), limite de quantificação (LOQ = 10 SDBranco / inclinação da curva analítica) e robustez. O método desenvolvido foi aplicado na análise de sulfonamidas em leite bovino, empregando-se no pré-tratamento das amostras a metodologia QuEChERS. Uma outra aplicação realizada foi a determinação de sulfonamidas em amostras de urina sintética após prévia hidrólise da uréia (interferente) na qual uma leguminosa foi usada como fonte da enzima urease. Em ambas as aplicações, os resultados obtidos foram satisfatórios. O método desenvolvido representa uma alternativa vantajosa em relação a outros métodos disponíveis, pois apresenta baixo custo relativo, além de ser simples, rápido, ambientalmente mais amigável (envolve o baixo consumo de reagentes e amostras) e não requerer procedimentos específicos ou complicados para o preparo das amostras. Palavras-chave: Sulfonamidas. Espectrofotometria. Análise por injeção em fluxo. ABSTRACT This work proposes a simple, fast and low cost analytical method for the screening (qualitative / quantitative) of sulfonamides in complex samples, such as urine and bovine milk. The screening of sulfonamides in those samples was proceeded by flow injection analysis in, micellar medium, with spectrophotometric detection (λ = 555 nm). The method is based on the reaction between sulfonamide and p- dimethylaminocinnamaldehyde in acidic medium. The use of micellar media increased the sensitivity of the analytical method allowing its application in the screening of target analytes according to the permitted value of maximum residue level (LMRsulfonamides = 100 ppb). Experimental design methodologies were used to optimize the proposed method. The following parameters were assessed in order to validate the method: accuracy, precision, limit of detection (LOD = 3 SD Blank / inclination of the analytical curve), limit of quantification (LOQ = 10 SD Blank / inclination of the analytical curve) and robustness. The method was applied to the analysis of sulfonamides in bovine milk. Pre-treatment of samples was proceeded by QuEChERS methodology. The method was also applied to the determination of sulfonamides in samples of synthetic urine after previous hydrolysis of urea (interferent); a legume was used as the source of the enzyme urease. In both applications, the results were satisfactory. The method represents an advantageous alternative over other available methods, since it has relatively low cost, besides being simple, rapid, environmentally friendly (it involves a low consumption of reagents and samples) and does not require specific or complicated procedures to prepare the samples. Keywords: Sulfonamides. Spectrophotometry. Flow injection analysis LISTA DE FIGURAS Figura 1- Estruturas químicas da sulfanilamida (precursora das sulfas) e do ácido p- aminobenzóico. 24 Figura 2- Comportamento anfotérico das sulfonamidas. 25 Figura 3- Estruturas químicas das sulfonamidas (SAs) estudadas. 25 Figura 4- Distribuição das publicações sobre métodos para a determinação de sulfonamidas encontradas na literatura até o mês de maio de 2011. 26 Figura 5- Diagrama de Fluxo em linha única. D – descarte, DE- detector, A – amostra, R – reator, CA – carregador da amostra, L – alça de amostragem, AL – alavanca. As 3 barras retangulares formam o injetor. 39 Figura 6- Diagrama de fluxo em confluência. Rg é o reagente adicionado na confluência 40 Figura 7- Diagrama esquemático do sistema de análises por injeção em fluxo com zonas coalescentes. Sendo C1 = transportador da amostra 1; A = amostra; L1 = alça da amostra; C2= transportador do reagente; R = reagente L2 =alça do reagente X = ponto de confluência; B = reator helicoidal; E = espectrofotômetro e D = descarte. 41 Figura 8- Esquema geral dos componentes de um espectrômetro de massas 44 Figura 9- Modelo Esquemático de análise por espectrometria de massas 45 Figura 10- Foto do sistema FIA utilizado acoplado ao espectrofotômetro 49 Figura 11- Fluxograma Ilustrativo das etapas da metodologia QuEChERS. 53 Figura 12- Espectros de absorção comparativos para verificar a interferência da uréia. 54 Figura 13- Espectros de absorbância da reação entre p-DAC em meio de ácido clorídrico e sulfonamidas (STZ, SMZ, SDM). O valor máximo de A foi obtido em 555 nm. Concentração das sulfas = 2,5 mg L-1 56 Figura 14- Provável reação entre sulfametazina e p-DAC em meio ácido. 57 Figura 15- Foto do Produto formado na reação da sulfametazina com p-DAC, ambos em meio de SDS. 59 Figura 16- Efeitos principais das variáveis estudadas no sinal de absorbância obtido. 62 Figura 17- Gráfico de barras dos efeitos das variáveis. 63 Figura 18- Superfície de resposta otimizada com sua respectiva curva de nível para a medida de absorbância em 555 nm em função das variáveis: concentração de p-DAC (mol L-1) e concentração de SDS (mol L-1). Concentração de sulfonamida utilizada foi de 2,5 mg L-1. 66 Figura 19- Curvas analíticas para as sulfonamidas estudadas. As concentrações das soluções padrão de sulfonamidas compreendem a faixa de concentração de 0,2 a 4,00 ppm. Cada ponto foi analisado em replicatas (n = 3). 70 Figura 20- Registro dos sinais transientes obtidos no monitoramento da absorbância em 555 nm em função do tempo durante a construção da curva analítica para sulfametazina. Da esquerda para direita são apresentados os valores de concentração em mg L-1. 71 Figura 21- Registro dos sinais transientes obtidos no monitoramento da absorbância em 555 nm em função do tempo durante as análises realizadas nas amostras de leite bovino. Da esquerda para direita são apresentados os valores de concentração em mg L-1. (A-Sulfadimetoxina, B-Sulfametazina e C-Sulfatiazol) 74 Figura 22- a) Cromatograma para os padrões para STZ, SMZ e SDM. Concentração 50 mg L-1. b) STZ, tempo de retenção 14,06 minutos. c) SMZ, tempo de retenção de 17,55 minutos. d) SDM, tempo de retenção de 24,14 minutos. 76 Figura 23 a) Cromatograma para os padrões para STZ, SMZ e SDM. Concentração 0,2 mg L-1. b) STZ, tempo de retenção 14,06 minutos. c) SMZ, tempo de retenção de 17,55 minutos. d) SDA, tempo de retenção de 24,14 minutos. 78 Figura 24- Cromatograma para detecção de STZ adicionada em leite na concentração de 0,1 mg L-1. 79 Figura 25- a) Cromatograma para detecção de STZ adicionada em leite na concentração de 0,2 mg L-1. b) Espectro de massa para detecção de STZ adicionada em leite na concentração de 0,2 mg L-1. Picos característicos de relação carga/massa em 256 e 278,9. 80 Figura 26- a) Cromatograma para detecção de STZ adicionada em leite na concentração de 0,3 mg L-1. b) Espectro de massa para detecção de STZ adicionada em leite na concentração de 0,3 mg L-1. Picos característicos de relação carga/massa em 256 e 278,9. 80 Figura 27- a) Cromatograma para detecção de SMZ adicionada em leite na concentração de 0,1 mg L-1. b) Espectro de massa para detecção de SMZ adicionada em leite na concentração de 0,1 mg L-1. Picos característicos de relação carga/massa em 278,9 e 279,9. 81 Figura 28- a) Cromatograma para detecção de SMZ adicionada em leite na concentração de 0,2 mg L-1. b) Espectro de massa para detecção de SMZ adicionada em leite na concentração de 0,2 mg L-1. Picos característicos de relação carga/ massa em 278,9 e 279,9. 82 Figura 29- a) Cromatograma para detecção de SMZ adicionada em leite na concentração de 0,3 mg L-1. b) Espectro de massa para detecção de SMZ adicionada em leite na concentração de 0,3 mg L-1. Picos característicos de relação carga/massa em 278,9 e 279,9. 83 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Principais características dos métodos espectrofotométricos que utilizam a reação de diazotação para determinação de sulfonamidas 33 Tabela 2- Principais características dos experimentos realizados para escolha do reagente cromogênico do método 48 Tabela 3- Valores de absorbância (555 nm) relativos aos testes com surfactante SDS 58 Tabela 4- Variáveis examinadas e seus níveis estudados no planejamento fracionário 2(7-3) realizado para a otimização do procedimento de screening por análise em fluxo 60 Tabela 5 - Matriz do planejamento fatorial fracionário 2(7-3) 60 Tabela 6 - Valores de Absorbâncias. (λ=555 nm). dos experimentos do planejamento fatorial fracionário e os respectivos coeficientes de variação. Número de replicatas= 3 61 Tabela 7- Variáveis estudadas e níveis estabelecidos no planejamento composto central 64 Tabela 8- Matriz (codificada) de ensaios utilizados no planejamento composto central. 64 Tabela 9- Valores de absorbância (555 nm) e seus respectivos coeficientes de variação obtidos para o planejamento composto central. Número de replicatas=3 65 Tabela 10- Concentrações das variáveis em condições experimentais ótimas e seus respectivos valores de absorbância (555 nm). n=10 67 Tabela 11 Análise de variância dos resultados obtidos no planejamento composto central 67 Tabela 12- Condições otimizadas do método para determinação de sulfonamidas 68 Tabela 13- Valores de absorbância (555 nm) relativos as oito sulfonamidas estudadas Sulfametazina(SMZ), Sulfadimetoxina (SDM), Sulfatiazol (STZ), Sulfacetamida (SCA), Sulfamerazina (SMR), Sulfametoxazol (SMX), Sulfametoxipiridazina (SMP) e Sulfadiazina (SDZ) 69 Tabela 14- Figuras de mérito cada uma das sulfonamidas estudadas pelo procedimento FIA desenvolvido . 71 Tabela 15- Verificação das repetibilidades intra e inter-dia para sulfametazina. 72 Tabela 16- Resultados de recuperação de sulfonamidas adicionadas nas amostras de leite. 73 Tabela 17- Condições do gradiente usado para injeção das amostras por CL-EM. 75 Tabela 18- Tempo de retenção de cada sulfonamida durante a análise cromatográfica. 77 Tabela 19- Valores de massa molar de cada sulfonamida e os respectivos picos de relação carga/massa obtidos no EM. 77 Tabela 20- Resultados de recuperação de sulfonamidas adicionadas nas amostras de urina. 84 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária CCD cromatografia em camada delgada CG cromatografia gasosa CL cromatografia líquida CLAE cromatografia líquida de alta eficiência CV coeficiente de variação C18 grupo octadecilsilano ligado a sílica C8 grupo octil ligado a sílica DMFS dispersão da matriz em fase sólida EC eletroforese capilar ECCM Eletrocromatografia Capilar Micelar EFS extração em fase sólida ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ELL extração líquido-líquido EM espectroscopia de massas FIA análise por injeção em fluxo IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry LOD limite de detecção LMR (s) limite máximo de resíduo (s) LOQ limite de quantificação PABA ácido p-aminobenzóico PAMVet Programa de análise de resíduos de medicamentos veterinários p-DAB p- dimetilaminobenzaldeído p-DAC p-dimetilaminocinamaldeído ppb partes por bilhão ppm partes por milhão PVC Cloreto de povinila rpm rotações por minuto R.S.D. desvio padrão relativo S.D. desvio padrão SDS dodecil sulfato de sódio SA (s) sulfonamida (s) SMZ sulfametazina SDM sulfadimetoxina STZ Sulfatiazol SCA sulfacetamida SMR Sulfamerazina SMX Sulfametoxazol SMP Sulfametoxipiridazina SDZ Sulfadiazina THF tetrahidrofurano UV Ultravioleta Vis visível LISTA DE SÍMBOLOS n nano A absorbância λ comprimento de onda μ micro Ω ohm SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1.1. Considerações gerais 1.2. Antimicrobianos 1.3. Sulfonamidas 1.4. Revisão bibliográfica 1.4.1 Métodos de análise de sulfonamidas 1.4.1.1 Cromatografia líquida de alta eficiência 1.4.1.2 Cromatografia gasosa 1.4.1.3 Eletroforese Capilar 1.4.1.4 Métodos Microbiológicos 1.4.1.5 Métodos Imunológicos 1.4.1.6 Métodos Espectrofotométricos 1.4.2.1 Outros Métodos 1.5. Técnicas Analíticas 1.5.1 Sistemas de “Screening” 1.5.2 Análise Química por Injeção em Fluxo 1.5.2.1 Sistemas em linha única 1.5.2.2 Sistemas em confluência 1.5.2.3 Sistemas com zonas coalescentes 1.5.3 Espectrofotometria UV/Vis 1.5.4 Espectrometria de massas 2. OBJETIVOS 2.1. Objetivo geral 2.2. Objetivos específicos 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1. Materiais e equipamentos 3.1.1 Instrumentação básica 3.1.2 Análise por injeção em fluxo com detecção Espectrofotométrica 3.2. Reagentes e soluções 3.3. Preparo das soluções utilizadas 3.4. Procedimento para preparo das amostras 21 21 23 23 26 26 28 29 30 31 32 32 34 35 35 37 38 39 40 42 43 47 47 47 48 48 48 49 50 51 52 3.4.1 Leite bovino 3.4.1.1 Procedimento empregando extração líquido-líquido 3.4.2 Urina sintética 3.4.2.1 Preparo das amostras de urina sintética 4. METODOLOGIA, RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Verificação do efeito do SDS sobre a reação proposta 4.2. Estudo e otimização das condições experimentais 4.2.1 Planejamento Fatorial Fracionário 4.2.2 Metodologia de superfície de resposta 4.3. Construção das curvas analíticas 4.4. Análise das amostras 4.4.1 Aplicação em amostras de leite bovino 4.4.1.1 Método de confirmação por CL-EM 4.4.2 Aplicação em urina sintética 5. CONCLUSÕES GERAIS 6. PERSPECTIVAS FUTURAS REFERÊNCIAS 52 52 53 55 56 57 59 59 63 68 72 72 75 84 85 86 87 21 1. INTRODUÇÃO 1.1. Considerações gerais O uso de fármacos, em animais de produção, no tratamento de doenças é uma prática antiga da medicina veterinária. Porém nos últimos anos a utilização de antibióticos, como promotores de crescimento, vem aumentando, tornando-se parte integrante do manejo da criação com função de prevenir doenças e/ou aumentar a produção do rebanho1-13. Estas fármacos têm sido utilizadas principalmente como aditivos em rações, melhorando a eficiência dos alimentos e proporcionando maior desenvolvimento e produtividade dos animais. Tem grande importância, também, a utilização de antibióticos para mascarar sinais clínicos de doença por ocasião do abate. Entretanto, os agentes antimicrobianos, caso não sejam corretamente utilizados (terapia indiscriminada com antibióticos, super-dosagem e não observância do período de retirada do antibiótico antes do abate) podem acarretar a presença de resíduos de antibióticos nos produtos originados destes animais, como ovos, leite e mel, que são destinados ao consumo humano1-13. Em contra partida, o cenário mundial e mercadológico internacional sinaliza o grande interesse da sociedade por alimentos mais seguros, saudáveis e ausentes de resíduos de medicamentos e/ou agrotóxicos, pois os mesmos devem ter qualidade adequada para consumo, visto que são essenciais para a promoção e manutenção da saúde. No entanto, mais importante que somente ingerir alimentos, é nutrir-se, garantindo que os nutrientes absorvidos com o alimento signifiquem qualidade de vida. Um dos aspectos fundamentais em se tratando de alimentos, diz respeito à sua segurança, ou seja, os alimentos devem prover nutrientes sem afetar negativamente a saúde de quem os consome14. As organizações internacionais envolvidas com a saúde pública, estabelecem as diretrizes para o Limite Máximo de Resíduo ou Limite de Tolerância definidos como a concentração máxima de resíduo resultante do uso de um medicamento veterinário, expresso em parte por milhão (ppm) ou parte por bilhão (ppb), que é legalmente permitido, ou reconhecido, como aceitável no alimento e é estabelecido 22 para cada antibiótico aprovado para uso em animal produtor de alimento, sendo o valor de limite máximo de resíduo correlacionável à Ingestão Diária Aceitável obtida a partir de ensaios de experimentação animal avaliando-se a toxicidade, teratogenicidade, e carcinogenicidade desses aditivos não intencionais15. No Brasil, a competência para estabelecer limites máximos de resíduos em alimentos, seja de medicamentos veterinários, seja de agrotóxicos, contaminantes e aditivos, é do Ministério da Saúde através da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Entretanto, no Brasil estes valores ainda não foram definidos. Assim, a ANVISA criou o Programa de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em alimentos de origem animal (PAMVet)16, através da resolução RDC nº. 253 de 16 de setembro de 2003 e desde então se vem utilizando valores de LMR internacionais. O valor máximo de resíduos estabelecido para os antibióticos da classe das sulfonamidas é de 100 μg kg-1 17. Dentre os alimentos sujeitos a esta avaliação, o leite bovino foi classificado como prioritário, devido à sua importância na dieta da população brasileira. Os antibióticos são amplamente utilizados no tratamento de doenças no gado leiteiro e também como medida profilática. Sua administração pode ser feita via intra- mamária, para o tratamento de mastite; por via parenteral (intramuscular, intravenosa, subcutânea), na terapia de infecções; por via intra-uterina, para o tratamento de infecções uterinas, cervicais e vaginais, e por via oral, para o tratamento de doenças ou como suplemento alimentar, em doses subterapêuticas18. Os resíduos de antibióticos no leite de consumo podem representar riscos à saúde humana, desde reações alérgicas até surgimento de resistência microbiana passível de ser transferida para o microbiota humano e ainda, alguns antibióticos podem ser potencialmente carcinogênicos19-20. Além disso, a presença de resíduos de antibióticos no leite interfere no processo industrial de derivados (iogurtes, queijos, etc.) inviabilizando a produção destes e, conseqüentemente, causando também sérios prejuízos econômicos. Diante desse contexto, é inquestionável a necessidade de se desenvolver métodos analíticos eficazes e adequados para monitorar resíduos de antibióticos em tais produtos. 23 1.2. Antimicrobianos Os antimicrobianos são compostos que inibem o crescimento de determinados microrganismos (bacteriostáticos) ou causam a sua destruição (bactericida)21, sendo utilizados na produção animal para (i) tratar enfermidades (terapêutico), (ii) prevenir contra enfermidades causadas pela presença de organismos patogênicos (profilático) e (iii) melhorar a taxa de crescimento ou conversão alimentar (promotores de crescimento). Eles podem ser classificados segundo inúmeros critérios, dentre eles, estrutura química, origem, ação biológica, espectro de ação e mecanismo de ação22, mas em linha geral são caracterizados como quimioterápicos e antibióticos. Ambos possuem a mesma função, porém conceitualmente, quimioterápicos são definidos como substâncias produzidas em laboratório e os antibióticos são aquelas produzidas parcial ou totalmente, por seres vivos23. Porém, na prática, esta distinção nem sempre é observada, sendo o termo antibiótico utilizado de forma geral. A indicação de um antimicrobiano está condicionada ao diagnóstico de uma infecção cuja etiologia seja sensível. Existe uma larga variedade de antimicrobianos disponíveis para uso na medicina para o tratamento de diversas enfermidades, dentre esses, os antimicrobianos da classe das sulfonamidas merecem uma atenção especial, uma vez que apresentam um considerável uso na medicina humana e na veterinária23. . 1.3. Sulfonamidas As sulfonamidas (SAs) são um importante grupo de antimicrobianos sintéticos que tem sido usado efetivamente no combate às infecções bacterianas e também na prática veterinária para promover o crescimento animal. As sulfonamidas, ou simplesmente sulfas, foram os primeiros agentes a serem utilizados para o tratamento de infecções bacterianas. Durante a década de 40, as sulfas foram consideradas como os fármacos de escolha para o tratamento de infecções bacterianas em humanos. Hoje, seu uso é limitado ao tratamento de doenças muito especificas na medicina humana, como infecções do trato urinário9-10,20-21. 24 O termo sulfonamida é utilizado para referir-se aos derivados do p- aminobenzeno- sulfonamida (sulfanilamida – figura 1), dessa forma a partir do núcleo químico formado pelos grupamentos anilina e ácido sulfônico, várias outras classes de fármacos foram sintetizadas. Atualmente, cerca de 5000 diferentes compostos desta classe são conhecidos, mas somente 30 têm efetivo emprego, seja na medicina humana ou nas ciências veterinárias24. As sulfonamidas são substâncias de estrutura análoga a do ácido p- aminobenzóico (PABA - Figura 1) e por serem antagonistas competitivas impedem a sua utilização pelas bactérias, na síntese do ácido fólico, afetando os microrganismos que precisam sintetizar o seu próprio ácido fólico21 ou vitamina B9. Mais especificamente, as sulfonamidas são inibidores competitivos da diidropteroato-sintetase, a enzima bacteriana responsável pela incorporação do PABA no ácido diidropteróico, precursor imediato do ácido fólico25. Figura 1- Estruturas químicas da sulfanilamida (precursora das sulfas) e do ácido p- aminobenzóico. De uma maneira geral, apresentam grande espectro de ação, atingindo bactérias Gram-positivas e Gram-negativas. O grupo amino na posição 4 confere para a molécula atividade bacteriana, enquanto que modificações no radical unido ao carbono 1 do anel benzênico modificam as características farmacológicas do composto21. A maioria dos membros dessa classe de compostos são pós cristalinos brancos, inodoros e relativamente insolúveis em água, mas os sais de sódio são rapidamente solúveis. E como resultado das propriedades indutivas do grupamento CH2N O OH 14 Ácido p-amino Benzóico H2N S O O NH24 1 Sulfanilamida 25 SO2, são compostos que exibem comportamento anfotérico, por possuírem grupamentos químicos com caráter acido e básico, o que permite que em determinadas faixas de pH estas moléculas se comportem como zwitterions (Figura 2), ou seja, capazes de manter carga formal positiva e negativa24. Figura 2- Comportamento anfotérico das sulfonamidas. O presente trabalho priorizou o estudo de três tipos de sulfonamidas: sulfametazina (SMZ), sulfadimetoxina (SDM) e sulfatiazol (STZ) cujas estruturas químicas estão representadas na Figura 3. Essas substâncias foram escolhidas para estudo, por estarem incluídas no Programa Nacional de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em Alimentos Expostos ao Consumo (PAMVet)16. Figura 3- Estruturas químicas das sulfonamidas (SAs) estudadas. H3N S O O NR H Forma catiônica pKa1 H2N S O O NR H Forma neutra pKa2 H2N S O O NR H Forma aniônica 26 1.4. Revisão bibliográfica 1.4.1 Métodos de análise de sulfonamidas Realizou-se um levantamento bibliográfico em fonte de consulta eletrônica (Scifinder Scholar) utilizando as palavras chaves: sulfonamides and (determination or analysis) no qual foram encontradas 4610 publicações sobre métodos analíticos para a determinação de sulfonamidas no período compreendido de 1937 a 2011. Na Figura 4 tem se a distribuição dessas publicações. Figura 4- Distribuição das publicações sobre métodos para a determinação de sulfonamidas encontradas na literatura até o mês de maio de 2011. 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 27 Verifica-se que desde os primeiros trabalhos publicados para análise de sulfonamidas, o interesse por estes antimicrobianos tem aumentado significativamente com o passar dos anos. De um modo geral, os métodos destinam-se à detecção e/ou quantificação das sulfonamidas em diversas matrizes, tais como: formulações farmacêuticas, fluídos biológicos (urina, sangue e plasma), alimentos de origem animal (leite, ovos, carnes e mel) e em amostras de águas. Diversos métodos têm sido desenvolvidos para detecção de sulfonamidas em produtos de origem animal. Na maioria dos casos tais métodos, envolvem etapas prévias de extração em fase líquida com um solvente apropriado ou extração em fase sólida (EFS) antes da quantificação por uma técnica analítica específica. Vários métodos são encontrados para a determinação de sulfonamidas, tais como: métodos cromatográficos, potenciométricos, enzimáticos, espectrofotométricos, métodos envolvendo espectrometria de massas, eletroforese capilar, fluorescência, métodos microbiológicos, dentre outros20. Com o levantamento foi possível agrupar, de forma generalizada, os métodos existentes em três diferentes grupos conforme estes foram aplicados. Há métodos de screening, aplicados em diferentes matrizes, com o objetivo de fornecer uma resposta positiva ou negativa para a presença de sulfonamidas. Tais métodos normalmente empregam procedimentos microbiológicos ou imunológicos, baseados no princípio da inibição microbiana ou enzimática26-27. Outros métodos são baseados em técnicas espectrofotométricas ou eletroquímicas. Possuem grande aplicação em formulações farmacêuticas para controle de qualidade e em alguns casos são aplicados em matrizes mais complexas. Um último grupo inclui os métodos de análise que tem por objetivo identificar um determinado analito e também quantificá-lo com exatidão e precisão. Esses métodos consistem na utilização de técnicas de separação, acopladas a sistemas de detecção variados e geralmente são aplicados à análise de amostras complexas e também para a confirmação dos resultados obtidos com métodos de screening. 28 1.4.1.1 Cromatografia líquida de alta eficiência A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tem sido a técnica mais empregada para determinação de sulfonamidas, principalmente quando associada à absorção por ultravioleta (UV), fluorescência, detecção por arranjo de diodos e à espectrometria de massas (EM) como técnica confirmatória. Isso devido à sua sensibilidade, fácil adaptação para determinações quantitativas acuradas, adequação à separação de espécies não voláteis ou termicamente frágeis e, acima de tudo sua ampla aplicabilidade28. Aluburda et al.29, propuseram um trabalho para avaliar e validar um método para determinação de resíduos de sulfatiazol (STZ), sulfametazina (SMZ) e sulfadimetoxina (SDM) em leite integral. A extração foi realizada com diclorometano e coluna de extração em fase sólida de sílica. Os resíduos, após derivação com fluorescamina, foram quantificados por cromatografia líquida de alta eficiência com detector de fluorescência. O limite de detecção das três sulfas em amostra de leite integral foi 0,3 μg L-1 e o limite de quantificação foi 1,0 μg L-1 para STZ e SMZ, 2,5 μg L-1 para SDM, com coeficientes de variação entre 4,4 e 6,6%. Os valores de recuperação para STZ, SMZ e SDM foram 63,2, 91,2 e 63,2%, respectivamente. WU et al.30 determinaram oito sulfonamidas (sulfadiazina, sulfatiazol, sulfametazina, sulfametoxipiridazina, sulfamonometoxina, sulfametoxazol, sulfametoxina e sulfaquinoxalina) em leite bovino utilizando a CLAE operando em modo gradiente com detecção em 270 nm. As amostras inicialmente são filtradas em papel de filtro quantitativo e na seqüência 10 mL foram tratados com sulfato de sódio anidro (15 g) e acetato de etila (15 mL) com agitação por um minuto. A mistura foi centrifugada e a fase orgânica coletada e o procedimento repetido mais uma vez. Os extratos orgânicos são combinados, evaporados até secura e o resíduo dissolvido em 1 mL de acetato de etila. Esta solução é então submetida a uma etapa de purificação em cartucho de extração aniônico contendo sílica modificada com grupos amino. As sulfas são eluídas com 1,5 mL da mistura de metanol – acetonitrila – solução aquosa de ácido acético 1% (1: 1: 8 v/v/v) e separadas em coluna C18. Setenta e cinco amostras foram fortificadas e analisadas. As porcentagens de recuperação variaram de 70,5 a 89,0%. ZHANG et al.31 determinaram resíduos de doze sulfonamidas (SAs) em ovos. O método inclui a extração das SAs com acetonitrila, n-hexano, e após a 29 evaporação, acidificando com ácido clorídrico, o processo de clean-up foi feito em um cartucho em fase sólida da Oasis. A coluna foi lavada com metanol, e as SAs foram eluídas com solução de 6% de amônia em metanol. Depois da evaporação, o resíduo foi dissolvido com a fase móvel. A separação analítica ocorreu em uma coluna C18 (25 cm x 4,6 mm, 5 mm) com detecção por UV em 265 nm. A eluição foi feita com acetonitrila-água-ácido acético glacial (23: 77: 0.5) O método apresentou boa linearidade e as recuperações médias de (71,13 ± 5,02)% - (99,53 ± 5,13)% e desvio padrão relativo (RSD) entre 0,3% e 4,8% foram obtidos para todas as sulfonamidas na amostra. HUANG et al.2 propuseram um método simplificado de CLAE para a identificação e determinação de resíduos de sulfonamidas em amostras de leite bovino. As sulfas são extraídas com a mistura etanol – ácido acético (97:3, v/v) seguida por centrifugação. O sobrenadante é então separado em coluna C8 modificada com grupos éter, confeccionada pelos próprios autores. O sistema opera em modo isocrático utilizando como fase móvel a mistura acetonitrila – água (5:95) com detecção em 270 nm. Uma relação linear foi observada para o intervalo de concentração de 0,05 a 1 ppm para sulfanilamida e de 0,1 a 1 ppm para sulfadiazina, sulfamezarina e sulfametazina. A separação das quatro sulfas é conseguida em aproximadamente 16 minutos. As porcentagens de recuperação variaram de 83,7 a 103,0%. TAMURA et al.32 desenvolveram uma metologia para a quantificação de SDM, SMX, SMZ em carne de frango, gema de ovo e carne de porco por DMFS. Amostra de 0,5 g foram misturados com 0,7 g de gel de sílica e 1,5 mL de acetonitrila. A mistura foi seca e em seguida lavada com hexano e eluída com metanol ou THF, alíquotas do metanol ou solução de THF foram submetidas a CLAE. A recuperação foi 78,1-93,1% na carne de frango, 74,6-86,2% na gema, 69,6-87,1% na carne de porco. Os valores de LOD obtidos variaram de 0,01 a 0,04 ppm. 1.4.1.2 Cromatografia gasosa É indiscutível a sensibilidade e seletividade da cromatografia gasosa para detecção de sulfonamidas, entretanto, esta técnica é pouco explorada devido à 30 necessidade de derivatizar as sulfonamidas para obter derivados voláteis antes da análise cromatográfica, sendo que esta etapa de derivatização normalmente envolve tanto a metilação das SFAs como a metilação seguida por uma acilação33-38. REEVES38 propôs a confirmação da presença de nove sulfas em concentrações de 10 ppb em amostras de leite bovino empregando a CG-EM. As sulfas são extraídas do leite com acetato de etila e purificadas em cartucho de EFS contendo como material sorvente sílica modificada com grupos ciclohexil. O extrato é derivatizado e então analisado. A separação é efetuada em aproximadamente 30 minutos. O método mostrou ser bastante preciso e exato, sendo indicado para análises confirmatórias. 1.4.1.3 Eletroforese Capilar A eletroforese capilar (EC) é uma técnica instrumental de análise que utiliza essencialmente um capilar de sílica fundida, preenchido com uma solução de eletrólito. As extremidades do capilar estão imersas em reservatórios contendo eletrólito, onde também estão colocados dois eletrodos de platina, conectados a uma fonte de alta tensão, para a aplicação da diferença de potencial. Um sistema de detecção e um dispositivo que permita a introdução da amostra no capilar também são necessários 39-40. O interesse crescente pela técnica nos últimos anos promoveu o desenvolvimento de instrumentos comerciais dotados de sistemas sofisticados de injeção de amostra, detecção em linha e aquisição de dados, que tornam a técnica atraente para a utilização em análises de rotina. A principal vantagem da eletroforese capilar em relação às outras técnicas de separação é a maior eficiência e resolução obtidas em um tempo menor de análise e com a utilização de volumes pequenos da amostra (1 – 10 nL por injeção) e do eletrólito de trabalho (10 – 100 mL diários)39. Nesta técnica os compostos são separados com base na diferença entre as mobilidades iônicas, que estão relacionadas com a razão carga-massa, e a fatores estruturais39-40. A preparação das amostras é semelhante às descritas para os métodos de CLAE. Tampões fosfato ou borato são os mais comumente utilizados como 31 modificadores eletrolíticos para a separação dos analitos no modo ECCM. No modo de EC a separação é controlada pelo ajuste adequado do pH do tampão empregado. Veraart et al.41 desenvolveram uma diálise automatizada, cujo procedimento de extração (EFS) foi acoplado on-line à EC. Eles analisaram soro e urina para determinar 5 tipos de sulfonamidas. A diálise mostrou ser um método muito eficaz para realizar clean-up e pré-concentração, especialmente para remover as proteínas e partículas-problemas da matriz. Depois dessa etapa, a amostra era injetada automaticamente no sistema de EC. Os LODs obtidos da urina e do soro são respectivamente, 50-100 ng e 50-300 ng. Wang et al.42 relatam um método com EC e detecção amperométrica para análise de sulfonamidas em medicamentos. O sistema de detecção eletroquímica era composto por um eletrodo de trabalho de carbono, um eletrodo auxiliar de platina e um eletrodo de referência de Ag/AgCl (KCl 3 mol L-1). A tensão aplicada ao trabalho foi de 1275 mV. As recuperações compreendiam entre 97-103%. 1.4.1.4 Métodos Microbiológicos O princípio destes testes baseia-se usualmente na inibição de crescimento de microrganismos empregados, percebida pela mudança de cor de um indicador de pH no meio-teste. As seguintes bactérias são amplamente utilizadas nos testes de inibição de crescimento: Bacillus stearothermophilus, Streptococcus salivarius subsp. thermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus e Micrococcus luteus. As concentrações detectadas dos vários antimicrobianos variam entre os diferentes testes15, 43. Métodos microbiológicos como testes rápidos para a detecção de resíduos de antimicrobianos em alimentos de origem animal têm se difundido. Os métodos microbiológicos permitem detectar um amplo espectro de antimicrobianos, mas com a limitação de que os limites de detecção (LOD) são relativamente altos, variando normalmente de 2 μg kg-1 a 10 mg kg-1. Desta forma, classes de antimicrobianos como a das sulfonamidas não pode ser determinada com sensibilidade adequada para análise de resíduos dos mesmos44. 32 Os métodos que empregam princípios microbiológicos apresentam certos pontos críticos que exigem maiores cuidados e conhecimento técnico especializado para sua execução; além disso, os resultados não são imediatos. Estes métodos também apresentam baixa especificidade e podem gerar resultados falso-positivos, exigindo, portanto, testes confiáveis adicionais para a confirmação dos resultados45. Estas análises confirmatórias normalmente são feitas por técnicas mais especializadas de separação cromatográfica acopladas a espectrômetros de massa e utilizadas para a detecção e quantificação de resíduos de antimicrobianos em diversas matrizes. 1.4.1.5 Métodos Imunológicos Os métodos que empregam princípios imunológicos baseiam-se na competição por sítios de ligação em receptores de células bacterianas que são específicos para várias classes de antibióticos. Os receptores bacterianos são adicionados à amostra, juntamente com antibióticos conjugados com isótopos radioativos (radioimunoensaio) ou enzimas (ELISA). A concentração de resíduos na amostra pode ser avaliada através de radiometria ou colorimetria, sendo diretamente proporcional ao número de sítios receptores ocupados pelo antibiótico não marcado46-49. Entre as vantagens destas técnicas, destaca-se a rapidez e simplicidade de execução, menor conhecimento técnico exigido para suas operações, maior especificidade para determinados antibióticos e possibilidade de detecção de outros agentes antimicrobianos, além de antibióticos46. Li et al.50 relata a detecção de sulfonamidas em carnes suínas por imunocromatografia, usando a reação cruzada de anticorpos policlonais e três sulfonamidas diferentes. 1.4.1.6 Métodos Espectrofotométricos Os métodos espectrofotométricos, por apresentarem simplicidade instrumental e operacional, estão entre os métodos mais utilizados em laboratórios de análise em todo mundo28. Entre os procedimentos baseados em medidas 33 espectrofotométricas descritos para análise de sulfonamidas pode ser observado que grande parte destes baseia-se na reação de diazotação51-57 das sulfas. A Tabela 1 apresenta as principais características de alguns métodos propostos para determinação espectrofotométrica de sulfonamidas em amostras diversas. Tabela 1- Principais características dos métodos espectrofotométricos que utilizam a reação de diazotação para determinação de sulfonamidas58 Reagente de acoplamento λ max (nm) Intervalo linear (μg mL-1) Amostras Comentários Ref. Iminodibenzil 570 - 580 0,05 – 6,0 Medicamento Requer 20 minutos p/ o desenvolvimento de cor e utiliza H2SO4 10 mol L-1. Produto é estável por 1 dia. 51 3-aminofenol 460 0,05 – 8,0 Medicamento Produto é estável por até 6 dias. 53 8-hidroxiquinolina 500 0,2 – 6,0 Medicamento Produto é estável por até 48 horas 54 N- naftiletilenodiamina 540 - 555 10,0 –100,0 Medicamento Reação em meio micelar de SDS e tampão acetato (pH 4,0). 55 N- naftiletilenodiamina 400 - 700 0,41 – 7,34 Urina, Mel e medicamento Requer o uso da espectrofotometria derivativa para uma análise correta devido interferências de matriz. 56 Fosfato de Primaquina 468 - 474 0,1 – 12,0 Urina, sangue e medicamento Requer 15 minutos para o desenvolvimento de cor. Produto colorido é estável por várias semanas. 57 Além dos métodos baseados na reação de diazotação/acoplamento, várias outras reações são propostas para a determinação espectrofotométrica de SAs. Al-abachi et al.59 propuseram o emprego da reação de acoplamento oxidativo utilizando cloridrato de prometazina para a determinação de SAs em formulações 34 farmacêuticas. A reação ocorre em meio de ácido acético diluído e íons hipoclorito. O produto colorido é formado após 25 minutos de reação a temperatura ambiente e monitorado espectrofotometricamente em 610 nm. A lei de Beer é obedecida para concentrações de 0,4 a 9 ppm. Compostos contendo grupos amino aromáticos primários tais como 1-aminonaftol, ácido amino-salicilico e 4- aminoantipirina interferem seriamente nas medidas 1.4.2.1 Outros Métodos Métodos eletroanalíticos são poucas vezes empregados para a análise de SAs. Dentre estes métodos, Yao et al.60 descreveram a construção de eletrodos íons-seletivos para a determinação potenciométrica de sulfatiazol, sulfadoxina e sulfadimetoxina em formulações farmacêuticas. Os eletrodos são construídos pela imobilização dos complexos íon-par formados entre cetiltrioctilamônio com as formas aniônicas das sulfas examinadas em tubos de PVC. Os eletrodos apresentaram resposta rápida (15 – 25 segundos) e comportamento nerstiano para faixas de concentrações entre 3,00 x 10-5 – 1,00 x 10-2 mol L-1. O método foi aplicado na análise de medicamentos com recuperação média de 99,3% e ausência de interferências. Braga et al.61 propuseram um método para quantificar sulfadiazina em duas amostras de produtos farmacêuticos usando voltametria de onda quadrada. O sinal analítico foi obtido por redução em vez de oxidação da sulfa sobre eletrodo de carbono vítreo. A determinação eletroanalítica foi realizada em solução-tampão Britton-Robinson 0,04 mol L-1 com pH 6,8. A redução irreversível da sulfadiazina foi observada em –1,49 V vs. Ag/AgCl. A curva analítica foi obtida na faixa de concentração entre 62,7 e 340 μmol L-1 (r = 0,9986) e o limite de detecção foi 10,9 μmol L-1. Para uma amostra analisada, os valores de recuperação ficaram entre 94,9 e 101,1%, enquanto para a outra amostra foram entre 96,0 e 104,6%, indicando que a composição da matriz não interfere nos resultados analíticos. Outros métodos propostos na literatura empregam medidas de absorção atômica62-64 para a determinação indireta de SAs em diversas matrizes. Métodos volumétricos com determinação do ponto de equivalência através de medidas 35 espectrofotométricas65 ou potenciométricas66 também foram propostos para a análise de medicamentos. Entre outras técnicas citam-se a CCD67, procedimentos em fluxo68-70 e a fluorimetria71-72 . 1.5. Técnicas Analíticas 1.5.1 Sistemas de “Screening” Em muitas situações práticas um grande número de amostras precisa ser analisado, e muitas vezes, o que importa não é uma concentração exata de um analito, mas determinar se essa concentração é maior ou menor que um certo valor. Os métodos de screening são considerados métodos para averiguação preliminar, e são usados quando um grande número de amostras precisa ser analisado rapidamente73. De uma maneira geral, estes métodos consistem de uma análise qualitativa ou semi-quantitativa das amostras, sem tratamento prévio ou com um tratamento que não demande muito tempo e material. Os métodos convencionais de laboratório que fornecem informações quantitativas e qualitativas sobre amostras estão sendo crescentemente substituídos por estas ferramentas analíticas de resposta rápida. Essas ferramentas, muitas vezes denominadas de sistemas de screening de amostras, visam identificar e selecionar, a partir de uma série inicial, um grupo de amostras que contem um ou mais analitos acima de um nível de concentração pré-estabelecido. Dessa forma são obtidas algumas vantagens importantes, incluindo redução dos custos, rapidez, simplicidade e minimização de erros operacionais pela demora entre a amostragem e análise74. Os principais objetivos dos sistemas de screening são73-78: Fornecer uma resposta rápida e confiável em relação a uma propriedade específica de uma amostra, objeto ou sistema, de modo a evitar o processamento completo de um grande número de amostras e, assim, obter medidas globais de substâncias tóxicas e/ou tomar decisões rápidas. 36 Minimizar as operações preliminares de um processo analítico convencional. Estas operações preliminares, normalmente são trabalhosas e são as maiores fontes de erros sistemáticos ou aleatórios, sendo o ponto fraco do processo analítico. Minimizar a necessidade do uso permanente de instrumentos com altos custos de aquisição e manutenção. Ao invés de serem usados para avaliar todas as amostras, estes poderiam ser reservados para processar somente aquelas amostras para as quais o sistema de screening previamente fornecesse uma resposta positiva confiável. O procedimento básico deve usar equipamentos e operações simples, e produzir uma resposta binária SIM/NÃO que ocasionalmente requer confirmação. As principais características dos sistemas screening que os diferenciam de métodos analíticos convencionais são73-78. Tendem a ter uma ênfase mais qualitativa do que quantitativa nas análises; Envolvem pouco ou nenhum tratamento prévio de amostras; Emprega metodologias rápidas; A resposta binária obtida algumas vezes requer confirmação por meio de um método convencional; A resposta é usada para realizar decisões imediatas; Entretanto, a resposta binária (sim/não) obtida pelos sistemas, muitas vezes possui conotações quantitativas, pois além de indicar em quais as amostras o analito está presente, o sistema de screening também pode indicar a concentração aproximada de forma a facilitar a escolha do método de confirmação. Na química analítica os sistemas de screening são utilizados para diversos tipos de amostras e analitos e nas mais diversas áreas, dessa forma os sistemas automatizados são muito utilizados para estes objetivos. 37 1.5.2 Análise Química por Injeção em Fluxo Os sistemas de fluxo são muito úteis na química analítica moderna e, como a análise por injeção em fluxo, têm se apresentado como uma ferramenta poderosa na automação analítica, suas aplicações vêm aumentando a cada dia, com as mais variadas configurações. Operações em fluxo são muito mais fáceis de controlar no tempo e no espaço, já que o uso de tubos fechados evita a evaporação de líquidos, permite a mistura de reagentes, bem como a formação altamente reprodutível de produtos de reação. Assim, a automatização e simplificação dos processos químicos de medida constituem uma inovação em relação a alguns métodos analíticos existentes apresentando vantagens como79-84: Consumo reduzido de reagente e amostras; Boa precisão e exatidão; Baixo custo de investimento e manutenção; Aumento da frequência analítica; Redução dos riscos de contaminação; Diminuição de erros operacionais; Grande versatilidade (possibilidade de acoplamento a várias técnicas de pré- tratamento, separação e pré-concentração de amostras, bem como a diferentes técnicas analíticas). A análise por injeção em fluxo (FIA do inglês: Flow Injection Analysis) foi proposta por Ruzicka e Hansen e no Brasil, por pesquisadores do CENA/USP79. Essa proposta surgiu diante da necessidade de minimizar a manipulação dos reagentes pelo analista, da rapidez das análises e principalmente pela possibilidade de transformação dos processos manuais em automatizados. A análise por injeção em fluxo é um processo que permite a automatização de procedimentos analíticos, no qual a amostra em solução aquosa é introduzida em um fluido carregador que a transporta em direção ao detector 83. 38 O processo de análise química por injeção em fluxo pode ser dividido em quatro partes: propulsão dos fluidos, injeção da amostra, reação e detecção. A propulsão dos fluidos pode ser a vazão ou pressão constante. Quando o sistema trabalha a vazão constante o meio mais empregado para movimentar o fluido carregador e as soluções dos reagentes através do percurso analítico é a bomba peristáltica. Em sistemas com pressão constante são empregados dispositivos de ação gravitacional como propulsores de fluidos. O injetor é o dispositivo fundamental do sistema, além de introduzir a amostra no percurso analítico pode ser empregado para selecionar as vazões do carregador e dos reagentes, aumentando a flexibilidade do processo. Dentre os vários tipos de injetores têm-se as válvulas rotatórias e os injetores comutadores. A reação ocorre dentro do percurso analítico. Para escolher o dimensionamento do mesmo deve se levar em conta o tempo de residência da amostra31. O tempo de residência está ligado ao fenômeno da dispersão, este processo é dependente das características físico-químicas das soluções, bem como das dimensões dos componentes do sistema (volume da alça da amostragem, material, diâmetro e comprimento dos tubos que constituem o percurso analítico). O detector para um sistema da análise em fluxo deve ser estável, utilizar um baixo volume morto, ter uma resposta rápida e os canais de fluxo não devem criar turbulência no sistema32. Os detectores empregados são praticamente todos usuais em química analítica: espectrofotômetros de UV-Vis, espectrômetros de absorção atômica e de emissão em plasma, potenciômetros e condutivímetros83. A versatilidade dos sistemas de análise em fluxo permite desenvolver configurações com percursos analíticos variados. 1.5.2.1 Sistemas em linha única Neste sistema (Figura 5), o transportador contendo o reagente é continuamente bombeado através do percurso analítico. Uma alíquota da amostra é injetada no percurso analítico e no decorrer do processo, a amostra sofre dispersão na solução transportadora formando um gradiente de concentração. Em função dos gradientes de concentração e da medida a ser feita com a zona da amostra em 39 movimento, obtém um sinal transiente, cuja altura é relacionada à concentração da espécie de interesse83. Figura 5- Diagrama de Fluxo em linha única. D – descarte, DE- detector, A – amostra, R – reator, CA – carregador da amostra, L – alça de amostragem, AL – alavanca, As 3 barras retangulares formam o injetor83. 1.5.2.2 Sistemas em confluência Nesta configuração (Figura 6) o reagente é adicionado logo após o injetor, permitindo que cada fração da amostra receba a mesma quantidade de reagente. Ao ocorrer a mistura do reagente com a amostra a partir da confluência as vazões de ambos são somadas, assim a amostra sofre uma diluição. Neste caso, a amostra toma uma maior fração do percurso analítico o que corresponde a um aumento da alça de amostra em um sistema de linha única, sendo importante ajustar a intensidade do fluxo para que a dispersão da amostra seja minimizada83. 40 Figura 6- Diagrama de fluxo em confluência. Rg é o reagente adicionado na confluência. 1.5.2.3 Sistemas com zonas coalescentes Nos sistemas FIA com zonas coalescentes (Figura 7), amostras e reagentes são inseridos em sincronia no percurso analítico por uma solução transportadora inerte. A inserção é realizada usando um injetor-comutador proporcional e a mistura de amostras e reagentes ocorre por confluência. Dessa forma os reagentes são consumidos somente na presença de amostras e pode ser continuamente recuperado80. 41 Figura 7. Diagrama esquemático do sistema de análises por injeção em fluxo com zonas coalescentes. Sendo C1 = transportador da amostra 1; A = amostra; L1 = alça da amostra; C2= transportador do reagente; R = reagente L2 =alça do reagente X = ponto de confluência; B = reator helicoidal;E = espectrofotômetro e D = descarte85. Estes sistemas foram inicialmente propostos para reduzir o consumo de reagentes e, consequentemente, o custo das análises e a produção de resíduos tóxicos82. O presente trabalho utiliza-se este tipo de configuração para o desenvolvimento de método. É importante ressaltar que existem também outros sistemas de análise em fluxo, como sistema de reamostragem, sistema monosegmentado, concentração e separação com resina de troca iônica, extração por solventes, destilação, geração de fase gasosa e outros. 42 1.5.3 Espectrofotometria UV/Vis O princípio fundamental da maior parte dos métodos de absorção quantitativos reside na comparação entre a quantidade de energia radiante de determinado comprimento de onda que é absorvida por uma solução do produto em análise e a que é absorvida por uma série de soluções-padrão33. As leis de Lambert e Beer são essenciais para o entendimento da espectrofotometria. Segundo a lei de Lambert, a intensidade da luz emitida diminui exponencialmente quando a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente, ou seja, qualquer camada de uma dada espessura absorve a mesma fração de luz que incide sobre ela. Segundo a lei de Beer, a intensidade de um feixe de luz monocromático diminui exponencialmente quando a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente. É vantajoso que as soluções obedeçam a lei de Beer, pois, neste caso, a absorbância é diretamente proporcional a concentração, e basta determinar um número reduzido de pontos para estabelecer a curva analítica. Na espectrofotometria são usados instrumentos destinados à medida da energia radiante emitida ou absorvida por dada substância pesquisada. A amostra analisada absorve certa fração da luz incidente e transmite a restante, a luz transmitida vai sensibilizar um detector, que a transformará em um sinal elétrico; este é então enviado a um amplificador, que vai intensificar o sinal proveniente do detector. Através do sinal elétrico é expressa a concentração da substância pesquisada86-87. A espectrofotometria é um processo que utiliza a luz para medir as concentrações químicas. Em relação à energia, é mais conveniente pensar na luz como partículas chamadas fótons, quando uma molécula absorve um fóton, a energia da molécula aumenta e dizemos que a molécula é promovida para um estado excitado. A luz visível e a radiação ultravioleta provocam a promoção dos elétrons para orbitais de maior energia, a luz oriunda de uma fonte contínua passa por um monocromador, que seleciona uma estreita faixa de comprimento de onda do feixe incidente. Essa luz monocromática passa pela amostra e a energia radiante da luz emergente é medida. Na espectrofotometria UV/visível, a amostra é geralmente colocada em uma cubeta. 43 O espectrofotômetro pode possuir um feixe simples ou um feixe duplo, nos dois casos é preciso uma amostra de referência contendo o solvente puro. No sistema de feixe simples, para cada amostra colocada no aparelho deve ser colocada novamente a amostra referência, no caso do sistema de feixe duplo, a amostra referência fica no equipamento durante todas as análises necessárias86-87. Os espectrofotômetros são compostos por uma fonte de radiação contínua, um monocromador para selecionar o comprimento de onda, um detector que converte a energia radiante em sinais elétricos e um dispositivo que faz a leitura do detector. A fonte mais comum empregada para a região visível é a lâmpada incandescente de filamento de tungstênio e para a região do ultravioleta é usado a lâmpada de deutério. Os monocromadores restringem a radiação que irá incidir sobre a amostra e podem ser usados para tal, prismas, grade de difração ou filtros óticos86-87. 1.5.4 Espectrometria de massas A espectrometria de massa (EM) é uma técnica microanalítica utilizada para obter informação do peso molecular e de características estruturais da amostra. É uma das mais importantes ferramentas analíticas disponíveis na atualidade, já que é capaz de fornecer informação sobre: i) a composição elementar de amostras; ii) a estrutura molecular; iii) a composição qualitativa e quantitativa de misturas complexas; iv) a estrutura e a composição de superfícies sólidas e as proporções isotópicas de átomos em amostras88-90. Os princípios básicos da espectrometria de massas são volatilização e ionização da amostra (não necessariamente nessa ordem) e esses íons são subseqüentemente separados, ou filtrados, de acordo com a sua razão massa/carga (m/z) e então detectados. Os componentes de um espectrômetro de massas são, basicamente, os representados na Figura88. 44 Figura 8- Esquema geral dos componentes de um espectrômetro de massas91. A introdução da amostra no interior do espectrômetro de massas se realiza de diferentes maneiras, dependendo da natureza dessa amostra. Esse dispositivo de entrada da amostra deve estar desenhado para situar a amostra no interior do equipamento, onde a pressão é, normalmente, inferior a 10-6 mbar e vaporizá-la, no caso dessa amostra não ser gasosa. Uma vez que a amostra foi introduzida no interior do espectrômetro de massas, se procede a sua ionização mediante diferente métodos (electrospray, ionização por elétrons, denominada, ionização química à pressão atmosférica etc), segundo o tipo de amostra que está sendo analisada90,91. A amostra ionizada é submetida a campos elétricos e/ou magnéticos que resultam em separação conforme a relação massa/carga do íon. Diferentes princípios de operação resultam em separação por velocidade adquirida pelo íon a partir de um estímulo inicial; por trajetória do íon em um campo magnético ou por condução do íon em um campo elétrico variável capaz de transportar apenas uma faixa muito estreita de m/z, dentre vários outros. Os íons seguem uma trajetória que é desviada mediante a aplicação de campos elétricos ou magnéticos situados na zona denominada analisador. A detecção consecutiva dos íons formados a partir das moléculas da amostra produz um sinal elétrico que, convenientemente amplificado, é registrado e representado graficamente91. Um resumo do processo integral de análise pela espectrometria de massa clássica é mostrado na Figura 9, onde M representa as moléculas de um composto 45 puro na fase gasosa. Após um processo de ionização, M+ se decompõe, criando íons de massas menores que, detectados, geram o espectro de massa. Figura 9- Modelo Esquemático de análise por espectrometria de massas Nesse projeto foi utilizada, para as análises espectrométricas, a ionização electrospray. Este tipo de ionização é atualmente, uma das principais técnicas utilizadas em espectrometria de massas, cobrindo um universo quase total de substâncias (tanto em termo de polaridade como em termo de massa molecular, requisitos principais na escolha do tipo de ionização a ser utilizado). A técnica de ionização por electrospray tem como princípio, transferir os íons existentes em uma solução para a fase gasosa, de uma maneira branda e suave. Esta versatilidade tem aumentado significativamente a gama de substâncias capazes de serem analisadas89. A ionização por electrospray envolve a formação de um spray eletrolítico de uma solução, que gera pequenas gotas carregadas e destas são liberados os íons. A implementação de uma fonte de electrospray é bastante simples se comparado com outras fontes de espectrometria de massas. É necessária uma fonte de alta tensão (1,0 a 7,0 KV) que esteja em contato com a solução contendo eletrólitos. Esta solução é bombeada através de um microcapilar (d.i. 50 a 100 μm) com uma velocidade de fluxo da ordem de 1 a 20 μL min-1 ou menores. No caso de fluxos menores que 1 μL min-1, denomina-se nanoelectrospray88-90. Quando um potencial positivo é aplicado na solução, os íons positivos tendem a se afastar para uma região menos positiva, isto é, em direção ao contra-eletrodo. Assim, a gota sendo formada na ponta do capilar estará enriquecida em íons 46 positivos. Conforme a densidade de carga aumenta na gota, o campo elétrico formado entre o capilar e o contra eletrodo aumenta provocando uma deformação na gota que está presa na ponta do capilar. A gota ganha forma de um cone, o qual é denominado cone de Taylor. Esta gota na forma de cone permanece “presa” ao capilar até o momento em que a densidade de carga na superfície da gota e o aumento da repulsão entre os íons vençam a tensão superficial, ocorrendo a liberação de pequenas gotas com alta densidade de carga. A freqüência deste processo depende da magnitude do campo elétrico, da tensão superficial do solvente e da condutividade da solução88-90. 47 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral Validar uma metodologia analítica para screening (qualitativo/quantitativo) de sulfonamidas em leite bovino e urina sintética, utilizando análise por injeção em fluxo com detecção espectrofotométrica na região visível visando a segurança alimentar, o desenvolvimento econômico e a geração de um produto de qualidade comprometido com a sustentabilidade ambiental. 2.2 Objetivos específicos Otimização dos parâmetros experimentais das novas metodologias desenvolvidas através de planejamento de experimentos; Validar um método de screening para a detecção (qualitativa/semi- quantitativa) de sulfametazina (SMZ), sulfatiazol (STZ) e sulfadimetoxina (SDM) em leite bovino e urina sintética. Confirmação da presença de sulfonamidas no leite bovino via cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas. (CL-EM) 48 3. PARTE EXPERIMENTAL Para o desenvolvimento deste trabalho foram realizados ensaios qualitativos preliminares para escolha do agente cromogênico com o objetivo de se definir uma reação adequada para a aplicação em FIA com detecção espectrofotométrica na região visível do espectro. Foi avaliado, com sulfonamidas, a reação de Greiss (naftiletilenodiamino) e os reagentes Iminodibenzil, p-dimetilaminobenzaldeído (p- DAB), p-dimetilaminocinamaldeído (p-DAC), A Tabela 2 ilustra os resultados obtidos. Tabela 2- Principais características dos experimentos realizados para escolha do reagente cromogênico do método Agente Cromogênico Cor do produto Intensidade da cor Produto estável Iminodibenzil Roxa Alta Não p-DAC Rosa Alta Sim Naftiletilenodiamino Violeta Baixa Sim p-DAB Amarelo Alta Sim Depois de realizado todos os testes, escolheu-se como reagente cromogênico p-DAC, devido sua maior sensiblidade para a reação em questão. 3.1. Materiais e equipamentos 3.1.1 Instrumentação básica As medidas de volume foram efetuadas com buretas classe A, micropipetas “Eppendorf” (10-100 μL) e (100-1000 μL). A vidraria utilizada no preparo das soluções foi de grau A e as pesagens foram realizadas em balança analítica AG204, da Mettler Toledo. Para solubilização dos reagentes, foi utilizado um banho de ultrassom, marca Thornton. Para medição do pH de algumas soluções foi usado um 49 pHmetro da marca Metrohm modelo 692 pH / íon meter. Uma centrifuga Sorvall® modelo RT7, foi usada para separação das fases sólidas, orgânicas e aquosas na extração de sulfonamidas em leite. 3.1.2 Análise por injeção em fluxo com detecção espectrofotométrica Para o desenvolvimento deste trabalho, o sistema de análise por injeção em fluxo escolhido foi por zonas coalescentes e para a construção do mesmo, utilizou- se uma bomba peristáltica de 8 canais Gilson Minipuls 3 equipada com tubos de bombeamento Tygon de diferentes diâmetros internos, um injetor de válvula rotatória confeccionado em acrílico, tubos de politetrafluoretileno de 0,8 mm de diâmetro interno foram usados para a confecção de alça de amostra e reagente, bobinas reacionais e linhas de transmissão. Para leitura dos valores de absorbâncias foi utilizado um espectrofotômetro FEMTO 600 Plus com o programa FemWin 670 e equipado com cubeta de fluxo com caminho ótico de 2 cm. A Figura 10 mostra a foto do sistema utilizado Figura 10- Foto do sistema FIA utilizado acoplado ao espectrofotômetro 50 3.2. Reagentes e soluções Para a preparação das soluções foi utilizada água destilada e purificada em sistema Milli-Q Gradiente (Millipore, Bedford, EUA) (18,2 mΩ cm-1). Todos os reagentes utilizados no desenvolvimento deste trabalho foram de grau analítico e encontram-se listados abaixo. a) As sulfonamidas utilizadas neste trabalho foram adquiridas da Henrifarma, São Paulo, Brasil. Todas com teor de pureza igual ou superior a 99,5%: Sulfametazina, Sulfatiazol, Sulfadimetoxina, Sulfamerazina, Sulfametoxazo, Sulfametoxipiridazina, Sulfacetamida e Sulfanilamida. b) p-DAC (p-dimetilaminocinamaldeído), (Aldrich®); c) Ácido clorídrico concentrado 37% (m/v) (MERCK); d) Metanol (Tedia); e) Etanol grau HPLC (J.T. Baker); f) Dodecil sulfato de sódio (SDS) (Sigma); g) Ácido acético (Synth); h) Acetonitrila (Tedia); i) Sulfato de magnésio anidro (Sigma); j) Cloreto de Sódio (Mallinckrodt); k) Acetato de Sódio (J.T. Baker); l) Cloreto de Cálcio dihidratado (Sigma-Aldrich); m) Sulfato de Sódio (Sigma-Aldrich); n) Uréia (J.T. Baker); o) Cloreto de potássio (Sigma-Aldrich); p) Cloreto de amônio (J.T. Baker), q) Fosfato diácido de potássio (J.T. Baker) r) Membrana de nylon 0,45μm (Millipore). 51 3.3. Preparo das soluções utilizadas a) Soluções de sulfonamidas de trabalho: Foram preparadas diariamente soluções estoque 100,00 mg L-1, pela dissolução de 100 mg de cada sulfonamida com 80 mL de etanol grau HPLC (exceto para sulfametazina que foi diluída em H2O desionizada) e quantitativamente transferidas para balão volumétrico de 1000,00 mL, tendo seu volume completado com água desionizada. Soluções padrão foram preparadas a partir de diluições adequadas das soluções estoque com H2O desionizada e utilizadas na construção das curvas analíticas (0,2 a 4,00 mg L-1). b) Solução estoque de HCl 2,17 mol L-1: foi preparada através da conveniente diluição do HCl concentrado (37,0% m/v) com água deionizada e adequadamente padronizada91. Soluções de trabalho foram preparadas por diluição com água desionizada. c) Solução estoque de dodecil sulfato de sódio (SDS) 0,10 mol L-1: foi preparada semanalmente através da dissolução de 14,24 g de SDS em aproximadamente 200 mL de água desionizada. Esta solução foi quantitativamente transferida para balão volumétrico de 500,00 mL e o volume completado com água desionizada. Soluções de trabalho foram convenientemente preparadas através de diluição com água desionizada. d) Solução de p-DAC (p-dimetilaminocinamaldeído) 0,067% m/v em HCl 0,04 mol L-1 e SDS 0,014 mol L-1: foi preparada pela dissolução de 0,0334 g de p- DAC, para a solubilização, utilizava-se 0,923 mL de HCl 2,17 mol L-1 e 7 mL de SDS 0,10 mol L-1. Esta solução foi quantitativamente transferida para balão volumétrico de 500,00 mL e o volume completado com água desionizada. e) Solução de ácido acético 1% v/v: 1 mL de ácido acético glacial foi transferido para balão de 100,00 mL e o volume foi completado até a marca com acetonitrila. f) Solução de cloreto de sódio 0,25 mol L-1: foi preparada pela dissolução de 7,25 g de NaCl em água desionizada para um balão volumétrico de 500,00 mL. 52 3.4. Procedimento para preparo das amostras 3.4.1 Leite bovino Amostras de leite longa vida desnatado (caixas de 1 litro) foram adquiridas, dentro de seus prazos de validades, em supermercados da cidade de Araraquara/SP. As amostras foram fortificadas com quantidades conhecidas de soluções-padrão de sulfonamidas e na sequência submetidas a tratamentos de extração liquido-liquido. 3.4.1.1 Procedimento empregando extração liquido-liquido Para o tratamento do leite bovino desnatado utilizou a metodologia QuEChERS92. Esse método, que tem como vantagens ser rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e seguro, explora as possibilidades oferecidas pela instrumentação analítica moderna, sendo que durante o seu desenvolvimento, grande ênfase foi dada para a obtenção de um procedimento dinâmico, que pudesse ser aplicado em qualquer laboratório, devido à simplificação das etapas93. Em tubos de centrifuga de 50 mL, 10 g de leite desnatado foram pesados, na sequência 1,00 mL de soluções-padrão de sulfonamidas (STZ, SMZ e SDM) foi adicionado as amostras de leite separadamente de modo que as concentrações finais fossem de 0,1; 0,2 e 0,3 mg L-1 para cada sulfonamida. Um volume de 10 mL da solução de 1% (v/v) de acido acético em acetonitrila foi adicionado ao tubo e este agitado por 1 minuto. Em seguida, 4 g de sulfato de magnésio anidro e 1 g de cloreto de sódio foram adicionados a mistura, novamente o tubo foi agitado por 1 minuto e centrifugado por 10 minutos a 4000 rpm. Então, 8 mL do sobrenadante foram retirados e evaporados até a secura em banho termostetizado à 50°C (1 hora aproximadamente), o resíduo foi recuperado com 2 mL de SDS 0,014 mol L-1 e filtrado em membrana da Millipore de 0,45 μm. O procedimento realizado está esquematizado no fluxograma a seguir: 53 Figura 11- Fluxograma Ilustrativo das etapas da metodologia QuEChERS. 3.4.2 Urina sintética O procedimento de preparo da solução de urina sintética foi semelhante ao descrito por Griffith et al.94. As sulfonamidas após administração são absorvidas estabelecendo níveis terapêuticos de 0,5 – 1,0 g L-1 sangue e excretadas posteriormente pela urina95. A aplicação do procedimento em fluxo desenvolvido na análise direta de amostras de urina não foi possível devido à grande quantidade de uréia presente na matriz, a qual reage com o p-DAC, interferindo significativamente na reação proposta no trabalho. Fortificar com solução padrão de sulfa Agitar por 1 minuto 10 mL de amostra (leite) 10 mL de solução de ácido acético 1% em acetonitrila 4,0 g de MgSO4 e 1,0g de NaCl Agitar por 1 minuto e centrifugar por 10 min Retirar 10 mL de sobrenadante Evaporar até a secura Recuperar o analito com 2 mL de solução de SDS 0,014 mol L-1 Leitura no sistema FIA Filtrar a 0,45μm 54 A eliminação deste interferente foi feita via hidrólise enzimática da uréia promovida pela urease. Como fonte natural de urease foi utilizada a leguminosa Cajanus cajan, conhecido popularmente como feijão Guandu96. Foram feitos alguns testes preliminares para verificar a eficiência da enzima presente na leguminosa para a hidrólise da uréia. Figura 12- Espectros de absorção comparativos para verificar a interferência da uréia. Pela Figura 12, pode-se concluir que a uréia, interferente da reação proposta, foi realmente hidrolisada, produzindo amônia e gás carbônico, que não interferem na reação. 55 3.4.2.1 Preparo das amostras de urina sintética O feijão Guandu, fonte natural da enzima urease, foi adquirido em estabelecimento comercial na cidade de Araraquara. Inicialmente, removeu-se a pele dos grãos, e após secagem completa foram triturados com auxilio de um moinho. Antes da utilização dos fragmentos de feijão para a eliminação da uréia, estes eram deixados em uma solução de NaCl 0,25 mol L-1 para um condicionamento prévio96. Soluções de urina sintética foram fortificadas separadamente com solução padrão de sulfametazina, sulfametoxazol e sulfadimetoxina nas concentrações de 5, 10 e 15 mg L-1. Após a fortificação, cada amostra foi adicionada a um béquer contendo 0,5 g de fragmentos do feijão. Em seguida o béquer foi deixado em um banho de ultra-som por 20 minutos. Após esse tempo, o cheiro característico da amônia já podia ser notado, posteriormente, o conteúdo de cada béquer foi devidamente filtrado em um sistema de filtração a vácuo. Na seqüência, retirou-se 1,00 mL de cada solução obtida após a filtragem (triplicatas) e transferiu-se para balões volumétricos de 10,00 mL, completando-os com água desionizada, a fim de se obter concentrações finais de 0,5; 1,0 e 1,5 mg L-1 . Essas novas soluções obtidas foram analisadas utilizando o sistema FIA. 56 4. METODOLOGIA, RESULTADOS E DISCUSSÃO Experimentos preliminares feitos em nosso laboratório com a reação de sulfonamidas e p-dimetilaminocinamaldeído em meio ácido demonstraram a formação de um produto colorido (cor rosa), com valor máximo de Absorbância em 555 nm, como mostra a Figura 13. Figura 13- Espectro de absorbância da reação entre p-DAC em meio de ácido clorídrico e sulfonamidas (STZ,SMZ, SDM). O valor máximo de Abs foi obtido em 555 nm. Concentração das sulfas = 2,5 mg L-1 As aminas por possuírem um par de elétrons livres do átomo de nitrogênio, são excelentes doadores de elétrons e podem, dessa maneira, interagir fortemente com espécies receptoras de elétrons como o p-DAC. A reação entre aminas 57 aromáticas e p-DAC envolve a condensação do grupo amino-protonado, com o grupo carbonila do reagente p-DAC produzindo um sal iminio97-98. Na Figura 14 é apresentada a provável reação entre a sulfonamida e o p- DAC, em meio ácido. Neste esquema a reação foi ilustrada utilizando a sulfametazina como sulfonamida modelo. Figura 14- Provável reação entre sulfametazina e p-DAC em meio ácido. 4.1. Verificação do efeito do SDS sobre a reação proposta Para melhoria da sensibilidade analítica sistemas envolvendo surfactantes têm sido comumente usados, pois seu uso está relacionado à formação de micelas NH2 O O S N H N N CH3 H3C NH3 O O SN H N N CH3 H3C N H2 O O SHN NN CH3 H3C -H2O + H+ N N H3C CH3 HN S O O N H H C N CH3 CH3 N N H3C CH3 HN S O O N H H C N CH3 CH3 Sulfametazina (SMTz) Sal imino p-Dimetilaminocinemaildeido (p-DAC) C H HC O H C N CH3 CH3 C H CH HO H C N CH3 CH3 C H H C H CC H 58 que são capazes de mudar o equilíbrio, propriedades espectrais e a cinética de reações99,100. Seu efeito catalítico tem sido objeto de estudo em reações de condensação de aldeídos como p-DAC com aminas101. Dessa forma, experimentos preliminares foram feitos com o objetivo de investigar a influência do surfactante dodecil sulfato de sódio (SDS). A Tabela 3 apresenta os resultados de testes feitos com e sem o uso do surfactante SDS tanto na solução do reagente cromogênico quanto na solução do próprio analito. Tabela 3- Valores de absorbância (555 nm) relativos aos testes com surfactante Sulfametazina (10 mg L-1 e SDS 0,01 mol L-1) + p-DAC (0,054 % em HCl 0,03 mol L-1 e SDS 0,01 mol L-1) Abs (λ= 555nm) Analito sem SDS + p-DAC sem SDS 0,285 Analito com SDS + p-DAC sem SDS 1,50 Analito sem SDS + p-DAC com SDS 0,480 Analito com SDS + p-DAC com SDS 2,50 Com a realização dos testes, verificou-se que a reação ocorre instantaneamente após a adição do SDS, resultando em um produto de coloração rosa bem intensa (Figura 15), porém para uma mesma concentração de sulfametazina a coloração da solução foi visivelmente menos intensa sem a presença do surfactante SDS. Decidindo dessa forma, utilizar o meio micelar na reação proposta a fim de obter melhor sensibilidade. 59 Figura 15- Foto do produto formado na reação da sulfametazina com p-DAC, ambos em meio de SDS. 4.2. Estudo e otimização das condições experimentais Neste trabalho o planejamento de experimentos foi aplicado com o objetivo de encontrar a melhor condição experimental, na qual um valor máximo para a intensidade de absorbância em 555 nm pode ser obtido, ou seja, uma melhor sensibilidade analítica. A otimização das condições experimentais para a metodologia proposta foi feita por meio dos planejamentos fatorial e composto central para a obtenção da superfície de resposta. Todos os resultados obtidos foram analisados utilizando o programa Statistica versão 6.0. 4.2.1 Planejamento Fatorial Fracionário Inicialmente uma triagem das variáveis que afetam a reação foi realizada através de um planejamento fatorial fracionário 2(7-3), o qual foi realizado em triplicata e as variáveis: concentração de p-DAC, concentração de HCl, concentração de SDS, alça da amostra, alça do reagente, bobina de reação e rotação da bomba 60 foram estudadas em dois níveis [baixo (-1) e alto (+1)], conforme ilustrado na Tabela 4. A concentração da solução de sulfametazina (SMZ) utilizada para realizar os experimentos do planejamento fatorial fracionário foi de 2,5 mg L-1. Tabela 4 - Variáveis examinadas e seus níveis estudados no planejamento fracionário 27-3 realizado para a otimização do procedimento de screening por análise em fluxo Variáveis Nivel (-1) Nivel (+1) p-DAC / % m/v 0,01 0,03 HCl / mol L-1 0,02 0,06 SDS / mol L-1 0,01 0,03 Alça do reagente / cm 50 100 Alça da amostra / cm 50 100 Bobina de reação / cm 60 100 Rotação da bomba/ rpm 10 20 A Tabela 5 mostra a matriz codificada e seus respectivos valores de absorbâncias obtidos. Tabela 5- Matriz do planejamento fatorial fracionário 2(7-3) Ensaios [p-DAC] [HCl] [SDS] Alça da amostra Alça do reagente Bobina da reação Rotação 1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 2 1 -1 -1 -1 1 -1 1 3 -1 1 -1 -1 1 1 -1 4 1 1 -1 -1 -1 1 1 5 -1 -1 1 -1 1 1 1 6 1 -1 1 -1 -1 1 -1 7 -1 1 1 -1 -1 -1 1 8 1 1 1 -1 1 -1 -1 9 -1 -1 -1 1 -1 1 1 10 1 -1 -1 1 1 1 -1 11 -1 1 -1 1 1 -1 1 12 1 1 -1 1 -1 -1 -1 13 -1 -1 1 1 1 -1 -1 14 1 -1 1 1 -1 -1 1 15 -1 1 1 1 -1 1 -1 16 1 1 1 1 1 1 1 61 Depois de realizados os experimentos sob as condições descritas, os valores de absorbâncias obtidos e os respectivos coeficientes de variação, estão representados na Tabela 6. Posteriormente, pode-se gerar os gráficos que fornecem características importantes sobre as influências das variáveis estudadas na reação proposta. Tabela 6 - Valores de Absorbâncias. (λ=555 nm) dos experimentos do planejamento fatorial fracionário e os respectivos coeficientes de variação. Número de replicatas= 3 Média de Abs (λ=555 nm) C. V (%) 0,482 3,02 0,347 1,23 0,481 2,06 0,458 2,65 0,323 1,23 0,518 0,34 0,242 0,51 0,399 1,98 0,412 1,47 0,838 0,91 0,579 0,3 0,633 1,88 0,428 1,16 0,400 4,06 0,132 1,15 0,519 2,03 62 A Figura 16 apresenta o gráfico de efeitos principais das variáveis estudadas. Figura 16- Efeitos principais das variáveis estudadas no sinal de absorbância obtido. Analisando a Figura 16, verificam-se quais são as variáveis que estão influenciando significativamente. Observa-se que as duas variáveis mais significativas são: concentração de p-DAC e concentração de SDS, sendo que para obtenção de um maior sinal, deve-se aumentar a concentração de p-DAC, e diminuir a concentração de SDS. Entretanto, para as outras variáveis em questão, os valores de absorbância tanto no nível (-1) quanto no nível (+1) estão bem próximas, não alterando muito a sensibilidade da reação, concluindo-se então que essas variáveis não são significativas para o sistema. A mesma conclusão pode ser observada pelo Gráfico de barras (figura 17), pois dentro de um limite de confiança de 90% (α=0,10), somente as variáveis concentração de p-DAC e concentração de SDS estão sendo relativamente mais significantes. 63 Figura 17- Gráfico de barras dos efeitos das variáveis. A partir destes resultados, fixaram-se os valores das variáveis menos significativas: concentração de HCl 0,04 mol L-1, alça de reagente de 50 cm, alça de amostra de 60 cm, rotação da bomba de 15 rpm e bobina de reação de 100 cm. Determinou-se também a faixa de concentração das variáveis experimentais para o estudo em questão (p-DAC: 0,060 - 0,120% e SDS 0,008 - 0,02 mol L-1) e iniciou-se o estudo do seu efeito pelo planejamento de composto central visando a obtenção da superfície de resposta. 4.2.2 Metodologia de superfície de resposta Após a triagem por meio do planejamento fatorial 2(7-3) e seleção das faixas de concentração das variáveis para o estudo, deu-se seqüência à otimização das condições experimentais aplicando-se o planejamento composto central em cinco níveis para a obtenção da superfície de resposta. Diversos testes foram realizados na tentativa de obter os valores ótimos paras as duas variáveis, muitas faixas de concentrações foram avaliadas e as faixas (concentrações de p-DAC e de SDS) para finalização do processo de otimização estão apresentadas na Tabela 7. 64 Tabela 7 - Variáveis estudadas e níveis estabelecidos no planejamento de composto central Níveis Reagentes -1,41 -1 0 +1 +1,41 [p-DAC] (%) 0,060 0,069 0,090 0,111 0,120 [SDS] (mol L-1) 0,008 0,009 0,014 0,018 0,020 Para a realização deste planejamento foram feitas combinações dos diferentes níveis de cada uma das variáveis, totalizando-se treze ensaios, os quais são apresentados na Tabela 8. Tabela 8 - Matriz (codificada) de ensaios utilizados no planejamento de composto central Ensaio Nível [p-DAC] Nível [SDS] 1 - 1 - 1 2 + 1 - 1 3 - 1 + 1 4 + 1 + 1 5 - 1,41 0 6 + 1,41 0 7 0 - 1,41 8 0 + 1,41 9 0 0 10 0 0 11 0 0 12 0 0 13 0 0 Realizados os ensaios do planejamento composto central, os resultados foram analisados usando o programa Statistica versão 6.0. Na Tabela 9 estão representadas as concentrações finais de SDS e p-DAC dos ensaios estabelecidos pelos níveis do planejamento assim como os valores de absorbância e seus respectivos coeficientes de variação. 65 Tabela 9 - Valores de absorbância (555 nm) e seus respectivos coeficientes de variação obtidos para o planejamento composto central. Número de replicatas: 3. Ensaio [p-DAC] (%)[ [SDS] (mol L-1) Abs (555nm) C V (%) 1 0,069 0,010 0,455 1,550 2 0,111 0,010 0,474 0,600 3 0,069 0,018 0,457 1,390 4 0,111 0,018 0,463 0,610 5 0,060 0,014 0,515 1,370 6 0,120 0,014 0,466 1,210 7 0,090 0,008 0,476 0,590 8 0,090 0,020 0,473 0,300 9 0,090 0,014 0,494 1,150 10 0,090 0,014 0,486 1,160 11 0,090 0,014 0,488 1,880 12 0,090 0,014 0,473 3,730 13 0,090 0,014 0,488 0,580 As técnicas matemáticas e estatísticas existentes podem ser aplicadas à exploração de informações para obtenção de dados analíticos importantes. O planejamento composto central, por ser um modelo matemático quadrático permite avaliar criticamente a condição ótima para a realização dos experimentos por meio do gráfico de superfície de resposta apresentado na Figura 18 juntamente com sua respectiva curva de nível, nela a região do valor máximo de absorbância está situada na área mais escura do gráfico, que representa as condições experimentais ótimas para a reação. Nesta região encontra-se também o ponto central do planejamento. Os resultados obtidos a partir deste planejamento (Tabela 9) foram ajustados a um modelo matemático quadrático descrito pela Equação 01. A equação 01 inclui os termos lineares (x e y) e quadráticos (x2 e y2) bem como o produto dos pares dos efeitos lineares (xy). Nesta equação, Z representa a absorbância em 555 nm, e as variáveis x e y são: concentração de e concentração de p-DAC e HCl , respectivamente. Z= 3,037 x 10-1 + 1,329X – 6,027x2 + 19,54y -595,1y2 – 36,11xy (Eq. 01) 66 Figura 18. Superfície de resposta otimizada com sua respectiva curva de nível para a medida de absorbância em 555 nm em função das variáveis: concentração de p- DAC (mol L-1) e concentração de SDS (mol L-1). Concentração de sulfonamida utilizada foi de 2,5 mg L-1. 67 O software empregado para obtenção da superfície de resposta forneceu os valores críticos de concentrações de p-DAC e HCl a serem utilizados para obtenção do melhor sinal analítico assim como também o seu valor de absorbância esperado. Esses valores foram calculados pelo software e em seguida, foram medidos experimentalmente para comparação entre os mesmos. Os resultados estão apresentados na Tabela 10. Tabela 10 - Concentrações das variáveis em condições experimentais ótimas e seus respectivos valores de absorbância (555nm). n = 10. Variáveis Valores Críticos Abs calculada Abs medida C V (%) [p-DAC] (%) 0,067 0,488 0,479 ± 0,002 0,473 [SDS] (mol L-1) 0,014 Os resultados de Abs calculado e medido foram comparados e concluiu-se que os mesmos foram repetitivos e estão concordantes entre si, apresentando um coeficiente de variação de 0,473%. O valor calculado de (-3,52) não excedeu o valor teórico tabelado (1,8595), portanto os resultados não apresentam diferenças em nível de confiança de 95,0%. A Tabela 11 apresenta os principais resultados obtidos na análise de variância (ANOVA) realizada após a obtenção do gráfico de superfície de resposta. Tabela 11- Análise de variância dos resultados obtidos no planejamento composto central Fontes de variação GL SQ Variância F P [p-DAC] 2 0,000051 0,000245 0,789308 0,403803 [SDS] 2 0,000798 0,000022 0,070542 0,798202 [p-DAC] x [SDS] 1 0,000042 0,000042 0,135962 0,723229 Erro 7 0,002175 0,000311 Total 12 0,003295 S=0,003107; R2=0,33988. GL: graus de liberdade; SQ: Soma de quadrados; F: valor do teste F; P; valor de significância; S: desvio padrão. 68 A Tabela 12, ilustra as condições otimizadas para o método. Tabela 12- Condições otimizadas do método para determinação de sulfonamidas Variáveis Valores ótimos [p-DAC] / % m/v 0,067 [HCl] / (mol L-1) 0,04 [SDS] /(mol L-1) 0,014 Alça de reagente / cm e μL 50 e 251 Alça de amostra /cm e μL 60 e 302 Bobina de reação / (cm) 100 Rotação da bomba / rpm 15 Vazão (mL min-1) 1 4.3 Construção das curvas analíticas Após a otimização do sistema de análise por injeção em fluxo (FIA) utilizando a sulfonamida – Sulfametazina como molécula modelo, o sistema desenvolvido foi aplicado para a análise das demais sulfonamidas. Entretanto, o presente trabalho priorizou o estudo de três tipos de sulfonamidas: sulfametazina (SMZ), sulfadimetoxina (SDM) e sulfatiazol (STZ). Tais substâncias estão no Programa Nacional de Análise de Resíduos de Medicamentos Veterinários em Alimentos Expostos ao Consumo (PAMVet). Foram construídas curvas analíticas individuais para todas as sulfonamidas, utilizando o sistema otimizado representado na Figura 10, os valores de absorbância obtidos neste estudo estão apresentados na tabela 13. 69 Tabela 13- Valores de absorbância (555nm) relativos as oito sulfonamidas estudadas: Sulfametazina(SMZ), Sulfadimetoxina (SDM), Sulfatiazol (STZ), Sulfacetamida (SCA), Sulfamerazina (SMR), Sulfametoxazol (SMX), Sulfametoxipiridazina (SMP) e Sulfadiazina (SDZ) Na Figura 19 são mostradas as curvas analíticas obtidas no estudo de linearidade para cada uma das sulfonamidas estudadas. A faixa de concentração em que uma relação linear foi observada entre o valor de A555nm e a concentração das sulfonamidas foi de 0,2 – 4,0 mg L-1 e as equações destas curvas estão apresentadas na Tabela 14 bem como os limites de detecção (LOD = 3 SDBranco / inclinação da reta) e de quantificação (LOQ = 10 SDBranco /inclinação da reta) determinados de acordo com as recomendações da IUPAC102. Concent. (mg L-1) Abs (SMZ) Abs (STZ) Abs (SDM) Abs (SCA) Abs (SMR) Abs (SMX) Abs (SMP) Abs (SDZ) 0,2 0,031 0,040 0,030 0,048 0,068 0,042 0,052 0,055 0,4 0,064 0,082 0,065 0,098 0,106 0,091 0,108 0,113 0,8 0,167 0,179 0,147 0,189 0,186 0,196 0,212 0,228 1,0 0,199 0,226 0,209 0,257 0,230 0,246 0,256 0,298 1,5 0,270 0,334 0,303 0,356 0,338 0,338 0,387 0,459 2,0 0,364 0,441 0,390 0,470 0,454 0,463 0,507 0,586 2,5 0,441 0,569 0,506 0,568 0,569 0,586 0,616 0,768 3,0 0,554 0,677 0,590 0,678 0,664 0,705 0,756 0,925 4,0 0,752 0,891 0,828 0,888 0,880 0,916 0,981 1,216 70 Figura 19- Curvas analíticas para as sulfonamidas estudadas. As concentrações das Soluções-padrão de sulfonamidas compreendem a faixa de concentração de 0,2 a 4,00 mg L-1. Cada ponto foi analisado em replicatas (n = 3). A Figura 20 representa os sinais transientes obtidos no monitoramento da absorbância em função do tempo durante a construção da curva analítica. Nesta figura são representados os resultados obtidos para a sulfametazina. 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 Sulfamerazina Sulfatiazol Sulfametoxazol Sulfacetamida Sulfametazina Sulfadimetoxina Sulfanilamida SulfametoxipiridazinaA bs or bâ nc ia Concentração (mg.L-1) 71 Figura 20- Registro dos sinais transientes obtidos no monitoramento da absorbância em 555 nm em função do tempo durante a construção da curva analítica para sulfametazina. Da esquerda para direita são apresentados os valores de concentração em mg L-1. Tabela 14: Figuras de mérito cada uma das sulfonamidas estudadas pelo procedimento FIA desenvolvido Sulfonamidas Equação da reta r2 a LOD b (mg L-1) LOQ c (mg L-1) Sulfametazina y = -0,00130 + 0,18531.x 0,99845 0,054 0,180 Sulfacetamida y = 0,01801 + 0,22020.x 0,99924 0,045 0,151 Sulfamerazina y = 0,01895 + 0,21587.x 0,9998 0,046 0,154 Sulfatiazol y = -0,00335 + 0,22527.x 0,99982 0,044 0,148 Sulfametoxazol y = 0,00373 + 0,23048.x 0,99953 0,043 0,149 Sulfadimetoxina y= -0,01354 + 0,20713.x 0,99917 0,048 0,161 Sulfanilamida y=-0,000228 + 0,30533.x 0,99871 0,032 0,108 Sulfametoxipiridazina y=0,01227 + 0,24445.x 0,99971 0,041 0,139 72 Para avaliar a precisão do método desenvolvido estudos de repetitividade foram feitos. Para isto, análises em replicata (n=10) foram realizadas no mesmo dia e em dias diferentes (repetitividade intra-dia e inter-dia), os quais apresentaram excelentes resultados , constatando-se a boa repetibilidade do sistema. Esses experimentos foram realizados com a concentração de sulfametazina de 2,5 mg L-1 e os resultados são apresentados a seguir na Tabela 15. Tabela 15: Verificação das repetibilidades intra e inter-dia para sulfametazina. Média de Abs (555 nm) C V (%)* Repetitividade Intra-dia 0,499 ± 0,015 3,05 Repetitividade Inter-dia** 0,515 ± 0,0063 1,23 * n = 3 ** durante 3 dias 4.4 Análise das amostras 4.4.1 Aplicação em amostras de leite bovino As amostras de leite desnatado foram tratadas conforme os procedimentos descritos nos itens 3.4.1.1 e um branco da mesma amostra também foi preparado. A absorbância foi medida em 555nm. Realizaram-se 3 repetições em cada análise. Os resultados para análise de sulfonamidas se encontram na Tabela 16, os quais foram satisfatórios, uma vez que o objetivo deste trabalho é fornecer uma resposta binária sim/não com relação à presença de sulfonamidas em leite (screening), fornecendo também uma idéia semiquantitativa das recuperações obtidas no método. 73 Tabela 16. Resultados de recuperação de sulfonamidas adicionadas nas amostras de leite. Amostras de leite desnatado Sulfonamida Adicionada (mg L–1) Recuperação a (%) R.S.Db (%) STZ 0,1 65,7 ± 7,40 11,2 0,2 65,7 ± 7,40 11,2 0,3 60,4 ± 0,57 0,95 SMZ 0,1 63,4 ± 4,80 7,60 0,2 56,9 ± 2,10 3,80 0,3 60,7 ± 4,30 7,00 SDM 0,1 67,7 ± 7,40 10,9 0,2 64,3 ± 1,90 2,90 0,3 62,3 ± 4,20 6,70 a Média ± desvio padrão (n=3). b Desvio padrão relativo. A Figura 21 mostra os sinais transientes obtidos durante a análise realizada nas amostras de leite bovino desnatado para as três sulfonamidas estudadas. 74 Figura 21: Registro dos sinais transientes obtidos no monit