RESSALVA Atendendo solicitação do autor, o texto completo desta Dissertação será disponibilizado somente a partir de 10/12/2022. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Estudo da velocidade de agitação na produção de Riboflavina por Bacillus subtilis em biorreator mecanicamente agitado e aerado Bruno Willian Picão Orientador: Prof. Dr. Marcel Otavio Cerri Coorientador: Prof. Dr. Danielle Biscaro Pedrolli Araraquara - SP 2021 II UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA "JÚLIO DE MESQUITA FILHO" Faculdade de Ciências Farmacêuticas Campus de Araraquara Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas Estudo da velocidade de agitação na produção de Riboflavina por Bacillus subtilis em biorreator mecanicamente agitado e aerado Bruno Willian Picão Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós- Graduação em ciências Farmacêuticas, área de concentração de em Pesquisa e Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos para obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Orientador: Prof. Dr. Marcel Otavio Cerri. Coorientadora: Prof. Dr. Danielle Biscaro Pedrolli. Araraquara - SP 2021 III IV V Dedico este trabalho aos meus pais e familiares, por todo o suporte e apoio. VI Agradecimentos Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Marcel Otavio Cerri, por todos os ensinamentos e suporte para desenvolver esta pesquisa. Muito obrigado pela confiança, amizade e preocupação não só com o lado profissional mais pessoal também. À minha coorientadora Profa. Dra. Danielle Biscaro Pedrolli, pelos ensinamentos e suporte. Aos meus pais e irmão, pela força, estímulo e participação em todos os momentos. Por todo o incentivo ao longo de toda minha vida, vocês são o meu maior motivo. Sem o apoio e suporte de vocês eu não teria conseguido. Amo vocês. A toda minha família que sempre me motivou e esteve torcendo pelo meu sucesso. Aos amigos Daniele, Renata, Agnes, Cassamo e Camila. Muito obrigado por todo apoio ao longo deste trabalho. Vocês foram uma peça fundamental para que eu conseguisse conciliar a vida profissional e pessoal. Agradeço em especial a Renata pelos ensinamentos e ajuda nos experimentos com biorreator. Agradeço também ao Cassamo pelos conselhos e ajuda nos tratamentos de dados. Agradeço aos colegas que somei durante este período no Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia da UNESP. Aos técnicos Adriana, Ana, Flavio e Matheus pelo profissionalismo e pela disposição em ajudar. À Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP – Araraquara por todas as oportunidades, infraestrutura e suporte concedidos. À CAPES pela concessão da bolsa de mestrado e pelo apoio financeiro para a realização desta pesquisa. VII SUMÁRIO Resumo ..................................................................................................................... IX Abstract ...................................................................................................................... X Lista de Figuras ......................................................................................................... XI Lista de Tabelas ....................................................................................................... XII Nomenclatura .......................................................................................................... XIII 1. Introdução. ............................................................................................................ 14 2. Revisão da literatura. ............................................................................................ 15 2.1. Biorreatores. ....................................................................................................... 15 2.2. Biorreator mecanicamente agitado e aerado (STR). ........................................... 16 2.3. Impelidores ......................................................................................................... 18 2.4. Vitamina B2. ........................................................................................................ 19 2.5. Produção de vitamina B2 por B. subtilis.............................................................. 22 2.6. Demanda e transferência de oxigênio em bioprocessos .................................... 24 3. Objetivo ................................................................................................................. 27 4. Material e Métodos ................................................................................................ 27 4.1. Biorreator STR .................................................................................................... 27 4.2. Sistema de aquisição de dados e controle dos biorreatores. .............................. 28 4.3. Cultivos de Bacillus subtilis para produção de Riboflavina. ................................ 28 4.3.1. Microrganismo. ............................................................................................. 28 4.3.2. Preservação do microorganismo. ................................................................. 29 4.3.3. Meios de Cultura........................................................................................... 29 4.3.4. Cultivo em Frascos Erlenmeyers .................................................................. 30 4.3.5. Cultivo em biorreator. ................................................................................... 30 4.4. Métodos Analíticos. ............................................................................................. 31 4.4.1. Determinação da Concentração Celular ....................................................... 31 4.4.2. Determinação de Riboflavina ........................................................................ 32 4.4.3. Determinação da concentração de Açucar. .................................................. 32 4.4.4. Determinação da concentração de CO2 e O2. .............................................. 33 4.4.5. Determinação da velocidade específica máxima de crescimento celular (μmáx). 33 4.4.6. Determinação do coeficiente de rendimento de substrato em células (Yx/s). 33 VIII 4.4.7. Determinação da produção específica (Yp/x), (Yp/s) e produtividade (Pr). ..... 34 4.5. Análise estatística ............................................................................................... 34 5. Resultados e discussão ........................................................................................ 35 6. ConclusÃo. ............................................................................................................ 35 7. Referências ........................................................................................................... 36 IX Resumo A Riboflavina (RF) também denominada como vitamina B2, têm sido amplamente utilizados nas indústrias alimentícia e farmacêutica, por ser um componente essencial do metabolismo básico, sendo um precursor de coenzimas flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e flavina mononucleotídeo (FMN). A produção comercial de RF é baseada no cultivo microbiano, atualmente a biossíntese de RF tem sido bastante estudada na bactéria Bacillus subtilis devido a sua alta capacidade de secretar proteínas diretamente no meio de cultivo em curto período de tempo, tornando-se um modelo entre as cepas industriais produtoras de RF. Em bioprocessos aeróbicos o transporte de oxigênio é o mais importante processo de transferência de massa gás- líquido a ser considerado no projeto de bioprocessos, podendo afetar o crescimento celular e a formação do produto. Neste trabalho, os efeitos da velocidade de agitação sobre o desempenho da produção de RF por Bacillus subtilis foram investigados em um cultivo em modo batelada em um biorreator mecanicamente agitado e aerado (STR). Os cultivos realizados durante o estudo apresentaram um perfil de redução na concentração de biomassa total juntamente com a diminuição da agitação, demonstrando uma relação direta entre a taxa de agitação operada com a expressão celular. Já a produtividade da RF não acompanhou a taxa de formação de biomassa de forma proporcional, indicando que o aumento na taxa de transferência de oxigênio gerada pelo aumento da agitação faz com que o microrganismo priorize o crescimento celular em detrimento da produção de RF. Indo de acordo com a literatura que relata que taxas de maior transferência de oxigênio o fluxo do consumo da fonte de carbono na rota metabólica é maior pela via Pentose Fosfato (PP), o que contribui para a alta taxa de crescimento, visto que ela oferece precursores para a biossíntese de nucleotídeos e aminoácidos essenciais para o crescimento celular, em contra partida, outra parte importante da rota metabólica na produção de RF é o metabolismo de Purinas que possui uma melhor eficiência em baixas taxas de transferência de oxigênio, sendo um ponto de equilíbrio na transferência de oxigênio de modo que não esteja em excesso nem escasso. Dentre as velocidades de agitação estudadas, o cultivo operado em 300 rpm foi mais o mais favorável para a biossíntese de RF, apesar de apresentar uma redução na velocidade de crescimento celular em comparação com os cultivos operados a 400 e 800 rpm. A concentração máxima de RF atingida foi de 2,151 g/L em 48 h com o rendimento Yp/s em média de 0,0242 g/g. Palavras Chave: Riboflavina, Bacillus subtilis, Biorreator, Operação em Batelada. X Abstract Riboflavin (RF), also called vitamin B2, has been widely used in the food and pharmaceutical industries, as it is an essential component of basic metabolism, being a precursor to the coenzymes flavin adenine dinucleotide (FAD) and flavin mononucleotide (FMN). The commercial production of Riboflavin is based on microbial fermentation, currently a biosynthesis of Riboflavin has been extensively studied in the bacterium Bacillus subtilis due to its high capacity to secrete protein directly into the culture medium in a short period of time, becoming a model among industrial strains producing Riboflavin. In aerobic bioprocesses, oxygen transport is the most important gas-liquid mass transfer process to be considered in the bioprocess project, which can affect cell growth and product formation. In this work, the effects of agitation speed on the performance of Riboflavin production by Bacillus subtilis were investigated in batch model cultivation in a mechanically agitated and aerated Bioreactor (STR). The cultures performed during the study showed a profile of reduction in the concentration of total biomass together with the reduction of preparation, demonstrating a direct relationship between the rate of preparation operated with cell expression. RF productivity, on the other hand, did not follow the rate of biomass formation proportionally, indicating that the increase in oxygen transfer rate generated by increased production makes the microorganism prioritize cell growth over RF production. Going according to the literature that reports that higher oxygen transfer rates or flow of consumption of the carbon source in the metabolic route is higher through the Pentose Phosphate pathway (PP), which contributes to the high growth rate, since it offers precursors for a biosynthesis of nucleotides and amino acids essential for cell growth, on the other hand, another important part of the metabolic route in RF production is the Purine metabolism, which has a better efficiency at low oxygen transfer rates, being a balance point in the transfer of oxygen so that it is neither too much nor too little. Among the studied parameters, the cultivation operated at 300 rpm was the most favorable for a riboflavin biosynthesis, despite presenting a reduction in the speed of cell growth compared to the cultures operated at 400 and 800 rpm. The maximum concentration of riboflavin reached was 2,151 g/L in 48 h with a Yp/s yield on average of 0,0242 g/g. Keywords: Riboflavin, Bacillus subtilis, Bioreactor, Batch Operation. XI Lista de Figuras Figura 1: Biorreator modelo STR, adaptado (LIU, 2020). .......................................... 17 Figura 2: Turbina tipo Rushton e seu padrão de fluxo (A), Turbina tipo Hélice marinha e seu padrão de fluxo (B); adaptado (LIU, 2020). ..................................................... 19 Figura 3: Estrutura química da Riboflavina, (SCHWECHHEIMER et al., 2016). ....... 20 Figura 4: Representação do metabolismo de Riboflavina em B. subtilis. Disponível em: https://www.kegg.jp/kegg-bin/show_pathway?bsu00740. ......................................... 23 Figura 5: Diagrama da transferência de oxigênio Gás-Líquido-Célula. Adaptado (CYTIVA, 2020). ........................................................................................................ 25 Figura 6: Fases de crescimento celular padrão. Adaptado (CYTIVA, 2020) ............. 26 Figura 7: Vista frontal de um biorreator STR; (A) impelidor do tipo turbina Smith; (B) impelidor do tipo turbina Rushton. (Autor). ................................................................ 28 XII Lista de Tabelas Tabela 1: Principais exemplos de biorreatores, adaptado (SCHMIDELL et al., 2001). .................................................................................................................................. 16 Tabela 2: Características das turbinas Rushton e Hélice marinha, adaptado (LIU, 2020) ......................................................................................................................... 19 Tabela 3: Produção de Riboflavina por diferentes microrganismos e seus parâmetros de operação. ............................................................................................................. 21 Tabela 4: Solubilidade do Oxigênio em agua pura a 1 (atm), adaptado (NIELSEN; VILLADSEN, 2011). .................................................................................................. 25 Tabela 5: Dimensão do posicionamento das turbinas no biorreator STR. ................ 28 Tabela 6: Cultivo em biorreator STR condições de operação. .................................. 31 Tabela 7: Matriz Delineamento de Composto Central (DCC) de duas variáveis. ...... 35 XIII Nomenclatura Símbolo Definição Unidade DCC Delineamento de Composto Central --- DO600 Densidade óptica a 600 nm nm FAD Flavina adenina dinucleotídeo --- FMN Flavina mononucleotídeo --- 𝑯𝑨 Constante de Henry atm.L.mol-1 H1 Altura entre a turbina Smith e Rushton mm H2 Altura entre a base do eixo e a turbina Smith mm kLa Coeficiente volumétrico de transferência de massa de oxigênio s-1 OTR Taxa de transferência de oxigênio mol.m-3.s-1 OUR Taxa de consumo de oxigênio pelo microrganismo mol.m-3.s-1 PP Pentose Fosfato --- Pr Produtividade g.L-1.h-1 RF Riboflavina --- rpm Rotação por minuto r.min-1 STR Biorreator mecanicamente agitado --- Yp/x Produção específica de produto por células g.g-1 Yp/s Produção específica de produto por substrato g.g-1 Yx/s coeficiente de rendimento de células por substrato g.g-1 μmáx Velocidade específica máxima de crescimento celular h-1 14 1. INTRODUÇÃO. Um biorreator pode ser definido como um equipamento no qual ocorrem conversões bioquímicas mediadas por biocatalisadores biológicos como enzimas, células animais e vegetais ou microrganismos. Devido à alta diversidade e especificidade de cultivo e manutenção destes agentes, existem diversos tipos de biorreatores projetados de forma a fornecer o ambiente mais adequado para a ocorrência de tais reações, como condições ideias de pH, temperatura, fornecimento de nutrientes e homogeneização (MANDENIUS, 2016). Em virtude de sua versatilidade para diversos tipos de bioprocessos, o biorreator convencional de tanque agitado (STR) é amplamente utilizado em escala laboratorial e industrial, devido a sua eficiente transferência de massa e energia. O microrganismo B. subtilis é um dos mais utilizados industrialmente para a produção de Riboflavina (RF) (AVERIANOVA et al., 2020). Durante o processo de cultivo a aeração desempenha um papel crucial, o B. subtilis demanda cerca de 1,78 – 10,06 mol.kg-1.h-1 de oxigênio (MESTRE et al., 2019). Sendo assim, a suplementação contínua do oxigênio é necessária devido sua atuação no crescimento celular, participando de diversas vias metabólicas, operando nos processos de manutenção, transporte e divisão da célula. No entanto, sua solubilidade é baixa em soluções aquosas (7 – 8 mg/L entre 25 – 35 °C a 0,209 atm). Assim, a fim de avaliar se o bioprocesso está operando com condições adequadas é possível mensurar a taxa de transferência de oxigênio (GARCIA-OCHOA; GOMEZ, 2009). A concentração de oxigênio dissolvido no meio, depende da transferência de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida, e da taxa de seu consumo pelo microrganismo. Tanto a transferência de massa de oxigênio do gás para a fase líquida quanto seu consumo pelo microrganismo têm importância decisiva, uma vez que em muitos processos a transferência de oxigênio é a etapa controladora do crescimento microbiano, podendo afetar a evolução dos bioprocessos (GARCIA-OCHOA et al., 2010). A influência da velocidade de agitação desempenha um papel importante no suprimento de oxigênio em um processo de produção, como demonstra MAN et al., 2014 que analisaram a influência da agitação na produção de RF através de cultivos com B. subtilis, onde agitações mais baixas foram benéficas para o crescimento celular e biossíntese de RF na fase inicial do processo de cultivo. 15 As condições de operação e as propriedades físicas das fases líquida e gasosa têm notável e complexa influência no desempenho do biorreator. É sempre desejado que o biorreator tenha a taxa máxima de transferência de massa, com mistura eficiente e entrada de energia mínima (LUO et al., 2013). Neste contexto este trabalho teve o objetivo de avaliar o perfil cinético e os efeitos na produção de RF por B. subtilis com relação a velocidade de agitação, fator que possui um grande impacto na transferência de oxigênio e taxa de cisalhamento, sendo estes, parâmetros essenciais para controle e manutenção dos cultivos. 2. REVISÃO DA LITERATURA. 2.1. Biorreatores. Biorreatores são reatores químicos nos quais ocorrem uma série de reações químicas catalisadas por biocatalisadores, como enzimas ou células vivas (microbianas, animais ou vegetais). Desde a década de 1940, tem sido utilizado biorreatores a base de microrganismos para a produção industrial de diversos produtos como enzimas, antibióticos, vitaminas, ácidos orgânicos, solventes usados para tratar resíduos orgânicos industriais ou domésticos. Nos últimos anos o emprego de biorreatores com células animais tem se desenvolvido bastante para a produção de produtos ligados à saúde humana e animal, tais como vacinas virais, anticorpos monoclonais e hormônios (LIU, 2020; PAWAR, 2016; SCHMIDELL et al., 2001). As funções de um biorreator incluem, contenção (segurança e esterilidade), introdução de reagentes gasosos (por exemplo, oxigênio), introdução de reagentes líquidos (por exemplo, fonte de carbono), remoção de produtos gasosos (por exemplo, dióxido de carbono), controle do ambiente físico (por exemplo, temperatura, taxa de cisalhamento, pH), suspensão (por exemplo, células, material particulado) e dispersão (sistemas de duas fases). Atualmente existem diversos tipos de biorreatores com características bastante distintas no que se refere aos fenômenos de transporte (calor, massa e quantidade de movimento) (LIU, 2020). Tais modelos, possuem diferentes design de acordo com o modo de operação dos bioprocessos industriais, são classificados de acordo com o tipo de biocatalisador utilizado (microrganismos, células ou enzimas) e modo de operação. A Tabela 1 apresenta os principais modelos de biorreatores. 16 Tabela 1: Principais exemplos de biorreatores, adaptado (SCHMIDELL et al., 2001). Reatores em fase aquosa  STR: "stirred tank reactor".  Coluna de bolhas ("bubble column").  Reatores "Air-lift".  Reatores de fluxo pistonado ("plug-flow").  Reatores com leito fixo.  Reatores com leito fluidizado.  Outras concepções.  Reatores com membranas planas.  Reatores de fibra oca ("hollow-fiber"). Reatores em fase não-aquosa (fermentação semi-sólida)  Reatores estáticos (reatores com bandejas).  Reatores com agitação (tambor rotativo).  Reatores com leito fixo.  Reatores com leito fluidizado gás-sólido. Dentre essa grande variedade de modelos de biorreatores, alguns dos tipos mais comuns são os reatores mecanicamente agitados (STR), colunas de bolhas e Airlift. O modelo com maior destaque é o STR que consistem em cerca de 90% do total de reatores utilizados industrialmente (ESPERANÇA, 2014). Os modelos STR possuem um importante destaque no ramo da biotecnologia, devido a sua alta capacidade na transferência de massa, fator esse, de extrema importância em reações trifásicas (gás-líquido-sólido) devido à complexa mecânica dos fluidos juntamente com a natureza complexa das células (LIU, 2020; ZHANG et al., 2017). 2.2. Biorreator mecanicamente agitado e aerado (STR). O biorreator do tipo STR consiste em um tanque cilíndrico no qual são comuns relações entre a altura e o diâmetro de 2:1 ou 3:1. Sua mistura e a dispersão de bolhas são obtidas por agitação mecânica realizada por impelidores acoplados ao eixo central ao biorreator, o qual, demanda um alto gasto de energia por unidade de volume. A entrada de gás é realizada por meio de aspersores que ficam na parte 17 inferior, o tanque agitado pode apresentar defletores internos, cuja função é evitar a formação de vórtice durante a agitação do líquido (DORAN, 2013). A Figura 1 apresenta o modelo de biorreator STR. Figura 1: Biorreator modelo STR, adaptado (LIU, 2020). Em biorreatores a homogeneidade é um parâmetro de extrema importância, em modelos do tipo STR esse processo é controlado principalmente pelo tipo de impelidor empregado no sistema. A dispersão do gás é realizada principalmente pelo Impelidor (transferência de oxigênio para a cultura), que deve fornecer agitação suficiente para dispersar as bolhas de gás por todo o vaso e aumentar seu tempo de residência (LIU, 2020). O desejo de rapidez na dispersão do gás deve, no entanto, ser equilibrada com o impacto na cultura. Impelidores de alto cisalhamento são geralmente utilizados em sistemas microbianos, onde o crescimento requer altas taxas de transferência de massa. Para células animais e vegetais, um ambiente de alto cisalhamento pode ser prejudicial por serem muito sensíveis ao cisalhamento (GARCIA-OCHOA; GOMEZ, 2009; RIBEIRO, 2017). Existem diversos tipos de impelidores disponíveis, tais alternativas juntamente com a facilidade no aumento de escala, boa mistura e alta taxa na transferência de massa é o que torna o biorreator do tipo STR o modelo mais utilizado industrialmente (STUANI, 2015). Dentre os principais modelos de impelidores usados para o este tipo de reator , a turbina de 6 pás planas com disco também conhecida 18 como turbina "Rushton" é a mais amplamente empregada em processos fermentativos devido a sua alta eficiência na dispersão de gás (LIU, 2020; SCHMIDELL et al., 2001). 2.3. Impelidores Agitação e mistura são operações unitárias essenciais na maioria dos processos industriais e têm por objetivo a obtenção de matérias primas ou produtos uniformes. Quando um sistema de agitação e mistura não está corretamente projetado e controlado obtém-se misturas indesejáveis, o que pode acarretar em perdas de produto e aumento no custo do processo (COSTA JÚNIOR; CORREA, 2019). Os impelidores mecânicos podem ser classificados de acordo com a direção do movimento do fluido no interior do tanque propulsionado pela rotação do mesmo. São divididos basicamente em axial e radial (LOPES, 2013). Os modelos de fluxo radial são aqueles que geram linhas de fluxo perpendicularmente ao eixo do agitador, ou seja, impulsiona a grande massa liquida contra as paredes do tanque, possuem alto consumo de potência, grande capacidade dispersiva, são aplicados na dispersão de gases, transferência de massa e dissolução de materiais sólidos, são encontrados nos modelos de turbina de pás retas, turbina de pás inclinadas e turbina de disco. Já os modelos de fluxo Axial são aqueles que geram linhas de fluxo paralelas ao eixo do agitador, ou seja, impulsiona a grande massa liquida contra o fundo do tanque, seu consumo de potência é baixo, possuem grande abrangência por sua distribuição geométrica do fluxo dentro do tanque e sua agressividade é baixa ao produto. São aplicados na mistura de produtos líquidos, sólidos em suspensão e transferência de calor. São encontrados nos modelos de hélice naval, turbinas de pás inclinadas e turbina de alto rendimento (SABIONI, 2013). A Figura 2 abaixo demostra o esquema de dois impelidores e seus impactos sobre os padrões de fluxo dentro do reator. A Tabela 2 apresenta as características das turbinas. 19 Figura 2: Turbina tipo Rushton e seu padrão de fluxo (A), Turbina tipo Hélice marinha e seu padrão de fluxo (B); adaptado (LIU, 2020). Tabela 2: Características das turbinas Rushton e Hélice marinha, adaptado (LIU, 2020) Características Rushton Hélice marinha Tipo de fluxo Radial Axial Transferência de gasosa Alta Baixa Dispersão Alta Baixa Suspensão Baixa Alta Mistura Média Alta 2.4. Vitamina B2. A RF conhecida como vitamina B2, também denominada Lactoflavina ou vitamina G, é um sólido microcristalino de cor amarelo/alaranjada, amargo e inodoro. A RF possui estabilidade em meio ácido, já em meio alcalino decompõe-se rapidamente o mesmo também ocorre na presença de luz. Com relação a temperatura ela se decompõe entre 278 - 282°C. A análise da absorbância de soluções aquosas de RF pode ser realizada em leituras de 223, 266, 373 e 445 nm. Embora a RF seja higroscópica é pouco solúvel em água e etanol, sua solubilidade é de 100 - 130 mg/L e 45 mg/L à temperatura ambiente em água e etanol. É pouco solúvel em álcoois alílicos e benzílicos, acetato de amila e fenol e praticamente insolúvel em éter, 20 clorofórmio e acetona (O’NEIL, 2006; SILVA et al., 2005). A Figura 3 apresenta a estrutura química da RF. Figura 3: Estrutura química da Riboflavina, (SCHWECHHEIMER et al., 2016). A RF pode ser sintetizada por plantas e microrganismos, já para humanos e animais é um componente obrigatório na dieta, por não haver uma via biossintética endógena. Desempenha um papel importante para múltiplas funções celulares, uma vez que serve como um precursor das coenzimas flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e flavina mononucleotídeo (FMN), que estão envolvidas no metabolismo oxidativo entre outros processos (ABBAS; SIBIRNY, 2011). A ingestão diária recomendada de RF é de 1,3 mg/dia para homens e 1,1 mg / dia para mulheres, sendo realizada principalmente através do consumo de carnes e produtos de laticínio. A sua deficiência pode contribuir para diversos problemas de saúde como aumento do risco de doença cardiovascular, prejuízo no metabolismo do ferro e cegueira noturna (ABBAS; SIBIRNY, 2011). Nas últimas décadas, o interesse crescente transformou a RF em um dos produtos mais importantes da biotecnologia. A RF, que é sintetizada exclusivamente por rota biotecnológica através de microrganismos, é usada principalmente como aditivo alimentar (cerca de 70% do mercado atual), enquanto cerca de 30% são usados para aplicações farmacêuticas (SCHWECHHEIMER et al., 2016). A Tabela 3 apresenta a produção de RF por diferentes microrganismos. 21 Tabela 3: Produção de Riboflavina por diferentes microrganismos e seus parâmetros de operação. Microrganismo Condições de operação Rendimento Referência B. subtilis modificado Quimiostato / Batelada alimentada / 600 a 1500 rpm / 1,5 vvm / pH 6,6 / 37°C / 45h 0,08 g/L (SAUER et al., 1996) Biorreator STR / Batelada / 700 rpm / 0,5 vvm / pH 7,5 / 34°C / 72h 1,05 g/L (USUI; YAMAMOTO; NAKAMATU, 1997) Biorreator STR / Batelada alimentada / 1100 rpm / 0,6 vvm / pH 6,5 – 7,2 / 37°C / 42h 12,4 g/L (DEBABOV et al., 1997) Biorreator STR / Batelada alimentada / 1000 rpm / 1 a 1,5 vvm / pH 6,8 / 39°C / 56h 4 – 15 g/L (PERKINS et al., 1999) Biorreator STR / Batelada alimentada / 800 rpm / 1 vvm / pH 7,2 – 7,4 / 37°C / 90h 26,8 g/L (LEE et al., 2004a) Biorreator STR / Batelada alimentada / 850 rpm / 1,1 vvm / pH 7,2 / 41°C / 48h 16,36 g/L (WU et al., 2007) Biorreator STR / Batelada alimentada / 600 - 900 rpm/ 1,3 vvm / pH 6,9 / 40°C / 48h 9,4 g/L (MAN et al., 2014) Shaker de agitação / 200 rpm / pH 6,5 / 30°C / 72h 0,274 g/L (HEMIDA ABD-ALLA et al., 2016) B. subtilis selvagem Shaker de agitação / 200 rpm / pH - / 30°C / 72h 0,0117 g/L (ORAEI; RAZAVI; KHODAIYAN, 2018) A gossypii selvagem Biorreator STR / Batelada / 600 rpm / 1 vvm / pH 6,8 / 28°C / 192h 5,2 g/L (SUGIMOTO et al., 2010) A gossypii modificado Biorreator STR / Batelada / 600 rpm / 1 vvm / pH 6,8 / 28°C / 216h 13,7 g/L (PARK et al., 2011) C famata modificado Biorreator STR / Batelada alimentada / 1200 rpm / 1,2 vvm / pH 5,5 / 28°C / 126h 16,4 g/L (DMYTRUK et al., 2014) 22 2.5. Produção de vitamina B2 por B. subtilis. B. subtilis é uma bactéria Gram-positiva e possui uma forma de bastonete, que produz endósporos que permitem a sobrevivência em condições ambientais extremas, incluindo calor e dessecação (HÄRTIG; JAHN, 2012). Foi originalmente denominada Vibrio subtilis em 1835 por Christian Gottfried Ehrenberg, e em 1872 foi renomeada B. subtilis por Ferdinand Cohn (KOVÁCS, 2019). Este microrganismo é uma das bactérias mais bem caracterizadas entre os Gram-positivos e é considerada um sistema modelo para diferenciação e desenvolvimento celular (AIZAWA, 2014). B. subtilis tornou-se a espécie mais estudada do gênero Bacillus devido à sua competência natural para a captação de DNA extracelular que facilita a modificação genética simples e a ocorrência de esporulação. Os esporos dormentes podem sobreviver a circunstâncias severas (alta temperatura, dessecação, UV e radiação γ), predação por microrganismos e macroorganismos, ou mesmo condições extraterrestres. B. subtilis pode ser isolado de vários ambientes, do solo aos habitats marinhos, e utilizado em várias aplicações, desde a produção de enzimas e fermentação de alimentos até o biocontrole de plantas (KOVÁCS, 2019). Em comparação com outros microrganismos, as espécies de Bacillus gram- positivas são bem conhecidas por sua capacidade superior de secreção de proteínas. Além disso, seu bom crescimento em fontes de carbono baratas, metabolismo endógeno distinto e robustez em fermentações industriais tornaram as espécies de Bacillus os organismos preferidos para a produção industrial de uma variedade de produtos (GU et al., 2018). B. subtilis vem sendo amplamente empregada na indústria biotecnológica. Uma dessas aplicações e a produção de RF sendo atualmente um dos mecanismos de produção de RF mais competitivo do mercado (AVERIANOVA et al., 2020; SHI et al., 2009). A Figura 4 apresenta a rota metabólica de produção da RF e seus derivados Flavina adenina dinucleotídeo (FAD) e flavina mononucleotídeo (FMN). 23 Figura 4: Representação do metabolismo de Riboflavina em B. subtilis. Disponível em: https://www.kegg.jp/kegg-bin/show_pathway?bsu00740. O B. subtilis utiliza como substrato carboidratos como fonte de carbono, a biossíntese de RF começa a partir dos precursores GTP e Ru5P e a RF pode ser ainda convertida em FMN e FAD. As vias biossintética que levam do substrato a síntese de flavinas abrangem β-oxidação, o ciclo glicerato, o ciclo TCA, a gliconeogênese, a via PP (ramo oxidativo), a via purina e a via de síntese de flavina (LIU et al., 2020). A engenharia biotecnológica das cepas de superprodução de flavina é sempre realizada pela superexpressão de genes nas vias relevantes, supressão de caminhos concorrentes e interrupção de genes regulatórios responsáveis pela inibição enzimática. Em B. subtilis, a via biossintética de RF é basicamente controlada pelo operon rib que consiste em cinco genes - ribDG, ribE, ribAB, ribH, ribT. A superexpressão dos genes responsáveis pela síntese de RF é um dos métodos mais comuns para melhorar a síntese de RF em B. subtilis (PEDROLLI et al., 2015b) Tradicionalmente, a produção de RF era realizada por processos químicos, mas nos últimos anos os processos biotecnológicos têm se tornado mais populares utilizando diversos tipos de microrganismos como o B. subtilis (SILVA et al., 2005). Esse desenvolvimento foi em grande parte impulsionado pela tecnologia de DNA recombinante, conhecido como engenharia metabólica. Uma vez que as vias metabólicas centrais e biossintética específicas são otimizadas para um determinado produto, onde as características gerais do hospedeiro de produção se tornam governáveis assim como o desempenho do processo comercial (ZAMBONI et al., 2003). De acordo com a antiga classificação de Demain, microrganismos capazes de 24 acumular mais de 10 mg/L de RF foram reconhecidos como superprodutores sendo dividido posteriormente divididos em três grupos: fracos (Produzindo aproximadamente 10 mg/L), moderados (Produção maior que 600 mg/L) , e forte (Produção maior que 10 g/L) (AVERIANOVA et al., 2020). A superprodução de RF alcançada pela obtenção de cepas geneticamente modificadas com superexpressão de certos genes e resistência a análogos de purina e RF é descrita em diversos trabalhos na literatura. Como descrito por SHI e colab., 2009, que obtiveram um aumento de 25% (15 g/L em modo Batelada-Alimentada) na produção de RF comparada a linhagem selvagem (B. subtilis 168) do centro de estoque genético de Bacillus. O mercado anual total de RF é de aproximadamente 9.000 toneladas de RF, que tem sido bastante usada no enriquecimento nutricional de alimentos e rações animais (AVERIANOVA et al., 2020). 2.6. Demanda e transferência de oxigênio em bioprocessos Entre os processos biotecnológicos de interesse industrial, envolvendo o cultivo de células microbianas, sem dúvida os processos conduzidos em aerobiose encontram uma situação de enorme destaque (LIU, 2020). Assim, por exemplo, a produção de antibióticos, enzimas, vitaminas, fermentos e inoculantes, proteínas recombinantes (hormônios de crescimento, insulina; etc.), constitui em sua grande maioria processos aeróbios. Igualmente, o cultivo de células animais, 'visando a produção de produtos ou a posterior infecção por vírus para a obtenção de vacinas, são processos aeróbios (SCHMIDELL et al., 2001). Em bioprocessos aeróbicos o transporte de oxigênio é o mais importante processo de transferência de massa gás-líquido a ser considerado no projeto de bioprocessos. O oxigênio é um substrato chave, devido à sua baixa solubilidade em meio aquoso, isto é, a "capacidade de armazenamento" de oxigênio na água é baixa (7 – 8 mg/L entre 25 – 35 °C a 0,209 atm) sendo essencial manter uma transferência de oxigênio continua da fase gasosa para a fase líquida, afim de manter a viabilidade do metabolismo celular (BADINO; MENDES; CERRI, 2016; SCHMIDELL et al., 2001). Na Tabela 4 encontram-se dados a respeito da solubilidade do oxigênio para diferentes temperaturas. 25 Tabela 4: Solubilidade do Oxigênio em agua pura a 1 (atm), adaptado (NIELSEN; VILLADSEN, 2011). Temperatura (°C) Solubilidade do O2 (mmol L-1) 0 2,18 10 1,70 15 1,54 20 1,38 25 1,36 30 1,16 40 1,03 Desta forma, processos fermentativos aeróbicos exigem um adequado dimensionamento do sistema de transferência de oxigênio, sendo este um substrato chave para o crescimento, produção, e atividades de manutenção. A concentração de o oxigênio dissolvido no caldo, depende da taxa de transferência de oxigênio (OTR) da fase gasosa para a fase líquida, e da taxa de consumo de oxigênio pelo microrganismo (OUR) (GARCIA-OCHOA et al., 2010). A Figura 5 demonstra o processo de transferência de oxigênio da bolha de gás até a célula, e as respectivas resistências do processo. Figura 5: Diagrama da transferência de oxigênio Gás-Líquido-Célula. Adaptado (CYTIVA, 2020). De modo simples o transporte de oxigênio de uma fase gasosa em meio líquido para o interior de uma célula ocorre em nas seguintes etapas: 26 1. Difusão do O2 da bolha de gás para interface Gás-Líquido. 2. Transporte através da interface Gás-Líquido. 3. Difusão do O2 através de uma região de líquido relativamente estagnada adjacente a bolha de gás, ou seja, da interface Gás- Líquido para o Líquido. 4. Transporte do O2 dissolvido para a célula. 5. Difusão do O2 através da película de líquido estagnado ao redor da célula. 6. Transporte através da membrana celular. 7. Transporte de O2 dissolvido dentro da célula para o local de reação intracelular. Durante um processo fermentativo, OUR é inicialmente baixo já que há pouco ganho de densidade celular. Conforme a densidade celular aumenta no decorrer do processo o OUR aumenta até que o OTR se torne uma taxa limitante. Isso ocorre pois o OTR é a etapa que apresenta maior resistência na transferência de oxigênio (CYTIVA, 2020). A Figura 6 ilustra a demanda de oxigênio no decorrer das fases do crescimento microbiano padrão. Figura 6: Fases de crescimento celular padrão. Adaptado (CYTIVA, 2020) As taxas OTR e OUR são correlacionadas pelo coeficiente volumétrico de transferência de massa de oxigênio (kLa), cujo valor é uma função de parâmetros 27 incluindo as propriedades físicas do fluido (densidade, tensão superficial e comportamento reológico), morfologia e concentração celular, modelo e geometria do biorreator e condições de operação (velocidade de agitação e / ou taxa de fluxo de ar). Consequentemente, a consideração de kLa é essencial no projeto e caracterização de biorreatores usados em bioprocessos, uma vez que é o parâmetro- chave usado para garantir a transferência de oxigênio adequada (MESTRE et al., 2019). De modo geral a literatura aborda a produção de RF por microrganismos voltada mais para os aspectos metabólicos, ou seja, focados na modificação através da engenharia genética havendo poucos trabalhos focados nos parâmetros operacionais. Como no caso da velocidade de agitação que possui influencia em 2 parâmetros extremamente importantes em cultivos, sendo a transferência de oxigênio e taxa de cisalhamento. 3. OBJETIVO O presente projeto teve como objetivo estudar os efeitos da velocidade de agitação na produção de Riboflavina por B. subtilis em um biorreator mecanicamente agitado e aerado (STR). 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Biorreator STR Foi utilizado o biorreator comercial de tanque agitado da Tecnal, TEC-BIO- 7,5VI (Piracicaba - SP, Brasil). Equipado com controlador de pH, temperatura, oxigênio dissolvido, agitação, rotâmetro para aeração e bombas de alimentação de nutrientes, adição de antiespumante e adição de soluções ácidas e básicas. O biorreator dispõe de volume total de 7,5 L, e volume útil de 5,0 L. O diâmetro interno do biorreator é 0,190 m e diâmetro externo 0,217 m. O sistema dispõe de quatro chicanas opostas diametralmente com largura de 0,015 m e foi montado utilizando-se dois impelidores uma do tipo turbina Rushton e outra do tipo Smith apresentado na Figura 7. 28 Figura 7: Vista frontal de um biorreator STR; (A) impelidor do tipo turbina Smith; (B) impelidor do tipo turbina Rushton. (Autor). Tabela 5: Dimensão do posicionamento das turbinas no biorreator STR. Dimensões (mm) H1 100 H2 10 4.2. Sistema de aquisição de dados e controle dos biorreatores. Os estudos foram realizados utilizando um Controlador Tecnal, TEC-BIO- FLEX (Piracicaba - SP, Brasil) com sensor de temperatura Pt-100, medidor de fluxo de gás Aalborg - GFC37, 4 bombas peristálticas (nutrientes, antiespumante, ácido e base), sistema de agitação e conexão para sensores de oxigênio e pH. Sendo o sensor de oxigênio dissolvido Mettler Toledo, O2 Transmitter 4500 (Barueri – SP, Brasil) e o sensor de pH Mettler Toledo, 405-DPAS-SCK8S/225 (Barueri – SP, Brasil). juntamente com um sistema de aquisição de dados para permitir medições em tempo real. 4.3. Cultivos de Bacillus subtilis para produção de Riboflavina. 4.3.1. Microrganismo. Foi utilizado o B. subtilis superprodutor de RF. A linhagem possui duas mutações causadas pela seleção com a antivitamina roseoflavina. Uma mutação pontual no gene ribC leva à produção de uma flavokinase com atividade reduzida a 29 1% em comparação ao tipo selvagem, provocando uma drástica redução na reação de fosforilação da RF (MACK; VAN LOON; HOHMANN, 1998). Nesta linhagem, o operon contendo os genes da via biossintética da RF teve seu promotor natural trocado pelo promotor veg, um promotor constitutivo e forte em B. subtilis. A última alteração feita nessa linhagem foi a mutação do gene tkt. O gene mutante codifica uma transketolase menos ativa, gerando um acúmulo de ribulose 5’-fosfato, um dos precursores da biossíntese de RF (GARCÍA-ANGULO, 2017). Foi realizado o desenvolvimento de um sRNA que se liga a um Riboswitche denominado ribDG. Esse Riboswitche regula a expressão de RF através da detecção da concentração de FMN, fazendo com que a produção de RF cesse quando detectado uma alta concentração de FMN. Porém com a ligação desse sRNA o Riboswitche é desativado, produzindo RF independente da concentração de FMN. Esse B. subtilis foi fornecido pela colaboradora Dr. Danielle Biscaro Pedrolli que é Professora Assistente Doutora em RDIDP no Departamento de Bioprocessos e Biotecnologia da Faculdade de Ciências Farmacêuticas da UNESP, Campus de Araraquara. 4.3.2. Preservação do microorganismo. Foi preparado um pré-inoculo da cepa de B. subtilis superprodutor de RF em meio liquido (20 g.L-1 LB; 20 g.L-1 Sacarose), realizado a 220 rpm e 37℃ em overnight. Deste, foi retirada uma alíquota de 720µL que foi adicionada assepticamente a um criotubo estéril. Como crioprotetor foram adicionados 480µL de glicerol 50% (v/v) obtendo-se volume final de 1200 µL. Em seguida os criotubos foram estocados a -80ºC. 4.3.3. Meios de Cultura. 4.3.3.1. Meio de Cultura de reativação (MR). O meio de cultura de rativação era composto por Meio LB 20,0 g.L-1 e Sacarose 20,0 g.L-1. 4.3.3.2. Meio de Cultura de Inóculo (MI). O meio de cultura utilizado é composto por 70 g.L-1 de Sacarose, 1 g.L-1 de Extrato de levedura, 25 g.L-1 de Nitrato de sódio (NaNO3), 0,333 g.L-1 de Fosfato monopotássico (KH2PO4), 1 g.L-1 de Fosfato dissódico dodecahidratado (Na2HPO4.12H20), 0,15 g.L-1 de Sulfato de magnésio heptahidratado (MgSO4.7H20), 30 7,5 mg.L-1 de Cloreto de cálcio (CaCl2), 6 mg.L-1 de Sulfato de manganês (MnSO4.H2O) e 6 mg.L-1 de Sulfato de ferroso (FeSO4.7H2O). O meio de cultivo teve o pH ajustado para 7,0 antes da esterilização (WANG et al., 2018). 4.3.3.3. Meio de Cultura de Produção (MP). O meio de produção teve a mesma composição do meio de cultura do inóculo, porém com 10% a mais de concentração na composição. O meio de cultivo teve pH do meio foi corrigido para 7,0 em reator, após o processo de esterilização. 4.3.4. Cultivo em Frascos Erlenmeyers 4.3.4.1. Reativação No processo de reativação foram inoculados 2 Falcons (50 mL) contendo 10 mL de MR, sendo inoculados a partir da cepa congelada de B. subtilis superprodutor através de raspagem. Os Falcons foram mantidos em 220 rpm a 37°C por 24h. 4.3.4.2. Inóculo Nesta etapa eram adicionado os 10 mL de meio contidos nos 2 Falcons após o processo de reativação em 2 frascos de Erlenmeyers (500 mL) contendo 90 mL cada de MR. Os frascos de Erlenmeyers foram mantidos em 220 rpm a 37°C por 24h. 4.3.4.3. Produção Ao final do processo de Inóculo o meio contido nos 2 frascos de Erlenmeyers eram reunidos e um volume de 10 mL era transferido para os frascos de Erlenmeyers de produção contendo 90 mL cada de MI. 4.3.4.4. Condições de Cultivo. Os cultivos foram realizados em Shaker de agitação a 220 rpm e 37°C. 4.3.5. Cultivo em biorreator. 4.3.5.1. Reativação. Mesmo procedimento descrito no iten 4.3.4.1. 31 4.3.5.2. Pré-Inóculo. Mesmo procedimento descrito no iten 4.3.4.2. 4.3.5.3. Inóculo. Na etapa de inóculo era realizado a mistura dos meios contidos nos 2 Erlenmeyers após o processo de Pré-Inóculo, onde era tranferido dessa mistura 10 mL para 6 Erlenmeyers (500 mL) contendo 90 mL cada de MI. Os frascos de Erlenmeyers eram mantidos em 220 rpm a 37°C por 24h. 4.3.5.4. Produção. Ao final do processo de Inóculo o meio contido nos 6 Erlenmeyers eram reunidos e um volume correspondente a 10% do volume de operação do cultivo era tranferido para o reator contendo MP. Conforme necessidade correções no Inóculo eram realizadas, para que a DO600 (densidade óptica a 600 nm) inicial do processo de cultivo fosse de 1,0±0,5 UA (unidade de absorbância). 4.3.5.5. Condições de Cultivo em biorreator STR. Em termos de modo de operação a cultivo foi operada em modo batelada, os parametros de operação estão apresentados na Tabela 6. Tabela 6: Cultivo em biorreator STR condições de operação. Agitação (rpm) Vazão (vvm) Temperatura (°C) pH Volume (L) 800 0,5 37 7 4 400 5 5 5 300 200 4.4. Métodos Analíticos. 4.4.1. Determinação da Concentração Celular O crescimento celular foi acompanhado de acordo com a densidade óptica do meio de cultura no comprimento de onda de 600nm (DO600nm) utilizando espectrofotômetro THERMO SCIENTIFIC®, GENESYS 10S (Waltham - MA, EUA) bem como por medidas de massa seca (g.L-1). A curva de calibração para conversão dos valores de DO600nm em massa de célula (g.L-1) foi obtida a partir dos cultivos realizados em shaker, através da adição de um volume conhecido da amostra em 32 placas de Petri previamente secas e pesadas. A amostra foi submetida a secagem por 24 horas em estufa a 60°C e pesada posteriormente. O ensaio foi realizado em triplicata. (JESUINO, 2019). Os dados estão apresentados no Apêndice A.1.1. 4.4.2. Determinação de Riboflavina Para análise da concentração de RF nas amostras, uma alíquota foi centrifugada a 5000 rpm por 10 minutos a 4°C em centrifuga HETTICH®, UNIVERSAL 320R (Kirchlengern – VE, Alemanha) ( (PEDROLLI et al., 2015a). O sobrenadante foi coletado e separado para análise. 4.4.2.1. Fluorescência As amostras foram adicionadas em placas de 96 poços e a unidade de fluorescência (UF) foi medida em leitor de placas PERKINELMER ENSPIRE® , Multimode Plate Reader ( Waltham - MA, USA) em comprimento de onda de excitação da molécula de 444 nm e de emissão de fluorescência de 520 nm (ABBAS; SIBIRNY, 2011). A reta padrão para calibração foi realizada com Riboflavina 98%, Sigma Aldrich (San Luis – MI, EUA). Os dados estão apresentados no Apêndice A.1.2. 4.4.2.2. HPLC A análise de concentração de RF por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada utilizando aparelho SHIMADZU, com controladora CBM20A, bomba NexeraXR LC20AD, fluxo de 0,5 mL.min-1, coluna Poroshell 120 ECC18 (tamanho de partícula 2,7 um, 50 x 3 mm), utilizando como fase movel 18% (v/v) de metanol - 20 mM de ácido fórmico - 20 mM de formato de amônio (pH 3,7) (PEDROLLI et al., 2015a). A detecção da RF foi realizada em 445 nm (ABBAS; SIBIRNY, 2011). A reta padrão para calibração foi realizada com Riboflavina 98%, Sigma Aldrich (San Luis – MI, EUA). Os dados estão apresentados no Apêndice A.1.3. 4.4.3. Determinação da concentração de Açucar. As concentrações de sacarose do meio de cultura foram analisadas através de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) utilizando aparelho SHIMADZU, com controladora CBM20A, bomba NexeraXR LC20AD, fluxo de 0,6 mL/min, coluna Aminex® HPX-87P, utilizando água como fase móvel, tempo de corrida de 20 minutos, 33 detector RID 20A, temperatura de 80°C e volume de injeção da amostra de 20 μL (injeção manual) (JESUINO, 2019). Os dados estão apresentados no Apêndice A.1.4. 4.4.4. Determinação da concentração de CO2 e O2. As concentrações de CO2 e O2 do processo de cultivo com B. subtilis foram analisadas em tempo real através medidor de gás BlueInOne, BlueSens (Herten, Alemanha). 4.4.5. Determinação da velocidade específica máxima de crescimento celular (μmáx). A velocidade específica de crescimento foi definida por meio de um balanço de massa em reator em batelada representado pela Equação 4.1. 𝑑(𝐶𝑥. 𝑉) 𝑑𝑡 = 𝜇. 𝐶𝑥. 𝑉 Equação 4.1 Na fase exponencial do crescimento μ = μmáx portanto, após integrar e rearranjar a Equação 4.1, a velocidade específica de crescimento pode ser calculada através da Equação 4.2. ln 𝐶𝑥/𝐶𝑥 = 𝜇 á . 𝑡 Equação 4.2 Onde Cx0 (g.L-1) é a concentração celular no tempo zero e t é o tempo de cultivo (JESUINO, 2019). 4.4.6. Determinação do coeficiente de rendimento de substrato em células (Yx/s). Para o cálculo do coeficiente de rendimento de substrato em células (Yx/s) (g.g-1) será utilizada a Equação 4.3. 𝐶𝑥 − 𝐶𝑥 = 𝑌 . (𝐶𝑠 − 𝐶𝑠) Equação 4.3 Onde Cx0 (g/L) é a concentração celular no tempo zero, 𝐶𝑠 (g.L-1) é a concentração inicial do substrato, e Cx (g.L-1) e Cs (g.L-1) são as concentrações celular e de substrato, respectivamente, variando com o tempo. A partir do cálculo do consumo de sacarose e da produção de biomassa correspondente para cada intervalo de tempo, é possível calcular o valor do Yx/s. (g.g- 1) (JESUINO, 2019). 34 4.4.7. Determinação da produção específica (Yp/x), (Yp/s) e produtividade (Pr). Para o cálculo da produção específica (Yp/x) (g.g-1) ou (Yp/s) (g.g-1) e produtividade (Pr) (g.L-1.h-1) foram utilizadas as Equações 4.4, 4.5 e 4.6 respectivamente. 𝑌 / = 𝐶𝑝 − 𝐶𝑝 𝐶𝑥 − 𝐶𝑥 Equação 4.4 𝑌 / = 𝐶𝑝 − 𝐶𝑝 𝐶𝑠 − 𝐶𝑠 Equação 4.5 𝑃𝑟 = 𝐶𝑝/𝑡 Equação 4.6 Onde Cp (g.L-1) é a concentração de RF. (JESUINO, 2019). 4.5. Análise estatística O Delineamento de Composto Central (DCC) foi realizado a fim de avaliar se a concentração de FeSO4 apresenta interferência estatisticamente significativa na produção de RF por B. subtilis. O experimento foi realizado com 3 repetições no ponto central, totalizando 11 ensaios. As variáveis independentes empregadas foram a concentração de FeSO4 (X1) e tempo de cultivo (X2). Todos os ensaios foram conduzidos em mesa incubadora rotativa e o cálculo estatístico dos dados obtidos foi realizado utilizando-se o software Statistica®. A Tabela 7 apresenta a matriz do planejamento realizado. 35 Tabela 7: Matriz Delineamento de Composto Central (DCC) de duas variáveis. Corrida Variáveis FeSO4 (X1) Tempo (X2) 1 -1 -1 2 -1 +1 3 +1 -1 4 +1 +1 5 0 0 6 -1,41421 0 7 +1,41421 0 8 0 -1,41421 9 0 +1,41421 10 0 0 11 0 0 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 6. CONCLUSÃO. Com relação aos cultivos em Frasco Erlenmeyer nota-se que a adição de semi-helicoides proporcionou um aumento na transferência de massa e oxigênio, o que resultou no aumento da produtividade do microrganismo. A produção em biorreatores seguiu o mesmo perfil observado nos cultivos em erlenmeyers, onde podemos concluir que a transferência de massa e oxigênio demonstrou ser um parâmetro extremamente importante. Dentre as variações testadas a configuração que apresentou melhor rendimento foi a operada em 300 rpm. Os resultados de produção obtidos se mostram promissores, comprando com o observado na literatura (AVERIANOVA et al., 2020; DMYTRUK et al., 2014; ZAMBONI et al., 2003). A respeito do fator que está provocando a redução na concentração de RF, demonstrando um maior impacto nos cultivos com alta agitação. Podemos concluir que a concentração de FeSO4 no meio de cultivo não é o fator que está influenciando essa degradação. Outro ponto abordado durante os cultivos foi um alto consumo de ácido para o controle do pH indicando a produção de alguma substância alcalina, que poderia está ligada a redução na concentração da RF, visto que ela se degrada em meio alcalino, porém esta hipótese foi descartada pois a faixa de pH para ocorrer essa 36 degradação tem que ser superior a um pH de 8. Processo esse que não ocorreu durante os cultivos realizados. Uma questão também levantada pelo grupo de pesquisa com relação a esse processo de redução da RF, é a possível precipitação da RF durante o processo de produção podendo justificar o fato de observamos a redução na concentração da RF no final dos cultivos (Ponto de alta concentração em teoria). Esse efeito pode ser observado com a repetição do cultivo realizado em 400 rpm, onde através da alteração da metodologia de coleta da amostra não houve uma de redução significativa na produção de RF, como a observada em cultivos anteriores. Com relação a produtividade mesmo alterando a metodologia de coleta, o 2° cultivo em 400 rpm apesar de apresentar uma produção final de RF maior ele apresentou uma produtividade bastante inferior em comparação ao 1° cultivo em 400 rpm, possivelmente devido ao maior tempo de cultivo sendo de 30h a mais. Com isso concluímos que o cultivo operado em 300 rpm foi o mais favorável para a biossíntese de RF, que apesar de apresentar uma redução na velocidade de crescimento celular em comparação com os cultivos operados a 400 e 800 rpm, atingiu taxas de produção de 2,151 g/L em 48 h com o rendimento Yp/s em média de 0,0242 g/g. Resultados estes bastantes promissores quando comparados a literatura (DEBABOV et al., 1997; LEE et al., 2004b; MAN et al., 2014; WU et al., 2007), mostrando a influência da velocidade de agitação no crescimento e produção. 7. REFERÊNCIAS ABBAS, C. A.; SIBIRNY, A. A. Genetic Control of Biosynthesis and Transport of Riboflavin and Flavin Nucleotides and Construction of Robust Biotechnological Producers. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 75, n. 2, p. 321–360, 2011. AIZAWA, S.-I. Bacillus subtilis: The Representative of Gram-Positive Bacteria. In: AIZAWA, S.-I. 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