Campus de Botucatu PG-BGA ORIGEM DE AFERÊNCIAS MONOAMINÉRGICAS E CART- ÉRGICAS AO CIRCUITO ELEMENTAR DO REFLEXO AUDI- TIVO DE SOBRESSALTO ANDRÉ VALÉRIO DA SILVA Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Câmpus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de Concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior BOTUCATU – SP 2015 Campus de Botucatu PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Júlio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU ORIGEM DE AFERÊNCIAS MONOAMINÉRGICAS E CART- ÉRGICAS AO CIRCUITO ELEMENTAR DO REFLEXO AUDI- TIVO DE SOBRESSALTO ANDRÉ VALÉRIO DA SILVA Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Doutor no Programa de Pós- Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional. Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior BOTUCATU – SP 2015 ANDRÉ VALÉRIO DA SILVA ORIGEM DE AFERÊNCIAS MONOAMINÉRGICAS E CART-ÉRGICAS AO CIRCUI- TO ELEMENTAR DO REFLEXO AUDITIVO DE SOBRESSALTO Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutor no Pro- grama de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de Concentração Bio- logia Celular Estrutural e Funcional. Orientador: Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior Comissão examinadora: __________________________ Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências – UNESP/Botucatu __________________________ Profa. Dra. Luciana Pinato Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Filosofia e Ciências – UNESP/Marília __________________________ Prof. Dr. Luiz Fernando Takase Universidade Federal de São Carlos – UFSCAR/São Paulo __________________________ Prof. Dr. Cláudio Aparecido Casatti Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP/Araçatuba __________________________ Profa. Dra. Mirela Barros Dias Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Instituto de Biociências – UNESP/Botucatu Botucatu, 25 de março de 2015 Dedicatória À Deus ... Dedico este trabalho em primeiro lugar à Deus que em toda sua sabedoria, sendo o maior Anatomista e Neurocientista de todos, nos deu a vida e a capacidade mental para tentarmos compreender as maravilhas do sistema nervoso. Cada vez que obtenho conhecimento sobre os assuntos mais abstratos do cérebro mais tenho a reverenciar o grande Criador. À minha família ... Dedico este trabalho ao meu pai Gérçon Valério da Silva, ao meu irmão Ale- xandre Valério da Silva e a minha sogra Sônia Ap. Fuzetti Torres. Estes que tão pre- cocemente nos deixaram e que nos deixam imensa saudade. Estas palavras um dia não mais existirão, esta tese um dia será extinta, mas, a minha saudade e meu amor a vocês jamais se extinguirão até o dia em que poderei juntar-me a vocês no paraíso celeste. À minha mãe Terezinha Faquim Corrêa que lutou a vida toda para fazer de mim uma pessoa honesta e preparada para as advercidades do mundo e, ao meu pai de criação, Sebastião Corrêa que se tornou um grande pai e amigo acolhedor. À família Crivilin e a família Torres que me acolheram como um filho, obrigado pela força de todos vocês. À minha esposa ... Dedico este espaço para minha maravilhosa esposa e também maior incenti- vadora Kelly Regina Torres da Silva que está em minha vida dividindo as tristezas, alegrias, conquistas, derrotas e cada vez mais revela o quanto é a mais capaz de todas as esposas, eu não poderia ter encontrado melhor pessoa para dividir a jorna- da da vida. Agradecimentos Agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada do Instituto de Biociências de Botucatu (IBB) da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP) cujo coordenador é o Professor Titular Marcos Roberto de Mattos Fontes. Agradeço ao meu Orientador Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior, por ser um grande Mestre e ensinar seus conhecimentos científicos e Ana- tômicos com muita ética, qualidade e responsabilidade. Foi imensa a honra de poder ser seu primeiro aluno de doutorado e tenho a certeza que ao longo da vida ainda aprenderei muito dos seus ensinamentos. Agradeço ao Prof. Titular Dr. Jackson Cioni Bittencourt do Departamento de Anatomia da Universidade de São Paulo (USP/SP) e ao Prof. Dr. Cláudio Aparecido Casatti do Departamento de Ciências Básicas da Universidade Estadual Paulista câmpus de Araçatuba (UNESP) por auxiliarem este trabalho concedendo alguns dos anticorpos utilizados e as barras auriculares. Agradeço aos professores de Anatomia do Departamento de Anatomia do Ins- tituto de Biociências de Botucatu, em especial aos professores doutores Patrícia Fernanda Felipe Pinheiro, Francisco Eduardo Martinez, Raquel Fantin Domeniconi, Renato Ferretti, Luiz Gustavo de Almeida Chuffa, Camila Contin Diniz de Almeida Francia, Luis Francia e os técnicos Luciano Alves da Cunha e Paulo Sérgio da Silva por terem me dado a honra de aprender, estudar, ensinar e ser ensinado por vocês em todos os momentos de aulas práticas em Anatomia. Obrigado pela oportunidade de dividir com vocês todos estes momentos incluindo os momentos de descontração que foram os melhores que já tive. Gostaria de agradecer aos funcionários do Centro de Microscopia Eletrônica do Instituto de Biociências de Botucatu em especial a assesora administrativa Lígia Barbosa Costa por sempre me receber bem e com muita paciência e a assistente de suporte acadêmico Shelly Favorito de Carvalho que sempre se empenhou ao máxi- mo para me ajudar com as análises no microscópio confocal. Agradeço ao Prof. Titular Carlos Roberto Padovani do Departamento de Bioe- statístista do Instituto de Biociências de Botucatu e ao seu aluno de pós-graduação, Prof. Sérgio Augusto Rodrigues da Faculdade de Tecnologia (FATEC) do Estado de São Paulo – Campus de Botucatu, pelo auxílio prestado nas análises estatísticas. Agradeço a excelente equipe de pesquisa do laboratório de Neuromorfologia do Prof. Dr. José de Anchieta de Castro e Horta Júnior que sempre proporcionou discussões científicas, filosóficas e agradavéis momentos de descontração. Em es- pecial agradeço a Nicole Orsi Barioni, Rian Stenico Beduschi e Micheli Ferreira que proporcionaram uma amizade rica em valores e uma preciosa ajuda para o desen- volvimento deste projeto científico. Agradeço a direção do Câmpus de Três Lagoas (CPTL) da Universidade Fe- deral de Mato Grosso do Sul (UFMS) por me dar apoio para a finalização deste tra- balho e aos meu novos colegas de trabalho Adalberto, Juliano, Nelson, Julie, Alex, Danielle, Odanir, Helder e Mônica, pelo apoio e companheirismo. Agradeço ao meu grande amigo e padrinho religioso Carlos Alexandre Haemmerle que mesmo distante sempre me dá apoio, uma palavra amiga e espiri- tual. Agradeço a todos brasileiros que pagam seus impostos no qual é revertido em recursos para o financimento de pesquisas e bolsas de pós-graduação por agências de fomento como a Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP (2008/02771-6) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) que me financiou três anos de bolsa de Doutorado. Epígrafe “Sou daqueles que acreditam que as questões relativas ao corpo devem ser de- monstradas, antes, de maneira teológica, pois que nada existe fora de Deus. Meu ofí- cio, o da anatomia, consiste em decifrar a obra do todo poderoso e, desse modo, ado- rá-lo. Vós, teólogos esclarecidos, sabeis que não só pela fé, mas também pela razão. Nem uma só palavra dentre as que haveis li- do em minha obra tem outra razão que não a fé. Quero dizer-vos com isto que as sagra- das escrituras não são mero papel impresso; cada vez que me é dado examinar um corpo, vejo nele a obra do altíssimo e em cada áti- mo daquele corpo posso ler a sagrada pala- vra, em minh’alma.” Frederico Andahazi “O Anatomista” Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….8 Sumário RESUMO……………………………………………………………………………………………………….. 9 ABSTRACT…………………………………………………………………………………………………….. 10 LISTA DE ABREVIATURAS…………………………………………………………………………………. 11 LISTA DE FIGURAS, QUADRO E TABELAS…………………………………………………………….. 15 1 INTRODUÇÃO……………………………………………………………………………………………….. 17 1.1 Monoaminas neuroativas……………………………………………………………………………………………………………………… 17 1.1.1 Os grupos noradrenérgicos……………………………………………………………………………………………………………. 17 1.1.2 Os núcleos serotoninérgicos……………………………………………………………………………………………………..…… 18 1.2 O Transcrito Regulado pela Cocaína e Anfetamina (CART)……………………………………………………………………. 22 1.3 O reflexo auditivo de sobressalto…………………………………………………………………………………………………………. 23 1.4 Os neurônios da raiz coclear e o núcleo reticular caudal da ponte……………………………………………………….. 27 2 OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………….. 32 3 MATERIAL E MÉTODOS………………………………………………………………………………….. 32 3.1 Estratégia experimental……………………………………………………………………………………………………………………….. 32 3.2 Animais de experimentação…………………………………………………………………………………………………………………. 32 3.3 Procedimentos experimentais………………………………………………………………………………………………………………. 33 3.3.1 Experimento tipo 1 - Mapeamento das aferências aos CRN e ao PnC com especial ênfase a núcleos noradrenérgicos, serotoninérgicos e CART-érgicos…………………………………………………………………………………. 33 3.3.2 Procedimentos histológicos e imuno-histoquímica para FG…………………………………………………………… 35 3.3.3 Experimento tipo 2 - Controle anterógrado das aferências identificadas ao circuito elementar do RAS: área noradrenérgica A5, núcleo dorsal da rafe e conexões recíprocas com o PnC………………………….. 37 3.3.4 Identificação neuroquímica dos terminais na raiz coclear e núcleo reticular caudal da ponte: imuno- histoquímica para dopamina-β-hidroxilase, transcrito regulado pela cocaína e anfetamina e serotonina..38 3.3.5 Estudo comportamental da avaliação do reflexo auditivo de sobressalto e inibiação por estímulo prévio após lesão seletiva na área noradrenérgica A5…………………………………………………………………………….. 38 3.3.6 Confirmação da funcionalidade da via auditiva nos animais submetidos a cirurgia estereotáxica para lesão do A5 e provas comportamentais de avaliação do RAS e PPI…………………………………………………………. 43 3.4 Análise das preparações histológicas e documentação fotográfica……………………………………………………….. 44 4 RESULTADOS………………………………………………………………………………………………. 46 4.1 Distribuição de terminais axonais noradrenérgicos serotoninérgicos e CART-érgicos, na raiz coclear e núcleo reticular caudal da ponte………………………………………………………………………………………………………………… 46 4.2 Mapeamento retrógrado das aferências a raiz coclear…………………………………………………………………………. 50 4.3 Conexões da área noradrenérgica A5 com os CRN………………………………………………………………………………… 53 4.4 Conexões do núcleo dorsal da rafe com os CRN……………………………………………………………………………………. 66 4.5 Conexões da área noradrenérgica A5 e do núcleo dorsal da rafe com o PnC…………………………………………. 71 4.6 Conexões recíprocas entre área noradrenérgica A5 o núcleo dorsal da rafe e o PnC…………………………….. 72 4.7 Neuroquímica das eferências do A5 aos CRN, PnC e ao DR…………………………………………………………………… 77 4.8 Neuroquímica das eferências do núcleo dorsal da rafe aos CRN, ao PnC e ao A5…………………………………. 83 4.9 Avaliação comportamental do RAS e da PPI após lesão na área noradrenérgica A5……………………………… 84 5 DISCUSSÃO………………………………………………………………………………………………… 92 5.1 Considerações Metodológicas……………………………………………………………………………………………………………… 92 5.2 Considerações Neuroanatômicas e Funcionais…………………………………………………………………………………….. 94 6 CONCLUSÕES…………………………………………………………………………………………….. 102 7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS…………………………………………………………………….. 103 8 APÊNDICES………………………………………………………………………………………………... 119 APÊNDICE A - Protocolo padrão de imuno-histoquímica 119 APÊNDICE B - Regiões onde foram encontrados neurônios imunorreativos ao FG após injeção no A5……… 122 APÊNDICE C: Regiões onde foram encontrados fibras imunorreativas ao BDA após injeção no A5…………… 125 APÊNDICE D: Resultado do Teste de normalidade e Teste t não paramétrico para os dados de densidade neuronal…………………………………………………………………………………………………………………………………………………… 130 APÊNDICE E: Casos experimentais de lesão no A5……………………………………………………………………………………. 131 Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….9 RESUMO Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito elementar do reflexo auditivo de sobressalto. Tese (Doutorado) – Instituto de Biociências de Botucatu, Unversida- de Estadual Paulista, Botucatu, 2015. O reflexo auditivo de sobressalto (RAS) é uma reação motora rápida e evidente frente a um estímulo acústico intenso e inesperado. Trata-se de um reflexo acústico-motor do tronco encefálico que está presente em muitas espécies de mamíferos, incluindo o homem. Possui caráter tanto defensivo frente a uma possível agressão quanto de alerta frente a aconteci- mentos não esperados. Além do RAS resultar em uma resposta sobre a musculatura esque- lética, possui ação sobre o sistema nervoso autônomo promovendo aumento da pressão arterial e da freqüência cardíaca. No rato o circuito neural elementar do RAS é constituído por: neurônios do gânglio espiral, neurônios da raiz coclear (CRN), neurônios reticuloespi- nais do núcleo reticular caudal da ponte (PnC) e motoneurônios da medula espinal. O RAS pode ser modulado pela habituação, sensibilização, inibição por estímulo prévio (PPI) e pela potenciação por um estímulo adverso. Estas modulações podem ocorrer mediante a influên- cia de diversas substâncias neuroativas sobre os componentes deste circuito. Neste traba- lho avaliamos a origem de aferências monoaminérgicas (serotonina e noradrenalina) e CART-érgicas para os CRN e PnC. Para isso foram utilizados 54 ratos Wistar, adultos fê- meas, que foram submetidos a injeções de traçadores neuronais anterógrados e retrógrados para mapeamento de vias nervosas e a identificação imuno-histoquímica de substâncias neuroativas. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais do Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP (protocolo no 17/08). Nos- sos resultados demonstram que o grupamento noradrenérgico A5 é uma fonte de aferências noradrenérgicas e CART-érgicas para os CRN e PnC, enquanto que o núcleo dorsal da rafe (DR) é a origem de aferências serotoninérgicas para estas regiões. Existem conexões recí- procas entre o DR, o A5 e o PnC. Além disso, verificamos que após 14 e 21 dias da lesão no A5 houve aumento da porcentagem da PPI nos intervalos de 100 e 150 milisegundos sem modificação no RAS. Nossos resultados sugerem que o A5 atua de forma direta sobre o circuito elementar do RAS como verificado pelas suas conexões e pela modulação da PPI. As conexões do A5 e do DR trazem novas perspecitvas na modulação do RAS e da PPI pela noradrenalina, serotonina e CART. Palavras-Chave: serotonina, noradrenalina, CART, Reflexo Auditivo De Sobressalto, traça- dores neuronais. Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….10 ABSTRACT Source of monoaminergic and CART-ergic afferents to the elementary circuitry of the acous- tic startle reflex. Thesis (PhD) – Biosciences Institute, São Paulo State University, Botucatu, 2015. The acoustic startle reflex (ASR) is a rapid motor reaction elicited by a sudden intense acoustic stimulus. This is an acoustic-motor reflex of brainstem conserved across mammal’s species including man. Moreover the ASR is defensive behavior against both possible ag- gressive and alert to unexpected events. The ASR evokes responses of skeletal muscles as well as of autonomic nervous system with elevation of blood pressure and acceleration of the heart rate. In the rat, the elementary neural circuitry of ASR is mediated by ganglion cells of the organ of Corti, the cochlear root neurons (CRN), the pontine caudal reticular nucleus (PnC) and motoneurons of the spinal cord. The ASR could be modulated by habituation, sensitization, prepulse inhibition (PPI), and fear potentiation. These modulations were medi- ated by the influence of neuroactive substances on components of neuronal circuitry of ASR. In this work we evaluate the origin of monoaminergic (serotonin and noradrenaline) and CART-ergic afferents to CRN and PnC. Adult Female Wistar rats (n=54) were submitted to injections of retrograde and anterograde neuronal tracers in track-tracing experiments and identification of neuroactive substances in brain by immunohistochemistry technique. All ex- perimental protocols are according with Ethics Committee on Animal Use (protocol: 17/08). Our results demonstrate that noradrenergic area A5 (A5) is a source of noradrenergic and CART-ergic afferents to CRN and PnC, and dorsal raphe nucleus (DR) is origin of seroto- ninergic afferents to these regions. There are reciprocal connections between DR, A5 and PnC. Furthermore, after 14 and 21 days of lesion in A5, the percentage of PPI increased during intervals of 100 and 150 milliseconds without modification of ASR. This data suggest that A5 have direct action on elementary circuit of ASR evidenced his connections and modulation of PPI. Moreover, A5 and DR connections bring new insights about modulation of ASR and PPI by noradrenaline, serotonin and CART. Keywords: serotonin, noradrenaline, CART, acoustic startle reflex, neuronal tracer. Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….11 LISTA DE ABREVIATURAS µl - microlitro 3N – núcleo oculomotor 3PC – parte parvocelular do nervo oculomotor 4N – núcleo troclear 4V - quarto ventrículo 5-HT – serotonina/ 5-hidroxitriptamina 5HTT – transportador vesicular de serotonina 5TT – núcleo motor trigeminal, parte tensor do tímpano 6-OHDA – 6-hidroxidopamina 7L – núcleo facial, subnúcleo lateral 7n – nervo facial 7N – núcleo facial 8cn – raiz coclear do nervo vestibulococlear A2 – grupo noradrenérgico A2 A5 - grupo noradrenérgico A5 ACTH - hormônio adrenocorticotrófico AP – antero-posterior Aq - aqueduto BDA - dextrano amina biotinilada Bo- complexo Botzinger C1 – células catecolaminérgicas 1 CALB - calbindina CART - Transcrito regulado pela cocaína e anfetamina CC – canal central CeM - núcleo central da amigdala CI – colículo inferior cic – comissura do colículo inferior CIC - núcleo central do colículo inferior Cli - núcleo caudal linear da rafe cos – complexo olivar superior CRF - fator liberador de corticotrofina CRN - neurônios da raiz coclear DAB – 3’-3’-diamino benzidina dB - decibel DBH - dopamina-β-hidroxilase DCIC – córtex dorsal do colículo inferior DCN – núcleo coclear dorsal DLPAG - porção dorsolateral da área cinzenta periaquedutal DMPAG - porção dorsomedial da área cinzen- ta periaquedutal DMTg - área tegmental dorsomedial DR - núcleo dorsal da rafe DRD – nucleo dorsal da rafe, parte dorsal DRL - núcleo dorsal da rafe, parte lateral DRV - núcleo dorsal da rafe, parte ventral DV- dorso-ventral ECIC – cortex externo do colículo inferior EVe – núcleo de origem dos eferentes do ner- vo vestibular EW – núcleo de Edinger - Westphal FG - Fluoro-Gold FG-ir – fluoro-gold imunorreativa GABA - ácido-γ-amino butírico Gi - núcleo reticular gigantocelular GiA – núcleo gigantocelular parte alfa HRP - peroxidase da raiz forte I.A. – interauricular ICV – intracerebroventricular IO – complexo olivar inferior IRt – núcleo reticular intermédio ISI - intervalos interestímulo KF- núcleo Killiker-Fuse kHz – quilohertz LC - núcleo locus coeruleus LDTg - núcleo tegmental laterodorsal LHAp - área hipotalâmica lateral parte posterior LHAt - área hipotalâmica lateral parte tuberal LPAG – porção lateral da área cinzenta peria- quedutal LPBCr - núcleo parabraquial lateral, parte crescente LPBD - núcleo parabraquial lateral, parte dor- sal LPBE - núcleo parabraquial lateral, parte ex- terna LPBV - núcleo parabraquial lateral, parte ven- tral LPGi – núcleo paragigantocelular lateral LPGiE - núcleo paragigantocelular lateral, parte externa LRt – núcleo reticular lateral LSO – núcleo lateral superior da oliva LVPO – núcleo periolivar lateroventral MdD – núcleo reticular medular, parte dorsal MdV – núcleo reticular medular, parte ventral ME – medula espinal ML – médio-lateral mlf - fascículo longitudinal medial MnR – núcleo mediano da rafe MNTB – núcleo medial do corpo trapeóide Mot7- núcleo motor do nervo facial MPB – núcleo parabraquial medial MPBE - núcleo parabraquial medial, parte externa ms - milisegundos MVPO – núcleo periolivar medioventral NaCl – cloreto de sódio NPY – neuropeptídeo Y NTS – núcleo do trato solitário oc- trato olivocerebelar ocb – feixe olivococlear P5 – núcleo principal do nervo trigêmio P7 – núcleo principal motor do facial Pa – núcleo paraventricular do hipotálamo PAG – área cinzenta periaquedutal PB – núcleos parabraquiais PCRt – núcleo reticular parvocelular PDR - núcleo dorsal da rafe posterodorsal PHAL - lectina da planta Phaseolus Vulgaris leucoagglutinin Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….12 Pn – núcleo pontino PnC - núcleo reticular caudal da ponte PnO – núcleo reticular pontino oral PnR – núcleo pontino da rafe PPI - inibição por estímulo prévio PPtg - núcleo tegmental pedunculopontino Pr5VL – núcleo principal do trigêmeo, parte ventrolateral py – trato piramidal pyx- decussação piramidal RAS – reflexo auditivo de sobressalto RC – raiz coclear RIP - núcleo interpósito da rafe RMg - núcleo magno da rafe Rob- núcleo obscuro da rafe RPa – núcleo pálido da rafe rs – trato rubroespinal RtTG – núcleo reticulotegmental da ponte RVL – núcleo rostroventrolateral s5 – raiz sensorial do nervo trigêmeo SC - colículo superior scp – pedúnculo cerebelar superior SNA – sistema nervoso autônomo SolC – núcleo do trato solitário, parte comissu- ral SolM – núcleo do trato solitário, parte medial sp5 - trato espinal do trigêmeo Sp5I – núcleo espinal do trigêmeo, parte inter- polar SPO - núcleo paraolivar superior Su3 –supraoculomotor periaqueductal Su3C – núcleo supraoculomotor Su5 - núcleo supratrigeminal SubC - núcleo subcerúleo SuVe - núcleo vestibular superior TH - tirosina hidroxilase TPH1 - triptofano hidroxilase 1 TPH2 - triptofano hidroxilase 2 tz – corpo trapezoide VCA – núcleo coclear ventral anterior VCN – núcleo coclear ventral VCP – núcleo coclear ventral posterior VGat - transportador vesicular de GABA e glicina VGlut1 - transportador vesicular de glutamato VLL - núcleo ventral do lemnisco lateral VLPAG – porção ventrolateral da área cinzen- ta periaquedutal VNTB - núcleo ventral do corpo trapezóide vsc- trato spinocerebelar ventral WGA-HRP – aglutinina do germe de trigo con- jugado com a peroxidase do rábano silvestre ZI – zona incerta μA – microampere μm – micrômetro Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….13 Bulbo de camundongo ao nível da oliva inferior, método de Golgi – Rafael Lorent de Nó Terminais nervosos ao redor de neurônios do núcleo coclear, impregnação de prata – Santigo Ramón y Cajal Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….14 De Humani Corporis Fabrica (Gravura 67) – Andreas Vesalius Leonardo Da Vinci Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….15 LISTA DE FIGURAS, QUADRO E TABELAS Figura 1 Esquema do circuito neural elementar responsável pelo reflexo auditivo de sobressalto. ……………………………………………………………………………………………………………….. 26 Figura 2 Nervo vestibulococlear e Raiz coclear. ……………………………………………………………28 Figura 3 Raiz coclear do nervo vestíbulo-coclear e os neurônios da raiz coclear (CRN). …………… 28 Figura 4 Esquema das eferências dos CRN. ……………………………………………………….……… 29 Figura 5 Comparação entre as barras auriculares para ratos e para gatos. …………………………… 40 Figura 6 Desenho experimental dos experimentos de lesão do A5 e avaliação comportamental do RAS e PPI………………………………………………………………………………………………..…. 41 Figura 7 Foto do sistema de avaliação do sobressalto. ………………………………………...………… 41 Quadro 1 Caracteríticas do pré-pulo, pulso e intervalo entre os estímulos em cada um dos blocos da sessão de avaliação comportamental do RAS e da PPI…………………………….......................... 42 Figura 8 Distribuição de terminais axonais noradrenérgicos na raiz coclear e núcleo reticular caudal da ponte. ……………………………………………………………………………………………………. 47 Figura 9 Distribuição de terminais axonais serotoninérgicos na raiz coclear e núcleo reticular caudal da ponte. …………………………………………………………………………………………………… 48 Figura 10 Distribuição de terminais axonais CART-érgicos na raiz coclear e núcleo reticular caudal da ponte. ………………………………………………………………………………………………………. 49 Figura 11 Locais de injeção de FG na raiz coclear dos casos N13, N15, N17 e N18. …………..……. 51 Figura 12 Locais de injeção de FG na raiz coclear dos casos N20, N25, N30 e N32. ……………..... 52 Figura 13 Aferências a Raiz Coclear provenientes da área do grupo noradrenérgico A5…………..… 55 Figura 14 Esquemas de cortes coronais do troncoencefálico, na região do grupamento noradrenérgico A5, do caso experimental N13…………………………………………………..…….. 56 Figura 15 Esquemas de cortes coronais do troncoencefálico, na região do grupamento noradrenérgico A5, do caso experimental N18……………………………………………………….... 57 Figura 16 Esquemas de cortes coronais do troncoencefálico, na região do grupamento noradrenérgico A5, do caso experimental N20. ……………………………………………………….. 58 Figura 17 Esquemas de cortes coronais do troncoencefálico, na região do grupamento noradrenérgico A5, do caso experimental N25. ………………………………………………….……. 59 Figura 18 Esquemas dos locais de injeção de BDA no A5, nos casos utilizados no estudo de suas eferências. ………………………………………………………………………………………………….. 60 Figura 19 Principais eferências do A5. ………………………………………………………………….….. 61 Figura 20 Esquemas de secções coronais do tronco encefálico, de um caso típico de injeção de BDA no A5 (N122). ……………………………………………………………………………………………… 63 Figura 21 Eferências do A5 à raiz coclear. ……………………………………………………………….…64 Figura 22 Eferências do A5 ao DR e ao PnC. ………………………………………………………...…… 65 Figura 23 Eferências do A5 para áreas que atuam de forma indireta sobre o circuito do reflexo auditivo de sobressalto (LC e CI)……………………………………………………………………….... 66 Figura 24 Aferências a raiz coclear provenientes do núcleo dorsal da rafe (DR). ………………….…. 67 Figura 25 Esquemas dos locais de injeção de BDA no DR, nos casos utilizados no estudo de suas eferências. ………………………………………………………………………………………………….. 68 Figura 26 Esquemas de secções coronais do tronco encefálico, de um caso típico de injeção de BDA no DR (N144). ……………………………………………………………………………………………… 69 Figura 27 Eferências do DR à raiz coclear. Fotomicrografias em campo claro de secções coronais da raiz coclear onde podem ser observadas fibras nervosas marcadas (setas) após injeção de BDA no DR. ………………………………………………………………………………………………………. 70 Figura 28 Eferências do DR ao PnC. ……………………………………………………………………….. 71 Figura 29 Locais de injeção de FG no PnC e identificação de suas aferências provenientes do DR e do A5. ……………………………………………………………………………………………………….. 74 Figura 30 Locais de injeção de FG no DR e identificação de suas aferências provenientes do A5 e do PnC. ………………………………………………………………………………………………………… 75 Figura 31 Locais de injeção de FG no A5 e identificação de suas aferências provenientes do PnC e do DR. ……………………………………………………………………………………………………… 76 Figura 32 Eferências do PnC……………………………………………………………………………..….. 77 Figura 33 Eferências noradrenérgicas do A5 à raiz coclear. ………………………………………..…… 79 Figura 34 Eferências noradrenérgicas e não-noradrenérgicas do A5 à raiz coclear. ……………….… 80 Figura 35 Secções coronais do local de injeção de BDA no A5 (caso 274), em três níveis rostrocaudais (A-A’’’, B-B’’’ e C-C’’’) que apresentam somas imunorreativos ao CART e a DBH. ……………………………………………………………………………………………………………..… 81 Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….16 Figura 36 Secções coronais da raiz coclear após injeção de BDA no A5 (caso 274) e detecção de imunorreatividade para CART e DBH. ……………………..…………………………………………… 82 Figura 37 Secções coronais do PnC e do DR após injeção de BDA no A5 (casos 274 e N278) e detecção de imunorreatividade para CART e DBH. ………………………………..…………………. 83 Figura 38 Eferências serotoninérgicas do DR a raiz coclear. ……………………………………………. 85 Figura 39 Eferências serotoninérgicas do DR ao PnC e ao A5. ……………………………..………….. 86 Figura 40 Resumo das conexões estudadas. ………………………………………………….………….. 86 Tabela 1 Média (desvio padrão) e mediana (mínimo e máximo) do peso corporal dos animais (em gramas) segundo grupo e momento da avaliação……………………………………..………………. 87 Figura 41 Citoarquitetura e imunorreatividade à DBH no A5 de animais do grupo controle e SHAM. …………………………………………………………………………………………………………….…. 88 Figura 42 Avaliação histológica das lesões bilaterais no A5 com 6-OHDA. …………………….……… 89 Tabela 2 Mediana (mínimo e máximo) de amplitude do RAS segundo grupo e momentos…………... 89 Tabela 3 Média (desvio padrão) e Mediana (mínimo e máximo) da variável % de PPI segundo grupo, momento da avaliação e ISI………………………………………………………………………………. 90 Figura 43 Densidade neuronal média e desvio padrão dos somas imunorreativos a proteína Fos no DCN, nos grupos lesão e controle. …………………………………………………………………….... 91 Figura 44 Densidade neuronal média e desvio padrão dos somas imunorreativos a proteína Fos no VCN, nos grupos lesão e controle……………………………………………………………………….. 91 Figura 45 Resumo da participação do A5 e do DR na modulação do RAS por meio de sua intervenção nas vias de ISI longa. ……………………………………………………………………………………. 100 Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….17 1 INTRODUÇÃO 1.1 Monoaminas neuroativas As monoaminas são neurotransmissores amplamante difundidos no sistema ner- voso. São divididas em catecolaminas (noradrenalina e dopamina) e as indolaminas como 5- hidroxitripitamina ou serotonina (5-HT) e seus homólogos 5-metoxitriptamine, triptamina e 6- hidroxitripitamina (HENSLER et al., 2013). As primeiras descrições sobre as monoaminas foram originados por demonstração bioquímica da noradrenalina em tecido cardíaco e fibras nervosas (VON EULER, 1946a;1946b), e por estudos de distribuição da serotonina no plas- ma sanguíneo (TWAROG e PAGE, 1953; AMIN et al., 1954). Trabalhos subsequentes descreveram detalhes anatômicos da distribuição des- tas substâncias neuroativas no sistema nervoso central (CARLSSON et al., 1962). O estudo clássico de DAHLSTRÖM e FUXE (1964) descreveu a distribuição de corpos celulares e terminais monoaminérgicos no sistema nervoso central. Os autores organizaram os núcleos em grupamentos celulares. Os grupos de neurônios catecolaminérgicos divididos em 13 grupos celulares (A1-A7) distribuídos do tronco encefálico e (A8-A13) no prosencéfalo, en- quanto que os grupamentos de neurônios serotoninérgicos foram descritos inicialmente co- mo nove grupos (B1-B9) ocupando principalmente a linha mediana do tronco encefálico, região denominada de rafe (DAHLSTRÖM e FUXE, 1964; STEINBUSCH, 1981). Posterior- mente foram descritos os feixes e as principais vias pelas quais as monoaminas trafegam pelo sistema nervoso central (BJÖRKLUND et al., 1971; UNGERSTEDT, 1971). Com o advento de técnicas de imuno-histoquímica para a detecção das enzimas de sínteses das catecolaminas como a tirosina hidroxilase (TH), que está presente tanto na biossíntese de dopamina quanto da noradrenalina, e a dopamina-β-hidroxilase (DBH), que é a responsável pela catálise da noradrenalina a partir da dopamina (HARTMAN et al., 1972; GOLDSTEIN, 1990), foi possível uma divisão entre sistemas dopaminérgicos e noradrenér- gicos, dando uma visão pormenorizada dos grupos catecolaminérgicos e de seus respecti- vos terminais axônicos (JACOBOWITZ e PALKOVITS, 1974; PALKOVITS e JACOBOWITZ, 1974). Outros estudos possibilitaram uma visão anatômica e fisiológica dos sistemas que utilizam catecolaminas como neurotransmissores (MOORE e BLOOM, 1978;1979) demons- trando a importância fundamental destas substâncias no sistema nervoso central, e que a sua falta está implicada na etiologia de doenças neurodegenarativas como doença de Par- kinson e Alzheimer (MARIEN et al., 2004). 1.1.1 Os grupos noradrenérgicos Dentre os grupamentos catecolaminérgicos, os grupos noradrenérgicos (A1-A7) estão tronco encefálico (DAHLSTRÖM e FUXE, 1964; JACOBOWITZ e PALKOVITS, 1974; Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….18 PALKOVITS e JACOBOWITZ, 1974; FELTEN e SLADEK, 1983). O Grupo A1 ocupa a parte ventrolateral do bulbo relacionando-se caudalmente com o núcleo reticular lateral da forma- ção reticular do bulbo e complexo olivar inferior. O Grupo A2 consiste de um pequeno grupo de neurônios pequenos situados próximo ao núcleo do trato solitário, núcleo motor dorsal do nervo vago, núcleo comissural e núcleo motor no nervo hipoglosso. O Grupo A3 consiste de um pequeno grupo de células ovais no núcleo olivar acessório dorsal. O Grupo A4 está loca- lizado no teto do quarto ventrículo, ventralmente aos núcleos centrais do cerebelo, esten- dendo-se em direção ao recesso lateral do IV ventrículo. O grupo A5, é um pequeno grupo de neurônios localizados na região ventrolateral da ponte e medialmente a raiz descendente do nervo facial. O Grupo A6 está localizado nos extremos laterais do assoalho do quarto ventrículo e corresponde ao núcleo locus coeruleus (LC). Neste núcleo praticamente todas as células são noradrenérgicas, com aparência de neurônios multipolares com longos den- dritos. Alguns neurônios do LC deslocam-se ventralmente em direção ao A5 e este grupa- mento esparso de neurônios é descrito como grupo A6sc ou núcleo subcoeruleus. O Grupo A7 situa-se ao nível caudal do colículo inferior, constituído por um pequeno grupo de células da formação reticular ventral ao pedúnculo cerebelar superior. O grupo Acg é um grupo de células encontrados em primatas, situado na substância cinzenta periaquedutal ao nível do núcleo troclear. Entre as funções da noradrenalina conhecidas na literatura, destacamos a se- creção de gonadotrofinas, hormônio-adreno-corticotrófico, hormônio do crecimento, aprendi- zado motor por ação em centros cerebelares, modulação da informação visual por ação di- reta no núcleo geniculado lateral (MOORE e BLOOM, 1978;1979), modulação da resposta de dor orofacial por ação nos núcleos trigeminais modulação da atividade cortical e talâmica, ciclo sono-vigília, indução do estresse, participação em processos cognitivos como atenção, aprendizado e memória, modulação de sistemas motores (BERRIDGE e WATERHOUSE, 2003), controle da pressão arterial, rítmo cardíaco, modulação de núcleos e vias auditivas, participação fundamental no sistema nervoso autônomo (SAWCHENKO e SWANSON, 1982; SAMUELS e SZABADI, 2008), participação nas vias relacionadas com desordens de humor como ansiedade e depressão (STONE et al., 2011), consumo de drogas (CHRISTIE et al., 1997), neurogênese (MARIEN et al., 2004) e modulação de órgãos sensoriais como a cóclea (EBERT, 1996; MULDERS e ROBERTSON, 2005). A variedade de funções atribuí- das a este neurotransmissor se deve a sua ampla distribuição no sistema nervoso e existên- cia de muitos subtipos de receptores pós-sinápticos (α1A, α1B, α1D, β1, β2 e β3) e pré- sinápticos (α2A, α2B, α2C) (BYLUND, 1992; ZHONG e MINNEMAN, 1999; MILLAN, 2003). 1.1.2 Os núcleos serotoninérgicos Assim como o sistema noradrenérgico, o sistema serotoninérgico é muito abran- gente. O mapeamento de sua distribuição no sistema nervoso central de mamíferos foi reali- Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….19 zado por meio de técnicas histoquímicas (DAHLSTRÖM e FUXE, 1964), imuno- histoquímicas para 5-HT (STEINBUSCH, 1981; JACOBS et al., 1984; GEFFARD et al., 1987; TOURET et al., 1987; TORK, 1990) e para seu precursor a 5-hidroxitripitofano (GEFFARD et al., 1987; AZMITIA, 1999;2007). Os neurônios serotoninérgicos estão restritos aos núcleos da rafe do tronco en- cefálico, porém seus terminais estão disseminados em muitas áreas do sistema nervoso central. Os núcleos da rafe no rato foram inicialmente descritos em nove grupos (B1-B9) em sequência caudo-rostral. (DAHLSTRÖM e FUXE, 1964;1965; STEINBUSCH, 1981; JACOBS et al., 1984) e posteriormente reagrupados em 4 grupos superiores e 7 grupos in- feriores no tronco encefálico de acordo com (JACOBS e AZMITIA, 1992) Grupos serotoninérgicos superiores Grupo B9 - Os neurônios serotoninérgicos deste grupo estão confinados em tor- no do lemnisco medial em sua área dorsal e em todo trajeto do lemninsco medial em sua passagem pelo mesencéfalo. Grupo B8 - Núcleo caudal linear da rafe. O núcleo caudal linear (CLi) é o grupo mais rostral de neurônios serotoninérgicos, estende-se do nível da parte caudal do núcleo rubro até a borda anterior da decussação cerebelar superior. Está localizado entre as raízes do núcleo oculomotor e estende-se dorsalmente para face anterior do núcleo dorsal da rafe. Grupo B7 e B6 - Núcleo dorsal da rafe. O núcleo dorsal da rafe (DR) está locali- zado na linha mediana do tronco encefálico ao nível da junção pontomesencefálica, dorsal- mente ao núcleo mediano da rafe. Grupo B8 e B5 - Núcleo mediano da rafe. O núcleo mediano da rafe (MnR) é um grupo celular com colunas paramedianas localizadas ventralmente ao fascículo longitudinal medial. Suas células se confundem com as do núcleo caudal linear (Grupo B8) e com célu- las do núcleo pontino (Grupo B5). Grupos serotoninérgicos inferiores Grupo B1- Núcleo pálido da rafe. Os neurônios serotoninérgicos do núcleo pálido da rafe (RPa) estão localizados na parte caudal do bulbo, dorsalmente ao núcleo olivar acessório e entre a parte ventral do núcleo reticular medular do bulbo e núcleo reticular pa- ramediano. Grupo B4 - pequeno grupo de células também localizadas no núcleo pálido da rafe, posicionadas nas proximidades na parte lateral do núcleo vestibular medial e dorsal ao núcleo prepósito do hipoglosso sendo que alguns neurônios estão em posição mediana. Grupo B2 - Núcleo obscuro - As células serotonérgicas destre grupo estão confi- nadas no núcleo obscuro da rafe (Rob), correspondendo a toda sua extensão. Muitas delas estão localizadas na parte mais caudal do núcleo reticular paramediano. Este grupo de célu- Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….20 las está ao redor do núcleo olivar inferior, parte ventral do núcleo reticular medular do bulbo e decussação piramidal. Grupo B3 - Núcleo magno da rafe - Os neurônios deste grupo estão na parte ros- tral do núcleo magno da rafe (RMg) e parte lateral do trato corticoespinal no núcleo paragi- gantocelular lateral. São visualizadas ao longo de todo corpo trapezóide, onde encontramos a maior concentração de neurônios 5-HT desta área. Os corpos celulares nesta região não estão na linha mediana, mas na parte ventrolateral do corpo trapezóide, próximo ao lemnis- co medial. Rostralmente se posicionam cercados pelo trato corticoespinal, núcleo paraolivar e núcleo do corpo trapezóide. GrupoB1/B3 - Medula ventral lateral. Neurônios na medula ventral lateral são en- contrados na formação reticular do bulbo, estende-se lateralmente ao longo do corpo trape- zóide, lemnisco medial e fibras pirâmidais sendo suas células uma fusão dos grupamentos B1 e B3. Rostralmente possuem aspecto medial ao núcleo paragigantocelular lateral (LPGi) e caudal a parte ventral do núcleo reticular intermédio (IRt). Um grupo substancial de células estende-se das raízes do nervo hipoglosso (XII) para a parte rostral do núcleo olivar inferior. Grupo B5 - Núcleo pontino da rafe. A maior parte deste grupo está presente na parte intermédia do núcleo pontino da rafe (PnR), posicionadas dorsalmente entre o fascícu- lo longitudinal medial. As partes rostrais e caudais deste núcleo não contêm nenhum neurô- nio serotoninérgico. Área postrema: neurônios serotoninérgicos na área postrema são pequenos e compactos, estão envolvidos em circuitos de comando cardiovascular e respiratório. Além destas regiões também foram descritas a presença da serotonina no lócus coeruleus (LC), parte lateral da área cinzenta periaquedutal, tegmento lateral e núcleo inter- peduncular (DAHLSTRÖM e FUXE, 1964; STEINBUSCH, 1981; GEFFARD et al., 1987). A 5-hidroxitriptamina (5-HT) ou serotonina foi primeiramente demonstrada bio- quimicamente em amostras de sangue (RAPPORT et al., 1948; RAPPORT, 1949), sendo um elemento do soro com forte ação sobre o tônus muscular liso das artérias provocando vasoconstrição, por este motivo chamada de “serum tonim” ou serotonina. A 5-HT é uma molécula preservada filogeneticamente estando presente em vários organismos incluindo plantas, invertebrados e vertebrados (JACOBS e AZMITIA, 1992; AZMITIA, 1999). Posteri- ormente, a presença da 5-HT foi detectada na urina e em órgãos de mamíferos como vasos sanguíneos, pulmões, estômago, intestinos (onde está a maior parte da serotonina no corpo humano), rins, testículos, gânglios da raiz dorsal e encéfalo (TWAROG e PAGE, 1953; AMIN et al., 1954; BERGER et al., 2009). A síntese da 5-HT ocorre pela hidroxilação do L- triptofano para L-5-hidroxitriptofano catalisado pela enzima triptofano hidroxilase, que pos- sue duas isoformas que atuam predominantemente em órgãos periféricos (TPH1) ou exclu- sivamente no sistema nervoso central (TPH2) (FILIP e BADER, 2009). Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….21 A 5-HT é um neuromodulador implicado nas mais variadas funções, entre elas podemos mencionar comportamento alimentar (TAKASE e NOGUEIRA, 2008), aprendiza- gem e modulação da dor (TAKASE et al., 2005; ALMADA et al., 2009), paciência e impulsi- vidade (DALLEY e ROISER, 2012; MIYAZAKI et al., 2012), ciclo sono-vigília, comportamen- to sexual (SGHENDO e MIFSUD, 2012), distúrbios de humor como a ansiedade e depres- são e motricidade da musculatura lisa (BALE, 2006), regulação da homeostase (AZMITIA, 1999;2001;2007), plasticidade neuronal (AZMITIA, 1999; TRAKHTENBERG e GOLDBERG, 2012), proliferação celular e apoptose (AZMITIA, 2001; DE SOUZA et al., 2004; TRAKHTENBERG e GOLDBERG, 2012) e modulação da via auditiva (KLEPPER e HERBERT, 1991; EBERT e OSTWALD, 1992). A diversidade de funções da serotonina está refletida na extensa família dos re- ceptores serotoninérgicos (5-HT1 a 5-HT7) (FILIP e BADER, 2009). A família 5-HT1 (5- HT1A-1F) é constituída por autorreceptores que inibem a liberação de 5-HT, controlam a liberação de ácido-γ-amino butírico (GABA) e acetilcolina. A família 5-HT2 (5-HT2A-2C) é composta de receptores somatodendríticos encontrados em neurônios GABA-érgicos, glu- tamatérgicos, colinérgicos, dopaminérgicos e noradrenérgicos que promovem alterações na atividade motora. As famílias 5-HT3 (3A-3E) e 5-HT4 (4A-4C) são compostas por receptores localizados em neurônios GABAérgicos, colinérgicos e glutamatérgicos que promovem se- creção de hormônio adrenocorticotrófico (ACTH), prolactina e induzem comportamento mo- tor (família 5-HT3) ou estão envolvidos na consolidação da memória (família 5-HT 4). A fa- mília 5-HT5 (5A-5B) é composta por receptores de neurônios GABA-érgicos que estão en- volvidos em respostas de ansiedade. A família 5-HT6 presente em neurônios GABA-érgicos, colinérgicos e glutamatérgicos estimula a liberação de 5-HT, dopamina e GABA. A família 5- HT7 (7A-7D) está presente em neurônios GABA-érgicos e glutamatérgicos e atuam sobre o ciclo circadiano, humor, percepção de dor, cognição e termorregulação (PASCAL e JOHANNES, 2006; FILIP e BADER, 2009; CURTIN et al., 2013) Estudos funcionais indicam que a redução da 5-HT no sistema nervoso promove alteração em estados de ansiedade levando a quadros depressivos e eventos de impulsivi- dade, provavelmente devido ao seu papel modulatório em áreas comportamentais e de ma- nutenção do fator liberador de corticotrofina (CRF) como amígdala, córtex pré-frontal e hipo- tálamo (COOLS et al., 2011; PUIG e GULLEDGE, 2011; WASELUS et al., 2011; JACOBSEN et al., 2012). Estudos farmacológicos tem demonstrado a existência de interações entre os sistemas da 5-HT e CRF, de forma que o aumento da 5-HT induzido por inibidores da recap- tação de serotonina acarreta em diminuição da liberação de CRF. Por outro lado, o aumento dos níveis de CRF causa inibição nos neurônios serotoninérgicos do núcleo dorsal da rafe que é um grande centro sintetizador de serotonina no sistema nervoso central (WASELUS et Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….22 al., 2011; KUBOTA et al., 2012). Além disso, a 5-HT está relacionada com vários distúrbios neurológicos como depressão, esquizofrenia, síndrome de Down, doença de Alzheimer, dé- ficit e desordem de atenção, alcoolismo, apnéia do sono (AZMITIA, 1999; FILIP e BADER, 2009). Recentemente, também foi descrito que terminais serotoninérgicos estão em grande quantidade, porém distróficos, no córtex cerebral de encéfalos de autistas (AZMITIA et al., 2011). Assim, nota-se o importante papel da serotonina na modulação das atividades que dependem da integração sensório-motora, entre elas podemos citar o reflexo auditivo de sobressalto (RAS) e a inibição por estímulo prévio (PPI) que envolve a participação dos nú- cleos da rafe (DAVIS e SHEARD, 1974) 1.2 O Transcrito Regulado pela Cocaína e Anfetamina (CART) Após a injeção de cocaína e anfetamina no estriado de ratos foi verificada a sín- tese de um novo peptídeo com ação psicomotora sendo este denominado de Transcrito Re- gulado pela Cocaína e Anfetamina (CART) (DOUGLASS et al., 1995; ELIAS et al., 2001). O CART apresenta em sua sequência de aminoácidos uma cadeia principal com duplicação de vários pares de base, sugerindo que o CART é formado por fragmentos de peptídeos meno- res, podendo atuar tanto como um neurotransmissor como um co-transmissor (KOYLU et al., 1998). O mapemanto da distribuição de CART no sistema nervoso central de ratos de- monstra terminais axonais e neurônios imunorreativos em alguns núcleos previamente rela- cionados com o RAS e a PPI, como LC (GOMEZ-NIETO et al., 2008a; HORMIGO et al., 2014b), o DR (MELONI e DAVIS, 2000; GOGOS et al., 2005), porém não foi descrita a pre- sença de terminais axonais em núcleos da via auditiva como os cocleares e colículo inferior (CI) ou do circuito elementar do RAS. Funcionalmente o CART tem sido implicado em efeitos ansiogênicos, hiperálgi- cos e na regulação autônoma (BANNON et al., 2001; ELIAS et al., 2001). A injeção de duas variantes do CART (CART 42-89, CART 49-89) no sistema nervoso central modificou o RAS e a PPI de formas diferentes (BANNON et al., 2001). Assim o CART 42-89 levou a diminui- ção do RAS mas não alterou significativamente a PPI, enquanto o CART 49-89 não alterou o RAS, porém aumentou a PPI. Este efeito poderia ser mediado pela presença do CART em áreas como área tegmental ventral, núcleo accumbens e pálido ventral que modulam a PPI ou estabelecem conexões com outros núcleos que o fazem, como núcleo tegmental pedunculopontino (PPtg) e o PnC (SWERDLOW et al., 1990; SWERDLOW e GEYER, 1993b). No entanto não existem informações sobre a origem e distribuição dos terminais axonais CART-érgicos nos núcleos do circuito elementar de sobressalto. Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….23 1.3 O reflexo auditivo de sobressalto O reflexo auditivo de sobressalto (RAS) é uma reação motora rápida e intensa que implica na contração de um grande número de grupos musculares de todo o corpo em resposta a um estímulo acústico intenso e inesperado. Apresenta um componente vegetati- vo mediado pelo sistema nervoso autônomo que se manifesta por um aumento da pressão arterial e da frequência cardíaca (LANDIS e HUNT, 1939; BAUDRIE et al., 1997; KOCH, 1999). Trata-se de um reflexo acústico-motor do tronco encefálico que está presente em muitas espécies de mamíferos, incluindo o homem. Possui tanto caráter defensivo frente a uma possível agressão como de alerta frente a acontecimentos não esperados (KEAY et al., 1988). No homem, (BROWN, 1995) descreveu o reflexo de sobressalto como uma contra- ção generalizada da musculatura estriada esquelética, principalmente da face, pescoço e parte proximal do membro superior. No rato o reflexo de sobressalto se manifesta de manei- ra mais ampla, com a contração dos membros, flexão do pescoço e encurtamento do com- primento total do animal (YEOMANS e FRANKLAND, 1996; KOCH, 1999). Como resultado destas contrações musculares o animal assume uma postura defensiva que protege partes importantes do seu corpo como a parte ventral do pescoço e do ventre. Tanto no homem como em animais de experimentação os estímulos que desencadeiam mais facilmente o RAS são sons compostos por um amplo espectro de frequências (ruído branco) e de alta intensidade, normalmente acima de 80 dB SPL (GRILLON et al., 1994; PILZ e SCHNITZLER, 1996; KOCH, 1999). A latência deste reflexo é muito curta: 8 ms no rato (DAVIS et al., 1982) e de 5 a 10 ms no homem (KOCH, 1999). Além do valor etológico dos reflexos acústico-motores para a sobrevivência do indivíduo, existe um enorme interesse nestes reflexos tanto na clínica médica como na pes- quisa básica relacionada com a integração sensório-motora (HOFFMAN e ISON, 1980; WILKINS et al., 1986; VALLS-SOLÉ, 1998; SWERDLOW et al., 1999;2000). Devido seu ar- cabouço anatômico encontrar-se ao nível do tronco encefálico, a avaliação clínica do RAS nos permite reconhecer o estado funcional desta importante parte do encéfalo. Esta estraté- gia é utilizada em pediatria perinatal onde a observação dos reflexos acústico-motores jun- tamente com a realização de potenciais evocados são as principais ferramentas que nos permitem conhecer o estado de desenvolvimento e funcionalidade do sistema nervoso. Em otorrinolaringologia, a avaliação destes reflexos nos proporciona informação sobre a funcio- nalidade da porção baixa da via auditiva, até o nível da ponte e principalmente do nervo coclear. O reflexo de sobressalto constitui um modelo experimental interessante já que é um comportamento bastante simples e facilmente avaliado em provas não invasivas. O RAS pode ser modificado quantitativamente ou qualitativamente por uma série de condições naturais ou experimentais (SWERDLOW et al., 1999; BELL et al., 2003), con- sideradas como modulações e que demonstram a plasticidade deste reflexo. O reflexo pode Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….24 estar diminuido por habituação ao estímulo (GONZALEZ-LIMA et al., 1989; PILZ e SCHNITZLER, 1996), por um estímulo prévio de menor intensidade (HOFFMAN e FLESHLER, 1963; BRAFF et al., 2001; FENDT et al., 2001; SWERDLOW et al., 2007) e por administração de drogas (SWERDLOW e GEYER, 1993a; BAKSHI et al., 1994; GEYER et al., 2001). Por outro lado, o reflexo pode estar aumentado em condições de potenciação por medo (DAVIS, 1990; GRILLON et al., 1991; ANISMAN et al., 2000; DAVIS, 2006; WINSLOW et al., 2007), ansiedade (KAVIANI et al., 2004; PREHN et al., 2006; GRILLON, 2008; DIAS et al., 2013), e estresse (ANDRESKI et al., 1998; KAVIANI et al., 2004; KANAI et al., 2007; STAM, 2007). Em geral as modulações mostram-se mais sensíveis do que o próprio reflexo e apresentam alterações significativas em situações em que o reflexo propriamente dito não está alterado (HOFFMAN e ISON, 1980; JUSTUS e FINN, 2007). Por esta razão as provas comportamentais envolvendo as modulações do RAS têm despertado interesse no diagnós- tico clínico (WILKINS et al., 1986). Na clínica neurológica e psiquiátrica estão documentadas alterações nas respostas do RAS devido as modulações provocadas por doenças neurode- generativas, esquizofrenia, hiperreflexia, depressão e estados de dependência de drogas como opiáceos e álcool (MANSBACH et al., 1992; BOROWSKI e KOKKINIDIS, 1994; GRILLON et al., 1994; BROWN, 1995; KOCH, 1999). O RAS também está sujeito a manipulações farmacológicas. Os agonistas do- paminérgicos diretos, queatuam diretamente sobre os receptores dopaminérgicos simulando a ação da dopamina,como a bromocriptina aumentam a magnitude do reflexo (SWERDLOW et al., 2002), assim como os agonistas dopaminérgicos indiretos, como as anfetaminas (BELL et al., 2003) ou a cocaína, que atuam promovendo a liberação do neurotransmissor armazenado em terminais axônicos. O “ecstase” também produz modificações na magnitude do reflexo auditivo de sobressalto, neste caso mediadas pelo sistema serotoninérgico já que esta substância promove a liberação de serotonina (VOLLENWEIDER et al., 1999; HEEKEREN et al., 2004). As “drogas de uso social” comuns em nossa sociedade como o álcool e o tabaco também exercem influência sobre o RAS. O álcool diminui a amplitude (GRILLON et al., 1994) como seria esperado por seu efeito depressor sobre o sistema ner- voso central. No entanto, estudos realizados em roedores demonstraram um aumento da amplitude do reflexo, o que pode ser explicado pelo efeito bifásico do álcool que inicialmente atua como estimulante (DUDEK et al., 1991) determinando a liberação de dopamina (LEWIS e GOULD, 2003) e posteriormente atua como um depressor pela ativação do GABA. O ta- baco atua através da liberação de dopamina por meio de seu componente estimulante, a nicotina, e produz uma diminuição da latência de resposta sem alteração da amplitude da mesma (HUTCHISON et al., 2000). Uma das modulações mais interessantes do RAS é a inibição por estímulo pré- vio (PPI) que consiste na diminuição do reflexo quando o estímulo desencadeante é prece- Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….25 dido, em uma fração de segundo (entre 30 e 500 ms), por outro estímulo sensorial (visual, sonoro ou tátil) de baixa intensidade (KOCH, 1999). As interações neurais que suportam a existência desta modulação do reflexo de sobressalto ainda não estão totalmente esclareci- das e nenhum dos circuitos propostos permite explicar satisfatoriamente todos os fenôme- nos associados à inibição por estímulo prévio (FENDT et al., 2001; SWERDLOW et al., 2001). Uma das vias propostas inclui uma projeção colinérgica inibidora originada no núcleo pedunculopontino do tegmento que atua sobre os neurônios grandes do núcleo reticular caudal da ponte (PnC) (KOCH et al., 1993; FENDT e KOCH, 1999; FENDT et al., 2001). Mais recentemente, após verificar efeitos inibitórios nos neurônios da raiz coclear (CRN) durante provas comportamentais desenhadas para desencadeamanto da PPI com intervalos interestímulos pequenos, foi proposta outra via envolvendo uma projeção colinérgica do nú- cleo ventral do corpo trapezóide diretamente aos CRN (GOMEZ-NIETO et al., 2008b; GOMEZ-NIETO et al., 2013). A avaliação das modulações do reflexo de sobressalto em animais de experi- mentação tem sido proposta como modelo equivalente para situações que podem ocorrer na espécie humana, convertendo-se em uma ferramenta para pesquisa de novos fármacos. Assim, o reflexo de sobressalto potenciado por estímulo adverso provoca em animais de experimentação um estado de temor que tem sido equiparado ao estado de ansiedade no homem (COOK et al., 1992) e pode ser utilizado para avaliar o efeito de fármacos em pato- logias psiquiátricas relacionadas com estados de ansiedade. As modulações próprias do RAS e suas alterações farmacológicas estão relacio- nadas com estruturas do sistema nervoso central que terminam por influenciar a atividade dos núcleos do circuito elementar do reflexo (LEE et al., 1996). No rato, o circuito neural elementar do reflexo auditivo de sobressalto está constituído de quatro elementos (Figura 1): as células ganglionares do órgão de Corti, os CRN, os neurônios reticuloespinais do PnC e os motoneurônios da medula espinal (YEOMANS et al., 1993; FRANKLAND et al., 1995; LEE et al., 1996; YEOMANS e FRANKLAND, 1996; KOCH e SCHNITZLER, 1997; KOCH, 1999). Dentre estes o núcleo mais estudado é o PnC sobre o qual se conhecem as caracte- rísticas eletrofisiológicas (LINGENHÖHL e FRIAUF, 1994), conectividade (YEOMANS e FRANKLAND, 1996) e respostas à manipulação farmacológica (EBERT e KOCH, 1992; KRASE et al., 1993; MISERENDINO e DAVIS, 1993). O PnC atua como centro integrador de aferências de diversas origens e com distintos neurotransmissores, fato que está relaciona- do com o grande número de modulações do RAS (KOCH, 1999). Um aspecto interessante é a modulação do RAS por monoaminas como a sero- tonina e a noradrenalina (DAVIS, 1980; DAVIS et al., 1986; PAVLASEK, 1989; BAKSHI e GEYER, 1997; ANISMAN et al., 2000; FLETCHER et al., 2001; ALMADA et al., 2009; BRAUER et al., 2009; CONTI, 2012; CURTIN et al., 2013). A vasta literatura sobre este as- Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….26 sunto nos mostra que ambas possuem forte influência sobre este reflexo, tanto de forma facilitatória, quanto inibitória. Figura 1 Esquema do circuito neural elementar responsável pelo reflexo auditivo de sobressalto. Arco aferente em cinza negro e arco eferente em cinza claro. Esquema modificado de Lee et al. (1996). O papel da noradrenalina na modulação comportamental foi estudado em vários pa- radigmas, entre eles o RAS, após a lesão dos feixes noradrenérgicos dorsal e ventral (efe- rências do LC) embora inicialmente não fosse evidenciada nenhuma influência (VERLEYE e BERNET, 1983). Estudos fisiológicos descreveram um aumento siginificante no RAS devido microinjeções de noradrenalina na formação reticular pontina, indicando que a noradrenalina possui papel potencializador sobre este reflexo (PAVLASEK, 1989). Neste contexto, estudos farmacológicos empregando a infusão de anfetamina (agonista noradrenérgico indireto) ou ioimbina (antagonista dos receptores α2) na medula espinal (DAVIS e ASTRACHAN, 1981) e no liquído cefaloraquidiano (KEHNE e DAVIS, 1985) levam ao aumento da amplitude do RAS. Corroborando com estes resultados a administração sistêmica de clonidina, droga agonista dos receptores α2, diminui a amplitude do sobressalto (DAVIS et al., 1977), mesmo em animais descerebrados ou com lesões bilaterais do LC, indicando que o efeito da cloni- Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….27 dina nos terminais noradrenérgicos pré-sinápticos poderia ser mediado por outras aferências noradrenérgicas sobre os neurônios dos núcleos cocleares e do PnC (DAVIS et al., 1989). Com relação a serotonina, como elemento modulador do RAS e da PPI, parece exercer seu papel durante as alterações de neurotransmissão (DAVIS e SHEARD, 1974; FLETCHER et al., 2001). Recentemente foi descrita a participação do receptor 5-HT5A na modulação sensório-motor atuando na inibição tônica do circuito do RAS em peixes (CURTIN et al., 2013). A serotonina participa na modulação mas não é essencial para o de- sencademanto do reflexo,uma vez que, a lesão neonatal de áreas serotoninérgicas com 5,7- DHT não interefere na PPI quando o animal atinge a idade adulta (KOLOMANSKA et al., 2011). Embora muitos trabalhos demonstrem que a serotonina possui papel modulador tan- to do RAS quanto da PPI, nota-se que foi dada muita importância para os efeitos da seroto- nina mediados por estruturas prosencefálicas e não se verificou a existência de conexões entre áreas serotoninérgicas e o circuito elementar do RAS. Os dados que dispomos até o momento indicam apenas a existência de terminais axonais serotoninérgicos no PnC (STEINBUSCH, 1981) sem no entanto identificar suas origens. 1.4 Os neurônios da raiz coclear e o núcleo reticular caudal da pon- te O nervo coclear está localizado medialmente ao paraflóculo do cerebelo, junta- mente ao nervo vestibular com o qual se dirige ao meato acústico interno, posicionando-se lateralmente, dorsalmente e caudalmente (ANGULO et al., 1990) para formar o nervo vestí- bulococlear, VIII par de nervos cranianos. A parte inicial do nervo vestíbulococlear emerge do tronco encefálico na porção lateral do sulco bulbopontino, caudalmente a raiz do nervo trigêmeo, sendo formado pela união da raiz do nervo coclear e do nervo vestibular e ocu- pandoo meato acústico interno juntamente com o nervo facial (Figura 2). O nervo coclear é constituído pelos axônios aferentes dos neurônios do gânglio espiral (Figuras 2 e 3), os quais conduzem impulsos nervosos associados à audição proce- dentes do Órgão de Corti situado na cóclea (HEBEL e STROMBERG, 1976), além disso, também é constituído de fibras eferentes oriundas do complexo olivar superior: o feixe olivo- coclear (WARR, 1992). Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….28 Figura 2 Nervo vestibulococlear e Raiz coclear. Em A vista ventral do tronco encefálico evidenciando o nervo vestibulococlear e raiz coclear; em B vista lateral do mesmo encéfalo em A evidenciando o nervo vestibulococlear e raiz coclear. Figura extraída de (BARIONI, 2012). Figura 3 Raiz coclear do nervo vestíbulo-coclear e os neurônios da raiz coclear (CRN). Em A, um esquema de um corte coronal do tronco encefálico e parte da espira basal da cóclea preparado com base no trabalho de Merchán et al. (1988). As cabeças de seta indicam a borda glial que delimita a raiz coclear. Em B, fotomicrografia de corte coronal da raiz coclear submetido a técnica imunohistoquímica para neurofilamentos SMI-32. Abreviaturas: vide lista de abreviaturas. No rato, como em outros mamíferos, as fibras do nervo coclear terminam no complexo nuclear coclear (LORENTE DE NÓ, 1933) e assim o fazem em um padrão tonotó- pico (ROSS e BURKEL, 1971; MERCHÁN et al., 1988). Cada fibra bifurca em um ramo as- cendente que supre o núcleo coclear ventral anterior (VCA), e um ramo descendente que supre os núcleos coclear ventral posterior (VCP) e dorsal (DCN) (HARRISON e IRVING, 1966). A raiz coclear compreende a parte do nervo que está entre o núcleo coclear ven- tral e a borda de células de Schwann do VIII par (MERCHÁN et al., 1988). A raiz do nervo coclear é definida como a parte do nervo desprovida das células de Schwann. Nela está situado um grupo de aproximadamente cinquenta células (de 30 a 38 µm de diâmetro) de cada lado (Figuras 2 e 3), facilmente identificadas em secções histológicas do tronco ence- fálico de roedores e marsupiais (LÓPEZ et al., 1993; AITKIN, 1995), as quais constituem os Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….29 primeiros neurônios do sistema nervoso central a receber informação auditiva através de colaterais axônicos originários das fibras nervosas do nervo coclear: os neurônios da raiz coclear (CRN) (HARRISON et al., 1962; HARRISON e WARR, 1962; OSEN et al., 1991). Cada CRN conecta-se com grande quantidade de colaterais provenientes de fi- bras nervosas de praticamente toda extensão do orgão de Corti (OSEN et al., 1991). Isto se deve ao padrão de ramificação dendrítica dos CRN com dendritos longos dispostos em duas direções: paralelamente e perpendicularmente às fibras aferentes cocleares primárias (MERCHÁN et al., 1988). Os dendritos perpendiculares são especialmente extensos e cru- zam transversalmente praticamente toda raiz coclear. Portanto, os CRN estão sujeitos a estimulação por um amplo espectro de frequências acústicas, embora possuam o limiar de excitação mais baixo para frequências ao redor de 30 kHz (SINEX et al., 2001). Embora sejam os primeiros neurônios a receber aferências auditivas, os CRN re- lacionam-se com estruturas não auditivas (LÓPEZ et al., 1999; NODAL e LÓPEZ, 2003). Os CRN conectam-se com núcleos de integração sensório-motor da formação reticular (Figura 4), especialmente com o núcleo reticular caudal da ponte (PnC) ou diretamente com o nú- cleo motor do nervo facial (HORTA-JUNIOR et al., 2008). Devido a sua posição e padrão de conectividade, os CRN foram relacionados funcionalmente com o circuito do reflexo auditivo de sobressalto, hipótese que foi confirmada por (LEE et al., 1996). Figura 4 Esquema das eferências dos CRN. A seta mais espessa indica a projeção mais exuberante. Abreviaturas: vide lista de abreviaturas. As origens das aferências aos CRN que não provenham da cóclea ainda são pouco conhecidas. Não foram investigadas com detalhes quais modulações do RAS poderi- am relacionar-se com os CRN e seus aferentes diretos ou indiretos. O estudo da ultra-estrutura da raiz coclear demonstrou que aproximadamente a metade da superfície celular dos CRN está recoberta de botões sinápticos classificados em quatro tipos (MERCHÁN et al., 1988). Os botões do tipo I são os mais numerosos, constitu- indo em conjunto 75% de todos botões sinápticos. Apresentam assimetria nas densidades pré e pós-sinápticas e contêm muitas vesículas circulares e elétron-lúcidas sugerindo conta- Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….30 tos sinápticos excitatórios. As características ultra-estruturais destes botões são iguais aos botões sinápticos dos aferentes primários nos núcleos cocleares que são glutamatérgicos (ZHOU et al., 2007). Isto sugeriu que os botões de tipo I se originassem de colaterais dos aferentes cocleares primários, como foi demonstrado por (OSEN et al., 1991). Os demais botões sinápticos que não se originam dos aferentes primários são menos numerosos (cer- ca de 25% de todos que terminam sobre os CRN) e possuem característica morfológica he- terogênea com vesículas elétron-lúcidas circulares ou pleomórficas que sugerem que se originem de outras regiões com identidades neuroquímicas diferentes (MERCHÁN et al., 1988). No núcleo coclear ventral, vizinho imediato dos CRN, foram identificadas aferên- cias serotoninérgicas provenientes dos núcleos da rafe, mas não há menção sobre a chega- da destas aferências aos CRN (KLEPPER e HERBERT, 1991). Os CRN estão em aposição com grande quantidade de botões imunorreativos para o transportador vesicular de glutama- to (VGlut1) assim como com terminais imunorreativos para o transportador vesicular de GA- BA e glicina (VGat) (OSEN et al., 1991; GOMEZ-NIETO et al., 2008a), porém não se conhe- ce a origem destas aferências inibitórias. Também foi descrita uma nova fonte de aferências diretas aos CRN com origem no LC e de natureza noradrenérgica (GOMEZ-NIETO et al., 2008a; HORMIGO et al., 2014b) e proveniente do VNTB de natureza colinérgica (GOMEZ- NIETO et al., 2008b). Por outro lado, o PnC é a porção da formação reticular rombencefálica que se estende desde o pólo rostral do núcleo motor do nervo facial até o pólo rostral do núcleo motor do nervo trigêmeo, onde começa o núcleo reticular pontino oral (PnO) (NEWMAN, 1985; KOCH et al., 1992). Ventralmente está limitado pelo Complexo Olivar Superior (COS), medialmente pelo feixe predorsal, lateralmente pelo núcleo subcerúleo (SubC) que rodeia o núcleo motor do nervo trigêmeo (JONES, 1995), dorsalmente pela área tegmental dorsomedial (DMTg) e pelo fascículo longitudinal medial (mlf). A porção auditiva do PnC corresponde a metade rostral de sua parte ventro-lateral, dorsalmente ao complexo olivar superior e ventromedial- mente ao núcleo motor do trigêmeo (LINGENHÖHL e FRIAUF, 1992;1994). O PnC é o principal centro de convergência de estímulos sensoriais e elemento fundamental do circuito elementar do reflexo auditivo de sobressalto (DAVIS et al., 1982; KOCH et al., 1992; LINGENHÖHL e FRIAUF, 1994). A conexão entre os CRN e o PnC é a principal responsável pelo envio de informação auditiva ao PnC (LÓPEZ et al., 1999; NODAL, 1999; NODAL e LÓPEZ, 2003) e possui importância fundamental para existência do reflexo (LEE et al., 1996). Muitos trabalhos sugerem que a noradrenalina exerça efeito sobre o circuito elementar do sobressalto em nível do PnC, porém, até o momento os terminais axonais no- radrenérgicos no PnC não foram caracterizados hodológica e neuroquimicamente embora Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….31 se saiba que esta área recebe inervação do LC (JONES e YANG, 1985). Além disso, foram descritas aferências noradrenérgicas aos CRN que em parte são provenientes do LC (GOMEZ-NIETO et al., 2008a; HORMIGO et al., 2014b), mas devido a exuberante quantida- de de terminais noradrenérgicos na raiz coclear é provável que outras fontes de aferências noradrenérgicas exerçam influência sobre o circuto elementar do RAS (DAVIS et al., 1977). Recetemente, foi descrita uma grande variedade de receptores adrenérgicos na raiz coclear (α2A, α2B, α2C, β1, β2 e β3), o que sugere um importante envolvimento da noradrenalina neste nível através do desencadeamento do RAS e também de suas modulações (GOMEZ- NIETO et al., 2008a). Desta forma, consideramos importante estudar as origens das aferências ao cir- cuito elementar do reflexo de sobressalto que apresentem identidade neuroquímica de subs- tâncias neuroativas que reconhecidamente participam da modulação do RAS e da PPI, co- mo a noradrenalina, serotonia e o neuropeptídeo CART. Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….32 2 OBJETIVOS 1. Estudar a origem das aferências monoaminérgicas (serotoninérgicas e noradrenérgi- cas) e CART-érgicas ao circuito elementar do reflexo auditivo de sobressalto por meio de estudos de mapeamento de vias nervosas e caracterização neuroquímica por imunohistoquímica em experimentos de co-localização. 2. Estudar a influência comportamental de lesões nos núcleos identificados como afe- rentes ao circuito elementar do RAS avaliando o reflexo auditivo de sobressalto e a inibição por estímulo prévio. 3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 Estratégia experimental Para estudar a origem das aferências ao circuito elementar do reflexo auditivo de sobressalto, inicialmente foram realizados experimentos de mapeamento de vias nervosas, empregando traçador retrógrado nos núcleos do circuito elementar do RAS no tronco ence- fálico: o CRN e o PnC. A partir do mapeamento das células retrogradamente marcadas em núcleos que pudessem ter identidade neuroquímica monoaminérgica ou CART-érgica, foram realizados experimentos de controle anterógrado e de colocalização dos traçadores com as substâncias neuroativas em questão através da técnica de imuno-histoquímica Uma vez caracterizada a hodologia e neuroquímica das aferências de interesse, foram panejados experimentos de lesão neurotóxica e avaliação comportamental do RAS e da PPI com diferentes intervalos interestímulos para avaliação do envolvimento do núcleo em questão com a via curta ou longa associadas a PPI. 3.2 Animais de experimentação Todos os experimentos propostos neste projeto requerem a utilização de animais de experimentação. Não existe método alternativo. Em todas as etapas nos preocupamos com o planejamento, preparação e execução dos experimentos para incrementar ao máximo as possibilidades de êxito, o que supõe uma redução do número de animais utilizados. Este preceito foi seguido na elaboração dos protocolos experimentais que foram aprovados pela Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA do Instituto de Biociências de Botucatu – UNESP (protocolo no 17/08). Utilizamos como modelo experimental, fêmeas de ratos albinos adultos (Rattus norvergicus), da linhagem Wistar, por volta de 100 dias de idade.Esta espécie é representativa dos mamíferos roedores que precisam de um ótimo funcionamento dos reflexos acústico-motores para sobrevivência em um habitat terrestre, principalmente Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….33 noturno, e por isso é amplamente utilizada para o estudo do reflexo auditivo de sobressalto (YEOMANS e FRANKLAND, 1996; KOCH, 1999) Os animais foram alojados em gaiolas (33x17x18cm) com livre acesso à água e ração, em biotério com temperatura controlada (21 a 23oC) e ciclo claro/escuro de 12/12 horas (luzes acesas às 7:00h). Para evitar o estresse por isolamento, em cada gaiola foram alocados dois animais. As intervenções cirúrgicas para injeção de traçadores, neurotóxico e a eutanásia dos animais foram realizadas sob anestesia profunda. Antes de iniciar qualquer procedimento cirúrgico ou imobilização do animal, foi comprovada a ausência do reflexo córneo-palpebral e reflexo de retirada da pata traseira, como sinal de anestesia eficaz. Os anestésicos que foram utilizados são de uso comum em experimentação animal, com uma dose cuja eficácia foi constatada repetidamente em vários laboratórios de pesquisa. Foram empregados os seguintes anestésicos: Para injeção de traçadores neurais e neurotóxicos: uma solução anestésica constituída de 5 ml de cloridrato de xilazina (Anasedan 2%, Ceva) a 20mg/ml (concentra- ção final = 5mg/ml), 5 ml de cloridrato de ketamina (Dopalen 10%, Ceva) a 100mg/ml (concentração final = 25mg/ml) e 2 ml de acepromazina (Acepran® 1%, Vetnil) a 10mg/ml (concentração final = 1mg/ml), em quantidade suficiente de água bidestilada para 20ml. A solução anestésica foi ministrada por via subcutânea na dose de 0,2ml para cada 100g de peso corporal do animal. Para o sacrifício por perfusão transcardíaca: sobredose de solução de hidrato de cloral a 10% por via intraperitoneal (aproximadamente 400 mg/kg de peso corporal). Todas as substâncias tóxicas foram manipuladas em uma capela extratora de gases. Nela foram preparados os fixadores, perfusão dos animais, reações imuno- histoquímicas com DAB e manipulação de substâncias para desidratação e montagem das lâminas para microscopia óptica. 3.3 Procedimentos experimentais 3.3.1 Experimento tipo 1 - Mapeamento das aferências aos CRN e ao PnC com especial ênfase a núcleos noradrenérgicos, serotoninérgicos e CART-érgicos Uma vez realizada a anestesia dos animais, os pêlos da região da cabeça e ao redor da orelha foram cortados. O animal foi posicionado no aparelho estereotáxico (David Kopf Instruments, #963) e seus olhos foram mantidos umedecidos com soro fisiológico du- rante todo o procedimento. A altura do apoio incisal do aparelho estereotáxico foi ajustada para 3,3mm abaixo da linha interauricular de forma que os pontos craniométricos Bregma e Lambda estivessem no mesmo nível (PAXINOS e WATSON, 2007). Foi realizada uma inci- são sagital mediana de aproximadamente 3cm na cabeça do animal, desde o ponto Bregma Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….34 até a região cervical. Os tecidos que recobrem a calota craniana, inclusive o periósteo, fo- ram divulsionados e afastados lateralmente com bastonetes de algodão expondo os ossos parietais e o osso occipital. Para o mapeamento das aferências empregamos o traçador neuronal retrógrado Fluoro-Gold (FG). Para a injeção de FG, foram confeccionadas micropipetas de vidro a partir de tubos capilares (capilares de vidro borosilicato, World Precision Instruments #1B150F-4) estirados verticalmente em equipamento específico (estirador de pipetas verti- cal, Narishige #PC-10). As coordenadas estereotáxicas foram ajustadas em relação à linha interauricular com a micropipeta de vidro fixada ao manipulador de eletrodos e com auxílio de um calibrador de ângulos (David Kopf Instruments, #935). As coordenadas foram basea- das em trabalhos prévios de nosso grupo e no atlas esteretáxico do encéfalo do rato (NODAL e LÓPEZ, 2003; GOMEZ-NIETO et al., 2008b; HORTA-JUNIOR et al., 2008). O uso do calibrador de ângulos assegurou a máxima precisão no ajuste das coordenadas es- tereotáxicas. Antes do inicio da cirúrgia o posicionamento do animal foi verificado pela proje- ção da coordenada ântero-posterior (AP) 0,0 e médio-lateral (ML) 0,0 sobre a calota crania- na, no centro do triângulo formado pela sutura lambdóide como preconizado por (PAXINOS e WATSON, 2007). As coordenadas para injeção de FG na raiz coclear foram: ântero- posterior -1,0mm; médio-lateral +4,3mm; dorsoventral +0,3mm; ângulo de +20° (ângulo cau- dal, para direita) e micropipetas com pontas de diâmetro interno variando entre 25 e 50μm. Desta forma a micropipeta atingiu a raiz coclear situada no interior do meato acústico inter- no, passando através do cerebelo. As coordenadas para o PnC foram: ântero-posterior, - 0,32mm; médio-lateral,+1,2mm; dorso-ventral, -0,5mm e micropipetas com pontas de diâme- tro interno de 20μm. Com as coordenadas calibradas, foi marcado o ponto de penetração da micropi- peta no crânio e em seguida realizada uma trepanação de aproximadamente 3mm de diâ- metro, com um micromotor de baixa rotação equipado com broca dental esférica. Após a remoção da dura-máter, a micropipeta foi carregada com uma solução de FG a 4% dissolvi- do em NaCl 0,9% e introduzida no encéfalo de acordo com as coordenadas previamente mencionadas. A injeção do traçador foi realizada por iontoforese, aplicando uma corrente positiva de 3μA de maneira intermitente a cada sete segundos, durante quinze minutos. Na sequência, a micropipeta foi mantida em posição por mais dez minutos antes de iniciar sua lenta e cuidadosa remoção. Este passo é fundamental para evitar o refluxo do traçador e consequentemente a contaminação de estruturas vizinhas. Após a remoção da micropipeta, os tecidos divulsionados foram reposicionados e a incisão fechada com grampos cirúrgicos. Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….35 Em vista das conexões recíprocas que foram encontradas ao longo do desenvol- vimento deste projeto foram necessárias injeções de FG também no grupamento A5 e DR cujas coordenadas faremos a descrição a seguir: As coordenadas para o grupo noradrenérgico A5 foram: ântero-posterior,-1,9mm; médio-lateral, +2,5mm; dorso-ventral, -0,1mm; e micropipetas com pontas de diâmetro inter- no variando entre 15 e 25μm. As coordenadas para o DR foram calibradas a partir do bregma e baseadas no estudo de Gonçalves et al. (2009): ântero-posterior, -5,3mm; médio-lateral, 0,0 (seio sagital); dorso-ventral -7,3mm (a partir do topo da dura-máter) e micropipetas com pontas de diâme- tro interno variando de 20μm. 3.3.2 Procedimentos histológicos e imuno-histoquímica para FG O período de sobrevida pós-cirúrgico foi de 10-14 dias. Passado este período os animais foram anestesiados e perfundidos por via transcardíaca com auxílio de uma bomba perfusora peristáltica ajustada a um fluxo de 30ml/min. Foram perfundidas as seguintes so- luções, nesta ordem: • Solução salina filtrada que garante uma boa lavagem do leito vascular e con- sequentemente a adequada fixação. Esta foi preparada através da dissolução de NaCl a 0,9% em água destilada (150ml, aproximadamente) acrescida de 1 ml de heparina sódica (Hepamax-S® - Blau, 5000U.I.) imediatamente antes da perfusão. A administração da solu- ção salina com heparina foi realizada em temperatura ambiente durante 3 minutos e em quantidade suficiente para permitir um retorno vascular quase transparente. • Solução fixadora filtrada (aproximadamente 1000ml por animal) composta de formaldeído a 4%, recém-preparada a partir de paraformaldeído (Sigma #P6148), glutaral- deído 0,125% em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,4 em temperatura ambiente. Imediatamente antes da perfusão, esta solução foi filtrada e o pH ajustado. O encéfalo foi reduzido com o auxílio de uma matriz para encéfalos (Insigth Ltda) a um bloco que se estendeu desde o núcleo do nervo hipoglosso até o hipotálamo. O bloco de tecido foi crioprotegido por imersão em uma solução de sacarose a 30% em tampão fos- fato 0,1M pH 7,4, em agitação a 4°C durante 48h. Posteriormente, o material foi cortado no plano coronal em secções seriadas de 30μm, obtidas em micrótomo de deslizamento (Leica SM2010R) equipado com platina con- geladora (Physitemp, BFS-30MP). Os cortes foram recolhidos sequencialmente, em uma série de 10 frascos preenchidos com tampão fosfato 0,1M pH 7,4, de maneira que o interva- lo entre os cortes consecutivos de cada frasco foi de 300μm. Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….36 O FG é um traçador autofluorescente que pode ser captado pelos neurônios através do transporte axonal retrógrado e acumulado no pericário (SCHMUED e FALLON, 1986). Embora o FG seja um traçador autofluorescente e não careça de tratamento para ser observado em secções do encéfalo, existem anticorpos comerciais contra FG que permitem a realização de um protocolo de imuno-histoquímica para sua detecção. Este processamen- to adicional justifica-se pelo aumento da sensibilidade e da estabilização da marcação retró- grada obtida, além de permitir o estudo do material no microscópio óptico convencional por tempo indeterminado (CHANG et al., 1990; NODAL e LÓPEZ, 2003). Em todos os casos foram processados os cortes de quatro frascos da série de 10, sendo que os cortes de dois frascos foram contra-corados pelo método de Nissl para referência citoarquitetônica. Antes de iniciar o protocolo para visualizar o FG, foram realizadas duas lavagens de quinze minutos cada, com tampão TBS-TX composto por Tris (Trisma Base, Sigma #T- 6066) 0,05 M pH 7,6 com 0,85% de NaCl e 0,2% de Triton X-100 (Merck #11869). Para vi- sualizar o FG, foram utilizados protocolos baseados no método do complexo avidina biotina peroxidase (ABC - Vectastain Standard, Vector Labs, #PK-4000). Este método utiliza a grande afinidade (constante de dissociação 10-15) que a molécula de avidina apresenta pela molécula de biotina (HSU e RAINE, 1981; HSU et al., 1981b;1981a). O complexo ABC está formado por moléculas de HRP unidas à biotina e estas, às moléculas de avidina. Como a avidina não se encontra saturada pelas moléculas de biotina, o complexo ABC possui a ca- pacidade de unir-se a outras moléculas de biotina que em nossos experimentos se encon- tram na cascata de anticorpos unidos ao FG. O protocolo para visualização imuno-histoquímica do FG foi realizado empre- gando o tampão TBS-TX em todas as soluções, exceto na solução de reação histoquímica. Iniciou-se o protocolo pela inibição da peroxidase endógena durante vinte minutos com uma solução de água oxigenada a 3%. Em seguida, os cortes foram incubados em anticorpo anti- FG (Chemicon, #AB 153), obtido em coelho na concentração de 1:10.000, seguido por um anticorpo secundário biotinilado (Vector Labs, #BA-1000) anti-IgG de coelho produzido em cabra na concentração de 1:200, e pela incubação em complexo ABC. Finalmente, o com- plexo ABC foi visualizado pela reação com a água oxigenada empregando 3,3’ – diamino- benzidina tetrahidrocloreto (DAB, Sigma #D-9015) como cromógeno (HSU et al., 1981b), o qual forma um produto de reação estável de cor marrom. Esta reação foi realizada em tam- pão Tris 0,05 M, pH 7,6 com 0,07% de DAB e 0,003% de água oxigenada. O produto da reação é estável e elétron-denso, podendo ser observado tanto em microscopia óptica quan- to eletrônica de transmissão (REINER et al., 2000; VAN HAEFTEN e WOUTERLOOD, 2000). Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….37 Após o protocolo de imuno-histoquímica, duas séries foram contra-coradas pelo método de Nissl (PAXINOS e WATSON, 2007; KADAR et al., 2009). Este protocolo consiste em realizar a desidratação dos cortes montados em lâminas por meio de banhos de álcool etílico de concentração crescente (de 50% a 100%), dissolução dos lipídeos com dois ba- nhos de xilol, reidratação dos cortes por meio de banhos de álcool etílico de concentração decrescente (de 100% até a água destilada), coloração com violeta de cresil (Sigma #C- 1791) ou tionina (Fisher #T-409), nova desidratação com alcoóis etílicos, imersão em três banhos de xilol e montagem da lamínula com Entellan® (Merck, #7961) como meio de mon- tagem. 3.3.3 Experimento tipo 2 - Controle anterógrado das aferências identificadas ao circuito elementar do RAS: área noradrenérgica A5, núcleo dorsal da rafe e co- nexões recíprocas com o PnC Para confirmar a origem das aferências identificadas nos experimentos de mapeamento retrógrado, realizamos injeções do neurotraçador anterógrado dextrano amina biotinilada (BDA). O BDA é um neurotraçador normalmente utilizado para identificar as afe- rências de uma determinada região, visto que é preferentemente anterógrado. O BDA utili- zado possui peso molecular de 10.000 Daltons e está conjugado com biotina. O procedimento cirúrgico foi semelhante ao já descrito para o experimento tipo 1, modificando-se o neurotraçador (BDA), as coordenadas utilizadas no aparelho estereotáxico e o diâmetro interno da micropipeta de vidro (15 micrômetros). As coordenadas utilizadas para injeção de BDA no núcleo A5, DR e PnC, base- adas no atlas estereotáxico do encéfalo de rato (PAXINOS e WATSON, 2007), foram as mesmas descritas para injeção de FG nos experimentos de tipo 1. O período de sobrevida pós-cirúrgico do animal foi de aproximadamente 10 dias, e os procedimentos de perfusão transcardíaca e corte do material ocorreram da mesma forma descrita para o experimento tipo 1. Os cortes seriados foram processados para visualização do BDA por meio da in- cubação com o complexo avidina biotina peroxidase e reação histoquímica com solução composta de DAB e níquel (níquel amônio sulfato, Sigma #A-1827) como cromógeno (HSU e SOBAN, 1982). Esta reação foi realizada em tampão Tris 0,05 M, pH 8,0 com 0,07% de DAB, 0,003% de água oxigenada e 0,04% de níquel. Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….38 3.3.4 Identificação neuroquímica dos terminais na raiz coclear e núcleo reticu- lar caudal da ponte: imuno-histoquímica para dopamina-β-hidroxilase, transcri- to regulado pela cocaína e anfetamina e serotonina Estes experimentos tiveram como objetivo verificar as identidades neuroquími- cas dos núcleos aferentes aos neurônios da raiz coclear e PnC. Inicialmente foi verificada a existência de terminais axonais adrenérgicos, serotoninérgicos e CART-érgicos na raiz coclear e no PnC. Para elucidar a identidade neuroquímica das aferências confirmadas nos experimentos de tipo 2, realizamos protocolos de imuno-histoquímica em experimentos de co-localização com os traçadores neuronais para marcar a substância neuroativa ou suas enzimas precursoras,ssim como, proteínas que possam ser utilizadas para evidenciar o so- ma e os dentritos dos neurônios do CRN e do PnC.Os protocolos foram realizados utilizando séries de cortes coronais provenientes de casos de experimentos do tipo 2 empregando protocolo de imuno-histoquímica padrão de nosso laboratório descrito no (apêndice A). Nes- te sentido utilizamos os seguintes anticorpos primários: anti-serotonina (rabbit anti- serotonina Immunostar #20080); anti-transcrito regulado pela cocaína e anfetamina (CART) (Phoenix Pharmaceuticals Inc. #55-102, gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Jackson Cioni Bittencourt do Laboratório de Neuroanatomia Química, Instituto de Ciências Biomédicas III, USP-SP); anti-tirosina hidroxilase (rabbit anti-tirosina hidroxilase, Chemicon #AB152) e anti- dopamina beta hidroxilase (mouse anti-dopamina beta hidroxilase, Chemicon #MAB 308). Em alguns casos a Calbindina D-28k foi utilizada como marcador para demonstrar os neu- rônios da raiz coclear e do núcleo reticular caudal da ponte. 3.3.5 Estudo comportamental da avaliação do reflexo auditivo de sobressalto e inibiação por estímulo prévio após lesão seletiva na área noradrenérgica A5 Uma vez que o estudo hodológico se mostrou eficaz em demonstrar a comuni- cação do grupo noradrenérgico A5 com núcleos pertencentes ao circuito elementar do refle- xo auditivo de sobressalto e em face de não existir relatos na literatura sobre o papel deste grupamento com relação ao RAS e a PPI, nos pareceu importante realizar um estudo funci- onal das novas conexões descritas por meio de lesão nesta área e análise comportamental do RAS e da PPI. Primeiramente, antes de realizar os grupos experimentais fizemos experimentos de padronização da cirurgia, concentração e volume do neurotóxico empregado. Foram tes- tados dois neurotóxicos para lesões seletivas no A5: a 6-hidroxidopamina (6-OHDA) (PERESE et al., 1989; THOMAS et al., 1994; BLANDINI e ARMENTERO, 2012) e a droga imunotóxica saporina conjugada a enzima dopamina-β-hidroxilase (DBH-SAP)(TAXINI et al., 2011). Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….39 Após a etapa inicial de padronização, comprovamos ser mais eficiente e cons- tante a lesão realizada com 6-OHDA na concentração de 3 µg/µl diluído em ácido ascórbico a 0,2 µg/µl, injetada bilateralmente com volume de 100 nanolitros durante 10 minutos. Para estes experimentos foi utilizada uma seringa de 10 µl (Hamilton 1700 series) controlada por uma bomba de microinjeção (micropump III – WPI) com ponta em aço de 60 µm de diâmetro interno. Finalizada esta etapa de padronização iniciamos os experimentos de lesão e avali- ação comportamental. Os animais destinados aos experimentos de lesão e avaliação comportamental passaram inicialmente por um período de habituação a prova, que consistiu em acondicionar os animais na caixa de sobressalto, uma vez por dia, por 5 minutos com exposição a um ruído de fundo branco de 60dB, durante três dias consecutivos. Uma vez habituados ao pro- cedimento, os animais foram submetidos a um teste inicial de mensuração do reflexo auditi- vo de sobressalto (RAS) e inibição por estímulo prévio (PPI). Com base na análise desta prova inicial, verificou-se a manifestação de respostas válidas de RAS e PPI, o que era de- terminante para seleção do animal. Portanto somente animais que respondiam às provas comportamentais foram selecionados para este estudo. Os animais foram distribuídos em dois grupos comportamentais, sendo um grupo lesão (LESÃO/RAS+PPI) no qual foi realiza- da a cirurgia estereotáxica e injeção do neurotóxico (6-OHDA) nas coordenadas estereotáxi- cas utilizadas para injeção dos traçadores neuronais no A5 (item 3.3.1), e um grupo controle da lesão (SHAM/RAS+PPI) no qual os animais passaram pela mesma cirurgia estereotáxica, porém sem a injeção do neurotóxico. Para evitar a lesão da membrana timpânica ou até mesmo os ossículos da audição, o que prejudicaria a avaliação do RAS e da PPI, nestes experimentos os animais foram posicionados no aparelho estereotáxico empregando barras auriculares desenhadas para animais de porte maior como gatos e macacos (David Kopf, #951), o que eliminava a possibilidade de lesão mecânica no tímpano, o que era comprova- do ao final de cada cirurgia com o exame do meato acústico externo (Figura 5, as barras nos foram gentilmente fornecidas pelo Prof. Dr. Cláudio Aparecido Casatti do Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, UNESP-SP). Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….40 O primeiro dia antes da lesão foi chamado de dia zero (pré-lesão), no qual os animais (8 por grupo) passaram por uma prova de sobressalto e em seguida era realizada a cirurgia para ambos os grupos (Lesão ou Sham). Os dados deste momento são interessan- tes para comparar o comportamento antes e depois do tratamento Posteriormente, o RAS e a PPI foram avaliados nos momentos 7, 14 e 21 dias após a lesão. No 21° dia, após a avali- ação comportamental, os animais foram sacrificados por perfusão transcardíaca, e o encéfa- lo foi pós-fixado e e processados para avaliação histológica do A5 pelas técnicas de Nissl e imuno-histoquímica para DBH e para a proteína c-Fos. O desenho experimental das provas comportamentais está ilustrado na Figura 6. Figura 5 Comparação entre as barras auriculares para ratos e para gatos. Em A fotografia de vista lateral do crânio de rato a seta aponta o meato acústico externo. Em B barras de fixação auricular. O asterisco marca a barra para gatos utilizada nos experimentos de lesão do A5. Em C e D comparação entre o diametro da ponta das barras e o meato acústico externo. Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….41 Figura 6 Desenho experimental dos experimentos de lesão do A5 e avaliação comportamental do RAS e PPI. A mensuração do RAS e da PPI foi realizada utilizando o sistema de avaliação do sobressalto da empresa Insight (Equipamentos Científicos Ltda.) que integra dispositivos de aquisição de quantidade de movimento do animal e dispositivos para a geração dos es- tímulos sonoros. O sistema é constituído por duas câmaras de prova com isolamento acústi- co, nas quais há uma plataforma de medição localizada a 9cm dos alto-falantes e um siste- ma gerador de estímulos sonoros controlados por software que estão conectados a um computador (Figura 7). A quatificação do RAS é realizada por um sensor, localizado abaixo da gaiola de prova, que registra a variação de peso do animal durante e após a estimulação acústica, visto que a resposta pode ser caracterizada por um movimento balístico. Figura 7 Foto do sistema de avaliação do sobressalto. Em A, interior da câmara de prova com isolamento acústico, na qual de observa a plataforma de captação do movimento do animal, o alto-falante responsável pela geração do ruído de fundo, pré-pulso e pulso, bem como luz ambiente e câmera de vídeo para acompanhamento de toda a sessão via computador. Em B, animal posicionado na gaiola de prova do reflexo, fixada à plataforma de medição. As avaliações do RAS e da PPI são realizadas em sessões que duram cerca de 40min. Durante toda sessão as câmaras (Figura 7) são mantidas com ventilação constante, luzes acessas e os animais são monitorados através do computador por uma câmera de vídeo instalada dentro da câmara de prova. Para aferição das intensidades de ruído de fundo e dos estímulos acústicos utili- zados nas sessões, foi utilizado um decibelímetro digital (medidor de nível de pressão sono- Origem de aferências monoaminérgicas e CART-érgicas ao circuito do reflexo auditivo de sobressalto........….42 ra, modelo DEC-460, Instrutherm Ltda., calibração interna 94,0dB), colocado sobre a plata- forma de medição na mesma posição na qual é afixada a gaiola de prova. Para aferição do ruído de fundo, o decibelímetro foi usado nas configurações Speed SLOW e dB low, en- quanto que para aferição dos estímulos acústicos (pré-pulsos e pulsos) as configurações foram Speed FAST e dB hi, seguindo as especificações do fabricante. Foram construídas curvas de calibração do ruído de fundo e dos estímulos acústicos de dois tipos: ruído branco e tons puros. Os tons puros foram calibrados nas frequências de 2kHz, 4kHz e 18kHz, que representam estímulos de baixas, médias e altas frequências, respectivamente, e compre- endem grande parte do espectro auditivo do rato. Os estímulos acústicos do tipo ruído bran- co foram utilizados como desencadeadores do reflexo de sobressalto e os estímulos de tom puro de 4kHz foram utilizados como pré-pulsos, variando sua intensidade. A avaliação do RAS/PPI consistiu de 6 tipos de apresentação de estímulos, des- critos na Quadro 1. Em cada prova, foram apresentados 65 estímulos no total. Os cinco mi- nutos iniciais da prova corresponderam ao período de habituação do animal à condição ex- perimental, que possuia o ruído de fundo de 60dB ligado, assim como durante toda a ses- são. O ruído de fundo, apresentado durante toda a sessão, é importante para normalizar o ruído ambiente na câmara de prova. O intervalo entre as tentativas foi de 30s±10, determi- nado randomicamente pelo programa do equipamento. As cinco primeiras tentativas de estimulação isolada (Bloco Treino) eram apre- sentadas no ínicio da sessão e excluídas do cálculo da média do RAS. Os blocos de estímu- los consistiram de um pulso de ruído branco, 113dB, 20ms de duração (Bloco Estímulo so- zinho), e esse mesmo estímulo precedido, com intervalos interestímulos diferentes, por um pré-pulso em tom puro (4kHz) de 70dB e 20ms de du