UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA VIVIAN CRISTINA NORONHA NOVAES “Influência do 5-Fluorouracil nos tecidos periodontais normais e sobre a evolução da doença periodontal experimental induzida.’’ ARAÇATUBA – SP 2013 UNESP UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE ODONTOLOGIA DE ARAÇATUBA VIVIAN CRISTINA NORONHA NOVAES “Influência do 5-Fluorouracil nos tecidos periodontais normais e sobre a evolução da doença periodontal experimental induzida’’ Orientador: Prof. Dr.Juliano Milanezi de Almeida Coorientador: Prof. Dr.Valdir Gouveia Garcia ARAÇATUBA – SP 2013 UNESP Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba - UNESP, para a obtenção do Título de MESTRE EM ODONTOLOGIA (Área de Periodontia). Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca da FOA / UNESP Novaes, Vivian Cristina Noronha. N935i Influência do 5-fluorouracil nos tecidos periodontais normais e sobre a evolução da doença periodontal experimental induzida Vivian Cristina Noronha Novaes. - Araçatuba, 2013 114 f.: il. ; tab. + 1 CD-ROM Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Odontologia de Araçatuba Orientador: Prof. Dr. Juliano Milanezi de Almeida Coorientador: Prof. Dr. Valdir Gouveia Garcia 1. Perda óssea alveolar 2. Doenças periodontais 3. Quimio- terapia 4. Defeitos da furca 5. Modelos animais Black D7 CDD 617.64 Dados curriculares Vivian Cristina Noronha Novaes Nascimento: 15.07.1972 Penápolis- SP Filiação: Adroaldo Mauro Ribeiro Noronha Lilian Marcia Marques Navarro 1991-1995: Curso de Graduação em Odontologia Faculdade de Odontologia de Lins 1996-1997: Curso de Especialização em Periodontia Universidade Metodista de São Paulo - UMESP 2011-2013: Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Odontologia Área de Periodontia Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP À Deus Dedicatória Neste momento ofereço esta conquista à Deus, que me deu força e persistência para ultrapassar todos os obstáculos encontrados, iluminando meu caminho em todos os momentos em que precisava de luz, não permitindo que eu desistisse nesta longa caminhada. Obrigada meu Deus por colocar ao meu lado uma família amorosa e compreensiva, amigos acolhedores e professores generosos. Com eles pude vivenciar momentos maravilhosos de aprendizado e crescimento pessoal. Obrigada Senhor por todas as graças concedidas e por cada momento que esteve comigo, protegendo-me e guiando-me nesse longo caminho de grandes realizações. Devo a Ele todos os momentos de alegria e sucesso até aqui conquistado. Minha eterna gratidão por mais esta benção em minha vida! “Tudo posso naquele que me fortalece” (Filipenses 4:13) Dedicatória Dedico especialmente este trabalho ao meu maridoPedro , meu eterno amor, Você viveu comigo todas as emoções deste curso de mestrado que hoje termino. Sem seu imenso amor eu não teria conseguido. Sou grata pelo seu companheirismo e carinho. Seu incentivo, atenção e proteção tornam essa caminhada mais segura e tranquila. Obrigada por compreender minhas escolhas e tornar possível esta conquista. Você foi a minha força nas vezes que fraquejei. Seu estímulo foi fundamental para cada conquista. Você acreditou em mim até mesmo quando eu já não acreditava. Sou feliz por ter você em minha vida. Te amo sempre. “Assim como viver sem teu amor não é viver Não há você sem mim e eu não existo sem você.” (Eu não existo sem você - Tom Jobim e Vinícius de Moraes) Ao Meu Marido Dedicatória Ás minhas amadas filhas Laura e Helena. Vocês são minha alegria e razão de viver. O sorriso de vocês me dá forças para continuar caminhando, mesmo quando não sei o caminho. Vocês trouxeram para minha vida um significado maior, mudando meus valores, prioridades e urgências. A cada dia tento aprender com vocês a mais importante e bela das profissões, ser mãe. Reconheço que também se sacrificaram para esta conquista. Mudaram sua rotina, sofreram com minha ausência e de alguma forma compreenderam o meu momento. Dedico a vocês, minhas filhas queridas, este trabalho e o meu amor eterno e infinito! “O Amor é a única coisa que cresce à medida que se reparte.” (O Pequeno Príncipe – Antoine de Saint –Exupéry) Às Minhas Filhas À Minha Irmã À Minha Irmã Dedicatória Á minha mãe Lilian (in memorian) ,ao meu pai Adroaldo. Ambos me deram o sustentáculo para a vida. Devo a vocês minha formação humana e profissional. Os exemplos de responsabilidade, trabalho, respeito e solidariedade me tornaram uma pessoa capaz de amar e ser feliz. Foi o incentivo em ir além, que sempre recebi de vocês, tendo em mente que através do esforço do nosso trabalho podemos alcançar grandes conquistas que me fizeram chegar à este momento. Compartilho com vocês os méritos desta conquista. Estarão sempre em meu coração. Aos Meus Pais À Minha Irmã À Minha Irmã Dedicatória Família Noronha, ,Família Navarro e Família Novaes Dedico este trabalho às minhas famílias entrelaçadas pelo amor e comprometimento. Obrigada pelas orações e carinho. Sou especialmente grata pelo apoio constante ao meu marido Pedro e pelo acolhimento às minhas filhas Laura e Helena nos momentos que não pude estar completamente presente. A toda a minha família, obrigada por caminharem ao meu lado! Mesmo distante, de alguma forma fizeram parte desta conquista. “Muitas vezes basta ser: Colo que acolhe, braço que envolve, palavra que conforta, silêncio que respeita, alegria que contagia, lágrima que corre, olhar que acaricia, desejo que sacia, amor que promove.” (Cora Coralina) Aos Meus Familiares À Minha Irmã À Minha Irmã Agradecimentos especiais Ao meu orientador Professor Dr. Juliano Milanezi de Almeida, por aceitar ser meu orientador e pela sua infinita paciência, disponibilidade e humildade. A distância do início não foi um empecilho devido a essas qualidades. Você é um professor cativante, inteligente e um exemplo de pesquisador. Durante meu mestrado tive o prazer de vê-lo ingressar como professor concursado nesta faculdade e de vibrar com sua conquista, da qual sinto muito orgulho. Com a convivência diária pude conhecer sua personalidade gentil e atenciosa. Mais que meu orientador, você se tornou um grande amigo. Sua responsabilidade e cuidado comigo foram fundamentais para que eu conseguisse concluir esse trabalho, sempre disposto a me atender em todos os momentos. Obrigada por contribuir inestimavelmente para a execução deste estudo. Obrigada pela sensibilidade em apontar meus erros e novos desafios, me ajudando a vencê-los. Minha sincera gratidão e admiração por você. Ao meu coorientador Prof. Dr. Valdir Guveia Garcia, pela confiança depositada em mim, por ter-me orientado durante toda esta caminhada e compartilhando comigo algo que não tem preço: Conhecimento. O senhor esteve comigo no início de minha vida acadêmica, e foi a inspiração para uma de minhas escolhas mais importantes na vida profissional. Com muito orgulho digo que fui sua aluna. O destino nos reaproximou depois um longo tempo e neste reencontro o senhor me ofereceu uma oportunidade nova, ampliando definitivamente meu horizonte. Além disso, quando ingressei no curso de mestrado deixou sob minha responsabilidade o seu projeto, um tesouro intelectual de valor inestimável e confiou que eu seria capaz de executá-lo. Este fato me comove e mostra a dimensão de sua Generosidade! Sou grata por todas as suas orientações e conselhos que vão além do âmbito científico, sempre com uma postura humilde e acolhedora. O seu exemplo como professor e pesquisador sempre irão me acompanhar. Muito obrigada pela oportunidade e por ter contribuído para este momento se tornar realidade! Agradecimentos especiais À Prof.a Dra. Letícia Helena Theodoro, muito obrigada pelas oportunidades concedidas e pelos ensinamentos transmitidos. Além de todo reconhecimento pela sua ajuda, disponibilidade e companheirismo. Sua extrema competência contribuiu para a concretização dessa dissertação. De maneira discreta, porém decisiva, esteve presente em todos os momentos críticos dessa minha caminhada. Como professora é um exemplo de serenidade, humildade e dedicação ao ensino e pesquisa. Ter a oportunidade de vê-la ingressar nesta faculdade foi uma grande alegria! Admiro-lhe pela forma tranquila e competente com que conduz tudo que faz, sempre com um grande sorriso no rosto. Exemplo de mulher forte e inteligente. Conviver com você foi um presente, obrigada por tudo! À Profa. Dra. Suely Bonfim, e sua equipe do Curso de Medicina Veterinária. Agradeço pela grande colaboração profissional, contribuindo para a elaboração e execução desse trabalho. Professora apaixonada pelo que faz, competente e profissional. Em muitas ocasiões esteve pessoalmente realizando nosso experimento, dividindo o tempo que dedica a sua família para nos ajudar. Obrigada pelo convívio agradável e carinhoso. É sempre um prazer estar em sua companhia! Ao Prof. Dr. Edilson Ervolino, sou grata pela presença real, constante e segura na etapa final desse trabalho. Seu extremo cuidado com as análises histológicas e imunoistoquimicas aprimoraram brilhantemente os resultados desse estudo, no qual sua dedicação foi além do que de costume. Obrigada pela presença sempre tranquila, transmitindo com paixão seus conhecimentos de ciência e histologia e pela dedicação e contribuição neste trabalho. Agradecimentos especiais Ao Prof. Álvaro Bosco. Que prazer poder conviver com o senhor nos nossos encontros semanais! Pude apreciar toda sua sabedoria e técnica, transmitidas de forma primorosa e humilde! Além de ser um dos grandes nomes da periodontia, o senhor é um ser humano espetacular e agradeço pela oportunidade de poder estar presente em alguns momentos. Aqueles que além de transmitir os conhecimentos inerentes a profissão, nos ensinam os caminhos da vida e como percorre-los são os que chamamos de Mestres. O senhor é um Mestre! Meu muito obrigado! À Profa. Dra Maria José Hitomi Nagata, agradeço por ter me concedido a oportunidade de estudar nesta casa, referência de grandes nomes da periodontia nacional, para que eu pudesse aprimorar meus conhecimentos na especialidade que tanto amo. Também agradeço por apoiar meus primeiros passos nessa fascinante caminhada e mostrar-se disponível quando necessário. Professora exemplo de dedicação à pesquisa e à docência, estando sempre empenhada com o crescimento do programa de Pós-graduação desta instituição. Receba minha gratidão, carinho e admiração neste momento. “Ensinar não é transferir conhecimento, mas criar possibilidades para a sua produção ou a sua construção. Quem ensina aprende ao ensinar e quem aprende ensina ao aprender.” (Paulo Freire) Agradecimentos especiais Ao meu amigo Erivan, serei eternamente grata por tudo que fez por mim. Conviver com você é um eterno aprendizado e agradeço por tudo o que me ensinou. E olha que foi quase tudo! Admiro sua inteligência, perseverança e capacidade de superação. Você é uma pessoa com coração imenso, que sente prazer em ajudar e se alegra com as conquistas alheias como se fossem próprias! Obrigada pela preocupação e carinho com que sempre me tratou. Obrigada pela ajuda em tempo integral, por me ouvir sempre que precisei e pelos conselhos pertinentes. Meu grande e querido amigo, que levarei no coração pela vida toda. Deus te guarde e que seu futuro seja brilhante! Á minha amiga Mariellen, garota de ouro! Talentosa e brilhante, sempre disposta e prestativa. Com uma maturidade impressionante e um bom humor inabalável, me ensinou muito do que eu precisava. Você é uma garota muito especial, que traz orgulho para todos com que convive. Cativou meu coração e está nas minhas orações. Suas futuras conquistas serão motivo de muita alegria! Torço por você! Obrigada por toda a ajuda em todas as etapas deste trabalho e pela convivência de carinho e respeito. Estar em sua companhia é sempre uma alegria. Jamais teria feito meu trabalho sem você! À amiga Natália de Campos, um anjo! Querida, doce e carinhosa, com quem sempre contei. Nem mesmo as grandes tristezas da vida apagaram seu lindo sorriso. Sempre pronta a ajudar e organizar tudo! Obrigada por me ajudar em alguns momentos difíceis. Obrigada pela deliciosa companhia de viagem e por sua amizade sincera e verdadeira. Você merece toda a felicidade do mundo! À amiga Paula. pessoa prestativa que me ajudou sempre que pode. Você está sempre atenta a todos os detalhes, empenhada em aprender e executar tudo com perfeição para obter os melhores resultados. Torço por você! Obrigada pela ajuda, companhia, boas risadas e grandes dicas. Agradecimentos especiais À amiga Natália Pola, obrigada pela disponibilidade e companheirismo na periodontia. Não me esqueço de que foi a primeira pessoa que carinhosamente me acolheu e me ajudou a começar entender o mundo novo que estava pela frente. Boa sorte e sucesso em sua caminhada. À amiga Carol, obrigada pelas dicas valiosas e pela companhia. Sempre gentil e sorridente, sua energia positiva contagia à todos. É sempre bom estar ao seu lado. Com carinho te desejo um futuro próspero e brilhante. Ao Luiz Henrique (Bizola), obrigada por toda ajuda na parte experimental, sua chegada fez muita diferença! Espero ter transmitido a você um pouco do que aprendi e que seu futuro acadêmico seja de muito sucesso. Você merece! Aos novos colegas da periodontia, Fabrizio, que veio de longe e me ajudou nesta etapa final, sempre muito alegre, prestativo e competente. Naida e Adriele obrigada pela alegre convivência. Boa sorte nesta nova etapa e que seus sonhos se realizem! Ao Joilson, muito gentil e atencioso, me ajudou diversas vezes, esclarecendo os caminhos burocráticos que deveriam ser seguido. Obrigada! Agradecimentos especiais A todos os professores do mestrado, Vocês foram importantes e contribuíram muito em todo meu aprendizado e caminhada durante estes anos. À todos os colegas de mestrado, Agradeço pela oportunidade de conhecer pessoas maravilhosas e pela amizade criada neste período. Agradecimentos À Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP, nas pessoas do ex Diretor Prof. Titular Pedro Felício Estrada Bernabé e da Senhora Vice-Diretora Profa. Adj. Ana Maria Pires Soubhia, e atuais Diretor Profa. Adj. Ana Maria Pires Soubhia e Vice-Diretor Prof. Adj. Wilson Roberto Poi por proporcionar a realização desta pesquisa e pelos anos de graduação, pós-graduação e crescimento profissional. À atual coordenação do Curso de Pós-Graduação em Odontologia, na pessoa da Professora Maria José Hitomi Nagata, por sua dedicação ao Curso e gosto pela docência. Aos colegas do Curso de Mestrado do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, nas Áreas de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial, Integrada, Estomatologia, Dentística e Prótese Dental. Aos Funcionários do Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada - Cleide, Dirce, Gilmar e Paulo obrigada pela ajuda e disposição. A todos os funcionários e estimados amigos da Biblioteca da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP, Ana Claudia Grieger Manzatti, Cláudio Hideo Matsumoto, Claúdio Marciel Júnior, Fernando Fukunishi, Ivone Rosa de Lima Munhoz, Izamar da Silva Freitas, Luzia Anderlini e Maria Cláudia de Castro Benez, pela atenção e eficiência com que sempre me atenderam. Agradecimentos Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Araçatuba - UNESP, Diogo Reatto, Marina Midori Sakamoto Hawagoe, Lilian e Valéria Queiroz Marcondes Zagatto, pelo excelente trabalho, atenção dispensada, grande disposição em atender e ótimo relacionamento. A todos os funcionários de todos os setores da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, por proporcionarem o conforto e o bom funcionamento desta instituição Aos funcionários e professores do Departamento de Ciências Básicas, da Faculdade de Odontologia de Araçatuba – UNESP, por sempre me acolherem tão bem. Aos funcionários do Biotério, Camilo, Arnaldo, que contribuíram para realização da parte experimental. Ao Sr. Odair, sempre dispostos a nos ensinar e ajudar, obrigada pela constante disposição e convivência. A Dirce, sempre dispostos a nos ensinar e ajudar, obrigada pela constante disposição e convivência. Aos professores da Pós Graduação da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba – UNESP, pelos ensinamentos durante todo o decorrer do curso. Aos pacientes, que nos depositando confiança, deram-nos a oportunidade de aprender e a satisfação de tratá-los no decorrer deste curso. Agradecimentos Aos animais, por servir à humanidade com suas vidas. À CAPES, pela concessão da Bolsa de Mestrado À FAPESP pela concessão do Auxílio à Pesquisa (Processo n° 2011/03021-3) para realização deste trabalho. A todos aqueles que, de alguma forma, contribuíram durante todo o decorrer do curso e que passaram em minha vida e colaboraram no desenvolvimento da pessoa que hoje sou. Finalmente, agradeço à Deus, ser superior, por ter me concedido essa oportunidade e ter colocado todas essas pessoas maravilhosas em meu caminho. OBRIGADA! Epígrafe “A verdadeira viagem de descobrimento não consiste em procurar novas paisagens, mas em ter novos olhos.” (Marcel Proust) Prefácio “Porque qualquer um, independente das habilitações que tenha, ao menos uma vez na vida fez ou disse coisas muito acima da sua natureza e condição, e se a essas pessoas pudéssemos retirar do quotidiano pardo em que vão perdendo os contornos, ou elas a si próprias se retirassem de malhas e prisões, quantas mais maravilhas seriam capazes de obrar, que pedaços de conhecimento profundo poderiam comunicar, porque cada um de nós sabe infinitamente mais do que julga e cada um dos outros infinitamente mais do que neles aceitamos reconhecer.” José Saramago (A Jangada e a Pedra) Resumo Novaes, VCN. Influência do 5-Fluorouracil nos tecidos periodontais normais e sobre a evolução da doença periodontal experimental induzida. [Dissertação]. Araçatuba: UNESP – Universidade Estadual Paulista; 2013. O presente estudo avaliou por meio de análise histomorfometrica, imunoistoquimica e da Fosfatase Alcalina (FA) os efeitos do quimioterápico 5-fluorouracil (5-FU), nos tecidos periodontais normais, na evolução da periodontite experimental (PE) e no tratamento periodontal mecânico de Raspagem e Alisamento Radicular (RAR). Foram tratados 150 ratos, dos quais 92 foram utilizados e divididos aleatoriamente em 6 grupos submetidos aos seguintes tratamentos: Grupo C (n=24) - animais não tratados com 5- FU, sem PE, área contralateral dos Grupos PE e PE + RAR que foram utilizadas como controle negativo. Grupo PE (n=16) – animais portadores da PE. Grupo PE + RAR (n=18) – animais portadores da PE e tratados localmente pela técnica da RAR. Grupo 5- FU (n=24) - animais tratados sistemicamente com 5-FU. Grupo 5-FU + PE (n=16) - animais tratados sistemicamente com 5-FU, com indução PE. Grupo 5-FU + PE + RAR (n=18) - animais tratados sistemicamente com 5-FU, portadores da PE e tratados localmente com RAR. A PE foi induzida pela adaptação de um fio de algodão ao redor do primeiro molar inferior esquerdo. Nos animais dos grupo 5-FU, 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR o 5-FU foi administrado no momento da indução da PE e após 48 horas. Após 7 dias da evolução da PE, nos animais dos grupos PE, PE + RAR, 5-FU + PE e 5- FU + PE + RAR a ligadura foi removida e os grupos PE + RAR e 5-FU + PE + RAR foram tratados localmente com RAR. Os animais foram eutanasiados aos 7, 15 e 30 dias após a remoção da ligadura. Foram obtidos cortes seriados de 4 μm de espessura no sentido mésio-distal e corados com Hematoxilina e Eosina ou Tricrômico de Masson. A porcentagem de osso na furca (POF) foi avaliada por análises histomorfométrica e foram realizadas a análise dos padrões de imunomarcação para RANKL, OPG e TRAP. Para análise hematológica, foram obtidas amostras sanguíneas antes do início dos protocolos de tratamento, após 7 dias e nos períodos de eutanásia. Foram avaliados os Leucócitos Totais (LT), neutrófilos e os níveis de FA. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística (p<0,05). Observou-se que os animais do grupo 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR apresentaram menor POF, maior infiltrado inflamatório e maior padrão de imunomarcação de RANKL quando comparados aos grupos PE e PE + RAR. Os animais dos grupos C e 5-FU não apresentaram diminuição da POF. Os animais dos grupos 5-FU, 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR apresentaram redução dos LT e neutrófilos após tratamento com 5-FU. Somente os animais do grupo C não apresentaram alteração dos níveis de FA. Dentro os limites do presente estudo pode-se concluir que o 5-FU influenciou na evolução da PE, no tratamento da PE e não induziu alterações no periodonto saudável. Palavras chaves: perda óssea alveolar; doenças periodontais; quimioterapia; defeito de furca; modelos animais. Abstract Novaes, VCN. Influence of 5-Fluorouracil in the normal periodontal tissues and in the evolution of experimentally induced periodontitis. [Dissertation]. Araçatuba: UNESP – São Paulo State University; 2013. The present study evaluated by histomorphometric, immunohistochemistry and Alkaline Phosphatase (ALP) analysis the effects of the chemotherapeutic 5-fluorouracil (5-FU), in the normal periodontal tissues, in the evolution of experimental periodontitis (EP) and in the mechanical periodontal treatment Scaling and Root Planing (SRP). 150 rats were treated, of which 92 were used and randomly divided into 6 groups of the following treatments: Group C (n = 24) - animals not treated with 5-FU without PE, contralateral area of groups EP and EP + SRP that were used as negative control. EP group (n = 16) - animals with EP. Group EP + SRP (n = 18) - animals with EP and treated locally by SRP. Group 5-FU (n = 24) - animals treated systemically with 5-FU. Group 5-FU + EP (n = 16) - animals treated systemically with 5-FU and with EP induction. Group 5-FU + EP + SRP (n = 18) - animals treated systemically with 5-FU, with EP and treated locally with SRP. The EP was induced by placing a cotton thread around the left mandibular first molar. In the animals of the groups 5-FU, 5-FU + EP and 5-FU + EP + SRP, 5-FU was administered at the time of induction of EP, and after 48 hours. After 7 days of evolution of EP, the animals of groups EP, EP + SRP, 5-FU + EP and 5-FU + EP + SRP, the ligature was removed and the groups PE + SRP and 5-FU + EP + SRP were treated locally with SRP. The animals were sacrificed at 7, 15 and 30 days after removal of the bandage. Were obtained from serial sections of 4 mm thick in the mesio-distal and stained with Hematoxylin and Eosin or Masson's Trichrome. The Percentage of Bone in the Furcation (PBF) was evaluated by histomorphometric analysis were performed and the analysis of patterns of immunostaining for RANKL, OPG and TRAP. For hematological analysis, blood samples were obtained before the start of treatment protocols, and after 7 days and in the euthanasias. Total leukocytes were evaluated (LT), neutrophils and levels of ALP. The data were subjected to statistical analysis (p <0.05). It was observed that the animals in the groups 5-FU + EP and 5-FU + PE + SRP showed lower PFB, greater inflammatory infiltrate and increased immunostaining pattern of RANKL compared to groups EP and EP + SRP. The animals in groups C and 5-FU showed no decrease in PFB. The animals in groups 5-FU, 5-FU + SRP and 5-FU + EP + SRP showed decreased in the neutrophil numbers and in the LT after treatment with 5-FU. Only animals in group C did not change the levels of ALP. Within the limits of this study it can be concluded that 5-FU influenced the evolution of EP in the treatment of EP and did not induce changes in periodontal health. Key words: alveolar bone loss, periodontal disease; chemotherapy; furcation defect; animal models. Lista de Tabela Manuscrito para publicação Tabela 1 Médias e desvio padrão (M±DP) dos dados histométricos da POF (%) do primeiro molar inferior com PE ou não, de acordo com cada grupo, tratamento e período. Média e desvio padrão (M±DP) de TRAP-positiva (célula/mm2) do primeiro molar inferior com PE ou não, de acordo com cada grupo, tratamento e período. 88 Lista de Figuras Manuscrito para publicação Figura 1 A: gráfico referente à quantidade de LT em todos os grupos no período -7 e 0 dias. B: gráfico referente à quantidade de neutrófilos de todos os grupos no período de -7 e 0 dias. C: gráfico referente aos níveis séricos de fosfatase alcalina em todos os grupos nos períodos de -7, 0, 7, 15 e 30 dias. 90 Figura 2 Fotomicrografias evidenciando o efeito do 5-FU sobre os tecidos periodontais. A-C: dente e periododnto de ratos sem tratamento com 5-FU. D- F: dente e periodonto de ratos comtratamento de 5- FU. As características histológicas do periododnto dos ratos não tratados (G I) e dos tratados (G IV) com normalidade. Abreviações e símbolos: pd, polpa dental; oa, osso alveolar; , ligamento periodontal; setas pretas, cemento. Coloração: hematoxilina e eosina (HE). Barra de escala: 500 μm. 91 Lista de Figuras Manuscrito para publicação Figura 3 Fotomicrografia evidenciando o efeito do 5-FU sobre a evolução da periodontite experimental. A- C: características histopatológicas da região de furca do primeiro molar inferior de ratos sem tratamento com 5-FU e com periodontite experimental após 7, 15 e 30 dias da remoção da ligadura. D-F: características histopatológicas da região de furca do primeiro molar inferior de ratos tratados com 5-FU e com periodontite experimental após 7, 15 e 30 dias da remoção da ligadura. A pequena porcentagem de osso na furca (POF) e a magnitude da resposta imune inflamatória expressam a maior severidade da periodontite experimental nos ratos tratados com 5- FU (G V) em comparação com os não tratados (G II). Abreviações e símbolos: pd, polpa dental; ao, osso alveolar; on, osso necrosado; *, infiltrado inflamatório. Coloração: hematoxilina e eosina (HE). Barras de escala: 500 μm. 92 Figura 4 Fotomicrografias evidenciando a influência do 5- FU sobre a evolução da periodontite experimental após o tratamento de raspagem e alisamento radicular. A-C: características histopatológicas aos 7, 15 e 30 dias da região de furca do primeiro molar inferior de ratos sem tratamento com 5-FU cuja periodontite experimental foi tratada através da respagem e alisamento radicular. D-F: características histopatológicas aos 7, 15 e 30 dias da região de furca do primeiro molar inferior de ratos tratados com 5-FU cuja periodontite experimental foi tratada através da raspagem e alisamento radicular. A resposta dos tecidos periodontais à raspagem e alisamento radicular é mais favorável em G III do que em G VI. Em G VI a resposta imune inflamatória persiste por mais tempo, o que compromete o processo de reparação tecidual. Abreviações e símbolos: pd, polpa dental; ao, osso alveolar; on, osso necrosado; *, infiltrado inflamatório. Coloração: hematoxilina e eosina (HE). Barra de escala: 500 μm. 93 Figura 5 Imunomarcação para TRAP, RANKL e OPG na região de furca do primeiro molar inferior. Fotomicrografias evidenciando o padrão de imunomarcação para TRAP (setas azuis), RANKL (setas vermelhas), e OPG (setas pretas) em G I (A- C), G IV (D-F), G V (G-I), G VI (J-L). Notar imunomarcaçõa similar para TRAP, RANKL e OPG em G I e G IV> Observar a alta quantidade de células TRAP-positivas e o alto padrão de imunomarcação para RANKL em G V (G-I) e G VI (J-L). O padrão de imunomarcação para OPG se mostrou semelhante em G I, G IV, G V e G VI. Abreviações e símbolos: ao, osso alveolar; setas azuis, osteoclastos TRAP-posistivos; setas vermelhas, células RANKL-positivas; setas pretas, células OPG-positivas. Contra-coloração: hematoxilina. Barras de escala: 20 μm. 94 Figura 6 (a) representação dos escores de imunomarcação de OPG de acordo com cada grupo e período. (b) representação dos scores de imunomarcação de RANKL de acordo com cada grupo e período. 95 Lista de Abreviaturas e Siglas AF - área total da furca. ANOVA – Análise de Variância. AO - área ocupada por tecido ósseo. CEUA – Comissão de Ética no Uso de Animais DP - Doença Periodontal. DNA - Ácido desoxiribonucleico. EDTA - Ácido Etilenodiaminotetracético. FdUMP - monofosfato de fluorodesoxiuridina. FA – Fosfatase Alcalina g – Grama. H&E - Expressa a técnica de coloração das lâminas. Hematoxilina e Eosina. LT – Leucócitos Totais. mg – Miligramas. mg/Kg - Miligramas por quilogarmas. mm2 – Milímetros quadrado. mL - Mililitros, equivalente à milésima parte do litro. μm – Micrometros. Lista de Abreviaturas e Siglas OPG – Osteoprotegerina. PE – Periodontite experimental. POF - Porcentagem de Osso na região de Furca. TM - Expressa a técnica de coloração das lâminas. Tricrômico de Masson. TRAP - Fosfatase Ácida Tartarato Resistente. RAR - Raspagem e Alisamento Radicular. RANKL - Receptor ativador de NF-Kappa B ligante. RNA - Ácido ribonucleico mensageiro. 5-FU – 5 Fluorouracil. Lista de Anexos Anexo A Certificado da Comissão de Ética na Experimentação Animal (CCEA). 97 Anexo B Delineamento do Estudo. 98 Anexo C Figura representativa da metodologia adotada para análise da histometria e campo de análise para contagem das células TRAP. 98 Anexo D Normas de publicação segundo o Periódico ‘’Journal of Clinical Periodontology ‘’. 99 Sumário Sumário Manuscrito para publicação 46 Página de título 47 Resumo 48 Introdução 50 Materiais e Métodos 54 Resultados 63 Discussão 72 Agradecimentos 79 Referências 80 Anexos 96 Manuscrito para Publicação 1 1 Normalização Segundo a Revista Journal of Clinical Periodontology. Campus de Araçatuba Título Influência do 5-Fluorouracil nos tecidos periodontais normais e sobre a evolução da doença periodontal experimental induzida. Autores: Vivian Cristina Noronha Novaes 1, Juliano Milanezi de Almeida 1, Valdir Gouveia Garcia 1,2,*. 1UNESP - Univ Estadual Paulista; Department of Surgery and Integrated Clinic - Division of Periodontics; Araçatuba, São Paulo, Brazil. 2University Center of the Educational Foundation of Barretos (UNIFEB), Barretos, SP, Brazil. *Corresponding author: Valdir Gouveia Garcia Address: Faculdade de Odontologia de Araçatuba-UNESP: Rua Jose Bonifácio 1193, Centro. CEP: 16050-300 Araçatuba, SP, Brasil. Tel/Fax 55- 1836363239 E-mail: vg.garcia@uol.com.br Número de figuras: 6 Número de tabela: 1 Running title: 5-FU influencia na evolução da PE. mailto:vg.garcia@uol.com.br Resumo O presente estudo avaliou por meio de análise histomorfometrica, imunoistoquimica e da Fosfatase Alcalina (FA) os efeitos do quimioterápico 5-fluorouracil (5-FU), nos tecidos periodontais normais, na evolução da periodontite experimental (PE) e no tratamento periodontal mecânico de Raspagem e Alisamento Radicular (RAR). Foram tratados 150 ratos, dos quais 92 foram utilizados e divididos aleatoriamente em 6 grupos submetidos aos seguintes tratamentos: Grupo C (n=24) - animais não tratados com 5- FU, sem PE, área contralateral dos Grupos PE e PE + RAR que foram utilizadas como controle negativo. Grupo PE (n=16) – animais portadores da PE. Grupo PE + RAR (n=18) – animais portadores da PE e tratados localmente pela técnica da RAR. Grupo 5- FU (n=24) - animais tratados sistemicamente com 5-FU. Grupo 5-FU + PE (n=16) - animais tratados sistemicamente com 5-FU, com indução PE. Grupo 5-FU + PE + RAR (n=18) - animais tratados sistemicamente com 5-FU, portadores da PE e tratados localmente com RAR. A PE foi induzida pela adaptação de um fio de algodão ao redor do primeiro molar inferior esquerdo. Nos animais dos grupo 5-FU, 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR o 5-FU foi administrado no momento da indução da PE e após 48 horas. Após 7 dias da evolução da PE, nos animais dos grupos PE, PE + RAR, 5-FU + PE e 5- FU + PE + RAR a ligadura foi removida e os grupos PE + RAR e 5-FU + PE + RAR foram tratados localmente com RAR. Os animais foram eutanasiados aos 7, 15 e 30 dias após a remoção da ligadura. Foram obtidos cortes seriados de 4 μm de espessura no sentido mésio-distal e corados com Hematoxilina e Eosina ou Tricrômico de Masson. A porcentagem de osso na furca (POF) foi avaliada por análises histomorfométrica e foram realizadas a análise dos padrões de imunomarcação para RANKL, OPG e TRAP. Para análise hematológica, foram obtidas amostras sanguíneas antes do início dos protocolos de tratamento, após 7 dias e nos períodos de eutanásia. Foram avaliados os Leucócitos Totais (LT), neutrófilos e os níveis de FA. Os dados obtidos foram submetidos à análise estatística (p<0,05). Observou-se que os animais do grupo 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR apresentaram menor POF, maior infiltrado inflamatório e maior padrão de imunomarcação de RANKL quando comparados aos grupos PE e PE + RAR. Os animais dos grupos C e 5-FU não apresentaram diminuição da POF. Os animais dos grupos 5-FU, 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR apresentaram redução dos LT e neutrófilos após tratamento com 5-FU. Somente os animais do grupo C não apresentaram alteração dos níveis de FA. Dentro os limites do presente estudo pode-se concluir que o 5-FU influenciou na evolução da PE, no tratamento da PE e não induziu alterações no periodonto saudável. Palavras chaves: Perda óssea alveolar; Doenças periodontais; Quimioterapia; Defeito de furca; Modelos animais. 51 Introdução 1. Introdução Pacientes sob o tratamento com quimioterápicos contra o câncer podem manifestar efeitos colaterais. Na cavidade oral a mucosite e a hipofunção das glândulas salivares são as manifestações adversas comumente observadas e interferem na qualidade de vida do indivíduo (Kim et al. 2012). Dentre os quimioterápicos, o 5-Fluorouracil (5-FU), um antimetabólito do tipo análogo da pirimidina, tem amplo espectro de ação contra tumores sólidos no trato gastrointestinal, ovário, fígado, cérebro e mama (Arias, 2008). Após sua entrada na célula, o 5-FU interfere com o metabolismo dos nucleosídeos e é incorporado a todas as classes de RNA por meio da RNA-polimerase. Adicionalmente, o fluorouracil forma o monofosfato de fluorodesoxiuridina (FdUMP), que incorporado a timidilato sintase leva a inibição desta enzima impedindo a síntese de timidilato, que é um precursor necessário do DNA. A ação do 5-FU sobre o DNA e o RNA promove a toxidade e morte celular (Noordhuis et al. 2004, Arias 2008,Wisniewska-Jarosinska et al. 2011). Os quimioterápicos antineoplásicos atuam no metabolismo das células que possuem rápido crescimento e proliferação, como as células cancerígenas, induzindo sua apoptose (Guchelaar et al. 1998, Arias 2008). A falta de especificidade na sua biodistribuição sistêmica faz com que estas drogas atinjam tanto as células alvo como as células saudáveis que possuem alto índice mitótico (Arias 2008). Drogas que afetam a síntese de DNA, como o 5-FU, exibem efeitos adversos na cavidade oral mais pronunciados em razão da rápida renovação do epitélio oral (Naidu et al. 2004). No periodonto o epitélio juncional é responsável pela adesão dentogengival e tem um papel fundamental na defesa do tecido periodontal (Tsukamoto et al. 2012). Por ser um tecido 52 com rápida proliferação ele pode ter sua renovação comprometida pela ação do 5-FU o que pode favorecer a penetração e contaminação dos tecidos mais profundos, incluindo os que compõem o periodonto de inserção. Por outro lado, o 5-FU pode bloquear a proliferação de osteoblastos e induzir sua apoptose em placas de crescimento ósseo (Xian et al. 2006). Além desta ação, o 5-FU pode afetar o sistema RANK-RANKL- OPG, um dos maiores reguladores do metabolismo ósseo, o qual resulta em reflexo sobre as células clásticas, TRAP-positivas (Raghu Nadhanan et al. 2012). Estas alterações podem favorecer o desenvolvimento da doença periodontal (DP) a qual é caracterizada pela migração epitelial, destruição do tecido conjuntivo e osso alveolar (Cochran 2008). A DP é uma condição patológica multifatorial que envolve tanto a presença de organismos patogênicos locais quanto a resposta imune infamatória do hospedeiro (Darveau 2009). O tratamento mecânico de raspagem e alisamento radicular (RAR) tem mostrado ser uma abordagem efetiva no tratamento da DP (Fleischer et al. 1989, Sanz et al. 2008), porém algumas medicações podem influenciar na progressão da DP (Nassar et al. 2009) e na resposta ao tratamento periodontal (Fernandes et al. 2009). Poucos são os estudos que avaliaram os efeitos adversos dos quimioterápicos antineoplásicos, como o 5-FU, nos tecidos periodontais (Jensen et al. 2008; Mazzeo et al. 2009; Djuric et al. 2010; Ogawa et al. 2012). Estes estudos clínicos em humanos demonstraram que a quimioterapia provocou aumento do índice gengival (Jensen et al. 2008; Djuric et al. 2010), alterações na resposta inflamatória gengival, aumento na profundidade de sondagem (Mazzeo et al. 2009; Djuric et al. 2010) e do índice de placa e do índice de sangramento (Djuric et al. 2010). Ogawa et al. 2012 constataram que a periodontite ocorreu com maior frequência em pacientes que receberam tratamento quimioterápico com 5-FU e associações. Porém em se tratando de estudos clínicos, os 53 dados são inconclusivos com relação a influência e mecanismo de ação do 5-FU no periodonto. Frente ao exposto e a ausência de estudos experimentais, o presente estudo tem por objetivo avaliar o efeito do tratamento com 5-FU em ratos com periodonto saudável, assim como a influência deste tratamento sobre dos tecidos periodontais durante a evolução da periodontite experimental (PE) ou após tratamento mecânico de raspagem e alisamento radicular. 55 Materiais e Métodos 2. Materiais e Métodos 2.1. Animais Foram utilizados no presente estudo 150 ratos machos (Rattus norvegicus, albinus, Wistar), pesando aproximadamente 250 a 300 g. Os animais foram mantidos em gaiolas plásticas com ração e água ad libitum. Antes dos procedimentos cirúrgicos, todos os animais foram mantidos em ambiente com temperatura estável (22 ± 2°C), por um período de 5 dias. Todos os protocolos descritos foram aprovados pela Comissão de Ética em Experimentação Animal (CEEA) da Faculdade de Odontologia do Campus de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP, protocolo no 01459/2011 (Anexo A). A pesquisa foi realizada seguindo as normas do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal e a legislação em vigor. 2.2. Protocolo Experimental 2.2.1. Protocolo da periodontite experimental e grupos experimentais Para todos os procedimentos cirúrgicos os animais foram anestesiados por injeção intramuscular de 70 mg/kg de peso corporal de cloridrato de ketamina (Vetaset, Fort Dodge, Iowa, EUA) associado à 6 mg/kg de peso corporal de cloridrato de xilazina (Coopazine, Coopers, São Paulo, SP, Brasil). Nos primeiros molares inferiores esquerdos foi induzida a PE pela instalação de um fio de algodão número 24 (Corrente Algodão n°24, Coats Corrente, São Paulo, SP, Brasil) 56 mantido em posição sub gengival por meio de nós cirúrgicos durante 7 dias para induzir a PE (Johnson 1975). 2.2.2 Tratamento com a Droga Quimioterápica – (5-FU) Os animais que foram tratados com o quimioterápico 5-fluorouracil (5-FU) (Fluorouracila, 250 mg, Eurofarma Laboratórios, São Paulo, SP, Brasil) receberam injeção intraperitoneal no dia da instalação da ligadura e 48 horas após, na dose de 80 e 40 mg/kg de peso corporal do animal, respectivamente (Lopes et al. 2010). 2.2.3 - Grupos Experimentais Segundo uma tabela gerado por um software, os animais foram aleatoriamente distribuídos em 6 (seis) grupos experimentais. Os grupos foram definidos de acordo com os seguintes tratamentos: Grupo C (n=30) - animais não tratados com 5-FU, sem PE, área contralateral dos grupos PE e PE + RAR que foram utilizadas como controle negativo. Grupo PE (n=30) - animais portadores da PE. Grupo PE + RAR (n=30) - animais portadores da PE e tratados localmente pela técnica da Raspagem e Alisamento Radicular (RAR). Grupo 5-FU (n=30) - animais tratados sistemicamente com 5-FU. Grupo 5-FU + PE (n=30) - animais tratados sistemicamente com 5-FU, com indução da PE. Grupo 5-FU + PE + RAR (n=30) - animais tratados sistemicamente com 5-FU, portadores da PE e tratados localmente com RAR. Nos animais dos grupos PE + RAR e 5-FU + PE + RAR após 7 dias da instalação das ligaduras, estas foram removidas e em seguida o primeiro molar foi tratado localmente com RAR para remoção dos agentes etiológicos locais. 57 2.2.4. Raspagem e alisamento radicular O tratamento local com RAR foi realizado com curetas manuais mini – five 1-2 (Hu- Friedy Co. Inc., Chicago, IL, EUA), através de 10 movimentos de tração disto-mesial nas faces vestibular e lingual. As áreas interproximais e de furca foram raspadas com as mesmas curetas através de movimentos de tração cérvico-oclusais (de Almeida et al. 2008). Os procedimentos de RAR foram realizados por um mesmo operador experiente, treinado e cego aos grupos experimentais (VCNN). 2.2.5. Procedimentos de coleta sanguinea e Períodos experimentais Para a análise sanguíneas foram colhidos de cada animal por punção cardíaca 2 ml de sangue nos momentos -7 dias, 0 dia, 7 dias, 15 dias e 30 dias. Para análise histomorfométricas e imunoistoquimicas, os animais foram eutanasiados pela administração de uma dose letal de Tiopental na dose de 150 mg/kg de peso corporal aos 7, 15 e 30 dias após remoção da ligadura (Cristália, Ltda., Itapira, SP, Brasil). A mandíbula de cada animal foi removida, separada em duas partes e fixada em formaldeído tamponado a 4%, por um período de 48 horas (Anexo B). 2.3. Processamento Laboratorial Após fixação, os espécimes obtidos foram lavados em água corrente e descalcificados em solução de EDTA à 10%, com trocas semanais por um período médio de 8 semanas. Após inclusão dos espécimes em parafina, cortes semi seriados (4 μm) foram obtidos no sentido mésio distal. Após exclusão do primeiro e do último corte histológico, nos quais a região de furca foi evidente, cinco cortes equidistantes de cada espécime foram 58 corados com hematoxilina e eosina (H&E) e Tricrômico de Masson (TM) para análise histomorfométrica por microscopia de campo claro. Outros três cortes foram submetidos ao processamento para análise imunoistoquímica. Esta seleção foi realizada por um examinador experiente, treinado e cego aos tratamentos efetuados (JMA). Outro examinador calibrado e cego aos tratamentos efetuados realizou a análise histométrica e histológica (EE) (de Almeida et al. 2008). 2.4. Análise dos Resultados 2.4.1. Análise dos Leucócitos Totais, Neutrófilos e Fosfatase Alcalina Dos 2 ml de sangue obtidos 0,5 ml foram acondicionados em microtubos tipo eppendorf, contendo anticoagulante (EDTA) a 10% para determinação dos Leucócitos Totais (LT) e neutrófilos e 1,5 ml acondicionados em microtubos tipo Eppendorf sem anticoagulante para a determinação da fosfatase alcalina (FA) sérica nos momentos. As contagens de LT e neutrófilos foram realizadas nos momentos -7 dias e 0 dias em contador de células automatizado (ABC Diagnostics, Montpellier, France). A contagem diferencial dos leucócitos foi realizada segundo Feldman et al. (2000). A determinação da FA foi realizada nos momentos -7 dias, 0 dias, 7dias, 15 dias e 30 dias, pelo modo cinético de acordo com as recomendações do fabricante (Labtest, Lagoa Santa, MG, Brasil) e analisados em espectrofotômetro semi automatizado (SB-190 Celm, Barueri, SP, Brasil). 59 2.4.2. Análise histológica Os cortes corados pela técnica de H&E foram analisados para verificar as características histológicas do ligamento periodontal e a Porcentagem de Tecido Ósseo na Região de Furca (POF) dos primeiros molares. 2.4.3. Análise histométrica Para a determinação da POF foi utilizando um sistema de análise de imagem (Axiovision 4.8.2, Carl Zeiss MicroImaging GmbH, 07740 Jena, Germany). Foi mensurada a Área Total da Furca (AF) e em seguida a Área Ocupada por Tecido Ósseo (AO), ambas em mm2. Posteriomente foi calculada a POF. A AF foi demarcada apicalmente por uma linha reta traçada a partir do ápice da raiz mesial em direção ao ápice da raiz distal. A partir desta linha seguiu-se todo o contorno da superfície externa do cemento situado entre as raízes. A AO teve o mesmo limite apical da AF e partir deste seguiu-se todo o contorno da superfície externa do tecido ósseo entre as raízes. A POF foi calculada multiplicando-se AO por 100 e dividindo-se por AF (POF = (AO x 100) / AF) (Anexo C). A POF de cada espécime foi mensurada três vezes pelo mesmo examinador (EE), em dias diferentes, com o propósito de reduzir a variação nos dados. As três medidas obtidas foram analisadas estatisticamente para análise de concordância com nível de 5% de significância (Teste Kappa). 2.4.4. Análise Imunoistoquímica Foram selecionados 3 cortes histológicos de cada espécime que foram desparafinizados em xilol e hidratados em série decrescente de etanol (100º - 100º - 100º - 90º - 70° GL). 60 A recuperação antigênica foi realizada através da imersão das lâminas histológicas em tampão específico (Diva decloaker®, Biocare Medical, Concord, CA, EUA), em câmara pressurizada (Decloaking chamber®, Biocare Medical, Concord, CA, EUA) a 95°C, por 20 minutos. No final de cada etapa da reação imunoistoquímica, as lâminas histológicas foram lavadas em PBS 0,1 M, pH 7,4. Posteriormente, as lâminas foram imersas em 3% de peróxido de hidrogênio por 1 hora e 1% de soro albumina bovino por 12 horas para bloqueio da peroxidase endógena e bloqueio dos sítios inespecíficos, respectivamente. As lâminas contendo amostras de cada grupo experimental foram divididas em três lotes, e cada lote foi incubado com um dos seguintes anticorpos primários: anti-TRAP do rato gerado em cabra (SC-30833, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-RANKL do rato gerado em cabra (SC-7628, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), anti-OPG do rato gerado em cabra (SC-8468, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). Os cortes histológicos foram incubados com anticorpo secundário biotinilado por 2 horas e subsequentemente tratados com estreptavidina conjugada com a peroxidase da raiz forte - HRP por 1 hora (Universal Dako Labeled HRP Streptavidin-Biotin Kit®, Dako Laboratories, CA, EUA). Procedeu-se a revelação utilizando como cromógeno o 3,3’- tetracloridrato de diaminobenzidina (DAB chromogen Kit®, Dako Laboratories, CA, USA) e a contracoloração com hematoxilina de Harris. Como controle negativo, os espécimes foram submetidos aos procedimentos descritos anteriormente suprimindo-se a utilização dos anticorpos primários. As secções histológicas foram analisadas sob iluminação de campo claro em microscópio óptico (Optiphot-2, Nikon, Japão) por um investigador que desconhecia os 61 grupos experimentais que estavam sendo analisados (EE). A imunomarcação foi definida como aquela de coloração acastanhada presente no compartimento citosólico das células. RANKL e OPG foram analisadas na AF com um aumento de 400x. Foi efetuada uma análise semi quantitativa da imunomarcação no ligamento periodontal e no osso alveolar desta área. Foram utilizadas três secções histológicas de cada animal e o critério para o estabelecimento do padrão de imunomarcação foi modificado de Kim et al. (2007). Foi padrões para as imunomarcações sendo: Padrão 0 - padrão de imunomarcação nulo (ausência total de células-IR), Padrão 1 - baixo padrão de imunomarcação ( 1/4 das células-IR por por área), Padrão 2 - moderado padrão de imunomarcação ( 1/2 das células-IR por por área) e Padrão 3 - alto padrão de imunomarcação ( 3/4 das células imunorreativas (IR) por área). A TRAP foi analisada no centro do septo interradicular de uma área de 1000µm x 1000µm com um aumento de 200x. O limite coronário desta área foi a crista óssea alveolar, a partir do qual se estendia apicalmente por uma distância de 1000µm. Foi efetuada uma análise quantitativa das células multinucleadas TRAP-positivas. 2.4.4. Análise Estatística A análise estatística dos dados coletados foi realizada pelo programa BioEstat 5.0 (Bioestat 5.0, Sociedade Civil de Mamirauá, Belém, PA, Brasil). A análise da normalidade dos dados foi realizada pelo teste de Shapiro Wilk (p<0,05). A hipótese de não haver diferença estatisticamente significante entre os Leucócitos Totais e para FA nos diferentes grupos experimentais entre os períodos foi testada pelo teste t de Student (p<0,05). 62 A hipótese de não haver diferença estatisticamente significante na POF e para TRAP entre os diferentes grupos e períodos foi testada. A análise intragrupo e intergrupo para POF e para TRAP foi realizada pela análise de variância a dois critérios ANOVA (p<0,05). Quando o ANOVA detectou diferença estatística, as comparações múltiplas foram realizadas e complementadas pelo teste de Tukey (p<0,05). 64 Resultado 3. Resultados Dos 150 animais utilizados no presente estudo, houve perda de 58 animais devido aos efeitos do quimioterápico utilizado e também em decorrência dos procedimentos de anestesia. Assim, foram utilizados 92 animais distribuídos como se segue: Grupo C (n=24); Grupo PE (n=16); Grupo PE + RAR (n=18); Grupo 5-FU (n=24); Grupo 5-FU + PE (n=16); Grupo 5-FU + PE + RAR (n=18). O poder do estudo foi calculado com estes animais e demonstrou 90% de confiabilidade. 3.1. Análise dos Leucócitos Totais e Neutrófilos Os resultados estão apresentados na figura 1A e 1B. Na análise estatística dos LT e neutrófilos nos períodos -7 dias e 0 dia, os animais dos grupos tratados com 5-FU, representados pelos grupos 5-FU, 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR, apresentaram queda significante entre os períodos no número de LT e neutrófilos (p<0,05). Os animais dos grupos sistemicamente saudáveis, representados pelos grupos C, PE e PE + RAR, não apresentaram diferença estatística significante entre os períodos. 3.2. Análise da Fosfatase Alcalina Os resultados estão apresentados na figura 1C. Na análise intragrupo, ao comparar os diferentes períodos, observou-se que o grupo PE apresentou queda nos níveis de FA com diferença estatística aos -7 dias quando comparado aos 0 dias (p<0,04). O grupo PE + RAR apresentou queda nos níveis de FA com diferença estatística aos -7 dias quando comparados aos 0 dias (p<0,0001) e aos 15 dias apresentou aumento nos níveis 65 de FA quando comparado com o período -7 dias (p = 0,01). O grupo 5-FU no período 0 dias apresentou queda nos níveis de FA quando comparado com o período – 7 dias (p<0,0001), seguido por um aumento significativo nos níveis de FA aos 7 dias (p<0,0001), e 15 dias (p = 0,04) quando comparado com o período de – 7 dias. O grupo 5-FU + PE apresentou queda nos níveis de FA no período de 0 dias com diferença significativa quando se comparou com o período de -7 dias (p = 0,001), seguido de aumento significativo aos 7 dias (p = 0,009), 15 dias (p = 0,03) e 30 dias (p = 0,01) quando comparado com o período de – 7 dias. O grupo 5-FU + PE + RAR apresentou queda significativa nos níveis de FA aos 0 dias (p<0,0001) quando comparado aos -7 dias. O grupo C apresentou oscilação nos níveis de FA porém não apresentou diferença estatística significante entre os períodos (p>0,05). 3.3. Análise Histológica Nos grupos C (Figuras 2A, 2B, 2C) e 5-FU (2D, 2E, 2F) em todos os períodos experimentais as características histopatológicas se mostraram similares. O ligamento periodontal se mostrou composto por grande quantidade de fibras colágenas, fibroblastos e vasos sanguíneos. Fibras de Sharpey estavam presentes tanto no cemento como no osso alveolar. A superfície do cemento se mostrou totalmente íntegra e revestida de cementoblastos. A superfície do tecido ósseo do septo interradicular apresentou-se sem grande irregularidade, repleta de osteoblastos ou células de revestimento ósseo. Nestes territórios as trabéculas ósseas se mostravam bastante espessas e delimitando pequenos espaços medulares preenchidos por medula óssea hematógena. 66 Nos animais do grupo PE aos 7 dias, um intenso infiltrado inflamatório composto por polimorfonucleares neutrófilos estava presente em todo o tecido conjuntivo da região de furca. Todos os espécimes deste grupo apresentavam espículas de osso necrosado envoltas por células inflamatórias na região de furca. O septo interradicular se mostrou com um contorno bastante irregular e com trabéculas ósseas bastante delgadas, em cuja superfície se observava grande quantidade de osteoclastos (Figura 3A). Aos 15 e 30 dias a inflamação ainda era intensa, no entanto, comparativamente houve uma redução no volume ocupado pelo infiltrado inflamatório composto por neutrófilos e linfócitos. O tecido conjuntivo nas imediações do septo interradicular se mostrou menos inflamado. O septo interradicular se apresentou com trabéculas ósseas delgadas, de contorno externo bastante irregular e com osteoclastos ativos (Figura 3B e C). No grupo PE + RAR, aos 7 dias, uma grande quantidade de células inflamatórias, especialmente neutrófilos, ocupava o tecido conjuntivo na região da furca. Nas imediações do septo interradicular foi observada uma margem de tecido conjuntivo bem menos inflamado, composto por uma grande quantidade de fibroblastos e vasos sanguíneos, entremeados em uma delicada rede de fibras colágenas. O tecido ósseo do septo interradicular se mostrava constituído por trabéculas ósseas de contorno externo irregular, em função da presença de muitas lacunas de reabsorção e osteoclastos ativos. Poucos espécimes apresentaram espículas de osso necrosado (Figura 4A). Aos 15 dias as características histopatológicas se mantiveram similares às descritas anteriormente; no entanto, houve uma redução do volume ocupado pelo infiltrado inflamatório (Figura 4B). Aos 30 dias o infiltrado inflamatório apresentou uma redução ainda maior no volume ocupado por células inflamatórias que neste período, além de neutrófilos, era composto por grande quantidade de linfócitos e macrófagos. Uma ampla faixa de tecido 67 conjuntivo desprovido de células inflamatórias estava situado nas adjacências do osso do septo interradicular. Este tecido exibia uma quantidade moderada de fibroblastos e fibras colágenas. O tecido ósseo se mostrava composto por trabéculas ósseas mais espessas e com contorno superficial mais regular (Figura 4C). No grupo 5-FU + PE aos 7, 15 e 30 dias o tecido conjuntivo da área de furca apresentava um intenso infiltrado inflamatório que atingia as margens tecido ósseo do septo interradicular. Na maioria dos espécimes grandes espículas de osso necrosado, envoltas por grande quantidade de células inflamatórias, estavam presentes. Em alguns espécimes, especialmente aos 30 dias, o nível de reabsorção óssea foi tão acentuado que eliminou por completo o septo interradicular e atingiu o osso basal da mandíbula, denotando um aumento da severidade da doença periodontal ao longo do tempo. O tecido ósseo do septo interradicular se mostrou composto por trabéculas ósseas muito delgadas, com amplos espaços medulares apresentando inclusive células inflamatórias. O contorno externo do septo interradicular se apresentou muito irregular, repleto de lacunas de reabsorção e osteoclastos ativos (Figuras 3D e F). No grupo 5-FU + PE + RAR aos 7 dias havia um intenso infiltrado inflamatório que ocupava o tecido conjuntivo da área de furca e margeava o tecido ósseo do septo interradicular. Espículas de osso necrosado estavam presentes em muitos espécimes. O contorno do septo interradicular se mostrou bastante irregular, repleto de osteoclastos e as trabéculas ósseas muito delgadas (Figura 4D). Aos 15 e 30 dias o volume ocupado pelo infiltrado inflamatório foi progressivamente sendo reduzido. O tecido conjuntivo nas imediações do septo interradicular mostrou sinais de reparação e se apresentou bem menos inflamado ao longo do tempo. Havia neste tecido uma moderada quantidade de fibras colágenas, fibroblastos, vasos sanguíneos e raras células inflamatórias, 68 especialmente aos 30 dias. As trabéculas ósseas se mostraram com uma espessura moderada, com pouca irregularidade na superfície e poucos osteoclastos ativos (Figuras 4E e F). Constatamos que a perda óssea na região de furca no grupo 5-FU + PE foi progressiva e muito agravada ao longo do tempo (Figuras 3D e F), enquanto que no grupo 5-FU + PE + RAR, esta se mostrou maior aos 7 dias, mas ao longo do tempo o processo de reparo teve um curso mais favorável (Figuras 4D e F). 3.4. Análise histométrica O teste Kappa indicou nível de concordância nas medidas da POF intraexaminador de 94%, indicando um alto nível de concordância. Os resultados estão apresentados na tabela 1. Na análise intragrupo, ao comparar os diferentes períodos, observou-se que o grupo PE apresentou menor POF aos 7 dias quando comparados aos 15 (p=0,016) e 30 (p=0,030) dias, o grupo PE + RAR apresentou maior POF aos 7 dias comparado com 30 dias (p=0,027) e o grupo 5-FU apresentou menor POF aos 7 dias quando comparado aos 15 dias (p=0,024) e 30 (0,0016). Os grupos C, 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR não apresentaram diferença estatística significante entre os períodos (p>0,05). Na análise intergrupo ao se comparar os diferentes grupos experimentais, observou-se que nos grupos C e 5-FU apresentaram maior POF com diferença significantiva quando comparados aos demais grupos em todos os períodos experimentais (p<0.0001). O grupo PE apresentou menor POF aos 7, 15 e 30 dias, com diferença significativa (p<0,05) quando comparado ao grupo PE + RAR nos respectivos períodos. Ainda no grupo PE, este apresentou menor POF quando comparado ao 5-FU + PE aos 30 dias e 5- 69 FU + PE + RAR aos 15 dias (p=0,0002) nos respectivos períodos. O grupo PE + RAR aos 7, 15 e 30 dias, apresentou maior POF com diferença estatística significante quando comparado com os grupos 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR nos respectivos períodos (p<0,05). 3.5. Análise imunoistoquímica Foram realizadas reações imunoistoquímicas utilizando-se anticorpos primários contra as proteínas RANKL, TRAP e OPG no processo de reparo da região de furca dos primeiros molares inferiores. A técnica imunoistoquímica empregada para a detecção de RANKL, OPG e TRAP mostrou alta especificidade na detecção de tais proteínas, a qual foi comprovada pela ausência total de marcação no controle negativo da reação imunoistoquímica. As células imunorreativas apresentaram uma coloração acastanhada confinada ao compartimento citossólico. A imunomarcação para TRAP estava presente predominantemente em osteoclastos (Figura 5A, 5D, 5G e 5F). A marcação para RANKL (Figura 5B, 5E, 5H e 5K) e OPG (Figura 5C, 5F, 5I e 5L) ficou confinada predominantemente aos osteoblastos, mas alguns fibroblastos exibiam imunorreatividade. O resultados para RANKL e OPG estão representados na Figura 6. Para RANKL prevaleceu um padrão baixo de imunomarcação aos 7, 15 e 30 dias nos grupos C e 5- FU. No grupo PE predominou um moderado padrão de imunomarcação aos 7 e 15 dias e um padrão de baixo a moderado aos 30 dias. No grupo PE + RAR predominou um moderado padrão de imunomarcação aos 7 dias, um padrão de baixo a moderado aos 15 dias e um baixo padrão de imunomarcação aos 30 dias. No grupo 5-FU + PE prevaleceu um padrão de imunomarcação que variou de alto a moderado aos 7, 15 e 30 dias. No 70 grupo 5-FU + PE + RAR predominou um moderado padrão de imunomarcação aos 7 e 15 dias e um baixo padrão de imunomarcação aos 30 dias (Figuras, 5B, 5E, 5H, 5K e 6A). Para OPG prevaleceu um padrão moderado de imunomarcação aos 7, 15 e 30 dias nos grupos C e 5-FU, nos demais grupos experimentais prevaleceu um baixo padrão de marcação. (Figuras 5C, 5F, 5I, 5L e 6B) Os resultados para TRAP estão representados na Tabela 1b (Figuras 5A, 5D, 5G e 5J). Na análise intragrupo, os grupos não apresentaram diferença estatística significante entre os períodos (p>0,05). Na análise intergrupo ao se comparar os diferentes grupos experimentais, observou-se que aos 7 dias o grupo C apresentou menor número de células TRAP (0,8 ± 0,44) com diferença estatisticamente significante quando comparado aos grupos 5-FU + PE (11,40 ± 3,69) e 5-FU + PE + RAR (13,25 ± 6,45). O grupo PE apresentou maior número de células TRAP aos 7, 15 e 30 dias com diferença estatisticamente significante quando comparado ao grupo 5-FU nos respectivos períodos. O grupo PE + RAR apresentou menor número de células TRAP aos 7 (6,83 ± 2,48) e 30 (3,64 ± 1,08) dias com diferença estatisticamente significante quando comparado ao 5-FU + PE + RAR nos respectivos períodos (13,25 ± 6,45; 6,16 ± 1,43). O grupo 5-FU apresentou menor número de células TRAP aos 7, 15 e 30 dias com diferença estatisticamente significante quando comparado aos grupos 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR nos respectivos períodos. Aos 15 dias o grupo C (0,37 ± 0,74) apresentou menor número de células TRAP com diferença estatisticamente significante quando comparado aos grupos PE (8,82 ± 5,79) e 5-FU + PE + RAR (7,63 ± 3,66). O grupo PE aos 15 dias (8,82 ± 5,79) apresentou maior número de células TRAP com diferença estatisticamente significante quando comparado ao grupo 5-FU (1,37 ± 1,18). O grupo 71 5-FU (1,37 ± 1,18) apresentou menor número de células TRAP com diferença estatisticamente significante quando comparado ao 5-FU + PE + RAR (7,66 ± 3,66). Aos 30 dias o grupo PE + RAR (3,64 ± 1,88) apresentou menor número de células TRAP com diferença estatisticamente significante quando comparado ao 5-FU + PE + RAR (6,16 ± 1,43), e os animais do grupo 5-FU + PE (10,25 ± 4,41) apresentaram maior número de células TRAP com diferença estatisticamente significante quando comparados aos animais do grupos C (0,33 ± 0,51) e 5-FU (0,37 ± 0,74). 73 Discussão 4. Discussão No presente estudo foi utilizado um modelo animal em ratos para se avaliar o efeito do tratamento com 5-FU no periodonto saudável, assim como a influência deste tratamento na evolução da PE ou frente o tratamento mecânico de RAR. Na análise sanguínea o leucograma mostrou que os animais tratados com 5-FU apresentaram leucopenia com significativa redução no número de neutrófilos. Resultado semelhante foi observado por estudos anteriores (Branda et al. 2002; Eisold et al., 2002). A diminuição no número de neutrófilos aumenta a vulnerabilidade do hospedeiro e consequentemente a severidade da doença periodontal (Nualart-Grollmus et al., 2007). Quanto a FA, este estudo mostrou haver uma significativa redução nos níveis séricos de FA nos animais com PE, o mesmo observado em outros estudos (Nassar et al. 2009; Goes et al. 2012; de Menezes et al. 2012). Adicionalmente, mostrou-se que os animais tradados com 5-FU também apresentaram uma redução significativa dos níveis séricos da FA, independente da presença da PE. Uma possível explicação para este resultado pode ser a supressão da atividade osteoblástica ocasionada pela droga (Xian et al. 2006; Raghu Nadhanan et al. 2012), uma vez que a FA é um marcador bioquímico da atividade dos osteoblastos estando intimamente ligada ao mecanismo de reparo ósseo (Whyte 2010). Também ficou demonstrado que nos períodos experimentais após a remoção da ligadura (grupos PE e 5-FU + PE) ou do tratamento de RAR (grupos PE + RAR e 5-FU + PE + RAR), os níveis séricos da FA apresentaram um aumento. Os animais não tratados com 5-FU apresentaram o pico da FA aos 7 dias ao passo que os animais tratados com 5-FU apresentaram o pico de FA aos 15 dias. O atraso no pico de FA nos animais tratados com 5-FU em relação aos não tratados com 5-FU pode ter sido 74 pelo aumento da apoptose de pré osteoblastos e diminuição da proliferação de osteoblastos ocasionado pela droga (Xian et al. 2006; Raghu Nadhanan et al. 2012). Outra provável explicação para o aumento nos níveis séricos da FA nos animais tratados com 5-FU pode ser um efeito hepatotóxico promovido pela droga (Moertel et al. 1993). Aos 30 dias em todos os grupos, houve um restabelecimento dos níveis séricos da FA provavelmente explicados pela diminuição do processo de resposta do hospedeiro, o qual apresenta diminuição da atividade osteoblástica (Doblaré et al., 2004) e também por uma provável diminuição dos efeitos hepatotóxicos da droga nos períodos mais longos. Histologicamente foi constatado que nos animais que não foram submetidos a PE tratados ou não com 5-FU, não foi observada diminuição da POF, alterações histopatológicas ou alterações no metabolismo ósseo determinadas pelas proteínas RANKL, OPG e TRAP em todos os períodos experimentais. Esta constatação permite concluir que na ausência da placa bacteriana, as alterações sistêmicas causadas pelo 5- FU, quando administrado na dosagem utilizada no presente estudo, não foram suficientes para promover alterações nos tecidos periodontais. Estes resultados estão de acordo com Ogawa et al. (2012) que observaram em pacientes tratados com terapia com 5-FU e associações, que o tratamento periodontal de remoção de cálculo e técnica de higiene oral foram eficazes para o tratamento da DP, porém sua eficiência é maior quando feito de forma preventiva, ou seja previamente a quimioterapia. Desta forma, acredita-se que na ausência de placa bacteriana possíveis alterações histopatológicas em decorrência do 5-FU possam acontecer no caso da administração prolongada da droga, tendo em vista a diminuição dos níveis séricos de FA observados no presente estudo e 75 também pelos estudos que relatam alterações no tecido ósseo pelo uso do 5-FU (Xian et al. 2006; Mizoguchi et al. 2009; Raghu Nadhanan et al. 2012). Por outro lado, pode ser observado que a PE nos animais do grupo 5-FU + PE apresentou maior severidade quando comparada aos animais do grupo PE, com diferença significativa na POF aos 30 dias. Os animais 5-FU + PE apresentaram pouca POF, intenso infiltrado inflamatório e extensas áreas de necrose óssea envolvendo a quase totalidade do osso na área de furca em todos os períodos experimentais. Estes resultados mostram que o 5-FU agravou a severidade da PE causando rápida e intensa destruição óssea nos períodos iniciais, o que resultou nas área de necrose frequentemente encontrada. Por ser um quimioterápico o 5-FU é citotóxico para células que possuem um alto índice de proliferação (Arias 2008). Von Bültzingslöwen et al. (2001) reportaram que o 5-FU provoca degeneração autofágica em queratinócitos da mucosa bucal. Em sendo o epitélio juncional periodontal um tecido epitelial especializado composto por queratinócitos que apresentam um alto índice de renovação (Pöllänen et al., 2003), supomos que seja também afetado pelo 5-FU. Por se tratar da primeira linha de defesa dos tecidos periodontais contra a agressão microbiana (Tsukamoto et al. 2011) a ruptura do epitélio juncional facilitaria a penetração de bactérias e seus subprodutos para o interior dos tecidos periodontais, especialmente aqueles que compõem o periodonto de inserção. Além disso, deve ser considerado que o 5-FU promove uma severa leucopenia na fase inicial do tratamento, como observado no presente trabalho, o que reduz a capacidade de defesa do hospedeiro (Naidu et al., 2004). 76 A atividade reabsortiva do osso alveolar foi avaliada pela reação imunoistoquímica para detecção de proteínas que regulam o metabolismo ósseo local, RANKL e OPG, e pela contagem de osteoclastos e células multinucleadas TRAP-positivas. Nos animais com PE, tratados ou não com 5-FU, a expressão de OPG se manteve baixa em todos os períodos experimentais. No G V houve um maior padrão de imunomarcação para RANKL, no entanto, a quantidade de osteoclastos não apresentou diferença estatística em relação G II. A menor POF verificada no grupo V supostamente ocorreu em função da maior quantidade de imunomarcação para RANKL, uma vez que esta citocina, além de estimular a osteoclastogênese, inibir a apoptose de osteoclastos maduros, também aumenta a capacidade reabsortiva de osteoclastos ativos. Nas células da linhagem osteoclástica o efeito do 5-FU parece ser diferente de sua ação sobre as células da linhagem osteoblástica. Mizoguchi et al. (2009) reportaram que o 5-FU provoca severa mielossupressão, o que poderia afetar os precursores dos osteoclastos, no entanto, tais células possuem os denominados precursores quiescentes, os quais são altamente resistentes ao 5-FU e se mantem viáveis e capazes de se diferenciar após tratamento com esta droga. Em adição Raghu Nadhanan et al. (2012) constataram que decorridos 4 dias da aplicação do 5-FU, houve uma diminuição da quantidade de osteoblastos e um aumento na quantidade osteoclastos. Estas evidências (Mizoguchi et al., 2009; Raghu Nadhanan et al., 2012) são uma possível explicação para os resultados apresentados no presente estudo, onde os animais tratados com 5-FU portadores de PE apresentaram uma severa destruição do tecido ósseo logo no período inicial de 7 dias, denotando uma intensa atividade osteoclástica em período precoce a este. Deste modo, em decorrência da pouca POF apresentada por estes animais no período de 7 dias, não houve diferença significante na progressão da PE aos 15 e 30 dias. 77 Com relação ao tratamento mecânico de RAR, este mostrou ser efetivo para os animais com PE não tratados com 5-FU quando comparados aos demais grupos portadores de PE. Nos grupos não tratados com 5-FU, os animais do grupo PE apresentaram menor POF com intenso infiltrado inflamatório em todos os períodos experimentais, caracterizando a progressão da DP na ausência de RAR. Em contraste, os animais do grupo PE + RAR apresentaram um aumento estatisticamente significante da POF ao se comparar os 7 com 30 dias. Constatou-se também uma progressiva melhora do quadro inflamatório, com tecido ósseo e conjuntivo mais organizado aos 30 dias. Nos resultados imunoistoquimicos ao se comparar os grupos PE com PE + RAR, observou- se uma diminuição progressiva da imunomarcação para RANKL e TRAP no grupo PE + RAR quando comparado ao grupo PE nos períodos de 15 e 30 dias. De acordo Belibasakis & Bostanci (2012) este resultado imunoistoquimico está relacionado com uma diminuição da atividade da DP. Em conjunto com os resultados histológicos e histométricos, estes demonstram claramente a remissão da PE frente ao tratamento de RAR, estando de acordo com consenso na literatura que relata que a terapia de RAR é eficaz na remissão da PE (Fleischer et al. 1989, Sanz et al. 2008) em comparação à livre progressão da DP na qual não é realizada a remoção do agente agressor pela terapia mecânica. Nos grupos 5-FU + PE e 5-FU + PE + RAR, observou-se que inicialmente o tratamento mecânico no 5-FU + PE + RAR apresentou uma tendência ao menor índice de POF no período de 7 dias ao se comparar com o grupo 5-FU + PE. Este dado sugere uma maior atividade clástica neste grupo, embora não foi evidente estatísticamente. A relevância deste resultado pode ser explicado pela agressão mecânica provocada pelo procedimento de raspagem que pode resultar inicialmente em fator de estímulo para atividade dos osteoclástos. Porém foi evidente que nos períodos seguintes de 15 e 30 dias, o tratamento mecânico de RAR promoveu uma redução no volume do infiltrado 78 inflamatório e menor atividade osteoclástica, evidenciada pela diminuição progressiva da imunomarcação de RANKL. De todo modo no grupo 5-FU + PE + RAR a RAR foi efetiva para redução do processo inflamatório, porém não foi suficiente para favorecer os índices da POF, que apresentou uma severa destruição do tecido ósseo logo no período inicial de 7 dias pela provável influência do 5-FU (Mizoguchi et al., 2009; Raghu Nadhanan et al. 2012). Observou-se também que o pico da leucopenia foi concomitante ao período de tratamento de RAR, o que pode agravar o quadro infeccioso (Naidu et al., 2004). Deste modo pode-se supor que além da pouca POF o próprio efeito do 5-FU sobre o metabolismo celular (Xian et al. 2006, Arias 2008; Raghu Nadhanan et al. 2012) e imunológico (Branda et al. 2002), interferiu no reparo periodontal frente a terapia mecânica de RAR. Por essa razão demonstrou-se que a terapia mecânica nos animais do grupo 5-FU + PE + RAR foi menos efetiva quando comparado com os animais do grupo PE + RAR, o que evidencia a necessidade de tratamentos adjuvantes. Portanto, dentro dos limites do presente estudo, podemos concluir que o 5-FU agravou a evolução da PE, reduziu o reparo ósseo após o tratamento da PE e não induziu alterações histológicas na ausência de PE. Estudos adicionais são necessários para compreender plenamente o mecanismo de ação do 5-FU nas respostas celulares e histológicas do periodonto saudável ou com PE, bem como terapias coadjuvantes que contribuam para uma melhor resposta ao tratamento da PE influenciada pelo 5-FU. 79 Agradecimentos À Disciplina de Periodontia e ao Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Odontologia de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista – UNESP, Araçatuba, São Paulo, Brasil. À Faculdade de Medicina Veterinária de Araçatuba, Universidade Estadual Paulista - UNESP, Araçatuba, São Paulo. À CAPES pela concessão de bolsa e à Fundação de Amparo á Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP pelo auxílio para o desenvolvimento desta pesquisa (Processo FAPESP 2011/03021-3). 81 Referências Bibliográficas Referências Bibliográficas Arias, J.L. (2008) Novel strategies to improve the anticancer action of 5-fluorouracil by using drug delivery system. Molecules 13, 2340-2369. Belibasakis, G.N. & Bostanci, N. (2012) The RANKL-OPG system in clinical periodontology. Journal of Clinical Periodontology 39, 239-248. Branda, R.F., Chen, Z., Brooks, E.M., Naud, S.J., Traine, T.D. & McCormack, J.J. (2002) Diet modulates the toxicity of cancer chemotherapy in rats. The Journal of Laboratory and Clinical Medicine 140, 358-368. Cochran, D.L. (2008) Inflammation and bone loss in periodontal disease. 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O controle de placa bacteriana prévio à quimioterapia pode ser eficiente para prevenção da doença periodontal. 87 (a) Análise intragrupo * Diferença estatisticamente significante quando comparado com o período de 15 e 30 dias; # Diferença estatisticamente significante quando comparado com o período de 30 dias; + Diferença estatisticamente significante quando comparado com o período de 15 e 30 dias. (Teste de ANOVA seguido pelo Tukey p<0,05). Análise intergrupo a Diferença estatisticamente significante com G I e G IV nos diferentes períodos; b Diferença estatisticamente significante com G II no período de 7 dias; c Diferença estatisticamente significante com G III no período de 7 dias; d Diferença estatisticamente significante com G II no período de 15 dias; e Diferença estatisticamente significante com G III no período de 15 dias; f Diferença estatisticamente significante com G II no período de 30 dias; g Diferença estatisticamente significante com G III no período de 30 dias. (Teste de ANOVA seguido pelo Tukey p<0,05). (b) h Diferença estatisticamente significante com G I aos 7 dias; i Diferença estatisticamente significante com G II aos 7 e 15 dias; j Diferença estatisticamente significante com G VI aos 7 e 30; l Diferença estatisticamente significante com G IV aos 7 e 15 dias; m Diferença estatisticamente significante com G I aos 15 dias; n Diferença estatisticamente significante com G I e G IV aos 30 dias. (Teste de ANOVA seguido pelo Tukey p<0,05). 88 Tabela Tabela 1: (a) Médias e desvio padrão (M±DP) dos dados histométricos da POF (%) na região de furca do primeiro molar inferior, de acordo com cada grupo, tratamento e período. (b) Média e desvio padrão (M±DP) de TRAP+ (célula/mm2) na região de furca do primeiro molar inferior, de acordo com cada grupo, tratamento e período. 80 81 B 82 83 84 85 97 Anexos Anexo A – Certificado da Comissão de Ética na Experimentação Animal (CEEA) 98 Anexo B – Delineamento do Estudo Anexo C – Figura representativa da metodologia adotada para análise histométrica e campo de análise para contagem de célula TRAP. Fotomicrografia evidenciando a área de furca do primeiro molar inferior onde se realizou a quantificação de células TRAP-positivas por mm2 (TRAP) e onde se mensurou a área total de furca (ATF) a partir do qual se obteve a porcentagem de osso na região de furca (POF). 99 Anexo D - Normas para Publicação segundo o Periódico - Journal of Clinical Periodontology. Author Guidelines Content of Author Guidelines: 1. General, 2. Ethical Guidelines, 3. Manuscript Submission Procedure, 4. Manuscript Types Accepted, 5. Manuscript Format and Structure, 6. After Acceptance Relevant Document: Sample Manuscript Useful Websites: Submission Site, Articles published in Journal of Clinical Periodontology, Author Services, Wiley-Blackwell’s Ethical Guidelines, Guidelines for Figures The journal to which you are submitting your manuscript employs a plagiarism detection system. By submitting your manuscript to this journal you accept that your manuscript may be screened for plagiarism against previously published works. 1. GENERAL Journal of Clinical Periodontology publishes original contributions of high scientific merit in the fields of periodontology and implant dentistry. Its scope encompasses the physiology and pathology of the periodontium, the tissue integration of dental implants, the biology and the modulation of periodontal and alveolar bone healing and regeneration, diagnosis, epidemiology, prevention and therapy of periodontal disease, the clinical aspects of tooth replacement with dental implants, and the comprehensive rehabilitation of the periodontal patient. Review articles by experts on new developments in basic and applied periodontal science and associated dental disciplines, advances in periodontal or implant techniques and procedures, and case reports which illustrate important new information are also welcome. Please read the instructions below carefully for details on the submission of manuscripts, the journal's requirements and standards as well as information concerning the procedure after a manuscript has been accepted for publication in Journal of Clinical Periodontology. Authors are encouraged to visit Wiley-Blackwell's Author Services for further information on the preparation and submission of articles and figures. http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1111/(ISSN)1600-051X/homepage/CPE_samplemanuscript.pdf http://mc.manuscriptcentral.com/jcpe http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1111/(ISSN)1600-051X http://onlinelibrary.wiley.com/journal/10.1111/(ISSN)1600-051X http://authorservices.wiley.com/bauthor/author.asp http://authorservices.wiley.com/bauthor/publicationethics.asp http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp http://authorservices.wiley.com/bauthor/illustration.asp http://authorservices.wiley.com/bauthor/ http://authorservices.wiley.com/bauthor/ 100 2. ETHICAL GUIDELINES Journal of Clinical Periodontology adheres to the below ethical guidelines for publication and research. 2.1. Authorship and Acknowledgements Authors submitting a paper do so on the understanding that the manuscript have been read and approved by all authors and that all authors agree to the submission of the manuscript to the Journal. Journal of Clinical Periodontology adheres to the definition of authorship set up by The International Committee of Medical Journal Editors (ICMJE). According to the ICMJE authorship criteria should be based on 1) substantial contributions to conception and design of, or acquisiation of data or analysis and interpretation of data, 2) drafting the article or revising it critically for important intellectual content and 3) final approval of the version to be published. Authors should meet conditions 1, 2 and 3. It is a requirement that all authors have been accredited as appropriate upon submission of the manuscript. Contributors who do not qualify as authors should be mentioned under Acknowledgements. Please note that it is a requirement to include email addresses for all co-authors at submission. If any of the email-addresses supplied are incorrect the corresponding author will be contacted by the journal administrator. Acknowledgements: Under acknowledgements please specify contributors to the article other than the authors accredited. 2.2. Ethical Approvals Experimentation involving human subjects will only be published if such research has been conducted in full accordance with ethical principles, including the World Medical Association Declaration of Helsinki (version 2008) and the additional requirements, if any, of the country where the research has been carried out. Manuscripts must be accompanied by a statement that the experiments were undertaken with the understanding and written consent of each subject and according to the above mentioned principles. A statement regarding the fact that the study has been independently reviewed and approved by an ethical board should also be included. When experimental animals are used the methods section must clearly indicate that adequate measures were taken to minimize pain or discomfort. Experiments should be carried out in accordance with the Guidelines laid down by the National Institute of Health (NIH) in the USA regarding the care and use of animals for experimental procedures or with the European Communities Council Directive of 24 November 1986 (86/609/EEC) and in accordance with local laws and regulations. All studies using human or animal subjects should include an explicit statement in the Material and Methods section identifying the review and ethics committee approval for each study, if applicable. Editors reserve the right to reject papers if there is doubt as to whether appropriate procedures have been used. 2.3 Clinical Trials Clinical trials should be reported using the CONSORT guidelines available at www.consort-statement.org. A CONSORT checklist should also be included in the submission material. http://www.wma.net/en/20activities/10ethics/10helsinki/index.html http://www.consort-statement.org/ http://www.consort-statement.org/index.aspx?o=2964 101 Journal of Clinical Periodontology encourages authors submitting manuscripts reporting from a clinical trial to register the trials in any of the following free, public clinical trials registries: www.clinicaltrials.gov, http://clinicaltrials.ifpma.org/clinicaltrials/, http://isrctn.org/. The clinical trial registration number and name of the trial register will then be published with the paper. 2.4 DNA Sequences and Crystallographic Structure Determinations Papers reporting protein or DNA sequences and crystallographic structure determinations will not be accepted without a Genbank or Brookhaven accession number, respectively. Other supporting data sets must be made available on the publication date from the authors directly. 2.5 Conflict of Interest and Sources of Funding Authors are required to disclose all sources of institutional, private and corporate financial support for their study. Suppliers of materials (for free or at a discount from current rates) should be named in the source of funding and their location (town, state/county, country) included. Other suppliers will be identified in the text. If no funding has been available other than that of the author’s institution, this should be specified upon submission. Authors are also required to disclose any potential conflict of interest. These include financial interests (for example patent, ownership, stock ownership, consultancies, speaker’s fee,) or provision of study materials by their manufacturer for free or at a discount from current rates. Author’s conflict of interest (or information specifying the absence of conflicts of interest) and the sources of funding for the research will be published under a separate heading entitled “Conflict of Interest and Sources of Funding Statement”. See Editor-in-Chief Maurizio Tonetti’s Editorial on Conflict of Interest and Sources of Funding and www.icmje.org/#conflicts for generally accepted definitions. 2.6 Appeal of Decision Under exception circumstances, authors may appeal the editorial decision. Authors who wish to appeal the decision on their submitted paper may do so by e-mailing the editorial office at cpeedoffice@wiley.com with a detailed explanation for why they find reasons to appeal the decision. 2.7 Permissions If all or parts of previously published illustrations are used, permission must be obtained from the copyright holder concerned. It is the author's responsibility to obtain these in writing and provide copies to the Publishers. 2.8 OnlineOpen OnlineOpen is available to authors of primary research articles who wish to make their article available to non-subscribers on publication, or whose funding agency requires grantees to archive the final version of their article. With OnlineOpen, the author, the author's funding agency, or the author's institution pays a fee to ensure that the article is http://www.clinicaltrials.gov/ http://clinicaltrials.ifpma.org/clinicaltrials/ http://isrctn.org/ http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-051X.2006.00948.x/abstract http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1600-051X.2006.00948.x/abstract http://www.icmje.org/#conflicts mailto:cpeedoffice@wiley.com 102 made available to non-subscribers upon publication via Wiley Online Library, as well as deposited in the funding agency's preferred archive. For the fu