RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a par�r de 27/02/2025. UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE B IOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Departamento de Biologia Estrutural e Funcional Laboratório de Biologia e Genética de Peixes Estudos genéticos em Squalus mitsukurii (Squalidae) na costa da américa, utilizando SNPs Ailton Amarante Ariza Botucatu - SP 2023 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA INSTITUTO DE B IOCIÊNCIAS DE BOTUCATU Departamento de Biologia Estrutural e Funcional Laboratório de Biologia e Genética de Peixes Estudos genéticos em Squalus mitsukurii (Squalidae) na costa da américa, utilizando SNPs Botucatu - SP 2023 Aluno: Ailton Amarante Ariza Orientadora: Dra. Profa.Vanessa Paes da Cruz Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Zoologia) do Instituto de Biociências de Botucatu, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre. Agradecimentos Agradeço primeiramente a minha família, por todo apoio e por sempre me incentivarem mesmo nos momentos difíceis durante todos esses anos. A minha orientadora Vanessa pelas correções, ensinamentos que me permitiram apresentar um melhor desempenho, pela ajuda e paciência que me ajudaram a finalizar este trabalho. Aos professores Claudio e Fausto por todo apoio, suporte e auxílio. Aos meus amigos que sempre estiveram ao meu lado, pela amizade e pelo apoio, em especial para minhas companheiras de laboratório Aisni, Beatriz B., Beatriz D., Giovana e Najla. Aos colaboradores deste projeto, Dr. Sergio M. Delpiani, Pollyana Roque e ao Instituto de Biotecnologia (IBETEC- Unesp Botucatu). Por fim, agradeço ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológica (Zoologia) da Unesp de Botucatu, e ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) (processo 130332/2021-6), por ser a agência de fomento responsável pela minha bolsa e assim proporcionaram a realização do meu mestrado. Resumo Conhecidos popularmente como cação-bagre, os pequenos tubarões do gênero Squalus podem atingir até 1,5 m. As espécies deste gênero estão distribuídas em todo o mundo, algumas com ampla distribuição e outras com elevado grau de endemismo. No entanto, devido as suas características biológicas como, crescimento lento, maturação sexual tardia e poucos filhotes por ninhada, estes tubarões estão cada vez mais ameaçados de extinção, principalmente pelos efeitos da pesca excessiva. Atualmente, Squalus mitsukurii está classificado como "em perigo" na lista vermelha de espécies ameaçadas da IUCN (International Union for Conservation of Nature). Squalus mitsukurii é considerado residente das águas do leste asiático, tendo distribuição da costa da Coreia até o Vietnã, porém indivíduos no Oceano Atlântico já foram nomeados como S. mitsukurii ou S. cf. mitsukurii. Entender sobre a biologia reprodutiva, ecologia e estrutura populacional é de grande importância para traçar estratégias de manejo e conservação de espécies ameaçadas. Nesse contexto o presente trabalho teve como objetivo caracterizar e identificar a diversidade e estrutura populacional de S. mitsukurii em três populações na costa da América, com a utilização de marcadores moleculares do tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms). Foram analisadas as amostras coletadas no oceano Pacífico, na costa da California (n = 11) nos Estados Unidos e em duas localidades do Atlântico nos estados brasileiros de Pernambuco (n= 17) e São Paulo (n= 10), totalizando 38 amostras. Após a construção da biblioteca genômica através da metodologia de ddRAD (double digest Restriction Associated DNA) e sequenciamento Illumina, foi obtido um total de 33.480.939 sequencias. Após etapas bioinformáticas foram retidos 8.206 marcadores SNPs. Os índices de diversidade genética apresentaram valores de 0,077 a 0,222 para heterozigosidades observada, enquanto a heterozigosidade esperada apresentou valores de 0,098 a 0,306. Os resultados obtidos da análise de coeficiente de endogamia (FIS) apresentaram valores positivos, indicando a ocorrência de endogamia. Os índices de estruturação genética obtidos através da análise de FST variou de 0,119 apresentados entre as populações da Califórnia e São Paulo, à 0,049 entre as populações de São Paulo e Pernambuco, indicando estruturação genética moderada. Indícios de estruturação genética também foi observada na análise de DAPC, que corroborou com a separação em três cluster genéticos para cada região analisada. Este é o primeiro estudo a identificar e caracterizar a diversidade genética e estrutura populacional em Squalus mitsukurii, os resultados obtidos neste estudo indicam a existência de três estoques genéticos em S. mitsukurii, estudos contendo outras localidades são necessários para identificar outros estoques e conectividade entre as populações. Abstract Popularly known as catsharks, the small sharks of the genus Squalus can reach up to 1.5 m. Species of this genus are distributed worldwide, some with wide distribution and others with a high degree of endemism. However, due to their biological characteristics such as slow growth, late sexual maturity, and few offspring per litter, these sharks are increasingly threatened with extinction, mainly due to the effects of overfishing. Currently, Squalus mitsukurii is classified as "endangered" on the IUCN Red List of Threatened Species (International Union for Conservation of Nature). Squalus mitsukurii is considered a resident of East Asian waters, with a distribution from the coast of Korea to Vietnam, although individuals in the Atlantic Ocean have been named as S. mitsukurii or S. cf. mitsukurii. Understanding the reproductive biology, ecology, and population structure is of great importance for developing management and conservation strategies for threatened species. In this context, the present study aimed to characterize and identify the diversity and population structure of S. mitsukurii in three populations along the American coast, using Single Nucleotide Polymorphism (SNP) molecular markers. Samples collected in the Pacific Ocean, off the coast of California (n = 11) in the United States, and in two locations in the Atlantic Ocean in the Brazilian states of Pernambuco (n = 17) and São Paulo (n = 10) were analyzed, totaling 38 samples. After constructing the genomic library using the ddRAD (double digest Restriction Associated DNA) methodology and Illumina sequencing, a total of 33,480,939 sequences were obtained. After bioinformatic steps, 8,206 SNP markers were retained. Genetic diversity indices showed values of 0.077 to 0.222 for observed heterozygosity, while expected heterozygosity showed values of 0.098 to 0.306. The results obtained from the analysis of the coefficient of inbreeding (FIS) showed positive values, indicating the occurrence of inbreeding. The genetic structuring indices obtained through the FST analysis ranged from 0.119 between the populations of California and São Paulo to 0.049 between the populations of São Paulo and Pernambuco, indicating moderate genetic structuring. Evidence of genetic structuring was also observed in the Discriminant Analysis of Principal Components (DAPC), which corroborated the separation into three genetic clusters for each analyzed region. This is the first study to identify and characterize the genetic diversity and population structure in Squalus mitsukurii. The results obtained in this study indicate the existence of three genetic stocks in S. mitsukurii, and studies containing other locations are necessary to identify other stocks and connectivity between populations. Sumário 1. Introdução ................................................................................................................ 8 2. Objetivos ................................................................................................................ 12 3. Material ................................................................................................................... 12 3.1 Obtenção das amostras .................................................................................... 12 4. Métodos .................................................................................................................. 13 4.1 Obtenção de DNA ............................................................................................ 13 4.2 Elaboração das bibliotecas de SNPs ............................................................... 14 4.3 Ligação dos adaptadores ................................................................................. 14 4.4 Indexação ......................................................................................................... 15 4.5 Pool das amostras ............................................................................................ 15 4.6 Análises dos resultados .................................................................................... 15 4.6.1Detecção e filtragem de SNPs.................................................................. 15 4.6.2Análises de diversidade genética populacional ....................................... 17 5. Resultados .............................................................................................................. 17 6. Discussão ................................................................................................................ 20 7. Referencias ............................................................................................................. 23 Apêndice 1 ..................................................................................................................... 30 8 1. Introdução Os ambientes marinhos apresentam diversos ecossistemas e uma variedade de grupos de organismos, incluindo os elasmobrânquios (Santos et al. 2020, Martins et al. 2022). Os elasmobrânquios representados pelos tubarões e as raias ocupam os mais diferentes níveis da cadeia trófica (Frisch et al. 2016, Bengil et al. 2022), apresentando crescimento lento, maturidade sexual tardia e poucos filhotes por ninhada (Cortés 2000, Stevens et al. 2000, Natanson et al. 2017, Penfold & Wyffles 2019, Ebert et al. 2021, Whitenack et al. 2022). Nas últimas décadas os elasmobrânquios sofreram um significativo declínio populacional em diversas espécies de tubarões e raias pelo mundo, aumentando consideravelmente os riscos de extinção de algumas espécies (Roff et al. 2018, Pacoureau et al. 2023, Sherman et al. 2023).Estima-se que 32,6% das espécies de elasmobrânquios encontram-se ameaçadas de extinção, entretanto, levando em conta as espécies que ainda se encontram como dados deficientes, este número pode ser ainda maior (Dulvy et al. 2021). A pesca é um dos principais contribuintes para a diminuição das populações de tubarões (Pacoureau et al. 2023, Sherman et al. 2023), podendo ocorrer pelos efeitos da pesca direcionada (Shea & To, 2017, Yano et al. 2022, Sherman et al. 2023) e ou pesca acessória (Santos et al. 2022, Cronin et al. 2023, Sherman et al. 2023). Há registros que algumas espécies de tubarões do gênero Squalus também vem sendo super exploradas pela pesca direcionada há mais de 120 anos (Yano et al. 2022). O gênero Squalus (Linnaeus, 1758) abriga espécies de tubarões popularmente conhecidos por cação bagre, este gênero apresenta mais de 35 espécies validas (Last et al. 2007, Daly-Engel et al. 2018, Pfleger et al. 2018, Ziadi-Künzli et al. 2020, Ebert et al. 2021). Estes são considerados tubarões de pequeno porte, podendo atingir até 1, 5m de comprimento, são comumente encontrados até 1000 m de profundidade, possuem hábito demersal e distribuição circunglobal (Compagno, 1984; Compagno et al. 2005, Ebert et al. 2021). Dentre as espécies do gênero, foram identificados comportamento de segregação por sexo e idade, e ainda, algumas espécies são consideradas residentes, enquanto outras realizam migrações de longa distância (Ebert et al. 2021). 9 Assim como os demais elasmobrânquios, a história de vida das espécies do gênero Squalus também é caracterizada por crescimento lento, maturação sexual tardia em média 15 anos e longa expectativa de vida, com indivíduos registrados com mais de 40 anos (Ebert et al. 2010, Ebert et al. 2021, Bengil et al. 2022), algumas espécies como S. acanthias podem apresentar período gestacional de até 24 meses, sendo um dos períodos mais longos registrados em vertebrados (Natanson et al. 2017, Ebert et al. 2021). Este gênero, possui caracteres fenotípicos limitados para identificação, como contagem de vertebras e medidas corporais, no qual se sobrepõe entre as espécies (Ebert et al. 2013, Viana et al. 2016, Veríssimo et al. 2017, Bellodi et al. 2018, Pfleger et al. 2018). Estudos taxonômicos e moleculares revelaram que este gênero é composto por três grandes complexos de espécies, sendo o complexo S. suckleyi/S. acanthias; S. blainville/S. megalops/S. raoulensis/S. brevirostris; e o terceiro complexo denominado complexo S. mitsukurii, comportando o maior número de espécies (Veríssimo et al. 2017, Bellodi et al. 2018, Ferrari et al. 2021). As espécies do gênero Squalus, como S. montalbani, S. japonicus, S. hemipinnis, S. formosus, S. blainville, S. bucephalus, S. quasimodo, S. altipinnis, S. melanurus, S. mahia, S. albicaudus e S. lobularis encontram-se classificadas com algum grau de ameaça ou como dados deficientes na União Internacional para a Conservação da Natureza (do inglês International Union for Conservation of Nature, IUCN (Finucci & Kine 2018, Finucci & White 2018, Finucci et al. 2019, Graham 2019, Dulvy et al. 2020, Pollom & Herman 2020, Pollom et al. 2020, Rigby et al. 2020, Finucci & Pacoureau 2021). Squalus mitsukurii (Jordan e Snyder,1903) é caracterizado morfologicamente por apresentar focinho arredondado e longo, um curto espinho na nadadeira dorsal e a presença de uma barra preta na parte posterior nadadeira caudal (Last et al. 2007, Viana et al. 2016, Ebert et al. 2021) (Figura 1). Sua descrição foi realizada a partir de um indivíduo coletado próximo ao Japão, e atualmente, é considerado residente do Pacífico, com distribuição no leste asiático, abrangendo a costa da Coreia do Norte até a costa do Vietnam (Finucci et al. 2020). Entretanto, indivíduos da espécie já foram registrados em várias regiões dos Oceanos Atlântico, Indico e Pacífico, no qual foram nomeados como S. mitsukurii ou S. cf. mitsukurii (Viana et al. 2016) Squalus mitsukurii apresenta expectativa de vida longa, em torno de 23 anos em machos e 26 anos em fêmeas, alcança a maturidade sexual tardiamente, em média com 09 anos e 15 anos, respectivamente (Cotton et al. 2011). Apresentam poucos filhotes por ninhada 10 com cerca de 3 a 11 filhotes por ninhada (Fischer et al. 2006) e apresenta o modo reprodutivo do tipo viviparidade lecitotrófica (Oddone et al. 2010), ou seja, há o desenvolvimento intrauterino do embrião, o embrião em desenvolvimento obtém seus nutrientes através do vitelo, que é armazenada no saco vitelínico conectado diretamente ao seu sistema digestivo (Hamlett 2011). Figura 1. Exemplar de Squalus mitsukurii. Foto: Sarah Tházia Viana de Figueirêdo, 2018. Squalus mitsukurii é capturada acidentalmente pela pesca artesanal e comercial (Ziadi-Kunzli et al. 2020) e em diferentes artefatos pesqueiros, como rede de arrasto demersal, espinhel, e possivelmente, rede de emalhe e rede de espera (Finucci et al. 2020). Segundo a lista vermelha de espécies ameaçadas da IUCN, S. mitsukurii encontra-se listada como “em perigo” (Finucci et al. 2020), porém no Brasil, a espécie está classificada como “dados deficientes” no Sistema de Avaliação do Risco de Extinção da Biodiversidade, do Instituto Chico Mendes da Conservação da Biodiversidade (ICMBio, 2022). Para traçar estratégias efetivas de gestão e conservação de espécies, é importante antes compreender sobre a biologia reprodutiva, ecologia, diversidade genética e estrutura populacional das espécies (Santos et al. 2020, Postaire et al. 2022). Os objetivos de gestão muitas vezes se concentram em populações distintas ou linhagens independentes, aspectos difíceis de determinar em algumas espécies. No entanto, os métodos de genética populacional fornecem um meio de delinear padrões de distribuição geográfica de acordo com a variação molecular das populações, assim inferindo processos e hipóteses, que geram e mantêm esses padrões (Allendorf 2017, De Kort et al. 2021, Stronen et al. 2022). A genética de populações é uma ferramenta que desempenha um papel importante no manejo e conservação de espécies ameaçadas de extinção (Frankham 2010), pois revela peculiaridades nas populações, como a endogamia, comprometendo a viabilidade 11 de populações naturais ao longo do tempo (Frankham et al. 2012). A manutenção da diversidade genética é um dos fundamentos da genética da conservação, principalmente porque esta confere plasticidade às espécies frente a uma série de variáveis ambientais e sustenta seu potencial evolutivo (Bernatchez 2016, Willi et al. 2022). Nas últimas décadas, os marcadores moleculares de polimorfismos de nucleotídeo único (do inglês Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs) vem demostrando ser um marcador molecular resolutivo, permitindo inferir a diversidade e estrutura populacional com precisão em espécies não modelo, ou seja espécies que não apresentam genoma de referência (Andrews et al. 2016, Green et al. 2019, Martins et al. 2022, Nelson et al. 2022) e ainda, um eficiente marcador genético para questões relacionadas a genética da conservação (Morin et al. 2009, McMahon et al. 2014, Zimmerman et al. 2020). Os SNPs são mutações pontuais no DNA que foram fixadas ao longo das gerações. Estes polimorfismos possuem ampla distribuição pelo genoma e podem ser encontrados em regiões de íntrons e éxons (Han et al. 2019). A utilização de marcadores moleculares do tipo SNPs em espécies não modelo, foi possível com o avanço de tecnologias de sequenciamento, como o sequenciamento de nova geração (NGS) associado com outras metodologias, como o RADseq (Restriction-site associated DNA sequencing), que se baseia na fragmentação do DNA, com o uso de uma ou mais enzimas de restrição, no qual permitirá uma redução do genoma da espécie a ser analisado (Baird et al. 2008, Peterson et al. 2012). A partir da técnica original de RADseq, derivadas metodologia surgiram, como o ddRADseq (Double digest RAD sequencing) (Peterson et al. 2012). Em suma a técnica ddRAD baseia-se na utilização de duas enzimas de restrição para realizar a digestão do DNA genômico, para posteriormente a construção da biblioteca genômica e o sequenciamento massivo de representações reduzidas do genoma, tendo como finalidade a obtenção de marcadores SNPs (Andrews et al. 2016, Driller et al. 2020). A utilização do ddRADseq ganhou popularidade por apresentar ótima relação custo-benefício em relação à quantidade de dados adquiridos, rápida, de fácil replicação e principalmente pela possibilidade da aplicação em espécies não modelo (Siccha-Ramirez et al. 2018, Green et al. 2019, Devloo‐Delva et al. 2019, Green et al. 2022). Apesar da utilização de SNPs para obtenção de dados populacionais de tubarões ter se mostrado resolutiva em diferentes grupos (Green et al. 2019, Devloo‐Delva et al. 2019, Green et al. 2022), muitas espécies ainda continuam com total ausência de informações genéticas populacionais, como S. mitsukurii. Portanto é necessária 12 maior atenção em estudos genéticos para esta espécie, que nos últimos anos, vem sofrendo com a ação antropogênica, com isso, uma melhor gestão e consequentemente, uma melhor ação de conservação sobre essa espécie poderá ser realizada. 23 7. Referencias Adachi AMC de L. 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