UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” Instituto de Química Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Síntese de peptídeos derivados do domínio funcional da Histatina 5 e sua incorporação em lipossomas como estratégia para inibição de Candida albicans CAROLINA REIS ZAMBOM CAROLINA REIS ZAMBOM Síntese de peptídeos derivados do domínio funcional da Histatina 5 e sua incorporação em lipossomas como estratégia para inibição de Candida albicans Tese apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Doutora em Biotecnologia Orientador: Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido Araraquara 2022 Z24s Zambom, Carolina Reis Síntese de peptídeos derivados do domínio funcional da Histatina 5 e sua incorporação em lipossomas como estratégia para inibição de Candida albicans / Carolina Reis Zambom. -- Araraquara, 2022 167 f. : il. Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista (Unesp), Instituto de Química, Araraquara Orientador: Saulo Santesso Garrido 1. Candida albicans. 2. Peptídeos. 3. Saliva. 4. Lipossomas. 5. Biofilme. I. Título. Sistema de geração automática de fichas catalográficas da Unesp. Biblioteca do Instituto de Química, Araraquara. Dados fornecidos pelo autor(a). Essa ficha não pode ser modificada. Instituto de Química - Câmpus de Araraquara - Rua Prof. Francisco Degni, 55, 14800060, Araraquara - São Paulo http://www.iq.unesp.br/#!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ: 48.031.918/0027-63. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA Câmpus de Araraquara CERTIFICADO DE APROVAÇÃO TÍTULO DA TESE: "Síntese de peptídeos derivados do domínio funcional da Histatina 5 e sua incorporação em lipossomas como estratégia para inibição de Candida albicans" AUTORA: CAROLINA REIS ZAMBOM ORIENTADOR: SAULO SANTESSO GARRIDO Aprovada como parte das exigências para obtenção do Título de Doutora em BIOTECNOLOGIA, pela Comissão Examinadora: Prof. Dr. SAULO SANTESSO GARRIDO (Participaçao Virtual) Departamento de Bioquimica e Quimica Organica / Instituto de Quimica - UNESP - Araraquara Por: Profa. Dra. PATRÍCIA BENTO DA SILVA (Participaçao Virtual) Departamento de Genética e Morfologia / Instituto de Ciências Biológicas - UNB - Brasília Por: Prof. Dr. EDUARDO FESTOZO VICENTE (Participaçao Virtual) Departamento de Engenharia de Biossistemas / Universidade Estadual Paulista - UNESP - Tupã Por: Prof. Dr. MARLUS CHORILLI (Participaçao Virtual) Departamento de Fármacos e Medicamentos / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Por: Prof. Dr. FERNANDO ROGERIO PAVAN (Participaçao Virtual) Departamento de Ciencias Biologicas / Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP - Araraquara Araraquara, 01 de agosto de 2022 http://www.iq.unesp.br/%23!/pos-graduacao/biotecnologia/CNPJ DADOS CURRICULARES IDENTIFICAÇÃO Nome: Carolina Reis Zambom Nome em citações bibliográficas: ZAMBOM, C. R.; ZAMBOM, CAROLINA R.; Reis Zambom, C.; Reis Zambom, Carolina; ZAMBOM, C.R.; ZAMBOM, CAROLINA; ZAMBOM, CAROLINA REIS FORMAÇÃO ACADÊMICA/TITULAÇÃO 2018-2022 Doutorado em Biotecnologia Instituto de Química de Araraquara Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil Orientador: Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido Bolsista da: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Projeto de Pesquisa: Síntese de peptídeos derivados do domínio funcional da Histatina 5 e sua incorporação em lipossomas como estratégia para inibição de Candida albicans 2020-2020 Período Sanduíche em University of Saskatchewan (SK, Canada) Supervisor: Walter L. Siqueira Bolsista da: Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) – Convênio CAPES-PRINT-UNESP 2016-2018 Mestrado em Biotecnologia Instituto de Química de Araraquara Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil Orientador: Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido Co-orientador: Prof. Dr. Marlus Chorilli Bolsista do: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Projeto de Pesquisa: Desenvolvimento e caracterização de lipossomas com diferentes composições lipídicas contendo o peptídeo antifúngico 0WHistatina-5 2010-2015 Graduação em Farmácia-Bioquímica Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil 2013-2014 Bolsista de Iniciação Cientifica Instituto de Química de Araraquara Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil Orientador: Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido Bolsista da: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Processo: 2012/23576-2 Projeto de Pesquisa: Estudos de permeação e liberação de peptídeos antimicrobianos estruturalmente derivados da toxina CcdB 2011-2012 Bolsista de Iniciação Científica Instituto de Química de Araraquara Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil Orientador: Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido Bolsista do: Programa Institucional de Bolsas de Iniciação Científica (PIBIC/CNPq) Projeto de Pesquisa: Estudos de drug delivery systems aplicado a novos inibidores peptídicos estruturalmente derivados de proteínas bacterianas FORMAÇÃO COMPLEMENTAR 2021 - 2021 Curso de Introdução a Nanotecnologia e Nanotoxicologia. Carga horária: 8h Centro Nacional de Pesquisa em Energia e Materiais, CNPEM, Brasil. 2021 - 2021 Workshop de Escrita Científica em Inglês. Carga horária: 5h Una Assessoria Linguística, UNA, Brasil. 2021 - 2021 Curso Rápido de Ilustração Científica. Carga horária: 2h Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz - USP, ESALQ - USP, Brasil. 2021 - 2021 ACS na Região Sudeste - Tudo o que você precisa saber para ter sucesso no d Carga horária: 1h American Chemical Society Publications, ACS PUBLICATIONS, Estados Unidos. 2020 - 2020 Laboratory Safety. Carga horária: 2h University of Saskatchewan, U of S, Canadá. 2020 - 2020 Biosafety. Carga horária: 2h University of Saskatchewan, U of S, Canadá. 2020 - 2020 WHMIS 2015. Carga horária: 1h University of Saskatchewan, U of S, Canadá. 2020 - 2020 COVID-19 Health and Safety. Carga horária: 2h University of Saskatchewan, U of S, Canadá. 2020 - 2020 Biowaste Course. Carga horária: 2h University of Saskatchewan, U of S, Canadá. 2018 - 2018 Mini Curso: Farmacogenética. Carga horária: 2h Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2016 - 2016 Mini Curso: Técnicas de Oratória. Carga horária: 3h Universidade de São Paulo, USP, Brasil. 2016 – 2016 Mesa Redonda - Zika Vírus. Carga horária: 3h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. 2016 – 2016 Palestra: Nanopartículas lipídicas e poliméricas como Sistemas Carreadores. Carga horária: 2h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. 2016 – 2016 Palestra: Técnicas de Oratória. Carga horária: 3h. Universidade de São Paulo, USP, Brasil. 2013 – 2013 Palestra: Nanotecnologia Farmacêutica. Carga horária: 4h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2013 – 2013 Palestra: Enzimas Farmacêuticas e Sua Estabilização para Usos Biotecnológicos. Carga horária: 3h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2013 – 2013 Palestra: Síntese de Peptídeos em Fase Sólida e Obtenção de Novos Fármacos. Carga horária: 2h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2012 – 2012 Palestra: Medicina Ortomolecular - Quebrando Paradigmas. Carga horária: 4h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2010 – 2010 Conscientização sobre a profissão Farmacêutica. Carga horária: 30h. Universidade Estadual de Maringá, UEM, Brasil. 2010 – 2010 Palestra: Nutrição Parenteral. Carga horária: 6h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2010 - 2010 Palestra: O Farmacêutico nas Ciências Forenses. Carga horária: 8h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. 2010 - 2010 Palestra: Psicofarmacologia e Doenças Neurodegenerativas. Carga horária: 4h. Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara, FCFAR, Brasil. Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, UNESP, Brasil. PRODUÇÃO BIBLIOGRÁFIA Artigos completos publicados em periódicos 1. ZOLIN, GABRIELA VIEIRA SILVA; FONSECA, FAULLER HENRIQUE DA; ZAMBOM, CAROLINA REIS; GARRIDO, SAULO SANTESSO. Histatin 5 Metallopeptides and Their Potential against Candida albicans Pathogenicity and Drug Resistance. Biomolecules, v. 11, p. 1209, 2021. 2. MORAES, GUSTAVO; ZAMBOM, CAROLINA; SIQUEIRA, WALTER L. Nanoparticles in Dentistry: A Comprehensive Review. Pharmaceuticals, v. 14, p. 752, 2021. 3. FARIAS, R.L.; POLEZ, A.M.R.; SILVA, D.E.S.; ZANETTI, R.D.; MOREIRA, M.B.; BATISTA, V.S.; REIS, B.L.; NASCIMENTO-JÚNIOR, N.M.; ROCHA, F.V.; LIMA, M.A.; OLIVEIRA, A.B.; ELLENA, J.; SCARIM, C.B.; ZAMBOM, C.R.; BRITO, L.D.; GARRIDO, S.S.; MELO, A.P.L.; BRESOLIN, L.; TIRLONI, B.; PEREIRA, J.C.M.; NETTO, A.V.G. In vitro and in silico assessment of antitumor properties and biomolecular binding studies for two new complexes based on NiII bearing k2N,S-donor ligands. Materials Science & Engineering C-Materials for Biological Applications, v. 121, p. 111815, 2020. 4. ALMEIDA, VITOR Y. G.; ROCHA, JOSIAS S.; FELIX, DÉBORA P.; OLIVEIRA, GABRIELA P.; LIMA, MAURO A.; FARIAS, RENAN L.; ZANETTI, RENAN D.; NETTO, ADELINO V. G.; ZAMBOM, CAROLINA R.; GARRIDO, SAULO S.; ROCHA, FILLIPE. Cytotoxicity and antibacterial activity of silver complexes bearing semicarbazones and triphenylphosphine. ChemistrySelect, v. 5, p. 14559-14563, 2020. 5. ZAMBOM, C.R; FONSECA, F.H; GARRIDO, S.S. Bio‐ and nanotechnology as the key for clinical application of salivary peptide Histatin: A necessary advance. Microorganisms, v. 8, p. 1–17, Jul 2020. 6. ZAMBOM, C.R; FONSECA, F.H; JUNIOR, E.C; SILVA, P.B; PAVAN, F.R; CHORILLI, M; GARRIDO, S.S. A novel antifungal system with potential for prolonged delivery of histatin 5 to limit growth of Candida albicans. Frontiers in Microbiology, v. 10, p. 1-11, Jul. 2019. 7. GARRIDO, S. S.; OLIVEIRA, I. C.; ZAMBOM, C. R.; VAZ, A.B.S; MARCHETTO, R.; BARBOSA, L. C. B. Avaliação quantitativa da susceptibilidade do crescimento de Staphylococcus aureus na presença de sistemas antimicrobianos de alta complexidade. Eclética Química, v. 40, p. 95-105, 2015. Resumos publicados em anais de congressos 1. NALIATTO, N.; FONSECA, F. H.; ZAMBOM, C. R.; GARRIDO, S. S. Metalopeptídeos derivados da Histatina 5 como alternativa para o tratamento de infecções causadas por Candida albicans. In: XXXI Congresso de Iniciação Científica da Unesp, 2019, Araraquara. XXXI CIC - Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2019. 2. MONTEIRO, A. R.; FONSECA, F. H.; ZAMBOM, C. R.; GARRIDO, S. S. Síntese e caracterização de peptídeos antifúngicos derivados da Histatina-5 para o tratamento de candidíase bucal. In: XXXI Congresso de Iniciação Científica da Unesp, 2019, Araraquara. XXXI CIC - Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2019. 3. ZAMBOM, C. R.; SILVA, P. B; CRUSCA, E.; CHORILLI, M.; GARRIDO, S. S. Encapsulação do peptídeo antifúngico 0WHistatina-5 em lipossomas como estratégia para uso no tratamento da candidíase bucal. In: VIII Congresso Farmacêutico da UNESP e IV Jornada de Engenharia de Bioprocessos, 2018, Araraquara. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, 2018. v. 39. 4. ZAMBOM, C. R.; SILVA, J.C.M; VAZ, A.B.S; SILVA, P. B; CHORILLI, M.; GARRIDO, S. S. Desenvolvimento e caracterização de lipossomas de diferentes composições lipídicas contendo o peptídeo antifúngico Histatina-5. In: VI Congresso Farmacêutico da UNESP, 2016, Araraquara/SP. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, 2016. v. 37. 5. SILVA, J.C.M.; VAZ, A.B.S.; ZAMBOM, C. R.; CRUZ, C.Z.P.; MONTI, R.; GARRIDO, S. S. Atividade antimicrobiana e antioxidante do peptídeo LeuB contra Salmonella sorovar Typhimurium e Escherichia coli. In: VI Congresso Farmacêutico da UNESP, 2016, Araraquara/SP. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, 2016. v. 37. 6. VAZ, A.B.S.; SILVA, J.C.M.; ZAMBOM, C. R.; GARRIDO, S. S. Avaliação da Atividade Antimicrobiana do Peptídeo LeuAB-2: Um Promissor Conservante de Alimentos. In: VI Congresso Farmacêutica da UNESP, 2016, Araraquara/SP. Revista de Ciências Farmacêuticas Básica e Aplicada, 2016. v. 37. 7. GARRIDO, S. S.; OLIVEIRA, I. C.; ZAMBOM, C. R. IN VITRO EFFICACY OF CCDB TOXIN PEPTIDE ANALOGUES MEDIATED BY DRUG DELIVERY SYSTEMS FORMULATION. In: Chemistry for Life Science-5th European Conference, 2013, Barcelona. Chemistry for Life Science, 2013. http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 8. OLIVEIRA, I. C.; ZAMBOM, C. R.; PORTO, P. M.; OLIVEIRA, A. G. F.; GARRIDO, S. S. New peptides structurally based on CcdB toxin with inhibition potential of bacterial topoisomerases. In: 5th Symposium on biological chemistry: Frontiers and new perspectives, 2013, Ilha Bela. Proceedings of 5th Symposium on biological chemistry: Frontiers and new perspectives, 2013. v. 1. p. 62-62. Apresentações de Trabalhos 1. ZAMBOM, C. R.; FONSECA, F. H.; SILVA, P. B.; CRUSCA, E.; MARCHETTO, R.; CHORILLI, M.; GARRIDO, S. S. Development of an antifungal system for prolonged release of Histatin-5 to control of Candida albicans growth. 2019. (Apresentação de Trabalho/Outra). 2. FONSECA, F. H.; ZAMBOM, C. R.; MARCHETTO, R.; CHORILLI, M.; GARRIDO, S. S. Evaluation of the Synergy Effect Between the Peptide 0WHistatin-5 and the Antifungals Nystatin and Fluconazole against Candida albicans. 2019. (Apresentação de Trabalho/Outra). 3. ZAMBOM, C. R.; SILVA, P. B.; CRUSCA, E.; CHORILLI, M.; GARRIDO, S. S. Encapsulação do peptídeo antifúngico 0WHistatina-5 em lipossomas como estratégia para uso no tratamento da candidíase bucal. 2018. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 4. ZAMBOM, C. R.; SILVA, P. B.; CRUSCA, E.; MARCHETTO, R.; CHORILLI, M.; GARRIDO, S. S. Development of antifungal peptide histatin-5-loaded pegylated liposomes for treatment of oral candidiasis. 2017. (Apresentação de Trabalho). 5. ZAMBOM, C. R.; SILVA, J.C.M; VAZ, A.B.S; SILVA, P. B; CHORILLI, M.; GARRIDO, S. S. Desenvolvimento e caracterização de lipossomas de diferentes composições lipídicas contendo o peptídeo antifúngico Histatina-5. 2016. (Apresentação de Trabalho/Congresso). 6. ZAMBOM, C. R.; GARRIDO, S. S.; SILVA, J.C.M.; VAZ, A.B.S. Studies of encapsulation and releasing for an antimicrobial peptide structurally derivatives toxin CcdB. 2016. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). 7. OLIVEIRA, I.C.; ZAMBOM, C. R.; GARRIDO, S. S. Synthesis and studies of bioencapsulation systems associated with antimicrobial peptides based on natural toxin CcdB. 2013. (Apresentação de Trabalho/Simpósio). 8. GARRIDO, S.S.; ZAMBOM, C. R. Estudo de drug delivery systems aplicado a novos inibidores peptídicos estruturalmente derivados de toxinas bacterianas. 2012. (Apresentação de Trabalho/Congresso). http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 http://lattes.cnpq.br/7940538630580657 PARTICIPAÇÃO EM EVENTOS CIENTÍFICOS 1. 48° Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Bioquímica e Biologia Molecular. Development of an antifungal system for prolonged release of Histatin-5 to control of Candida albicans growth. 2019. (Encontro). 2. VIII Congresso Farmacêutico da UNESP. Encapsulação do peptídeo antifúngico 0WHistatina-5 em lipossomas como estratégia para uso no tratamento da candidíase bucal. 2018. (Congresso). 3. 46th Annual Meeting of Brazilian Society for Biochemistry and Molecular Biology. Águas de Lindóia – São Paulo – Brazil. 4. 7th International Symposium of Graduate and Research. Studies of encapsulation and releasing for an antimicrobial peptide structurally derivatives toxin CcdB. 2016. (Simpósio). 5. 1° Workshop de Inovação e Empreendedorismo do Instituto de Química - UNESP. 2016. 6. VI Congresso Farmacêutico da UNESP. Desenvolvimento e caracterização de lipossomas de diferentes composições lipídicas contendo o peptídeo antifúngico Histatina-5. 2016. (Congresso). 7. I International Symposium of Medical Chemistry and Regenerative Medicine. 2014. (Simpósio). 8. I Curso de Verão - Biociências e Biotecnologia Aplicadas a Farmácia. 2013. 9. III Congresso Farmacêutico da UNESP - 60° Jornada Farmacêutica da UNESP. 2013. (Congresso). 10. III Symposium on Drug Discovery. Synthesis and studies of bioencapsulation systems associated with antimicrobial peptides based on natural toxin CcdB. 2013. (Simpósio). 11. XXIV Congresso de Iniciação Científica da UNESP. Estudos de Drug Delivery Systems aplicados a novos inibidores peptídicos estruturalmente derivados de toxinas bacterianas. 2012. (Congresso). 12. II Congresso Farmacêutico da UNESP. Estudos de Drug delivery systems aplicado a novos inibidores peptídicos estruturalmente derivados de proteínas bacterianas. 2012. (Congresso). PARTICIPAÇÃO EM BANCAS DE TRABALHOS DE CONCLUSÃO Trabalhos de conclusão de curso de graduação 1. GARRIDO, S. S.; Freitas, Z. F; ZAMBOM, C. R. Participação em banca de Nathalia Naliatto. Aplicação de metalopeptídeos derivados de Histatina-5 para o combate de infecções causadas por Candida albicans. 2021. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia) - Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP/Araraquara. 2. MONTI, R.; ZAMBOM, C. R.; Sivieri, K. Participação em banca de Isabela Mouro Pianta. Hidrólise parcial das proteínas do soro de queijo bovino com bromelina imobilizada em suporte sólido: determinação da atividade antioxidante e quelante de metais. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia e Bioquímica) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. 3. GARRIDO, S. S.; VAZ, A.B.S; ZAMBOM, C. R. Participação em banca de Sara Pini Zenatti. Avaliação do potencial antimicrobiano da associação de peptídeos derivados do sistema Toxina/Antitoxina CcdB/CcdA. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia e Bioquímica) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. 4. GARRIDO, S. S.; CHORILLI, M.; ZAMBOM, C. R. Participação em banca de Rebeca Carvalho Souza. Avaliação da eficiência de encapsulação do peptídeo 0WHistatina-5 em lipossomas de diferentes diâmetros. 2018. Trabalho de Conclusão de Curso (Graduação em Farmácia e Bioquímica) - Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. OUTRAS ATIVIDADES Estágio Docência Disciplina: Bioquímica Industrial Professor Responsável: Prof. Dr. Saulo Santesso Garrido Duração: 2°semestre/2018 Supervisão Científica Aluna: Sara Pinni Zenatti Bolsa: FAPESP Duração: 2°semestre/2018 Programa de Prática Docente dos Pós-graduandos da Faculdade de Ciências Farmacêuticas Disciplina: Enzimologia Farmacêutica Professor Responsável: Profa. Dra. Daniela Cardoso Umbelino Cavallini Duração: 02 de outubro a 13 de dezembro de 2019 Total de 20 horas aulas semanais Ao Bruno, meu esposo e melhor companhia. Por me acompanhar desde o início nessa caminhada. Por compartilhar essa vida comigo. Agradecimentos É inevitável escrever esses agradecimentos sem lembrar dos passos dessa caminhada até aqui. É para mim uma viagem ao passado. Lembrar de cada um que passou pelo meu caminho, cada um que colaborou, compartilhou ou de alguma forma deixou sua marca em mim e neste trabalho. Antes de tudo, é necessário lembrar que sem Ele nada aqui seria possível. Dessa forma, agradeço a Deus. Agradeço pelo dom da minha vida, pela companhia diária, por guiar meus caminhos e passos mesmo quando achava que estava sozinha. Mas na verdade, eu nunca estive. E por não me deixar em nenhum momento sozinha, agradeço a minha mãe do céu Maria Santíssima. Que nas horas mais difíceis sempre me mostrou seu amor incondicional de mãe e vinha ao meu encontro, me consolar. Agora, agradeço ao Bruno. Meu esposo. Compartilhou comigo o início dessa caminhada, no mestrado em 2016. E antes disso, a minha vontade de fazer pós-graduação quando ainda fazia iniciação científica. Ele seguiu ao meu lado em todos os momentos, sempre com uma palavra amorosa de incentivo. Ele que nos momentos mais difíceis se mostrava forte e me dava segurança para que eu pudesse continuar. Ele que foi primordial para que eu pudesse viajar para o Canadá, em meu doutorado sanduíche, vencer o medo e todos os desafios que lá me esperavam. Por todas as conversas, risadas, lágrimas, chamadas de vídeo, desabafos, abraços que já compartilhamos, eu te agradeço. Sem você, não seria possível. Não posso me esquecer deles, meus pais, Eliane e José Roberto. Os responsáveis pela minha educação, por me incentivarem a ler, a estudar, e a querer ser pesquisadora. Por me comprar os primeiro livros e gibis da Turma da Mônica, com os quais aprendi a ler. Os primeiros que lá na minha infância, talvez já teriam visto minha vocação para a pesquisa. Quando eu sentava por muito tempo no jardim e fazia “remédios” com as folhas das plantas. Agradeço pelo primeiro apoio, por me ajudar a subir os primeiros degraus dessa escada. Por fazerem tantas mudanças de cidade comigo e nunca duvidarem que seria possível. E ao meu primeiro amigo, minha primeira parceria na vida, meu irmão Betinho. Por me defender quando foi preciso, por acompanhar as minhas mudanças de cidade e de ideia sempre com bom humor, por de certa forma acreditar em mim e em meus objetivos. Agora, definitivamente sem ele, nada disso seria possível. Prof. Saulo, meu orientador. Impossível não me lembrar do dia em que apareci em sua sala, no segundo ano de minha graduação. O primeiro projeto de iniciação científica sob orientação dele foi o que começou tudo isso. Já são 11 anos de parceria e orientação. Agradeço pelos conselhos, pelas discussões dos projetos, pelo incentivo, pela confiança em mim e no meu trabalho. Por se preocupar comigo, mesmo longe, quando estava no Canadá. Por me ouvir sempre e por acatar, às vezes, até minhas ideias mais absurdas. Obrigada por tudo isso, e por ser essencial na minha formação científica. Em 2020 entrei em um avião para a experiência mais desafiadora da minha vida até então. Meu período de doutorado sanduíche no Canadá, na University of Saskatchewan. Agradeço ao programa Capes Print pela oportunidade e pela bolsa concedida. Agradeço ao Dr. Walter Siqueira por me receber em seu laboratório, me incluir em seu grupo de pesquisa e apoiar o desenvolvimento de meu projeto. Foram muitos os desafios que foram vencidos devido a ajuda que tive dos meus colegas de laboratório, Lina, Dina, Gustavo, Priscila e Stephanie. No entanto, não posso resumir essa experiência somente pela parte acadêmica, pois foi muito mais do que isso. Foi uma experiência de vida da qual Marlene e Dennis foram essenciais ao me acolher em sua casa e me tratar como família. Por fazerem os meses de lockdown serem mais leves na medida do possível. Pelos muitos “puzzles” que montamos juntos. Pelos “barbecue” no jardim. Pelas caminhadas na neve nos dias mais tediosos. Pelos sanduíches na hora do almoço. Pelas horas ouvindo e cantando música antiga com o Dennis. Mas o essencial, por me ensinar que não existem fronteiras, nem nacionalidades, nem diferenças culturais quando se trata de amor ao próximo, de carinho e de cuidado. Além disso, agradeço a Thaisa, Gabriel e Raquel por facilitar os meus primeiros passos fora de meu país de origem. Não poderia deixar de dar a todos eles um espaço nesse trabalho. Nesse tempo fora, senti muita falta dos amigos aqui do Brasil. Presença constante na “salinha” e companhia no dia-a-dia do laboratório na UNESP, uma parte desse trabalho também é deles. Fauller, Gabi, Naiara, André, Greg, Zaida, Nathália, Jonatas e Beatriz. Acredito que fizemos de tudo um pouco naquele laboratório. Festinhas com bolo e refrigerante, sessões de terapia e desabafos, dúvidas sobre projetos, experimentos, equipamentos e sobre a vida. Resoluções de problemas que pareciam sem resoluções e café. Sempre café. A verdade é que durante esses quatro anos compartilhei esse trabalho com pessoas que me auxiliariam a construí-lo. Então deixo meu agradecimento aqui ao Lucas do Grupo de Materiais Eletroquímicos e Métodos Eletro-analíticos (GMEME) do Instituto de Química de São Carlos – USP. Ao Dr. Renan do Grupo de Pesquisa em Química de Coordenação e Organometálicos do Instituto de Química – UNESP/Araraquara. A Profa. Ana Marisa e ao William do Grupo de Pesquisa de Interação fungo-hospedeiro da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP/Araraquara. Ao Léo do Laboratório de Farmacotécnica e Tecnologia Farmacêutica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara/UNESP. Ao Prof. Fernando Pavan do Grupo de pesquisa de novos fármacos contra tuberculose da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara/UNESP, pela constate ajuda com metodologias e dúvidas microbiológicas. Aqui, faço um agradecimento especial ao Prof. Marlus Chorilli, que me acompanha desde a graduação. Professor de farmacotécnica, depois co-orientador em meu mestrado e parceria constante nesse projeto de doutorado. Na verdade, a ideia inicial de trabalhar com a Histatina 5 foi dele. Então, de certa forma, foi ele quem começou tudo isso. Eu agradeço pelo apoio, por abrir as portas de seu laboratório para mim e permitir o uso de tantos equipamentos e técnicas. Agradeço por ser presença constante em minha caminhada, contribuindo para mim formação científica e pessoal. Por sempre dar suporte e apoio a mim e aos alunos do Instituto de Química, agradeço a Wennia, Robson, Ana Paula e Maria Isabel da sessão de Pós-graduação em Biotecnologia. Agradeço a Fiocruz por doar as cepas de C. albicans necessárias para esse estudo. O presente trabalho foi realizado com o apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. Quatro anos pode ser considerado muito tempo, ou não. Por vezes acreditava estar passando rápido demais enquanto em outras tinha a impressão de estar se arrastando. De uma forma ou de outra, eu sempre imaginei como seria quando o tempo acabasse e chegasse ao fim. E hoje mal consigo acreditar que cheguei até aqui. Mais do que um título, a finalização desse trabalho é a realização de um sonho para mim. E aprendi durante esse tempo todo que o importante mesmo não é o lugar em que me encontro agora, e sim toda a caminhada até aqui. Agradeço por isso, e sigo em frente para o que me aguarda no futuro. “Fui ontem quem hoje não sou mais. Porque a existência não se estanca, mas flui em remanso que preserva e substitui. O ser que fui se despede, cede lugar ao ser que posso ser, nele continuando em estado de memória.” (Pe. Fábio de Melo) RESUMO Candida albicans é o principal micro-organismo causador de infecções na cavidade bucal e já apresenta resistência aos principais antifúngicos utilizados para tratamento. Os peptídeos da família das Histatinas são moléculas promissoras para esse tratamento, devido a sua forte ação contra C. albicans. Histatina-5 (Hst5), um dos peptídeos dessa família, apresenta ação contra esse micro-organismo, mas sofre rápida degradação em saliva humana. Nesse trabalho foram propostas três novas sequências de peptídeos baseados na Hst5, denominados 8WH5, 7WH5 e 6WH5, e os peptídeos análogos 0WHst5, WP113. Além disso, foram desenvolvidos lipossomas produzidos pela técnica de hidratação do filme lipídico, com objetivo de proteger os peptídeos da degradação salivar. Os peptídeos 0WHst5 e WP113 apresentaram degradação após 1,5 horas em saliva humana. Já os peptídeos 8WH5, 7WH5 e 6WH5 foram encontrados na saliva após 8 horas de incubação. Todos os peptídeos apresentaram ação antifúngica, com destaque para o peptídeo 8WH5 que apresentou concentração inibitória mínima (CIM) de 20 µmol L-1 para C. albicans ATCC 90028. Os peptídeos foram eficazes em prevenir a formação de biofilme de C. albicans, mantendo seu crescimento abaixo de 20% em concentrações de 320 e 160 µmol L-1. Os lipossomas vazios apresentaram diâmetro hidrodinâmico médio de 80,0 nm e os lipossomas incorporados com os peptídeos apresentaram aumento nesse diâmetro com valores na faixa de 90,0 a 120,0 nm. O potencial zeta das formulações foi negativo, com valores de -11,6 mV para os lipossomas vazios e valores abaixo de -8,7 mV para os lipossomas incorporados com os peptídeos. O índice de polidispersão ficou entre 0,200 e 0,300 para todos os sistemas lipossomais. A eficiência de incorporação (IPD) foi maior de 90% para todos os peptídeos, indicando uma alta incorporação mesmo se tratando de moléculas hidrofílicas. Estudos de microscopia de força atômica (AFM) e de espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) indicaram que os peptídeos podem interagir eletrostaticamente com bicamada externa dos lipossomas. Os lipossomas foram mais eficazes do que os peptídeos livres para inibição de biofilmes maduros inibindo seu crescimento com concentração oito vezes menor do que os peptídeos livres. Dessa forma, é possível concluir que os peptídeos 8WH5, 7WH5 e 6WH5 são mais resistentes a degradação por proteases salivares e foram eficazes em prevenir a formação de biofilme. Já os sistemas lipossomais, apesar de apresentaram proteção reduzida contra degradação proteolítica dos peptídeos, foram eficazes em inibir biofilmes maduros. Dessa forma, os peptídeos e sistemas lipossomais produzidos nesse trabalho surgem como uma nova estratégia para prevenção de infecções causadas por C. albicans na cavidade bucal. Palavras chave: Candida albicans, peptídeos, saliva, lipossomas, biofilmes. ABSTRACT Candida albicans is the main microorganism that causes infections in the oral cavity and already shows resistance to most antifungals used for treatment. The peptides of the Histatin family are promising molecules for this treatment due to their strong action against C. albicans. Histatin-5 (Hst5), a peptide from the histatin family, has action against this microorganism, but it undergoes rapid degradation in human saliva. In this work, three new peptides based on Hst5 were proposed, called 8WH5, 7WH5 and 6WH5, and the analogous peptides 0WHst5, WP113. In addition, liposomes produced by the thin film hydration technique, were developed in order to protect the peptides from salivary degradation. The 0WHst5 and WP113 peptides showed degradation after 1.5 hours in human saliva. The peptides 8WH5, 7WH5 and 6WH5 were found in saliva after 8 hours of incubation. All peptides showed antifungal action, especially peptide 8WH5, which showed a minimum inhibitory concentration (MIC) of 20 µmol L-1 for C. albicans ATCC 90028. The peptides were effective in preventing C. albicans biofilm formation, maintaining its growth below 20% at concentrations of 320 and 160 µmol L-1. The empty liposomes showed a mean hydrodynamic diameter of 80.0 nm and the liposomes incorporated with the peptides showed an increase in this diameter with values in the range of 90.0 to 120.0 nm. The zeta potential of the formulations was negative, with values of -11.6 mV for empty liposomes and values below -8.7 mV for liposomes incorporated with peptides. The polydispersion index (PDI) was between 0.200 and 0.300 for all liposomal systems. The incorporation efficiency was greater than 90% for all peptides, indicating a high incorporation even in the case of hydrophilic molecules. Atomic force microscopy (AFM) and Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) studies indicated that peptides can interact electrostatically with the outer bilayer of liposomes. Liposomes were more effective than free peptides for inhibiting mature biofilms, inhibiting their growth at eight times lower concentration than free peptides. Thus, it is possible to conclude that peptides 8WH5, 7WH5 and 6WH5 are more resistant to degradation by salivary proteases and were effective in preventing biofilm formation. Liposomal systems, despite showing reduced protection against proteolytic degradation of peptides, were effective in inhibiting mature biofilms. Thus, the peptides and liposomal systems produced in this work emerge as a new strategy to prevent infections caused by C. albicans in the oral cavity. Key words: Candida albicans, peptides, saliva, liposomes, biofilms. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Representação das formas morfológicas do micro-organismo C. albicans. (A) representação esquemática e imagem de microscópio obtida com aumento de 100x em câmera de Neubauer da forma de levedura; (B) representação esquemática e imagem de microscópio obtida com aumento de 100x em câmera de Neubauer da forma de hifa. ................................................ 38 Figura 2. Esquema representativo das fases de formação de biofilme de C. albicans. ................ 41 Figura 3. Principais peptídeos da família das Histatinas com suas sequências de aminoácidos. Histatina-1, 3 e 5 são naturalmente encontrados na saliva humana e Histatina-1 apresenta um aminoácido serina fosfatado (Sp) em sua sequência. Os demais peptídeos são gerados por meio da clivagem proteolítica salivar de Histatina-1, 3 e 5. ....................................................................... 46 Figura 4. Mecanismo de ação da Histatina-5 em C. albicans. Histatina-5 permeia a membrana celular (A), é atraída para a mitocôndria (B), induz ao lançamento de ATP (C) e prejudica a respiração celular. A perda de ATP ativa um mecanismo de morte celular (D). O estresse oxidativo causado pela interação com as mitocôndrias gera espécies reativas de oxigênio (ERO´s) (G), que afetam o núcleo, a própria mitocôndria e parede celular. Além disso, Histatina-5 pode ser atraída para o núcleo (E) e impedir a fase G1 do ciclo celular (F). ........................................................... 47 Figura 5. Lipossomas podem ser classificadas como multilamelares (A) ou unilamelares (B). Os lipossomas unilamelares podem ser GUV´s, LUV´s ou SUV´s dependo de seu tamanho médio. 56 Figura 6. Representação esquemática de uma resina utilizada com a cadeia peptídica em crescimento. ................................................................................................................................... 61 Figura 7. Esquema das principais etapas empregadas durante a SPFS. O processo se inicia com a desproteção do grupo Fmoc do primeiro aminoácido já acoplado a resina (1). Após 20 minutos em solução de piperidina em 20% de DMF, o grupo Fmoc é removido (2). Após lavagem para remoção do excesso de solventes, o próximo aminoácido da sequência é solubilizado em HOBt e DIC e adicionado para acoplamento (3). Após 120 minutos, o acoplamento do próximo aminoácido é confirmado (4). O ciclo se reinicia com lavagem para remoção de excessos de solventes e reagentes, seguido de uma nova desproteção do grupo Fmoc do aminoácido recém acoplado. .................... 62 Figura 8. Perfil cromatográfico do peptídeo 0WHst5; (A) peptídeo bruto; (B) peptídeo puro. Espectro de massas (C) referente ao peptídeo 0WHst5 puro indicando a massa de 3222,5 g mol-1. ....................................................................................................................................................... 80 Figura 9. Perfil cromatográfico do peptídeo WP113; (A) peptídeo bruto; (B) peptídeo puro. Espectro de massas (C) referente ao peptídeo WP113 puro indicando a massa de 1751,51 g mol-1. ....................................................................................................................................................... 80 Figura 10. Perfil cromatográfico do peptídeo 8WH5; (A) peptídeo bruto; (B) peptídeo puro. Espectro de massas (C) referente ao peptídeo 8WH5 puro indicando a massa de 1267,44 g mol-1. ....................................................................................................................................................... 81 Figura 11. Perfil cromatográfico do peptídeo 7WH5; (A) peptídeo bruto; (B) peptídeo puro. Espectro de massas (C) referente ao peptídeo 7WH5 puro indicando a massa de 1110,59 g mol-1. ....................................................................................................................................................... 81 Figura 12. Perfil cromatográfico do peptídeo 6WH5; (A) peptídeo bruto; (B) peptídeo puro. Espectro de massas (C) referente ao peptídeo 6WH5 puro indicando a massa de 982,57 g mol-1.82 Figura 13. Curvas de Log UFC/mL ao longo do tempo, avaliados no ensaio de cinética de morte celular para a cepa CA10. O número de UFC/mL foi avaliado por um total de 12 horas ao incubar o fungo com os peptídeos em uma concentração de 80 µmol L-1. ................................................ 86 Figura 14. Efeito dos peptídeos 0WHst5, WP113, 8WH5, 7WH5 e 6WH5 na prevenção da formação de biofilme de CA10. As concentrações testadas foram 40, 80, 160 e 320 μmol L-1. .. 88 Figura 15. Efeito dos peptídeos 0WHst5, WP113, 8WH5, 7WH5 e 6WH5 quando incubados com um biofilme pré-formado (24 horas) de CA10. As concentrações que apresentaram inibição foram 320 e 640 μmol L-1, que estão representadas no gráfico. .............................................................. 91 Figura 16. Viabilidade de células OSCC medida pelo método de redução de resazurina após incubadas com diferentes concentrações dos peptídeos; (A) 0WHst5; (B) WP113; (C) 8WH5; (D) 7WH5; (E) 6WH5. O traço pontilhado nos gráficos indica 50% de viabilidade celular. .............. 93 Figura 17. Perfil de degradação em saliva humana dos peptídeos (A) 0WHst5; (B) WP113; (C) 8WH5; (D) 7WH5; (E) 6WH5. Amostras de 100 µL foram coletadas após determinados períodos de incubação e analisadas em gel catiônico (PAGE). A primeira coluna da esquerda (coluna 1) corresponde a banda do padrão de todos os peptídeos, as demais colunas de 2 a 9 mostram os diferentes períodos de incubação (t=0, 0,5, 1,5, 4, 6, 8, 24 e 48 horas). ....................................... 96 Figura 18. Sítios de clivagem proteolítica, utilizados por proteases salivares, para o peptídeo 0WHst5 e possíveis sítios de clivagem para os demais peptídeos sintetizados. O sinal de estrela indica todos os locais de clivagem primária e o círculo indica os locais de clivagem primária preferidos. ...................................................................................................................................... 98 Figura 19. Cromatogramas dos peptídeos puros analisados por cromatografia líquida de alta eficiência indicando os tempos de retenção para cada um deles; (A) 0WHst5; (B) WP113; (C) 8WH5; (D) 7WH5; (E) 6WH5. ................................................................................................... 100 Figura 20. Perfil de degradação, em saliva humana, para os peptídeos 0WHst5. Os cromatogramas estão identificados de acordo com o tempo de coleta de cada amostra. As setas indicam o tempo de retenção característico para o peptídeo 0WHst5 (15,35 minutos) indicando sua presença ou ausência na amostra. .................................................................................................................... 101 Figura 21. Perfil de degradação, em saliva humana, para o peptídeo WP113. Os cromatogramas estão identificados de acordo com o tempo de coleta de cada amostra. As setas indicam o tempo de retenção característico para o peptídeo WP113 (15,14 minutos) indicando sua presença ou ausência na amostra. ................................................................................................................................... 102 Figura 22. Perfil de degradação, em saliva humana, para o peptídeo 8WH5. Os cromatogramas estão identificados de acordo com o tempo de coleta de cada amostra. As setas indicam o tempo de retenção característico para o peptídeo 8WH5 (14,20 minutos) indicando sua presença ou ausência na amostra. ................................................................................................................................... 102 Figura 23. Perfil de degradação, em saliva humana, para o peptídeo 7WH5. Os cromatogramas estão identificados de acordo com o tempo de coleta de cada amostra. As setas indicam o tempo de retenção característico para o peptídeo 7WH5 (13,99 minutos) indicando sua presença ou ausência na amostra. ................................................................................................................................... 103 Figura 24. Perfil de degradação, em saliva humana, para o peptídeo 6WH5. Os cromatogramas estão identificados de acordo com o tempo de coleta de cada amostra. As setas indicam o tempo de retenção característico para o peptídeo 6WH5 (14,61 minutos) indicando sua presença ou ausência na amostra. ................................................................................................................................... 103 Figura 25. Imagens de AFM dos lipossomas vazios (F1). (A) micrografias dos lipossomas vazios; (B) perfil topográfico 3D gerado para a imagem. ....................................................................... 114 Figura 26. Imagens de AFM dos lipossomas incorporados com 0WHst5. (A) micrografias dos lipossomas contendo o peptídeo 0WHst5; (B) perfil topográfico 3D gerado para a imagem. .... 115 Figura 27. Imagens de AFM dos lipossomas incorporados com WP113. (A) micrografias dos lipossomas contendo o peptídeo WP113; (B) perfil topográfico 3D gerado para a imagem. ..... 116 Figura 28. Imagens de AFM dos lipossomas incorporados com 8WH5. (A) micrografias dos lipossomas contendo o peptídeo 8WH5; (B) perfil topográfico 3D gerado para a imagem. ...... 116 Figura 29. Imagens de AFM dos lipossomas incorporados com 7WH5. (A) micrografias dos lipossomas contendo o peptídeo 7WH5; (B) perfil topográfico 3D gerado para a imagem. ...... 117 Figura 30. Imagens de AFM dos lipossomas incorporados com 6WH5. (A) micrografias dos lipossomas contendo o peptídeo 6WH5; (B) perfil topográfico 3D gerado para a imagem. ...... 117 Figura 31. Esquema teórico representando a localização dos peptídeos nos lipossomas. Os sistemas lipossomais formulados incorporam o peptídeo de duas maneiras, uma parte está localizada no compartimento interno aquoso, por se tratar de uma molécula hidrofílica. Outra parte está localizada na bicamada externa, interagindo por meio de interações eletrostáticas ou ancorados na bicamada. ..................................................................................................................................... 119 Figura 32. Espectros de FTIR obtidos em pastilhas de KBr na região entre 4000 e 400 cm-1 para F1 e para os sistemas lipossomas contendo os peptídeos (A) 0WHst5 e (B) WP113. Os retângulos pontilhados indicam os modos vibracionais PO2- e C—O—C. ................................................... 121 Figura 33. Espectros de FTIR obtidos em pastilhas de KBr na região entre 4000 e 400 cm-1 para F1 e para os sistemas lipossomas contendo os peptídeos (A) 8WH5, (B) 7WH5. Os retângulos pontilhados indicam os modos vibracionais PO2- e C—O—C. .................................................. 122 Figura 34. Espectro de FTIR obtido em pastilhas de KBr na região entre 4000 e 400 cm-1 para F1 e para o sistema lipossomal incorporado com o peptídeo 6WH5. O retângulo pontilhado indica os modos vibracionais PO2- e C—O—C. ....................................................................................... 123 Figura 35. Representação da molécula de fosfatidilcolina (PC) utilizada na formulação dos lipossomas. Os grupos funcionais destacados nos círculos pontilhados foram os detectados nos espectros de FTIR. ....................................................................................................................... 124 Figura 36. Monitoramento do tamanho médio dos lipossomas não incorporados e incorporados com os peptídeos. O tamanho médio foi avaliado ao longo de 45 dias, com os sistemas sempre mantidos sob refrigeração em temperatura de 4 °C. .................................................................... 126 Figura 37. Monitoramento do IPD dos lipossomas não incorporados e incorporados com os peptídeos. O IPD foi avaliado ao longo de 45 dias, com os sistemas sempre mantidos sob refrigeração em temperatura de 4 °C. .......................................................................................... 127 Figura 38. Monitoramento do potencial zeta dos lipossomas não incorporados e incorporados com os peptídeos. O potencial zeta foi avaliado ao longo de 45 dias, com os sistemas sempre mantidos sob refrigeração em temperatura de 4 °C. ................................................................................... 128 Figura 39. Curva padrão para os peptídeos 0WHst5 (A) e WP113 (B). As medidas foram realizadas em triplicata utilizando as concentrações de 160, 80, 40, 30, 20, 15, 12,5 e 10 µmol L-1. Nos gráficos estão as médias ± desvio padrão para cada ponto. ...................................................................... 130 Figura 40. Curva padrão para os peptídeos 8WH5 (A) e 7WH5 (B). As medidas foram realizadas em triplicata utilizando as concentrações de 160, 80, 40, 30, 20, 15, 12,5 e 10 µmol L-1. Nos gráficos estão as médias ± desvio padrão para cada ponto. ...................................................................... 130 Figura 41. Curva padrão para os peptídeos 6WH5. As medidas foram realizadas em triplicata utilizando as concentrações de 160, 80, 40, 30, 20, 15, 12,5 e 10 µmol L-1. Nos gráficos estão as médias ± desvio padrão para cada ponto. .................................................................................... 131 Figura 42. Correlação entre Log UFC/mL ao longo do tempo, avaliados no ensaio de cinética de morte celular para a cepa de CA10. O número de UFC/mL foi avaliado por um total de 12 horas ao incubar o fungo com os peptídeos incorporados nos lipossomas. (A) Log UFC/mL em função do tempo para os lipossomas incorporados com os peptídeos; (B) Log UFC/mL em função do tempo para os peptídeos livres..................................................................................................... 134 Figura 43. Comparação entre o efeito dos lipossomas incorporados com os peptídeos 0WHst5, WP113, 8WH5, 7WH5 e 6WH5 e dos peptídeos livres na prevenção da formação de biofilme de CA10. As concentrações dos peptídeos incorporadas nos lipossomas foi 80 μmol L-1. E a concentração dos peptídeos utilizados para comparação foi de 80 μmol L-1. ............................. 137 Figura 44. Comparação entre o efeito dos lipossomas incorporados com os peptídeos 0WHst5, WP113, 8WH5, 7WH5 e 6WH5 e dos peptídeos livres quando incubados com um biofilme pré- formado (24 horas) de CA10. As concentrações dos peptídeos incorporadas nos lipossomas foi 80 μmol L-1. E a concentrações dos peptídeos livres utilizados para comparação foram de 320 e 640 μmol L-1. ...................................................................................................................................... 140 Figura 45. Perfil de degradação em saliva humana (SST) dos sistemas lipossomais (A) F1+0WHst5; (B) F1+WP113; (C) F1+8WH5; (D) F1+7WH5; (E) F1+6WH5. Amostras de 100 µL foram coletadas após determinados períodos de incubação e analisadas em gel catiônico (PAGE). A primeira coluna da esquerda (coluna 1) corresponde a banda do padrão de todos os peptídeos, as demais colunas de 2 a 9 mostram os diferentes períodos de incubação (t=0, 0,5, 1,5, 4, 6, 8, 24 e 48 horas). ..................................................................................................................................... 142 LISTAS DE TABELAS Tabela 1. Nome e sequência de aminoácidos para os peptídeos análogos e híbridos baseados na estrutura primária da Histatina-5. .................................................................................................. 51 Tabela 2. Sequência de aminoácidos dos peptídeos 0WHst5, WP113, 8WH5, 7WH5 e 6WH5. Comparação entre número de resíduos de aminoácidos, carga líquida em pH 7,0 e quantidade de resíduos de aminoácidos básicos que estão representados em verde. ........................................... 60 Tabela 3. Descrição das resinas utilizadas para a síntese de cada um dos peptídeos, juntamente com as massas utilizadas e a massa separada para incorporação do aminoácido triptofano. ........ 79 Tabela 4. Massas moleculares teóricas e obtidas após análise de espectroscopia de massas para os peptídeos sintetizados. ................................................................................................................... 83 Tabela 5. Descrição das características de cada cepa com as siglas utilizadas neste trabalho. .... 84 Tabela 6. Concentração inibitória mínima dos peptídeos sintetizados, determinada para diferentes cepas de C. albicans. Os valores de CIM estão representados em µmol L-1. ................................ 84 Tabela 7. Valores de porcentagem hemolítica obtida para os peptídeos 0WHst5, WP113, 8WH5, 7WH5 e 6WH5. As concentrações testadas foram de 160, 80, 40 e 20 µmol L-1. Os valores estão em porcentagem. ............................................................................................................................ 92 Tabela 8. Média e desvio padrão para a quantificação em porcentagem dos peptídeos 0WHst5, WP11, 8WH5, 7WH5 e 6WH5 remanescentes após coleta das alíquotas nos tempos 0, 0.5, 1.5, 4, 6, 8, 24 e 48 horas. As bandas foram analisadas e quantificadas utilizando software Image Lab 6.1 (Bio-Rad Inc.). ............................................................................................................................... 97 Tabela 9. Sequência de aminoácidos e massas moleculares para os fragmentos de 0WHst5 gerados após incubação por 48 horas em saliva humana, e analisados por LC-ESI-MS/MS................... 105 Tabela 10. Sequência de aminoácidos e massas moleculares para os fragmentos de WP113 gerados após incubação por 48 horas em saliva humana. ......................................................................... 106 Tabela 11. Sequência de aminoácidos e massas moleculares para os fragmentos de 8WH5 gerados após incubação por 48 horas em saliva humana. ......................................................................... 107 Tabela 12. Sequência de aminoácidos e massas moleculares para os fragmentos de 7WH5 gerados após incubação por 48 horas em saliva humana. ......................................................................... 108 Tabela 13. Sequência de aminoácidos e massas moleculares para os fragmentos de 7WH5 gerados após incubação por 48 horas em saliva humana. ......................................................................... 108 Tabela 14. Médias ± desvio padrão para os valores de tamanho médio, IPD e potencial zeta da formulação F1 não incorporada com os peptídeos sintetizados e incorporada com 80 µmol L-1 de cada um dos peptídeos sintetizados. ............................................................................................ 110 Tabela 16. Resumo das atribuições de banda, para os modos vibracionais dos grupamentos PO2- e C—O—C, presentes nos lipossomas liofilizados. Obs.: O erro da medida corresponde a  ± 2 cm-1. ............................................................................................................................................. 125 Tabela 17. Eficiência de incorporação (EI%), em porcentagem, para os lipossomas contendo os peptídeos 0WHst5, WP113, 8WH5, 7WH5 e 6WH5. ................................................................. 132 Tabela 18. Valores obtidos após quantificação em porcentagem dos peptídeos 0WHst5, WP11, 8WH5, 7WH5 e 6WH5 remanescentes incorporados em lipossomas após coleta das alíquotas nos tempos 0, 0.5, 1.5, 4, 6, 8, 24 e 48 horas. As bandas foram analisadas e quantificadas utilizando software Image Lab 6.1 (Bio-Rad Inc.). ...................................................................................... 143 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AMINOÁCIDOS: Ala (A) – Alanina Arg (R) – Arginina Asn (N) – Asparagina Asp (D) – Ácido Aspártico Cys (C) – Cisteína Gln (Q) – Glutamina Glu (E) – Ácido Glutâmico Gly (G) – Glicina His (H) – Histidina Ile (I) – Isoleucina Leu (L) – Leucina Lys (K) – Lisina Met (M) – Metionina Phe (F) – Fenilalanina Pro (P) – Prolina Ser (S) – Serina Thr (T) – Treonina Trp (W) – Triptofano Tyr (Y) – Tirosina Val (V) – Valina OUTRAS: 0WHst5 - 0WHistatina-5 DOTAP- 1,2-dioleoil-3-trimetilamônio-propano MTT - 2-brometo de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazólio DOPS - 2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfo-L-serina DPPC - 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfocolina Fmoc - 9-Fluorenilmetoxicarbonil BCA - ácido bicinconínico PLGA - ácido poli(lático-co-glicólico) ACN – acetonitrila SDA - ágar Sabouraud Dextrose BSA - albumina sérica bovina SAPs - aspartil-proteinases ATP –adenosina trifosfato Ca – cálcio SDB - sabouraud dextrose broth (caldo sabouraud dextrose) DSC - calorimetria diferencial de varredura Chol - colesterol CIM – concentração inibitória mínima CLSI - Clinical and Laboratory Standards Institute CLAE - cromatografia líquida de alta eficiência DCM – diclorometano DO - densidade ótica DIC – diisopropilcarbodiimida DCM - diclorometano DIEA – N-diisopropiletilamina DLS – dimanic ligth scaterring (espalhamento de luz dinâmico) DMEM - dulbecco's modified eagle medium DMF – dimetilformamida DMSO – dimetilsulfóxido DPPC – dipalmitoilfosfatidilcolina de soja EDT – 1,2-etanoditiol EI – eficiência de incorporação ERO´s – espécies reativas de oxigênio ESI-MS – electron spray ionization-mass spectrometry Fmoc-aa - Fmoc-aminoácido G1 – fase da interfase do ciclo celular, denominado de GAP1 H2O - água HBTU - hexafluorfosfato de 2-(1h-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-tetrametilurónio HCl – ácido clorídrico HPMC - hidroxipropilmetilcelulose Hst5 - Histatina-5 HIV - Human Immunodeficiency Virus (virus da imunodeficiência humana) HOBt – N-hidroxibenzotriazol HPLC - high performace liquid chromatography (cromatografia líquida de alta eficiência) IgA – imunoglobulina A FTIR - fourier transform infrared spectroscopy (infravermelho por transformada de Fourier) IPD – índice de polidispersão KDa – quilodalton LC-ESI-MS/MS - liquid chromatography coupled with electrospray ionization tandem mass spectrometry LL-37 – peptídeo derivado de catelicidina humana LUV – large unilamellar vesicle (vesículas unilamelares grandes) PC - L-α-fosfatidilcolina AFM – atomic force microscopy (microscopia de força atômica) TEM - transmission electron microscopy (microscopia eletrônica de transmissão) MEV - microscopia eletrônica de varredura MLV – multilamellar large vesicles (vesículas multilamelares grandes) MS/MS - tandem mass spectrometry NaCl – cloreto de sódio OSCC - oral squamous cell carcinoma PEG – polietilenoglicol AFPs - peptídeos antifúngicos POPG - 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfo-rac-1-glicerol PZ - potencial zeta SAXS - small angle x-ray scattering (espalhamento de raios X de baixo ângulo) SPFS - síntese de peptídeo em fase sólida SST - sobrenadante de saliva total SUV – small unilamellar vesicles (vesículas unilamelares pequenas) t-Bu - terc-butil TFA – ácido trifluoracético TFE – trifluoretanol TIS – triisopropilsilano Tm – temperatura de transição de fase FLU1 - transportadores de efluxo de poliamina Tris - tris(hidroximetil)aminometano UV-vis – espectroscopia na região do ultravioleta-visível GUV´s – giants unilamellar vesicles (vesículas unilamelares gigantes) Zn- Zinco SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................... 36 2 REVISÃO DA LITERATURA ........................................................................................... 38 2.1 Candida albicans: fatores de virulência e resistência ................................................. 38 2.2 Histatina 5 e seu papel como antifúngico .................................................................... 45 2.3 Nanotecnologia: estratégia para viabilização do uso da Histatina 5 ........................ 52 3 OBJETIVOS ......................................................................................................................... 58 4 MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................. 59 4.1 Peptídeos ........................................................................................................................ 59 4.1.1 Escolha dos peptídeos e planejamento das sequências peptídicas .......................... 59 4.1.2 Síntese e clivagem dos peptídeos ............................................................................ 60 4.1.3 Purificação e caracterização dos peptídeos sintetizados.......................................... 63 4.2 Micro-organismos e ensaios antifúngicos ................................................................... 63 4.2.1 Micro-organismos e condições de crescimento ....................................................... 63 4.2.2 Determinação da concentração inibitória mínima (CIM) ........................................ 64 4.2.3 Avaliação da atividade antifúngica: cinética de morte celular ................................ 64 4.2.4 Prevenção da formação de biofilme de C. albicans ................................................ 65 4.2.5 Avaliação da inibição de biofilmes pré-formados ................................................... 66 4.3 Ensaios de citotoxicidade .............................................................................................. 67 4.3.1 Avaliação da atividade hemolítica ........................................................................... 67 4.3.2 Avaliação da citotoxicidade celular ......................................................................... 67 4.4 Ensaios utilizando saliva humana ............................................................................... 68 4.4.1 Coleta de saliva ........................................................................................................ 68 4.4.2 Análise de proteína total e preparo das alíquotas .................................................... 69 4.4.3 Análise da degradação dos peptídeos livres em SST .............................................. 69 4.4.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) catiônica após ensaio de degradação 70 4.4.5 Cromatografia líquida de alta eficiência para análise das alíquotas após ensaio de degradação .............................................................................................................................. 70 4.4.6 Cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa de ionização por eletrospray em tandem (LC-ESI-MS/MS) ............................................................................. 71 4.5 Lipossomas .................................................................................................................... 72 4.5.1 Composição e preparo dos lipossomas .................................................................... 72 4.5.2 Caracterização dos lipossomas por espalhamento de luz dinâmico (DLS) e mobilidade eletroforética........................................................................................................ 73 4.5.3 Caracterização dos sistemas lipossomais por microscopia de força atômica (AFM) 73 4.5.4 Caracterização dos sistemas lipossomais por espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) ............................................................................................. 74 4.5.5 Estabilidade dos lipossomas .................................................................................... 74 4.5.6 Eficiência de incorporação dos peptídeos nos lipossomas ...................................... 74 4.6 Ensaios biológicos com os sistemas lipossomais produzidos ..................................... 75 4.6.1 Avaliação da atividade antifúngica: cinética de morte celular ................................ 75 4.6.2 Avaliação da prevenção da formação de biofilme de C. albicans........................... 76 4.6.3 Avaliação da inibição de biofilme pré-formados .................................................... 76 4.6.4 Avaliação da capacidade de proteção dos peptídeos pelos sistemas lipossomais ... 77 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................................... 79 5.1 Peptídeos ........................................................................................................................ 79 5.1.1 Síntese, clivagem e purificação dos peptídeos ........................................................ 79 5.1.2 Avaliação da atividade antifúngica: concentração inibitória mínima (CIM) .......... 83 5.1.3 Avaliação da atividade antifúngica: cinética de morte celular ................................ 86 5.1.4 Avaliação da prevenção contra formação de biofilmes de C. albicans ................... 88 5.1.5 Avaliação da inibição de biofilmes pré-formados ................................................... 90 5.1.6 Atividade hemolítica e citotoxicidade celular ......................................................... 92 5.1.7 Estudo da degradação dos peptídeos em saliva humana – análises de eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) catiônica................................................................................. 94 5.1.8 Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE).................................................... 99 5.1.9 Cromatografia líquida acoplada com espectrometria de massa de ionização por eletrospray em tandem (LC-ESI-MS/MS) ........................................................................... 104 5.2 Lipossomas .................................................................................................................. 110 5.2.1 Caracterização física dos lipossomas por DLS...................................................... 110 5.2.2 Microscopia de força atômica (AFM) ................................................................... 112 5.2.3 Espectroscopia de infravermelho por transformada de Fourier (FTIR) ................ 119 5.2.4 Estabilidade dos lipossomas .................................................................................. 125 5.2.5 Eficiência de incorporação dos peptídeos nos lipossomas .................................... 129 5.3 Ensaios biológicos utilizando os sistemas lipossomais ............................................. 133 5.3.1 Avaliação da atividade antifúngica: cinética de morte de celular ......................... 133 5.3.2 Avaliação da prevenção da formação de biofilme de C. albicans......................... 137 5.3.3 Avaliação da inibição de biofilmes pré-formados ................................................. 139 5.3.4 Estudo da degradação dos sistemas lipossomais em saliva humana ..................... 141 6 CONCLUSÃO .................................................................................................................... 145 REFERÊNCIAS ........................................................................................................................ 146 36 Introdução 1 Introdução Nos últimos dez anos houve um considerável aumento dos casos de doenças infecciosas com destaque para as causadas por fungos. O aumento de casos de infecções fúngicas está diretamente relacionado com o aumento de intervenções médicas como quimioterapia para tratamento de câncer, imunossupressão para realização de transplantes, infecções causadas pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), e mais recentemente, pelo vírus da COVID-19 (BERKOW; LOCKHART, 2017a; BONGOMIN et al., 2017; LOGAN; MARTIN-LOECHES; BICANIC, 2020). Tal fato permitiu o aparecimento de infecções prevalentes, dentre as quais os principais patógenos são Candida albicans, Cryptococcus neoformans e Aspergillus fumigatus. Dentre essas, aproximadamente 80% são causadas por espécies do gênero Candida ssp. (BERKOW; LOCKHART, 2017a; D’ENFERT et al., 2021; LOGAN; MARTIN-LOECHES; BICANIC, 2020; ROBBINS; WRIGHT; COWEN, 2016). Das várias espécies conhecidas de Candida ssp, seis delas predominam em isolados clínicos: Candida albicans, Candida tropicalis, Candida krusei, Candida glabrata, Candida parapsilosis e Candida auris. Dentre essas, C. albicans é responsável por quase metade dos casos infecciosos em todo o mundo, representando 47% deles (PFALLER et al., 2019). A alta de casos de infecções causadas por C. albicans está relacionado ao fato desse micro-organismo coexistir com a microbiota humana, colonizando pele, boca, trato gastrointestinal e geniturinário de forma comensal. Quando se torna infecciosa C. albicans pode causar candidíase orofaríngea, mucocutânea e vulvovaginal. Além de estomatite protética na cavidade oral, infecção atrelada ao uso de próteses dentárias parciais ou totais, além de causar infecções endodônticas por colonizar algumas regiões dentárias como o canal radicular. Por fim, C. albicans pode causar candidemia, infecção sistêmica generalizada que acomete sangue e órgãos, com alta taxa de mortalidade (D’ENFERT et al., 2021). Essa espécie já apresenta mecanismos de resistência a antifúngicos convencionais, como o fluconazol (SHAPIRO; ROBBINS; COWEN, 2011). Alguns desses mecanismos envolvem respostas celulares do fungo ao estresse oxidativo causado por alguns antifúngicos, além de alterações intrínsecas no alvo do fármaco que impedem ou limitam sua ação (LOPES; LIONAKIS, 2022). Além disso, C. albicans também é capaz de promover a degradação enzimática de alguns 37 Introdução agentes antifúngicos. Todos esses mecanismos adaptativos permitem que esse micro-organismo sobreviva mesmo durante o tratamento com antibióticos (LOPES; LIONAKIS, 2022). Por se tratar de uma célula eucariótica, semelhante a células humanas, existe certa dificuldade em se encontrar novas moléculas que apresentem seletividade para as células fúngicas e não causem danos as demais células do organismo. Uma alternativa é a utilização de peptídeos bioativos, como os peptídeos da família das Histatinas. Histatina-5 (Hst5) é o peptídeo com maior ação antifúngica da família das Histatinas e possui ampla ação contra fungos patogênicos, incluindo C. albicans e C. auris (HELMERHORST et al., 1997b; PATHIRANA et al., 2018). No entanto, Hst5 sofre extensa degradação por enzimas proteolíticas presentes na saliva humana (SUN et al., 2009). Alguns estudos também demostraram diferença entre a quantidade do peptídeo presente na secreção salivar coletada diretamente da glândula parótida e a encontrada na saliva presente na cavidade oral, após secreção. Dessa forma, estudos que reduzam ou modifiquem a sequência de aminoácidos do peptídeo Hst5 podem ser a chave para esclarecer as questões sobre sua degradação, assim como para a produção de moléculas resistentes a degradação proteolítica e com melhor atividade antifúngica. Por outro lado, o desenvolvimento de sistemas nanoestruturados que incorpore esse peptídeo também pode ser uma alternativa para proteção contra sua degradação. Estudos anteriores desse grupo de pesquisa demonstraram que a incorporação do peptídeo 0WHst5 em lipossomas controlou o crescimento de C. albicans por mais de 72 horas mantendo e até prolongando a ação desse peptídeo (ZAMBOM et al, 2019). Como forma de estudar o potencial antifúngico de outras sequências peptídicas derivadas da 0WHst5 e também proteger esses peptídeos da degradação o presente trabalho utilizou duas estratégias nanobiotecnológicas, sendo elas: (a) a síntese de peptídeo em fase sólida (SPFS); e (b) produção de um sistema lipossomal nanoestruturado. A SPFS pode proporcionar a obtenção de peptídeos para o estudo do processo de degradação da Hst5, além de produzir novas moléculas resistentes a degradação proteolítica salivar. Além disso, a incorporação desses peptídeos em lipossomas poderá garantir proteção contra degradação, além de permitir sua aplicação tópica na cavidade bucal. 38 Revisão da Literatura 2 Revisão da Literatura 2.1 Candida albicans: fatores de virulência e resistência C. albicans é um fungo polimórfico e diploide que pode alternar sua morfologia, podendo apresentar crescimento na forma de levedura ou hifa, conforme demonstrado na Figura 1. Figura 1. Representação das formas morfológicas do micro-organismo C. albicans. (A) representação esquemática e imagem de microscópio obtida com aumento de 100x em câmera de Neubauer da forma de levedura; (B) representação esquemática e imagem de microscópio obtida com aumento de 100x em câmera de Neubauer da forma de hifa. Fonte: elaborado pela autora (2022). 39 Revisão da Literatura C. albicans é um micro-organismo comensal e comum da microbiota humana, colonizando de forma assintomática a pele e os tratos gastrointestinal, respiratório e geniturinário (DADAR et al., 2018; VILA et al., 2020). O estado comensal de C. albicans é mantido devido a inter-relação de diversos fatores que garantem a homeostase do organismo humano. Entre esses fatores podem- se destacar a manutenção das barreiras epiteliais intactas, a resposta do sistema imune inato e a presença de micro-organismos coexistentes. Mas, situações em que esses fatores estão ausentes ou enfraquecidos, a proliferação de C. albicans é favorecida e esse fungo pode se tornar oportunista, causando desde infecções superficiais até infecções sistêmicas que podem levar o hospedeiro à morte (CALDERONE; CLANCY, 2012; VILA et al., 2020). Os fatores de risco para infecções superficiais ou sistêmicas causadas por Candida spp. podem ser divididas em três categorias: (I) fatores que promovem a colonização por Candida, como por exemplo, antibioticoterapia de amplo espectro; (II) fatores que causam imunossupressão, como transplante de órgãos, HIV, neutropenia, uso de quimioterápicos, idade, desnutrição; e (III) fatores que fornecem uma rota para a infecção por Candida, por exemplo, procedimentos cirúrgicos, nutrição parenteral, hemodiálise, ventilação mecânica e uso de cateteres (CANELA et al., 2018; PFALLER; DIEKEMA, 2007). Para que C. albicans colonize e permaneça em um hospedeiro, como comensal ou como patógeno, sua adesão a uma superfície mucosa é essencial. O primeiro passo para isso é superar a barreira mucosa que protege o epitélio do hospedeiro, promovendo uma interação física entre as células epiteliais e o fungo (GULATI; NOBILE, 2016; LEWIS; WILLIAMS, 2017a; NIKOU et al., 2019). Acredita-se que essa interação inicial seja efetuada pelo fungo em sua forma de levedura, mas estudos em modelos murinos mostraram que, tanto a morfologia de levedura quanto a de hifa, podem ser observadas no trato gastrointestinal durante a colonização comensal (NIKOU et al., 2019; WITCHLEY et al., 2019). As formas de levedura e hifas de C. albicans desenvolveram mecanismos para promover a adesão ao tecido epitelial, sendo as proteínas adesinas as mais importantes. As proteínas de sequência do tipo aglutinina (Als), como Als5p e Als3p permitem a adesão das células de levedura e hifa ao epitélio do hospedeiro, respectivamente (GAUR; SMITH; KLOTZ, 2002; MURCIANO et al., 2012). Essas proteínas estão ligadas aos β-1,6-glucanos presentes na parede celular do fungo e, juntamente com outras proteínas da família Als, são responsáveis por reconhecer e ligar-se a diferentes superfícies, desde tecidos epiteliais até superfícies abióticas, como dentaduras e dispositivos médicos (SILVA-DIAS et al., 2015). Além 40 Revisão da Literatura da importância para a adesão de C. albicans aos tecidos epiteliais do hospedeiro, essas proteínas também participam da adesão de outros micro-organismos às hifas de C. albicans, como outras espécies de Candida e Streptococcus oralis, podendo formar aglomerados de múltiplos micro- organismos (TATI et al., 2016; XU et al., 2017). Após a adesão de C. albicans ao epitélio do hospedeiro, é necessário que o micro-organismo seja internalizado pelas células; para isso, há dois mecanismos possíveis. O primeiro mecanismo, chamado de endocitose induzida, é iniciado pela interação entre proteínas fúngicas, como a invasina Ssa1p ou a adesina Als3p, e os complexos E-caderina ou EGFR/Her2 do hospedeiro. Essa ligação ativa um mecanismo dependente de clatrina que induz a remodelação do citoesqueleto de actina, produzindo pseudópodes responsáveis por puxar o fungo para dentro das células hospedeiras. (HÖFS; MOGAVERO; HUBE, 2016; MORENO-RUIZ et al., 2009; SWIDERGALL; FILLER, 2017). O segundo mecanismo, chamado de penetração ativa, é uma combinação da tensão mecânica causada pelo alongamento das hifas, a ação de enzimas hidrolíticas e peptídeos citolíticos secretados, que facilitam a extensão das hifas através ou entre as células epiteliais (ALLERT et al., 2018; WÄCHTLER et al., 2012). C. albicans é conhecida por secretar 255 tipos diferentes de enzimas que atuam diretamente como fatores de virulência. No entanto, duas classes de enzimas extracelulares apresentam um papel importante na adesão, invasão tecidual e aquisição de nutrientes pelo micro-organismo, que são as aspartil-proteinases (SAPs) e as fosfolipases (IBRAHIM et al., 1995; JABRA-RIZK et al., 2016; SORGO et al., 2013; SWIDERGALL; FILLER, 2017). As SAPs secretados por C. albicans possuem a capacidade de degradar várias proteínas do hospedeiro. Especialmente as Sap2p e Sap5p, estão relacionados à degradação da E-caderina e mucinas presentes no epitélio gastrointestinal, facilitando a penetração das hifas (COLINA et al., 1996; VILLAR et al., 2007). Estas proteinases também estão envolvidas na degradação de fatores de defesa do hospedeiro, como anticorpos e peptídeos antimicrobianos (LEWIS; WILLIAMS, 2017b). Um exemplo disso foi a observação in vitro da capacidade da enzima produzida por C. albicans Sap9p de inativar o peptídeo Histatina-5, em concentrações salivares (MEILLER et al., 2009). A proteína de superfície celular de C. albicans Msb2p também é responsável pela degradação de peptídeos antimicrobianos, como Histatina-5 e LL-37 (SWIDERGALL; ERNST; ERNST, 2013). Além disso, Moyes et al., (2016) identificaram um peptídeo citolítico secretado por C. albicans apenas na presença de células epiteliais. O gene de alongamento celular 1 específico da hifa de C. albicans codifica a proteína 41 Revisão da Literatura Ece1p, composta por 271 aminoácidos, que é clivada pela protease Kex2 em oito peptídeos secretores, sendo o peptídeo citolítico fúngico um desses peptídeos. Esse peptídeo foi denominado candidalisina e foi apontado pelos autores como a toxina peptídica citolítica fúngica mais importante no processo de infecção da mucosa por C. albicans (MOYES et al., 2016). A candidalisina apresenta a capacidade de permeabilizar as membranas das células epiteliais do hospedeiro, danificando-as através de um “mecanismo tipo tapete”, que leva a efluxos enzimáticos e iônicos, além de estimular a secreção de citocinas (MOYES et al., 2016). Um outro fator de virulência importante apresentado por C. albicans é a capacidade de formação de biofilmes. Biofilmes são comunidades microbianas associadas à uma superfície, que apresentam aumento da expressão de fatores de virulência e resistência a medicamentos. As fases de crescimento e maturação de um biofilme de C. albicans estão representados na Figura 2. Figura 2. Esquema representativo das fases de formação de biofilme de C. albicans. Fonte: elaborado pela autora (2022). Esse processo inicia-se com a adesão das células e uma superfície e termina com formação do biofilme maduro. Nesse estágio, há intensa produção de matriz extracelular que funciona como uma barreira protetora impedindo a ação de antibióticos e do sistema imune do hospedeiro. Alguns dos outros fatores de virulência dos biofilmes de C. albicans, são a secreção de adesinas, bombas de efluxo, alterações na resposta ao estresse e resistência à fagocitose quando comparada à forma planctônica do micro-organismo (JABRA-RIZK et al., 2016; KONG et al., 2016). Além dos fatores de resistência a medicamentos, a matriz extracelular produzida por biofilmes também é responsável 42 Revisão da Literatura por evitar que medicamentos antifúngicos penetrem no interior da comunidade microbiana formada, diminuindo a biodisponibilidade desses medicamentos. Biofilmes de C. albicans podem ser associados a superfícies abióticas como dispositivos médicos e cateteres, o que aumenta o risco de infecção para pacientes hospitalizados que necessitam de ventilação mecânica, por exemplo (HAMET et al., 2012). Em relação à cavidade oral, onde podem ser encontradas bactérias patogênicas, como Streptococcus spp., Staphylococcus aureus e Fusobacterium nucleatum (HIROTA et al., 2017), é possível observar a formação de biofilmes monomicrobianos (somente uma espécie de micro- organismo) e polimicrobianos (várias espécies de micro-organismos associadas) no epitélio oral ou em superfícies de próteses e aparelhos ortodônticos, por exemplo (JABRA-RIZK, 2011). A cárie dentária é a doença bucal mais comum e está associada à bactéria Streptococcus mutans. No entanto, evidências apontam que C. albicans também contribuem para a formação da cárie dentária, uma vez que S. mutans pode formar biofilmes polimicrobianos com C albicans, induzindo a formação de cárie. Essas duas espécies são capazes de produzir e tolerar espécies ácidas responsáveis por danificar o dente (HIROTA et al., 2017; KLEIN et al., 2015; ZERO et al., 2009). Alguns trabalhos também já exploraram a associação de C. albicans a outros micro- organismos, que é o caso de estudos in vitro conduzidos por Cavalcanti et al., (2016) que demonstrou um maior desenvolvimento de biofilme dentário por C. albicans quando S. oralis também estava presente. Xu et al., (2014) observaram a invasão facilitada de C. albicans em análogos de mucosa, língua e rim de camundongo quando associada a S. oralis, relacionada a um aumento na degradação da E-caderina pela calpaína; além disso, foi demonstrado que S. oralis induz a expressão de genes e proteínas que promovem sua adesão às hifas de C. albicans. Streptococcus gordonii também é capaz de formar biofilmes em associação com C. albicans, que conferem resistência ao tratamento antimicrobiano para ambos os micro-organismos (CHINNICI et al., 2019; MONTELONGO-JAUREGUI; LOPEZ-RIBOT, 2018). Diferente dos exemplos acima, a interação entre C. albicans e as espécies Pseudomonas aerugionosa e Fusobacterium nucleatum parece ser antagônica. Estudos envolvendo P. aerugionosa mostraram inibição do desenvolvimento de hifas de Candida por fatores de virulência de P. aerugionosa (HOGAN; KOLTER, 2002). A adesão entre C. albicans e F. nucleatum pode ocorrer, mas reduz a capacidade de ambos os micro-organismos de escaparem da fagocitose (BOR et al., 2016; WU et al., 2015). 43 Revisão da Literatura Esses dados mostram a importância das interações interespécies e do equilíbrio microbiano na manutenção de uma boa saúde bucal. A primeira linha do hospedeiro para defesa contra C. albicans são as células epiteliais orais que não só atuam como uma barreira física, mas também podem minimizar a aderência, por sofrerem descamação ao reconhecer as hifas de C. albicans (KRAGELUND, 2017; SULTAN et al., 2018). A saliva também representa um fator importante na prevenção da colonização e aderência de C. albicans, seja pela remoção mecânica das células de Candida ou pelos diversos peptídeos antimicrobianos em sua composição (NAGLIK et al., 2017; SULTAN et al., 2018). Os peptídeos mais destacados relacionados ao controle de Candida na cavidade oral são as histatinas, defensinas, catelicidina e lactoferrina (RICHARDSON et al., 2018). As histatinas são uma família de peptídeos catiônicos ricos no aminoácido histidina, pertencentes ao grupo das defensinas, que serão melhor descritos adiante. As defensinas são peptídeos ricos em cisteína produzidos por neutrófilos (α-defensinas) e células epiteliais (β- defensinas) (DIAMOND; RYAN, 2011). Existe apenas uma catelicidina humana conhecida, chamada LL-37, que impede a adesão de Candida por interação com componentes da parede celular do fungo e adicionalmente é capaz de induzir a produção de quimosinas (TSAI et al., 2011). Finalmente, a lactoferrina possui a capacidade de romper a membrana plasmática fúngica e alterar a disponibilidade de ferro dentro da célula (KIRKPATRICK et al., 1971; NIKAWA et al., 1993). Os linfócitos Th1 e Th17 compõe a imunidade adaptativa humana, e são sugeridos como responsáveis pela imunidade de longa duração a infecções da mucosa oral (HERNÁNDEZ- SANTOS et al., 2013; KRAGELUND, 2017; LIN et al., 2009). Esse fato está relacionado à maior incidência de infecções orais de C. albicans em pacientes imunodeficientes ou imunossuprimidos. Por exemplo, estudos relataram níveis mais altos de IgA específica de C. albicans em indivíduos HIV+, que também mostraram níveis mais baixos do peptídeo Histatina-5 e linfócitos Th17 (CASSONE; CAUDA, 2012; KHAN et al., 2013). Algumas estratégias terapêuticas para tratar infecções fúngicas envolvem o uso de algumas das classes de antifúngicos como azóis (fluconazol, cetoconal, clotrimazol), equinocandinas (caspofungina, micafungina) e polienos (nistatina e anfotericina B). O uso extensivo e frequente de antifúngicos, como tratamentos profiláticos ou terapêuticos de humanos e animais, levou ao desenvolvimento de cepas multirresistentes de fungos, sendo a resistência a azóis e equinocandinas a mais relatada (PARKER et al., 2014; REVIE et al., 2018; VINCENT et al., 2013). Enquanto as 44 Revisão da Literatura equinocandinas apresentam atividade fungicida contra a maioria das espécies de Candida, os azóis são fungistáticos, proporcionando a possibilidade de desenvolvimento de resistência adquirida (BONDARYK; KURZA̧TKOWSKI; STANISZEWSKA, 2013; PFALLER et al., 2015). A prevalência de resistência ao fluconazol em C. albicans é baixa, mas taxas mais altas são observadas para C. glabrata, com taxas de até 13%; e C. auris, que pode apresentar cerca de 93%; além da resistência inata observada para C. krusei (CLEVELAND et al., 2012; LOCKHART et al., 2017; PFALLER et al., 2008). Alguns dos mecanismos de resistência relatados envolvem substituições de aminoácidos nos alvos moleculares dos antifúngicos, como observado nas subunidades Fks da glucano sintase, alvo das equinocandinas (PARK et al., 2005); ou na enzima 14-alfa demetilase, alvo de azóis (SANGLARD et al., 1998; WARRILOW et al., 2010). A supra regulação metabólica e a superexpressão de genes também contribuem para os mecanismos de resistência: o aumento da síntese de quitina foi observado para espécies de Candida resistentes à equinocandinas; da mesma forma, a superexpressão do gene ERG11, que codifica a enzima 14-alfa demetilase, está associada a fungos resistentes a azóis, juntamente com outras mutações (BERKOW; LOCKHART, 2017b; SINGH-BABAK et al., 2012). Mutações no gene ERG3 resultando na perda da função da enzima esterol Δ5,6-desaturase levam a resistência cruzada a azóis e polienos, uma vez que a célula contorna a produção de esteróis metilados tóxicos e também acumula esteróis alternativos de membrana para substituir o ergosterol. (COWEN et al., 2015; MARTEL et al., 2010). Por fim, as bombas de efluxo são importantes para os mecanismos de resistência, pois não permitem que o fármaco se acumule no ambiente intracelular. Em espécies de Candida, três proteínas estão relacionadas à resistência ao fluconazol, as proteínas de resistência a medicamentos dependentes de ATP 1 e 2, e a força eletroquímica próton-motriz, Mdr1p (PAO; PAULSEN; SAIER, 1998; PRASAD; GOFFEAU, 2012; WIRSCHING; MICHEL; MORSCHHÄUSER, 2000). Levando em conta o desenvolvimento de mecanismos de resistência, o surgimento de espécies de Candida resistentes e a dificuldade de encontrar novos alvos terapêuticos para o desenvolvimento de novos antifúngicos (ROBBINS; CAPLAN; COWEN, 2017), os peptídeos antimicrobianos tornam-se aliados contra os obstáculos enfrentados. 45 Revisão da Literatura 2.2 Histatina 5 e seu papel como antifúngico Os peptídeos da família das Histatinas são o grupo de proteínas presente em maior quantidade na saliva humana. São peptídeos ricos no aminoácido histidina, secretados pelas glândulas parótidas e submandibulares e descritos pela primeira vez por Oppenheim et al., (1988). Esses peptídeos possuem elevada atividade antifúngica e antibacteriana contra diversas espécies de patógenos orais. São importantes para a manutenção da homeostase da cavidade bucal, pois auxiliam na cicatrização de feridas e na re-epitelização oral (BAEV et al., 2002; HELMERHORST et al., 2006). Histatina-1, Histatina-3 e Histatina-5 (Hst5) são os três principais peptídeos desta família presentes na saliva humana (OPPENHEIM et al., 1988), e apresentam suas sequências de aminoácidos demonstradas na Figura 3. Hst5 é produto da clivagem proteolítica de Histatina-3 e é o peptídeo com maior ação antifúngica da família das histatinas (Figura 3). Os demais peptídeos da família das Histatinas encontrados na saliva são gerados a partir dos peptídeos Histatina-1, 3 e 5 por meio de clivagem proteolítica (KHURSHID et al., 2016). 46 Revisão da Literatura Figura 3. Principais peptídeos da família das Histatinas com suas sequências de aminoácidos. Histatina-1, 3 e 5 são naturalmente encontrados na saliva humana e Histatina-1 apresenta um aminoácido serina fosfatado (Sp) em sua sequência. Os demais peptídeos são gerados por meio da clivagem proteolítica salivar de Histatina-1, 3 e 5. Fonte: adaptado de KHURSHID et al., 2016. Hst5 possui em média 3 KDa, sequência de 24 aminoácidos, carga positiva em pH fisiológico e com boa solubilidade em água. Além disso, assume estrutura em α-hélice em dimetilsulfóxido (DMSO) e em mistura de trifluoretanol (TFE) e água. Mas, em água pura assume estrutura desordenada (SEO et al., 2012). O peptídeo Hst5 apresenta ampla ação antifúngica contra fungos patogênicos, incluindo C. albicans (CAMPESE et al., 2009) e C. glabrata (KONOPKA et al., 2010). Estudos já demostraram que Hst5 é capaz de inibir o crescimento de cepas de C. albicans 47 Revisão da Literatura em concentrações de 25 a 800 μg mL-1 (MOFFA et al., 2015b), com concentração inibitória mínima (CIM) de 8-16 μg mL- 1 (HAN et al., 2016). Embora seu mecanismo de ação não seja totalmente compreendido até o momento, evidências indicam que o efluxo de ATP e o estresse oxidativo causados pela interação com as células mitocondriais levam o micro-organismo à morte (BAEV et al., 2002; HELMERHORST et al., 1999; PURI; EDGERTON, 2014), conforme esquema apresentado na Figura 4. Além disso, os alvos desse peptídeo são intracelulares e, ao contrário de outros peptídeos antimicrobianos, Hst5 não causa a formação de poros e ruptuda da membrana do micro-organismo. Hst5 é capaz de penetrar na célula de C. albicans através do receptor de membrana Ssa 1/2 e de glicanas, sendo seu mecanismo de internalização dependente de energia (PURI; EDGERTON, 2014). Este receptor de membrana presente nas células de C. albicans funciona como um alvo para sua ação e torna esse peptídeo seletivo e sem citotoxicidade para células humanas (PARK et al., 2017). Figura 4. Mecanismo de ação da Histatina-5 em C. albicans. Histatina-5 permeia a membrana celular (A), é atraída para a mitocôndria (B), induz ao lançamento de ATP (C) e prejudica a respiração celular. A perda de ATP ativa um mecanismo de morte celular (D). O estresse oxidativo causado pela interação com as mitocôndrias gera espécies reativas de oxigênio (ERO´s) (G), que afetam o núcleo, a própria mitocôndria e parede celular. Além disso, Histatina-5 pode ser atraída para o núcleo (E) e impedir a fase G1 do ciclo celular (F). Fonte: elaborado pela autora (2022). 48 Revisão da Literatura Um estudo recente conduzido por Basso et al., (2018) mostrou que o efluxo de ATP causado pela Hst5 é lento e prolongado e leva a uma morte celular mais lenta em comparação com o peptídeo RTD-1, usado para comparação neste estudo. Apesar disso, Pathirana et al., (2018) comprovou a eficácia desse peptídeo na inibição de sete cepas resistentes de C. auris. Hst5 inibiu de 55 a 90% das células de C. auris na concentração de 7,5 µM. Mas não é apenas contra fungos que esse peptídeo apresenta atividade antimicrobiana. Estudos demonstraram que Hst5 é capaz de inibir patógenos multirresistentes como Enterococcus faecium, Staphylococcus aureus, Klebsiella pneumoniae, Acinetobacter baumanni, Pseudomonas aeruginosa e espécies de Enterobacter. Apenas 30 µM de Hst5 foi suficiente para inibir cinco dos seis patógenos testados (DU et al., 2017). Diferenças no mecanismo de ação desse peptídeo também foram encontradas entre esses patógenos. Para E. faecium e E. cloacae, o peptídeo precisa ser internalizado de forma dependente de energia e para P. aeruginosa e A. baumanni, a rápida ação antibacteriana está relacionada com a formação de poros na membrana (DU et al., 2017). Este resultado comprova que este peptídeo possui ampla atividade antimicrobiana, com múltiplos mecanismos de ação. Em 2014, Puri e Edgerton propuseram que a atividade antifúngica da Hst5 também estaria relacionada à sua capacidade de se ligar a metais (PURI; EDGERTON, 2014). Eles descreveram duas regiões preferidas para que esta ligação ocorra. A região N-terminal possui um grupo ATCUN, na qual Cu (II) e Ni (II) podem ligar-se, e a região C-termina, que possui a sequência de aminoácidos para ligação com Zn (II) (MELINO et al., 2014). O estudo realizado por Conklin et al., (2017) demonstrou que a ligação com Cu (II) pode melhorar a ação antifúngica do peptídeo apresentando um IC50 abaixo de 5 µM. O mesmo estudo também mostrou que os primeiros 12 aminoácidos da sequência de Hst5 desempenham papel importante na ligação com Cu (II) (CONKLIN et al., 2017). Além disso, ligações com Fe (III) também já foram relatadas, e este metal foi capaz de induzir a formação de α-hélice, no entanto, isso não levou a um aumento da atividade antifúngica (PURI et al., 2015b). Embora este peptídeo mostre vários mecanismos de ação e várias opções para aumentar sua ação antifúngica, já foi detectada resistência de algumas cepas de C. albicans contra Hst5. Um exemplo disso está relacionado à clivagem proteolítica da Hst5 por proteases aspárticas, bem como a ligação com a proteína de membrana Msb2 que impede a internalização do peptídeo (MEILLER et al., 2009; PURI et al., 2015a; SZAFRANSKI-SCHNEIDER et al., 2012). Li et al., (2013) também demonstraram que transportadores de efluxo de poliamina, como FLU1, são capazes de 49 Revisão da Literatura causar o efluxo de Hst5 impedindo sua ação antifúngica. No entanto, esse estudo também observou que o aparecimento da mutação que leva FLU1 a promover o efluxo de Hst5 não é causado pela superexposição a esse peptídeo. Hampe et al., (2017) também observaram o mesmo ao investigar fatores de transcrição que regulam a expressão de FLU1. Embora a mutação em FLU1 não esteja associada à superexposição à Hst5, ela está associada à superexposição ao fluconazol. É interessante notar que a exposição excessiva a drogas convencionais promoveu não apenas resistência a esses tratamentos, mas também resistência a um mecanismo de defesa inato do hospedeiro, como o peptídeo Hst5. Como já mencionado anteriormente, o surgimento de cepas resistentes causa um grave problema de saúde pública, devido à existência de apenas quatro classes de medicamentos disponíveis para tratamento (azólicos, equinocandinas, polienos e flucitosina) (PERLIN; RAUTEMAA-RICHARDSON; ALASTRUEY-IZQUIERDO, 2017). Embora existam relatos de que algumas cepas de C. albicans são resistentes à Hst5, essa molécula ainda é atrativa para o tratamento clínico contra patógenos resistentes. A vantagem do uso de peptídeos antifúngicos é a possibilidade de modificar a sequência de aminoácidos de sua estrutura para criar análogos e híbridos. Essas modificações podem melhorar sua atividade antifúngica e também evitar os mecanismos de resistência criados pelos patógenos. O peptídeo Dh-5 foi um dos primeiros análogos da Hst5 a ser produzido. Sua cadeia de aminoácidos corresponde à sequência C-terminal da Hst5, conhecida por responsável pela ação antifúngica (resíduos 11-24) (HELMERHORST et al., 1997a). No entanto, este peptídeo não apresentou aumento em sua atividade e por esta razão foram produzidos os análogos dhvar1 e dhvar2. A sequência de aminoácidos desses peptídeos foi modificada para aumentar sua hidrofobicidade e para assumir uma estrutura em α-hélice. Essas modificações promoveram um aumento de seis vezes na atividade antifúngica por meio de um mecanismo de ação que causa formação de poros em membranas (DEN HERTOG et al., 2004; HELMERHORST et al., 1997a, 2001). Esse mecanismo de ação difere esses análogos do peptídeo original Hst5, que não possui ação membranolítica. Assim, essa característica hidrofóbica permite que esses análogos atuem contra outros patógenos, como Torulopsis glabrata, Prevotella intermedia, Streptococcus mutans e Staphylococcus aureus resistente à meticilina (FABER et al., 2003; HELMERHORST et al., 1997a). 50 Revisão da Literatura Além de modificar a sequência de aminoácidos, outra estratégia amplamente utilizada para melhorar as propriedades dos peptídeos é a fusão entre dois peptídeos diferentes. Lu et al., (2006) produziram os peptídeos quiméricos cCF10-dhvar4 e cOB1-dhvar4 que apresentaram LC50S de 1 µM, dez vezes maior que o peptídeo dhvar4 original. Outro exemplo disso seria a combinação de Hst5 e halocidina demonstrada por Han et al., (2016). Esta combinação produziu três peptídeos híbridos denominados di-PH2, di-WP2 e HHP1, que apresentaram CIM de 1-2 μg mL- 1, 2-4 μg mL-1 e 2-4 μg mL-1, respectivamente. O peptídeo híbrido di-WP2 não apresentou citotoxicidade e manteve sua ação mesmo em meio contendo 150 mM de NaCl. Resultados como este demonstram que a fusão de dois peptídeos diferentes resultou em uma melhora não só na atividade antifúngica da Hst5, mas também no ganho de outras funções proporcionadas pela união de duas moléculas diferentes. No entanto, não é apenas o aumento da ação antimicrobiana que a produção de peptídeos híbridos ou quiméricos pode proporcionar. Ao juntar dois fragmentos ou dois peptídeos diferentes, o resultado pode produzir uma nova molécula com efeito duplo ou efeito sinérgico. O peptídeo híbrido DR9-RR14, produzido por Basiri et al., (2017), uniu o fragmento ativo da Histatina-3 com o fragmento ativo do peptídeo estaterina resultando em uma molécula com potencial para prevenir a desmineralização dentária e com atividade antimicrobiana. Talvez a vantagem mais importante proporcionada pela produção de híbridos e análogos, seja evitar os mecanismos de resistência apresentados por C. albicans. Ikonomova et al., (2017) propuseram a substituição de duas lisinas (posições 11 e 17) por duas argininas na sequência da Hst5. Essa modificação aumentou a atividade antifúngica e proporcionou resistência à clivagem proteolítica causada por C. albicans. O mesmo resultado foi observado por Jephthah et al., (2017) ao produzir um peptídeo híbrido de Hst5 e espermidina. O Hst4-15-Spd apresentou aumento em sua atividade antifúngica, além da resistência às proteases aspárticas secretadas por C. albicans. Conforme descrito aqui, existem inúmeros análogos da Hst5 já produzidos e com eficácia comprovada na inibição de C. albicans. Os análogos aqui citados e sua sequência de aminoácidos podem ser vistos na Tabela 1. Os análogos produzidos apresentam características extremamente importantes para seu uso, como baixa concentração necessária para inibição e não apresentaram citotoxicidade. No entanto, eles ainda não são usados na terapia e existem poucos relatos de estudos in vivo. 51 Revisão da Literatura Tabela 1. Nome e sequência de aminoácidos para os peptídeos análogos e híbridos baseados na estrutura primária da Histatina-5. Nome Sequência Referência dh-5 KRKFHEKHHSHRGY Helmerhorst et al., (1997b) dhvar1 KRLFKELKFSLRKY dhvar2 KRLFKELLFSLRKY dhvar4 KRLFKKLLFSLRKY Lu et al., (2006) cCF10 LVTL