UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL FÍSTULA ORONASAL EM CÃO. REPARO COM FLAPE SIMPLES ASSOCIADO A FATOR PROTEICO ANGIOGÊNICO PURIFICADO DO LÁTEX DE SERINGUEIRA, VEICULADO COM MATRIZ DE ESPONJA DE COLÁGENO. ESTUDO EXPERIMENTAL. Rodrigo de Moura Nogueira Médico Veterinário JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL 2009 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS CÂMPUS DE JABOTICABAL FÍSTULA ORONASAL EM CÃO. REPARO COM FLAPE SIMPLES ASSOCIADO A FATOR PROTEICO ANGIOGÊNICO PURIFICADO DO LÁTEX DE SERINGUEIRA, VEICULADO COM MATRIZ DE ESPONJA DE COLÁGENO. ESTUDO EXPERIMENTAL. Rodrigo de Moura Nogueira Orientadora: Profa. Dra. Cintia Lúcia Maniscalco Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Cirurgia Veterinária. JABOTICABAL – SÃO PAULO – BRASIL Novembro de 2009 ii DADOS CURRICULARES DO AUTOR Rodrigo de Moura Nogueira – nascido em 16 de agosto de 1979, na cidade de Sorocaba, graduou-se em Medicina Veterinária na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias (FCAV) /Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Câmpus de Jaboticabal no ano de 2002. Em 2004 participou de curso teórico-prático de Odontologia Veterinária de pequenos animais ministrado pelo Prof. Dr. Marco Antônio Gioso (Médico Veterinário, Cirurgião Dentista, docente da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) / Universidade de São Paulo (USP) / Câmpus de São Paulo e diplomado pelo American Veterinary Dental College, EUA). Exerceu entre 2003 e 2006 atividades em pequenos animais nas áreas de clínica geral, anestesiologia e, principalmente, odontologia veterinária, em centros especializados particulares na cidade de Ribeirão Preto, SP. Em 2007 ingressou no Programa de Pós-graduação em Cirurgia Veterinária da FCAV/UNESP/Jaboticabal. Prestou durante dois anos atendimento no Serviço de Odontologia Veterinária do Hospital Veterinário (HV) Governador “Laudo Natel” desta mesma instituição. iii Ao meu Pai, Leandro Nogueira “in memoriam”, pois sem ele nada disso teria acontecido, desde meu nascimento até agora. A minha Mãe, Marli, por sempre ouvir minhas lamentações e me dar bons conselhos. A minha esposa Simone por toda sua paciência, ajuda e amor. DEDICO iv AGRADECIMENTOS A minha Orientadora Profa. Dra. Cintia Lúcia Maniscalco, por ter acreditado em mim e me concedido esta oportunidade impar, muito obrigado. Ao Prof. Dr. Joaquim Coutinho Neto, por ter me ajudado com seus ensinamentos sobre o látex, que são muitos, e por ter fornecido o fator proteico necessário para a realização deste trabalho. Ao Prof. Dr. Newton Nunes, pela força, tanto na orientação sobre a anestesia como na permissão do custeio de meu experimento, como coordenador do Programa de Pós-graduação em Cirurgia Veterinária da FCAV/UNESP/Jaboticabal, obrigado professor. A Ana Paula, residente anestesista do HV/FCAV/UNESP/Jaboticabal, por ter acompanhado meu experimento e feito todas as anestesias sempre com muita disposição, valeu Aninha. Aos meus amigos de Jaboticabal, pós-graduandos, Miguel e Giovani (os colombianos), Denise, Manuela, Andréia e Raquel, por toda a ajuda com conselhos, dicas e momentos de descontração. Aos meus amigos Veterinários de Ribeirão Preto, Gustavo (Verminho), Daniel (Baxo) e Alessander (Gazela) pela ajuda em meu experimento. v Ao Alexandre (Dedo) pós-graduando em Cirurgia Veterinária da FCAV/UNESP/Jaboticabal, por suas dicas, pela ajuda na estatística e nos resultados da dissertação. Aos meus amigos e padrinhos de casamento Seidi e Doéze, pela paciência, compreensão e sempre bons conselhos. Aos meus irmãos Rodolfo e Gustavo pelo apoio. A FCAV/UNESP/Jaboticabal por ter cedido às instalações e equipamentos usados nesta pesquisa. A CAPES, órgão de fomento a pesquisa, e ao Programa de Pós-Graduação em Cirurgia Veterinária da FCAV/UNESP/Jaboticabal pela concessão da bolsa de estudos. A todos que de alguma forma contribuíram para a confecção deste trabalho e não foram lembrados agora, mas que com certeza jamais serão esquecidos. vi SUMÁRIO Página 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA............................................... 1 1.1. Reparo de Fístula Oronasal ...................................................................... 3 1.2. Biomembrana de Látex ............................................................................. 5 1.3. Cicatrização .............................................................................................. 8 1.3.1. Fase Inflamatória............................................................................... 8 1.3.2. Fase Proliferativa .............................................................................. 8 1.3.3. Fase de Remodelagem..................................................................... 9 2. OBJETIVO E JUSTIFICATIVA........................................................................ 10 3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................ 11 3.1. Aspectos Éticos......................................................................................... 11 3.2. Animais ..................................................................................................... 11 3.3. Material ..................................................................................................... 11 3.3.1. Preparo ............................................................................................. 12 3.4. Grupos Experimentais............................................................................... 13 3.5. Protocolo Anestésico................................................................................. 13 3.6. Técnica Cirúrgica ...................................................................................... 15 3.6.1. Exodontia do Canino......................................................................... 15 3.6.2. Produção e Diagnóstico da Comunicação ........................................ 17 3.6.3. Reparo .............................................................................................. 17 vii 3.7. Protocolo Terapêutico ............................................................................... 19 3.8. Critérios de Avaliação ............................................................................... 19 3.8.1. Avaliação Clínica............................................................................... 19 3.8.2. Avaliação Radiográfica...................................................................... 20 3.9. Análise Estatística..................................................................................... 20 4. RESULTADOS................................................................................................ 21 4.1. Sinais Inflamatórios................................................................................... 21 4.2. Cicatrização .............................................................................................. 24 4.3. Deiscência de Sutura ................................................................................ 26 4.3.1. Perda de Pontos ............................................................................... 26 4.3.2. Descontinuidade da Linha de Cicatrização ....................................... 29 4.5. Osteoproliferação...................................................................................... 31 5. DISCUSSÃO................................................................................................... 34 6. CONCLUSÕES............................................................................................... 40 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 41 viii LISTA DE FIGURAS Página FIGURA 1. Imagens fotográficas das diferentes etapas da exodontia de canino superior em cão............................................................ 16 FIGURA 2. Imagens fotográficas da avulsão de canino; produção, diagnóstico e reparo da comunicação oronasal em cão ............. 18 FIGURA 3. Imagens fotográficas dos sinais inflamatórios e cicatrização, nos grupos experimentais (ESP1, ES, S) no terceiro, sétimo, décimo quarto e vigésimo primeiro dias de observação ........... 23 FIGURA 4. Imagens fotográficas da perda de pontos (deiscência de sutura), nos grupos experimentais (ESP1, ES, S) no décimo quarto e vigésimo primeiro dias de observação....................... 28 FIGURA 5. Imagens fotográficas da descontinuidade da linha de cicatrização (deiscência de sutura), nos grupos experimentais (ESP1 e ES) ao sétimo dia de observação........ 30 FIGURA 6. Imagens radiográficas da osteoproliferação, nos grupos experimentais (ESP1, ES, S) no primeiro e vigésimo primeiro dia de observação...................................................... 33 ix LISTA DE GRÁFICOS Página GRÁFICO 1. Média e erro padrão* dos escores qualiquantitativos dos sinais inflamatórios na avaliação clínica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias) .................................................................... 22 GRÁFICO 2. Média e erro padrão* dos escores qualiquantitativos da cicatrização na avaliação clínica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias) .................................................................... 25 GRÁFICO 3. Média e erro padrão* dos escores qualiquantitativos da perda de pontos (deiscência de sutura) na avaliação clínica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias)................................ 27 GRÁFICO 4. Média e erro padrão* dos escores qualiquantitativos da descontinuidade da linha de cicatrização (deiscência de sutura) na avaliação clínica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias).. 30 GRÁFICO 5. Média e erro padrão* dos escores qualiquantitativos da osteoproliferação na avaliação radiográfica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias) ............................................................... 32 x LISTA DE TABELAS Página TABELA 1. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise clínica, dos sinais inflamatórios entre os grupos nos diferentes períodos (dias)........................................................... 21 TABELA 2. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise clínica, da cicatrização entre os grupos nos diferentes períodos (dias)............................................................................ 24 TABELA 3. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise clínica, da perda de pontos (deiscência de sutura) entre os grupos nos diferentes períodos (dias) .......................... 26 TABELA 4. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise clínica, da descontinuidade da linha de cicatrização (deiscência de sutura) entre os grupos nos diferentes períodos (dias)............................................................................ 29 TABELA 5. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise radiográfica, da osteoproliferação entre os grupos nos diferentes períodos (dias)........................................................... 31 xi LISTA DE ABREVIATURAS BML: Biomembrana de látex de planta (Hevea brasiliensis) ESP: Grupo experimental com comunicações reparadas com esponja de colágeno e salina ESP1: Grupo experimental com comunicações reparadas com esponja de colágeno, salina e P1 FAP: Fator proteico angiogênico obtido da seiva da seringueira FON: Fístula Oronasal P1: Fração de proteínas angiogênicas obtidas por purificação do látex de planta (Hevea brasiliensis) S: Grupo experimental controle com comunicações reparadas com salina xii FÍSTULA ORONASAL EM CÃO. REPARO COM FLAPE SIMPLES ASSOCIADO A FATOR PROTEICO ANGIOGÊNICO PURIFICADO DO LÁTEX DE SERINGUEIRA, VEICULADO COM MATRIZ DE ESPONJA DE COLÁGENO. ESTUDO EXPERIMENTAL. RESUMO - A fístula oronasal é uma comunicação anormal entre a cavidade oral e nasal. É ocasionada normalmente por doença periodontal avançada, onde o vértice alveolar, principalmente do canino superior, sofre processo de degeneração resultando na injúria; também pode ser causada por traumas, corpos estranhos, extrações dentárias inadequadas, cirurgias na cavidade oral, choques elétricos e atropelamentos. Nos cães, as fístulas acarretam vários sinais clínicos como espirros, secreção nasal, sinusites, rinites, infecções no trato respiratório e até pneumonias aspirativas. Devido à periodontites crônicas e o pouco tecido circunjacente, são de difícil reparação, sendo o pós-operatório problemático pela ocorrência de deiscência de sutura e recidiva com concomitante processo inflamatório e infecção. O látex da seringueira (Hevea brasilienses) mostrou em vários outros experimentos seu poder angiogênico e cicatrizante na formação tecidual. Este experimento teve por finalidade utilizar fração proteica purificada do látex de seringueira no reparo de comunicações oronasais provocadas, para simulação experimental de fístula, após exodontia de caninos superiores de cães. Foram obtidos como resultados uma melhor qualidade na cicatrização, menor processo inflamatório ao final de 21 dias, menor ocorrência de deiscência de sutura e maior quantidade de tecido ósseo no alvéolo, concluindo-se que a utilização do fator proteico auxilia no processo de reparo, tornando-o mais rápido e eficiente. Palavra – chave: Cão, Cicatrização, Cirurgia, Biomaterial, Exodontia, Odontologia. xiii ORONASAL FISTULA IN DOG. SINGLE FLAP REPAIR ASSOCIATED WITH ANGIOGENIC PROTEIN FACTOR FROM SERINGUEIRA LATEX, IN A COLLAGEN SPONGE MATRIX. EXPERIMENTAL STUDY. ABSTRACT – The oronasal fistula is an abnormal communication between oral and nasal cavities. It is generally caused by advanced periodontal disease, where the alveolar vertex, especially from the superior canine tooth, become degenerated resulting in that injury; it can either be caused by trauma, foreign bodies, inappropriate dental extractions, surgeries in the oral cavity, electric shock and car run over. In dogs, fistulas may cause several clinical signs as sneeze, nasal secretion, sinusitis, rhinitis, respiratory tract infection and even aspiration pneumonia. Because of chronic periodontitis and little tissue surrounding the fistulas, they are hard to repair; with difficult post-operative period due to the occurrence of suture dehiscence and fistulae recurrence with concomitant inflammatory process and infections. In others several experiments the rubber tree latex (Hevea brasiliensis) showed its angiogenic and healing power in tissue growth formation. The purpose of this experiment was to use a purified protein fraction from rubber tree latex to repair an oronasal communication induced for experimental simulation of the fistula, after extraction of superior canines in dogs. The obtained results corresponded to better healing quality, less inflammatory process after 21 days, less suture dehiscence and more alveolar bone tissue, concluding that the utilization of the protein factor helps in the repair process, making it faster and efficient. Key – word: Biomaterial, Dog, Healing, Odontology, Surgery, Tooth extraction. 1 1. INTRODUÇÃO E REVISÃO DE LITERATURA A fístula oronasal (FON) é uma comunicação anormal entre as cavidades oral e nasal (SALISBURY, 1996; HEDLUND, 2002) que geralmente é causada por trauma ou doença periodontal. A FON é mais incidente nos alvéolos de caninos superiores (EISNER, 1990), normalmente ocorre após a queda desses dentes (HARVEY & EMILY, 1993), mas também pode ser vista em pré-molares superiores (MANFRA-MARRETA & THOLEN, 1990). Está relacionada principalmente com doença periodontal severa ou exodontia do canino superior (MANFRA-MARRETA & THOLEN, 1990; HARVEY & EMILY, 1993; DORN, 1998; ROZA, 2004). Embora Manfra-Marreta & Tholen, (1990) também citem o abscesso periapical como uma das principais causas e San Roma et al. (1999) consideram apenas a exodontia como causa principal. Hedlund (2002) afirma que as fístulas decorrentes das odontopatias são mais comuns do que as adquiridas em ferimentos por mordedura ou à bala, queimaduras elétricas, presença de corpos estranhos compressores e cirurgias como excisão de massa ou rinotomia ventral. Podemos relacionar ainda como causas: neoplasias, defeitos congênitos, necrose por radiação ou deiscência de suturas após procedimentos cirúrgicos (SALISBBURY, 1996). Os sintomas da FON são: sinusite (EISNER, 1990), pneumonia por aspiração (EISNER, 1990; SALISBURY, 1996; HEDLUND, 2002), rinite crônica (EISNER, 1990; PEAK, 2007), descarga nasal mucopurulenta (SALISBURY, 1996; HEDLUND, 2002), espirros (SALISBURY, 1996; HEDLUND, 2002; GIOSO, 2003; DOGAN et al., 2007), epistaxe (SMITH, 2000) corrimento nasal (GIOSO, 2003; DOGAN et al., 2007) e anorexia (DOGAN et al., 2007). Gioso (2003) considera que, na maioria das vezes, as fístulas são decorrentes de complicações pó permanência de fragmentos de raiz dentária ou resquícios ósseos fraturados no interior do alvéolo, dizendo ainda que na exodontia errônea do canino seja comum ocorrer lesão da tabua óssea e formação da comunicação. Na maioria dos casos de periodontopatia avançada há perda do dente canino superior e degeneração óssea do vértice do alvéolo (SALISBURY, 1996), 2 principalmente por ação de bactérias gram negativas (REED, 1988). A degeneração severa entre a raiz e cavidade nasal leva a perda óssea desta região promovendo a comunicação (LOBPRISE, 2000; DOGAN et al., 2007), sendo a periodontite resultante na face palatina do dente canino a maior causadora da fístula (DOGAN et al., 2007). Para Niemiec (2008) a perda óssea resultante da doença periodontal tem como principal consequência a FON. A FON ocorre com maior frequência em animais de meia idade e exige reconstrução cirúrgica, tendo cicatrização espontânea apenas em pequenas fístulas traumáticas (HEDLUND, 2002). Dorn (1998) relata estarem sob maior risco os animais de pequeno porte e focinho estreito. As técnicas para reparação de fístula oronasal mais usadas são flapes de camada única ou duplo (HARVEY & EMILY, 1993; NELSON, 1998; SAN ROMAN et al., 1999; LOBPRISE, 2000; HEDLUND, 2002; ROZA, 2004), aproximação direta e flape rotacional (NELSON, 1998; SAN ROMAN et al., 1999; HEDLUND, 2002; ROZA, 2004), esses últimos citam ainda o flape como mais eficiente pela menor tensão e maior suporte para o reparo. Para Smith (2000) flapes simples devem ser utilizados somente para FONs agudas. Nas crônicas os duplos são mais indicados e, nestes casos, se houver recidiva pode-se empregar, para o reparo, enxerto septal nasal borrachóide. As complicações das técnicas de flape são muitas, como: deiscência de sutura pela alta tensão da sutura, falta de suprimento sanguíneo, infecção, falta de sustentação para o flape e cirurgia traumática para preparo do mesmo, as quais podem impedir a cicatrização, resultando em prognóstico ruim (HEDLUND, 2002). Peak (2007) descreve FONs inaparentes que não são diagnosticadas a olho nu, a não ser pelos sinais clínicos. Elas ocorrem pela presença de bactéria específica, com afinidade pelo ápice radicular, que provoca grandes bolsas periodontais que se comunicam com o seio nasal, porém com o dente mantido no alvéolo por vezes sem mobilidade. Em humanos, as fístulas também são causadas por exodontias (SILVEIRA et al., 2008), predominantemente de pré-molares e molares superiores (ALLAIS et al., 2008; 3 MEIRELES & PINTO, 2008) e as complicações são as mesmas encontradas nos animais (ALLAIS et al., 2008). 1.1. Reparo de Fístula Oronasal (FON) Salisbury (1996) sugere para a correção da fístula flape simples, porém com maxilectomia prévia das cristas alveolares, assim como a extração dos dentes próximos a ela, para diminuir a tensão da sutura. Nelson (1998) indica sutura dupla na fixação dos flapes de mucosa e submucosa, pois fechamento hermético garantiria melhor cicatrização da ferida. Smith (2001), após recidiva de FON gerada por exérese de fibrossarcoma em cão, usou flape mucoperiosteal confeccionado do palato contralateral a lesão, obtendo cicatrização em duas semanas. Atribuiu o bom resultado à presença da artéria palatina no retalho e menor rotação do mesmo quando comparado aquele em U rotacionado do palato adjacente a lesão. Bryant et al. (2003) confeccionaram flape pediculado de mucosa jugal para tratamento de FON recidivante em dois cães, defendendo sua utilização pela presença de artéria e veia angular no flape, ocorrendo em um dos animais cicatrização em seis meses e no outro permanência de 5% da FON original. Goelzer et al. (2003) colocaram resina acrílica auto-polimerizável (polimetil-metacrilato-PMMA) no orifício fistular previamente provocado em alvéolos de caninos superiores em 12 cães, havendo três casos de rejeição do material. Em defeitos ósseos causados em furcas dentais de quarto pré-molares inferiores de dois cães, Lima et al. (2003) empregaram hidroxiapatita sintética como enxerto, obtendo reparação óssea ao redor de 71 dias, constatada pelo retorno da anatomia normal (bolsa periodontal de 1 a 2 mm). Silva (2006) provocou em sete cães defeito em palato duro, reparando o mesmo em cinco cães com a biomembrana de látex (BML) e mantendo os demais como 4 controle. Observou que ao redor de 10 dias quatro animais tratados tinham fechamento completo da comunicação, enquanto que nos controles tardou por volta de 40 dias. Gomes et al. (2007) usaram colágeno bovino liofilizado no preenchimento de fístulas de alvéolos de caninos superiores (previamente provocadas em cães), ocorrendo alguns casos de deiscência de sutura, porém com bom resultado. Também, para reparar a FON, foi utilizado enxerto de cartilagem auricular autógeno em cinco felinos por Cox (2007), tendo resultado satisfatório, porém com o aumento do tempo operatório pela realização de duas feridas cirúrgicas e limitação de coleta da cartilagem. Na odontologia humana, enxertos autógenos provenientes das regiões retromolares ou interforames da mandíbula foram empregados por Watzak et al. (2005) em fístulas oroantrais, porém tiveram problemas como deiscência de sutura, necessidade de fixação do enxerto com miniplacas e, a união óssea foi observada apenas oito meses após a cirurgia; além do aumento do tempo cirúrgico para coleta do material. Hugentobler et al. (2006) monstraram, também em humanos, a superioridade dos flapes mucoperiosteais deslizantes frente aos de mucosas rotacionais, pois apresentam menor chance de deiscência de sutura e recidiva, além de menor necessidade de procedimentos periodontais secundários. Kirschener et al. (2006) testaram derme humana acelular comercial (AlloDerm®) para oclusão de FON em três suínos (induzidas experimentalmente) e em nove humanos (decorrentes de patologia); obtiveram bons resultados com cicatrização completa de todos os casos por volta de quatro semanas, havendo apenas dois pacientes humanos com deiscência de sutura e exposição do enxerto. Ainda em humanos, para o tratamento de fístulas oronasais, Scala et al. (2007) aplicaram um gel contendo plaquetas, conservadas criogênicamente, com bons resultados pela estimulação de fatores de crescimento e células osteoprogenitoras. Allais et al. (2008) também usaram em humano, corpo adiposo bucal como enxerto, obtendo total fechamento da FON em sete dias, pois este serviu como leito para crescimento do tecido de granulação com posteriormente epitelização. 5 Outra técnica foi a de retalho mucoso geniano realizada por Meirelles & Neves- Pinto (2008) para tratamento de vinte e cinco pacientes humanos, com sucesso em 24 casos em 30 dias de pós cirúrgico, sendo de pouca valia em animais pela falta de colaboração na movimentação exacerbada da mandíbula, assim como pela distância entre a fístula de canino superior e a mucosa jugal, além de menor quantidade deste tecido no animal. 1.2. Biomembrana de Látex Na década de 90 o Prof. Dr. Joaquim Coutinho Neto, docente do Departamento de Bioquímica e Imunologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto (FMRP) / Universidade de São Paulo (USP) e alguns colaboradores iniciaram estudos com a BML (Biomembrana de Látex), composta pela seiva da seringueira (Hevea brasiliensis), a qual apresenta atividade neoangiogênica que acelera e otimiza o processo de cicatrização, característica descoberta em várias pesquisas. No ano de 1994 a estudante de Mestrado da área de Cirurgia da FMRP/USP, Fátima Mrué tentou reproduzir, sem sucesso, a prótese de Takimoto, composta de silicone e colágeno, para reconstituição de esôfago de cães. Foi então que o Prof. Dr. Coutinho lançou mão da seiva da seringueira (Hevea brasiliensis) para a confecção desta prótese. No décimo dia, após a cirurgia de implante, as próteses foram expelidas com as fezes, observando-se no sítio operatório, por endoscopia e análises histológicas, reconstrução sem nenhuma complicação. O tecido formado era muito semelhante ao esôfago normal (ERENO, 2003), sem sinais cicatriciais ou fibrose, sugerindo processo de neoformação (MRUÉ, 1996). A neovascularização foi comprovada pela grande quantidade de vasos encontrada nos cortes histológicos, sugerindo a indução de neoangiogênese pelo látex. Testes comparativos da biomembrana de látex (BML) com luvas cirúrgicas e preservativos em ovos embrionados mostraram a sua atividade neovascularizante, não observada nos outros 6 materiais. Concluindo-se que a vulcanização aplicada na fabricação desses materiais (luvas e preservativos), onde a temperatura varia de 110° a 125°C, inativaria as propriedades neoangiogênicas que, provavelmente, são inerentes às proteínas existentes no látex, pois a manufatura da BML é diferente (PELE NOVA BIOTECNOLOGIA, 1999). Coutinho e Mrué em 1997 submeteram então à Comissão de Ética do Hospital das Clínicas (HC) da FMRP/USP pedido para iniciarem testes em humanos. Pacientes com úlceras crônicas de pele começaram a ser tratados com BML, no Hospital de Itajobi/SP e, 12 dias após os curativos serem aplicados observou-se tecido de granulação e epitelização contra os seis meses necessários pelos métodos tradicionais (ERENO, 2003). Em substituição a defeito induzido no pericárdio de cães, a BML mostrou-se satisfatória, propiciando a regeneração do pericárdio nativo com evidenciada proliferação fibroblástica e vascular em cortes histológicos, da membrana neoformada (SADER et al., 2000). Oliveira et al. (2003) usaram a BML para reparação de membrana timpânica, comparando-a com a fáscia temporal, em perfurações causadas por otite média em humanos, e observaram fechamento de 96% dos ouvidos e intensa vascularização local o que não é comum com outras opções. Pinho et al. (2004) aplicaram BML em conjuntivas de coelhos, previamente lesadas, e obtiveram cicatrização e neoangiogênese superior quando compararam àqueles que permaneceram com a esclera nua. Mendonça (2004) concluiu que uma fração de proteína, chamada de pico 1 (P1) obtida do soro do látex de Hevea brasiliensis, por diluição em ácido acético 2,2%, seria responsável pelas propriedades de cicatrização da BML. Neste estudo essa fração de proteína, obtida por cromatografia em DEAE – celulose do soro proveniente do látex, foi aplicada na pele do dorso de coelhos, mostrando alta atividade no aumento da permeabilidade vascular, e também avaliada em membranas cório-alantóides de ovos de galinhas, com maior formação de neovasos em relação ao grupo controle. 7 Paulo et al. (2005a) empregaram a BML na herniorrafia perineal de um cão e notaram no momento da retirada do implante um tecido fibroso ocluindo completamente o anel herniário, que foi suficiente para reconstruir o diafragma pélvico. A BML foi também aplicada na correção de hérnias umbilicais recidivantes em bovinos leiteiros. Macroscopicamente, houve crescimento acentuado de tecido conjuntivo fibroso sob a membrana, com intensa associação com a musculatura adjacente, promovendo assim, adequada estabilidade e reparação cicatricial (RABELO et al., 2005). Balabaniam (2005) introduziu a BML em forma de grânulos ou gel de látex em alvéolos de ratos após a extração de dentes incisivos e não observou rejeição ou processo inflamatório persistente. A reparação óssea intra-alveolar foi incrementada juntamente com a quantidade de vasos sanguíneos, havendo ainda superioridade do gel em relação aos grânulos no período inicial de sete dias. Paulo et al. (2005b) produziram defeitos na parede abdominal em ratos, repararam com BML, notando formação de base fibrosa após expulsão das membranas. Defeitos em ossos parietais do crânio de ratos foram criados para a observação da indução da regeneração óssea guiada (ROG) pela BML. Constatou-se formação óssea superior nos sítios criados e preenchidos com a membrana, além de grande quantidade de vasos que parecem resultar do fator estimulador da osteogênese, os quais não ocorreram nos controles que receberam tecidos autógenos (SOUSA, 2006). Silva (2006) usou a BML para reparar fendas palatinas induzidas em cães e observou fechamento mais rápido quando comparado aos animais controle que tiveram cicatrização por segunda intenção. Souza et al. (2007) utilizaram a BML em cavidades neoformadas por timpanomastoidectomia, em humanos, e perceberam a aceleração do processo de neoangiogênese com subsequente epitelização. 8 1.3. Cicatrização A cicatrização é o processo de reparação após o rompimento da integridade tecidual com formação de uma cicatriz. Ocorre em três fases bem definidas: fase inflamatória, fase proliferativa e fase de remodelagem (CLARK, 1996). 1.3.1. Fase Inflamatória: preenchimento da área lesada com plasma e elementos celulares, principalmente plaquetas. A coagulação sanguínea e a agregação plaquetária geram um tampão rico em fibrina que, além de estabelecer a hemostasia e servir como uma barreira a infecções, organiza matriz provisória para a migração celular servindo ainda como um reservatório de fatores de crescimento necessários para as próximas fases da cicatrização (WERNER & GROSE, 2003). 1.3.2. Fase Proliferativa: ocorre devido à estimulação mitogênica formando, além do epitélio, tecido de granulação contendo capilares neoformados (FRADE, 2003). Nesta fase o aumento na permeabilidade vascular permite o transporte de água e macromoléculas incluindo fibrinogênio e outras proteínas da coagulação que favorecem a hemostasia e a deposição de fibrina extravascular, necessários para o processo de cicatrização (DVORAK, 2002). De fundamental importância, a angiogênese é responsável pelo aporte nutricional e de oxigênio aos tecidos neoformados (LI et al. 2003). Na formação de neovasos e aumento da permeabilidade vascular os fatores de crescimento são os principais responsáveis por essa estimulação, além de crescimento tecidual, reepitelização, formação do tecido de granulação, quimiotaxia, entre outros (MENDONÇA, 2004). Para o crescimento de neovasos e tecidos é necessário matriz extracelular constituída basicamente por fibronectina, colágeno, vibronectina, tenascina e laminina; funcionando como “plataforma” para a migração celular e principalmente como reservatório de fatores de crescimento (RUOSLAHTI & YAMAGUCHI, 1991). 9 1.3.3. Fase de Remodelagem: nesta etapa o organismo tenta restabelecer a estrutura tecidual normal. É marcada por maturação dos elementos e modificação na matriz extracelular, ocorrendo deposição de proteoglicanas e colágeno. A matriz que era provisória torna – se então definitiva e com a remodelagem desaparecem a maioria dos vasos, fibroblastos e células inflamatórias, por processos de emigração, apoptose ou outros mecanismos de morte celular desconhecidos, levando à formação de uma cicatriz relativamente acelular (ARNOLD & WEST, 1991). 10 2. OBJETIVO E JUSTIFICATIVA Com este trabalho objetivou-se otimizar e acelerar o processo de reparação das fístulas oronasais, com a utilização fator proteico purificado do látex de seringueira, de comprovada atividade neovascular e promotora da cicatrização, no tratamento de comunicações oronasais induzidas experimentalmente. 11 3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Aspectos éticos A pesquisa foi realizada de acordo com os Princípios Éticos da Experimentação Animal, adotado pelo Colégio Brasileiro de Experimentação (COBEA) e foi aprovada pela Comissão de Ética e Bem Estar Animal (CEBEA) da FCAV/UNESP/Jaboticabal sob Protocolo n° 0012401-08. 3.2. Animais Foram utilizados nove cães (sem raça definida), com idade média aproximada de 8 anos, sendo quatro machos e cinco fêmeas com peso médio de 15 kg, selecionados após exame físico e laboratorial (níveis séricos de alalinoaminotransferase - ALT, uréia sérica e hemograma) para avaliação das condições de saúde e não interferência no experimento. 3.3. Material Com base nos dados de Mendonça (2004), a fração de proteína denominada de pico 1 (P1) foi escolhida para utilização no experimento. 12 3.3.1. Preparo O material foi preparado no Laboratório do Prof. Dr. Coutinho no Departamento de Bioquímica e Imunologia da FMRP/USP. A proteína 1 (P1) ou pico 1, obtida pelo método de Mendonça (2004), foi então liofilizada adquirindo o aspecto de pó, o qual foi utilizado para preparo de solução de 0,01% de P1 em cloreto de sódio 0,9%. Nesta solução foram colocadas as esponjas de colágeno1, afim de que absorvessem esse líquido. Para a comprovação de que as esponjas conteriam a P1 foram feitas leituras de absorbância em espectofotômetro2 a 280 nm. Foi realizada leitura logo após o preparo e após 24h da inclusão das esponjas na solução. O aparelho foi zerado com salina 0,9% e os seguintes valores de absorbância foram obtidos: Primeira leitura • Salina 0,9% + esponjas: 0,054 • Salina 0,9% + P1: 0,429 • Salina 0,9% + P1 + esponjas: 0,436 Segunda leitura • Solução 1 (S1) – suspensão de imersão das esponjas (salina + P1): 0,303 • Solução 2 (S2) - suspensão contida nas esponjas, obtida por compressão (salina + P1): 0,420 Portanto, na primeira leitura foi comprovada a presença da proteína na solução salina quando se obteve um valor muito superior (0,429) naquela contendo esponjas e P1 quando comparado a outra contendo apenas esponjas (0,054). Identificou-se ainda, na segunda (após 24h), que ocorreu retenção de parte da proteína pela esponja, visto 1 Hemospon cx c. 10 – Technew Comércio e Indústria Ltda. – Rio de Janeiro – RJ 2 Aparelho de Espectrocospia Spectronic Genesys 20 – Thermo Fisher Scientific Inc. – Waltham, MA. USA 13 que o valor de 0,303 na solução de imersão das esponjas é menor em relação ao valor obtido (0,420) naquela resultante da compressão delas, propriedade favorável ao experimento pela manutenção por maior tempo e quantidade de P1 na comunicação (liberação controlada). 3.4 Grupos experimentais Foram extraídos os dois caninos superiores de todos os nove animais e provocadas as comunicações oronasais para simular as fístulas (n=18). Essas formaram então três grupos (n=6) para três diferentes tratamentos: I (ESP1) - esponja de colágeno contendo salina e P1, II (ES) - esponja de colágeno com salina e III (S) Controle – apenas com salina. 3.5. Protocolo Anestésico O procedimento cirúrgico foi realizado sob anestesia geral inalatória. Os animais receberam como medicação pré-anestésica a associação de levomepromazina3 (1mg/kg) e cloridrato de petidina4 (3 mg/kg) por via intravenosa. Após quinze minutos foram induzidos com propofol5, por via intravenosa, na dose suficiente (5 a 10 mg/kg) para a intubação orotraqueal com sonda de Magill de diâmetro apropriado. A anestesia foi mantida com o gás inalatório isofluorano6 diluído em oxigênio a 100% a 1,0 CAM (Concentração Alveolar Mínima), em circuito semi-fechado. Para 3 Neozine 25mg/5ml amp. 20 mL – Sanofi-Aventis – Suzano –SP 4 Dolantina 50 mg/ml amp. 2 ml – Sanofi-Aventis – Suzano –SP 5 Propovan 10 mg/ml amp. 20 ml - Laboratório Cristália – Itapira -SP 6 Isoflurane fco 100 ml - Laboratório Cristália – Itapira –SP 14 anestesia local, das hemi-maxilas, administrou-se cloridrato de bupivacaína7 na dose de 0,5 mg/kg infundido bilateralmente nos forames infra-orbitários. 7 Bupivacaína 0,25% amp 20 ml – Abbott Brasil – São Paulo – S.P. 15 3.6. Técnica Cirúrgica O procedimento cirúrgico foi precedido de lavagem da cavidade oral com solução cloreto de sódio a 0,9 %8 e posterior antissepsia com solução de gluconato de clorexedine a 0,12%9 como determinado por Nelson (1998) e Hedlund (2002). 3.6.1. Exodontia do Canino A exodontia dos dentes caninos superiores foi executada segundo a técnica modificada de Roza (2004), na qual se cria um flape mucoperiosteal mediante duas incisões paralelas à raiz do canino (mesial e distal), com bisturi e lâmina n° 24 (Figura 1A), iniciadas nas bordas coronais passando pela linha mucogengival até a posição necessária para exposição dos terços distal e medial da raiz. O tecido incisado foi então rebatido com auxílio de cinzel odontológico unibiselado formando-se o flape (Figura 1B). Com a raiz exposta (Figura 1C), foi promovida a luxação na face mesial radicular com alavanca apical tipo Seldin reta (Figura 1D) para rompimento do ligamento periodontal e liberação do elemento dental. Os movimentos de luxação foram feitos sempre no sentido meso-distal e nunca vestíbulo-palatino a fim de se evitar a fratura radicular do canino (GIOSO, 2003). Quando o dente já estava com acentuada mobilidade foi usado o fórceps odontológico (Figura 2A) com movimentos de rotação e extrusão para sua completa remoção. 8 Cloreto de Sódio 0,9% fco 500 ml – Fresenius Medical Care – Jaguariúna – S.P. 9 Periogard fco 1l - Colgate-Palmolive Ind. e Com. Ltda. – São Paulo – S.P. 16 Figura 1. Imagens fotográficas das diferentes etapas da exodontia de canino superior de cão. A: incisões paralelas, com bisturi, mesial e distal à raiz (setas). B: rebatimento do flap com cinzel unibiselado odontológico (seta). C: raiz exposta e flap confeccionado (setas). D: luxação com alavanca apical Seldin reta na face mesial radicular. A B C D 17 3.6.2. Produção e Diagnóstico da Comunicação Extraídos os caninos, foram provocadas as comunicações com pinça histológica de ponta perfurante e martelo de Marlet (Figura 2B), sendo confirmada pela hemorragia oriunda da narina correspondente (GOELZER, 2003 e GOMES, 2007). Para diagnóstico definitivo da fístula empregou-se técnica modificada de Godói (1992). Foi preparada sonda uretral (calibre 6, 8 ou 10) ocluíndo-se sua extremidade com pinça hemostática aquecida em lamparina odontológica, para seu preenchimento com sulfato de bário e não extravasamento na cavidade nasal. No orifício recém formado introduziu-se a sonda preparada e realizou-se radiografia odontológica intra-oral (Figuras 2C e D), com aparelho de Radiologia10 e filme11 n° 2, constatando-se assim a comunicação entre a cavidade oral e os seios nasais. 3.6.3. Reparo Promovidas as comunicações, suas cavidades foram preenchidas (Figura 2E) com esponjas de colágeno + salina + P1 (grupo ESP1), esponja de colágeno + salina (grupo ES) ou somente salina (grupo S). Em cada cavidade dos grupos ESP1 e ES foram colocadas três esponjas. As comunicações foram então reparadas pelo método de flape simples mucoperiosteal deslizante (SAN ROMAN et al.,1999; HEDLUND, 2002; ROZA, 2004; GOMES, 2007) utilizando-se aquele confeccionado na exodontia. Esse foi posicionado de modo a cobrir completamente o orifício deixado pela exodontia, sendo ampliadas às incisões laterais, caso houvesse tensão na aproximação. O flape foi então suturado ao tecido gengival e mucoso circunjacente, com fio de nailon12 4-0 (Figura 2F). 10 Aparelho de Raios–X – Gnatus 66 Kvp – 6,5 ma – modelo – Time X-66 – Ribeirão Preto – S.P. 11 Filme Dental 31x41mm - Kodak insight – São José dos Campos – S.P. 12 Fio de Sutura de Nylon Monofilamentar Preto – Technofio – Goiânia – GO. 18 Figura 2. Imagens fotográficas da avulsão de canino, produção, diagnóstico e reparo da comunicação oronasal em cão. A: avulsão com fórceps. B: produção da comunicação. C: sonda contendo sulfato de bário (seta), posição do aparelho (a) e filme (b) para captação de imagem radiográfica. D: imagem radiográfica confirmando a presença da comunicação (setas). E: cavidade preenchida com esponjas (seta). F: comunicação reparada após sutura do flape (setas). A B b a C D E F 19 3.7. Protocolo Terapêutico Os animais receberam antibiótico azitromicina13 na dose de 10 mg/kg a cada 24h por 10 dias, anti-inflamatório meloxicam14 na dose de 0.1 mg/kg a cada 24 horas por sete dias e analgésico cloridrato de tramadol15 na dose de 1 mg/kg a cada 12 horas por sete dias, todas as medicações iniciadas no dia da cirurgia. A alimentação foi pastosa nos 10 primeiros dias de pós-operatório para evitar complicações no local da cirurgia. 3.8. Critérios de Avaliação Todas as avaliações foram feitas por três Médicos Veterinários, que atribuíram um escore numérico qualiquantitativo para cada fator analisado, citado a seguir, dos quais foi obtida uma média. Com base no proposto por Pinho et al. (2004) os escores qualiquantitativos estabelecidos foram: (0) ausente, (1) discreto, (2) moderado, (3) intenso e (4) muito intenso. 3.8.1. Avaliação Clínica Os aspectos macroscópicos foram avaliados aos três, 14 e 21 dias de pós- operatório. Foram inspecionados sinais inflamatórios, cicatrização e deiscência de sutura (perda de pontos e descontinuidade na linha de cicatrização). Os sítios cirúrgicos foram fotografados em todas as avaliações. 13 Azitromicina susp. 200mg/ml – Ranbaxy Farmacêutica LTDA. – São Gonçalo – RJ 14 Maxicam comp 0,5mg ou 10mg – Ouro Fino Saúde Animal – Cravinhos - SP 15 Tramal comp 50 ou 100mg – Searle do Brasil LTDA. – São Paulo – S.P. 20 3.8.2. Avaliação Radiográfica Após sedação, dos animais, com propofol (5 a 10 mg/kg) por via intravenosa, foram realizadas radiografias intra-orais aos 21 dias de pós-operatório para averiguação de osteoproliferação. 3.9. Análise Estatística Os dados foram submetidos ao Teste de Friedman (Variância por médias repetidas), com posterior análise pelo “post doc” de Dunn. Considerou-se significativo os resultados com valores de p<0,05. Empregou-se programa computacional para a estatística16, bem como para a confecção de gráficos17. 16 Sigma Stat 3.0, Systat Software inc - San Jose, CA, USA 17 Origin 6.1, OriginLab Corporation - Northampton, MA, USA 21 4. RESULTADOS Todos os dados avaliados foram expressos pela média e erro padrão (±EPM). 4.1. Sinais Inflamatórios Em nenhum dos períodos de observação houve diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos (Tabela 1 e Gráfico 1), entretanto o escore qualiquantitativo aos três dias, do grupo ESP1, foi 6,8 vezes superior ao do grupo S e 4 vezes ao do grupo ES. Além disso, ocorreu diminuição do valor do grupo ESP1 no sétimo dia, enquanto que nos outros grupos aconteceu um aumento. Notou-se ainda que, aos 21 dias o escore do grupo ESP1 foi 31% menor que o grupo S e 22% que o ES. Na Figura 3 pode ser observada hiperemia no grupo ESP1 aos 3 dias de pós- operatório, sendo que ao sétimo dia não é mais visibilizada. No grupo ES, este sinal é notado a partir do sétimo dia, acentuando-se com o tempo, assim como em S. Aos 21 dias notam-se sinais de inflamação mais intensos no grupo S, seguido de ES e ESP1. Tabela 1. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise clínica, dos sinais inflamatórios, entre os grupos, nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal, 2009. Período de Observação (dias) GRUPOS 3 7 14 21 Esponja de colágeno, Salina e P1 (ESP1) 1,33±0,22 0,17±0,17 0,67±0,22 1,17±0,60 Esponja de colágeno e Salina (ES) 0,33±0,22 1,00±0,45 0,50±0,34 1,50±0,43 Salina (S) 0,17±0,17 0,67±0,21 1,17±0,40 1,70±0,42 *Teste de Dunn (p > 0,05) 22 3 7 14 21 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 Si na is In fla m at ór io s (e sc or e qu al iq ua nt ita tiv o) Dias de Observação ESP1 ES S Gráfico 1. Média e erro padrão dos escores qualiquantitativos dos sinais inflamatórios na avaliação clínica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal, 2009. 23 Figura 3. Imagens fotográficas dos sinais inflamatórios e cicatrização, nos grupos experimentais (ESP1, ES, S) no terceiro (3), sétimo (7), décimo quarto (14) e vigésimo primeiro (21) dias de observação. ESP1(3) ES(3) S(3) ESP1(7) ES(7) S(7) ESP1(14) ES(14) S(14) ESP1(21) ES(21) S(21) 24 4.2. Cicatrização Em nenhum dos períodos avaliados houve diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos (Tabela 2 e Gráfico 2). Contudo, no terceiro dia de observação, somente o grupo ES obteve escore positivo e, ao sétimo dia, mostrou superioridade de 12% e 28% ao grupo ESP1 e S, respectivamente. No décimo quarto dia houve uma inversão dos escores entre ESP1 e ES, ficando o do primeiro 15% superior ao ES e 25% ao S. Ao vigésimo primeiro dia o grupo ESP1 manteve o maior escore, sendo 20% superior ao ES e 29% ao S. Visualiza-se na Figura 3, na página anterior, em ESP1(14) melhor aspecto cicatricial quando comparado a ES(14), o qual está superior a S(14), conservando-se a mesma situação aos 21 dias de observação, porém muito acima quando comparado aos 14 dias de observação. Tabela 2. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise clínica, da cicatrização entre os grupos nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal 2009. Período de Observação (dias) GRUPOS 3 7 14 21 Esponja de colágeno, Salina e P1 (ESP1) 0,00±0,00 1,33±0,42 2,50±0,34 3,00±0,52 Esponja de colágeno e Salina (ES) 0,17±0,17 1,50±0,22 2,17±0,30 2,50±0,43 Salina (S) 0,00±0,00 1,17±0,40 2,00±0,36 2,33±0,49 *Teste de Dunn (p > 0,05) 25 3 7 14 21 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 C ic at riz aç ão (e sc or e qu al iq ua nt ita tiv o) Dias de Observação ESP1 ES S Gráfico 2. Média e erro padrão dos escores qualiquantitativos da cicatrização na avaliação clínica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal, 2009. 26 4.3. Deiscência de Sutura 4.3.1. Perda de pontos Não houve diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos ou períodos (Tabela 3 e Gráfico 3), porém aos três dias ela ocorreu entre os grupos ES e S. Aos 14 dias o escore de ESP1 foi 85% menor que os outros grupos e aos 21 dias permanecia 57% menor que ES e 62% que S. Observamos na Figura 4 que em ESP1(14) e (21) não ocorre perda de pontos de sutura, enquanto que em ES(14) e (21) há perda considerável, mas ela ainda é bem menor quando comparada a S(14) e (21). Tabela 3. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise clínica, da perda de pontos entre os grupos nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal 2009. Período de Observação (dias) GRUPOS 3 7 14 21 Esponja de colágeno, Salina e P1 (ESP1) 0,00±0,00 0,17±0,17 0,17±0,17 0,50±0,34 Esponja de colágeno e Salina (ES) 1,00±0,45 1,00±0,45 1,17±0,40 1,17±0,40 Salina (S) 0,67±0,21 1,00±0,36 1,17±0,30 1,33±0,42 *Teste de Dunn (p > 0,05) 27 3 7 14 21 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 Pe rd a de p on to s (e sc or e qu al iq ua nt ita tiv o) Dias de Observação ESP1 ES S Gráfico 3. Média e erro padrão dos escores qualiquantitativos da perda de pontos na avaliação clínica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal, 2009. 28 Figura 4. Imagens fotográficas da perda de pontos (setas), nos grupos experimentais (ESP1, ES, S) no décimo quarto (14) e vigésimo primeiro (21) dias de observação. ESP1(14) ESP1(21) ES(14) ES(21) S(14) S(21) 29 4.3.2. Descontinuidade da linha de cicatrização Entre os grupos ou períodos não houve diferença significativa para p > 0,05 (Tabela 4 e Gráfico 4), entretanto ocorreu descontinuidade na linha de cicatrização nos grupos ESP1 e ES que apresentaram o mesmo escore no terceiro e sétimo dia. A descontinuidade aparece no grupo S, no sétimo dia, porém 34% menor que nos outros grupos. Visualizamos na Figura 5, pequena descontinuidade na linha de cicatrização em ESP1 e ES aos 7 dias de observação. Tabela 4. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise clínica, da descontinuidade da linha de cicatrização entre os grupos nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal 2009. Período de Observação (dias) GRUPOS 3 7 14 21 Esponja de colágeno, Salina e P1 (ESP1) 0,17±0,17 0,50±0,34 0,00±0,00 0,00±0,00 Esponja de colágeno e Salina (ES) 0,17±0,17 0,50±0,34 0,00±0,00 0,00±0,00 Salina (S) 0,00±0,00 0,33±0,21 0,00±0,00 0,00±0,00 *Teste de Dunn (p > 0,05) 30 3 7 14 21 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 D es co nt in ui da de d a lin ha d e ci ca tri za çã o (e sc or e qu al iq ua nt ita tiv o) D ias de Observação ESP1 ES S Gráfico 4. Média e erro padrão dos escores qualiquantitativos da descontinuidade da linha de cicatrização na avaliação clínica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal, 2009. Figura 5. Imagens fotográficas da descontinuidade da linha de cicatrização (setas), nos grupos experimentais (ESP1 e ES) ao sétimo (7) dia de observação. ESP1(7) ES(7) 31 4.4. Osteoproliferação Quanto à osteoproliferação, em nenhum dos períodos avaliados, houve diferença significativa (p > 0,05) entre os grupos (Tabela 5 e Gráfico 5), todavia observou-se escores diferentes nas radiografias realizadas no vigésimo primeiro dia, sendo o do grupo ESP1 26% maior que ES e 149% que S. Constatou-se maior osteoproliferação no grupo ESP1, seguido pelo grupo ES e, por último, o S. Como observamos na Figura 6 em ESP1(21) ocorreu aumento considerável da radiopacidade comparado a ESP1(1), com comportamento semelhante entre ES(21) e ES(1), porém de menor dimensão. Em S(21) houve pequena deposição óssea. Tabela 5. Média e erro padrão* do escore qualiquantitativo obtido por análise radiográfica, da osteoproliferação entre os grupos nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal 2009. Período de Observação (dias) GRUPOS 1 21 Esponja de colágeno, Salina e P1 (ESP1) 0,00±0,00 1,670,42 Esponja de colágeno e Salina (ES) 0,00±0,00 1,330,42 Salina (S) 0,00±0,00 0,670,21 *Teste de Dunn (p > 0,05) 32 1 21 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 2,2 O st eo pr ol ife ra çã o (e sc or e qu al iq ua nt ita tiv o) Dias de Observação ESP1 ES S Gráfico 5. Média e erro padrão dos escores qualiquantitativos da osteoproliferação na avaliação radiográfica dos sítios cirúrgicos dos grupos ESP1, ES e S nos diferentes períodos de observação (dias). Jaboticabal, 2009. 33 Figura 6. Imagens fotográficas de radiografias mostrando a osteoproliferação (setas), nos grupos experimentais (ESP1, ES, S) no primeiro (1) e vigésimo primeiro (21) dias de observação. ESP1(1) ESP1(21) ES(1) ES(21) S(1) S(21) 34 5. DISCUSSÃO Vários são os relatos na literatura, de fístulas oronasais, seus sinais clínicos (EISNER, 1990; MANFRA-MARRETA & THOLEN, 1990; HARVEY & EMILY, 1993; SALISBURY, 1996; DORN, 1998; GIOSO, 2003; ROZA, 2004; DOGAN et al., 2007; PEAK, 2007) e as diversas técnicas para seu reparo (SALISBURY, 1996; SMITH, 2001; BRYANT, 2003; GOELZER et al., 2003; LIMA et al., 2003; SILVA, 2006; GOMES et al., 2007; COX, 2007), porém com suas diversas complicações surge a necessidade e o interesse de se buscar nova técnica que seja eficiente, simples e de baixo custo para sua correção. Os experimentos realizados com a BML (MRUÉ, 1996; SADER et al., 2000; ERENO, 2003; OLIVEIRA et al. 2003; PINHO et al., 2004; PAULO et al., 2005a; PAULO et al. 2005b; RABELO et al. 2005; BALABANIAM, 2005; SILVA, 2006; SOUSA, 2006; SOUSA et al., 2007) revelaram o poder cicatrizante da seiva de seringueira, mais especificamente do fator proteico angiogênico estudado por Mendonça (2004). Portanto, a necessidade de vascularização do flape de reparo de FON, para aumentar o potencial de cicatrização (SMITH, 2001; BRYANT et al., 2003; KIRSCHENER, 2006) justificou a utilização do pico 1 (P1) de proteínas, com atividade neovascularizante comprovada (MENDONÇA, 2004). No início do trans-operatório foi de grande valia a lavagem da cavidade oral com solução cloreto de sódio a 0,9%, seguida de antissepsia com solução de gluconato de clorexedine a 0,12%, como determinado por Nelson (1998) e Hedlund (2002), visto que a realização de tratamento periodontal aumentaria muito o tempo cirúrgico, já longo devido à dificuldade da exodontia dos caninos superiores (GIOSO, 2003) e dos demais procedimentos (produção, diagnóstico e reparo da comunicação). Para a exodontia dos caninos não tivemos sequer uma fratura indesejada da tábua óssea ou elemento dental como descrito por Gomes et al. (2007), provavelmente por terem sido seguidas a risca as orientações de Gioso (2003) de nunca executar movimentos de luxação láteromediais e sempre crâniocaudais. 35 Em todas as cirurgias, no momento da produção da comunicação, ocorreu hemorragia nasal, como relataram Goelzer et al. (2003) e Harvey & Emily (1993), confirmando o sucesso da realização. No seu diagnóstico, a técnica de Godoy (1992) modificada, mostrou-se simples e eficaz, com pequena modificação. Vedou-se a porção final da sonda contendo sulfato de bário, a fim de se evitar extravasamento do contraste no interior da cavidade nasal, o que prejudicaria a visualização da imagem radiográfica. Por último, empregou-se aparelho de radiologia odontológica ao invés de panorâmica, o que conferiu maior qualidade nas imagens. Gomes et al. (2007), em um grupo de seu experimento, produziram e repararam as comunicações oro-nasais logo após sua confecção e, em outro grupo, provocaram as fístulas e não as reparou deixando os orifícios preenchidos por uma gaze para evitar a cicatrização. Após dois dias, as gazes haviam saído do local e não foram repostas. Em sete dias, todas as comunicações ainda estavam abertas, mostrando que mesmo sem mecanismos para impedir sua cicatrização, ela não aconteceu, concluindo-se então que, não há necessidade de espera para o reparo. Portanto, com base no exposto, as comunicações, simulando fístulas, foram imediatamente reparadas com flape simples deslizante associado ao FAP, neste experimento. Na sutura do flape, confeccionado na exodontia e aproveitado no reparo da comunicação, foi utilizado o ponto simples interrompido com fio de diâmetro 3-0 (SMITH, 2000) e com nailon, por suas propriedades monofilamentares que conferem a impermeabilidade necessária para a síntese da mucosa e pela sua liberação espontânea quando mantido na superfície epitelial (HARVEY, 1987). Para o reparo de FONs, Lima et al. (2003) empregaram a hidroxiapatita sintética em exposições de furca provocadas em cães, havendo, após 71 dias o retorno da anatomia próxima ao normal nos defeitos pequenos. Contudo, seu uso em FONs é dificultado pela porosidade do material, que certamente se perderia na cavidade nasal, sendo então contra-indicada (MEIRELLES & NEVES-PINTO, 2008). Eles ressaltam ainda, que o material não apresentou bons resultados quando em contato com a mucosa oral. 36 FONs induzidas em cães foram preenchidas com polimetilmetacrilato (GOELZER et al., 2003), havendo rejeição do material em 12,5% dos casos e deiscência de sutura em 75% (provavelmente devido a tentativa do organismo em expulsar o material). Comparando-se ao FPA, não ocorreu rejeição do material e, mínima ou quase nula, deiscência de sutura. Garcia et al. (1981) descreveram a inibição da osteoproliferação, muito importante como tecido de sustentação, diferentemente do FPA que induz crescimento ósseo. O uso de cartilagem auricular em cinco gatos com FON por Cox et al. (2007) resultou na eliminação da comunicação, porém o tempo médio de cicatrização foi de seis semanas, muito superior ao de duas semanas observado neste trabalho. Salientamos ainda, o aumento de tempo cirúrgico para coleta do enxerto e prejuízo estético para o animal, o que não acontece com a utilização do flape simples associado ao FPA, de rápida e fácil execução. Gomes et al. (2007) aplicaram osso esponjoso bovino inorgânico em FONs induzidas, e afirmaram se tratar de um ótimo método, pois conseguiram preenchimento do defeito dos sete aos 21 dias de pós-operatório e baixa taxa de deiscência (20%). Todavia, contestamos por se tratarem de fístulas induzidas e sem grupo controle para verificação da superioridade do material frente às técnicas convencionais. Em técnica aplicada para enormes fístulas pós exérese de neoplasia em dois cães, Bryant et al. (2003) lançaram mão de grande flape feito a partir da mucosa jugal, para recobrir região de palato duro fistulado, não obtendo sucesso. No primeiro, o tempo de cura foi de seis meses e no segundo a fístula não foi reparada totalmente com persistência de 5% da lesão. Portanto o método proposto, além de ser mais utilizado para grandes comunicações caudais, é de realização mais elaborada e com tempo de cicatrização superior. Então não são recomendados para FONs, que são mais comuns em região de caninos superiores. Tratando-se ainda de flape da mucosa jugal a movimentação da mandíbula prejudicaria a sutura do flape e consequente adesão do mesmo aos bordos do defeito. As complicações para reparo de FONs em animais são praticamente as mesmas encontradas em humanos (ALLAIS et al., 2008; MEIRELES & PINTO, 2008; SILVEIRA 37 et al., 2008) e as várias técnicas para reparo das comunicações encontradas na literatura (WATZAK et al., 2005; HUGENTOBLER et al., 2006; KIRSCHENER et al., 2006; SCALA et al., 2007; ALLAIS et al., 2008; MEIRELLES & PINTO, 2008), a maioria é de difícil transposição para os animais. Kirschener et al. (2006) utilizaram derme humana acelular comercial (AlloDerm®) para oclusão de FONs, em três suínos (induzidas) e em nove humanos (naturais), obtiveram cicatrização, contudo em quatro semanas e houve ainda em dois pacientes humanos, deiscência de sutura e exposição do enxerto (levando-se em conta tratarem- se de fístulas naturais). Isto não ocorreu com o flape simples com FPA e o tempo de cicatrização foi inferior, salientando-se ainda o custo elevado do produto comparado ao do fator protéico angiogênico da seiva da seringueira. Também em humanos, a técnica de retalho mucoso geniano (Meirelles & Neves- Pinto, 2008) para tratamento de fístulas clínicas em 25 pacientes reparou o defeito, mas somente aos 30 dias. Porém, a grande dificuldade encontra-se na transposição da técnica aos animais, sendo as principais recomendações pós-cirúrgicas: evitar tocar o local da cirurgia com a língua, não escovar, não soprar, não exercitar a bochecha, etc., para não lesar a cirurgia, problemas estes que não afetaram o emprego de flape simples com FPA, mesmo sendo utilizado em animais. No uso de flapes rotacionais palatinos, descrito por Silveira et al. (2008), obtiveram como vantagem a boa vascularização do pedículo e ausência de tensão na linha de sutura, todavia depara-se com o mesmo problema: a não cooperação dos animais que resulta no insucesso do procedimento. A ausência de significância na análise estatística, desta pesquisa, pode ter sido pelo baixo número de animais estudados que se deveu a dificuldade atual para utilização de organismos vivos, frente ao exercício mais atuante das Comissões de Ética Animal. Referente ao aspecto macroscópico, sinais inflamatórios, tem-se como um dos mais pronunciados. Estão exacerbados e muito superiores aos demais grupos nas comunicações do grupo ESP1 no terceiro dia de observação. Acredita-se que esta reação inflamatória superior acelerou e potencializou os processos de cicatrização, que 38 são superiores aos demais grupos. Na fase inflamatória do processo de cicatrização temos a formação da matriz provisória que funciona como base de sustentação para a cicatrização, assim como reserva de fatores de crescimento (WERNER & GROSE, 2003); consequentemente esta reação aumentada garantiria melhor início de processo reparatório. Destaca-se também que mesmo havendo sinal inflamatório superior no terceiro dia de observação do grupo ESP1 o mesmo encontra-se inferior aos demais grupos no vigésimo primeiro dia, característica benéfica a longo prazo. No aspecto clínico cicatrização tem-se o seu início primeiramente no grupo ES, sendo este superior aos demais até o sétimo dia. Contudo ao décimo quarto dia nota-se o grupo ESP1 com escores maiores e que são mantidos até o vigésimo primeiro dia de observação. Provavelmente o melhor aspecto cicatricial das comunicações do grupo ESP1, a partir do décimo quarto dia de observação, seja devido ao poder neoangiogênico e de aumento da permeabilidade vascular do fator proteico (MENDONÇA, 2004). Na fase proliferativa da cicatrização o aumento da permeabilidade vascular permitiria o maior afluxo de água, macromoléculas, proteínas da coagulação e deposição de fibrina extravascular, necessárias para o processo reparatório (DVORAK, 2002) associado ao aumento de vasos que garantiria um melhor aporte nutricional e abastecimento de oxigênio aos tecidos neoformados (LI et al. 2003). A perda de pontos também mostrou diferencial entre os grupos. Nas suturas realizadas nas comunicações do grupo ESP1 houve perda mínima dos pontos com escores muito baixos, já nos grupos ES e S esta ocorreu com valores um pouco superiores, mas ainda assim pequenos. Crê-se que a menor perda de pontos no grupo ESP1, seja justificada pela maior neovascularização e melhor cicatrização, pela presença do fator proteico angiogênico, que conferiu boa formação tecidual, levando a melhor ancoragem dos pontos na ferida. Ao contrário da análise dos sinais inflamatórios, cicatrização e perda de pontos, a descontinuidade da linha de cicatrização teve pouco destaque. A mesma ocorreu apenas nos grupos ESP1 e ES com escores ínfimos no terceiro dia, aumentando em pouco o valor no sétimo e desaparecendo no décimo quarto. Portanto foi um aspecto de pouca valia. 39 Já na osteoproliferação observamos grande relevância na análise das imagens radiográficas obtidas aos vinte e um dias. Nota-se nitidamente, comparando-se a imagem radiográfica do primeiro dia, crescimento ósseo superior do grupo ESP1 frente ao ES e principalmente ao S, que apresentou pequena expressão nesse aspecto. O crescimento ósseo obtido foi o mesmo observado em experimento com a BML feito por Balabanian et al. (2005) e presumivelmente foi o que garantiu maior sustentação para o reparo, melhorando a cicatrização. 40 6. CONCLUSÕES Com base nos resultados obtidos neste estudo pode-se concluir que: � A utilização do fator proteico angiogênico exacerba o processo inflamatório nos primeiros dias de pós-cirúrgico, o que pode auxiliar no processo de reparação tecidual; � Encontra-se melhor aspecto cicatricial nas comunicações tratadas com FAP a partir dos 14 dias do processo; � Tem-se menor perda de pontos comparada, garantindo menor chance de deiscência de sutura; � Ocorre maior preenchimento ósseo dos alvéolos tratados com FAP, assegurando maior sustentação ao flape e melhor fechamento da fístula; � O flape simples associado ao fator proteico angiogênico mostrou ser método eficiente, de simples execução e baixo custo no reparo das fístulas oro-nasais em cães. 41 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALLAIS, M.; MAURETTE, P. E.; CORTEZ, A. L. V.; LAUREANO FILHO, J. R.; MAZZONETTO, R. Retalho de corpo adiposo bucal no fechamento de comunicação buco-sinusal. 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