RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 24/09/2023. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Warne Pedro de Andrade DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DA HIPERTERMIA EM MODELO IN VITRO DE HIPEC SOBRE AS LINHAGENS DE CÉLULAS DE CÂNCER DE OVÁRIO: IMPLICAÇÕES DA EXPRESSÃO DOS GENES DAS PROTEÍNAS DO CHOQUE TÉRMICO E RESISTÊNCIA À PLATINA Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor(a) em Tocoginecologia: Área de Cancerologia. Orientador: Prof. Dr. Agnaldo Lopes da Silva Filho Coorientadora: Profa. Dra. Luciana Maria Silva Lopes Botucatu (2021) Warne Pedro de Andrade DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DA HIPERTERMIA EM MODELO IN VITRO DE HIPEC SOBRE AS LINHAGENS DE CÉLULAS DE CÂNCER DE OVÁRIO: IMPLICAÇÕES DA EXPRESSÃO DOS GENES DAS PROTEÍNAS DO CHOQUE TÉRMICO E RESITÊNCIA À PLATINA Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para obtenção do título de doutor em Tocoginecologia: Área de Cancerologia Orientador: Prof. Dr. Agnaldo Lopes da Silva Filho Coorientadora: Profa. Dra. Luciana Maria Silva Lopes Botucatu 2021 FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUIS. TRATAMENTO DA INFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CÂMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/5651 Andrade, Warne Pedro. Determinação dos efeitos da hipertermia em modelo in vitro de HIPEC sobre as linhagens de células de câncer de ovário : implicações da expressão dos genes das proteínas do choque térmico e resistência à platina / Warne Pedro Andrade. - Botucatu, 2021 Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Faculdade de Medicina de Botucatu Orientador: Agnaldo Lopes da Silva Filho Coorientador: Luciana Maria Silva Lopes Capes: 40101150 1. Ovários - Tumores. 2. Hipertermia. 3. Técnicas in vitro. 4. Proteínas de choque térmico. 5. Expressão gênica. Palavras-chave: Câncer de ovário; HIPEC; Proteínas de choque térmico; Resistência à platina. Dedicatória ___________________________________________________________ Dedicatória À minha esposa Tatiana Torres Lisboa de Andrade, meus filhos João Pedro e Amanda pela compreensão das horas em que me fiz ausente e pelas palavras que me deram incentivo e perseverança para a conclusão dessa jornada. Agradeço por cada minuto ao lado de vocês. Do fundo do meu coração, obrigado por existirem na minha vida. Nosso lema continua “No final, tudo dá sempre certo¨. Minha eterna gratidão. Gratidão!! Agradecimentos Especiais ___________________________________________________ Agradecimentos Especiais À minha mãe Maria José de Andrade pelo início de toda a caminhada, obrigado pelo dom da vida e por tudo. GRATIDÃO! Ao amigo professor Agnaldo, obrigado pela amizade e parceria. Você é simplesmente genial. Me desculpe por tantos questionamentos e mudanças de rotas. Você me fez entender que o simples é mais e no caos da pandemia temos que ter calma e perseverança. Estaremos sempre juntos. Gratidão! Ao amigo de mais uma jornada juntos, Gabriel Oliveira Bernardes Gil pela amizade, parceria no dia a dia. Juntos somos mais fortes.!!! Amizade por resto da vida. Gratidão!!!! Agradecimentos _______________________________________________________ Agradecimentos Agradeço à Profa. Dra. Luciana Maria Silva Lopes e toda equipe da FUNED, pelo apoio logístico e pelo tempo dedicado à sua coorientação. Obrigado por ter acreditado no meu projeto, apoiar as minhas ideias. Você realmente e corajosa, forte e, ao mesmo tempo, ¨mãe inspiradora de ciência¨ no seu laboratório e na vida. Gratidão!!! Ao Bryan Ôrtero Perez Gonçalves e Iago Oliveira Peixoto pelo apoio no laboratório, pelas aulas de pipetagem e pelo apoio técnico. Minha gratidão. À Renata Garcia Fernandino, pelo apoio, inspiração e por ter me apresentado às proteínas do choque térmico. Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ginecologia, Obstetrícia e Mastologia da Faculdade de Medicina de Botucatu da UNESP, em especial à Solange Sako Cagliari por toda a dedicação. Você é nota 10! Epígrafe ___________________________________________________________________ Epígrafe “A certidão de nascimento” do câncer é um papiro egípcio do século VII antes de Cristo em que um médico descreve uma “massa saliente no peito” para qual o tratamento não existia. No entanto, são raras as referências à doença antes do século XIX. O motivo é simples: As pessoas morriam de outros flagelos como tuberculose, cólera varíola, peste ou pneumonia. Nesse sentido, o câncer é uma moléstia da civilização moderna, não tanto pelos malefícios causados por ela, mas porque, com o prolongamento da vida humana, foi levado para o primeiro plano. Só na metade do século XX é que se intensificou a batalha épica da medicina contra um mal cuja a causa era desconhecida. Texto do livro “O Imperador de todos os males” (Siddhata Mukherjee) “Câncer: uma dialética da vida e da morte” (Warne Pedro de Andrade) Resumo ______________________________________________________________ Resumo Andrade, W.P. DETERMINAÇÃO DOS EFEITOS DA HIPERTERMIA EM MODELO IN VITRO DE HIPEC SOBRE AS LINHAGENS DE CÉLULAS DE CÂNCER DE OVÁRIO: IMPLICAÇÕES DA EXPRESSÃO GÊNICA DE PROTEÍNAS DO CHOQUE TÉRMICO E RESITÊNCIA À PLATINA. 2021. 115 f, Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2021 INTRODUÇÃO: O câncer epitelial de ovário (EOC) é a neoplasia maligna ginecológica mais letal, com a presença de quimiorresistência contribuindo para o pior prognóstico. Aproximadamente 80 por cento dos casos são diagnosticados no estágio III C e são tratados com cirurgia de citorredução seguida de quimioterapia adjuvante. No entanto, 70 por cento desses pacientes têm recorrências pélvicas e peritoneais. As Proteínas de Choque Térmico são produzidas em resposta ao estresse fisiopatológico e participam de diversos estágios da carcinogênese, atuando principalmente como agentes antiapoptóticos. Elas também estão implicadas na resistência à quimioterapia em vários tipos de tumores. Na tentativa de melhorar os resultados oncológicos, novas abordagens terapêuticas, como quimioterapia intraperitoneal e HIPEC, foram propostas em estudos recentes com ganhos na sobrevida global (SG). No entanto, algumas questões ainda não foram respondidas. MÉTODO: No estudo, culturas de células de câncer de ovário TOV-21G (carcinoma de células claras), SKOV-3 (carcinoma seroso resistente à platina) e OV-90 (seroso de alto grau) foram utilizadas. O ensaio de citotoxicidade celular (MTT) foi realizado. As linhagens de células de câncer de ovário foram tratadas com cisplatina em normotermia (37ºC) e cisplatina em hipertermia (41ºC) e um grupo controle tratado com solução salina PBS de 37 a 41ºC) por 24 horas, seguido por nova suplementação e uma nova incubação de três horas. Um ensaio clonogênico foi realizado. Em seguida, foram submetidos à extração de RNA e transcrição reversa. O qRT-PCR foi realizado para comparar a expressão de TRAP1, HSPB1, HSPD1, HSPA1A e HSPA1L em diferentes tratamentos. RESULTADOS: Não houve diferença significativa quanto à citotoxicidade no tratamento com cisplatina aquecida em relação ao tratamento com normotermia. Não foi possível avaliar a expressão gênica das proteínas de choque térmico na linhagem SKOV-3. Os genes HSPB1, HSPD1 e TRAP1 foram regulados positivamente em OV- 90 submetido à hipertermia em relação à normotermia. Não houve alterações significativas na expressão gênica na linhagem TOV-21G. CONCLUSÃO: A linhagem ______________________________________________________________ Resumo de células serosas de câncer de ovário OV-90, após tratamento com cisplatina aquecida, teve os genes de choque térmico HSPA1A, TRAP1 e HSPB1 regulados positivamente. O gene HSPB1 apresentou a expressão de valor mais significativa. Nosso resultado mostrou que os genes do choque térmico podem estar relacionados à fenotipagem de resistência à quimioterapia encontrada neste tumor. O uso de everolimus tem o potencial de sensibilizar a citotoxicidade em um modelo usando cisplatina aquecida e melhorar resultados. Assim, é necessário avaliar esses genes em um estudo clínico de HIPEC. Palavras-chave: câncer de ovário, resistência à platina, proteínas de choque térmico, HIPEC. Abstract _____________________________________________________________ Abstract DETERMINATION OF THE EFFECTS OF HYPERTHERMIA IN A HIPEC IN VITRO MODEL ON OVARY CANCER CELL LINES: IMPLICATIONS OF HEAT SHOCK PROTEIN GENES EXPRESSION AND PLATINUM RESISTANCE INTRODUCTION: Epithelial ovarian cancer (EOC) is the most lethal gynecological malignancy, with the presence of chemoresistance contributing to the poor prognosis. Approximately 80% of cases are diagnosed in stage III C and are treated with cytoreduction surgery followed by adjuvant chemotherapy. However, 70 percent of these patients have pelvic and peritoneal recurrences. Heat Shock Proteins are produced in response to pathophysiological stress and take part in several stages of carcinogenesis, acting primarily as anti-apoptotic agents. They are also implicated in resistance to chemotherapy in several types of tumors. In an attempt to improve oncological results, new therapeutic approaches such as intraperitoneal chemotherapy and HIPEC have been proposed in recent studies with gains in overall survival (OS). However, some questions have not yet been answered. METHODS: In the study, cultures of ovarian cancer cells TOV-21G (clear cell carcinoma), SK-OV3 (platinum- resistant serous carcinoma), and OV-90 (high-grade serous). Cell cytotoxicity (MTT) assay was performed. The ovarian cancer cells lines were treated with cisplatin in normothermia (37 degrees Celsius) and cisplatin in hyperthermia (41 degrees Celsius) and a control group treated with PBS saline solution at (37 degrees Celsius and 41 degrees Celsius) for 24 hours, followed by new supplementation and a new three hours incubation. A clonogenic assay was performed. Then they were submitted to RNA extraction and reverse transcription. qRT-PCR was performed to compare the expression of TRAP1, HSPB1, HSPD1, HSPA1A and HSPA1L in different treatments. RESULTS: There was no statistical difference concerning cytotoxicity between treatment with heated cisplatin and treatment with normothermia. It was not possible to evaluate the expression of the heat shock genes in the SKOV-3 lineage. The HSPB1, HSPD1 and TRAP1 genes were positively regulated in OV-90 submitted to hyperthermia in relation to normothermia, and there were no significant changes in expression in the TOV-21G. CONCLUSION: In conclusion, we observed that OV-90 serous ovarian cancer cell line, after heated cisplatin treated had the HSPA1A, TRAP1, and HSPB1 heat shock genes upregulated. The HSPB1 genes had the most significant value expression. Our result showed that the heat shock genes can be related at chemotherapy resistance phenotyping founded this tumor-like. The use of everolumus _____________________________________________________________ Abstract has the potential to sensitize cytotoxicity in a model using heated cisplatin and improved results Thus, it is necessary to evaluate these genes in a clinical study of HIPEC. Keywords: ovarian cancer, resistance to chemotherapy, heat shock proteins, HIPEC. Índice _______________________________________________________________ Índice 1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 19 1.1 Câncer ................................................................................................ 20 1.2 Câncer Epitelial de Ovário (CEO) ..................................................... 22 1.3 Câncer de ovário e a carcinomatose peritoneal .............................. 25 1.4 Tratamento do câncer de ovário ....................................................... 28 1.5 Cisplatina ........................................................................................... 29 1.5.1 Mecanismos de resistência tumoral à cisplatina ..................... 31 1.5.1.1 Influxo/efluxo de cisplatina ........................................................ 31 1.5.1.2 Detoxificação ............................................................................. 32 1.5.1.3 Reparo a danos no DNA ............................................................ 32 1.5.1.4 Sinalização da apoptose ........................................................... 33 1.6 Quimioterapia intraperitoneal (QT IP) ............................................. 33 1.7 HIPEC (Quimioterapia Hipertérmica Intraperitoneal) como modalidade de tratamento na doença peritoneal ................................. 34 1.8 O papel das Proteínas de Choque Térmico na carcinogênese ..... 37 1.8.1 Proteínas de choque térmico e câncer de ovário: relação com prognóstico e resistência ao tratamento............................................. 40 1.9 Everolimus: inibidor da via do m-TOR ............................................. 44 2. JUSTIFICATIVA DO ESTUDO .................................................................. 46 3. OBJETIVOS .............................................................................................. 49 3.1 Objetivo Geral ................................................................................... 50 3.2 Objetivos Específicos ....................................................................... 50 4. METODOLOGIA ........................................................................................ 51 4.1 Cultivo celular ................................................................................... 52 4.2 Ensaio de citotoxicidade celular .................................................... 52 4.2.1 Análise de solubilização de everolimus e sobrevivência celular em diferentes concentrações de everolimus (ensaio de MTT) ...................................................................................... 53 4.3 Ensaio clonogênico .......................................................................... 53 4.4 Extração e qualificação do RNA total .............................................. 54 _______________________________________________________________ Índice 4.5 Avaliação da integridade do RNA .................................................... 55 4.6 Tratamento do RNA com DNAse ..................................................... 55 4.7 Síntese do DNA complementar (cDNA) ........................................... 56 4.8 Avaliação da expressão dos transcritos ......................................... 56 5. RESULTADOS .......................................................................................... 58 5.1 Análise estrutural das linhagens expostas aos tratamentos .......... 59 5.2 Cálculo das expressões gênicas ........................................................ 62 5.3 Análise in silico da rede de interação dos genes ............................. 62 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................... 65 7. ARTIGO .................................................................................................... 74 8. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 104 9. ANEXOS .................................................................................................... 106 19 1. Introdução ___________________________________________________________ Introdução 20 1. INTRODUÇÃO 1.1 Câncer O câncer engloba um grande grupo de doenças que são caracterizadas por crescimento anormal das células e sua propagação, a partir do local de origem, é conhecido como metástase. Sendo entendido como uma doença do genoma, que surge pelo acúmulo de mutações genéticas e modificações epigenéticas que perturbam a função normal das vias de sinalização responsáveis pela coordenação da morte celular, diferenciação e proliferação celular.1 O desenvolvimento do câncer se inicia pelas mutações que são modificações na sequência do DNA capazes de alterar a expressão gênica, tais como alterações nas sequências de nucleotídeos dentro de regiões promotoras ou codificadoras de um gene. As mutações podem ser introduzidas no DNA pela exposição à cancerígenos ambientais, tanto exógenos como endógenos, ou pela replicação e reparação intrínseca do DNA sujeito a erros na própria maquinaria celular.2 A mutação genética é o fator mais relevante para a formação do câncer, pois podem ocorrer mutações em genes drivers, isto é, genes que quando mutados, podem promover a tumorigênese levando à formação do câncer.3 Todavia é importante ressaltar que algumas das alterações no DNA que predispõem ao câncer são herdadas (5-10% dos casos). No entanto, a grande maioria (90-95%) dos casos é induzida por exposições a fatores externos, tais como xenobióticos (tabaco, álcool, pesticidas), organismos infecciosos (vírus da hepatite B e C, vírus HTLV1 e HTLV2) e alimentação inadequada.4 A perda de estabilidade do genoma é uma característica relevante relacionada à progressão do tumor, em que elevadas taxas de mutação somadas a alterações cromossômicas, tanto numéricas quanto estruturais e ativação de vias específicas, se combinam para conduzir à proliferação celular sem nenhum controle e resistência à morte celular. Estes fatores são cada vez mais estudados em oncologia, visto que a instabilidade genômica está associada à resposta ao tratamento com imunoterapia.5 É importante ressaltar que outros fatores também são essenciais ao desenvolvimento do câncer, como a reprogramação do metabolismo energético, estímulo à angiogênese e evasão à destruição imune, construindo então o “microambiente do tumor"9, atualmente conhecidos como “hallmarkers” do câncer.6 ___________________________________________________________ Introdução 21 Segundo o GLOBOCAN, foram estimados para 2020 aproximadamente 18,1 milhões de novos casos e 9,6 milhões de mortes por câncer em todo mundo (Figura1).7 São estimados, para o ano 2030, 20 milhões de casos incidentes e 13 milhões de mortes, indicando um acentuado aumento tanto em número de novos casos quanto em mortalidade provocadas pelo câncer (WORLD CANCER REPORT, WHO, 2014).8 Homens Incidência Mortalidade Mulheres Incidência Mortalidade FIGURA 1. Distribuição de casos e mortes por área mundial, em 2020, para homens e mulheres. Fonte: Adaptado GLOBOCAN, 2020 Outros 25,4% Mama 15,5% Pulmão 13,7% Colorretal 9,5% Cervical 7,7% Estômago 6,0% Fígado 5,7% Pâncreas 4,9% Ovário 4,7% Esôfago 3,8% Leucemia 3,0% Outros 30,7% Pulmão 14,3%Próstata 14,1% Colorretal 10,6% Estômago 7,1% Fígado 6,3% Bexiga 4,4% Esôfago 4,2% Linfoma Não-Hodgkin 3,0% Rim 2,7% Leucemia 2,7% Outros 28,9% Mama 24,5%Colorretal 9,4% Pulmão 8,4% Cervical 6,5% Tireóide 4,9% Endométrio 4,5% Estômago 4,0% Ovário 3,4% Fígado 3,0% Linfoma Não-Hodgkin 2,6% Outros 22,9% Pulmão 21,5% Fígado 10,5% Colorretal 9,3% Estômago 9,1% Próstata 6,8% Esôfago 6,8% Pâncreas 4,5% Leucemia 3,2% Bexiga 2,9% Linfoma Não-Hodgkin 2,7% ___________________________________________________________ Introdução 22 Segundo dados do Instituto Nacional do Câncer (INCA)9, a estimativa no biênio 2020-2021 para o Brasil aponta a ocorrência de cerca de 625 mil casos novos de câncer. Entre os dez tipos de câncer com maior incidência, excetuando-se o câncer de pele não melanoma, os tipos mais frequentes em homens foram próstata (31,7%), pulmão (8,7%), intestino (8,1%), estômago (6,3%) e cavidade oral (5,2%). Em mulheres, os cânceres de mama (29,5%), intestino (9,4%), colo do útero (8,1%), pulmão (6,2%) e tireoide (4,0%) foram os mais incidentes (INCA, 2020) (Figura 2).9 FIGURA 2. Distribuição proporcional dos dez tipos de câncer mais incidentes estimados para 2020-2021, por sexo, exceto pele não melanoma*. Fonte: INCA, 2020. 1.2- Câncer Epitelial de Ovário (CEO) CEO é o sexto tumor mais frequente e a quinta causa de morte por câncer, em mulheres, nos Estados Unidos.10 No Brasil, segundo dados do INCA, são esperados 6.650 casos novos de câncer de ovário para o triênio 2020-2022, sendo que este valor corresponde a um risco estimado de 6,18 casos novos a cada 100.000 mulheres.9 A média de idade ao diagnóstico é 63 anos, sendo que 70% das pacientes já são diagnosticadas em estadio avançado.11 Sendo assim, o CEO é considerado o mais letal dos tumores ginecológicos, embora seja considerado uma neoplasia de baixa incidência quando comparados com outros tipos de câncer, como de câncer de mama e o de colo de útero.Este achado se deve ao seu caráter insidioso.11 Estudos recentes, tem demonstrado que o CEO não é uma doença isolada, mas é composto por um grupo heterogêneo de tumores que podem ser classificados com base nas características morfológicas e moleculares distintas e possuem origens diferentes.12 Em função dos tipos celulares que constituem os ovários, podem ser 65 6. Referências Bibliográficas ____________________________________________________ Referências Bibliográficas 66 1. Kooeffler HP, McCormick F, Denny C. Molecular mechanisms of cancer. West J Med. 1991; 155:505-514. 2. Tomasetti C, Li L, Vogelstein B. Stem cell divisions, somatic mutations, cancer etiology, and cancer prevention. Science. 2017; 355:1330-1334. 3. Youn A, Simon R. Identifying cancer driver genes in tumor genome sequencing studies. Bioinformatics.2011; 15;27(2):175-181. 4. Ali A, Bhattacharya S. DNA binders in clinical trials and chemotherapy. Bioorg Med Chem. 2014; 15;22(16):4506-4521 5. Lim S, Quinton RJ, Ganem NJ. Nuclear envelope rupture drives genome instability in Lin S1, Gregory RI2. MicroRNA biogenesis pathways in cancer. Nat Rev Cancer. 2015; 15(6):321-333. 6. Hanahan D, Weinberg RA. Hallmarks of cancer: The next generation. Cell. 2011 Mar 4; 144(5): 646–674. 7. Bray F, Ferlay J, Soerjomataram I, Siegel RL, Torre LA, Jemal A. 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Agradeço por cada minuto ao lado d... Agradecimentos Especiais Agradecimentos Epígrafe Resumo Abstract Índice 1. Introdução 1.2- Câncer Epitelial de Ovário (CEO) 1.8 O papel das Proteínas de Choque Térmico na carcinogênese 2. Justificativa do Estudo 3. Objetivos 3.1 Objetivo Geral 3.2 Objetivos específicos 4. Metodologia 4.4 Extração e quantificação do RNA total 5. Resultados 6. Referências Bibliográficas 7. Artigo 2.1 Cell culture 2.4 Clonogenic assay 8. Considerações Finais 9. Anexos