Dayane Fonseca Soares Validação de metodologias de extração e quantificação de pesticidas diuron, clorpirifós e metil paration em águas subterrâneas em região de cultura de soja, utilizando QuEChERS/HPLC-UV Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, no âmbito do Programa DINTER - CAPES com o Instituto Federal do Mato Grosso, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutor em Química. Orientador: Prof. Dr. André Henrique Rosa Coorientador: Prof. Dr. Anízio Márcio de Faria Araraquara – SP 2014 DADOS CURRICULARES ______________________________________________________________________ Formação acadêmica/titulação 2010 - 2014 Doutorado em Química. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, São Paulo, Brasil Título: Validação de metodologias de extração e quantificação de pesticidas diuron, clorpirifós e metil paration em águas subterrâneas em região de em região de cultura de soja, utilizando QuEChERS/HPLC-UV Orientador: André Henrique Rosa Co-orientador: Anizio Marcio de Faria Bolsista do(a): Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior 2004 - 2006 Mestrado em Química. Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Uberlandia, Brasil Título: Proposta de Tratamento e Disposição Adequada de Resíduos Químicos Gerados no Laboratório de Separação e Pré-concentração do Instituto de Química da Universidade Federal de Uberlândia, Ano de obtenção: 2006 Orientador: Efigênia Amorim 1994 - 1999 Graduação em Química. Universidade Federal de Uberlândia, UFU, Uberlandia, Brasil ___________________________________________________________________ Atuação profissional 1. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Triângulo Mineiro - IFTM _____________________________________________________________ Vínculo institucional 2012 - Atual Vínculo: Servidor público , Enquadramento funcional: Professora de química , Carga horária: 40, Regime: Dedicação exclusiva 2. Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Mato Grosso - IFMT _____________________________________________________________ Vínculo institucional 2008 - 2012 Enquadramento funcional: Professora de química , Carga horária: 40, Regime: Dedicação exclusiva 3. Universidade Federal de Uberlândia - UFU _____________________________________________________________ Vínculo institucional 2007 - 2008 Vínculo: Professora Substituta , Enquadramento funcional: Professora de Ensino Superior , Carga horária: 40. 4. Instituto Politécnico de Ensino - FPU _____________________________________________________________ Vínculo institucional 2004 - 2004 Vínculo: Livre , Enquadramento funcional: Professora de Ensino Superior , Carga horária: 10, Regime: Parcial 5. Instituto Educacional Maria Ranulfa Ltda - FACU TRABALHO _____________________________________________________________ Vínculo institucional 2005 - 2007 Vínculo: Livre , Enquadramento funcional: Professora de Ensino Técnico , Carga horária: 8, Regime: Parcial 6. Escola Estadual Antônio Luís Bastos - EALBA _____________________________________________________________ Vínculo institucional 2001 - 2008 Vínculo: Servidor público , Enquadramento funcional: Professora de Ensino Médio , Carga horária: 20, Regime: Parcial 7. Comunidade Evangélica Luterana São Paulo - CELSP _____________________________________________________________ Vínculo institucional 2000 - 2000 Vínculo: Livre , Enquadramento funcional: Professora de Ensino Médio , Carga horária: 15, Regime: Parcial 8. Escola Estadual Sebastião Dias Ferraz - EESDF _____________________________________________________________ Vínculo institucional 1999 - 2000 Vínculo: Professora Contratada , Enquadramento funcional: Professora de Ensino Médio , Carga horária: 18, Regime: Parcial ______________________________________________________________________ Linhas de pesquisa 1. Análise de resíduos de pesticidas Objetivos: Determinação de resíduos de pesticidas em água empregando o método de extração QuEChERS e cromatografia líquida de alta eficiência para identificação e quantificação dos princípios ativos. ______________________________________________________________________ Projetos 2013 - 2014 Determinação do teor alcoólico e de cobre em amostras de cachaça comercializadas no município de Ituiutaba-MG Descrição: A cachaça é o terceiro destilado mais consumido no mundo e sua origem difunde com a história do nosso país. No processo de destilação da cachaça ocorre a formação do carbonato básico do cobre na superfície do metal. Tendo em vista os riscos que o excesso de cobre traz à saúde é de grande importância a realização de análises para determinar os teores alcoólico (entre 38% e 48%) e de cobre (quantidade máxima de 5mg L-1 de cachaça) para avaliar se as concentrações destes estão de acordo com os valores máximos estabelecidos pela legislação nacional. Situação: Concluído Natureza: Projetos de pesquisa Integrantes: Dayane Fonseca Soares (Responsável); ; Financiador(es): Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais- FAPEMIG 2012 - 2013 Avaliação da qualidade do mel de girassol produzido no município de Campo Novo do Parecis-MT Descrição: A apicultura tem tido destaque como atividade de benefícios sociais, econômicos e ecológicos, onde diversos subprodutos podem ser fabricados como produtos alimentícios, cosméticos, fitoterápicos, etc. Embora seja um produto muito apreciado, pode ser facilmente adulterado. Desta forma se faz necessário a realização de algumas análises para determinar sua qualidade. A produção de girassol em Mato Grosso é a maior do País, responsável por 65% da safra brasileira, sendo que aproximadamente 85% de área cultivada situa-se na região de Campo Novo do Parecis. Através de parceria firmada entre apicultores e agricultores durante o cultivo do girassol é possível a verticalização e geração de renda para os pequenos produtores. A fim de valorizar o produto desenvolvido no município, o objetivo do presente trabalho é avaliar a qualidade do mel de abelha produzido em cultura de girassol no município de Campo Novo do Parecis e sua adequação quanto aos padrões de qualidade estipulados pela legislação brasileira oferecendo subsídios aos apicultores da região para uma melhor comercialização do produto. Situação: Em andamento Natureza: Projetos de pesquisa Alunos envolvidos: Graduação (2); Integrantes: Dayane Fonseca Soares (Responsável); ; Henrique de Araujo Sobreira Financiador(es): Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Mato Grosso- IFMT 2011 - 2012 Fabricação de sabão artesanal: uma questão de conscientização ambiental Descrição: O óleo para a utilização de frituras é utilizado na grande maioria das cozinhas brasileiras. Com isso, são geradas grandes quantidades de óleo de cozinha usado. Esse óleo quando descartado de forma inadequada provoca graves impactos ambientais, representando um risco para meio ambiente. Uma alternativa para diminuir o impacto ambiental é conscientizar a população sobre a coleta seletiva e reciclar esse o óleo usado. Esse projeto tem como objetivo testar procedimentos variados de fabricação de sabão artesanal, bem como promover a conscientização da sociedade através de oficinas e palestras sobre os malefícios ambientais do descarte do óleo usado e a importância do seu reaproveitamento. Situação: Em andamento Natureza: Projeto de extensão Alunos envolvidos: Graduação (1); Integrantes: Dayane Fonseca Soares; Henrique de Araujo Sobreira (Responsável); Cleudes Guimarães Financiador(es): Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Mato Grosso- IFMT Produção ______________________________________________________________________ Produção bibliográfica Artigos completos publicados em periódicos 1. SOARES, D. F., AMORIM, E., ALMEIDA, A. M. Gerenciamento tratamento e disposição adequada de misturas geradas em laboratório de química analítica. Analytica (São Paulo). , v.11, p.76 - 85, 2012. 2. SOARES, D. F., CALCADO, M. R., PEREIRA, S. B., COSTA, V. P. Ensinano a Conscientizar. Revista em Extensão (Online). , v.7, p.124 - 124, 2008. Apresentação de trabalho e palestra 1. SOARES, D. F., SOBREIRA, H. A., GONCALVES, K. R. A importância da observação no ensino de introdução à Química como proposta de auxílio em outras áreas do conhecimento, XVI Encontro Nacional de Ensino de Química. X Encontro de Educação Química da Bahia; Universidade Federal da Bahia; 2012. 2. Farias, G. L., SOBREIRA, H. A., SOARES, D. F., Guimarães, C. Avaliação da qualidade do sabão artesanal produzido a partir de óleo utilizado em frituras, Congresso Nacional de Meio Ambiente de Poços de Caldas; IFSULDEMINAS - campus Muzambinho, 2012. 3. SOBREIRA, H. A., SOARES, D. F. O ensino de química no curso Técnico em Comércio, modalidade PROEJA, do IFMT-campus Campo Novo do Parecis. Uma visão do aluno, XVI Encontro Nacional de Ensino de Química. X Encontro de Educação Química da Bahia; Universidade Federal da Bahia, 2012. 4. SOBREIRA, H. A., SOARES, D. F. Despertando o Interesse dos Alunos para o Ensino de Pilhas, 50º Congresso Brasileiro de Química; Associação Brasileira de Química, 2010. 5. SOARES, D. F., SOBREIRA, H. A. Ensino de Química nas Escolas Públicas do Município de Campo Novo do Parecis, 50º Congresso Brasileiro de Química; Associação Brasileira de Química, 2010. 6. SOARES, D. F. Estudo da Viabilidade de Tratamento e Recuperação dos Solventes Etanol e Clorofórmio e o Ligante 1-(2-piridilazo)-2-naftol., XIX Encontro Regional da SBQ-MG; Sociedade Brasileira de Química, 2005. 7. SOARES, D. F. Estudo do Gerenciamento de Resíduos, Obtidos a partir de Estudos com Misturas de Solventes na Determinação de Micronutrientes em Plantas., 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química; Sociedade Brasileira de Química, 2005. 8. SOARES, D. F. Tratamento de Resíduos de Laboratório - Uma Opção de Qualidade., 28ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química; Sociedade Brasileira de Química, 2005. 9. SOARES, D. F. Viabilidade de Tratamento de Resíduos Laboratoriais, 13º Encontro Nacional de Química Analítica/1º Congresso Ibero-Americano de Química Analítica; Universidade Federal Fluminense, 2005. 10. SOARES, D. F. Desenvolvimento de uma Metodologia Analítica para Determinação de Enxofre Utilizando Técnica de Análise Por Injeção em Fluxo, XXXVIII Congresso Brasileiro de Química; Inst.promotora/financiadora: ABQ - Associação Brasileira de Química,1998. Orientações e Supervisões Orientações e supervisões concluídas Monografias de conclusão de curso de aperfeiçoamento/especialização 1. Denise Morais Oliveira. Tratamento de efluente líquido em uma indústria de reciclagem de plásticos: um estudo de caso na cidade de Ituiutaba-MG. 2014. Monografia (Pós-Graduação Lato Sensu em Ciências Ambientais) - Instituto Federal do Triângulo Mineiro. 2. Henrique de Araujo Sobreira. Desvendando plástico no Proeja: uma proposta de ensino de Química. 2012. Monografia (Especialização) - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Mato Grosso. 3. Joelir Alves e Silva. Realidade e perspectiva do curso Técnico em Comércio de Campo Novo do Parecis. 2012. Monografia (Especialização) - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Mato Grosso. 4. Jessé Garcia de Faria. Uma reflexão sobre o ensino de matemática financeira no curso Técnico em Comércio. 2012. Monografia (Especialização) - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Mato Grosso. Trabalhos de conclusão de curso de graduação 1. Alexandre Mauricio Tozzo. Avaliação da qualidade do mel de girassol produzido no município de Campo Novo do Parecis-MT. 2012. Curso (Tecnologia em Agroindústria) - Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Mato Grosso. Iniciação científica 1. Júlia Caroline Freitas do Carmo. Determinação do teor alcoólico e de cobre em amostras de cachaça comercializadas no município de Ituiutaba-MG. 2012. Iniciação científica (Técnico em Química) - Instituto Federal do Triângulo Mineiro. Bancas Participação em banca de trabalhos de conclusão Curso de aperfeiçoamento/especialização 1. Oliveira, R. S., Braga, H. F., SOARES, D. F. Participação em banca de Camila Guimarães Vilarinho. Aproveitamento de sementes e casca de ovo para a fabricação de óleos, farinhas e sabonetes translúcido, 2013 (Pós-Graduação Lato Sensu em Ciências Ambientais) Instituto Federal do Triângulo Mineiro. Graduação 1. Faria, A. M., SOARES, D. F., Takeuchi, R. M. Participação em banca de Nadja Thereza Macedo Silva. Desenvolvimento e otimização de um método de determinação de resíduos de agrotóxicos de amostras de água, empregando CLAE-UV, 2014 (Química) Universidade Federal de Uberlândia. AGRADECIMENTOS A DEUS que, por todos os dias, está ao meu lado me fortalecendo para realização deste trabalho. Ao meu eterno namorado Henrique, que me incentivou sempre me apoiando com muito amor, paciência e compreensão nos momentos mais difíceis dessa longa jornada. Aos meus filhos, Natália e Pablo, que por muitas vezes sentiram minha falta, mas souberam compreender a minha ausência. À minha mãe querida, que me auxiliou nos momentos mais difíceis ao longos destes anos e à minha vozinha, que sempre cuidou de mim com muito carinho em suas orações. Ao Prof. Dr. André Henrique Rosa, pela orientação neste trabalho, que mesmo à distância, aceitou prontamente o meu pedido. Ao Prof. Dr. Anízio Márcio de Faria (FACIP/UFU), que além de compartilhar comigo sua experiência acadêmica, aceitou me pedido de coorientação e cedeu gentilmente às instalações e equipamentos do laboratório de ensino e pesquisa para que fosse possível a execução experimental deste trabalho. À Profª. Dra. Valéria de Souza (IFMT) por aceitado inicialmente o meu pedido de coorientação e pela ajuda no início do trabalho. À Profª. Dra. Eliana (UFMT), pela colaboração no início da parte experimental. Ao Prof. Dr. Sérgio Marcos Sanches pelas contribuições nas conversas pelos corredores do local de trabalho. Aos Amigos do DINTER, em especial, Demétrio, pela colaboração nas discussões durante os estudos. Ao Sr. Haroldo, técnico do Departamento de água pela ajuda com as coletas. Aos técnicos dos laboratórios da FACIP/UFU Magayver, João e Diesley, que sempre se prontificaram em me ajudar com os equipamentos dos laboratórios. Ao meu querido amigo Flávio, pela companhia, diversão e risadas no laboratório. E a todos que contribuíram com minha formação acadêmica. Ao CNPq pela oportunidade concedida. RESUMO Os pesticidas são substâncias utilizadas no controle de doenças e pragas de plantas. O aumento na produção agrícola ocasionou o uso excessivo de pesticidas nas lavouras, o que tem sido considerado uma importante fonte de contaminação do solo e da água. Estudos realizados no Estado do Mato Grosso apontam resíduos de pesticidas encontrados em solo, águas superficiais e subterrâneas em alguns de seus municípios. Diante deste cenário há uma preocupação quanto à presença destes compostos nos recursos hídricos, pois podem contaminar lençóis freáticos, causando diversos tipos de doenças na população. Assim o objetivo deste estudo foi realizar um estudo no sentido de identificar e quantificar o nível de contaminação de águas subterrâneas por resíduos dos pesticidas diuron, metil paration e clorpirifós empregados em cultura de soja em uma pequena região da Bacia Sedimentar do Parecis-MT. Foi feito um levantamento dos pesticidas empregados na cultura de soja, onde 43,8% pertencem às classes I e II da classificação toxicológica e 45,6% pertencem às classes I e II da classificação ambiental. A partir deste levantamento foram selecionados os pesticidas para estudo baseando-se nas propriedades físico-químicas, índice GUS e critérios de Goss, permitindo realizar uma análise preliminar do potencial de contaminação de águas subterrâneas por resíduos de pesticidas. A metodologia de análise foi avaliada para a determinação dos princípios ativos por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência/Detector Ultravioleta (CLAE/UV). Os procedimentos experimentais envolveram a extração dos analitos em amostras de água empregando o método QuEChERS. O método foi avaliado em quatro níveis de fortificação (n = 4), considerando os parâmetros de seletividade, linearidade, efeito matriz, exatidão, precisão, limite de detecção e limite de quantificação. Estes compostos apresentaram valores médios de recuperação entre 53 e 108% e coeficientes de variação abaixo de 15%. Foram selecionados seis pontos de coleta de amostras de águas de poços artesianos em área urbana próxima à áreas de produção de soja durante o período de safra 2012/2013. Dos seis poços artesianos analisados foram detectados diuron, metil paration e clorpirifós em concentrações abaixo do limite de quantificação em quatro deles, sendo que o metil paration foi detectado nas concentrações 0,062 e 0,032 g mL-1 em dois poços. A análise dos resultados mostrou que a área apresenta uma região com potencial de contaminação de águas subterrâneas. Palavras-chave: Pesticidas. Águas subterrâneas. Contaminação. QuEChERS. ABSTRACT Pesticides are substances used to control pests and diseases of plants. The increase in agricultural production caused the excessive use of pesticides on crops, what has been considered an important source of contamination of soil and water. Studies conducted in the State of Mato Grosso point pesticide residues found in soil, surface water and groundwater in some of its municipalities. In this scenario there is concern about the presence of these compounds in water, they can contaminate groundwater, causing different types of diseases in the population. Thus the aim of this study was to conduct a study to identify and quantify the level of groundwater contamination by pesticide residues diuron, parathion-methyl and chlorpyrifos employees under soybean in a small region of Sedimentary Basin Parecis-MT. A survey of pesticides used in soybean, where 43.8% belong to class I and II of the toxicological classification and 45.6% belong to class I and II environmental classification was done. From this survey were selected pesticides for study based on the physicochemical properties, GUS index and criteria Goss, allowing to perform a preliminary analysis of the potential for groundwater contamination by pesticides. The analysis methodology was evaluated for the determination of active ingredients for High Efficiency Liquid Chromatography/Ultraviolet detector (HPLC / UV). The experimental procedures involved the extraction of analytes in water samples using QuEChERS method. The method was evaluated in four fortification levels (n = 4), considering the parameters of selectivity, linearity, matrix effect, accuracy, precision, limit of detection and limit of quantification. These compounds showed average recovery values between 53 and 108% and coefficients of variation below 15%. Six points of collecting water samples from wells in the nearby areas of soybean production during the 2012/2013 harvest urban area were selected. Of the six wells diuron, parathion-methyl and chlorpyrifos were analyzed detected at concentrations below the limit of quantification in four of them being the methyl parathion was detected at concentrations of 0.062 and 0.032 g ml-1 in two wells. The results showed that the area presents a region with potential for groundwater contamination. Keywords: Pesticides. Groundwater. Contamination. QuEChERS. LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Mapa da localização da Bacia dos Parecis em relação às outras regiões brasileiras ................................................................................................... 21 Figura 2 - Região de ocorrência dos aquíferos Ronuro, Salto das Nuves e Utiariti ....... 23 Figura 3 - Alguns processos determinantes do transporte de pesticidas no ambiente.... 31 Figura 4 - Fluxograma representativo do método QuEChERS original......................... 34 Figura 5 - Etapas do método de extração QuERChERS ................................................ 51 Figura 6 - Localização do município de Campo Novo do Parecis no Estado do Mato Grosso ......................................................................................................... 53 Figura 7 - Região de coleta de amostras de água no município de Campo Novo do Parecis (MT) ............................................................................................... 53 Figura 8 - Porcentagem de agrotóxicos classificados de acordo com a toxicologia e os riscos ambientais .................................................................................... 59 Figura 9 - Cromatograma (CLAE-UV 237 nm, C18, 125x4,6 mmDI, 5m), modo de edluição isocrático, acetonitrila:70:30 v/v), vazão de 1 mL min-1, vol. injeção de 20L, do pesticida 2,4-D na concentração de 10 g mL-1 ........ 63 Figura 10 - Cromatograma (CLAE-UV 237 nm, C18, 125x4,6 mmDI, 5m), modo de edluição isocrático, acetonitrila:70:30 v/v), vazão de 1 mL min-1, vol. injeção de 20L, dos pesticidas (1) Carbendazim, (2) 2,4-D, (3) Metil paration e (4) Clorpirifós na concentração de 10 g mL-1 ......................... 64 Figura 11 - Cromatograma (CLAE-UV 237 nm, C18, 125x4,6 mmDI, 5 m), modo de eluição isocrático, acetonitrila:água (70:30 v/v), vazão de 1 mL min- 1, vol. injeção de 20 L, dos pesticidas (1) Carbendzim, (2) Diuron, (3) Metil paration e (4) Clorpirifós, na concentração de 10 g mL-1 .............. 65 Figura 12 - Cromatograma (CLAE-UV 237 nm, C18, 125x4,6 mmDI, 5 m), acetonitrila:água (45:55 até 8 minutos, 70:30 até 20 minutos, v/v), vazão de 1 mL min-1, vol. injeção de 20 L, dos pesticidas (1) carbendazim, (2) Diuron, (3) Metil paration e (4) Clorpirifós na concentração de 10 g mL-1 ....................................................................... 66 Figura 13 - Cromatograma (CLAE-UV 237 nm, C18, 125x4,6 mmDI, 5 m), acetonitrila:água (45:55 até 8 minutos, 70:30 até 20 minutos, v/v), vazão de 1 mL min-1, vol. injeção de 20 L, dos pesticidas (1) Diuron, (2) Metil paration e (3) Clorpirifós, na concentração 10 g mL-1 ............. 68 Figura 14 - Cromatograma dos pesticidas no extrato a 5,0 mg L-1: (1) diuron; (2) metil paration; (3) clorpirifós ..................................................................... 69 Figura 15 - Cromatogramas obtidos por CLAE-UV, da solução padrão dos pesticidas selecionados (10 mg L-1) e da amostra testemunha: (1) Carbendazim, (2) Diuron, (3) Metil paration e (4) Clorpirifós .................. 70 Figura 16 - Curva analítica (CLAE-UV) em solvente acetonitrila (vermelho) e na matriz (azul) para o diuron ......................................................................... 72 Figura 17 - Curva analítica (CLAE-UV) em solvente acetonitrila (vermelho) e na matriz (azul) para o metil paration ............................................................. 72 Figura 18 - Curva analítica (CLAE-UV) em solvente acetonitrila (vermelho) e na matriz (azul) para o clorpirifós ................................................................... 73 Figura 19 - Curvas de linearidade para os pesticidas no intervalo de 0,001 a 2,000 g mL-1 – 0,001; 0,002; 0,005; 0,010; 0,050; 0,100; 0,200; 0,500; 1,000; 2,000 µg mL-1 (concentração no extrato) ........................................ 75 Figura 20 - Curvas analíticas obtidas para os analitos (1) diuron, (2) metil paration e (3) clorpirifós na matriz utilizando CLAE-UV ......................................... 77 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Comparação de padrão de potabilidade para substâncias químicas que representam risco à saúde. Concentração em g L-1 ................................... 27 Tabela 2 - Classificação toxicológica dos pesticidas ..................................................... 28 Tabela 3 - Resumo de aplicação do método de extração QuEChERS em diversas matrizes ........................................................................................................ 37 Tabela 4 - Métodos de análise de resíduos de pesticidas em água, enfatizando o tipo de extração, a técnica de detecção, os princípios ativos .............................. 39 Tabela 5 - Parâmetros do índice de GUS para avaliar o potencial de contaminação de águas subterrâneas (DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001) ............... 46 Tabela 6 - Critérios para avaliação do potencial de contaminação pelo método de Goss (DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001) ..................................... 47 Tabela 7 - Concentrações utilizadas para estudos de recuperação ................................ 52 Tabela 8 - Localização geográfica dos poços onde foram coletadas amostras de água 54 Tabela 9 - Produtos comerciais e respectivos ingredientes-ativos ................................ 56 Tabela 10 - Parâmetros dos pesticidas selecionados para estudo (INTERNATIONAL UNION OF PURE AND APPLIED CHEMISTRY, IUPAC)..................... 62 Tabela 11 - Condições cromatográficas utilizadas nesta tese ........................................ 67 Tabela 12 - Valores de tempos de retenção (tR) de cada pesticida estudado ................. 67 Tabela 13 - Parâmetros das curvas analíticas obtidos por adição de padrão para os agrotóxicos fortificados no extrato da matriz empregando o método QuEChERS e CLAE-UV ............................................................................ 76 Tabela 14 - Recuperações médias (%) (n = 7) e CV(%) para a repetitividade do método em amostras de água ....................................................................... 78 Tabela 15 - Limites de detecção e quantificação do método de extração utilizando HPLC-UV .................................................................................................... 80 Tabela 16 - Recuperação, desvio padrão relativo, LOD e LOQ reportados em diferentes estudos que usaram a técnica de extração em fase sólida (SPE) 81 Tabela 17 - Concentrações de pesticidas em água (g mL-1), por poço artesiano e época de coleta ............................................................................................. 82 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS 2,4-D – ácido diclorofenoxiacético 2,4,5-T – ácido 2,4,5-triclorofenoxiacético ANA – Agência Nacional de Águas ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária C18 – fase sólida de octadecilsilano CEE – Comunidade Econômica Européia CLA-DAD – cromatografia líquida de alta eficiência com detector de arranjo de diodos CLAE-UV – cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultravioleta CONAB – Companhia Nacional de Abastecimento DDD – diclorodifenildicloroetano DDE - diclorodifenildicloroetano DDT – diclorodifeniltricloetano DEA – desetil atrazina DIA – desisopropil atrazina d-SPE – extração em fase sólida dispersiva DT50 – meia-vida EUA – Estados Unidos da América EXTOXNET – “Extension Toxicology Network”(Rede de Extensão de Toxicologia) GC/ DTE – cromatografia gasosa com detector termoiônico específico GC/ FPD – cromatografia gasosa com detector fotométrico de chama GC/MS – cromatografia gasosa com detector de espectrometria de massa GC/NDP – cromatografia gasosa detector de nitrogênio-fósforo GPC – cromatografia de permeação em gel GUS – “Groundwater Ubiquity Score” (índice de vulnerabilidade de água subterrânea) HCH – hexaclorociclohexano HPLC-UV – cromatografia líquida de alta eficiência com detector ultravioleta IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatísitica ICH – “International Conference on Harmonization” (Conferência Internacional sobre Harmonização dos Requisitos Técnicos para o Registro de Produtos Farmacêuticos para Uso Humano) INDEA – Instituto de Defesa Agropecuária do Estado do Mato Grosso INMETRO – Instituto Nacional de Metrologia , Qualidade e Tecnologia KOC – coeficiente de sorção à matéria orgânica KOW – coeficiente de patição octanol-água LC/APCI/MS – cromatografia líquida com ionização química à pressão atmosférica e espectrometria de massa LC/MS – cromatografia líquida com detector de espectrometria de massa LOD – limite de detecção LOQ – limite de quantificação MeCN – acetonitrila NPIC – “National Pesticide Information Center” (Centro Nacional de Informações de pesticidas) OMS – Organização Mundial da Saúde PSA – amina primária e secundária QqQ-MS/MS – espectrometria de massa triplo quadrupolo RIMAS – Rede Integrada de Monitoramento de Águas Subterrâneas RSD – desvio padrão relativo SEMA – Secretaria de Estado de Meio Ambiente SQ/MS – espectrometria de massa/quadrupolo único UFPR – Universidade Federal do Paraná UFU – Universidade Federal de Uberlândia UHPLC/MS – cromatografia líquida de ultra eficiência com espectrometria de massa US EPA – “United States Environmental Protection Agency” (Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos) SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 18 1.1 Região de estudo: a Bacia Sedimentar dos Parecis ......................................... 21 1.2 A soja ................................................................................................................... 23 1.3 Uso de pesticidas no Brasil ................................................................................. 25 1.4 Valores Máximos Permitidos (VMP) para resíduos de pesticidas em água .. 26 1.5 Contaminação de águas por resíduos de pesticidas ......................................... 28 1.6 Métodos de análise de resíduos de pesticidas em água.................................... 31 1.6.1 Técnicas de preparo de amostra......................................................................... 31 1.6.2 O método de extração QuEChERS .................................................................... 33 1.6.3 Emprego de técnicas cromatográficas na análise de resíduos de pesticidas ...... 38 1.7 Validação de métodos analíticos ........................................................................ 40 2 OBJETIVOS .............................................................................................................. 45 3 MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 46 3.1 Levantamento dos pesticidas ............................................................................. 46 3.2 Análise preliminar do risco potencial de contaminação por pesticidas de águas superficiais e subterrâneas ............................................................................ 46 3.3 Equipamentos ..................................................................................................... 47 3.4 Reagentes e solventes .......................................................................................... 48 3.5 Padrões dos pesticidas ........................................................................................ 48 3.6 Limpeza da vidraria ........................................................................................... 48 3.7 Preparo das soluções .......................................................................................... 49 3.8 Desenvolvimento das condições cromatográficas ............................................ 49 3.9 Métodos de extração QuEChERS ..................................................................... 50 3.10 Fortificação das amostras de água .................................................................. 52 3.11 Amostragem ...................................................................................................... 52 3.11.1 Coleta de amostras ........................................................................................... 52 3.12 Análise Quantitativa ......................................................................................... 54 3.13 Análise dos Resultados ..................................................................................... 55 3.14 Análise da Amostra Testemunha .................................................................... 55 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ............................................................................. 56 4.1 Levantamento dos pesticidas ............................................................................. 56 4.2 Análise de risco de contaminação ..................................................................... 59 4.3 Condições cromatográficas ................................................................................ 63 4.4 Método de extração QuEChERS ....................................................................... 68 4.6 Validação ............................................................................................................. 69 4.6.1 Seletividade ....................................................................................................... 69 4.6.2 Efeito Matriz ...................................................................................................... 70 4.6.3 Linearidade ........................................................................................................ 73 4.6.4 Exatidão e precisão ............................................................................................ 78 4.6.5 Limites de detecção e de quantificação ............................................................. 79 4.6.7 Aplicação do método ......................................................................................... 82 5 CONCLUSÕES .......................................................................................................... 84 6 PERSPETIVAS FUTURAS ...................................................................................... 85 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 86 APÊNDICE A – RELAÇÃO DE PESTICIDAS UTILIZADOS NA REGIÃO DE ESTUDO ........................................................................................................................ 96 ANEXOS ....................................................................................................................... 98 18 1 INTRODUÇÃO Os pesticidas, desde a sua criação, possuem ação fundamental no desenvolvimento da agricultura e aumento da produtividade agrícola. A utilização destes produtos ajuda no controle de pragas e doenças nas mais variadas culturas, porém o uso descontrolado pode acarretar a contaminação do solo, da água e dos alimentos. A atual intensificação do uso da terra para fins agrícolas tem despertado grande preocupação devido, principalmente, aos impactos que vem causando ao ambiente, sobretudo no que diz respeito à contaminação de recursos hídricos por insumos agrícolas, como nutrientes e pesticidas (RIBEIRO et al., 2013). Os ambientes aquáticos são utilizados em todo o mundo com distintas finalidades, entre as quais se destacam o abastecimento, a geração de energia e as práticas agrícolas. A água representa, sobretudo, o principal constituinte de todos os organismos vivos. No entanto, nas últimas décadas, esse recurso vem sendo ameaçado pelas ações indevidas do homem, o que resulta em prejuízo para a própria humanidade (MORAES; JORDÃO, 2002). O impacto dos efluentes genotóxicos no ambiente e o significado para a saúde humana são, de fato, difíceis de predizer, porque eles são misturas complexas de substâncias químicas. A interpretação completa de seus efeitos frequentemente requer, de forma complementar, análises químicas dos constituintes. Tais análises podem indicar os componentes dos efluentes que podem persistir a acumular na biota exposta e, então, representar potencialmente um perigo à saúde humana (MORAES e JORDÃO, 2002). A água é um solvente versátil frequentemente usado para transportar produtos residuais para longe do local de produção e descarga (MORAES e JORDÃO, 2002). Tendo em vista que estes produtos residuais transportados são na maioria tóxicos, podem degradar rios, lagos e lençóis freáticos prejudicando a vida animal e vegetal. 19 A qualidade das águas superficiais pode ser influenciada por fatores naturais e antrópicos. Os diversos tipos de uso e ocupação do solo geram fenômenos que podem repercutir em grandes extensões dentro da bacia hidrográfica, alterando os seus aspectos quantitativos e qualitativos (MATO GROSSO – SEMA, 2010). Para avaliar a contaminação da água por resíduos de pesticidas e assegurar a saúde pública, agências reguladoras de alguns países têm estabelecido níveis de detecção destes ingredientes ativos em matrizes ambientais. No Brasil, que se destaca pela grande produção de grãos e um dos maiores consumidores de pesticidas a nível mundial, o Ministério da Saúde, através da Portaria 2.914/2011 estabeleceu valores máximos permitidos para alguns pesticidas. O padrão de qualidade dos recursos hídricos é monitorado através do PNQA – Programa Nacional de Avaliação da Qualidade das Águas (ANA, 2005). O Conselho Nacional do Meio Ambiente(CONAMA) por meio da Resolução 357/2005 dispõe sobre a classificação dos corpos de água e diretrizes ambientais para o seu enquadramento. Dentre os impactos à saúde relacionados ao processo produtivo do agronegócio, os de maior relevância para a saúde humana e ambiental são as poluições e/ou contaminações e as intoxicações agudas e crônicas relacionadas à aplicação de pesticidas, presente em todas as etapas da cadeia produtiva (ABRASCO, 2012a). Devido ao grande número de princípios ativos utilizados em áreas agrícolas, as análises exigem métodos multi-resíduos eficientes e capazes de detectar limites máximos de resíduos estabelecidos por legislação (LMR) e concentrações consideradas de alerta para a saúde humana (RIBEIRO et al., 2007). O Brasil se destaca como um dos grandes produtores de soja no cenário mundial. Na safra de 2012/2013, a produção nacional foi de, aproximadamente 81 milhões de toneladas (CONAB), o que justifica uma avaliação da possível contaminação por resíduos de pesticidas neste tipo de cultura. Para avaliar a contaminação de águas subterrâneas por resíduos de pesticidas, geralmente são empregados métodos cromatográficos de análise, como a cromatografia 20 gasosa (GC) e a cromatografia líquida (LC). Atualmente, tem sido desenvolvidas técnicas de análise cada vez mais precisas, seletivas e sensíveis, pois há a necessidade de se detectar simultaneamente vários compostos em concentrações a nível de traço. Dentre elas, a cromatografia líquida de ultra eficiência (ultra-higth pressure liquid chromatography – UHPLC) e os métodos cromatográficos com detecção por espectrometria de massas em série (MS/MS) tem se destacado. Uma vez determinado o princípio ativo, é possível através de sua estrutura química, determinar a dinâmica no ambiente, incluindo sua mobilidade e degradabilidade, e assim analisar o potencial de contaminação das águas, por meio de modelagem matemática. Os resultados são apresentados na forma de índices e intervalos numéricos, tais como os critérios da EPA (Agência de Proteção Ambiental) e o índice de GUS (Groundwater Ubiquity Score) para águas subterrâneas e o método de Goss para águas superficiais (ANDRADE et al., 2011). Esses métodos baseiam-se nas propriedades físico-químicas dos pesticidas, como solubilidade em água, coeficiente de sorção à matéria orgânica (kOC) e meia-vida no solo e na água (DT50). Neste trabalho foi realizado uma análise preliminar do potencial de contaminação de águas subterrâneas por pesticidas em uma região de cultura de soja através dos seguintes critérios de “screening”: índice de GUS (Groundwater Ubiquity Score), que é o índice de vulnerabilidade de águas subterrâneas e o método Goss, que avalia o potencial de contaminação de águas superficiais. Esse critérios são de grande utilidade uma vez que permite identificar dentre aqueles usados em determinada região quais apresentam risco de contaminação de ambientes aquáticos. Além da análise preliminar do potencial de contaminação, este estudo teve como objetivo realizar a validação de método de preparação de amostras QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Ruged and Safe) para águas subterrâneas e análise por cromatografia líquida – CLAE/UV-Vis dos pesticidas diuron, metil paration e clorpirifós, pois trata-se de um método simples que envolve o consumo de uma pequena 21 quantidade de solvente em relação às técnicas descritas na literatura, que permite determinar resíduos de pesticidas em águas subterrâneas. O método foi aplicado em amostras coletadas em uma região localizada na Bacia Sedimentar dos Parecis-MT. 1.1 Região de estudo: a Bacia Sedimentar dos Parecis A Bacia Sedimentar dos Parecis localiza-se nas regiões Amazônica e Centro Oeste do Brasil, entre as bacias sedimentares do Solimões, Alto Tapajós e Paraná. A bacia cobre uma área de 500.000 km² abrangendo os estados de Rondônia e Mato Grosso (BAHIA et al., 2007, 2006). A Figura 1 ilustram a localização da Bacia dos Parecis. Figura 1 – Mapa da localização da Bacia dos Parecis em relação às outras regiões brasileiras Fonte: (BAHIA et al., 2007) 22 A bacia dos Parecis é tratada como um sistema aquífero poroso e livre e, no âmbito do projeto de monitoramento de água subterrânea – RIMAS (Rede Integrada de Monitoramento das Águas Subterrâneas), é carente de dados hidro geológicos (ANA, 2005). É formada pelos aquíferos Ronuro, Salto das Nuvens e Utiariti (Figura 2). A região apresenta dois tipos de solos: do tipo Latossolo Vermelho-Amarelo que são solos profundos ou muito profundos, bem drenados, com textura argilosa, muito argilosa ou média, em consequência porosidade total alta a muito alta; e Vermelho Escuro, além de Areias Quartzosas. Os primeiros com boa aptidão a agricultura mecanizada, no entanto a última se apresenta com baixa fertilidade tornando-se assim impróprias para o manejo agrícola (PORTELA; PARPINELLI, 2009; SANTOS et al., 2006). Mais de 270 poços tubulares aproveitam as águas subterrâneas que circulam no Grupo Parecis e Formação Ronuro. A Formação Salto das Nuvens é a que possui maior número de poços cadastrados, com 46,5% do total, seguido do aquífero Ronuro, com 44,7%. A maior parte dos poços é voltada para abastecimento doméstico, visto que 47,6% são de propriedade particular, abrangendo cooperativas agropecuárias e comerciantes (PEIXOTO et al., 2012). Por corresponderem a aquíferos porosos e livres, as unidades hidrogeológicas Salto das Nuvens e Utiariti apresentam riscos de contaminação semelhantes àqueles a que estão sujeitas as águas superficiais, ou seja, vinculadas à vocação econômica regional e ao processo de ocupação do território. No caso do estado de Mato Grosso, a principal atividade econômica é a agropecuária, com destaque para as culturas de soja, milho e algodão, pecuária de corte e grandes criações confinadas de avícolas e de suínos (PEIXOTO et al., 2012), tendo em vista que os municípios situados nesta região estão entre os maiores produtores de grãos do país. 23 Figura 2 - Região de ocorrência dos aquíferos Ronuro, Salto das Nuves e Utiariti Fonte: (PEIXOTO et al., 2012). As consequências dessas atividades implicam em contaminação potencial de águas superficiais e subterrâneas, a exemplo da contaminação por pesticidas em outras regiões do Estado (CARBO et al., 2008; DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001; POSSAVATZ et al., 2014). 1.2 A soja A soja (Glycine max (L.) Merrill) é uma das mais importantes culturas na economia mundial. É utilizada, principalmente na indústria de óleos comestíveis. Seus grãos são muito usados pela agroindústria (produção de óleo vegetal e rações para alimentação animal), indústria química e de alimentos (FREITAS, 2011). A produção de soja está entre as atividades econômicas que, nas últimas décadas, apresentaram crescimentos mais expressivos. Isso pode ser atribuído a diversos fatores, 24 dentre os quais: desenvolvimento e estruturação de um sólido mercado internacional relacionado com o comércio de produtos do complexo agroindustrial da soja; consolidação da oleaginosa como importante fonte de proteína vegetal, especialmente para atender demandas crescentes dos setores ligados à produção de produtos de origem animal; geração e oferta de tecnologias, que viabilizaram a expansão da exploração sojícola para diversas regiões do mundo (HIRAKURI; LAZZAROTTO, 2014). A soja faz parte do conjunto de atividades agrícolas com maior destaque no mercado mundial. Observa-se que a soja tem sido o quarto grão mais consumido e produzido globalmente, atrás de milho, trigo e arroz, além de ser a principal oleaginosa cultivada anualmente no mundo. Adicionalmente, no período entre os anos agrícolas 2000/01 e 2013/14, a soja e o milho são as culturas que apresentaram os crescimentos absolutos mais expressivos, tanto em consumo quanto produção (HIRAKURI; LAZZAROTTO, 2014). De acordo com pesquisa mensal de acompanhamento das safras agrícolas feito pelo Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística, a produção de soja (em grão) estimada do País em 2014 alcança 86,6 milhões de toneladas, aumento de 6,0% em relação a 2013. Mato Grosso é o principal produtor de soja do País participando com 30,4% do total nacional, seguido por Paraná com 17,1%, Rio Grande do Sul com 15,1%, Goiás com 10,2% e Mato Grosso do Sul com 7,3. O crescimento da cultura da soja no país esteve sempre associado aos avanços científicos e a disponibilização de tecnologias ao setor produtivo. A mecanização e a criação de cultivares altamente produtivas adaptadas às diversas regiões, o desenvolvimento de pacotes tecnológicos relacionados ao manejo de solos, ao manejo de adubação e calagem, manejo de pragas e doenças, além da identificação e solução para os principais fatores responsáveis por perdas no processo de colheita, são fatores promotores desse avanço (FREITAS, 2011). Para destacar a importância do referido complexo para a economia nacional, pode-se utilizar algumas estatísticas básicas. Na safra 2013/14, a soja ocupou 3,5% do 25 território nacional e 8,9% da área dos estabelecimentos agropecuários brasileiros (IBGE, 2014b; CONAB, 2014c). Mesmo assim, as exportações originadas pela cadeia produtiva da commodity alcançaram quase US$ 31 bilhões e representaram 31,0% e 12,8%, respectivamente, do total exportado pelo agronegócio nacional e pelo país como um todo (BRASIL, 2014b), consolidando o complexo agroindustrial da soja como principal exportador de produtos agropecuários. 1.3 Uso de pesticidas no Brasil Os termos agrotóxicos, defensivos agrícolas, praguicidas, biocidas e pesticidas têm sido usados como sinônimos, e embora a legislação utilize do termo agrotóxico, o presente estudo faz uso do termo pesticida uma vez que é o mais encontrado na literatura científica. Segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e do Observatório da Industria dos Agrotóxicos da UFPR, divulgados durante o 2º Seminário sobre Mercado de Agrotóxicos e Regulação, realizado em Brasília (DF), em abril de 2012, enquanto, nos últimos dez anos, o mercado mundial de pesticidas cresceu 93%, o mercado brasileiro cresceu 190% (ABRASCO, 2012b). Em 2012, a concentração do mercado de pesticidas era de 45% do total de herbicidas. Os fungicidas correspondem 14% do mercado nacional, os inseticidas 12% e 29% representam as demais categorias (CASSAL et al., 2014). Os pesticidas registrados não têm prazo de registro. O custo pago para registro no Brasil é baixo. Enquanto para a ANVISA são pagos 90 reais, nos EUA custam 600 mil dólares por registro (ABRASCO, 2012a). O que favorece o aumento no consumo destes produtos contribuindo para o aumento de risco de contaminação dos mais variados ambientes: águas, ar, solo, alimentos, etc. 26 1.4 Valores Máximos Permitidos (VMP) para resíduos de pesticidas em água Os Valores Máximos Permitidos (VMP) para pesticidas em água são estipulados pelos órgãos governamentais, como a Organização Mundial da Saúde (OMS) e a Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (US EPA), que por sua vez regulamentam a quantidade máxima permitida para a utilização desses produtos no meio ambiente (EPA; GORCHEV; OZOLINS, 2011). O Conselho Nacional do Meio Ambiente (CONAMA, 2005) através da Portaria nº 357 de 17 de março de 2005 estabelece padrões de qualidade das águas brasileiras fixando limites máximos de contaminação individuais para algumas substâncias em cada classe, dentre esses alguns pesticidas organoclorados, organofosforados e carbamatos. A Portaria nº 2.914 de 12 de dezembro de 2011 do Ministério da Saúde dispõe sobre os procedimentos de controle da qualidade da água para consumo humano e seu padrão de potabilidade. Estabelece ainda os valores máximos permitidos para alguns pesticidas, porém o número de ingredientes ativos ainda é pequeno em relação à quantidade de pesticidas utilizados nas culturas para o controle de doenças e pragas de plantas (BRASIL, 2011). A Comunidade Econômica Européia (CEE) estabelece como "concentração máxima admissível" para pesticidas em água potável, como substâncias individuais, o limite de 0,1 mg L-1, desde que a concentração total de pesticidas não ultrapasse 0,5 mg L-1 (AMARANTE JUNIOR et al., 2002). A Tabela 1 apresenta o Valor Máximo Permitido (VMP) dos pesticidas listados na Portaria 2.914/2011 e compara esses valores com os valores estabelecidos pela OMS, pelo CONAMA e pela US EPA. 27 Tabela 1 - Comparação de padrão de potabilidade para substâncias químicas que representam risco à saúde. Concentração em g L-1 Pesticida Portaria 2914 CONAMA OMS US EPA 2,4-D + 2,4,5 T 30 x 30 70 Alaclor 20 20 20 2 Aldicarbe+Aldicabesulfona+Aldicarbesulfóxico 10 x 10 x Aldrin+ Dieldrin 0,03 0,005 0,03 x Atrazina 2 2 100* 3 Carbendazim+benomil 120 x x x Carbofurano 7 x 7 40 Clordano 0,2 0,04 0,2 2 Clorpirifós+clorpirifós-oxon 30 x 30 x DDT+DDD+DDE 1 0,002 1 x Diuron 90 x x x Endossulfan (α,  e sais) 20 0,056 x x Endrin 0,6 0,004 0,6 2 Glifosato+AMPA 500 65 x 0,7 Lindano (gama HCH) 2 0,02 2 0,2 Mancozebe 180 x x x Metamidofós 12 x x x Metolacloro 10 10 10 x Molinato 6 x 6 x Paration-metílica 9 0,04 x x Pendimentalina 20 x 20 x Permetrina 20 x x x Profenofós 60 x x x Simazina 2 2 2 4 Tebuconazol 180 x x x Terbufós 1,2 x x x Trifluralina 20 0,2 20 x OMS – Organização Mundial da Saúde; US EPA – Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos; CONAMA – Comissão Nacional do Meio Ambiente; x – pesticida não listado; *Atrazina e seus metabólitos, Hidroxiatrazina = 200 g L-1. 28 1.5 Contaminação de águas por resíduos de pesticidas A contaminação de águas por resíduos de pesticidas ocorre principalmente pela ação das águas da chuva e de irrigação que provocam lixiviação, drenagem e escoamento dos praguicidas presentes nas plantações e no solo, que irão atingir correntes de água ou reservatórios. As contaminações destas águas podem resultar em efeitos tóxicos para a fauna e flora aquáticas e também para a saúde humana, devido à utilização para consumo e práticas de lazer (SANTOS NETO; SIQUEIRA, 2005). No Brasil, a toxicidade aguda dos agrotóxicos é expressa em termos de valor da dose letal 50% (Lethal Dose 50% ou LD50), que é a dose de uma substância química que provoca a morte de, pelo menos, 50% das espécies estudadas (geralmente ratos ou camundongos) quando administrada pela mesma via, por exemplo, oral (JARDIM; ANDRADE; QUEIROZ, 2009). Sendo assim, o Ministério da Saúde divide os pesticidas em quatro classes toxicológicas representadas na Tabela 2 (BRASIL, 2011). Tabela 2 - Classificação toxicológica dos pesticidas Classe LD50 (mg kg-1 de m.v.)* Classificação I  5 Extremamente tóxicos II 5 < LD50  50 Altamente tóxicos III 50 < LD50  500 Medianamente tóxicos IV LD50 > 5000 Pouco ou muito pouco tóxicos *A LD50 é representada em miligramas do produto tóxico por quilograma de massa viva (m.v.) (JARDIM; ANDRADE; QUEIROZ, 2009) A água subterrânea faz parte de um processo dinâmico e interativo do ciclo hidrológico, pelo qual a água circula do oceano para a atmosfera e dessa para os continentes, de onde retorna, superficial e subterraneamente, ao oceano (RIBEIRO et al., 2007). As águas subterrâneas são, geralmente, fontes de águas limpas e de boa qualidade. No Brasil, atualmente, 39% dos municípios são abastecidos exclusivamente através de poços tubulares que captam essas fontes (FERON; REGINATO, 2014). 29 As reservas hídricas subterrâneas respondem por aproximadamente 97% de toda água doce disponível para uso. Entretanto, por se tratar de um recurso que não é facilmente observável, é uma fonte desconsiderada pela população. O fato de o ensino brasileiro dar maior importância às águas superficiais aliado ao consumo hídrico implicará em um impacto sobre essa reserva prejudicando o equilíbrio ambiental terrestre (MEIRA; DE-CAMPOS; PEREIRA, 2014). A contaminação das águas subterrâneas por pesticidas é um assunto de interesse mundial, em especial, a partir da década de 1980, inspirado pela constatação de sua ocorrência, ainda que em baixas concentrações, em diferentes países tais como Grã- Bretanha, Alemanha, Estados Unidos, Grécia, Bulgária, Espanha, Portugal e Brasil(BARBOSA et al., 2011). Estudo realizado em aquíferos da região Nordeste da Grécia revelou que foram detectados resíduos de metolacloro em 63% dos poços monitorados, seguido por atrazina (61%), DEA (50%), alacloro (47%) e DIA (34%) (VRYZAS et al., 2012). Estudos feitos no estado de Sergipe reportam a contaminação de águas subterrâneas por metil paration. De 26 amostras analisadas o ingrediente ativo foi detectado em 5 com um concentração de 0,17 g L-1. Além deste, foram detectados resíduos de bifentrina, piraclostrobina e azoxistrobina com concentrações média de 2,28, 3,12 e 0,15 ng mL-1, respectivamente. O nível de detecção de metil paration na região de estudo sugerem estudos de monitoramento, uma vez que a água é utilizada pela população (MENEZES FILHO; SANTOS; PEREIRA, 2010). Na Espanha, os estudos realizados no período de 2007 a 2010 mostram que houve um decréscimo nos níveis dos pesticidas devido a proibição do usos dos mesmos naquele país, outro fator que também contribuiu, segundo os autores, foi a implementação de boas práticas agrícolas (KÖCK-SCHULMEYER et al., 2014). O cultivo e manejo do solo exercem grande influência na qualidade das águas subterrâneas e nas taxas de recarga de alguns aquíferos. Algumas práticas agrícolas são capazes de causar contaminação difusa por nutrientes e pesticidas, especialmente em 30 áreas com solos pouco espessos com boa drenagem, e ocasionar um aumento da salinidade das águas. Os tipos de atividade agrícola que geram contaminação difusa mais preocupante das águas subterrâneas são as relacionadas com extensas áreas de monocultura. Práticas agrícolas envolvendo o cultivo de culturas perenes apresentam menor perda por lixiviação que em locais onde as plantações sazonais são praticadas, devido ao menor distúrbio e aeração do solo e também ao aumento da demanda de nutrientes pelas plantas (RIBEIRO et al., 2007). Os recursos hídricos agem como integradores dos processos biogeoquímicos de qualquer região. Sendo assim, quando pesticidas são introduzidos, os recursos hídricos, sejam superficiais ou subterrâneos, aparecem como o destino final principal desses compostos (RIBEIRO et al., 2007). O processo natural que governa a velocidade e o transporte de pesticidas no ambiente pode ser agrupado nas seguintes categorias: lixiviação, volatilização, degradação, sorção e absorção pelas plantas (Figura 3). A absorção pela planta é geralmente o menor componente. A perda por volatilização ocorre a partir das partículas do solo, da planta e da umidade do solo. Os pesticidas podem ser degradados no solo por processos microbiológicos ou químicos, produzindo metabólitos e compostos mais simples, como amônia e dióxido de carbono (RIBEIRO et al., 2007). Embora a camada de solo funcione como um filtro, purificando a água que nele penetra, diversos poluentes orgânicos, em especial os pesticidas, podem atingir as águas subterrâneas, o que mostra a necessidade de investigação sobre os fatores que influenciam o movimento de contaminantes até os lençóis subterrâneos. Uma vez que os pesticidas tenham atingido as águas subterrâneas, os processos de degradação são reduzidos devido à menor população e atividade microbiana, o que contribui para aumentar sua meia-vida neste ambiente (RIBEIRO et al., 2007). 31 Figura 3 - Alguns processos determinantes do transporte de pesticidas no ambiente Fonte: (REBELO; CALDAS, 2014). O número de estudos realizados sobre águas subterrâneas no Brasil cresceu nos últimos anos (ANDRADE et al., 2011; CABRERA; COSTA; PRIMEL, 2008; FILIZOLA et al., 2005; GAMA; OLIVEIRA; CAVALCANTE, 2013; MARTINI et al., 2012), porém ainda necessita de muitos avanços (REBELO; CALDAS, 2014). 1.6 Métodos de análise de resíduos de pesticidas em água 1.6.1 Técnicas de preparo de amostra Quando se trata de amostras ambientais, no caso amostras aquosas, a determinação de resíduos de pesticidas inicia-se por etapas de extração e pré- concentração, onde as técnicas mais utilizadas são a extração líquido-líquido (ELL) e a extração em fase sólida (solid-phase extraction - SPE). A ELL é uma técnica clássica de extração, baseada na transferência dos analitos presentes em uma matriz líquida para outra fase líquida imiscível (solvente orgânico menos polar ou apolar), de acordo com as diferenças de solubilidade dos analitos nestas 32 duas fases (CHEN et al., 2008). Esta técnica de extração apresenta alguns problemas como o consumo de grandes quantidades de amostra e solventes, a possibilidade de formação de emulsões e muitas vezes não é capaz de eliminar os interferentes presentes em matrizes complexas, como alimentos, além de ser relativamente lenta e gerar um grande volume de descarte (CHIARADIA, 2009). A SPE é baseada na adsorção dos analitos, inicialmente presentes em uma matriz líquida, em cartuchos contendo um sorvente sólido. Os analitos são, posteriormente, eluídos do cartucho com um sorvente apropriado. Os mecanismos de retenção da SPE são semelhantes aos da cromatografia em coluna (CHIARADIA, 2009). A extração em fase sólida possui algumas vantagens em relação à extração líquido-líquido: permite a extração de pesticidas polares, utiliza menor quantidade de solventes e consome um tempo menor de análise (SOUZA, 2006). Enquanto para ELL o tempo de extração é de uma hora, para a SPE é necessário um tempo estimado de 5 minutos. Em relação ao volume de solvente, na SPE é consumido um volume aproximado de 10 mL contra 500 mL utilizados na ELL (LANÇAS, 2004). Embora a SPE seja uma técnica vantajosa, ainda apresenta alguns problemas como por exemplo, quando há a passagem de volumes maiores de água, pode ocasionar a obstrução dos cartuchos deixando o processo de extração mais lento (SANTOS NETO; SIQUEIRA, 2005). O sorvente mais comumente empregado para extração de pesticidas e seus produtos de degradação é o C18 (CALDAS; DEMOLINER; PRIMEL, 2009; MARCHESAN et al., 2010; MARTINEZ et al., 2011; RISSATO et al., 2004). Além da SPE, pode-se destacar outras técnicas de extração: a microextração em fase sólida (solid phase micro-extraction – SPME) foi introduzida em 1990 como uma técnica rápida, simples, com boa capacidade de concentração, sem a necessidade de solvente orgânico em com a conveniência da automação (CALDAS et al., 2011), a SPME foi utilizada para determinação de pesticidas organoclorados em água (BARRIONUEVO; LANÇAS, 2001; KOMATSU; VAZ, 2004; SILVA; CARDEAL; CARVALHO, 1999); a extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura 33 (liquid-liquid extraction with the low temperature partition – LLE-LTP) foi empregada para a determinação de pesticidas em água dentre eles clorpirifós (SILVÉRIO et al., 2012; VIEIRA; NEVES; QUEIROZ, 2007) e a técnica microextração em fase sólida por headspace também foi utilizada para determinar pesticidas em águas subterrâneas (PRATES; GEBARA; RÉ-POPPI, 2011; RATOLA et al., 2006). 1.6.2 O método de extração QuEChERS QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Ruged and Safe) é um método de extração voltado para análise multirresidual de pesticidas que foi publicado pela primeira vez em 2003 (ANASTASSIADES et al., 2003), com o propósito de superar limitações práticas dos métodos multirresíduo de extração disponíveis na época. Esse método tem como vantagens ser rápido, fácil, econômico, efetivo, robusto e seguro (PRESTES et al., 2009). O método QuEChERS original (Figura 4) envolve uma extração inicial utilizando 10 g de amostra com 10 mL de acetonitrila (MeCN), seguida por uma etapa de partição líquido-líquido através da adição de 4 g de MgSO4 anidro. A adição de sais promove o efeito “salting out” em vários métodos multirresíduos, o que promove um aumento nas recuperações para analitos mais polares, uma vez que a adição de sais diminui a solubilidade destes compostos na fase aquosa, bem como a quantidade de água na fase orgânica e vice-versa. A adição do MgSO4 é devido a maior capacidade de remover água quando comparado a outros sais. Além de reduzir o volume de fase aquosa, sua dissolução é uma reação exotérmica, tendo como resultado o aquecimento entre 40 e 45 °C da amostra durante a etapa de extração/partição, favorecendo a extração, especialmente dos compostos apolares (PRESTES et al., 2009). A remoção de água residual e clean-up são realizadas simultaneamente, usando um procedimento rápido denominado extração em fase sólida dispersivo (dispersive solid-phase extraction – d-SPE), onde 150 mg de MgSO4 anidro e 25 mg de sorvente 34 amina primária e secundária (PSA, grupos etilenodiamina-N-propil ligados à silica) são misturados com 1 mL de extrato. O PSA tem a função de remover açúcares, ácidos graxos, ácidos orgânicos e pigmentos (ANASTASSIADES et al., 2003; ANDRADE, 2013). Figura 4 - Fluxograma representativo do método QuEChERS original Fonte: (PRESTES et al., 2009). Durante o seu desenvolvimento, grande ênfase foi dada para a obtenção de um procedimento dinâmico, que pudesse ser aplicado em qualquer laboratório, devido à simplificação das etapas como representado na Figura 4 (PRESTES et al., 2009). Apesar de ser um método relativamente novo, QuEChERS tem sido amplamente aceito pela comunidade internacional de analistas de resíduos de pesticidas (CHIARADIA, 2009), uma vez que muitos trabalhos tem sido publicados empregando sua forma original ou com variações (BANDEIRA et al., 2014; OMAR; BAKAR; 10 g de amostra (tubo de teflon 50 mL) 10 mL MeCN 4 g MgSO4 e 1g NaCℓ Adicionar o padrão interno (trifenilfosfato) Transferir para outro tubo 1 mL de extrato e adicionar 150 mg de MgSO4 e 25 mg PSA Análise cromatográfica Agitar vigorosamente por 1 min Agitar vigorosamente por 1 min Agitar por 30 seg e centrifugar Agitar por 30 seg e centrifugar 35 MUHAMMAD, 2013; QUEIROZ; FERRACINI; ROSA, 2012; RAMÍREZ RESTREPO et al., 2014; RODRIGUES et al., 2011). O método QuEChERS foi desenvolvido para análise de resíduos de pesticidas em matrizes com baixo teor de gordura. Porém, quando realizadas algumas modificações, ele pode ser empregado na análise de matrizes com elevado teor de gorduras, assim como à matrizes que possuem grandes quantidades de pigmentos (CHIARADIA, 2009). O método original foi modificado com o objetivo de melhorar os percentuais de recuperação, no qual o efeito tamponante é promovido pela adição de acetato de sódio (LEHOTAY, 2007). Então em 2007, o método “QuEChERS-acetato” foi adotado como método oficial da Association of Official Analytical Chemists (AOAC) para a determinação de resíduos de pesticidas em alimentos (PRESTES; ADAIME; ZANELLA, 2011). Outra modificação bastante relevante foi a adição de C18 (LEHOTAY; MASTOVSKÁ; YUN, 2005), juntamente com PSA na etapa de limpeza (d-SPE), para promover uma limpeza mais efetiva de algumas matrizes, em especial aquelas que contêm gordura. A combinação do método QuEChERS com limpeza à baixa temperatura, visando a redução dos co-extrativos lipídicos, também foi empregada com sucesso. Porém, a adição de C18 na etapa de d-SPE é mais rápida e fácil, e promove uma remoção igualmente eficaz dos lipídios (PRESTES; ADAIME; ZANELLA, 2011). O extrato final, obtido pelo método QuEChERS pode ser analisado empregando técnicas cromatográficas. Embora o QuEChERS seja utilizado na determinação de resíduos de pesticidas em alimentos, o mesmo foi empregado para a determinação dos pesticidas atrazina, finopril, α e -endossulfan em amostras de água e de sedimentos. Os autores obtiveram valores de exatidão, precisão e linearidade dentro dos valores aceitáveis pela legislação (BRONDI et al., 2011). 36 No presente estudo propôs-se empregar este método para a determinação de resíduos de diuron, metil paration e clorpirifós em amostras de água por CLAE-UV. O procedimento do método QuEChERS empregado neste estudo envolve uma extração inicial com acetonitrila, seguida de uma etapa de partição realizada pela adição de uma mistura de sais composta por sulfato de magnésio anidro e cloreto de sódio, (BRONDI et al., 2011; PRESTES et al., 2009). Uma porção do extrato é então submetida à uma etapa de limpeza por extração em fase sólida dispersiva (d-SPE), na qual é empregado uma mistura de sulfato de magnésio anidro, PSA e C18. Os sorventes tem a função de remover coextrativos interferentes como ácidos graxos, ácidos orgânicos e pigmentos (CABRERA et al., 2012). A Tabela 3 apresenta um resumo do emprego do método de extração QuEChERS, indicando técnica de detecção, tipo de matriz e pesticidas analisados. Nesta Tabela evidencia que o método foi aplicado para análise de resíduos de atrazina, fipronil, α e -endossulfan em águas superficiais e sedimentos, que não são os mesmos analitos envolvidos neste estudo (diuron, clorpirifós e metil paration). 37 Tabela 3 - Resumo de aplicação do método de extração QuEChERS em diversas matrizes Ref. Detecção# Matriz Analitos (BRONDI et al., 2011) GC-MS Água e sedimento Atrazina, fipronil, α e -endossulfan (AFIFY et al., 2010) LC-MS/MS Uva 150 pesticidas dentre eles clorpirifós e diuron (GONZÁLEZ-CURBELO et al., 2011) GC/NPD Banana 8 pesticidas dentre eles clorpirifós (QUEIROZ; FERRACINI; ROSA, 2012) UPLC-MS/MS Alface e tomate 29 pesticidas dentre eles diuron (BANDEIRA et al., 2014) GC-MS/MS Leite bovino 48 pesticidas (SOUSA et al., 2013) GC-SQ/MS Melão 35 pesticidas dentre eles metil paration e clorpirifós (LU et al., 2012) Online-GPC-GC/MS Frutas e vegetais 45 pesticidas dentre eles clorpirifós (MARCHIS et al., 2012) GC-MS Milho e soja 10 pesticidas dentre eles clorpirifós e metil paration (QU et al., 2010) GC-QqQ-MS/MS Alho-poró 20 pesticidas dentre eles clorpirifós e metil paration (BELENGUER et al., 2014) LC-MS/MS Água de rio* e peixe 40 pesticidas dentre eles clorpirifós, diuron e metil paration * Os autores utilizaram SPE (Oasis HLB) para a análise da água de rio e QuEChERS para análise dos peixes; # abreviações de acordo com lista de abreviações. 38 1.6.3 Emprego de técnicas cromatográficas na análise de resíduos de pesticidas Na etapa de identificação, separação e quantificação dos resíduos de pesticidas, as técnicas mais empregadas são a cromatografia gasosa (GC – Gás Cromatography) e a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O critério para seleção de uma ou ambas é baseado no comportamento do analito. O desenvolvimento de pesticidas de caráter mais polar (mais facilmente degradáveis) em substituição aos pesticidas mais apolares tem colaborado para o aumento do uso de CLAE (SOUZA, 2006). Publicações recentes mostram que há uma tendência em utilizar técnicas sensíveis como a cromatografia gasosa acoplada a espectrômetro de massa (GC/EM), cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrômetro de massas (CLAE/EM) e CLAE com detectores por arranjos de diodos (FENOLL et al., 2011; PRATES; GEBARA; RÉ-POPPI, 2011; SEEBUNRUENG; SANTALADCHAIYAKIT; SRIJARANAI, 2014). Entretanto, vários estudos mostram que o monitoramento de pesticidas mais polares em água também é possível empregando CLAE com fase reversa, usando detector ultravioleta (LOPES et al., 2011; PINHEIRO; SILVA; KRAISCH, 2010; SILVÉRIO et al., 2012). A Tabela 4 apresenta um resumo das metodologias para análise de resíduos de pesticidas em água, indicando técnica de extração, técnica de detecção, pesticidas analisados e tipo de matriz de água estudada. Fica claramente evidenciado alguns estudos de degradação e de monitoramento de pesticidas, tanto no Brasil quanto em outros países. 39 Tabela 4 - Métodos de análise de resíduos de pesticidas em água, enfatizando o tipo de extração, a técnica de detecção, os princípios ativos Ref. Extração Detecção# Matriz Pesticidas analisados (HU; AIZAWA; MAGARA, 1999) SPE (poliestireno/divinilbenzeno + carbono molecular) LC/ACPI/MS Água tratada e água de rio 31 pesticidas dentre eles diuron (CARBO et al., 2008) SPE (copolímero estireno divinilbenzeno – SDVB) CLAE/DAD Águas subterrâneas 12 pesticidas dentre eles diuron (PINHEIRO; SILVA; KRAISCH, 2010) SPE (C18) HPLC/UV-Vis Águas superficiais e subterrâneas 12 pesticidas dentre eles diuron (RIBEIRO et al., 2013) SPE (SDVB) HPLC/DAD Águas superficiais 12 pesticidas dentre eles o diuron (LOPES et al., 2011) SPE (C18) CLAE/UV GC/DTE Águas superficiais e subterrâneas 7 pesticidas dentre eles metil paration (PINHEIRO; DA ROCHA; DE ANDRADE, 2011) SDME GC/MS Água de rio e água de torneira Dimetoato, metil paration, etion e permetrina (SILVÉRIO et al., 2012) ELL-PBT CLAE/UV-Vis Águas superficiais Bifentrina, -cialotrina, clorpirifós e permetrina (SANTOS NETO; SIQUEIRA, 2005) SPE (discos de C18) GC/FPD Águas de reservatório 5 pesticidas dentre eles metil paration (FENOLL et al., 2011) Extração em fase única com acetonitrila LC-MS/MS Águas de torneira, lixiviação e esgoto 48 pesticidas dentre eles diuron (MENEZES FILHO; SANTOS; PEREIRA, 2010) SPME GC/MS Águas subterrâneas 16 pesticidas dentre eles metil paration (CLAVER et al., 2006) SPE (poliestirenodivinilbenzeno) GC-MS Águas de rio 44 pesticidas dentre eles diuron, clorpirifós e metil paration # abreviações de acordo com lista de abreviações. SPE – extração em fase sólida; ELL-PBT – extração líquido-líquido com partição em baixa temperatura; SPME - microextração por fase sólida. 40 1.7 Validação de métodos analíticos Os estudos de validação constituem uma ferramenta essencial das boas práticas de fabricação em sistemas de gestão da qualidade de laboratórios de diversas áreas analíticas. Tais estudos são estruturados tendo como referência guias e documentos orientados publicados nacional e internacionalmente (BERNARDES; SOUZA, 2011). Os parâmetros para validação de métodos têm sido definidos em diferentes grupos de trabalho de organizações nacionais ou internacionais. Infelizmente algumas definições são diferentes entre as diversas organizações. Uma tentativa para harmonizar estas diferenças foi feita para aplicações farmacêuticas, através da ICH (International Conference on Harmonization), na qual representantes das indústria e agências reguladoras dos EUA, Europa e Japão definiram parâmetros, requerimentos e, em alguns casos, também metodologias para validação dos métodos analíticos(RIBANI et al., 2004). No Brasil, há dois órgãos credenciados que disponibilizam guias para procedimento de validação de métodos analíticos, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) e o Instituto de Metrologia (INMETRO). A literatura traz diversos parâmetros empregados para validar um método analítico (BRITO et al., 2003; CASSIANO et al., 2009; LANÇAS, 2009; RIBANI et al., 2004; RIBEIRO et al., 2008), onde os principais são definidos abaixo: a) Seletividade: é a capacidade de detectar os analitos de interesse na presença de outros componentes presentes na matriz. Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidas (ANVISA, 2004). b) Linearidade: refere-se à capacidade do método fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância de interesse, dentro de uma determinada faixa de aplicação. A linearidade em métodos quantitativos é determinada pela medição de amostras, em várias concentrações de analito abrangendo a faixa reivindicada do 41 método (ANVISA, 2004). Ou seja, o quanto os dados se ajustam a equação linear (Eq. 1): Eq. 1 onde: y = corresponde ao sinal analítico; x = concentração do analito de interesse; a = coeficiente angular (Inclinação); b = coeficiente linear (intersecção). c) Intervalo de trabalho: é a faixa compreendida entre o menor e o maior valor de concentração que possa ser determinado com precisão e exatidão usando a linearidade do método. d) Precisão: representa a dispersão de resultados entre ensaios independentes, repetidos de uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padrões, sob condições definidas (RIBANI et al., 2004). A precisão é avaliada pelo desvio padrão absoluto (σ) e o desvio padrão relativo (RSD) ou coeficiente de variação (CV), são utilizados para descrever a precisão. Em validação de metodologia como o número de determinações é geralmente pequeno o que se calcula é a estimativa do desvio padrão absoluto ( ) representado pela Eq. 2. Eq. 2 Onde: = média aritmética de um pequeno número de determinações; = valor individual de cada medida; = número de determinações. A estimativa do desvio padrão relativo (RSD) ou coeficiente de variação (CV) é calculado através da Equação 3: Eq. 3 42 Para análises de traços ou impurezas, são aceitos RSD de até 20%, dependendo da complexidade da amostra (RIBANI et al., 2004). A precisão pode ser expressa de diferentes formas, vai depender da maneira como ela é calculada (ANVISA, 2004). Este parâmetro é considerado em três níveis diferentes: repetitividade; precisão intermediária e reprodutibilidade. Repetitividade: expressa a concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo método, sob as mesmas condições de operação em um curto intervalo de tempo. A repetitividade, algumas vezes é denominada precisão intra-ensaio ou intra-corrida e pode ser expressa através da estimativa do desvio padrão relativo (RSD). Para a repetitividade, o INMETRO recomenda sete ou mais repetições para o cálculo da estimativa do desvio padrão. A ICH e ANVISA sugerem que seja verificada a partir de um mínimo de nove determinações cobrindo o limite especificado do procedimento (ex.: três níveis, três repetições cada um), ou a partir de um mínimo de seis determinações a uma concentração similar ao valor esperado (RIBANI et al., 2004). Precisão intermediária: indica o efeito das variações dentro do laboratório devido a eventos como diferentes dias ou diferentes analistas, diferentes equipamentos, entre outros. Reprodutibilidade: expressa o grau de concordância entre os resultados das medições de uma mesma amostra, efetuadas sob condições variadas (por exemplo, mudança de operador). Refere-se aos resultados dos estudos de colaboração entre laboratórios e são aplicados em situações como a padronização de procedimentos analíticos. e) Exatidão: representa o grau de concordância entre os resultados individuais encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência aceito como verdadeiro (RIBANI et al., 2004). A exatidão de um método pode ser determinada também pela comparação dos resultados obtidos pelo método sob avaliação e os 43 resultados obtidos por um método de referência por meio da avaliação do grau de proximidade entre os resultados obtidos pelos dois métodos, ou seja, o grau de exatidão do método que está sendo testado em relação ao de referência. Pode ser determinada também pela análise de um material de referência, com concentrações conhecidas dos compostos em análise. E, por último, pode ser determinada por ensaios de recuperação, em que amostras são fortificadas com concentrações conhecidas dos analitos de interesse e determinadas pelo método sob análise através da Equação 4: Eq. 4 Onde: = valor obtido; = valor considerado verdadeiro. f) Limite de detecção (LD ou LOD): corresponde à menor concentração do analito que pode ser detectada pelo método analítico sob avaliação, mas não necessariamente quantificada. O LD pode ser determinado de três maneiras: método visual, que é a análise de amostras fortificadas com o analito em concentrações decrescentes com definição do limite por inspeção visual onde a menor concentração do analito possa ser diferenciada do ruído do sistema com segurança; método sinal-ruído, que pode ser aplicado em procedimentos analíticos que apresentam ruído da linha de base e é estimado a partir da comparação do sinal analítico obtido para uma amostra contendo baixas concentrações da espécie de interesse com o sinal de uma amostra do branco (RIBEIRO et al., 2008). Em gera, é considerado aceitável uma relação sinal-ruído que gera um sinal três vezes maior do que o ruído do sistema (LANÇAS, 2009); método baseado em parâmetros da curva analítica, expresso através da Equação 5: Eq. 5 44 Onde: = estimativa do desvio padrão da resposta, que pode ser a estimativa do desvio padrão do branco, da equação da linha de regressão ou do coeficiente linear da equação; = inclinação ou coeficiente angular da curva analítica. g) Limite de quantificação (LQ ou LOQ): corresponde à menor concentração do analito que pode ser quantificada utilizando um determinado procedimento experimental. Os mesmos critérios de LD podem ser adotados para o LQ, utilizando a relação 10:1, ou seja, o LQ pode ser calculado, utilizando o método visual, a relação sinal-ruído ou baseado em parâmetros da curva analítica, expressa pela Equação 6: Eq. 6 45 2 OBJETIVOS Este trabalho teve como objetivo principal validar metodologias de extração e quantificação de resíduos de pesticidas diuron, clorpirifós e metil paration em águas subterrâneas utilizados em região de cultura de soja. E como objetivos específicos: Avaliar o potencial de contaminação de águas subterrâneas por resíduos de pesticidas aplicados em cultura de soja através dos critérios de “screening” índice de GUS para águas subterrâneas e método de Goss para águas superficiais; Otimizar um método para a determinação de resíduos dos pesticidas clorpirifós, diuron e metil paration em matriz de água utilizando a técnica de cromatografia líquida com detector espectrofotométrico na região do UV-Vis (CLAE-UV); Avaliar a confiabilidade dos resultados e a eficiência do método pelos seguintes critérios de validação: seletividade, exatidão, precisão, linearidade, limites de detecção (LD) e limite de quantificação (LQ); Aplicar o método em amostras de água provenientes de poços artesianos na região Médio Norte-matogrossense durante o período de safra 2012/2013. 46 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 Levantamento dos pesticidas Como etapa inicial deste trabalho, foi realizado um levantamento dos pesticidas utilizados em cultura de soja, por meio de entrevistas com promotores de venda e responsáveis técnicos, junto às lojas de insumos agrícolas com a finalidade de realizar a identificação dos princípios ativos, da classe química e das classificações toxicológica e ambiental dos produtos comercializados na área de estudo. 3.2 Análise preliminar do risco potencial de contaminação por pesticidas de águas superficiais e subterrâneas Foram aplicados o índice de GUS (Groundwater Ubiquity Score) para avaliar o potencial de contaminação de águas subterrâneas e o método de GOSS para avaliar o potencial de contaminação de águas superficiais (COHEN et al., 1995). Os critérios de “screening” estão apresentados nas tabelas 5 e 6. Tabela 5 - Parâmetros do índice de GUS para avaliar o potencial de contaminação de águas subterrâneas (DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001) Índice de GUS Potencial GUS  1,8 Não sofre lixiviação 1,8  GUS  2,8 Faixa de transição GUS  2,8 Provável lixiviação O índice é GUS considera duas propriedades físico-químicas: os valores de meia-vida dos compostos no solo (DT50 solo) e coeficiente de adsorção à matéria orgânica (KOC). É calculado de acordo com a Equação 7: Eq. 7 47 Tabela 6 - Critérios para avaliação do potencial de contaminação pelo método de Goss (DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001) APTAS BPTAS APTDA BPTDA DT50 solo  40 dias KOC  1000 mL g-1 DT50 solo  1 dia DT50 solo  35 dias KOC  1.000.000 mL g-1 S  1 mg.L-1 KOC  1.000.000 mL g-1 DT50 solo  40 dias KOC  500 mL g-1 S = 0,5 mg L-1 DT50 solo  40 dias KOC  500 mL g-1 S  0,5 mg L-1 KOC  700 mL g-1 10  S  100 mg.L-1 DT50 solo  1 dia KOC  100 mL g-1 S = 0,5 mg.L-1 DT50 solo  40 dias KOC  900 mL g-1 S  2 mg.L-1 DT50 solo  35 dias S  0,5 mg.L-1 DT50 solo  2 dias KOC  500 mL g-1 DT50 solo 4 dias KOC  900 mL g-1 S  0,5 mg.L-1 APTAS – Alto Potencial de Transporte Associado ao Sedimento; BPTAS – Baixo Potencial de Transporte Associado ao Sedimento; APTDA – Alto Potencial de Transporte Dissolvido em Água; BPTDA – Baixo Potencial de Transporte Dissolvido em Água; S – Solubilidade em água; DT50 – meia- vida do composto; KOC – coeficiente de adsorção. Os compostos não enquadrados em nenhum dos critérios são considerados como tendo potencial médio para contaminarem águas superficiais. 3.3 Equipamentos Todas as análises foram realizadas em um sistema modular CLAE Varian ProStar (Varian, Palo Alto, CA, EUA) equipado com sistema de distribuição binário de solventes, bomba ProStar 210; com injetor manual Rheodyne®, modelo 7725i, com alça de amostragem de 20 µL; detector UV ProStar 325, operando em 237 nm; coluna Varian recheada com partículas de 5 µm de C18, comprimento de 125 mm x 4,6 mm d.i. e pré-coluna de C18 de 3,0 mm x 4,6 mm. 48 Para as extrações foi utilizado centrífuga (Sislab/Twister), sistema de vácuo para extração em fase sólida (Supelco) e bomba de vácuo (Prismatec), modelo 131. 3.4 Reagentes e solventes O solvente empregado para eluição dos analitos foi acetonitrila (MeCN) grau HPLC (J. T. Baker). Na etapa de partição foram utilizados os reagentes sulfato de magnésio anidro (MgSO4) (Fluka); cloreto de sódio (NaCℓ) (Panreac). Na etapa de limpeza foram utilizados os sorventes amina primária e secundária (PSA) 40 m (Supelco) e octadecilsilano (C18) 40m (Chromabond). O detergente extran foi utilizado para lavagem da vidraria. Na etapa de extração foram utilizados tubos tipo Falcon de 15 e 50 mL e cartuchos de extração em fase sólida vazios. 3.5 Padrões dos pesticidas Padrões de clorpirifós (99,9%), diuron (99,6%), e metil paration (99,7%) foram adquiridos da firma Sigma Aldrich (São Paulo, Brasil). Na etapa inicial do trabalho estavam incluídos os padrões de 2,4-D, acefato, metomil e carbendazim. No entanto estes foram excluídos deste estudo como descrito nos itens 3.8 e 4.3 3.6 Limpeza da vidraria Toda vidraria e tubos utilizados foram lavados com detergente comum e enxaguados com água corrente, posteriormente imersos em solução extran (20%) por 12 horas. Em seguida enxaguados abundantemente água corrente e secos em temperatura ambiente. 49 3.7 Preparo das soluções A solução estoque dos padrões foi preparada em acetonitrila na concentração de 1000 mg L-1 a partir dos padrões primários. A solução estoque do padrão carbendazim foi preparada em acetonitrila acidificada com HCℓ 0,8 mol L-1 na concentração de 1000 mg L-1. A solução estoque foi armazenada sob refrigeração. A partir desta solução preparou-se, por diluição, uma mistura na concentração de 200 mg L-1 em MeCN, contendo todos os compostos. Esta solução foi denominada solução intermediária mista. As soluções de trabalho para a construção da curva analítica foram preparadas a partir da solução intermediária mista, por diluição em MeCN nas concentrações de 0,001 mg L-1 a 2,0 mg L-1. As soluções estoque e a solução intermediária mista foram conservadas sob refrigeração por no máximo 4 meses e as soluções de trabalho foram armazenadas por um mês. 3.8 Desenvolvimento das condições cromatográficas A decisão em usar a técnica de análise por CLAE-UV foi baseada nas propriedades físico-químicas dos analitos de interesse. Como os compostos possuem polaridades variadas, a cromatografia líquida de alta eficiência mostrou-se apropriada para análise dos pesticidas, devido sua seletividade e sensibilidade. Como não há estudos envolvendo o conjunto de analitos do presente trabalho foi necessário otimizar a separação cromatográfica dos pesticidas estudados, primeiramente, injetando-se soluções analíticas de 10,0 g mL-1 para avaliar as seguintes condições: (a) Modo de eluição isocrático: foram utilizadas Fase Móvel (FM) de composição acetonitrila:água 70:30, 40:60 e 50:50 em uma vazão de 1 mL min-1 e comprimento de onda 237 nm. 50 (b) Modo de eluição por gradiente: foram utilizadas FM compostas por água e acetonitrila, cuja composição foi variada em função do tempo conforme a programação de diferentes gradientes lineares em uma vazão de 1 mL min-1 e comprimento de onda 237 nm. Definidas as condições cromatográficas de separação, foi realizada a identificação dos pesticidas estudados injetando-se uma solução de 10 mg L-1 em acetonitrila de cada um deles separadamente e comparado o tempo de retenção aos obtidos quando se injetou uma mistura dos padrões desses compostos. Através de injeções de solução de trabalho, foram testados os comprimentos de onda 230, 233, 237 e 260 nm, em que 237 nm foi o que apresentou melhor absorção, no qual os compostos clorpirifós, carbendazim, diuron e metil paration apresentaram boa separação. Os pesticidas acefato e metomil não absorvem na região UV, portanto os mesmos foram excluídos das análises. Como o pesticida 2,4-D apresentou dois picos cromatográficos para as condições testadas, também foi excluído desse estudo. 3.9 Métodos de extração QuEChERS Os procedimentos de otimização da extração pelo método QuEChERS foram baseados no método estabelecido por BRONDI e colaboradores (2009). Após a determinação das melhores condições cromatográficas de análise, iniciou-se o estudo do método de extração QuEChERS dos analitos de interesse em amostras de água de torneira. Para tal foram criadas condições específicas para este estudo: 1ª Etapa: Foram medidos 10,0 g de amostra e fortificados com a mistura dos pesticidas na concentração de 10,0 g mL-1 (a mistura foi deixada em repouso por 40 minutos em um tubo falcon de 50 mL para que houvesse interação entre os analitos e a amostra). 2ª Etapa: Adição de 10,0 mL de acetonitrila e posterior agitação manual por 1 minuto. 51 3ª Etapa: Adição de 4,0 g de sulfato de magnésio anidro (MgSO4) e 1,0 g de cloreto de sódio (NaCℓ) e posterior agitação por 1 minuto. Em seguida, a mistura foi centrifugada a 3000 rpm por 1 minuto. 4ª Etapa: Da fase orgânica formada, foi recolhida uma alíquota de 5,0 mL e transferida para um cartucho de extração em fase sólida contendo 330 mg de octadecilsilano (C18), 330 mg de amina primária e secundária (PSA) e 700 mg de MgSO4 pré-ativado com 3,0 mL de MeCN em sistema de vácuo. O eluato foi recolhido em tubo falcon de 15,0 mL. Uma alíquota de 20 L do extrato foi injetada no sistema cromatográfico. A Figura 5 apresenta o fluxograma do método de extração utilizado na análise. Figura 5 - Etapas do método de extração QuERChERS Agitação por 1 min. Extração Partição Limpeza Repouso por 40 min. 10 g de amostra fortificada - Agitação por 1 min. - Centrifugação (3000 rpm, 1 min.) 330 mg de C18; 330 mg de PSA; 700 mg de MgSO4 Adição de 10 mL de acetonitrila 4 g de MgSO4 1 g de NaCℓ CLAE/UV - Agitação por 1 min. 52 3.10 Fortificação das amostras de água Amostras de água de torneira do Laboratório de Pesquisa de Química da Faculdade de Ciência do Pontal (FACIP)/UFU, do campus de Ituiutaba, empregadas como testemunhas, foram filtradas em membrana de 0,45 μm sob vácuo. Foi adicionada solução do padrão de diuron, clorpirifós e metil paration, de concentração adequada, sob agitação, para obter os níveis de fortificação apresentados na Tabela 7. Tabela 7 - Concentrações utilizadas para estudos de recuperação Pesticida Níveis de fortificação (g mL-1) Diuron 0,25 0,50 1,00 2,00 Metil paration 0,25 0,50 1,00 2,00 Clorpirifós 0,25 0,50 1,00 2,00 3.11 Amostragem 3.11.1 Coleta de amostras As coletas das amostras de água foram efetuadas em abril/2012, junho/2012, novembro/2012 e janeiro/2013 no município de Campo Novo do Parecis (Figuras 6 e 7). Estes períodos foram escolhidos em função: do período de safra da soja na região; da região apresentar duas estações bem definidas, uma de seca que vai de maio a setembro, onde há aplicação de inseticidas e desfolhantes, e uma estação chuvosa que vai de outubro a abril aumentando a probabilidade de carreamento de resíduos de pesticidas para os corpos d’água. Foram amostrados 6 poços artesianos com profundidades variadas, todos em área urbana (Tabela 8). 53 Figura 6 - Localização do município de Campo Novo do Parecis no Estado do Mato Grosso Fonte: Grosso (BAHIA, 2007). Figura 7 - Região de coleta de amostras de água no município de Campo Novo do Parecis (MT) Fonte: (Foto: Google earth). 54 Tabela 8 - Localização geográfica dos poços onde foram coletadas amostras de água Poço Local Profundidade/ metros Coordenadas (UTM) P01 Hospital Municipal Euclides Horst 96,33 Lat=13°39’08,84” Lon=57°53’28,12” P02 Escola Estadual Madre Tarcila 82,20 Lat=13°39’36,73” Lon=57°53’10,02” P03 Ao lado do INDEA 89,29 Lat=13°39’49,03” Lon=57°53’19,01” P04 Feira Municipal 77,10 Lat=13°40’00,06” Lon=57°53’25,86” P05 Igreja Católica Boa Esperança 100,00 Lat=13°39’59,21” Lon=57°53’45,33” P06 ETA – Estação de tratamento 117,00 Lat=13°39’19,63” Lon=57°53’57,63” A coleta das amostras ocorreu obedecendo o seguinte procedimento: as amostras foram coletadas pela manhã, tomando-se o cuidado de coletar nos mesmos horários (entre 8:00 e 10:30); em frasco âmbar, previamente lavado. Foram coletados 2 litros tomando-se diretamente na torneira na saída das bombas, depois de deixar a água escoar por 10 minutos, aproximadamente, antes da coleta. Os frascos foram etiquetados e transportados em caixas de Isopor e armazenadas sob refrigeração. 3.12 Análise Quantitativa A quantificação dos pesticidas foi efetuada utilizando-se o método de adição de padrão. Os extratos e as soluções padrão foram injetadas em triplicata. Nos casos em que os resultados das injeções diferiam mais de 10%, foi realizada uma nova análise. 55 3.13 Análise dos Resultados Os resultados das análises dos ensaios de recuperação foram submetidos aos critérios de validação, descritos no item 1.7. Quatro análises foram realizadas para cada nível de fortificação estudado, com a injeção em triplicata. 3.14 Análise da Amostra Testemunha A amostra de água testemunha utilizada para a validação do método foi submetida aos processos de extração (item 3.9) para a verificação de possíveis interferentes. 56 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 Levantamento dos pesticidas Os pesticidas mais utilizados na região de estudo, segundo o levantamento feito preliminarmente, através de entrevistas com revendedores, estão descritos na tabela 9. Tabela 9 - Produtos comerciais e respectivos ingredientes-ativos Nº Nome comercial Ingrediente ativo 01 2,4-D (Bd) 2,4-D 02 CEFANOL, ORTHENE, AQUILA 750 acefato 03 MOSPILAN/SAURUS acetamiprido 04 PROFF, HERBITRIN, SIPTRAM atrazina 05 KIT AZOCI PRÓ, KIT GALILEO azoxistrobina+ciproconazol 06 KIT FUNGICIDA TEBUCONAZOLE+PRIORI azoxistrobina+tebuconazole 07 KIT DOMARK + PRIORI azoxistrobin+tetraconazole 08 DIPEL Bacillus thuringiensis 09 TURBO betaciflutrina 10 TALSTAR bifentrina 11 BIOZYNE bioestimulante 12 RUGBI cadusafós 13 CARBOMAX, STREAK, RODAZIN, DEROSAL 500, PORTERO carbendazim 14 PROTEAT carbendazin+tiram 15 FURADAN carbofuran 16 FURAZIN carbofuran+Zn 17 FENIX, MARSHALL 400 carbosulfano 18 VITAVAX-Thiram carboxina+tiram 19 AURORA carfentrazona-etílica 20 CYPTRIN cipermetrina 21 SELECT cletodin 22 GAMIT clomazone 23 ATABRON clorfluazurom 24 CLASSIC HYDRO, CLASSIC 2x1 clorimuron 25 CLORIM clorimuron-etílico 26 KLORPAN, NUFUS clorpirifós 57 Tabela 9 - Produtos comerciais e respectivos ingredientes-ativos Nº Nome comercial Ingrediente ativo 27 SPIDER diclosulam 28 DIMILIN, DIMILIN 80 WG, DIFLUCHEN(DIMAX) diflubenzurom 29 KARMEX 800 GRDA diurom 30 ENDOSSULFAN endosulfan 31 IHARAGUEN-S espalhante Adesivo 32 OBERON espiromesifeno 33 PODIUM EW fenoxaprope-P-etílico 34 PODIUM S fenoxaprope-P-etílico+cletodim 35 VIOLIN (STANDAK) finopril 36 FRONWCIDE (ZIGNAL) fluazinam 37 BELT flubendiamida 38 RANDIANT flumicloraque-pentílico 39 SUMYZIN flumioxazina 40 ATENTO fluquinconazol 41 FLEX (4x5) fomesafen 42 DIRECT, POLARIS, GLIFOSATO NU FARM,SHADOW, ATANOR glifosato 43 GALLANT haloxifope-P-metílico 44 IMAZETHAPIR, ZETHAPIR, ZAPHIR imazetapir 45 IMIDACLOPRID, PICUS, WARRANT imidacloprido 46 CONNECT imidacloprido+betaciflutrina 47 KIT NUPRID imidacloprido+cipermetrina 48 AVAUNT/AVATAR indoxacarbe 49 LACTOFEN, DRIBLE lactofem 50 NEXID lambda-cialotrina 51 MALATHION malationa 52 FERSOL metamidofós 53 SPOONSOR (PIX HC) mepiquate 54 ALLY metsulfurom-metílico 55 LANNATE, METHOMEX metomil 56 RIMON novalurom 57 ACCENT, SANSON nicosulfuron 58 BOX: ACCENT+CALLISTO nicosulfuron+mesotrione 59 AUREO óleo metilado 60 LANZAR, IHAROL, NIMBUS óleo mineral 61 GRAMOXONE, HELMOXONE paraquate 62 PARATHION 600 (PARACAP), FERUS metil paration 63 PERMETRINA 384 (FERSOL), GALGOPER permetrina 58 Tabela 9 - Produtos comerciais e respectivos ingredientes-ativos Nº Nome comercial Ingrediente ativo 64 APROACH PRIMA picoxistrobina+ciproconazol 65 OPERA piraclostrobina+epoxiconazol 66 STAPLE piritiobaque sódico 67 BORAL sulfentrazona 68 SOBERAN tembotriona 69 KIT DOMARK+PRIORI tetraconazole+azoxistrobina 70 LARVIN tiodicarbe 71 SUPPORT SC, SUPPORT WG tiofanato-metílico 72 CERTEZA tiofanato metílico+fluazinam 73 PLATINUM/ALIKA tiametoxam+cipermetrina 74 PLATINUM NEO tiametoxam+lambdacialotrina 75 CROP STAR tiodicarbe+imidacloprido 76 THIRAM tiram 77 SPHERE MAX trifloxistrobina+ciproconazol 78 FOX trifloxistrobina+protioconazol 79 CERTERO triflumurom 80 MUSTANG zeta-cipermetrina Pela análise da Tabela 9 observou-se que dos 80 ingredientes ativos, 17 não são empregados em cultura de soja. Observou-se ainda que 43,8% pertencem às classes I e II da classificação toxicológica (extremamente tóxico e altamente tóxico, respectivamente). Quanto à classificação ambiental, 45,6% pertencem às classes I e II (produto altamente perigoso e muito perigoso ao meio ambiente, respectivamente). Esses dados estão representados na Figura 8. Embora os valores apontados sejam inferiores a estudos realizados em outras regiões (ANDRADE et al., 2011; DORES; DE-LAMONICA-FREIRE, 2001; GAMA; OLIVEIRA; CAVALCANTE, 2013), esses dados mostram a necessidade de estudos sobre a utilização destes pesticidas nas atividades agrícolas da região. 59 Figura 8 - Porcentagem de agrotóxicos classificados de acordo com a toxicologia e os riscos ambientais I II III IV SR 0 10 20 30 40 50 Toxicológica Risco ambiental In gr ed ie nt es a tiv os (% ) Classificação 4.2 Análise de risco de contaminação A avaliação da mobilidade dos pesticidas pode envolver estimativas diretas ou indiretas. Estimativas diretas envolvem o estudo do comportamento do pesticida aplicado ao solo. Já as estimativas indiretas são baseadas na medida de parâmetros que utilizam modelos de avaliação do potencial de lixiviação (RIBEIRO et al., 2007). Esses modelos são representações físicas, conceituais ou matemáticas da realidade, apresentando diferentes propósitos, tais como triagem – estabelecimento de prioridades, regulamentações/exposição – avaliações quantitativas e estabelecimento de regulamentos, e pesquisa – diversos tipos de aplicação e requerem grande número de dados (RIBEIRO et al., 2007). A avaliação do risco de contaminaç