UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE B IOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Departamento de Biologia Estrutural e Funcional Laboratório de Biologia e Genética de Peixes Estudos genéticos em Squalus mitsukurii (Squalidae) na costa da américa, utilizando SNPs Ailton Amarante Ariza Botucatu - SP 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE B IOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Departamento de Biologia Estrutural e Funcional Laboratório de Biologia e Genética de Peixes Estudos genéticos em Squalus mitsukurii (Squalidae) na costa da américa, utilizando SNPs Botucatu - SP 2023 Aluno: Ailton Amarante Ariza Orientadora: Dra. Profa.Vanessa Paes da Cruz Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Zoologia) do Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre. Agradecimentos Agradeço primeiramente a minha família, por todo apoio e por sempre me incentivarem mesmo nos momentos difíceis durante todos esses anos. A minha orientadora Vanessa pelas correções, ensinamentos que me permitiram apresentar um melhor desempenho, pela ajuda e paciência que me ajudaram a finalizar este trabalho. Aos professores Claudio e Fausto por todo apoio, suporte e auxílio. Aos meus amigos que sempre estiveram ao meu lado, pela amizade e pelo apoio, em especial para minhas companheiras de laboratório Aisni, Beatriz B., Beatriz D., Giovana e Najla. Aos colaboradores deste projeto, Dr. Sergio M. Delpiani, Pollyana Roque e ao Instituto de Biotecnologia (IBETEC- Unesp Botucatu). Por fim, agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológica (Zoologia) da Unesp de Botucatu, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (processo 130332/2021-6), por ser a agência de fomento responsável pela minha bolsa e assim proporcionaram a realização do meu mestrado. Resumo Conhecidos popularmente como cação-bagre, os pequenos tubarões do gênero Squalus podem atingir até 1,5 m. As espécies deste gênero estão distribuídas em todo o mundo, algumas com ampla distribuição e outras com elevado grau de endemismo. No entanto, devido as suas características biológicas como, crescimento lento, maturação sexual tardia e poucos filhotes por ninhada, estes tubarões estão cada vez mais ameaçados de extinção, principalmente pelos efeitos da pesca excessiva. Atualmente, Squalus mitsukurii está classificado como "em perigo" na lista vermelha de espécies ameaçadas da IUCN (International Union for Conservation of Nature). Squalus mitsukurii é considerado residente das águas do leste asiático, tendo distribuição da costa da Coreia até o Vietnã, porém indivíduos no Oceano Atlântico já foram nomeados como S. mitsukurii ou S. cf. mitsukurii. Entender sobre a biologia reprodutiva, ecologia e estrutura populacional é de grande importância para traçar estratégias de manejo e conservação de espécies ameaçadas. Nesse contexto o presente trabalho teve como objetivo caracterizar e identificar a diversidade e estrutura populacional de S. mitsukurii em três populações na costa da América, com a utilização de marcadores moleculares do tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Foram analisadas as amostras coletadas no oceano Pacífico, na costa da California (n = 11) nos Estados Unidos e em duas localidades do Atlântico nos estados brasileiros de Pernambuco (n= 17) e São Paulo (n= 10), totalizando 38 amostras. Após a construção da biblioteca genômica através da metodologia de ddRAD (double digest Restriction Associated DNA) e sequenciamento Illumina, foi obtido um total de 33.480.939 sequencias. Após etapas bioinformáticas foram retidos 8.206 marcadores SNPs. Os índices de diversidade genética apresentaram valores de 0,077 a 0,222 para heterozigosidades observada, enquanto a heterozigosidade esperada apresentou valores de 0,098 a 0,306. Os resultados obtidos da análise de coeficiente de endogamia (FIS) apresentaram valores positivos, indicando a ocorrência de endogamia. Os índices de estruturação genética obtidos através da análise de FST variou de 0,119 apresentados entre as populações da Califórnia e São Paulo, à 0,049 entre as populações de São Paulo e Pernambuco, indicando estruturação genética moderada. Indícios de estruturação genética também foi observada na análise de DAPC, que corroborou com a separação em três cluster genéticos para cada região analisada. Este é o primeiro estudo a identificar e caracterizar a diversidade genética e estrutura populacional em Squalus mitsukurii, os resultados obtidos neste estudo indicam a existência de três estoques genéticos em S. mitsukurii, estudos contendo outras localidades são necessários para identificar outros estoques e conectividade entre as populações. Abstract Popularly known as catsharks, the small sharks of the genus Squalus can reach up to 1.5 m. Species of this genus are distributed worldwide, some with wide distribution and others with a high degree of endemism. However, due to their biological characteristics such as slow growth, late sexual maturity, and few offspring per litter, these sharks are increasingly threatened with extinction, mainly due to the effects of overfishing. Currently, Squalus mitsukurii is classified as "endangered" on the IUCN Red List of Threatened Species (International Union for Conservation of Nature). Squalus mitsukurii is considered a resident of East Asian waters, with a distribution from the coast of Korea to Vietnam, although individuals in the Atlantic Ocean have been named as S. mitsukurii or S. cf. mitsukurii. Understanding the reproductive biology, ecology, and population structure is of great importance for developing management and conservation strategies for threatened species. In this context, the present study aimed to characterize and identify the diversity and population structure of S. mitsukurii in three populations along the American coast, using Single Nucleotide Polymorphism (SNP) molecular markers. Samples collected in the Pacific Ocean, off the coast of California (n = 11) in the United States, and in two locations in the Atlantic Ocean in the Brazilian states of Pernambuco (n = 17) and São Paulo (n = 10) were analyzed, totaling 38 samples. After constructing the genomic library using the ddRAD (double digest Restriction Associated DNA) methodology and Illumina sequencing, a total of 33,480,939 sequences were obtained. After bioinformatic steps, 8,206 SNP markers were retained. Genetic diversity indices showed values of 0.077 to 0.222 for observed heterozygosity, while expected heterozygosity showed values of 0.098 to 0.306. The results obtained from the analysis of the coefficient of inbreeding (FIS) showed positive values, indicating the occurrence of inbreeding. The genetic structuring indices obtained through the FST analysis ranged from 0.119 between the populations of California and São Paulo to 0.049 between the populations of São Paulo and Pernambuco, indicating moderate genetic structuring. Evidence of genetic structuring was also observed in the Discriminant Analysis of Principal Components (DAPC), which corroborated the separation into three genetic clusters for each analyzed region. This is the first study to identify and characterize the genetic diversity and population structure in Squalus mitsukurii. The results obtained in this study indicate the existence of three genetic stocks in S. mitsukurii, and studies containing other locations are necessary to identify other stocks and connectivity between populations. Sumário 1. Introdução ................................................................................................................ 8 2. Objetivos ................................................................................................................ 12 3. Material ................................................................................................................... 12 3.1 Obtenção das amostras .................................................................................... 12 4. Métodos .................................................................................................................. 13 4.1 Obtenção de DNA ............................................................................................ 13 4.2 Elaboração das bibliotecas de SNPs ............................................................... 14 4.3 Ligação dos adaptadores ................................................................................. 14 4.4 Indexação ......................................................................................................... 15 4.5 Pool das amostras ............................................................................................ 15 4.6 Análises dos resultados .................................................................................... 15 4.6.1Detecção e filtragem de SNPs.................................................................. 15 4.6.2Análises de diversidade genética populacional ....................................... 17 5. Resultados .............................................................................................................. 17 6. Discussão ................................................................................................................ 20 7. Referencias ............................................................................................................. 23 Apêndice 1 ..................................................................................................................... 30 8 1. Introdução Os ambientes marinhos apresentam diversos ecossistemas e uma variedade de grupos de organismos, incluindo os elasmobrânquios (Santos et al. 2020, Martins et al. 2022). Os elasmobrânquios representados pelos tubarões e as raias ocupam os mais diferentes níveis da cadeia trófica (Frisch et al. 2016, Bengil et al. 2022), apresentando crescimento lento, maturidade sexual tardia e poucos filhotes por ninhada (Cortés 2000, Stevens et al. 2000, Natanson et al. 2017, Penfold & Wyffles 2019, Ebert et al. 2021, Whitenack et al. 2022). Nas últimas décadas os elasmobrânquios sofreram um significativo declínio populacional em diversas espécies de tubarões e raias pelo mundo, aumentando consideravelmente os riscos de extinção de algumas espécies (Roff et al. 2018, Pacoureau et al. 2023, Sherman et al. 2023).Estima-se que 32,6% das espécies de elasmobrânquios encontram-se ameaçadas de extinção, entretanto, levando em conta as espécies que ainda se encontram como dados deficientes, este número pode ser ainda maior (Dulvy et al. 2021). A pesca é um dos principais contribuintes para a diminuição das populações de tubarões (Pacoureau et al. 2023, Sherman et al. 2023), podendo ocorrer pelos efeitos da pesca direcionada (Shea & To, 2017, Yano et al. 2022, Sherman et al. 2023) e ou pesca acessória (Santos et al. 2022, Cronin et al. 2023, Sherman et al. 2023). Há registros que algumas espécies de tubarões do gênero Squalus também vem sendo super exploradas pela pesca direcionada há mais de 120 anos (Yano et al. 2022). O gênero Squalus (Linnaeus, 1758) abriga espécies de tubarões popularmente conhecidos por cação bagre, este gênero apresenta mais de 35 espécies validas (Last et al. 2007, Daly-Engel et al. 2018, Pfleger et al. 2018, Ziadi-Künzli et al. 2020, Ebert et al. 2021). Estes são considerados tubarões de pequeno porte, podendo atingir até 1, 5m de comprimento, são comumente encontrados até 1000 m de profundidade, possuem hábito demersal e distribuição circunglobal (Compagno, 1984; Compagno et al. 2005, Ebert et al. 2021). Dentre as espécies do gênero, foram identificados comportamento de segregação por sexo e idade, e ainda, algumas espécies são consideradas residentes, enquanto outras realizam migrações de longa distância (Ebert et al. 2021). 9 Assim como os demais elasmobrânquios, a história de vida das espécies do gênero Squalus também é caracterizada por crescimento lento, maturação sexual tardia em média 15 anos e longa expectativa de vida, com indivíduos registrados com mais de 40 anos (Ebert et al. 2010, Ebert et al. 2021, Bengil et al. 2022), algumas espécies como S. acanthias podem apresentar período gestacional de até 24 meses, sendo um dos períodos mais longos registrados em vertebrados (Natanson et al. 2017, Ebert et al. 2021). Este gênero, possui caracteres fenotípicos limitados para identificação, como contagem de vertebras e medidas corporais, no qual se sobrepõe entre as espécies (Ebert et al. 2013, Viana et al. 2016, Veríssimo et al. 2017, Bellodi et al. 2018, Pfleger et al. 2018). Estudos taxonômicos e moleculares revelaram que este gênero é composto por três grandes complexos de espécies, sendo o complexo S. suckleyi/S. acanthias; S. blainville/S. megalops/S. raoulensis/S. brevirostris; e o terceiro complexo denominado complexo S. mitsukurii, comportando o maior número de espécies (Veríssimo et al. 2017, Bellodi et al. 2018, Ferrari et al. 2021). As espécies do gênero Squalus, como S. montalbani, S. japonicus, S. hemipinnis, S. formosus, S. blainville, S. bucephalus, S. quasimodo, S. altipinnis, S. melanurus, S. mahia, S. albicaudus e S. lobularis encontram-se classificadas com algum grau de ameaça ou como dados deficientes na União Internacional para a Conservação da Natureza (do inglês International Union for Conservation of Nature, IUCN (Finucci & Kine 2018, Finucci & White 2018, Finucci et al. 2019, Graham 2019, Dulvy et al. 2020, Pollom & Herman 2020, Pollom et al. 2020, Rigby et al. 2020, Finucci & Pacoureau 2021). Squalus mitsukurii (Jordan e Snyder,1903) é caracterizado morfologicamente por apresentar focinho arredondado e longo, um curto espinho na nadadeira dorsal e a presença de uma barra preta na parte posterior nadadeira caudal (Last et al. 2007, Viana et al. 2016, Ebert et al. 2021) (Figura 1). Sua descrição foi realizada a partir de um indivíduo coletado próximo ao Japão, e atualmente, é considerado residente do Pacífico, com distribuição no leste asiático, abrangendo a costa da Coreia do Norte até a costa do Vietnam (Finucci et al. 2020). Entretanto, indivíduos da espécie já foram registrados em várias regiões dos Oceanos Atlântico, Indico e Pacífico, no qual foram nomeados como S. mitsukurii ou S. cf. mitsukurii (Viana et al. 2016) Squalus mitsukurii apresenta expectativa de vida longa, em torno de 23 anos em machos e 26 anos em fêmeas, alcança a maturidade sexual tardiamente, em média com 09 anos e 15 anos, respectivamente (Cotton et al. 2011). Apresentam poucos filhotes por ninhada 10 com cerca de 3 a 11 filhotes por ninhada (Fischer et al. 2006) e apresenta o modo reprodutivo do tipo viviparidade lecitotrófica (Oddone et al. 2010), ou seja, há o desenvolvimento intrauterino do embrião, o embrião em desenvolvimento obtém seus nutrientes através do vitelo, que é armazenada no saco vitelínico conectado diretamente ao seu sistema digestivo (Hamlett 2011). Figura 1. Exemplar de Squalus mitsukurii. Foto: Sarah Tházia Viana de Figueirêdo, 2018. Squalus mitsukurii é capturada acidentalmente pela pesca artesanal e comercial (Ziadi-Kunzli et al. 2020) e em diferentes artefatos pesqueiros, como rede de arrasto demersal, espinhel, e possivelmente, rede de emalhe e rede de espera (Finucci et al. 2020). Segundo a lista vermelha de espécies ameaçadas da IUCN, S. mitsukurii encontra-se listada como “em perigo” (Finucci et al. 2020), porém no Brasil, a espécie está classificada como “dados deficientes” no Sistema de Avaliação do Risco de Extinção da Biodiversidade, do Instituto Chico Mendes da Conservação da Biodiversidade (ICMBio, 2022). Para traçar estratégias efetivas de gestão e conservação de espécies, é importante antes compreender sobre a biologia reprodutiva, ecologia, diversidade genética e estrutura populacional das espécies (Santos et al. 2020, Postaire et al. 2022). Os objetivos de gestão muitas vezes se concentram em populações distintas ou linhagens independentes, aspectos difíceis de determinar em algumas espécies. No entanto, os métodos de genética populacional fornecem um meio de delinear padrões de distribuição geográfica de acordo com a variação molecular das populações, assim inferindo processos e hipóteses, que geram e mantêm esses padrões (Allendorf 2017, De Kort et al. 2021, Stronen et al. 2022). A genética de populações é uma ferramenta que desempenha um papel importante no manejo e conservação de espécies ameaçadas de extinção (Frankham 2010), pois revela peculiaridades nas populações, como a endogamia, comprometendo a viabilidade 11 de populações naturais ao longo do tempo (Frankham et al. 2012). A manutenção da diversidade genética é um dos fundamentos da genética da conservação, principalmente porque esta confere plasticidade às espécies frente a uma série de variáveis ambientais e sustenta seu potencial evolutivo (Bernatchez 2016, Willi et al. 2022). Nas últimas décadas, os marcadores moleculares de polimorfismos de nucleotídeo único (do inglês Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) vem demostrando ser um marcador molecular resolutivo, permitindo inferir a diversidade e estrutura populacional com precisão em espécies não modelo, ou seja espécies que não apresentam genoma de referência (Andrews et al. 2016, Green et al. 2019, Martins et al. 2022, Nelson et al. 2022) e ainda, um eficiente marcador genético para questões relacionadas a genética da conservação (Morin et al. 2009, McMahon et al. 2014, Zimmerman et al. 2020). Os SNPs são mutações pontuais no DNA que foram fixadas ao longo das gerações. Estes polimorfismos possuem ampla distribuição pelo genoma e podem ser encontrados em regiões de íntrons e éxons (Han et al. 2019). A utilização de marcadores moleculares do tipo SNPs em espécies não modelo, foi possível com o avanço de tecnologias de sequenciamento, como o sequenciamento de nova geração (NGS) associado com outras metodologias, como o RADseq (Restriction-site associated DNA sequencing), que se baseia na fragmentação do DNA, com o uso de uma ou mais enzimas de restrição, no qual permitirá uma redução do genoma da espécie a ser analisado (Baird et al. 2008, Peterson et al. 2012). A partir da técnica original de RADseq, derivadas metodologia surgiram, como o ddRADseq (Double digest RAD sequencing) (Peterson et al. 2012). Em suma a técnica ddRAD baseia-se na utilização de duas enzimas de restrição para realizar a digestão do DNA genômico, para posteriormente a construção da biblioteca genômica e o sequenciamento massivo de representações reduzidas do genoma, tendo como finalidade a obtenção de marcadores SNPs (Andrews et al. 2016, Driller et al. 2020). A utilização do ddRADseq ganhou popularidade por apresentar ótima relação custo-benefício em relação à quantidade de dados adquiridos, rápida, de fácil replicação e principalmente pela possibilidade da aplicação em espécies não modelo (Siccha-Ramirez et al. 2018, Green et al. 2019, Devloo‐Delva et al. 2019, Green et al. 2022). Apesar da utilização de SNPs para obtenção de dados populacionais de tubarões ter se mostrado resolutiva em diferentes grupos (Green et al. 2019, Devloo‐Delva et al. 2019, Green et al. 2022), muitas espécies ainda continuam com total ausência de informações genéticas populacionais, como S. mitsukurii. Portanto é necessária 12 maior atenção em estudos genéticos para esta espécie, que nos últimos anos, vem sofrendo com a ação antropogênica, com isso, uma melhor gestão e consequentemente, uma melhor ação de conservação sobre essa espécie poderá ser realizada. 2. Objetivos Considerando-se a falta de informações acerca da diversidade genética de Squalus mitsukurii, com o presente trabalho tem como objetivo principal caracterizar geneticamente as populações deste grupo de organismos que ocorre na costa brasileira, mais especificamente no litoral de Pernambuco e São Paulo, e na região leste do Oceano Pacífico, no litoral da California. Procurar-se-á identificar e caracterizar as populações, bem como sua diversidade genética e suas conectividades existentes entre essas entidades biológicas, buscando verificar os possíveis mecanismos envolvidos no processo de diversificação e dispersão dos seus componentes. De modo específico, pretende-se: • analisar amostras de S. mitsukurii que ocorrem no litoral brasileiro e na costa leste do Oceano Pacífico, buscando identificar diferenças e similaridades em nível de espécie e populações de Squalus mitsukurii com o uso dos marcadores moleculares SNPs; • verificar a variabilidade genética intrapopulacional e interpopulacional em Squalus mitsukurii utilizando marcadores SNPs; • testar a hipótese de panmixia entre as três localidades S. mitsukurii. 3. Material 3.1 Obtenção das amostras Para realização do presente estudo foram analisadas 38 amostras de tecido muscular de Squalus mitsukurii de três localidades da costa das Américas, pertencentes aos Oceanos Atlântico e Pacífico. As amostras foram obtidas através de pesquisadores colaboradores e encontram-se depositadas na coleção de tecidos do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, sendo 11 amostras no estado da Califórnia (CA) nos Estados Unidos e amostras na costa dos estados brasileiros de Pernambuco (PE) e de São Paulo (SP), sendo 17 amostras de Pernambuco e 10 de São Paulo, conforme indicado na Figura 2. Fragmentos de tecido dos exemplares coletados foram armazenados em frascos 13 contendo etanol a 95% e armazenadas a -20o, algumas amostras foram previamente identificadas por meio da metodologia do DNA Barcoding utilizando o gene mitocondrial citocromo c oxidase I (COI) e estão indicadas na Tabela S1. Figura 2. Mapa das Américas do norte, central e sul, indicando em destaque as regiões dos espécimes de Squalus mitsukurii amostrados no presente estudo. 4. Métodos 4.1 Obtenção de DNA A preparação da biblioteca de SNPs foi realizada no Laboratório de Biologia e genética de Peixes da Unesp campus de Botucatu. O protocolo utilizado para o desenvolvimento de SNPs foi aquele descrito por Peterson et al. (2012) e adaptado em Campos et al. (2017) com a técnica ddRAD (double digest Restriction Site Association DNA). Inicialmente, o DNA genômico dos indivíduos foi extraído do tecido muscular utilizando o Kit de extração Promega. A quantidade de DNA genômico das amostras foi determinada pelo equipamento Qubit® 4.0 Fluorometer (Invitrogen), posteriormente padronizada através de diluição para uma reação de digestão com volume final de 34 µl, com a concentração de 200 ng de DNA. 14 4.2 Elaboração das bibliotecas de SNPs A digestão enzimática foi realizada com duas enzimas de restrição, sendo uma das enzimas de corte raro EcoRI (20U/μl) e outra MspI (10U/μl) de corte mais frequente, 4 μl TANGO buffer (Cut Smart) a um volume final de 40 μl, a etapa de digestão ocorreu a 37ºC durante três horas. Ao final da digestão do genoma pelas enzimas, foi realizada a etapa de purificação com o kit de beads Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA), de acordo com o protocolo do fabricante, cuja finalidade é eliminar os restos de enzimas e remover fragmentos de DNA menores que 100pb e maiores que 500 pb. Posterior a purificação, as amostras de DNA foram submetidas a uma quantificação no Qubit® 4.0 Fluorometer (Invitrogen), para obter a concentração de DNA contida em cada amostra, para posteriormente ser feita a ligação dos adaptadores. 4.3 Ligação dos adaptadores Os fragmentos de DNA digeridos possuem regiões complementares aos adaptadores específicos de cada enzima. Para a reação de ligação dos adaptadores foram utilizados um par de adaptadores hibridizados P1(0,3 μM) e P2 (4,8 μM), esta etapa foi realizada em um volume final de 40 µl com 0,5 µl da enzima T4 ligase, 4 µl do tampão 10X T4 DNA ligase Reaction Buffer, 2,0 µl do adaptador P1 4.04 µM (referente a EcoRI), e 2,0 µl do adaptador P2 0,07 µM (referente a MspI), sendo que cada indivíduo apresentava um barcode diferente no adaptador P2. Este processo de ligação ocorreu com as amostras incubadas a 23ºC durante 30 min, 65ºC por 10 min, 63ºC por 90 segundos, ao qual a cada 90 segundo a temperatura diminui 2 ºC, até alcançar 23 ºC. Após a etapa de ligação dos adaptadores foi realizada novamente a etapa de purificação com o kit de beads Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA), de acordo com o protocolo do fabricante. 15 4.4 Indexação Em seguida foi realizada a etapa de enriquecimento via amplificação por PCR com a Phusion® High-Fidelity PCR Kit. Esta etapa foi necessária para incorporar a sequência de anelamento no flowcell da Illumina e as regiões das sequências (index) dos primers da Illumina, cada amostra continha um conjunto de primers único que indexado a cada amostra. As condições de PCR ocorreram em volume final de 50 µL, sendo 13,6 µL de H2O, 0,4 µL dNTPs 10 mM, 4 µL 5X Phusion HF Buffer, 2,5 µL de primer P1 5 µM, 5,0 µL de Primer P2 5 µM, 5,0 µL Phusion DNA Polymerase e 15 µL de DNA digerido. Os ensaios de PCR foram realizados em uma etapa inicial à temperatura de 72ºC por 3 min; 30 segundos a 95ºC; seguindo-se 16 ciclos a 95ºC por 10 segundos, 55ºC por 30 segundos e a 72ºC por 30 segundos; e uma etapa final a 72ºC por 5 min. Novamente foi realizada a etapa de purificação, purificação com o kit de beads Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA), de acordo com o protocolo do fabricante. As amostras foram quantificadas por meio do equipamento Qubit® 4.0 Fluorometer (Invitrogen) e posteriormente padronizadas a um volume final de 10 µL. 4.5 Pool das amostras Foi realizado um pool composto por todas as amostras, sendo que este pool foi posteriormente aplicado em um gel de agarose a 1%, de onde foram cortados fragmentos de 300 pb a 500pb. Os fragmentos cortados do gel de agarose foram purificados utilizando-se o kit Wizard SV gel Promega, para verificar com precisão a biblioteca, foi realizado o PCR em tempo real (qPCR), e, posteriormente, a normalização da mesma. A biblioteca foi sequenciada com leituras de extremidade única (single-end) de 150pb, em uma célula de fluxo (flow cell) High Output, na plataforma NGS Illumina Nextseq500 no Instituto de Biotecnologia (IBTEC– UNESP, campus Botucatu/SP), em colaboração com Prof. Dr. Paulo Eduardo M. Ribolla. 4.6 Análises dos resultados 4.6.1 Detecção e filtragem de SNPs Após a etapa de sequenciamento das bibliotecas, foram obtidas as leituras das sequências (raw data). A fim de verificar a acurácia de qualidade das reads, dois 16 programas foram utilizados: o FastQC (Andrews, 2010), disponível em: http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/, o qual verifica diferentes parâmetros de qualidade das reads de cada amostra e o programa MultiQC (Ewels et al. 2016), disponível em https://github.com/ewels/MultiQC, que combina os resultados do FastQC e aplica para todas as sequências simultaneamente. Os programas FastQC e MultiQC permitem visualizar em forma gráfica, a qualidade das amostras representadas por Phred Quality Score (Q) que pode variar de 10 a 60, presença possíveis adaptadores e tamanho das sequências em pares de base (pb), entre outras informações. Após a etapa de verificação de qualidade, foi realizada a filtragem das sequências para só constar no conjunto de dados somente reads com grau de qualidade acima de Q>20. Foi realizada uma digestão in sílico para remoção de sequências que continham possíveis sítios enzimáticos não digeridos, posteriormente o conjunto de dados restante foi submetido ao software Trimmomatic, onde as sequências foram padronizadas em um tamanho de 143pb. A montagem do catálogo de marcadores e rastreio de SNPs foi realizado utilizando o pipeline STACKS (Catchen et al. 2011). O objetivo deste programa é proporcionar a identificação e montagem do painel de marcadores, aplicando uma série de estatísticas utilizadas (ver Paris et al. 2017). Como a espécie alvo deste estudo não possui genoma de referência, foi realizada a montagem do catálogo de marcadores, a escolha dos indivíduos para montagem do catálogo de SNPs, foi realizada com amostras que continham o maior número de reads e, ao final, foram selecionadas três amostras, sendo uma de Pernambuco (voucher:195FLPE), uma de São Paulo (voucher: Sm5) da Califórnia (voucher: 1164CA). A partir das amostras selecionadas, foi realizado o rastreio de SNPs utilizando a abordagem de novo. O rastreio do SNPs foi efetuado com os parâmetros de M=2 reúne os stacks com limite de distâncias (clusterização) e m=3, este parâmetro seleciona qual número mínimo de cobertura. Posteriormente, com o catálogo de marcadores, foi construída a biblioteca de referência utilizando o software Bowtie2 (v2.2.4) e, ao final, todas as amostras foram genotipadas (refmap), através da abordagem Populations implementado pela pipeline STACKS (Catchen et al. 2011), utilizando 3 filtros, primeiramente foram selecionados SNPs que ocorrem em pelo menos 70% dos indivíduos (r = 0.7), posteriomente foi aplicado o filtro que remove SNPs que apresentram valor de MAF (Minor allele frequency) <0.05, por fim, foi aplicado o filtro que exclui SNPs com heterozigozidade 17 maior que 0,65, o último filtro foi aplicado pois SNPs com heterozigosidade alta, podem ser artefatos que podem interferir no resultado das análises. 4.6.2 Análises de diversidade genética populacional A aplicação do programa populations, que compõe a pipiline do STACKs permitiu calcular o número de alelos privados (Na), a Heterozigosidade Observada (Ho), a Heterozigosidade Esperada (He), o coeficiente de endogamia (FIS). Com a finalidade de analisar a diferenciação genética entre as populações, o programa Alerquin (Excoffier et al. 2010) também foi utilizado para calcular os valores de FST (Meirmans, 2006). Foi realizada uma análise discriminante de componentes principais (DAPC) proposta por Jombart et al. (2010) para estimar possível estruturação genética entre as populações da espécie analisada. Esta análise foi implementada com o pacote adegenet do R (Jombart & Ahmed, 2011) e o número apropriado de clusters genéticos foi determinado utilizando o critério de informação bayesiana (Bayesian Information Criterion - BIC). 5. Resultados Foram obtidos resultados para 38 exemplares de S. mitsukurii, sendo 11 da Califórnia (EUA), 17 de Pernambuco e 10 de São Paulo (Brasil). A biblioteca de ddRAD resultou em um total de 33.480.939 de sequências, variando de 426.695 a 1.362.078 para cada indivíduo, tendo um comprimento de 35 a 151 pb (pares de base). A qualidade das sequências foi verificada através dos programas FastQC e MultiQC (Figura 3), após a remoção das reads abaixo do valor de referência Q<20, foram removidas 177.078 sequências do conjunto de dados, resultando em um total de 33.303.861, variando de 426.062 a 1.357.950 sequências por indivíduo. 18 Figura 3. Representação gráfica da qualidade das sequências através do MultiQC, Sendo A e C antes das filtragens e B e C depois das filtragens. A e B representam o valor médio da qualidade de cada base (Mean Quality Scores), C e D representam os índices de qualidade por sequência (Per Sequence Quality Scores). Posteriormente, as sequências foram submetidas a uma digestão in sílico para remoção de possíveis sítios enzimáticos e, ao final desta etapa, 31.604.817 reads restaram no conjunto de dados final (Apêndice 1). Ao final, todas as reads foram padronizadas em um tamanho de 143pb, utilizando o software Trimmomatic, restando 26.795.041 reads para as análises populacionais. O rastreio de marcadores SNPs, utilizando as pipelines denovo e refmap do Stacks resultou inicialmente em 30.353 SNPs. Estes SNPs foram filtrados para uma melhor acurácia no conjunto de dados, resultando em um total de 8.206 SNPs, dos quais 3.666 são transições e 4.540 transversões (Figura 4). 19 Figura 4. Identificação da distribuição de 8.206 SNPs em vermelho, quantidade de SNPs sendo transições (cinza) e transversões (preto) obtidas nas amostras de Squalus mitsukurii. As 38 amostras de S. mitsukurii foram genotipadas com um total de 8.206 marcadores SNPs. Foram calculadas diferentes estimativas de diversidade genética para as três populações e esses valores estão apresentados na tabela 1. A presença de alelos privados foi mais elevada na localidade de Pernambuco, apresentando 486 alelos privados, enquanto Califórnia e São Paulo apresentaram 214 e 241 alelos privados respectivamente. Além disso a heterozigosidade observada foi menor que a heterozigosidade esperada em todas as regiões geográficas amostradas. Os valores do coeficiente de endogamia (FIS) das populações foram positivos (0,0730-0,2114), indicando a presença de endogamia nas populações. Tabela 1. Estimativas de diversidade genética em Squalus mitsukurii por oceano. Oceano País Região Sigla n Ap Ho He Fis Pacífico EUA Califórnia CA 11 214 0,18586 0,19134 0,0730 Atlântico Brasil São Paulo SP 10 241 0,22276 0,30623 0,2241 Pernambuco PE 17 486 0,07773 0,09852 0,2114 Abreviações: número de amostras (n), alelos privados (Ap), heterozigosidade observada (Ho), heterozigosidade esperada (He), coeficiente de endogamia (Fis). A análise pairwise do índice de diferenciação genética (FST) entre as localidades da Califórnia e São Paulo resultou o maior valor de FST 0,119 (P value 0,000±0,000), 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 AC AG AT CG CT GT Ts Tv SNPs 20 enquanto entre Califórnia e Pernambuco resultou no valor de 0,075 (P value 0,000±0,000). Entre as localidades do Atlântico, São Paulo e Pernambuco, a análise resultou no valor de 0,049 (P value 0.06306±0.0273). Os valores obtidos indicam uma estruturação genética moderada entre as três populações. A análise Discriminante de Componentes Principais (DAPC) demostrou que os componentes das três localidades estão subdivididos em 3 grupos genéticos, não havendo compartilhamento dos clusters entre os as populações (Figura 5A e 5B). Figura 3. Inferências do número de cluster obtidos em Squalus mitsukurii, utilizando 8.206 SNPs, em 38 espécimes. (A) Resultado obtido através do software DAPC demostrando o compartilhamento de cluster por amostra. (B) Subdivisão dos indivíduos baseado no DAPC em três grupos genéticos k=3. 6. Discussão Neste estudo realizamos a primeira avaliação dos aspectos genômicos de diversidade genética, baseada em SNPs para indivíduos de S. mitsukurii. As estimativas 21 de estruturação populacional encontradas neste estudo utilizando marcadores do tipo SNPs, indicaram diferenciação genética moderada entre as três populações, de acordo com Wright (1978), valores de FST de 0,05 a 0,15 indicam diferenciação genética moderada, como a apresentada no estudo, refutando a hipótese e panmixia em S. mitsukurii, evidenciando a existência de três estoques genéticos distintos. Os valores das heterozigosidades obtidos no presente estudo indicam uma baixa frequência de heterozigotos em S. mitsukurii, evidenciados pelos valores das heterozigosidades observada (Ho) de 0,077 a 0,222 serem menores que os obtidos nas heterozigosidades esperadas (He) que variou de 0,098 a 0,306. Esta variação também pode ser encontrada no tubarão com Carcharhinus albimarginatus esta espécie apresenta ocorrência em plataformas continentais a aproximadamente 800 m de profundidade variaram de 0,126-0,13 para Ho e 0,139-0,152 para He (Green et al. 2019). No entanto níveis de heterozigosidades apresentada por S. mitsukurii foi relativamente baixa quando comparada com outros estudos utilizando SNPs em espécies congêneres, como o Squalus acanthias que apresentou 0,281-0,293(Ho) e 0,250-0,258 (He) (Boza, 2022) e Squalus albicaudus Ho=0,230-0,423 e He=0,212-0,377 (Adachi, 2022), S. acanthias e S. albicaudus, além de apresentarem elevados valores de heterozigosidades as espécies também apresentaram Ho maior que He o que não é encontrado em S. mitsukurii. Paralelamente aos resultados das heterozigosidades, os valores do coeficiente de endogamia (Fis), valores positivos e diferentes de zero apontam a presença de endogamia na população, como observado no estudos de Green et al. (2022) Fis = 0,177- 0,228. Os índices de diversidade genética obtidos aumentam o alerta para conservação da espécie S. mitsukurii, definido pelo menor número de heterozigotos, presença de endogamia e pesca, podem acarretar a diminuição variabilidade genética nas populações (Domingues et al. 2018). Estruturação genética encontrada através dos valores de FST também foram encontra em tubarões de ampla distribuição, quando comparadas populações pertencentes aos oceanos Atlântico e Pacífico como Galeocerdo cuvier FST=0,5293-0,9221 (Bedulli et al. 2019) e como apresentado por Bernard et al. (2021) FST=0,182-0,190, O estudo realizado por Corrigan et al. (2018) analisou o DNA mitocondrial de Isurus oxyrinchus, popularmente conhecido como tubarão Mako, que é uma espécie conhecida por apresentar comportamento migratório. Os resultados indicaram uma leve estruturação 22 populacional com um valor de FST variando de 0,072 a 0,80 ao comparar indivíduos de dois oceanos diferentes. DAPC também indicou que as três regiões amostradas no presente estudo demonstram estruturação genética, um dos principais fatores para que esteja ocorrendo esta diferenciação nos clusters, pode ser em decorrência da distância entre as regiões do Pacífico e Atlântico. A descontinuidade genética apresentada pelas populações de Pernambuco e São Paulo podem estar ocorrendo pela presença do monte submarino presente na costa brasileira Vitória–Trindade, que apresenta ser uma barreira biogeográfica para diferentes espécies de invertebrados, algas e peixes (Martins et al. 2022). O gênero Squalus é taxonomicamente problemático, devido a limitação de caracteres fenotípicos evidentes para separação das espécies, principalmente quando se trata das espécies do complexo mitsukurii (Ferrari et al. 2021). O holótipo da espécie S. mitsukurii foi coletado em Misaki, Kanagawa, Japão, em 1900 por D. S. Jordan e J. O. Snyder e veio a ser descrito dois anos após a coleta. Entretanto, apesar de ser uma espécie descrita na costa do Japão, sua distribuição no Atlântico vem sendo debatida por vários autores (Viana et al.2016, Pfleger et al. 2018, Ziadi-Künzli et al. 2020. Com isso, revisões foram feitas a fim de evidenciar a real distribuição de S. mitsukurii pelo mundo. Foi descoberto que muitos dos indivíduos anteriormente identificados como S. mitsukurii pelo mundo, foi descoberto que muitos dos indivíduos anteriormente identificados como S. mitsukurii na verdade pertencem a outras espécies e em muitos casos com alto grau de endemismo, como S. hawaiiensis (Daly-Engel, et al. 2018), S. clarkae (Pfleger, et al. 2018) e Squalus shiraii (Viana, et al. 2020). Um estudo realizado por Ziadi-Künzli et al. (2020), utilizando a técnica molecular o DNA barcode para dois genes mitocondriais (COI e NADH2) em amostras coletadas no Japão, juntamente com sequências de banco de dados de outras regiões, objetivou evidenciar a proximidade genética destes indivíduos. O estudo mostrou que indivíduos pertencentes ao Japão se diferenciavam geneticamente de outras regiões. Análises morfológicas também foram efetuadas demonstrando que a diversidade do complexo mitsukurii pode estar subestimada ou em processos recentes de especiação (Ziadi-Künzli, et al. 2020). Os resultados obtidos revelaram a existência de três estoques genéticos, o primeiro composto pelas amostras da California, um segundo comportando as amostras de São Paulo e um terceiro estoque composto pelas amostras de Pernambuco, tais resultados 23 apontam para a necessidade de elaboração de planos de gestão e manejo que comportem as populações de maneira que seja levado em consideração a conectividade entre elas. Além disso, análises futuras comportando demais localidades são necessárias para identificação de outros possíveis estoques e analise de conectividade entre as populações, já que a espécie encontra-se como em perigo na IUCN. 7. Referencias Adachi AMC de L. 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Vouchers Localidade DNA Barcode NGS Rawdate Q< 20 Digest Final 1160CA EUA 1225472 1220547 1163354 561978 1164CA EUA 1362078 1357950 1263349 1178028 1167CA EUA 988555 984972 952118 832535 7176CA EUA 933368 921704 855708 638033 7253CA EUA Ariza et al. 2021 698837 697112 657896 459045 12234CA EUA 745883 740445 690904 661840 12236CA EUA Ariza et al. 2021 701598 700193 677548 659748 12238CA EUA Ariza et al. 2021 901289 892808 868133 741694 12242CA EUA Ariza et al. 2021 1204446 1196667 1170238 914542 12243CA EUA 840649 838547 801508 773676 12245CA EUA Ariza et al. 2021 781813 779375 710024 671723 Sm1 São Paulo 659000 657425 630571 606795 Sm2 São Paulo 1198501 1188494 1137180 803792 Sm3 São Paulo 898501 890983 852516 602582 Sm4 São Paulo 965471 957376 915955 647422 Sm5 São Paulo 1024681 1022139 988925 935793 Sm6 São Paulo 994214 991748 959446 907972 Sm7 São Paulo 741332 739483 715380 677008 Sm8 São Paulo 895139 892811 839789 765421 Sm9 São Paulo 902135 899793 846376 771470 Sm10 São Paulo 812408 810293 762194 694793 100361PE Pernambuco 701599 699905 671227 645909 100363PE Pernambuco 833959 829777 744424 632333 100364PE Pernambuco 788927 781308 716261 601178 100370PE Pernambuco 779307 773381 707731 613684 100375PE Pernambuco 426695 426062 389385 271180 100376PE Pernambuco 747771 744013 698858 628699 100377PE Pernambuco 827775 824477 788553 672887 100379PE Pernambuco 965616 963114 905980 825807 100380PE Pernambuco 842168 836848 769999 548962 100383PE Pernambuco 890598 886996 839690 768700 100384PE Pernambuco 793090 782638 745756 613635 193FLPE Pernambuco 1231201 1220923 1168230 825763 195FLPE Pernambuco 1119000 1116204 1079833 1021963 31 196FLPE Pernambuco 853955 844012 818798 781948 198FLPE Pernambuco 725727 722993 699143 652994 199FLPE Pernambuco 716211 712848 679631 572117 203FLPE Pernambuco 761970 757497 722206 611392 TOTAL: 33480939 33303861 31604817 26795041