Pedro Carlos Lucas de Oliveira ESTUDO COMPARATIVO DO VENENO BOTRÓPICO (Bothrops jararaca) NATIVO E IRRADIADO COM 60Co EM CAPRINOS. ASPECTOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS. Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu para obtenção do título de Doutor em Clínica Veterinária. ORIENTADORA: Profa. Ass. Dra. Michiko Sakate BOTUCATU 2003 Pedro Carlos Lucas de Oliveira ESTUDO COMPARATIVO DO VENENO BOTRÓPICO (Bothrops jararaca) NATIVO E IRRADIADO COM 60Co EM CAPRINOS. ASPECTOS CLÍNICOS E LABORATORIAIS. Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu para obtenção do título de Doutor em Clínica Veterinária. ORIENTADORA: Profa. Ass. Dra. Michiko Sakate BOTUCATU 2003 À Prof.ª Ass. Dra. Michiko Sakate Cada um que passa em nossa vida, passa sozinho, mas não vai sozinho e não nos deixa sozinhos, leva um pouco de nós e deixa um pouco de si. AGRADECIMENTOS A realização deste trabalho foi possível perante a colaboração de inúmeras pessoas. A todos agradeço e, em especial: ao Corpo Docente do Curso de Pós-Graduação em Clínica Veterinária, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu, UNESP, pelo conhecimento adquirido em suas disciplinas; à Universidade de Uberaba, UNIUBE, ao Hospital Veterinário de Uberaba, HVU, e à Associação Brasileira de Criadores de Zebu, ABCZ, pelo incentivo à minha pós-graduação; aos professores, funcionários e alunos do Hospital Veterinário de Uberaba, pelo apoio profissional na realização deste trabalho; ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP), da UNESP de Botucatu, pelo apoio técnico na obtenção e preparo do veneno de serpente Bothrops jararaca utilizado na intoxicação experimental dos caprinos; ao Instituto de Pesquisas em Energéticas e Nucleares (IPEN), da Universidade de São Paulo (USP), principalmente representado na pessoa da Dra. Nanci Nascimento, pela irradiação do veneno de serpente Bothrops jararaca em bomba de cobalto-60; aos alunos Ricardo de Assis Madruga e Newton Pimentel de Ulhôa Barbosa, do Curso de Medicina Veterinária da UNIUBE, pela inestimável colaboração na realização do experimento; à Profa. Dra. Joely Ferreira Figueiredo Bittar, à Médica Veterinária Marli Kanayama e ao técnico de laboratório Luciano Bernardino de Freitas pelo empenho na realização dos exames laboratoriais contidos neste trabalho. SUMÁRIO LISTA DE TABELAS LISTA DE FIGURAS LISTA DE QUADROS RESUMO ABSTRACT 1- INTRODUÇÃO 01 2- REVISÃO DA LITERATURA 05 3- OBJETIVOS 15 4- MATERIAL E MÉTODO 17 4.1 Animais experimentais 17 4.2 Manutenção dos animais 17 4.3 Obtenção do veneno 18 4.4 Irradiação do veneno 18 4.5 Intoxicação dos animais 18 4.6 Momentos das coletas 19 4.7 Exames físicos dos animais 19 4.8 Exames laboratoriais 20 4.9 Análise dos resultados 22 4.10 Procedimento estatístico 22 5- RESULTADOS 23 5.1. TEMPERATURA RETAL, FREQUÊNCIA CARDÍACA, PULSO E FREQUÊNCIA RESPIRATÓRIA 23 5.2. EXAME CLÍNICO 23 5.3. ALTERAÇÕES LOCAIS 23 5.3.1. Presença de solução de continuidade, hemorragia e necrose 23 5.3.2. Presença de edema 24 5.3.3. Presença de calor 26 5.3.4. Presença de dor 28 5.3.5. Presença de rubor 30 5.4. ERITROGRAMA 33 5.4.1. Contagem de hemácias 33 5.4.2. Volume globular 35 5.4.3. Nível sérico de hemoglobina 37 5.5. LEUCOGRAMA 40 5.5.1. Contagem de leucócitos 40 5.5.2. Contagem de metamielócitos e basófilos 42 5.5.3. Contagem de bastonetes 42 5.5.4. Contagem de neutrófilos 44 5.5.5. Contagem de linfócitos 46 5.5.6. Contagem de monócitos 48 5.5.7. Contagem de eosinófilos 50 5.6. PERFIL DE HEMOSTASIA 53 5.6.1. Tempo de coagulação 53 5.6.2. Contagem de plaquetas 55 5.7. PARÂMETROS DE BIOQUÍMICA SÉRICA 58 5.7.1. Uréia 58 5.7.2. Creatinina 60 5.7.3. Creatina quinase (CK) 62 5.7.4. Aspartato aminotransferase (AST) 64 5.7.5. Alanino aminotransferase (ALT) 66 5.8. NÍVEIS SÉRICOS DE IMUNOGLOBULINAS TOTAIS 69 6- DISCUSSÃO 71 7- CONCLUSÕES 81 REFERÊNCIAS 84 APÊNDICE 97 LISTA DE TABELAS Tabela 1. Protocolo de intoxicação dos animais do grupo inoculado com veneno nativo (GIVN) e grupo inoculado com veneno irradiado (GIVI). Tabela 2. Desenvolvimento de edema inflamatório local (notas de 0 a 4, sendo 0 a ausência de edema e 4 o edema mais intenso observado) nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes da inoculação dos venenos botrópicos e de um a oito dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 3. Desenvolvimento de calor inflamatório local (notas de 0 a 4, sendo 0 a ausência de calor e 4 o calor mais intenso observado) nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes da inoculação dos venenos botrópicos, e de um a oito dias após esta inoculação, incluindo média obtida a partir dos dados. Tabela 4. Desenvolvimento de dor local (notas de 0 a 4, sendo 0 a ausência de dor e 4 a dor mais intensa observada) nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes da inoculação dos venenos botrópicos, e de um a nove dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 5. Desenvolvimento de rubor inflamatório local (notas de 0 a 4, sendo 0 a ausência de rubor e 4 o rubor mais intenso observado) nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes da inoculação dos venenos botrópicos e de um a nove dias após esta inoculação, incluindo média obtida a partir dos dados. Tabela 6. Contagens de hemácias (x106) nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 7. Valores de volume globular (%) mensurados nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 8. Níveis séricos de hemoglobina (g/dL) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 9. Contagens de leucócitos (células/mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 10. Contagens de bastonetes (células/mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 11. Contagens de neutrófilos (células /mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 12. Contagens de linfócitos (células /mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 13. Contagens de monócitos (células /mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 14. Contagens de eosinófilos (células /mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 15. Tempos de coagulação, em minutos, observados em sangue total, dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 16. Contagens de plaquetas (unidades /mm3) executadas em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos, um, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 17. Níveis séricos de uréia (mg/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 18. Níveis séricos de creatinina (mg/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 19. Níveis séricos de creatina quinase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 20. Níveis séricos de aspartato aminotransferase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 21. Níveis séricos de alanino aminotransferase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. Tabela 22. Valores séricos de imunoglobulinas totais (g/dL) obtidos dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados. LISTA DE FIGURAS Figura 1. Médias, dos valores atribuídos à intensidade dos edemas locais desenvolvidos pelos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 2. Médias, dos valores atribuídos à intensidade do calor local desenvolvido pelos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 3. Médias, dos valores atribuídos à intensidade da dor local desenvolvida pelos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 4. Médias, dos valores atribuídos à intensidade do rubor local desenvolvido pelos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 5. Médias, dos valores de contagem de hemácias (x106) nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 6. Médias, dos valores de volume globular (%) nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 7. Médias, dos valores de hemoglobina (g/dL) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 8. Médias, dos valores de contagem de leucócitos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 9. Médias, dos valores de contagem de bastonetes (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 10. Médias, dos valores de contagem de neutrófilos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 11. Médias, dos valores de contagem de linfócitos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 12. Médias, dos valores de contagem de monócitos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 13. Médias, dos valores de contagem de eosinófilos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 14. Médias, dos valores de tempo de coagulação, em minutos, do sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 15. Médias, dos valores de contagem de plaquetas (unidades/mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 16. Médias, dos valores séricos de uréia (mg/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 17. Médias, dos valores séricos de creatinina (mg/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 18. Médias, dos valores séricos de creatina quinase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 19. Médias, dos valores séricos de aspartato aminotransferase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 20. Médias, dos valores séricos de alanino aminotransferase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Figura 21. Médias, dos valores de imunoglobulinas séricas totais (g/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. LISTA DE QUADROS Quadro 1. Gráficos, representativos das evoluções do edema, calor, dor e rubor locais nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Quadro 2. Gráficos, representativos das evoluções das contagem de hemácias (células x 106/mm3), mensurações de volume globular (%) e hemoglobina (g/dL) em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Quadro 3. Gráficos, representativos da evolução das contagens totais e diferenciais de leucócitos (células/mm3) em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Quadro 4. Gráficos, representativos das evoluções das contagem de plaquetas (unidades/mm3) e mensurações do tempo de coagulação (minutos) em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Quadro 5. Gráficos, representativos da evolução de parâmetros bioquímicos séricos dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. OLIVEIRA, P.C.L. Estudo comparativo do veneno botrópico (Bothrops jararaca) nativo e irradiado com 60Co em caprinos. Aspectos clínicos e laboratoriais Botucatu, 2003. 100p. Tese (Doutorado em Clínica Veterinária)-Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. RESUMO Sabe-se que o veneno das serpentes do gênero Bothrops possui ação proteolítica, coagulante, hemorrágica e nefrotóxica, gerando edema, necrose, hemorragia, intensa dor no local da picada, hemorragias internas, hipotensão, insuficiência renal, choque, aumentos na contagem total de leucócitos, segmentados e bastonetes, no hematócrito, na hemoglobina e no nível sérico de creatinina. Vários adjuvantes foram adicionados aos venenos, empregados na sensibilização dos animais produtores do soro, visando aumentar o estímulo antigênico e reduzir os efeitos patológicos da intoxicação. A radiação gama com 60Co vem sendo utilizada como agente atenuante da propriedade tóxica dos venenos. Este trabalho teve por objetivo geral estudar, comparativamente, os aspectos clínicos e laboratoriais de caprinos inoculados com veneno botrópico (Bothrops jararaca) nativo e irradiado com 60Co. Assim, 12 caprinos foram divididos em dois grupos de seis animais, GIVN, inoculados com 0,5 mg/kg de veneno nativo, e GIVI, inoculados com 0,5 mg/kg de veneno irradiado (GIVI). Amostras de sangue foram coletadas imediatamente antes da inoculação dos venenos e um, dois, sete e trinta dias após. As lesões locais foram avaliadas diariamente quanto à presença ou não de edema, calor, dor, rubor, solução de continuidade, hemorragia e necrose. Foram procedidos os seguintes exames: hemograma, bioquímicos de uréia, creatinina, creatino quinase (CK), aspartato aminotransferase (AST), alanino aminotransferase (ALT), tempo de coagulação, contagem de plaquetas e mensuração de imunoglobulinas séricas totais. Perante às condições deste experimento, pode-se concluir que o veneno irradiado é menos agressivo e mais imunogênico, demonstrado por sinais locais mais brandos; menores aumentos dos tempos de coagulação, níveis séricos de uréia e enzimas musculares, quedas menos intensas nos valores de hemoglobina, contagem de hemáceas e volume globular; contagens globais de leucócitos mais intensas e mais persistentes; contagens diferenciais de leucócitos maiores para bastonetes e linfócitos e menores para neutrófilos e eosinófilos. O veneno, na dose de 0,5 mg/kg, não interfere nos níveis séricos de creatinina e na contagem de monócitos e plaquetas, porém causa agregação plaquetária. A inoculação única em caprinos, sem sensibilização prévia, com veneno de serpente Bothrops jararaca nativo ou irradiado em bomba de 60Co, não gera alterações nos níveis séricos de imunoglobulinas totais. OLIVEIRA, P.C.L. Comparative study of the bothropic venom (Bothrops jararaca) native and irradiated with 60Co on caprines. Clinical and laboratories aspects. Botucatu, 2003. 100p. Tese (Doutorado em Clínica Veterinária)- Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”. ABSTRACT It is known that the snake venoms of the Bothrops genus are proteolytic, coagulant, hemorrhagic and nephrotoxic, causing edema, necrosis, hemorrhage and intense pain at the place of the bitten, internal hemorrhages, hipotension, renal failure, chock, increases on the total leukocytes count, neutrophils and band neutrophils count, on the globular volume, hemoglobin concentration and creatinine serum level. Many adjuvants have been added to the venom, used in the sensibilization of the antisera producers animals, in other to increase the antigenic induction and reducing the intoxication pathologic effects. The gamma radiation from 60Co has been used as an attenuating agent of the venoms toxic proprieties. This work had the main objective to study, comparatively, the clinical and laboratories aspects on caprines inoculated with the bothropic venom (Bothrops jararaca), native and irradiated from 60Co source. Thus, 12 caprines were divided into two groups of six animals, GIVN, inoculated with 0,5 mg/kg of native venom, and GIVI, inoculated with 0,5 mg/kg of irradiated venom (GIVI). Blood samples were collected immediately before the venoms inoculation and one, two, seven and thirty days after. The local lesions were daily evaluated for the presence or not of edema, hotness, pain, redness, continuity solution, hemorrhage and necrosis. The following exams were realized: hemogram, biochemical of urea, creatinine, creatine kinase (CK), aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), time of coagulation, platelets count and mensuration of total serum immunoglobulin. In the conditions of this experiment, it can be conclude that the irradiated venom is less aggressive and more immunogenic, showed by moderate local signs; smaller increases on the coagulation time and on urea and muscular enzymes serum levels, less intense reduces in the values of hemoglobin, erythrocytes count and globular volume; more intense and persistent leukocytes global count; leukocytes differential count higher for band neutrophils and lymphocytes and lower for neutrophils end eosinophils. The venom, at the dose of 0,5 mg/kg, does not interfere on creatinine serum levels and monocytes and platelets count, but leads to platelets aggregation. The single inoculation in caprines, without previous sensibilization, with the Bothrops jararaca native or irradiated from 60Co venom, does not lead to alterations in the total immunoglobulin serum levels. 1 1- INTRODUÇÃO As serpentes são répteis que evoluíram dos lagartos há mais de 130 milhões de anos. Venenosas ou não, sempre exerceram um secreto fascínio nos homens. Para alguns povos orientais, elas são representantes de deuses, para outros personificam o mal. No símbolo da Medicina Veterinária, a serpente representa a enfermidade, e o bastão representa o remédio contra a doença (Oliveira, 1999). Estes animais devem ser respeitados e considerados importantes no ecossistema da Terra. A completa eliminação das serpentes traria grave desequilíbrio à natureza. Apesar de não serem bem vistas pelos homens, principalmente os de cultura ocidental, as serpentes prestam grande contribuição à humanidade, pois participam do controle de pequenos roedores que, por se reproduzirem muito rapidamente, são devoradores das safras de grãos e transmissores de doenças. Portanto, as serpentes não devem ser indistintamente perseguidas e eliminadas (Oliveira, 1999). As serpentes venenosas possuem distribuição geográfica mundial (Belluomini, 1984), sendo que no Brasil ocorrem quatro gêneros: Crotalus, Bothrops, Micrurus e Lachesis (Rosenfeld et al., 1970). O segundo gênero é o mais importante, pois concentra o maior número de espécies (em número de trinta), sendo que as seguintes são as principais: B. jararaca, B. jararacussu, B. alternatus, B. moojeni, B. neuwiedi e B. atrox. Além da variedade e número de espécies do gênero Bothrops, o comportamento mais agressivo destas serpentes faz com que os acidentes sejam mais freqüentes e, portanto, de grande 2 importância clínica (Rosenfeld et al., 1970; Oliveira, 1999). O trabalhador rural ainda é a vítima mais freqüente dos acidentes ofídicos, e os acidentes com serpentes do gênero Bothrops ainda são os mais comuns (Bochner, Struchiner, 2003). Dentre as espécies do gênero Bothrops, a B. jararaca é a mais comum, por exemplo, de 817.688 serpentes recebidas pelo Instituto Butantan até dezembro de 1977, 419.597 correspondiam a esta espécie (Belluomini, 1984). Como se pode observar, a intoxicação por veneno de serpente é comum e de grande importância médica e médica veterinária no Brasil, sobretudo, aqueles acidentes causados por serpentes da espécie B. jararaca. Ocorrem cerca de 20 mil acidentes ofídicos por ano no Brasil, notificados ao Ministério da Saúde, incorrendo em cerca de 100 óbitos por ano (Barraviera, 1993; Oliveira, 1999). Segundo à dentição, as serpentes podem ser classificadas em quatro grupos: áglifas, opistóglifas, proteróglifas e solenóglifas. A B. jararaca pertence ao grupo das solenóglifas, cuja dentição se caracteriza por dentes bem desenvolvidos, móveis, situados anteriormente de cada lado do maxilar superior, grandes, pontiagudos e com um canal central que lembra uma agulha de injeção em forma de bisel (Belluomini, 1984; Oliveira, 1999). O veneno das serpentes do gênero Bothrops possui diversas características que ainda não estão totalmente elucidadas, porém, sabe-se que este veneno possui ação coagulante, proteolítica e hemorrágica (Rosenfeld et al., 1970; Oliveira, 1999). Em 1897, Vital Brazil iniciou o desenvolvimento da produção do soro antiofídico contra o veneno de serpentes brasileiras, constituindo o único 3 tratamento que neutraliza a peçonha destes animais, desde então, tem salvado milhares de vidas (Oliveira, 1999). Ao longo da história da produção dos soros antiofídicos, alguns animais domésticos como eqüinos, bovinos, ovinos e caprinos foram utilizados como organismos produtores do anticorpo. Porém, em função de seu grande volume sangüíneo e de sua imunocompetência, os eqüinos foram escolhidos como os melhores soroprodutores (Almeida et al., 1998). Vários adjuvantes foram também adicionados ao veneno empregado na sensibilização dos animais produtores do soro, visando aumentar o estímulo antigênico e reduzir os efeitos deletérios da intoxicação (Li, Ownby, 1992). A radiação gama com 60Co vem sendo utilizada como agente atenuante da propriedade tóxica dos venenos (Nascimento, 1996). A irradiação de materiais biológicos em fonte de 60Co é a mais utilizada por não aquecer o produto, que é sensível às altas temperaturas (Guidolin et al., 1988). A utilização de animais na produção de soro antiofídico é indispensável até os dias de hoje, entretanto, tais animais sofrem danos orgânicos decorrentes das ações tóxicas dos venenos (Angulo et al., 1997). Portanto, há necessidade de pesquisar mecanismos que reduzam esses danos e que mantenham a resposta imune adequada à soroprodução. A irradiação de venenos em fonte de 60Co talvez se mostre um mecanismo eficiente para reduzir os efeitos tóxicos dos venenos e, ao mesmo tempo, manter ou até incrementar a resposta imune no animal inoculado para fins de 4 soroprodução, pois a energia eletromagnética deste elemento não aquece o produto da irradiação (Guidolin et al., 1988). Apenas três instituições governamentais brasileiras dedicam-se à produção de antiveneno para utilização nestes tipos de acidentes, que são: o Instituto Butantan em São Paulo, o Instituto Ezequiel Dias em Minas Gerais e o Instituto Vital Brazil no Rio de Janeiro (Oliveira, 1999) e, também algumas empresas privadas se dedicam a esta produção. Para viabilizar essas produções, esses institutos ou empresas necessitam manter grandes fazendas para criação de centenas de cavalos soroprodutores. Esses animais são de manutenção onerosa em função de seu porte e mesmo de sua natureza física mais exigente (Torres, Jardim, 1987). Já os caprinos são animais de exigências modestas, sobrevivendo em ambientes inóspitos, como a região de clima semi-árido do Nordeste brasileiro (Pinheiro Júnior, 1973). Portanto, os caprinos podem ser criados a custos muito baixos e em áreas consideradas impróprias para a lavoura ou mesmo para a pecuária bovina (Pinheiro Júnior, 1973). Outros inconvenientes do uso de cavalos para soroprodução são: resposta imunomediada muito forte com formação de abscessos no local da inoculação (Sjostrom, 1994), e grande sensibilidade dos humanos às proteínas dos cavalos, podendo causar reação anafilática tipo I (Russell et al., 1970). Desta forma, julga- se importante verificar a viabilidade imunológica dos caprinos como animais produtores de soro antibotrópico, utilizando para isto, veneno nativo ou irradiado. 5 2- REVISÃO DA LITERATURA No Brasil a principal serpente venenosa causadora de acidentes é a B. jararaca, seguida pelas Crotalus durissus terrificus, B. jararacussu, B. alternatus, B. neuwiedi e B. atrox (Rosenfeld et al., 1970). As serpentes B. jararaca estão presentes em quase todo território brasileiro, vivendo nos mais diferentes locais, como em cima de árvores, enterradas, entocadas, nas margens dos rios e em baixadas, cerrados, matas e capoeiras (Oliveira, 1999), sendo freqüentemente encontradas perto das habitações humanas (Bürcherl, 1980; Belluomini, 1984). Entretanto, Sazima (1983) relatou que as serpentes B. jararaca são raramente encontradas totalmente expostas aos raios solares, sendo mais comum encontrá-las em locais parcialmente sombreados. Este autor também relatou que as serpentes desta espécie são mais ativas ao crepúsculo e à noite, em temperaturas entre 19o a 31o C e umidade relativa entre 68 a 100%. As táticas defensivas das jararacas podem ser escalonadas como imobilidade, fuga, enrodilhamento e bote (Sazima, 1983). A maioria dos acidentes ofídicos no Brasil é causada por serpentes do gênero Bothrops, com 95,03 % de prevalência sobre aqueles causados por outros gêneros de serpentes (Ribeiro, 1991). De 160 serpentes classificadas por Ribeiro (1991), 142 pertenciam à espécie B. jararaca. Barraviera et al. (1989) relataram que 80% dos acidentes ofídicos ocorridos na região de Botucatu são causados por serpentes do gênero Bothrops. 6 O trabalhador rural ainda é a vítima mais freqüente dos acidentes ofídicos, e os acidentes com serpentes do gênero Bothrops ainda são os mais comuns (Bochner, Struchiner, 2003). Além do homem, a maioria dos animais domésticos também é sensível ao veneno do gênero Bothrops, sendo que eqüinos, bovinos e ovinos são os mais sensíveis, seguidos pelos caprinos, caninos, coelhos, suínos, cobaias, camundongos, felinos, hamsters e o rato, sendo o último o menos sensível de todos (Araújo, Belluomini, 1962). O veneno das serpentes é constituído por uma complexa mistura de enzimas, proteínas e peptídeos, com ação proteolítica, coagulante, hemorrágica e nefrotóxica (Russell, 1983; Markland, 1998; Oliveira, 1999) e, pelo menos, 26 enzimas já foram caracterizadas. Dez das enzimas identificadas são comuns às serpentes de famílias distintas, estando presentes em diferentes concentrações em cada família (Russell, 1983). Para as serpentes o veneno possui função digestiva, por meio de suas propriedades proteolíticas (Rosenfeld et al., 1970). A ação proteolítica baseia-se nas enzimas contidas no veneno botrópico, que provocam a decomposição de proteínas, destruindo o tecido e causando grave necrose no local da picada. A enzima mais conhecida é a fosfolipase A2, capaz de causar dano à membrana plasmática da célula muscular, destruir organelas intracelulares, permitir aumento no afluxo de íons Cálcio e incrementar o efluxo de creatinina e creatina quinase (Barraviera, 1993; Oliveira, 1999). O aumento da concentração de Cálcio intracelular pode causar liberação de enzimas lisossomais e necrose tecidual 7 (Hudelson, Hudelson, 1995). Gutierrez et al. (1984) relataram que, associada às ações miotóxicas da fosfolipase, a isquemia celular decorrente de hemorragias também participa na formação da necrose tecidual. Outras substâncias relacionadas à ação proteolítica do veneno botrópico são os fatores hemorrágicos HF1, HF2 e HF3 (Assakura et al., 1986) e a botropasina (Queiroz et al., 1985). A ação coagulante está intimamente relacionada à ação hemorrágica da peçonha botrópica, pois a coagulação intravascular decorrente das ações do veneno esgota o sistema de coagulação sangüínea, com manifestações na forma de hemorragias (Rosenfeld et al., 1970; Oliveira, 1999). Do ponto de vista bioquímico, o veneno botrópico age interferindo na hemostasia (Zingali et al., 1988). Esta ação ocorre pelo estímulo à coagulação, pela transformação do fibrinogênio em fibrina, derivada da ativação da protrombina e do fator X da cascata de coagulação (Rosenfeld et al., 1959; Nahas et al., 1979; Marlas et al., 1983; Kamiguti, Cardoso, 1989; Barraviera, Pereira, 1994; Oliveira, 1999). Sano- Martins et al. (1995) relataram que a coagulopatia observada em cães é semelhante àquela identificada em seres humanos. Porém, além da transformação do fibrinogênio em fibrina, derivada da ativação da protrombina e do fator X da cascata de coagulação, também são ativados os fatores II, V e VIII. O desenvolvimento de moderada trombocitopenia colabora na coagulopatia nesse tipo de intoxicação (Sano-Martins et al., 1995). As substâncias responsáveis pela ação coagulante do veneno botrópico são botrojararacina, capaz de formar um complexo não covalente com a trombina (Zingali et al., 1993; Castro et al., 1999); botrombina, capaz de ativar o fator VIII 8 da cascata de coagulação (Nishida et al., 1994); e jararagina C, capaz de induzir a agregação plaquetária (Usami et al., 1994). Também a botrocetina participa em atividade agregante plaquetária, porém este fato só foi comprovado in vitro (Zingali et al., 1990), entretanto, na presença do fator de von Willebrand, a botrocetina age, definitivamente, como agregante plaquetário por mecanismo desconhecido (Andrews et al., 1989; Usami et al., 1993). Podem ocorrer hemorragias na ausência de coagulopatia, o que é atribuído à ação vasculotóxica do veneno botrópico, com destruição da membrana basal do endotélio vascular e subseqüente ruptura capilar (Barraviera, Pereira, 1994). Outros fatores hemorrágicos também têm sido isolados do veneno botrópico (Mandelbaum et al., 1982; Moura da Silva et al., 1990; Robeva et al., 1991; Paine et al., 1992). Muitos destes fatores hemorrágicos possuem atividade enzimática sobre o fibrinogênio prejudicando a formação de fibrina (Markland, 1991). Assim, enzimas como a jararafibrase I e jararafibrase II, com atividade alfa-fibrinogenase, foram descritas por Tanigawa et al. (1993), bem como a jararafibrase III e IV por Maruyama et al. (1993). A ação nefrotóxica da peçonha botrópica é direta sobre os túbulos renais e endotélio vascular, levando à insuficiência renal aguda grave (Oliveira, 1999). A insuficiência renal causada por venenos de serpentes está primariamente relacionada a efeitos nefrotóxicos da mioglobinúria, hemoglobinúria, coagulação intravascular disseminada, nefropatia tóxica e choque hipovolêmico (Hudelson, Hudelson, 1995). A histopatologia de tecido renal de ratos, experimentalmente intoxicados com veneno de B. jararaca, revelou proliferação da matriz mesangial, 9 alterações dos túbulos caracterizadas por perda da borda em escova e vacuolização citoplasmática (Rezende et al., 1989). Outros autores, como Pinho, Burdmann (2001), Havt et al. (2001), Barbosa et al. (2002) e Boer-Lima et al. (2002), também relataram lesões renais agudas provocadas pelo veneno botrópico. Alterações locais e/ou sistêmicas são causadas pelo veneno botrópico quando inoculado em tecidos vivos (Rosenfeld et al., 1959; Rosenfeld et al., 1970; Rosenfeld, 1991; Ribeiro et al., 2001). Assim, a aplicação de 0,5 mg/kg de veneno nativo de serpente B. jararaca, por via intramuscular no músculo glúteo, é capaz de provocar os sinais clínicos da intoxicação, em bovinos, sem levar à morte (Araújo et al., 1963). As características da picada são variáveis, podendo ser desde de um arranhão até uma marca puntiforme única ou dupla, não havendo relação entre a distância interposta às duas marcas e as dimensões da serpente ou a quantidade de veneno inoculada (Rosenfeld et al., 1970). Os acidentes com serpentes podem apresentar diferentes graus de gravidade, os quais são determinados por alguns fatores como: espécie atacada, quantidade de veneno inoculada, número de picadas, tipo de tecido atingido, resposta individual da vítima, que geralmente depende de fatores como peso, idade, estado geral, local da picada (cabeça, tronco ou membros) e tempo decorrido entre o acidente e início do tratamento (Russell, 1983; Murtaugh, Kaplan, 1992). Os acidentes botrópicos incorrem em amputação de membros em 0,7% dos casos, e morte do indivíduo picado em 0,3% dos casos (Ribeiro, Jorge, 1997). 10 Clinicamente, os acidentes botrópicos caracterizam-se por edema, necrose, hemorragia e intensa dor no local da picada (Oliveira, 1999). Sinais sistêmicos podem manifestar-se na forma de hemorragias internas, hipotensão, insuficiência renal e choque, tudo decorrente das atividades proteolíticas e coagulantes do veneno (Murtaugh, Kaplan, 1992). Oliveira (1999) relatou ainda a presença de bolhas, que podem ser hemorrágicas, calor e rubor no local da picada, enfartamento ganglionar, equimose, vômitos, sudorese, hipotermia e hematúria. Embora Rosenfeld et al. (1970) tenham relatado que o veneno botrópico não era capaz de atingir o sistema nervoso e, portanto, não havia sinais de comprometimento deste sistema, Mosquera et al. (2003) relataram hemorragias intracranianas e infartos cerebrais em pacientes picados por serpentes do gênero Bothrops, e De Souza et al. (2002) relataram que o veneno de B. jararacussu poderia causar danos aos axônios no local de inoculação do veneno. É comum a contaminação bacteriana no local da picada com formação de abscessos, sendo que as bactérias mais freqüentemente encontradas são a Morganella morganii, Providencia rettigeri, Enterobacter sp, Escherichia coli, Streptococcus do grupo D e Bacterioides sp (Jorge et al., 1993). O envenenamento botrópico implica em alterações hematológicas, como a hemólise in vitro observada por Kelen et al. (1962). Observaram-se também aumentos na contagem total de leucócitos, na contagem de segmentados e bastonetes, bem como no hematócrito e na hemoglobina (Barraviera, 1993). Em cães, observaram-se leucocitose com neutrofilia, linfopenia, monocitose e trombocitopenia, sendo que o eritrograma não se apresentou 11 alterado (Sano-Martins et al., 1995). Os níveis séricos de creatina quinase elevam- se pela inoculação de veneno de B. jararacussu (Calil-Elias et al., 2002). A soroterapia específica é o único tratamento eficaz para a neutralização da peçonha ofídica, devendo-se esquecer todos os tratamentos preconizados pela "sabedoria" popular (Oliveira, 1999). Segundo Brazil (1918), Smirnow foi o primeiro a isolar a antitoxina do soro do cavalo, no ano de 1895, mostrando que a substância ativa se precipitava junto às globulinas, quando se tratava o soro até a saturação com sulfato de magnésio. A produção de soro consiste na formação de um "pool" de veneno, toxinas ou toxóides dos venenos que é injetado em cavalos. Assim, ocorre a hiperimunização do cavalo pelo estímulo do sistema imune deste animal, que produz anticorpos específicos contra o veneno daquela espécie de serpente. Quando o organismo do cavalo já produziu anticorpos suficientes para neutralizar o veneno, são feitas as sangrias (Guidolin et al., 1989; Oliveira, 1999). O plasma obtido do sangue retirado é submetido a uma variação não fisiológica de pH, temperatura e precipitação com sulfato de amônia para obtenção da fração que contém os anticorpos (Morais, 1994). Pesquisadores já trabalharam na busca de espécies alternativas para a soroprodução, como coelhos, cabras e ovinos (Russell, Lauritzen, 1966, Russell et al., 1970, Egen, 1994, Rawat, 1994, Dart, 1994 e Sjostrom, 1994). Para obtenção de maior resposta imune e menor dano ao organismo produtor de soro, adicionam-se ao veneno substâncias denominadas adjuvantes 12 que retardam a liberação do antígeno para o organismo formando um “depósito” (Guidolin et al, 1989). Geralmente, os adjuvantes utilizados são: alume, Freünd completo ou incompleto, lipopolissacarídeos de bactérias Gram negativas, hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, betonita, alginato de sódio, sulfato de berílio, emulsões oleosas. Os adjuvantes mais utilizados são os de Freünd completo e incompleto, que consistem na mistura de óleo mineral e agente emulsificante, o primeiro contendo ainda fragmentos de micobactérias que incrementam a resposta imune (Soerensen, 1990). A irradiação de amostras de venenos de serpentes, visando a soroprodução, deverá ser de grande valor no futuro, substituindo ou sendo somada aos adjuvantes já existentes (Souza-Filho, 1992). As radiações ionizantes afetam a estrutura das moléculas destruindo suas ligações químicas por ação direta ou indireta. A ação indireta consiste na produção de derivados da radiólise da água (radicais livres hidroxila, íon hidrogênio e elétron desidratado), e a ação direta é a excitação ou ionização do próprio alvo biológico, no caso as substâncias tóxicas do veneno (Costa, Rogero, 1988). A ação indireta só ocorre quando se irradia material em solução, enquanto a ação direta ocorre a seco e em solução. Assim, quando se irradia algum material em solução, os efeitos indiretos se unem aos diretos (Rogero, Nascimento, 1995). A radiação ionizante consiste na passagem de radiação eletromagnética, ou mesmo de um fóton, através de um material, causando projeção de um elétron de um átomo e resultando na criação de um par de íons, positivo e negativo (Rogero, Nascimento, 1997). Esta técnica vem sendo utilizada na desintoxicação de 13 venenos de serpentes indianas, associando redução da toxicidade da amostra de veneno e manutenção das propriedades imunológicas sem adição de qualquer substância adjuvante (Kankonkar, 1974). A radiação gama com 60Co vem sendo utilizada como agente atenuante da propriedade tóxica dos venenos por diversos autores (Salafranca, 1972, 1973; Kankonkar, 1974; Gaitonde, Baride, 1981; Murata, 1987; Murata, Rogero, 1988; Costa, Rogero, 1988; Guidolin et al., 1988; Hati, 1989; Murata, 1990; Rogero, Nascimento, 1995; Nascimento, 1996). A irradiação de materiais biológicos em fonte de 60Co é a mais utilizada por não aquecer o produto, que é sensível às altas temperaturas (Guidolin et al., 1988). A ação da radiação ionizante sobre as proteínas em solução aquosa é seletiva, enquanto, os grupos sulfidrila e carboxila são muito susceptíveis, e a ligação peptídica é radioestável. Portanto, pode-se controlar os danos à amostra irradiada alterando-se a dose de radiação segundo a concentração protéica do veneno, mantendo a imunogenicidade deste e reduzindo ou eliminando a toxicidade (Kankonkar, 1974). Souza et al. (2002) relataram que a irradiação de veneno de B. jararacussu, por 60Co, reduz a ação deste veneno nas junções neuromusculares de camundongos, reduzindo efeitos de miotoxicidade e paralisia muscular. Rogero, Nascimento (1995) relataram ausência de lesões cutâneas em animais inoculados com veneno irradiado de serpente da espécie B. jararaca. Segundo Bailey, Wilce (2001), os venenos podem se tornar importantes fontes de agentes terapêuticos. Assim, Correa et al. (2002) e Silva et al. (2002a e 2002b) relataram atividades antitumorais de componentes do veneno botrópico e 14 Gonçalves et al. (2002) descreveram alterações, induzidas pelo veneno de B. jararaca, no crescimento do Trypanosoma cruzi e da Leishmania spp. Fenard et al. (1999) observaram interferência da fosfolipase A2, obtida a partir de venenos de serpentes, na entrada de alguns vírus, como o HIV-1, em leucócitos. 15 3- OBJETIVOS Este trabalho teve por objetivo geral estudar, comparativamente, os aspectos clínicos e laboratoriais de caprinos inoculados com veneno botrópico (Bothrops jararaca) nativo e irradiado com 60Co. Objetivos específicos: 1. Verificar, comparativamente, os sinais clínicos em caprinos submetidos à inoculação de veneno botrópico (B. jararaca) nativo ou irradiado em fonte de 60Co. 2. Verificar, comparativamente, as alterações hematológicas em caprinos submetidos à inoculação de veneno botrópico (B. jararaca) nativo e irradiado em fonte de 60Co. 3. Verificar, comparativamente, o perfil da bioquímica sérica em caprinos submetidos à inoculação de veneno botrópico (B. jararaca) nativo e irradiado em fonte de 60Co, por mensurações séricas de uréia, creatinina, alanino aminotransferase, aspartato aminotransferase e creatina quinase. 4. Verificar, comparativamente, as alterações no tempo de coagulação sangüínea em caprinos submetidos à inoculação de veneno botrópico (B. jararaca) nativo e irradiado em fonte de 60Co. 5. Verificar, comparativamente, as alterações na contagem de trombócitos em caprinos submetidos à inoculação de veneno botrópico (B. jararaca) nativo e irradiado em fonte de 60Co. 16 6. Verificar, comparativamente, o nível sérico de imunoglobulinas totais de caprinos submetidos à inoculação de veneno botrópico (B. jararaca) nativo e irradiado em fonte de 60Co. 17 4- MATERIAL E MÉTODO 4.1 Animais experimentais: Para a realização do experimento, foram utilizados 12 caprinos provenientes da região de Miguelópolis, Estado de São Paulo, sendo dois machos e dez fêmeas, sem raça definida, com mais de um ano de idade, pesando entre 16 e 23 kg de peso vivo e em bom estado clínico geral, segundo parâmetros preconizados por Gay APUD Radostits et al. (2002). Quatro semanas antes do início do experimento, os animais receberam tratamento anti-helmíntico à base de ivermectina 1% (IVOMEC®)1, na dose única de 0,2 mg/kg de peso vivo (Roberson, 1992), e permaneceram isolados e em observação. Esses animais não possuíam histórico de qualquer tipo de vacinação e assim permaneceram. 4.2 Manutenção dos animais: Os animais foram mantidos em baias coletivas (seis animais por baia) cobertas pertencentes ao Hospital Veterinário de Uberaba, em Uberaba, Estado de Minas Gerais, com área de 16 m2, piso de cimento recoberto com cama de maravalha, trocada diariamente, e parede de alvenaria com pintura em tinta látex, iluminada naturalmente e por eletricidade, apenas no período noturno, sem solário, com água encanada ad libitum, fornecida em bebedouro de alvenaria, com reabastecimento por sistema de bóia, e alimentados com capim elefante triturado à vontade, proveniente de capineira da Fazenda das Faculdades Associadas de 1- IVOMEC® (50 mL) - Merck-Sharp-Dohm 18 Uberaba (FAZU), e cerca de 200g de ração concentrada própria para essa espécie animal, por animal por dia, (CAPRINOTECH®)2. 4.3 Obtenção do veneno: O veneno (200 mg) foi colhido de serpentes da espécie B. jararaca pertencentes ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP), da Universidade Estadual Paulista (UNESP) de Botucatu. Coube ao CEVAP a colheita e a liofilização do veneno. Metade do veneno colhido (100 mg) foi conservado e outra metade foi utilizada no processo de irradiação. 4.4 Irradiação do veneno: Metade da dose total do veneno foi diluída em solução salina (NaCl 150 mM, pH 3,0) e submetida à irradiação em fonte de 60Co (2000 Gy com taxa de dose de 5,7 KGy/hora) e conservada sob temperatura de resfriamento, segundo Rogero, Nascimento (1995). Este procedimento coube ao Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares (IPEN). 4.5 Intoxicação dos animais: Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos, denominados grupo inoculado com veneno nativo (GIVN) e grupo inoculado com veneno irradiado (GIVI) e submetidos aos protocolos experimentais que constam na tabela 1. 2- CAPRINOTECH® (25kg) – Purina 19 Tabela 1. Protocolo de intoxicação dos animais do grupo inoculado com veneno nativo (GIVN) e grupo inoculado com veneno irradiado (GIVI) GRUPOS PROTOCOLO DE INTOXICAÇÃO GIVN (n=6) Aplicação de 0,5 mg/kg (Araújo et al., 1963) de veneno nativo de serpente B. jararaca diluído a 2 mg/mL de solução fisiológica, por via intramuscular no músculo semitendinoso. GIVI (n=6) Aplicação de 0,5 mg/kg (Araújo et al., 1963) de veneno de serpente B. jararaca, irradiado em fonte de 60Co, diluído a 2 mg/mL de solução fisiológica, por via intramuscular no músculo semitendinoso. 4.6 Momentos das coletas: Amostras de sangue foram coletadas, por punção venopunção da jugular, em EDTA (sal de potássio do ácido etilenodiamino tetra-acético) para realização de hemograma e sem anticoagulante para as mensurações séricas, imediatamente antes da inoculação dos venenos e 24 horas, 48 horas, sete dias e 30 dias após a inoculação experimental. 4.7 Exames físicos dos animais: Os animais foram examinados, imediatamente antes e diariamente após a inoculação dos venenos, segundo protocolo recomendado por Gay APUD Radostits et al. (2002). As lesões, nos locais das aplicações dos venenos, foram 20 avaliadas enquanto persistiram, quanto à presença ou não de edema, rubor, solução de continuidade, hemorragia e necrose, por inspeção direta, e calor e dor, por palpação. Para se avaliar a intensidade dessas alterações foram atribuídas notas de zero a quatro, sendo zero a ausência de lesão e quatro a lesão mais intensa. 4.8 Exames laboratoriais: Foram realizados os seguintes exames: • hemograma, em contador CELM CC530®3 para contagem de hemácias, mensuração da hemoglobina sérica e contagem total de leucócitos; microhematócrito, em centrífuga CENTRIMICRO®4 a 11.000 rotações por minuto durante cinco minutos; contagem diferencial de leucócitos, por contagem de 100 células em lâmina corada por Panótico rápido (Jain, 1993). 3- CELM CC530® - CELM 4- CENTRIMICRO® - FANEN 21 • bioquímicos séricos de uréia, por método enzimático ultravioleta em kit URÉIA LIQUIFORM ®5 ; creatinina, por método colorimétrico de ponto final, em kit CREATININA LIQUIFORM ®6 ; creatina quinase (CK), por método de cinética ultravioleta em kit CK NACI LIQUIFORM ®7 ; aspartato aminotransferase (AST), por método de cinética ultravioleta em kit AST/GOT LIQUIFORM ®8 ; alanino aminotransferase (ALT), por método de cinética ultravioleta em kit ALT/GPT LIQUIFORM ®9 ; todos com leitura em espectrofotômetro BIO2000®10 semiautomático (Kaneko, 1997). • tempo de coagulação, em minutos, por observação visual do sangue total em temperatura ambiente (Kaneko, 1997). • contagem de plaquetas, por método indireto de Fônio (Pratt, 1997). • mensuração de imunoglobulinas séricas totais por eletroforese, em aparelho CELM FEA 250®11 (Pratt, 1997). 5- URÉIA LIQUIFORM ® - LABTEST 6- CREATININA LIQUIFORM ® - LABTEST 7- CK NACI LIQUIFORM ® - LABTEST 8- AST/GOT LIQUIFORM ® - LABTEST 9- ALT/GPT LIQUIFORM ® - LABTEST 10- BIO2000® - BIOPLUS 11- CELM FEA 250® - CELM 22 4.9 Análise dos resultados: Os resultados obtidos foram anotados em fichas individuais (apêndices 1 e 2) e, posteriormente, tabulados e analisados, visando verificar se houve variação significativa no desenvolvimento dos sintomas clínicos e nos padrões laboratoriais, entre animais do mesmo grupo e entre os grupos GIVN (grupo inoculado com veneno nativo) e GIVI (grupo inoculado com veneno irradiado). 4.10 Procedimento estatístico: Para comparação entre grupos, foi utilizada análise de variância; para um delineamento inteiramente casualizado com as comparações múltiplas foi empregado o método de Tuckey ao nível de 5% de significância (Zar, 1984). 23 5- RESULTADOS 5.1. TEMPERATURA RETAL, FREQUÊNCIA CARDÍACA, PULSO E FREQUÊNCIA RESPIRATÓRIA Pôde-se observar, ao longo do experimento, que fatores ambientais, como estresse e temperatura ambiental, foram preponderantes nas variações observadas nas aferições da temperatura retal, freqüência cardíaca, pulso e freqüência respiratória, portanto, estes parâmetros não foram considerados. 5.2. EXAME CLÍNICO Após a inoculação dos venenos, em ambos os grupos, observou-se o desenvolvimento de apatia e anorexia, que persistiu durante cerca de três dias nos animais pertencentes ao grupo GIVN e apenas 1 dia nos animais do grupo GIVI, além das alterações locais. Entretanto, percebeu-se que os animais pertencentes ao grupo inoculado com veneno nativo (GIVN) se mostraram mais apáticos e anoréticos que aqueles pertencentes ao grupo inoculado com veneno irradiado (GIVI), embora estes parâmetros não tenham sido mensurados. 5.3. ALTERAÇÕES LOCAIS Os resultados das avaliações, das alterações locais observadas nos animais dos grupos GIVN e GIVI, são demonstrados nas tabelas 2, 3, 4 e 5; figuras 1, 2, 3 e 4 e quadro1. 5.3.1. Presença de solução de continuidade, hemorragia e necrose Em nenhum animal de ambos os grupos foi observada qualquer lesão, na superfície da pele no local da inoculação dos venenos, que pudesse ser 24 caracterizada como solução de continuidade, hemorragia ou necrose, portanto, estes parâmetros não foram considerados. 5.3.2. Presença de edema A tabela 2 mostra, e a figura 1 ilustra, os dados obtidos da observação dos edemas inflamatórios locais nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 2. Desenvolvimento de edema inflamatório local (notas de 0 a 4, sendo 0 a ausência de edema e 4 o edema mais intenso observado) nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes da inoculação dos venenos botrópicos e de um a oito dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 0 2 3 2 1 1 1 0 0 2 0 3 3 2 1 0 0 0 0 3 0 3 3 2 1 0 0 0 0 5 0 2 2 3 2 0 0 0 0 6 0 3 4 4 4 3 3 3 1 GIVN 10 0 3 4 2 1 0 0 0 0 X 0 A 2,67 A 3,17 B 2,5 B 1,67 B 0,67 A 0,67 A 0,5 A 0,17 A 4 0 1 0 0 0 0 0 0 0 7 0 2 1 0 0 0 0 0 0 8 0 1 1 0 0 0 0 0 0 9 0 1 0 0 0 0 0 0 0 11 0 1 1 0 0 0 0 0 0 GIVI 12 0 1 1 0 0 0 0 0 0 X 0 A 1,17 B 0,67 A 0 A 0 A 0 A 0 A 0 A 0 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 25 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 média 0 1 2 3 4 5 6 7 8 dias GIVN GIVI Figura 1. Médias, dos valores atribuídos à intensidade dos edemas locais desenvolvidos pelos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Pôde-se observar, considerando-se os valores das médias, que o edema inflamatório local instalou-se logo após as inoculações, sendo mais intenso nos animais do grupo GIVN. No segundo dia de experimento, os edemas continuavam a aumentar nos animais do grupo GIVN, porém, se reduziam nos animais do grupo GIVI. No terceiro dia, os edemas dos animais do grupo GIVN iniciaram suas reduções, e nos animais do grupo GIVI já haviam desaparecido. Os edemas locais dos animais do grupo GIVN continuaram a regredir lentamente e, no nono dia após as inoculações, desapareceram (tabela 2, figura 1 e quadro 1). 26 5.3.3. Presença de calor A tabela 3 mostra, e a figura 2 ilustra, os dados obtidos da observação do desenvolvimento de calor decorrente do processo inflamatório local nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 3. Desenvolvimento de calor inflamatório local (notas de 0 a 4, sendo 0 a ausência de calor e 4 o calor mais intenso observado) nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes da inoculação dos venenos botrópicos, e de um a oito dias após esta inoculação, incluindo média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 1 0 2 2 1 0 0 0 0 0 2 0 3 3 2 1 1 1 0 0 3 0 3 3 2 1 1 1 0 0 5 0 2 2 2 1 1 1 0 0 6 0 3 3 3 3 3 2 2 0 GIVN 10 0 2 2 1 1 1 1 1 0 X 0 A 2,5 B 2,5 B 1,83 B 1,17 B 1,17 B 1 A 0,5 A 0 A 4 0 1 0 1 0 1 1 0 0 7 0 2 1 1 0 1 0 0 0 8 0 1 0 0 1 1 1 0 0 9 0 1 1 1 1 1 0 0 0 11 0 3 2 1 0 1 0 0 0 GIVI 12 0 2 2 1 1 1 1 0 0 X 0 A 1,67 B 1 A 0,83 A 0,5 A 1 A 0,5 A 0 A 0 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 27 0 0,5 1 1,5 2 2,5 média 0 1 2 3 4 5 6 7 8 dias GIVN GIVI Figura 2. Médias, dos valores atribuídos à intensidade do calor local desenvolvido pelos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Considerando-se as médias, pôde-se observar que no primeiro dia após as inoculações dos venenos, o calor inflamatório já estava instalado em todos os animais de ambos os grupos, entretanto, com maior intensidade nos animais do grupo GIVN. No segundo dia, o calor local se manteve constante nos animais do grupo GIVN, e reduziu-se nos animais do grupo GIVI. A partir do terceiro dia, o calor local se mostrou em queda gradativa nos animais dos dois grupos, porém, sempre mais intenso nos animais do grupo GIVN. No sétimo dia, o calor havia desaparecido no animais do grupo GIVI e ainda estava presente nos animais do 28 grupo GIVN. No oitavo dia, o calor havia desaparecido em todos os animais dos dois grupos (tabela 3, figura 2 e quadro 1). 5.3.4. Presença de dor A tabela 4 mostra, e a figura 3 ilustra, os dados obtidos da observação de dor decorrente da inflamação local nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 4. Desenvolvimento de dor local (notas de 0 a 4, sendo 0 a ausência de dor e 4 a dor mais intensa observada) nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes da inoculação dos venenos botrópicos, e de um a nove dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 2 2 2 1 0 0 2 0 1 1 0 1 2 1 1 0 0 3 0 2 2 2 2 2 2 1 0 0 5 0 1 2 2 2 2 1 1 0 0 6 0 2 2 2 2 2 2 2 1 0 GIVN 10 0 3 2 2 2 2 1 0 0 0 X 0 A 1,67 B 1,67 B 1,5 B 1,83 B 2 B 1,5 B 1 B 0,17 A 0 A 4 0 1 0 1 1 1 0 0 0 0 7 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 8 0 2 1 1 1 2 1 0 0 0 9 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 11 0 3 1 2 2 1 1 0 0 0 GIVI 12 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 X 0 A 1,67 B 0,67 A 1 A 0,83 A 0,83 A 0,5 A 0 A 0 A 0 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 29 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8 2 média 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 dias GIVN GIVI Figura 3. Médias, dos valores atribuídos à intensidade da dor local desenvolvida pelos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. A dor inflamatória local instalou-se imediatamente após a inoculação dos venenos, tendo sido demonstrada pela atitude antiálgica dos animais que mantinham o membro levantado do solo. Segundo as médias dos valores atribuídos à dor local, observou-se que um dia após a inoculação dos venenos, a dor local mostrou-se em semelhante intensidade nos animais dos dois grupos. Do segundo ao quinto dia, a dor local sofreu variações aleatórias nos animais de ambos os grupos, porém, sempre mais intensa nos animais do grupo GIVN. Do sexto ao oitavo dia, a dor local passou a reduzir-se nos animais dos dois grupos, entretanto, foi sempre mais intensa nos animais do grupo GIVN. A dor local 30 desapareceu a partir do sétimo dia, nos animais do grupo GIVI, e a partir do nono dia, nos animais do grupo GIVN (tabela 4, figura 3 e quadro 1). 5.3.5. Presença de rubor A tabela 5 mostra, e a figura 4 ilustra, os dados obtidos da observação do rubor inflamatório local nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 5. Desenvolvimento de rubor inflamatório local (notas de 0 a 4, sendo 0 a ausência de rubor e 4 o rubor mais intenso observado) nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes da inoculação dos venenos botrópicos e de um a nove dias após esta inoculação, incluindo média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 2 0 2 2 1 1 1 1 0 0 0 3 0 1 1 1 1 1 1 1 0 0 5 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 6 0 1 1 2 1 2 2 1 1 0 GIVN 10 0 1 1 1 0 1 1 0 0 0 X 0 A 1,17 B 1,17 B 1,17 B 0,67 A 1 B 1 B 0,33 A 0,17 A 0 A 4 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 7 0 2 1 1 0 1 0 0 0 0 8 0 1 0 1 1 1 1 1 0 0 9 0 2 1 1 1 1 0 0 0 0 11 0 1 1 1 0 0 0 0 0 0 GIVI 12 0 1 1 1 1 1 1 0 0 0 X 0 A 1,33 B 0,83 B 1 B 0,67 A 0,83 B 0,33 A 0,17 A 0 A 0 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 31 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 média 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 dias GIVN GIVI Figura 4. Médias, dos valores atribuídos à intensidade do rubor local desenvolvido pelos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Considerando-se as médias, dos valores atribuídos à intensidade do rubor inflamatório local, pôde-se verificar que este foi observado um dia após a inoculação dos venenos, sendo mais intenso nos animais do grupo GIVI. A partir do segundo até o quinto dia, o rubor local sofreu variações aleatórias, sendo sempre mais intenso nos animais do grupo GIVN, exceto no quarto dia, quando foi semelhante nos animais dos dois grupos. A partir do sexto dia, o rubor local passou a decair nos animais de ambos os grupos, sendo sempre menos intenso nos animais do grupo GIVI. O rubor local desapareceu, nos animais de grupo GIVI, no oitavo dia e, nos animais do grupo GIVN, no nono dia após a inoculação dos venenos (tabela 5, figura 4 e quadro 1). 32 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 5 6 7 8 dias ed em a GIVN GIVI 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 0 1 2 3 4 5 6 7 8 dias ca lo r GIVN GIVI 0 0,5 1 1,5 2 2,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 dias d o r GIVN GIVI 0 0,5 1 1,5 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 dias ru b o r GIVN GIVI Quadro 1. Gráficos, representativos das evoluções do edema, calor, dor e rubor locais nos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. 33 5.4. ERITROGRAMA Nos exames de eritrograma foram analisados parâmetros demonstrados nas tabelas 6, 7 e 8; figuras 5, 6 e 7 e quadro 2. 5.4.1. Contagem de hemácias A tabela 6 mostra, e a figura 5 ilustra, os dados obtidos a partir da contagem de hemácias nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 6. Contagens de hemácias (x106) nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 22,15 22,1 16,96 14,33 22,52 2 15 16,25 14,49 11,2 9,92 3 15,25 10,5 10,48 11,07 15,65 5 13,85 19,15 14,85 13,01 13,88 6 14,25 12,2 10,93 13,68 18,88 GIVN 10 11,35 21,1 15,65 11,44 21,45 X 13,12 A 14,61 A 12,19 A 11,67 A 18,9 B 4 14,25 13 11,78 13,39 12,04 7 14,35 15,3 15,36 17,9 18,6 8 17,25 18,05 17 17,29 19,39 9 18,55 16,15 12,6 13,6 22,52 11 16,1 11,45 15,93 12,64 18,5 GIVI 12 22,05 20,65 14,15 22,26 26,45 X 17,1 B 15,77 A 14,47 A 14,87 A 19,58 B X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 34 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 hemácias 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 5. Médias, dos valores de contagem de hemácias (x106) nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores médios das contagens de hemácias sofreram quedas proporcionais e gradativas em ambos os grupos no primeiro e segundo dia após a inoculação dos venenos. No sétimo dia, a contagem de hemácias continuava a decair, nos animais do grupo GIVN, e passou a elevar-se nos animais do grupo GIVI. No trigésimo dia, a contagem de hemácias havia se elevado, estando com valores semelhantes entre os animais dos dois grupos e superiores ao observado antes da inoculação dos venenos (tabela 6, figura 5 e quadro 2). 35 5.4.2 Volume globular A tabela 7 mostra, e a figura 6 ilustra, os valores de volume globular obtidos nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 7. Valores de volume globular (%) mensurados nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 33 32 22 24 32 2 23 24 22 17 20 3 32 23 17 21 33 5 35 33 30 25 32 6 35 34 28 25 33 GIVN 10 29 32 24 22 36 X 31,17 A 29,67 A 23,83 B 22,33 B 31 A 4 33 32 31 22 28 7 28 29 28 26 33 8 28 28 28 28 34 9 29 27 26 27 35 11 25 23 25 23 29 GIVI 12 35 35 29 34 47 X 29,67 A 29 A 27,83 A 26,67 A 34,33 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 36 0 5 10 15 20 25 30 35 volume globular 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 6. Médias, dos valores de volume globular (%) nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores médios de volume globular decaíram proporcionalmente, entre os grupos, no primeiro dia após inoculação dos venenos. Do segundo ao sétimo dia, os valores continuaram a decair em ambos os grupos, porém, esta queda foi mais intensa nos animais do grupo GIVN. No trigésimo dia, os valores de volume globular aumentaram em ambos os grupos, sendo semelhante ao observado antes da inoculação dos venenos, nos animais do grupo GIVN, e superior nos animais do grupo GIVI (tabela 7, figura 6 e quadro 2). 37 5.4.3. Nível sérico de hemoglobina A tabela 8 mostra, e a figura 7 ilustra, os níveis séricos de hemoglobina obtidos nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 8. Níveis séricos de hemoglobina (g/dL) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 10,1 9,8 8,3 7,8 10 2 7,7 8,1 6,1 6,2 6 3 8,8 7 5,3 6,7 9,1 5 9,8 10,6 9,6 8,3 9,7 6 8,9 10,5 8,9 8,3 10,3 GIVN 10 9,5 10,8 7,8 7,8 11,9 X 9,13 9,47 7,67 7,52 9,5 4 7 6,9 6,5 7,2 6,1 7 9,2 9,4 8,7 9,4 11,1 8 9,5 9 8,3 8,9 12,1 9 9,1 8,6 7,9 8,8 12,9 11 8,3 7,8 7,6 7,7 7,9 GIVI 12 11,1 10,9 10,1 11,4 14,2 X 9,03 8,77 8,18 8,9 10,72 X = média aritmética Médias não diferem significativamente (p>0,05). 38 0 2 4 6 8 10 12 hemoglobina 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 7. Médias, dos valores de hemoglobina (g/dL) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. A tabela 8, a figura 7 e o quadro 2 demonstram que os valores médios dos teores séricos de hemoglobina sofreram variações aleatórias ao longo do experimento, porém, no trigésimo dia, os valores foram superiores aos observados antes da inoculação dos venenos em ambos os grupos, entretanto, estas variações não foram significativas em nenhum momento (p>0,05). 39 0 5 10 15 20 25 0 1 2 7 30 dias h em ác ia s GIVN GIVI 0 10 20 30 40 0 1 2 7 30 dias VG GIVN GIVI 0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 7 30 dias Hb GIVN GIVI Quadro 2. Gráficos representativos das evoluções das contagem de hemácias (células x 106/mm3), mensurações de volume globular (%) e hemoglobina (g/dL) em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. 40 5.5. LEUCOGRAMA Nos exames de leucograma foram analisados parâmetros demonstrados nas tabelas 9 a 14, figuras 8 a 13 e quadro 3. 5.5.1. Contagem de leucócitos A tabela 9 mostra, e a figura 8 ilustra, as contagens de leucócitos obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 9. Contagens de leucócitos (células/mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 9250 17600 13800 9700 4950 2 13650 15400 14000 11650 6700 3 12000 15250 11000 9900 8500 5 36500 18200 16800 12650 7900 6 15700 27600 20800 12350 15050 GIVN 10 11000 11400 15600 9400 6450 X 16350 A 17575 A 15333,33 A 10941,67 B 8258,33 B 4 20650 25400 16200 15250 13250 7 5600 4400 10600 9200 4000 8 8600 4700 9800 9150 5150 9 10050 15400 13600 12000 7950 11 9000 15200 11000 8550 7950 GIVI 12 14200 24200 21000 14650 12050 X 11350 B 14883,33 A 13700 A 11466,67 B 8391,67 B X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 41 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 leucócitos 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 8. Médias, dos valores de contagem de leucócitos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores médios de contagem total de leucócitos se elevaram um dia após a inoculação dos venenos, sendo que esta elevação foi mais intensa nos animais do grupo GIVI. A partir do segundo dia, os valores passaram a decair gradativamente em ambos os grupos, porém, esta queda foi mais intensa nos animais do grupo GIVN. No trigésimo dia, os valores de contagem total de leucócitos estavam semelhantes, entre os animais do dois grupos, e inferiores ao observado antes da inoculação dos venenos (tabela 9, figura 8 e quadro 3). 42 5.5.2. Contagem de metamielócitos e basófilos As contagens de metamielócitos e basófilos foram sempre iguais a zero, para todos os animais de ambos os grupos. 5.5.3. Contagem de bastonetes A tabela 10 mostra, e a figura 9 ilustra, as contagens de bastonetes obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 10. Contagens de bastonetes (células/mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 0 0 0 0 99 2 0 0 0 0 67 3 0 152,5 0 0 170 5 0 182 0 0 158 6 0 0 0 0 0 GIVN 10 0 0 0 0 64,5 X 0 A 55,75 B 0 A 0 A 93,08 B 4 0 0 0 0 132,5 7 0 132 0 0 40 8 0 0 0 0 103 9 0 308 0 0 79,5 11 0 152 0 0 159 GIVI 12 0 726 0 0 120,5 X 0 A 219,67 C 0 A 0 A 105,75 B X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 43 0 50 100 150 200 250 bastonetes 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 9. Médias, dos valores de contagem de bastonetes (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os bastonetes não estavam presentes, nas contagens diferenciais de leucócitos, antes da inoculação dos venenos, porém, no primeiro dia após as inoculações, estavam presentes nos leucogramas dos animais de ambos os grupos e mais intensamente nos animais do grupo GIVI. Essas células não foram encontradas nos exames realizados no segundo e sétimo dias, entretanto, no trigésimo dia, estavam presentes em valores médios semelhantes nos leucogramas dos animais dos dois grupos (tabela 10, figura 9 e quadro 3). 44 5.5.4. Contagem de neutrófilos A tabela 11 mostra, e a figura 10 ilustra, as contagens de neutrófilos obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 11. Contagens de neutrófilos (células /mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 3607,5 14784 4968 3298 2227,5 2 6415,5 9240 7140 3262 3216 3 5520 12505 5280 4851 4505 5 17155 12922 12264 6451,5 3555 6 6594 17388 16432 4569,5 6170,5 GIVN 10 7260 8664 9672 4700 4063,5 X 7758,67 A 12583,83 B 9292,67 B 4522 A 3956,25 A 4 10531,5 18542 8100 7015 6492,5 7 2632 3256 4664 3220 2320 8 3956 2585 3724 4209 2678 9 4321,5 9086 3808 6360 4452 11 3060 10792 4730 4104 4531,5 GIVI 12 4402 18634 11550 5567 5904,5 X 4817,17 A 10482,5 B 6096 A 5079,17 A 4396,42 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 45 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 neutrófilos 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 10. Médias, dos valores de contagem de neutrófilos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores médios de contagem diferencial de neutrófilos elevaram-se, proporcionalmente entre os grupos, um dia após a inoculação dos venenos. A partir do segundo dia, passaram a decair e estavam em valores semelhantes entre os dois grupos no sétimo dia, mantendo-se assim até o trigésimo dia (tabela 11, figura 10 e quadro 3). 46 5.5.5. Contagem de linfócitos A tabela 12 mostra, e a figura 11 ilustra, as contagens de linfócitos obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 12. Contagens de linfócitos (células /mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 5365 2288 8556 6305 2376 2 7098 5852 6720 8388 3149 3 6360 2440 5610 5049 3230 5 16060 4732 4032 5566 3950 6 8949 9936 3952 7657 8127 GIVN 10 3410 2736 5304 4136 1806 X 7873,67 A 4664 B 5695,67 A 6183,5 A 3773 B 4 9499 6096 8100 7930 5830 7 2744 1012 5830 5888 1520 8 3870 1927 6076 4666,5 2111,5 9 5226 5698 9656 5520 3100,5 11 5490 3952 5940 4275 3021 GIVI 12 9656 4114 8190 8057,5 5422,5 X 6080,83 A 3799,83 B 7298,67 A 6056,17 A 3500,92 B X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 47 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 linfócitos 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 11. Médias, dos valores de contagem de linfócitos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Um dia após a inoculação dos venenos, os valores médios das contagens diferenciais de linfócitos decaíram, com queda mais intensa nos animais do grupo GIVN. No segundo dia, as contagens se elevaram, com elevação mais intensa nos animais do grupo GIVI. No sétimo dia, as contagens estavam semelhantes entre os animais dos dois grupos. No trigésimo dia, as contagens haviam decaído e se mostraram semelhantes entre os dois grupos e inferiores ao observado antes da inoculação dos venenos (tabela 12, figura11 e quadro 3). 48 5.5.6. Contagem de monócitos A tabela 13 mostra, e a figura 12 ilustra, as contagens de monócitos obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 13. Contagens de monócitos (células /mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 92,5 528 276 0 198 2 136,5 308 140 0 268 3 0 152,5 110 0 595 5 365 364 504 506 237 6 0 276 208 0 451,5 GIVN 10 110 0 312 376 322,5 X 117,33 A 271,42 B 258,33 B 147 A 345,33 B 4 619,5 762 0 152,5 530 7 56 0 0 92 120 8 0 94 0 91,5 206 9 0 154 136 0 238,5 11 90 304 330 85,5 238,5 GIVI 12 0 484 840 879 482 X 127,58 A 299,67 B 217,67 B 216,75 B 302,5 B X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 49 0 50 100 150 200 250 300 350 monócitos 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 12. Médias, dos valores de contagem de monócitos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores médios de contagem diferencial de monócitos elevaram-se um dia após a inoculação dos venenos nos dois grupos, passando a decair após o segundo dia. No trigésimo dia, os valores elevaram-se em ambos os grupos, com elevação mais intensa nos animais do grupo GIVN, sendo que, em ambos os grupos, os valores eram superiores ao observado antes da inoculação dos venenos (tabela 13, figura 12 e quadro 3). 50 5.5.7. Contagem de eosinófilos A tabela 14 mostra, e a figura 13 ilustra, as contagens de eosinófilos obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 14. Contagens de eosinófilos (células /mm3) obtidas nos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 185 0 0 97 49,5 2 0 0 0 0 0 3 120 0 0 0 0 5 2920 0 0 126,5 0 6 157 0 208 123,5 301 GIVN 10 220 0 312 188 193,5 X 600,33 A 0 C 86,67 C 89,17 C 90,67 C 4 0 0 0 152,5 265 7 168 0 106 0 0 8 774 94 0 183 51,5 9 502,5 154 0 120 79,5 11 360 0 0 85,5 0 GIVI 12 142 242 420 146,5 120,5 X 324,42 B 81,67 C 87,67 C 114,58 C 86,08 C X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 51 0 100 200 300 400 500 600 700 eosinófilos 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 13. Médias, dos valores de contagem de eosinófilos (células /mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores médios das contagens diferenciais de eosinófilos decaíram, em ambos os grupos, após a inoculação dos venenos, e assim se mantiveram até o trigésimo dia (tabela 12, figura 13 e quadro 3). 52 0 10000 20000 0 1 2 7 30 dias leucócitos totais GIVN GIVI 0 100 200 300 0 1 2 7 30 dias bastonetes GIVN GIVI 0 5000 10000 15000 0 1 2 7 30 dias neutrófilos GIVN GIVI 0 5000 10000 0 1 2 7 30 dias linfócitos GIVN GIVI 0 200 400 0 1 2 7 30 dias monócitos GIVN GIVI 0 500 1000 0 1 2 7 30 dias eosinófilos GIVN GIVI Quadro 3. Gráficos representativos da evolução das contagens totais e diferenciais de leucócitos (células/mm3) em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. 53 5.6. PERFIL DE HEMOSTASIA Alterações no perfil de hemostasia são demonstradas nas tabelas 15 e 16, figuras 14 e 15 e quadro 4. 5.6.1. tempo de coagulação A tabela 15 mostra, e a figura 14 e o quadro 4 ilustram, os dados de tempo de coagulação obtidos em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 15. Tempos de coagulação, em minutos, observados em sangue total, dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 3 60 27 8 60 2 4 32 60 15 17 3 2 60 60 12 44 5 3 60 60 17 35 6 2 60 21 12 31 GIVN 10 3 60 60 12 40 X 2,83 A 55,33 B 48 B 12,66 A 37,83 B 4 2 13 14 10 59 7 2 17 14 5 41 8 4 9 19 15 48 9 3 12 18 12 50 11 6 17 8 14 41 GIVI 12 2 6 9 11 26 X 3,17 A 12,33 A 13,67 A 11,17 A 44,17 B X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 54 0 10 20 30 40 50 60 tempo de coagulação 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 14. Médias, dos valores de tempo de coagulação (min), do sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Considerando-se valores médios, o tempo de coagulação do sangue total elevou-se, em ambos os grupos, um dia após a inoculação dos venenos, entretanto, esta elevação foi mais intensa nos animais do grupo GIVN. No segundo dia, o tempo de coagulação manteve-se semelhante ao observado no primeiro dia para os animais do grupo GIVI, e passaram a decair para os animais do grupo GIVN. No sétimo dia, os tempos de coagulação estavam semelhantes entre os dois grupos e em relação ao observado para os animais do grupo GIVI no segundo dia. No trigésimo dia, o tempo de coagulação elevou-se nos animais de ambos os grupos (tabela 15, figura 14 e quadro 4). 55 5.6.2. contagem de plaquetas A tabela 16 mostra, e a figura 15 e o quadro 4 ilustram, as contagens de plaquetas executadas em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 16. Contagens de plaquetas (unidades /mm3) executadas em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos, um, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 1 7 30 1 959830 852630 371580 2 780000 907000 282720 3 594750 1140000 453850 5 962575 870350 430280 6 805125 961000 291400 GIVN 10 298180 729300 525525 X 733410 A 910046,7 A 392559,2 A 4 855000 783300 638120 7 308525 1640000 567300 8 448500 1770500 475055 9 255000 793300 529220 11 225400 717320 333000 GIVI 12 595350 845880 462875 X 447962,5 B 1091717 A 500928,3 B X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 56 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 plaquetas 0 7 30 dias GIVN GIVI Figura 15. Médias, dos valores de contagem de plaquetas (unidades/mm3) obtidos a partir dos hemogramas dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. As contagens de plaquetas não foram possíveis no primeiro e segundo dia, após a inoculação dos venenos, em decorrência de agregações plaquetárias. No sétimo dia, os valores médios elevaram-se em ambos os grupos, com elevação mais intensa nos animais do grupo GIVI. No trigésimo dia, as contagens decaíram a valores semelhantes ao observado antes da inoculação, sendo semelhantes entre os animais dos dois grupos (tabela 16, figura 15 e quadro 4). 57 0 10 20 30 40 50 60 0 1 2 7 30 dias te m p o d e co ag u la çã o GIVN GIVI 0 200000 400000 600000 800000 1000000 1200000 0 7 30 dias p la q u et as GIVN GIVI Quadro 4. Gráficos, representativos das evoluções das contagem de plaquetas (unidades/mm3) e mensurações do tempo de coagulação (minutos), em sangue total dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. 58 5.7. PARÂMETROS DE BIOQUÍMICA SÉRICA Os resultados obtidos com a análise dos parâmetros de bioquímica sérica são demonstrados nas tabelas 17 a 21, figuras 16 a 20 e quadro 5. 5.7.1. Nível sérico de uréia A tabela 17 mostra, e a figura 16 ilustra, os dados obtidos da mensuração sérica de uréia nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 17. Níveis séricos de uréia (mg/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 39 86 42 15 44 2 23 48 23 11 35 3 36 73 49 22 43 5 37 103 94 23 47 6 46 83 58 23 39 GIVN 10 39 40 49 20 36 X 36,67 A 72,17 B 52,5 A 19 A 40,67 A 4 40 52 37 15 47 7 27 57 28 12 49 8 37 37 28 16 42 9 38 50 34 17 28 11 43 35 43 28 38 GIVI 12 60 33 35 13 47 X 40,83 A 44 A 34,17 A 16,83 A 41,83 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 59 0 10 20 30 40 50 60 70 80 uréia 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 16. Médias, dos valores séricos de uréia (mg/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores médios de uréia sérica mantiveram-se sem diferença estatística (p>0,05), para os animais do grupo GIVI, durante todo o experimento. Para os animais do grupo GIVN, os valores médios de uréia sérica aumentaram no primeiro dia após a inoculação do veneno e passaram a decair gradativamente até o sétimo dia. No trigésimo dia, os valores estavam semelhantes, entre os animais dos dois grupos e em relação ao momento antes da inoculação dos venenos (tabela 17, figura 16 e quadro 5). 60 5.7.2. Nível sérico de creatinina A tabela 18 mostra, e a figura 17 ilustra, os dados obtidos da mensuração sérica de creatinina nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 18. Níveis séricos de creatinina (mg/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 0,8 0,9 0,8 0,69 0,73 2 0,6 0,5 0,46 0,4 0,46 3 0,84 0,9 0,65 0,65 0,61 5 0,88 1 1 0,65 0,84 6 1 1,1 0,88 0,73 0,65 GIVN 10 0,84 0,9 0,57 0,61 0,65 X 0,83 0,88 0,73 0,62 0,66 4 0,9 0,7 0,65 0,84 0,69 7 1 0,69 0,73 0,88 0,69 8 0,9 0,8 0,69 0,96 0,76 9 0,8 0,69 0,53 0,65 0,61 11 0,88 0,7 0,73 0,76 0,76 GIVI 12 0,96 0,8 0,76 0,92 0,96 X 0,91 0,73 0,68 0,83 0,75 X = média aritmética Médias não diferem significativamente (p>0,05). 61 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 creatinina 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 17. Médias, dos valores séricos de creatinina (mg/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores das médias de creatinina sérica não se alteram significativamente (p>0,05), ao longo de todo o experimento, para os animais de ambos os grupos (tabela 18, figura 17 e quadro 5). 62 5.7.3. Nível sérico de creatina quinase (CK) A tabela 19 mostra, e a figura 18 ilustra, os dados obtidos da mensuração sérica de creatina quinase (CK) nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 19. Níveis séricos de creatina quinase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 194 2259 4250 242 145 2 194 922 1141 194 97 3 218 2574 2161 218 170 5 242 3011 6581 291 121 6 145 3521 4906 218 242 GIVN 10 145 2623 2987 145 97 X 189,67 A 2485 B 3671 B 218 A 145,33 A 4 218 558 364 315 170 7 194 1530 1384 242 97 8 121 194 194 218 145 9 194 1239 1821 485 170 11 170 1409 1020 170 121 GIVI 12 121 4590 3327 315 145 X 169,67 A 1586,67 A 1351,67 A 290,83 A 141,33 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 63 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 CK 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 18. Médias, dos valores séricos de creatina quinase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores séricos médios de creatina quinase elevaram-se um dia após a inoculação dos venenos, com elevação mais intensa nos animais do grupo GIVN. No segundo dia, estes valores continuaram a aumentar nos animais do grupo GIVN, e passaram a decair nos animais do grupo GIVI. No sétimo, dia estavam em valores semelhantes entre os dois grupos e em relação ao observado antes da inoculação dos venenos, e assim permaneceram até o trigésimo dia (tabela 19, figura 18 e quadro 5). 64 5.7.4. Nível sérico de aspartato aminotransferase (AST) A tabela 20 mostra, e a figura 19 ilustra, os dados obtidos da mensuração sérica de aspartato aminotransferase (AST) nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 20. Níveis séricos de aspartato aminotransferase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 89 141 382 220 73 2 146 136 204 167 83 3 89 104 371 162 73 5 89 131 434 256 68 6 83 141 466 340 78 GIVN 10 99 183 366 141 52 X 99,17 A 139,33 A 370,5 B 214,33 A 71,17 A 4 104 115 115 89 73 7 89 104 188 68 57 8 68 94 62 47 57 9 83 131 188 89 68 11 115 178 277 136 83 GIVI 12 68 146 293 120 57 X 87,83 A 128 A 187,17 A 91,5 A 65,83 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 65 0 50 100 150 200 250 300 350 400 AST 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 19. Médias, dos valores séricos de aspartato aminotransferase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Até o segundo dia após a inoculação dos venenos, os valores séricos médios de aspartato aminotransferase elevaram-se gradativamente em ambos os grupos, sendo que esta elevação foi mais intensa nos animais do grupo GIVN. No sétimo dia, os valores decaíram, e os animais do grupo GIVI apresentaram valores semelhantes ao observado antes da inoculação dos venenos. No trigésimo dia, os valores foram semelhantes, entre os animais dos dois grupos e em relação ao momento antes da inoculação dos venenos (tabela 20, figura 19 e quadro 5). 66 5.7.5. nível sérico de alanino aminotransferase (ALT) A tabela 21 mostra, e a figura 20 ilustra, os dados obtidos da mensuração sérica de alanino aminotransferase (ALT) nos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 21. Níveis séricos de alanino aminotransferase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 20 20 52 41 15 2 20 15 15 15 10 3 26 20 36 31 10 5 15 20 26 20 10 6 15 20 36 36 10 GIVN 10 20 15 41 26 20 X 19,33 A 18,33 A 34,33 B 28,17 A 12,5 A 4 20 20 15 10 15 7 20 20 26 20 15 8 15 15 10 10 15 9 26 26 31 15 15 11 20 15 31 15 15 GIVI 12 15 26 47 15 15 X 19,33 A 20,33 A 26,67 A 14,17 A 15 A X = média aritmética Médias acompanhadas de letras iguais não diferem significativamente (p>0,05). 67 0 5 10 15 20 25 30 35 ALT 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 20. Médias, dos valores séricos de alanino aminotransferase (U/L) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores séricos médios de alanino aminotransferase elevaram-se apenas no segundo dia após a inoculação dos venenos em ambos os grupos, entretanto, este aumento foi maior nos animais do grupo GIVN. No sétimo dia, os valores decaíram, principalmente nos animais do grupo GIVI e, no trigésimo dia, estavam semelhantes, entre os animais dos dois grupos e em relação ao momento antes da inoculação dos venenos (tabela 21, figura 20 e quadro 5). 68 0 20 40 60 80 0 1 2 7 30 dias ur éi a (m g/ dL ) GIVN GIVI 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 0 1 2 7 30 dias cr ea tin in a (m g/ dL ) GIVN GIVI 0 1000 2000 3000 4000 0 1 2 7 30 dias C K ( U /L ) GIVN GIVI 0 100 200 300 400 0 1 2 7 30 dias A S T ( U /L ) GIVN GIVI 0 10 20 30 40 0 1 2 7 30 dias A LT ( U /L ) GIVN GIVI Quadro 5. Gráficos, representativos da evolução de parâmetros bioquímicos séricos dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. 69 5.8. NÍVEIS SÉRICOS DE IMUNOGLOBULINAS TOTAIS A tabela 22 mostra, e a figura 21 ilustra, os valores de imunoglobulinas totais obtidos da mensuração sérica dos animais dos grupos GIVN e GIVI. Tabela 22. Valores séricos de imunoglobulinas totais (g/dL) obtidos dos animais dos grupos GIVN e GIVI antes da inoculação dos venenos botrópicos e um, dois, sete e trinta dias após esta inoculação, incluindo a média obtida a partir dos dados GRUPOS ANIMAIS e média MOMENTOS (em dias após a inoculação dos venenos) 0 1 2 7 30 1 3,48 2,79 2,89 4,1 3,92 2 2,97 2,37 2,36 3,51 3,02 3 2,85 1,03 3,14 2,81 3,66 5 3,45 2,73 2,96 3,87 4,41 6 3,47 2,18 2,2 3,5 4,2 GIVN 10 2,71 3,85 1,54 3,08 3,46 X 3,15 2,49 2,52 3,48 3,78 4 4,3 2,49 3,02 3,73 4,05 7 3,81 2,02 3,34 3,67 3,41 8 3,28 2,3 4,72 1,35 4,28 9 4,38 3,57 3,42 4,56 4,88 11 2,54 3,31 2,58 3,38 2,93 GIVI 12 2,96 3,28 3,32 2,62 3,33 X 3,55 2,83 3,4 3,22 3,81 X = média aritmética Médias não diferem significativamente (p>0,05). 70 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 im u n o g lo b u lin a 0 1 2 7 30 dias GIVN GIVI Figura 21. Médias, dos valores de imunoglobulinas séricas totais (g/dL) dos animais dos grupos GIVN e GIVI, antes e após a inoculação dos venenos. Os valores das médias de imunoglobulinas séricas totais não se alteraram significativamente (p>0,05) durante todo o experimento, para os animais de ambos os grupos (tabela 22 e figura 21). 71 6- DISCUSSÃO No delineamento experimental decidiu-se avaliar parâmetros clínicos clássicos como temperatura retal, freqüência cardíaca, pulso e freqüência respiratória. Entretanto, influências ambientais, tais como estresse e temperatura ambiente instável, não permitiram a atribuição das variações observadas meramente à ação dos venenos inoculados nos animais de ambos os grupos, portanto, estes parâmetros não foram considerados na análise dos resultados. Após a inoculação dos venenos, nos animais de ambos os grupos, observou-se o desenvolvimento de apatia e anorexia, além das alterações locais, caracterizadas como edema, dor, calor e rubor inflamatórios locais (tabelas 2 a 4, figuras 1 a 4 e quadro 1). Em nenhum animal, de ambos os grupos, foi observada qualquer lesão que pudesse ser caracterizada como solução de continuidade, hemorragia ou necrose. Estes dados contrariam as afirmações de Rosenfeld (1991), Rosenfeld et al (1959, 1970), Araújo et al (1963), Murtaugh, Kaplan (1992), Jorge et al. (1993) e Oliveira (1999), que relataram que os acidentes botrópicos caracterizam-se por edema, necrose, hemorragia, presença de bolhas, contaminação bacteriana e intensa dor no local da picada, bem como sinais sistêmicos manifestados na forma de enfartamento ganglionar, equimose, sudorese, hipotermia, hemorragias internas, hipotensão, insuficiência renal e sinais de choque. As hemorragias, derivadas da ação coagulante da peçonha botrópica, são colocadas em foco nos trabalhos de Nahas et al. (1979), Mandelbaum et al. (1982), Marlas et al. (1983), Zingali et al. (1988, 1990, 1993), Andrews et al. (1989), Kamiguti, Cardoso (1989), Moura da Silva et al. (1990), 72 Markland (1991), Robeva et al. (1991), Paine et al. (1992), Tanigawa et al. (1993), Usami et al. (1993, 1994), Nishida et al. (1994), Barraviera, Pereira (1994), Sano-Martins et al. (1995) e Castro et al. (1999). Não foram observados sinais neurológicos, corroborando a afirmação de que o veneno botrópico não atinge o sistema nervoso (Rosenfeld et al., 1970), no entanto, contraria os relatos de Pinho, Burdmann (2001), Souza et al. (2002) e Mosquera et al. (2003). A seletividade na apresentação dos sinais clínicos, da intoxicação botrópica experimental, provavelmente se deu em decorrência da dose de veneno inoculada (0,5 mg/kg), recomendada por Araújo et al. (1963), que seria capaz de provocar os sinais clínicos da intoxicação sem levar à morte. As alterações locais e sistêmicas observadas foram mais intensas nos animais pertencentes ao grupo inoculado com veneno nativo (GIVN), em comparação àquelas evidenciadas nos animais do grupo inoculado com veneno irradiado (GIVI), indicando menor agressividade da peçonha irradiada. Embora não fizesse parte do delineamento deste experimento, pôde-se observar que os animais de ambos os grupos experimentais se mostraram mais ativos, aumentaram o consumo de alimentos, ganharam peso e mostraram melhoras em suas características de pelagem, quando comparados entre o momento antes da inoculação dos venenos e trinta dias após. Aparentemente, as peçonhas estimularam os organismos dos caprinos ou combateram algum agente injuriante, não identificado, presente antes da inoculação dos venenos. Esta hipótese é possível considerando-se os relatos da utilização de venenos, ou de seus 73 componentes, com fins terapêuticos realizados por Fenard et al. (1999), Bailey, Wilce (2001), Correa et al. (2002), Silva et al. (2002a e 2002b) e Gonçalves et al. (2002). Os valores de contagem de hemácias, mensuração da hemoglobina sérica e volume globular sofreram quedas gradativas até o sétimo dia após a inoculação dos venenos, entretanto, no trigésimo dia todos estes parâmetros haviam aumentado e estavam acima dos níveis observados antes da inoculação (tabelas 6 a 8, figuras 5 a 7 e quadro 2), corroborando os dados de Barraviera (1993), que relatou aumento do hematócrito e da hemoglobina, mas contraria Sano-Martins et al. (1995) que afirmaram que a série vermelha não se altera. Os incrementos na contagem de hemácias, hemoglobina e volume globular, observados no trigésimo dia após a inoculação dos venenos, sugerem que ambas as peçonhas estimularam os organismos, de forma inespecífica (imunidade inata), ou combateram possíveis agentes agressores não identificados. As quedas nos valores mensurados foram mais intensas nos animais submetidos à inoculação do veneno nativo (GIVN), e os aumentos foram maiores nos animais que receberam o veneno irradiado (GIVI), indicando que o veneno nativo foi mais prejudicial. As contagens globais de leucócitos (tabela 9 e figura 8) aumentaram no primeiro dia após a inoculação dos venenos, tal qual descreveram Barraviera (1993) e Sano-Martins et al. (1995), e passaram a decair a partir do segundo dia, atingindo, no trigésimo dia, contagens inferiores ao observado antes da inoculação. Este comportamento, das células de defesa, demonstra a imunogenicidade tanto do veneno nativo quanto do irradiado. As menores 74 contagens de leucócitos no trigésimo dia podem indicar que os animais estariam mais resistentes a agentes injuriantes não identificados, ou estes agentes poderiam ter sido atingidos pelos venenos. O aumento nas contagens globais de leucócitos foi mais intenso e mais persistente nos animais que receberam o veneno irradiado (figura 8), demonstrando maior ativação do sistema imune pelo veneno i