RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta tese será disponibilizado somente a partir de 29/11/2021. Construção de um denso mapa genético e associação genômica para peso corporal e sexo em Piaractus mesopotamicus NATÁLIA JADE MENDES Botucatu - SP 2019 Construção de um denso mapa genético e associação genômica para peso corporal e sexo em Piaractus mesopotamicus Natália Jade Mendes Prof. Dr. Fausto Foresti Dr. Diogo Teruo Hashimoto Tese apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para a obtenção do título de Doutor no Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (Genética). Botucatu – SP 2019 Mendes, Natália Jade. Construção de um denso mapa genético e associação genômica para peso corporal e sexo em Píaractus mesopotamicus / Natália Jade Mendes. - Botucat,u 2019 Tese (doutorado)- Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Instituto de Biociências de Botucatu Orientado:r Fausto Foresti Coorientador: Diogo Teruo Hashimoto Cape s : 2020 000 1. Pacu (Peixe). 2. Genômic.a 3. Marcadores genéticos. 4. Técnicas de genotipage.m Palavras-chav:eGWAS; Mapa de liqaçâo; Pacu; Radseq. FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉC. AQUI S . TRATAMENTO DA I NFORM. DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - d IPUS OE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEtoiEIRE APARECIDA VICENTE-CRB 8/S651 UNESP - Botucatu - SP • Laboratório de Biologia e Genética de Peixes LaGeAC flCNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico C A P E S Dedico esta tese ao meu marido e a minha filha! “O período de maior ganho em conhecimento e experiência é o período mais difícil da vida de alguém” Dalai Lama AGRADECIMENTOS Primeiramente eu agradeço a Deus por ter me guiado até aqui. Agradeço a minha filha Gigi por ter me acompanhado nessa longa etapa em Jaboticabal e ao meu marido por ter me dado todo o suporte durante o doutorado. Eu amo vocês! A minha família Rute, Félis, Bruno, Hícaro, Vitor, Vitória e em memória ao meu pai Donizete; vocês são o meu porto seguro. Em especial a minha mãe por sempre estar ao meu lado; eu não sei o que seria da minha vida sem você. E ao meu pai que por apenas 2 meses não conseguiu me acompanhar fisicamente até essa conquista, mas que está presente espiritualmente e no meu coração. Obrigada a todas as pessoas que me ajudaram a cuidar da Giovanna para que eu pudesse me dedicar ao doutorado, especialmente minha mãe, ao meu segundo pai Félis, a minha sogra Cleusa, as minhas tias Érica e Andréia e a minha prima Laysla. Agradeço ao meu orientador Prof. Dr. Fausto Foresti pela confiança, pelos conselhos e por diversas vezes ter me mostrado o caminho correto. O Sr. é um exemplo de pesquisador e pessoa. Ao meu coorientador Dr. Diogo Teruo Hashimoto por todo o ensinamento, confiança e pela paciência. Não é fácil ter uma mãe com filho pequeno na equipe. Ao Dr. Claudio Oliveira pelo exemplo como pesquisador e pela amizade. Agradeço a todos do Laboratório de Biologia e Genética de Peixes, aos meus amigos que em algum momento estivemos juntos aprendendo e dando risadas no laboratório: Silvana, Fábio (Fio), Bruno Melo, Gabriel (Pink), Luz, Vanessa, Yuldi, Sâmia (Alka), Jefferson (Menudo), Dani, Carol (Papiro), Guilherme (Varvito), Cristiane, Camila (Sova), Ricardo (Tarja). Também agradeço a todos da equipe Lageac (Vito, Valéria, Milena, Raquel, Jonh, Carol e Rubens). Foram quatro anos de muito aprendizado, em especial à Valéria que por diversas vezes me socorreu com a Gigi. A toda equipe do Aquaculture Genomics Laboratory que me recebeu de braços abertos. Ao Prof. José Yáñes por ter me recebido em seu laboratório e ao Agustin por toda atenção durante o meu estágio no Chile. Aos amigos que fiz em Botucatu, em especial às minhas amigas Camila (Judi), Letícia (Loba), Camila (Travs), Bruna (Treps), Thaís (Balboa). Apesar da distância, vocês estiveram presentes na minha vida. Judi, obrigada pelos conselhos, pela amizade, por ter sido o meu apoio emocional durante essa jornada, amo você minha irmã. Também agradeço a todos os meus amigos de São Carlos que fizeram a minha vida mais feliz e, em especial, a todos do grupo “Etanóis”. Aos órgãos de fomento Capes, Fapesp e CNPq por financiarem as nossas pesquisas. E ao CNPq pela bolsa de estudos concedida. Muito obrigada! RESUMO Estudos genéticos com foco no aprimoramento de espécies de peixes Neotropicais são raros e, nesse sentido, uma espécie alvo é o pacu (Piaractus mesopotamicus), uma vez que é considerada uma das espécies de peixe de grande interesse econômico, com grande produção e valor comercial para a piscicultura brasileira. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver ferramentas genéticas e genômicas através da genotipagem dos marcadores genéticos do tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) para desenvolvimento de um mapa de ligação para esta espécie e, dessa maneira identificar regiões correlacionadas com características de peso corporal e sexo. Inicialmente foram formadas 14 famílias, sendo os indivíduos marcados com pit-tags e alocados em 3 tanques distintos. Os indivíduos foram pesados e tiveram o sexo identificado; no entanto, apenas 3 famílias foram genotipadas (família1, família2 e família3). Na etapa seguinte, foi realizada a extração do DNA e a elaboração de uma biblioteca genômica para cada família através da metodologia Restriction- Site Associated DNA-Sequencing (RADseq). As bibliotecas foram sequenciadas na plataforma Hiseq 4000 Illumina, resultando em uma média de 35.697.700 de sequências brutas de cada família. Um total de 11.240 marcadores SNP foram prospectados e filtrados, sendo que destes 6.437 foram utilizados na construção do primeiro mapa genético da espécie, que possui 2.814,92cM com intervalo médio de 0.44. Esses mesmos marcadores também foram utilizados para desenvolver o primeiro GWAS (Estudo de Associação Ampla do Genoma) prospectado com indivíduos genotipados e não genotipados, totalizando 399 amostras. A análise do GWAS foi realizada por meio da abordagem ssGBLUP e explicou 3,21% para o peso corporal e 2,89% para o sexo. A partir da identificação dos loci foi realizado o Blast e a busca pelos genes candidatos, sendo identificados genes para o peso corporal envolvidos com fatores de crescimento, regulação e metabolismo do osso, codificação do colágeno, proliferação e crescimento celular. Do mesmo modo foi verificado que os genes candidatos para identificação sexual estavam relacionados à espermatogênese, diferenciação sexual, células germinativas e expressão do hormônio anti-Mülleriano (AMH) em células de Sertoli. Considera-se que as ferramentas genéticas e genômicas desenvolvidas neste trabalho poderão auxiliar em investigações sobre a evolução da espécie, organização do genôma, identificação de QTLs (loci de característica quantitativa) e em programas de melhoramento genético para o pacu e espécies aparentadas. Palavras-chave: Pacu, Mapa de ligação, GWAS, RADseq ABSTRACT Genetic studies focusing on the improvement of neotropical fish species are rare and, in this sense, one target species is pacu (Piaractus mesopotamicus), as it is considered one of the most produced fish species and commercial value for Brazilian fish farming. The present work aimed to develop genetic and genomic tools through the genotyping of SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) genetic markers for the development of a linkage map for this species, and thus identify regions correlated with body weight and sex. Initially, 14 families were formed, individuals were tagged with Pit-tags and allocated in 3 distinct tanks. The subjects were weighed and had the gender identified; however, only 3 families were genotyped (family1, family2 and family3). In the next step, DNA extraction and the elaboration of a genomic library for each family were performed through the Restriction-Site Associated DNA-Sequencing (RADseq) methodology. The libraries were sequenced on the platform Hiseq 4000 Illumina, resulting in an average of 35.697.700 raw sequences from each family. A total of 11.240 SNP markers were prospected and filtered, of which 6.437 were used to construct the first genetic map of the species, which has 2.814,92cM with an average interval of 0.44. These same markers were also used to develop the first GWAS (Genome Wide Association Study) with genotyped and non-genotyped individuals, totaling 399 samples. The GWAS analysis was performed using the ssGBLUP approach and explained 3,21% for body weight and 2,89% for sex. Based on the loci identification, the Blast was performed and the candidate genes were searched, and genes for body weight involved with bone growth, regulation and metabolism, collagen coding, proliferation and cell growth factors were identified. Similarly, it was found that candidate genes for sexual identification were related to spermatogenesis, sexual differentiation, germ cells and anti-Müllerian hormone (AMH) expression in Sertoli cells. It is considered that the genetic and genomic tools developed in this work can assist in investigations on species evolution, genome organization, QTL identification (quantitative trait loci) and breeding programs for pacu and related species. Keywords: Pacu, Linkage Map, GWAS, RADseq SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL ................................................................................................................ 1 Panorama geral da aquicultura .......................................................................................................... 1 Melhoramento genético na piscicultura. ........................................................................................... 2 Genômica na piscicultura. ................................................................................................................. 4 Caracterização da espécie Piaractus mesopotamicus ....................................................................... 7 OBJETIVOS. .................................................................................................................................. 9 Objetivo geral ................................................................................................................................... 9 Objetivos específicos ........................................................................................................................ 9 MATERIAIS E MÉTODOS. ......................................................................................................... 9 CAPÍTULO 1 Descoberta de SNPs e construção de um mapa genético de alta densidade através do ddRADseq de Piaractus mesopotamicus ................................................................... 10 1.1 INTRODUÇÃO ...................................................................................................................... 12 1.2 MATERIAIS E MÉTODOS. .................................................................................................. 14 1.2.1 Formação dos grupos genéticos, instalações e manejo. ......................................................... 14 1.2.2 Construção de bibliotecas ddRADseq. ...................................................................................15 1.2.3 Identificação de filtro de SNPs. .............................................................................................. 17 1.2.4 Construção do Mapa Genético. .............................................................................................. 19 1.2.5 Mapeamento Comparativo. .................................................................................................... 19 1.3 RESULTADOS. ...................................................................................................................... 20 1.3.1 Construção das bibliotecas ddRADseq .................................................................................. 20 1.3.2 Identificação e filtro de SNPs. ............................................................................................... 20 1.3.3 Construção do Mapa Genético. .............................................................................................. 21 1.3.4 Mapeamento Comparativo. .................................................................................................... 24 1.4 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 25 1.4.1 Construção do Mapa Genético. .............................................................................................. 25 1.5 REFERÊNCIAS ...................................................................................................................... 27 CAPÍTULO 2 Estudo de Associação Genômica Ampla para o Peso Corporal e Sexo em Piaractus mesopotamicus ......................................................................................................... 31 2.1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................ 33 2.2 MATERIAIS E MÉTODOS. ................................................................................................. 35 2.2.1 Formação dos grupos genéticos, instalações e manejo. .......................................................... 35 2.2.2 Avaliação do peso corporal e do sexo .................................................................................... 36 2.2.3 Estudo de associação genômica ampla (GWAS) e herdabilidade .......................................... 38 2.2.4 Candidate genes ...................................................................................................................... 39 2.3 RESULTADOS. ...................................................................................................................... 40 2.3.1 Avaliação do peso corporal e do sexo .................................................................................... 40 2.3.2 Estudo de associação genômica ampla (GWAS) e herdabilidade .......................................... 41 2.3.3 Candidate genes ...................................................................................................................... 43 2.4 DISCUSSÃO ........................................................................................................................... 45 2.4.2 Estudo de associação genômica ampla (GWAS) e herdabilidade .......................................... 45 2.4.3 Candidate genes ...................................................................................................................... 46 2.5 REFERÊNCIAS ....................................................................................................................... 50 CONSIDERAÇÕES FINAIS. ...................................................................................................... 56 REFERÊNCIAS GERAIS. .......................................................................................................... 58 MATERIAL COMPLEMENTAR ............................................................................................... 65 APÊNDICE I .................................................................................................................................. 66 APÊNDICE II ................................................................................................................................. 76 APÊNDICE III ................................................................................................................................ 88 APÊNDICE IV ............................................................................................................................... 97 APÊNDICE V ................................................................................................................................ 110 1 INTRODUÇÃO GERAL Panorama geral da aquicultura Com a exploração pesqueira praticamente estática desde meados da década de 1980, de acordo com a Organização das Nações Unidas para a Agricultura e Alimentação (FAO, 2018), a oferta de pescado dependerá certamente de desenvolvimento e de uma correta exploração dos recursos aquícolas (Porto-Foresti & Foresti, 2004). Neste sentido, pesquisas devem ser realizadas com o objetivo de aumentar a produção mundial de peixes de maneira sustentável (Longo et al., 2019), ou seja, promover o desenvolvimento da aquicultura com medidas menos impactantes e com o investimento de recursos cada vez menor. O setor da aquicultura manteve uma taxa de crescimento anual médio de 8,30% em todo o mundo entre 1970 e 2008 (FAO, 2010). No período de 2000 a 2016, o crescimento foi de 5,80%, sendo que o setor continua crescendo quando comparado aos outros setores de produção animal (FAO, 2018). No ano de 2014, a aquicultura continental mundial produziu cerca de 47.1 milhões de toneladas (FAO, 2016), enquanto em 2016 este valor aumentou para 51.4 milhões de toneladas e foi responsável por aproximadamente 30,00% de toda a produção de organismos aquáticos (FAO, 2018). Ainda de acordo com os registros da FAO (2018), os maiores produtores de peixes de águas continentais no ano de 2016 foram a China com 28.2 milhões de toneladas, a Índia com 5.0 milhões de toneladas e a Indonésia com 3.4 milhões de toneladas. Neste cenário, o Brasil aparece entre os 10 maiores produtores, com aproximadamente 507.1 mil toneladas. No Brasil, a aquicultura é um setor com grande potencial, principalmente devido à produção recorde de grãos, indústria de rações estabelecida e amplo território (8,5 milhões de km2), situado em grande parte sob um clima tropical com boa disponibilidade hídrica e áreas favoráveis para a construção de tanques e açudes (Kubitza, 2015). O início efetivo da aquicultura no Brasil foi estabelecido na década de 1990, quando houve um crescimento acima da média mundial. No período de 1991 a 2004 a aquicultura brasileira cresceu em média 21,10%/ano, enquanto a mundial cresceu cerca de 9,50%/ano (FAO, 2006). Entre o período de 2007 a 2010 a produção de pescado pela aquicultura brasileira teve um avanço de 87,00%, cujos valores totais passaram de 210.644 toneladas para 394.340 toneladas, segundo estatísticas do IBAMA (2007) e do Ministério da Pesca e Aquicultura (MPA, 2012). Em 2014, o IBGE (Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística) incluiu a aquicultura em seu censo agropecuário. 2 Segundo essa instituição, em 2013 o Brasil produziu 392.5 mil toneladas de pescados cultivados. Em 2018, a piscicultura brasileira continuou crescendo e atingiu um total de 519.3 mil toneladas de peixes (IBGE, 2019). Neste sentido, houve um crescimento de produtos da ordem de 4,40% em relação ao ano de 2017. De acordo com os dados divulgados pela FAO (2016), a aquicultura brasileira terá forte expansão nos próximos anos, sendo que o consumo per capita de pescados no Brasil deverá chegar a 12.7 kg em 2025, ou seja, 32,00% a mais do que os 9.6 kg consumidos entre 2013 e 2015. Os dados apontam também que a produção de pescado em cativeiro no País mais que dobrará em dez anos. Levando em consideração este cenário, existem basicamente duas alternativas para os aquicultores melhorarem o desempenho produtivo nos sistemas de cultivo. A primeira seria por meio de uma ampliação em suas instalações, o que frequentemente é inviável, uma vez que nem sempre existem áreas ou volume de água disponíveis, além da ampliação frequentemente resultar na elevação dos custos de produção. A segunda seria através da maximização da produtividade, ou seja, pela melhora do rendimento da produção de peixes produzidos por unidade de área cultivada, tanto por meio de melhorias ambientais realizadas na propriedade, que envolveria a aplicação de práticas de manejo adequadas, com equilibrada taxa de arraçoamento e controle da qualidade da água, quanto por meio da instalação de um programa de melhoramento genético dos plantéis, com o objetivo de aumentar o ganho genético nos estoques de peixes que estão sendo cultivados (Tave, 1995). Melhoramento genético na piscicultura Entre as técnicas utilizadas no Brasil para se obter estoques genéticos mais produtivos na área da aquicultura, a hibridação interespecífica é responsável pela produção de milhares de toneladas de peixes ao ano (IBGE, 2019). Porém, apesar do aparente resultado zootécnico resultante da hibridação entre espécies nativas, existe uma séria preocupação com a possibilidade de escape e introgressão genética destes híbridos sobre as populações selvagens (Hashimoto et al., 2012; 2013), além do risco da implementação incidental de híbridos no plantel de reprodutores, frequentemente devido à dificuldade de se identificar e diferenciar exemplares híbridos daqueles correspondentes às espécies puras, principalmente nos estágios iniciais de vida (Hashimoto et al., 2014). Portanto, para evitar possíveis impactos ambientais e na estrutura das populações naturais, a aplicação de técnicas de seleção e acasalamentos 3 controlados entre indivíduos de uma mesma espécie usando a variabilidade genética presente nestas populações apresentam-se como alternativas mais sustentáveis (Hilsdorf & Orfão, 2011). O Brasil apresenta excelentes recursos naturais e uma rica biodiversidade de peixes com potencial para a implantação de programas de melhoramento genético, sendo que aproximadamente 40 espécies nativas de rios brasileiros são utilizadas nos programas desenvolvidos pela aquicultura nacional (Godinho, 2007). Entretanto, a maior parte dos cultivos utiliza espécies exóticas, principalmente a tilápia (IBGE, 2019), espécie que passa no Brasil por rígidos e longos programas de melhoramento genético desde a década de 2000. Este panorama revela a carência de projetos de melhoramento e inovação genética com enfoque nas espécies de peixes nativos. Em relação aos objetivos de seleção utilizados pelos programas de melhoramento genético de animais em aquicultura, a maioria destes está ligada à produção, tais como taxa de crescimento, resistência a patógenos e rendimento de filé. Entre tantos fenótipos de interesse zootécnico, características relacionadas ao crescimento, assim como ao peso corporal, constituem uma das primeiras a serem buscadas, pois considera-se que quanto maior for o crescimento dos animais melhor será a utilização dos recursos (Gjedrem et al., 2012) e, dessa forma, o retorno financeiro poderá ser mais rápido. Diversos estudos foram realizados para avaliar o potencial de crescimento das espécies de peixes de interesse econômico tendo por base ações de melhoramento genético, tendo sido observadas diferenças significativas no peso corporal entre as gerações de várias espécies. Entre estas, a tilápia do Nilo Oreochromis niloticus apresentou um ganho genético de 11,9% por geração, cerca de 219 g (Hamzah et al., 2014); a espécie Cyprinus carpio, conhecida como carpa comum, teve um ganho de 18,2% por geração, sendo que este valor equivale a 533 g (Ninh et al., 2013), enquanto que na espécie Oncorhynchus mykiss, conhecida como truta arco- íris, o ganho foi de 7,0 %, aproximadamente 2.7 kg por geração (Kause et al., 2005). Além das características relacionadas ao ganho de peso, o conhecimento sobre o sexo dos indivíduos é de grande importância na piscicultura, pois além de auxiliar no controle do sistema de acasalamentos, também a exploração de apenas um sexo é mais vantajosa em algumas espécies (Dong et al., 2019a). Outro benefício do controle na identificação do sexo dos indivíduos seria para a formação de lotes de produção monosexo, que resultaria na contenção de gastos energéticos com a atividade reprodutiva, na obtenção de uniformidade de tamanho na colheita, na redução dos efeitos da maturação sexual, bem como na aparência e na qualidade da carne (Beardmore et al., 2001). 4 Entretanto, existem espécies que não apresentam um dimorfismo sexual bem definido e as ferramentas moleculares são utilizadas para auxiliar na determinação do sexo. Neste sentido, alguns estudos foram realizados com o intuito de identificar os genes que determinam o sexo em peixes, tendo já resultado na caracterização de vários genes, como exemplo há o gene amhy na espécie Odontesthes hatcheri (Hattori et al., 2012); do gene GsdfY em Oryzias luzonensis (Myosho et al., 2012); e do gene DMY/dmrt1bY em Oryzias latipese (Matsuda et al., 2002, 2003). Partindo desta questão, a espécie de peixe utilizada no presente trabalho é uma espécie nativa conhecida popularmente como pacu (Piaractus mesopotamicus) que possui grande aplicação na piscicultura (Santos et al., 2012). Contudo, sua utilização em programas de melhoramento genético ainda apresenta algumas limitações e necessita de investimentos mais significativos. Considera-se, pois, que seria de grande importância o desenvolvimento de variedades com características voltadas à obtenção de maior peso corporal e com um sistema de determinação sexual bem conhecido, visto que esta espécie não possui características fenotípicas diferenciais relacionadas ao sexo. Genômica na piscicultura Com o desenvolvimento da genômica e a identificação de um denso painel de SNPs através dos avanços das tecnologias NGS (Next Generation Sequencing), foi possível a identificação de milhares de marcadores moleculares em um curto espaço de tempo, ao mesmo tempo que foi possível a obtenção de produtos com preço cada vez mais reduzido e maior acurácia no sequenciamento (Kumar et al., 2017). Entretanto, apesar do expressivo progresso verificado na área da genômica, este avanço não foi completamente acompanhado pela geração de dados referentes às espécies de peixes Neotropicais, sendo observada uma situação aquém das possibilidades quanto à descrição de marcadores SNPs. Assim, algumas referências encontradas com relação à descrição desses marcadores moleculares referem-se ao estudo com o híbrido Amphilophus spp (Recknagel et al., 2013), com o tambaqui Colossoma macropomum (da Silva Nunes et al., 2017) e com o pacu (Mastrochirico-Filho et al., 2016). Entre as diversas metodologias existentes para a identificação dos SNPs, destaca-se o RADseq (Restriction Site Associated DNA- Sequencing) (Baird et al., 2008). O RADseq é uma tecnologia de sequenciamento de DNA associada aos sítios de restrição e à fragmentação mecânica, sendo a análise desenvolvida a partir de uma grande quantidade de amostras formando um pool que pode ser sequenciadas de uma só vez (Andrews et al., 2016). Porém, 5 uma variação chamada de ddRADseq (Double digest RADseq) é caracterizada pelo uso de dupla restrição enzimática, pode resultar em alta capacidade de multiplexação e apresentar maior confiabilidade no tamanho dos RADtags obtidos (Peterson et al., 2012). Com a implementação dos marcadores moleculares nos programas de melhoramento genético, as estratégias convencionais de seleção tornaram-se mais eficientes, promovendo a possibilidade de maiores ganhos genéticos nas características de interesse econômico (Sonesson et al., 2012), podendo ser realizado através da identificação dos loci de característica quantitativa (QTLs) (Rosa et al., 2013). Existem duas principais estratégias para a descoberta dos QTLs, a tradicional (mapeamento de ligação) e o GWAS (estudo de associação genômica ampla). A primeira metodologia explora a diferença alélica entre apenas dois parentais e geralmente identifica uma baixa quantidade de QTL devido à baixa taxa de recombinação e a dificuldade em avaliar uma grande quantidade de loci. (Zhu et al., 2008). A segunda abordagem indica os SNPs associados com características de interesse através de um denso painel de SNPs e faz a correlação entre marcador e o loci com base no desequilíbrio de ligação (LD), dessa forma este processo identifica a região do genoma (QTL) em que esses SNPs estão inseridos (Kijas et al., 2014). A vantagem do GWAS é poder amostrar inúmeros loci, identificar diferentes níveis de recombinação (Yu et al., 2008) e testar várias características ao mesmo tempo, dessa forma um grande número de regiões pode ser associado. O estudo de associação genômica tem sido utilizado para várias características economicamente importantes para a aquicultura em espécies modelos e não-modelos, incluindo características de crescimento (Neto et al., 2019; Yu et al., 2019., Yang et al., 2020, Shi et al., 2020), resistência a doenças (Barría et al., 2019, Wang et al., 2019; Zhou et al., 2019), loci e genes candidatos relacionados a determinação sexual (Gabián et al., 2019; Yossa et al., 2019; Wang et al., 2019), entre outros. Os resultados obtidos do mapeamento QTL e GWAS são aplicadas através do MAS (seleção assistida por marcadores) e GS (seleção genômica). Como exemplo, atualmente, vários QTLs são comercializados pela empresa norueguesa Aquagen de salmonídeos em germoplasma qualificado, livres de diversas doenças, sem a síndrome cardiomiopática e também com melhor pigmentação de filé (Aquagen, 2014, 2015a, 2015b). E ainda, se tratando de salmonídeos, um caso que se destacou na aquicultura foi a utilização do mapa de QTL em salmão do atlântico para seleção da resistência ao IPN – Necrose Pancreática Infeciosa (Houston et al., 2008; Moen et al., 2009). Com a implementação do MAS, a salmonicultura europeia reduziu em 75,00% os 6 focos da doença e tem garantido atualmente uma economia anual de 24 milhões de libras no Reino Unido (Houston et al., 2008; Moen et al., 2009). Entretanto, para a identificação de QTLs é necessário o conhecimento prévio sobre a localização dos marcadores moleculares no genoma, tornando essencial a construção de um mapa de ligação (Moen et al., 2004). Os mapas de ligação além de auxiliar no estudo de associações genômicas, também possibilitam a localização de genes, estudos comparativos de sintenia genômica, cobertura e análise completa de genomas, além de gerar informações a respeito da arquitetura genética e pleiotropia (Guo et al., 2007; Li et al., 2016). A função dos mapas genéticos é ordenar os marcadores moleculares em um cromossomo ou em grupos de ligação, sendo que a distância entre eles é estimada a partir da frequência da taxa de recombinação (Xu et al., 2008). Para espécies de peixes nativos atualmente existe apenas o mapa de ligação desenvolvido para a espécie Colossoma macropomum (Silva Nunes et al., 2017). Além da identificação de QTLs, a utilização da genômica pode ter diversas aplicações de interesse zootécnico que são de difícil medição ou nas quais o fenótipo demora para se expressar; entre estes casos podem ser citados a resistência a doenças (Houston et al., 2008), o acompanhamento do crescimento corporal (Gutierrez et al., 2015), as características de formato do corpo (Dong et al., 2019b). A utilização desta metodologia também auxilia o estabelecimento de populações de base para utilização em programas de melhoramento genético, otimiza a diversidade genética, controla a consanguinidade das gerações subsequentes produzidas (Fernández et al., 2014) e prever valores genômicos de reprodução para caracteres de interesse (Yoshida et al., 2018). Pode ser considerada ainda a utilização dos marcadores moleculares em estudos evolutivos, assim como em estudos da genética de populações e filogenia (Bernatchez et al., 2016) e no conhecimento da biologia e estrutura do genoma (Yáñez et al., 2015). A implementação das ferramentas moleculares em programas de melhoramento genético proporciona expressivos avanços com relação a aumento nos ganhos genéticos. Considera-se, assim, que a aplicação das técnicas genômicas no estudo das espécies nativas pode determinar um desenvolvimento acelerado nos processos de produção, bem como auxiliar nos estudos sobre a evolução e biologia das espécies utilizadas na piscicultura. 7 Caracterização da espécie Piaractus mesopotamicus A espécie Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887) (Figura 1) componente da família Serrasalmidae (Calcagnotto et al., 2005; Oliveira et al., 2011) é um peixe conhecido popularmente como pacu-caranha, caranha, pacu-guaçu, ou simplesmente pacu, sendo nativa das bacias dos rios Paraná, Paraguai e Uruguai, com especial distribuição nas planícies alagadas da região Centro-Oeste, no Pantanal do Mato Grosso (Petrere Jr, 1989; Resende, 2003). Os exemplares desta espécie possuem corpo ovalado, estreito e robusto, com dorso cinza escuro e ventre amarelado (Britski et al., 2007), sendo que existem relatos de exemplares que atingiram 82,0 cm de comprimento total e peso de 18,5 kg (Moreira et al., 2001). No ambiente natural é comum encontrar exemplares com 7 kg que atingem entre 60 a 80 cm de comprimento total (Britski et al., 2007). A primeira maturidade sexual ocorre aos 3 anos, com duração média até os 8 anos, sendo caracterizados por um período de reprodução que atinge o seu ápice nos meses de novembro a janeiro, época de temperaturas mais altas e maior incidência de chuvas (Bernardino, 1999). Na estação chuvosa, o pacu permanece nas áreas de inundação onde se alimenta principalmente de itens de origem vegetal; porém, durante a seca permanece no leito dos rios, local onde pode haver maior disponibilidade de alimento (Menton, 1989; Urbinati et al., 2013). Figura 1. Imagem representativa da espécie Piaractus mesopotamicus Holmberg, 1887 (pacu). Fonte: Britski et al., 2007 O pacu é uma das espécies de peixes mais estudadas no Brasil, principalmente com relação aos aspectos de reprodução, larvicultura, engorda, nutrição e parasitologia (Urbinati et al., 2013). Sua criação com fins comerciais vem crescendo principalmente devido características como uma dieta com menor exigência de proteínas, bom sabor da carne, baixo 8 custo de manutenção, boa resistência a patógenos, baixa exigência quanto à qualidade da água, alta adaptabilidade ao cultivo em tanques e viveiros, além de ser uma das espécies mais apreciadas na pesca esportiva (Fernandes et al., 2000; Abimorad & Carneiro, 2004; Jomori et al., 2008). Tais características levaram o pacu a ser a quarta espécie nativa mais produzida na aquicultura continental nacional (IBGE, 2017). De acordo com publicação da FAO (2018), a maior produção nacional do pacu ocorreu em 2010, com 21.245 toneladas. No ano de 2018, de acordo com o IBGE (2019), o pacu e seu híbrido patinga (fêmea P. mesopotamicus x macho de P. brachypomus), foram relacionados como ocupantes do quarto maior renda de produção de pescados entre as espécies nativas, com aproximadamente 11.600 toneladas. Ainda em relação à piscicultura, a espécie P. mesopotamicus também tem considerável importância econômica para a aquicultura de outros países da América do Sul como Colômbia, Peru, Venezuela e Argentina, bem como de países asiáticos como China, Mianmar, Tailândia e Vietnã (Flores Nava, 2007; Honglang, 2007; FAO, 2010). Em relação à pesca extrativa, o último dado referente à estatística pesqueira continental nacional foi referente ao ano de 2011, no qual o pacu ocupou o sexto lugar no ranking de espécies mais pescadas, representando, juntamente com a pescada, aproximadamente 10,00% do total de capturas (MPA, 2013). No entanto, a partir de 2011, a maior parte das informações obtidas sobre estatística pesqueira é proveniente de dados regionais, aos quais pode ser citado os dados coletados e analisados por meio do Sistema de Controle da Pesca de Mato Grosso do Sul SCPESCA/MS. No ano de 2016, o pacu ocupou o terceiro lugar como a espécie mais pescada (52t - 13,80%), para os setores comercial e esportivo (Catella et al., 2017). Além da dificuldade enfrentada pela sobrepesca, a espécie também tem sentido os efeitos da fragmentação de seu habitat, causado pela construção de sucessivas barragens ao longo dos cursos dos rios (Agostinho et al., 2005) e, em consequência do impacto sofrido pelas populações naturais, a espécie foi classificada como “quase ameaçada” no ano de 2014, de acordo com o Decreto N° 60.133 (São Paulo, 2014). Por isso, a reprodução desta espécie em cativeiro tem sido uma boa alternativa para suprir a demanda do mercado e reduzir o impacto nos estoques das populações naturais. Embora sendo o pacu uma espécie bastante estudada e importante na aquicultura brasileira, ainda são escassas as informações relativas à genômica e ao melhoramento genético aplicados no seu cultivo. Considera-se, portanto, que os resultados obtidos no presente estudo como a prospecção de SNPs, desenvolvimento do primeiro mapa genético da espécie e o 9 GWAS para o peso corporal e identificação do sexo dos indivíduos, certamente se constituirão em ferramentas importantes para um manejo biológico adequado e para o melhoramento genético da espécie. OBJETIVOS Objetivo geral O presente estudo teve como objetivo a prospecção e aplicação de marcadores SNPs para a construção de um mapa genético e estudo de associação genômica ampla (GWAS), para testar a correlação com o peso corporal e determinação sexual na espécie Piaractus mesopotamicus. Objetivos específicos • caracterização dos marcadores SNPs provenientes das reads do ddRADseq para os parentais e dos indivíduos da geração F1; • desenvolvimento de um mapa genético de SNPs para esta espécie; • estudo de associação genômica ampla (GWAS) as características de peso corporal e determinação do sexo nos exemplares; • identificação dos genes candidatos próximos aos QTLs correlacionados com as características de peso corporal e determinação do sexo citadas acima. MATERIAIS E MÉTODOS Os materiais e métodos utilizados no presente trabalho serão descritos na parte específica de cada capítulo dos resultados. 10 CONSIDERAÇÕES FINAIS Este trabalho constituiu um dos primeiros passos no desenvolvimento de ferramentas genômicas para espécies de peixes Neotropicais, com foco especial no pacu, Piaractus mesopotamicus, de grande importância econômica para a piscicultura nacional. Foi formado um denso painel de marcadores moleculares, com a caracterização de mais de 6.000 SNPs que poderão servir de suporte para diferentes abordagens biológicas envolvendo programas de melhoramento genético, revelação de mecanismos evolutivos e de conservação desta espécie e de espécies aparentadas. Esta ferramenta genômica permitiu a construção de um rico mapa genético que foi imprescindível para realizar associações entre o marcador e características fenotípicas (GWAS) e, a partir desta, proceder à identificação de QTLs. Os resultados obtidos com a identificação dos QTLs evidenciaram a natureza poligênica de características relacionadas ao peso corporal dos indivíduos. Em relação ao crescimento esse resultado já era esperado, pois trata-se de uma característica tipicamente controlada por vários genes (Tsai et al., 2015) na maioria dos organismos. Em relação aos mecanismos envolvidos na determinação sexual desta espécie foram identificadas muitas variantes com pequenos efeitos para a formação desta característica, de conformidade com referências existente para outras espécies de peixes (Yoshida et al., 2018). Porém, no caso específico da espécie aqui estudada, trata-se da primeira constatação desta natureza. Contudo, considera-se que este caminho de pesquisa aberto com as análises realizadas deve ser complementado com a realização de mais estudos para comprovar essa questão. Além disso, os loci identificados podem ser utilizados como um critério complementar para a identificação de indivíduos candidatos a processos de seleção, aumentando a acurácia nas avaliações genéticas dos indivíduos (Resende et al., 2012) O painel de SNPs produzido certamente para esta espécie poderá ser utilizado para identificar loci relacionados a diversas características de interesse e caso seja detectada uma forte associação entre o marcador e a característica alvo, com um alto valor de associação genética, os indivíduos poderão ser selecionados diretamente pelo genótipo. Tal metodologia possibilitaria, então, a realização do processo de seleção de uma forma mais precoce e acurada, do mesmo modo como foi descrito no trabalho de Houston et al. (2008) para a seleção de peixes 11 resistentes à uma doença identificada como necrose pancreática infeciosa (IPN). O mapa de ligação resultante das análises realizadas com estes marcadores nas progênies resultantes dos cruzamentos realizados envolvendo casais de reprodutores desta espécie proporcionou uma 12 abordagem mais direta do genoma, com possibilidades de aplicação direta nos estoques desta espécie. Os genes candidatos encontrados nas regiões identificadas neste trabalho também podem explicar e/ou mostrar a sua influência sobre o fenótipo. Entendendo como eles funcionam e como exercem sua influência nas características de interesse zootécnico, certamente serão de grande auxílio nos programas de melhoramento genético. 13 REFERÊNCIAS GERAIS Abimorad EG & DJ Carneiro. 2004. Métodos de coleta de fezes e determinação dos coeficientes de digestibilidade da fração protéica e da energia de alimentos para o pacu, Piaractus mesopotamicus (Holmberg, 1887). Revista Brasileira de Zootecnia. 33: 1101-1109. Agostinho AA, Thomaz SM, Gomes LC. 2005. 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Dalai Lama RESUMO ABSTRACT INTRODUÇÃO GERAL Melhoramento genético na piscicultura Genômica na piscicultura OBJETIVOS Objetivos específicos MATERIAIS E MÉTODOS CONSIDERAÇÕES FINAIS REFERÊNCIAS GERAIS