UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS, LETRAS E CIÊNCIAS EXATAS CAMPUS DE SÃO JOSÉ DO RIO PRETO JUPYRACYARA JANDYRA DE CARVALHO BARROS Estudo in situ de culturas autóctones de Lactobacillus helveticus autolíticos sobre a dinâmica bioquímica e sensorial do queijo Parmesão São José do Rio Preto-SP 2009 JUPYRACYARA JANDYRA DE CARVALHO BARROS Estudo in situ de culturas autóctones de Lactobacillus helveticus autolíticos sobre a dinâmica bioquímica e sensorial do queijo Parmesão Tese apresentada para obtenção do título de Doutor em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de Ciência e Tecnologia de Alimentos junto ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus São José do Rio Preto. Orientadora: Profa. Dra. Ana Lúcia Barretto Penna São José do Rio Preto - SP 2009 Barros, Jupyracyara Jandyra de Carvalho. Estudo in situ de culturas autóctones de Lactobacillus helveticus autolíticos sobre a dinâmica bioquímica e sensorial do queijo Parmesão / Jupyracyara Jandyra de Carvalho Barros. - São José do Rio Preto: [s.n.], 2009. 106 f.: il.; 30 cm. Orientador: Ana Lúcia Barretto Penna Tese (doutorado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas 1. Tecnologia de alimentos. 2. Queijo parmesão - Indústria. 3. Lactobacillus helveticus. 4. Queijo parmesão - Maturação. I. Penna, Ana Lúcia Barretto. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título. CDU - 637.354.64 Ficha catalográfica elaborada pela Biblioteca do IBILCE Campus de São José do Rio Preto - UNESP BANCA EXAMINADORA ___________________________________ Profa. Dra. Ana Lúcia Barretto Penna Universidade Estadual Paulista - UNESP Orientadora ____________________________________ Profa. Dra. Daise Aparecida Rossi Universidade Federal de Uberlândia - UFU Membro da Banca ____________________________________ Profa. Dra. Izildinha Moreno Instituto de Tecnologia de Alimentos - ITAL Membro da Banca ____________________________________ Profa. Dra. Neuza Jorge Universidade Estadual Paulista - UNESP Membro da Banca __________________________________ Prof. Dr. Roger Darros Barbosa Universidade Estadual Paulista - UNESP Membro da Banca São José do Rio Preto - SP 2009 Este trabalho foi desenvolvido com o auxílio de profissionais qualificados de diferentes instituições. O projeto foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). As culturas de Lactobacillus helveticus autóctones foram cedidas pela Prof. Dra. Daise Aparecida Rossi da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Federal de Uberlândia (FAMEV - UFU). Os queijos foram fabricados no Departamento de Engenharia de Alimentos da Universidade Federal de Goiás, sob a orientação do Prof. Dr. Celso José de Moura. As análises microbiológicas e físico-químicas foram realizadas no Laboratório de Tecnologia de Leite e Derivados do Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos (DETA - UNESP). O perfil eletroforético foi realizado no Laboratório de Bioquímica da UFU e Laboratório Biogenetics® - Uberlândia, sob a orientação do Prof. Dr. Luiz Fernando Moreira Izidoro e Prof. MS. Gismar Vieira Silva, respectivamente. Discentes do Programa de Pós-graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos (UNESP) participaram como provadores nos testes sensoriais. As análises das frações voláteis foram realizadas no Laboratório de Química do Departamento de Química (UNESP), sob a orientação do Prof. Dr. Maurício Bóscolo. A análise da microestrutura foi realizada no Laboratório de Microscopia e Microanálise (UNESP) sob a orientação do Prof. Dr. Sebastião Roberto Taboga (Microscopia Eletrônica de Transmissão - MET), Prof. Dra. Lilian Ravazzi (Microscopia Eletrônica de Varredura - MEV) e técnico Luis Roberto Faleiros Júnior (MET/MEV). “Se você teve a oportunidade de conhecer este trabalho, possivelmente seja por dois motivos. Talvez, você seja uma das pessoas sábias de mente e coração que Deus, em sua infinita justiça e bondade, ofertou-me para inspirar-me na busca da minha evolução. Por outro lado, você utilize-o como consulta. De qualquer modo, desejo-lhe que as mesmas bênçãos que envolveram-me em cada momento na execução deste trabalho possam ser redobradas e direcionadas a você e a todos que lhe acompanham nesta caminhada. Tenha uma ótima leitura!”. Dedico Deus, Manoel Lopes e Joana Dalte Caminhar sabendo que tudo fluirá em favor da nossa própria Evolução é uma das formas mais sábias de utilizar a mente. Oferecer ao próximo a oportunidade de ascensão é a atitude mais singela de quem está sempre Evoluindo. Grata pelos inúmeros gestos de abnegação, carinho e cumplicidade, sempre amparados pela Sabedoria Divina. Amo vocês! Ofereço Alaurinda Cristiani, Amélia Sanches (in memorian) Ana, Carlos Andrade, Carlos Eduardo, Carlos Henrique (in memorian), Eustáquio Antônio, Fabiana Almeida, João Eduardo, Jorge Luiz, Júlio César, Pedro, Roseâmely, Zenon. Agradecimentos Adriana Rodrigues Ribeiro (in memorian), Adriano Kultvak (in memorian), Adrielle Oliveira, Aline de Grandi, Aline Teodoro, Alysson Diniz, Amigos do Centro Espírita Francisco de Assis (CEFA, São José do Rio Preto), Amanda Rodrigues Ribeiro, Ana Lúcia Barretto Penna, Ana Paula Maciel, Ana Ribeiro, Analice Azevedo, Andaluza, André Nascentes, Andréa Rodrigues Ribeiro, Antônio Roberto di Marco, Aparecida Regina Diniz, Azrael, Caius Lucius, Carlos Henrique Carvalho, Carmélia Silva, Cássia Malacrida, Catharina Callochi, Célia Landi Franco, Celso José de Moura, Cláudia Ribeiro, Daise Aparecida Rossi, Daniel Cardoso, Débora, Demétrius, Denise Andreo, Denise Silva, Denise Soncini, Departamento de Engenharia e Tecnologia de Alimentos (IBILCE/UNESP), Departamento de Engenharia de Alimentos (UFG/Goiânia/GO), Departamento de Tecnologia e Ciência dos Alimentos (Universidade Federal de Santa Maria), Edison Luis Pinceli, Elfa Nattes Costa, FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), Fernanda Seixas, Fernando Leite Hoffmann, Francielle Marques, Franscesca Dutra, Francisco Fernandes dos Reis, Gilmar Toniolo, Ginaldo Vieira, Gismar Vieira, Gislaine de Oliveira Alves Paulino, Gleison Silva, Hélio Leonardo, Henrique Roitt. Janaína Reis, Jaqueline, João Cláudio Thoméo, João Jesuíno Demílio, José Onofre, Julyanna Andrade, Laboratório Biogenetics Tecnologia Molecular Ltda (UDI), Laboratório de Bioquímica (IBILCE/UNESP), Laboratório de Biotecnologia Animal Aplicada (LABIO/UFU), Laboratório de Microscopia e Microanálise (IBILCE/UNESP), Laticínio Sonata (Votuporanga/SP), Laticínio Tirolez (Arapuá/MG), Larissa, Letícia Silva, Lidimara Caetano, Lilian Ravazzi, Liliane Pinheiro, Luana Bogno, Luciana Beatriz Carvalho, Lugiel, Luis Faleiros, Luiz Carlos Camolizi, Luiz Carlos Muniz, Luiz Fernando Moreira Izidoro, Marcel Campos, Márcio Roberto de Freitas, Maurício Bóscolo, Maria de Lourdes Rodrigues Ribeiro, Mieko Kimura, Narciso Silva, Neila Richards, Netinho, Neuza Jorge, Newton Mayer, Odécio Silva, Paulo Roberto dos Santos, Pedro Romanneli, Pedro Silva, Priscila Ângelo, Raquel Gutierrez, Renata Prado (in memorian), Rimar Diniz, Roberto da Silva, Roberto Diógenes, Roger Darros, Sabrina Casarotti Rodrigo Custódio, Ronaldo Rosa, Rosana Ferro, Roseli Francisco, Rosemar Brena, Salvador Ribeiro, Samir, Sebastiana Soares, Sebastião Taboga, Shirleny Romualdo, Silvia Kazama, Silvio Roberto Brandatte, Simara Pícoli, Sônia de Fátima, Sueli Gonçalves, Sulamita, Sofia, Tânia Gonçalves, Tharlisson Prado, Vania Batista, Vidiany Santos, Vera Lúcia Perussi, Vivyanne Melo. O crescimento espiritual, humano e profissional será efetivado em sua plenitude, apenas se permitirmos a nós mesmos a troca de saberes. Sou grata pelo conhecimento adquirido e pelas vivências ofertadas. Desejo que a Essência de cada um de vocês possa fluir livremente; sobretudo, anseio que cada uma destas Essências Amigas, amparadas pela Centelha Divina, possam ser lançadas ao mundo, para inspirar novos ares. Jupyracyara Jandyra de Carvalho Barros SUMÁRIO Página LISTA DE FIGURAS................................................................................................... i LISTA DE TABELAS.................................................................................................. iii RESUMO GERAL........................................................................................................ iv GENERAL ABSTRACT ............................................................................................. v INTRODUÇÃO GERAL............................................................................................. 1 CAPÍTULO I - Aspectos tecnológicos e bioquímicos envolvidos na fabricação do queijo Parmesão............................................................................................................ 3 Resumo........................................................................................................................... 4 Abstract........................................................................................................................... 5 1. Introdução................................................................................................................... 6 2. Breve caracterização da variedade Parmesão............................................................. 6 3. Aspectos tecnológicos da fabricação do queijo Parmesão......................................... 7 3.1 Microbiota oportunista como bioindicador da qualidade sanitária do queijo........ 9 3.2 Culturas láticas e sua aplicabilidade na indústria queijeira................................... 11 3.2.1 Mecanismo de ação da lactato desidrogenase (LDH) durante a lise de bactérias láticas............................................................................................................... 13 3.3 Evolução dos componentes químicos no queijo Parmesão durante a estocagem.. 15 3.3.1 Desenvolvimento do sabor e aroma lipolítico no queijo Parmesão............... 17 3.4. Análise da microestrutura de queijos por diagnóstico de imagens....................... 18 3.5 Atributos sensoriais em queijos maturados........................................................... 19 4. Considerações finais................................................................................................... 21 5. Referências Bibliográficas.......................................................................................... 21 CAPÍTULO II - Avaliação do aspecto sanitário e microbiota lática durante a maturação do queijo Parmesão................................................................................... 32 Sumário........................................................................................................................... 33 Abstract........................................................................................................................... 34 1. Introdução................................................................................................................... 35 2. Material e métodos..................................................................................................... 37 2.1 Viabilidade de bioindicadores de contaminação e lactobacilos termófilos no leite pasteurizado e queijo maturado.............................................................................. 38 2.2 Análise estatística dos dados experimentais.......................................................... 40 3. Resultados e discussão................................................................................................ 41 3.1 Qualidade sanitária do leite pasteurizado e do queijo Parmesão maturado............ 41 3.2 Viabilidade de lactobacilos termófilos durante o período de maturação do Parmesão......................................................................................................................... 42 4. Conclusões.................................................................................................................. 45 5. Referências Bibliográficas.......................................................................................... 46 CAPÍTULO III - Efeito de Lactobacillus helveticus autóctones com diferentes perfis autolíticos sobre a evolução dos componentes químicos no Parmesão maturado....................................................................................................................... 50 Resumo........................................................................................................................... 51 Abstract........................................................................................................................... 52 1. Introdução................................................................................................................... 52 2. Material e métodos..................................................................................................... 54 2.1 Caracterização físico-química dos queijos............................................................ 55 2.2 Atividade da lactato desidrogenase (LDH) como marcador da lise das culturas láticas no queijo Parmesão ............................................................................................. 55 2.3 Perfil eletroforético em gel de poliacrilamida (UREA - PAGE)............................ 56 2.4 Análise estatística.................................................................................................. 56 3. Resultados e discussão................................................................................................ 57 3.1 Análises físico-químicas do leite pasteurizado e do queijo Parmesão maturado......................................................................................................................... 57 3.2 Evolução dos componentes químicos durante a proteólise do queijo Parmesão......................................................................................................................... 61 3.3 Atividade da lactato desidrogenase no queijo Parmesão maturado....................... 66 3.4 Proteólise da caseína como marcador da maturação do queijo Parmesão............. 67 4. Conclusões.................................................................................................................. 71 5. Referências bibliográficas.......................................................................................... 72 CAPÍTULO IV - Compostos voláteis, perfil sensorial e análise da microestrutura do queijo Parmesão fabricado com Lactobacillus helveticus autóctones com diferentes perfis autolíticos .............................................................. 79 Resumo........................................................................................................................... 80 Abstract........................................................................................................................... 81 1. Introdução................................................................................................................... 82 2. Material e métodos..................................................................................................... 84 2.1 Perfil dos compostos voláteis................................................................................ 85 2.2 Avaliação sensorial................................................................................................ 85 2.3 Análise qualitativa da microestrutura dos queijos maturados............................... 86 2.4 Análise estatística.................................................................................................. 87 3. Resultados e discussão................................................................................................ 88 3.1. Identificação de compostos voláteis...................................................................... 88 3.2. Perfil sensorial....................................................................................................... 91 3.3 Microestrutura......................................................................................................... 94 4. Conclusões.................................................................................................................. 97 5. Referências bibliográficas…………………………………………………….......... 97 CONCLUSÃO GERAL…………………………………………………………........ 103 PRODUÇÕES CIENTÍFICAS REFERENTES À TESE……………………......... 104 1. Introdução................................................................................................................. 104 2. Trabalho aceito para publicação em periódico...................................................... 104 3. Trabalhos submetidos à publicação em periódicos............................................... 104 4. Trabalhos apresentados em eventos científicos e publicados em anais .............. 105 5. Resultados experimentais para futuras publicações............................................. 106 i LISTA DE FIGURAS CAPÍTULO II - Avaliação do aspecto sanitário e microbiota lática durante a maturação do queijo Parmesão Figura 1. Fluxograma de fabricação do queijo Parmesão experimental.......................... 38 Figura 2. Comportamento das culturas de lactobacilos termófilos nos queijos Parmesão A, Cc1, D1 e E5 maturados a 18 oC durante 180 dias....................................... 44 CAPÍTULO III - Efeito de Lactobacillus helveticus autóctones com diferentes perfis autolíticos sobre a evolução dos componentes químicos no queijo Parmesão maturado Figura 1. Evolução da acidez titulável (%) no queijo Parmesão maturado a 18 oC durante 180 dias............................................................................................................... 62 Figura 2. Evolução do teor de tirosina (mg.100g-1) no queijo Parmesão maturado a 18 oC durante 180 dias..................................................................................................... 63 Figura 3. Evolução do teor de triptofano (mg.100g-1) no queijo Parmesão maturado a 18 oC durante 180 dias..................................................................................................... 64 Figura 4. Evolução do índice de profundidade da maturação (%) no queijo Parmesão maturado a 18 oC durante 180 dias................................................................................... 64 Figura 5. Evolução do índice de extensão da maturação (%) no queijo Parmesão maturado a 18 oC durante 180 dias................................................................................... 65 Figura 6. Atividade da enzima LDH na matriz do queijo Parmesão maturado a 18 oC durante 180 dias................................................................................................................ 66 Figura 7. Microheterogeneidade das frações de caseína insolúveis em pH4,6 em gel UREA-PAGE obtida em queijo Parmesão fabricado com culturas A, Cc1, D1 e E5 e maturado a 18 oC durante 180 dias. CN: caseína; Linha 1-6: Parmesão maturado por 30, 60, 90, 120, 150 e 180 dias; f*-*:clivagem indeterminada; 1P-9P: número de grupo fosfato..................................................................................................................... 68 CAPÍTULO IV - Compostos voláteis, perfil sensorial e análise da microestrutura do queijo Parmesão fabricado com Lactobacillus helveticus autóctones com diferentes perfis autolíticos Figura 1. Cromatograma das amostras de queijo Parmesão fabricado com as culturas de Lactobacillus helveticus A, Cc1, D1 e E5, maturado a 18 oC por 60 dias.................... 89 Figura 2. Cromatograma das amostras de queijo Parmesão fabricado com as culturas de Lactobacillus helveticus A, Cc1, D1 e E5, maturado a 18 oC por 120 dias.................................................................................................................................... 90 Figura 3. Cromatograma das amostras de queijo Parmesão fabricado com as culturas de Lactobacillus helveticus A, Cc1, D1 e E5, maturado a 18 oC por 180 dias.................................................................................................................................... 90 Figura 4. Perfil sensorial de amostrass de queijo Parmesão fabricado com as culturas de Lactobacillus helveticus A, Cc1, D1 e E5, maturado a 18 oC aos 180 dias................................................................................................................................... 93 ii Figura 5 - Microestrutura do queijo Parmesão maturado a 18 oC (a, b - queijo Parmesão fabricado com a cultura A maturado por 30 (16.700x) e 60 dias (21.560x); c - queijo Parmesão fabricado com a cultura Cc1 maturado por 60 dias (2.784x); d, f, g, i - queijo Parmesão fabricado com a cultura D1 maturado por 90 (27.000x), 120 (7.750x), 150 (4.646x) e 180 dias (4.646x); e, h - queijo Parmesão fabricado com a cultura E5 maturado por 90 (10.000x) e 150 dias (4.646x), respectivamente; Ba: bacilo; G: glóbulos de gordura; P: matriz protéica)......................................................... 95 Figura 6 - Microestrutura do queijo Parmesão fabricado com a cultura autóctone E5 e maturado a 18 oC (a - 30 dias 641x, setas: pontos de inserção dos glóbulos de gordura; b -30 dias 370x; c: 60 dias 648x; d - 60 dias 1.390x; e - 60 dias 1.090x; f - 60 dias 779x; Cr: cristais; G: glóbulos de gordura; P: matriz protéica)....................................... 96 iii LISTA DE TABELAS CAPÍTULO II - Avaliação do aspecto sanitário e microbiota lática durante a maturação do queijo Parmesão Tabela 1. Viabilidade e pH de Lactobacillus helveticus na cultura (LDR12%) incubada a 42 oC por 16 horas, utilizada para fabricação do queijo Parmesão............................... 43 CAPÍTULO III - Efeito de Lactobacillus helveticus autóctones com diferentes perfis autolíticos sobre a evolução dos componentes químicos no queijo Parmesão maturado Tabela 1. Características* físico-químicas do leite pasteurizado empregado no processamento do queijo Parmesão.................................................................................. 57 Tabela 2. Caracterização* físico-química do queijo Parmesão fabricado com a cultura A e maturado a 18 oC durante 180 dias............................................................................ 58 Tabela 3. Caracterização* físico-química do queijo Parmesão fabricado com a cultura Cc1 e maturado a 18 oC durante 180 dias......................................................................... 58 Tabela 4. Caracterização* físico-química do queijo Parmesão fabricado com a cultura D1 e maturado a 18 oC durante 180 dias........................................................................... 59 Tabela 5. Caracterização* físico-química do queijo Parmesão fabricado com a cultura E5 e maturado a 18 oC durante 180 dias........................................................................... 59 Tabela 6. Análise densitométrica (%) das frações da caseína do queijo Parmesão maturado a 18 oC durante 180 dias................................................................................... 69 CAPÍTULO IV - Compostos voláteis, perfil sensorial e análise da microestrutura do queijo Parmesão fabricado com Lactobacillus helveticus autóctones com diferentes perfis autolíticos Tabela 1 - Relação dos descritores sensoriais e referências de escala adotados na avaliação sensorial do queijo Parmesão........................................................................... 86 Tabela 2. Compostos voláteis* identificados de amostras de queijo Parmesão fabricado com culturas de Lactobacillus helveticus, maturado a 18 oC por 180 dias...... 89 Tabela 3. Notas* atribuídas pelos provadores para as amostras de queijo Parmesão fabricado com as culturas de Lactobacillus helveticus A, Cc1, D1 e E5, maturado a 18 oC por 90, 120 e 150 dias............................................................................................ 92 iv RESUMO GERAL O uso de culturas de L. helveticus isoladas de soro-fermento na fabricação do queijo Parmesão pode representar a preservação da biodiversidade, e também uma alternativa na redução de custos dos laticínios. Esta economia, combinada com a melhoria da qualidade tecnológica pode representar produtos com melhor aroma, textura e sabor e menor custo aos consumidores. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de culturas autóctones isoladas de soro-fermento na fabricação do queijo Parmesão. Os queijos foram produzidos com Lactobacillus helveticus com perfil autolítico elevado (Cc1, E5) e perfil autolítico intermediário (A, D1) maturados a 18 oC durante 180 dias. Mensalmente, foram avaliados a qualidade sanitária, viabilidade de bactérias láticas, perfil físico-químico, atividade da lactato desidrogenase (LDH), perfil eletroforético e análise da microestrutura por microscopia eletrônica de transmissão (MET). A microestrutura do queijo E5 maturado por 30 e 60 dias foi avaliada também em microscopia eletrônica de varredura (MEV). A presença de compostos aromáticos foi avaliada no queijo maturado por 60, 120 e 180 dias usando cromatógrafo gasoso, após prévia concentração das substâncias voláteis por head- space. Análise descritiva quantitativa (ADQ) foi empregada nas amostras maturadas por 90 a 180 dias. Todas as amostras de leite e queijo Parmesão atenderam aos padrões legais quanto aos bioindicadores de contaminação avaliados. Bactérias láticas apresentaram redução a partir de 90 dias de maturação. Houve aumento significativo nos teores de acidez, nitrogênio solúvel em pH 4,6 (NSpH4,6) e nitrogênio solúvel em ácido tricloroacético (NSTCA12%) em todas as amostras de queijo Parmesão ao longo de 180 dias de maturação. A maior hidrólise da caseína e liberação dos aminoácidos tirosina e triptofano foi obtida quando os queijos foram fabricados pelas culturas D1 e E5. Nestes queijos, a LDH permaneceu ativa até o período final de maturação. Em todos os tratamentos houve a degradação da αs1 caseína em αs1-I e αs1-II, sendo identificada também a degradação da β-caseína em γ1, γ2 e γ3 caseína. Ao longo da maturação foi registrada a presença de acetato de etila, acetona, n-butiraldeído e propanol em todos os queijos analisados, sem apresentar um perfil aromático claramente definido. A ADQ demonstrou semelhança no perfil sensorial dos queijos D1 e E5, com diferença do queijo fabricado com a cultura comercial, preferido sensorialmente. A microestrutura mostrou a interação entre as culturas láticas e os lipídeos em MET e de lipídios com a matriz protéica em MEV. Palavras chave: Parmesão, Lactobacillus helveticus autóctones, autólise, maturação, qualidade. v GENERAL ABSTRACT The use of cultures of L. helveticus isolated from natural whey starter in the production of Parmesan cheese can represent biodiversity preservation, and also an alternative in reducing costs to the dairy industry. These savings, combined with the improved technological quality may represent products with a better aroma, texture and taste and lower cost to consumers. This study aimed to evaluate the effect of autochthonous cultures isolated from natural whey starter in the production of Parmesan cheese. The cheeses were produced with added Lactobacillus helveticus with high autolitic profile (CC1, E5) and intermediary autolitic profile (A, D1) and ripened at 18oC during 180 days. Once a month, the sanitary quality, viability of lactic acid bacteria, physicochemical profile, the activity of lactate dehydrogenase (LDH), electrophoretic profile and transmission electronic microstructure (TEM) were analysed. The microstructure of cheese sample E5 ripened during 30 and 60 days was also evaluated using scanning electronic microstructure (SEM). The presence of aromatic compounds was evaluated in the ripened cheese at 60, 120 and 180 days using gas chromatography, after prior concentration of volatile compounds by head-space. Quantitative Descriptive Analysis (QDA) was applied in ripened samples at 90 and 180 days. All samples of milk and Parmesan cheese were in accordance to the legal standards of bioindicators of contamination. Lactic acid bacteria population was reduced after 90 days of ripening. There was a significant increase in acidity, soluble nitrogen in pH 4.6 (NSpH4,6) and soluble nitrogen in trichloroacetic acid (NSTCA12%) contents in all samples of Parmesan cheese during 180 days of ripening. The higher hydrolysis of casein and release of tyrosine and tryptophan amino acids were higher in cheese produced with the D1 and E5 cultures added. In these cheeses, the LDH activity stayed active until the final period of ripening. In all experiments, there was a degradation of α s1-casein into αs1-I and αs1- II -casein, and β-casein into γ1, γ2 and γ3 fractions. During the 180 days of ripening the presence of ethyl acetate, acetone, propanol and n- butyraldehyde were recorded in all cheeses analysed. However, they did not show a clear aromatic pattern. The QDA showed similarity to the sensory profile of D1 and E5 cheeses and both showed a slight difference when compared to cheese made with a commercial culture, which was the preferred to the sensory taste panel. Electronic microstructure showed an interaction between lactic acid cultures and lipids using TEM and lipids with protein matrix using SEM. Key words: Parmesan, Lactobacillus helveticus autochthonous, autolysis, ripening, quality. 1 INTRODUÇÃO GERAL No Brasil, parte da produção leiteira é direcionada aos laticínios para a manufatura de produtos lácteos, como o queijo Parmesão. Esse produto pode ser comercializado sob formas íntegras e fracionadas, entretanto, é geralmente consumido pela população na forma ralada. A tecnologia de fabricação do queijo Parmesão compreende, basicamente a adição de cultura lática responsável pela maturação e coalho para a coagulação do leite, seguida do corte da coalhada para liberação do lactosoro, prensagem da massa, salga e maturação. O produto pronto para consumo é caracterizado pelo reduzido teor de umidade, consistência dura, textura compacta e cor amarelo-palha. A matriz desse queijo é alvo de intensa atividade lipolítica, devido à ação de lipases microbianas que atuam, incisivamente, na porção lipídica oriunda da matéria-prima empregada na fabricação. Em queijos de massa dura como o Parmesão, o complexo enzimático da microbiota lática é um dos principais fatores que auxiliam na estabilidade físico-química desse produto durante o seu período de maturação, conferindo sabor e aroma picantes, peculiares desse queijo. Todavia, essa etapa agrega elevado custo à tecnologia desse derivado lácteo, sendo comum a comercialização de peças de queijos em períodos inferiores a seis meses; tempo mínimo preconizado pela legislação vigente. Na tecnologia de queijos que requerem prolongado período de vida de prateleira, diversas estratégias têm sido adotadas para abreviar o processo de maturação, sem que haja o comprometimento da qualidade do produto final. O emprego da cultura lática autolisada, ou seja, culturas previamente submetidas ao tratamento térmico severo e elevada pressão, bem como a adição de lipases, são recursos comumente relatados na literatura especializada. Contudo, tais procedimentos podem impulsionar o desenvolvimento de precursores responsáveis pelo aroma e sabor indesejáveis na matriz do queijo, sendo detectáveis apenas em longo prazo. Ainda, tais tratamentos inativam as proteínas antimicrobianas láticas, denominadas também como bacteriocinas, importantes à estabilidade microbiológica do produto durante o período de estocagem. No Brasil, o Parmesão é elaborado na maioria dos laticínios utilizando culturas láticas comerciais, que são compostas por bactérias láticas termofílicas, como o Lactobacillus helveticus. Esse é caracterizado por apresentar ampla aptidão tecnológica e algumas linhagens dessa espécie apresentam habilidade autolítica. 2 A autólise espontânea de cultivos láticos acelera a maturação, uma vez que as endoenzimas são liberadas para o meio extracelular, atuando, rapidamente, sobre carboidratos, lipídios e proteínas constituintes do queijo. Para a tecnologia do Parmesão, o uso de cultura de L. helveticus com perfil autolítico em detrimento da cultura lática autolisada assegura o aroma e sabor do produto, permite a atividade das bacteriocinas láticas, as quais inibem a proliferação da microbiota oportunista no produto durante o período de maturação, e reduz o custo de produção, uma vez que o armazenamento adequado dos queijos durante o período de cura representa um investimento considerável. Ainda, em países em desenvolvimento, a aceleração da maturação de queijos, e conseqüente redução na estocagem, também é vista como uma alternativa para aumentar a fabricação do queijo Parmesão. Nesse contexto, o objetivo dessa pesquisa consistiu em avaliar o desempenho das culturas autóctones de Lactobacillus helveticus autolíticos isoladas de soro-fermento sobre a dinâmica bioquímica e sensorial do queijo Parmesão. Para melhor entendimento, os dados obtidos foram organizados em capítulos. No capítulo I apresenta uma revisão sobre o aspecto tecnológico do processo de fabricação do queijo Parmesão. O capítulo II é referente a caracterização da microbiota lática e bioindicadores de contaminação durante a maturação do queijo. O perfil físico-químico e de aminoácidos e a degradação da caseína estão detalhados no capítulo III. A identificação e quantificação de substâncias responsáveis pelo aroma e sabor no Parmesão e os estudos da microestrutura das amostras experimentais foram descritos no capítulo IV. 3 CAPÍTULO I1,2 1BARROS, J. J. C; PENNA, A. L. B. Aspectos tecnológicos e bioquímicos envolvidos na fabricação do queijo Parmesão. Revista SEMINA, Londrina. (submetido à publicação, 2009). 2O texto foi formatado de acordo com as normas da SEMINA Ciências Agrárias, Londrina. 4 Aspectos tecnológicose bioquímicos envolvidos na fabricação do queijo Parmesão Technological and biochemical aspects involved in the production of Parmesan cheese Resumo Na tecnologia de fabricação de queijo Parmesão é empregado leite in natura ou pasteurizado e/ou reconstituído padronizado. O leite é fermentado por culturas láticas termofílicas como Lactobacillus helveticus e Streptococcus thermophilus. As enzimas destes microrganismos atuam sobre os carboidratos, gorduras e proteínas, conferindo aroma e textura característicos desse produto. O queijo Parmesão pronto para consumo deve apresentar teor de gordura entre 25,0 % a 44,9 % e umidade não superior a 36,0 %. A lise, espontânea ou induzida, das culturas láticas tem sido considerada uma alternativa para acelerar a maturação de queijos de massa dura. O Parmesão sofre intensa atividade proteolítica e lipolítica, que podem ser monitoradas pela evolução dos componentes do leite utilizando métodos objetivos ou subjetivos. Para avaliar a evolução da maturação são comumente empregadas análises cromatográficas e/ou espectrofotométricas, eletroforese, análise da microestrutura, e avaliação sensorial. Palavras chave: Parmesão, caracterização, enzimas láticas, maturação, qualidade. 5 Abstract In Parmesan cheese producing, raw or pasteurized and/or reconstituted standardized milk are used. The milk is fermented using thermophilic lactic acid cultures, such as Lactobacillus helveticus and Streptococcus thermophilus. The enzymes of these microorganisms act on carbohydrates, fats and proteins, giving the characteristic flavor and texture of the product. The Parmesan cheese ready for consumption should contain between 25.0 % and 44.9 % of fat content and less than 36.0 % of moisture. The lysis of lactic cultures, spontaneous or induced, has been considered an alternative to accelerate the ripening of hard cheeses. During ripening the Parmesan undergoes intense lipolytic and proteolytic activity, which can be monitored by the evolution of milk components using subjective or objective methods. In order to evaluate the ripening chromatographic and/or spectrophotometric analysis, electrophoresis, analysis of the microstructure, and sensory evaluation are commonly used. Key words: Parmesan, characterization, lactic enzymes, ripening, quality. 6 1. Introdução O sistema agroindustrial do leite e seus derivados exerce forte impacto nas atividades sócio-econômicas do país. Segundo o Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística - IBGE (2008), em 2008, a produção brasileira de leite atingiu no 1º trimestre 4.893 bilhões de litros, captados pelas indústrias sob inspeção sanitária federal, estadual ou municipal. No Brasil, parte da produção leiteira é direcionada aos laticínios para a fabricação de queijos, obtendo-se 592 mil toneladas de queijo por ano, sendo 28 mil toneladas de queijo Parmesão (IBGE, 2006). Este produto é o segundo dentre as variedades de queijos estrangeiros mais consumidos, após o mussarela, podendo ser comercializado sob formas íntegras e fracionadas, entretanto, é geralmente consumido pela população na forma ralada. O Parmesão é um queijo semi-gordo, maturado e de baixa umidade, obtido a partir da coagulação do leite por meio do coalho e/ou outras enzimas coagulantes apropriadas, complementada pela ação de bactérias láticas específicas e deve apresentar teor de gordura entre 25,0 % a 44,9 %, umidade não superior a 36,0 %. 2. Breve caracterização da variedade Parmesão No Brasil, a legislação estabelece que o Parmesão pode ser fabricado com leite in natura ou pasteurizado e/ou reconstituído padronizado. É um queijo de consistência dura, textura compacta e granulosa, com crosta espessa de 4 mm a 8 mm, lisa e cor amarela- palha. Apresenta-se na forma cilíndrica, com peso oscilando entre 5 Kg a 10 Kg. O produto é ligeiramente picante e salgado, apresenta odor suave e agradável. A temperatura de armazenamento não deve exceder a 18 °C e deve ser maturado por cerca de seis meses (BRASIL, 1997). O rendimento da fabricação é em torno de 13 Kg de leite.Kg-1 de queijo após sua completa maturação (PERRY, 2004). Na Itália, Parmesão é o termo genérico aplicado aos queijos que utilizam processamentos semelhantes ao Grana Padano e Parmigiano-Reggiano, fabricados em regiões externas aos limites geográficos de origem destes queijos. As regiões italianas são amparadas pela legislação européia, a qual assegura a genuidade dos queijos, por meio de um registro de Denominação de Origem Protegida - DOP (GAIASCHI et al., 2001; SALVINI et al., 2006). As condições edafo-climáticas dessas regiões conferem ao leite in 7 natura, empregado no processamento, atributos peculiares, os quais são transferidos ao queijo, contribuindo para o aroma e sabor característicos desses produtos. 3. Aspectos tecnológicos da fabricação do queijo Parmesão O leite destinado à manufatura de queijos deve apresentar acidez entre 15,0 oD e 18,0 oD. Em escala industrial, a padronização dos queijos é assegurada a partir do teor máximo de umidade e mínimo de gordura no extrato seco - ESD (FURTADO, 1991). Para a fermentação utiliza-se bactérias ácido-láticas termofílicas, geralmente compostas por Lactobacillus helveticus e Streptococcus thermophillus, e a coagulação da massa é realizada a temperatura de 35 oC (McSWEENEY, 2004; FURTADO, 2005). Esta temperatura propicia o desenvolvimento das células láticas (KENNY et al., 2003; MARILLEY; CASEY, 2004) e mantém ativo o complexo enzimático endógeno (LORTAL; CHAPOT-CHARTIER, 2005; KELLY; FOX, 2006). Esta temperatura é, ligeiramente, abaixo da temperatura ótima para ação do coalho (PERRY, 2004; STEPANIAK, 2004), de modo que a susceptibilidade das micelas de caseínas à proteólise não é afetada (McSWEENEY, 2004). A coagulação ocorre de forma lenta, decorrente da insolubilização do cálcio durante o tratamento térmico elevado do leite. Em indústrias queijeiras que utilizam a pasteurização rápida, é comumente utilizada uma solução de cloreto de cálcio (CaCl2) 50% para recuperar a aptidão original do leite para a coagulação e fabricação do Parmesão (FURTADO, 2005); todavia, o emprego abusivo desse sal pode conferir-lhe o gosto amargo (FURTADO, 1991; PERRY, 2004; SALÄUN, MIETTON; GAUCHERON, 2005). O processo de mexedura e corte da coalhada é realizado em diferentes tempos e velocidades. Na primeira fase da mexedura a temperatura interna do grão é de 35 oC, favorecendo a viabilidade (RAY, 2003, MADIGAN; MARTINKO, PARKER, 2004) e atividade (CIBIK; CHAPOT-CHARTIER, 2004). Por se tratar de massa cozida, os grãos da coalhada do queijo Parmesão apresentam tamanhos aproximados de 0,2 cm e resultam em baixo teor de umidade e de ácido lático e elevado teor de minerais, como o cálcio (FURTADO, 1991). A velocidade empregada na segunda etapa da mexedura é mais intensa, e a temperatura atinge 54 oC, promovendo a retirada de soro dos grãos, assegurando assim, o teor de umidade final (FURTADO, 1991). Este parâmetro está, intimamente, associado à concentração de lactose remanescente na massa, que pode 8 favorecer o desenvolvimento da microbiota secundária indesejável (SOOMRO; MASUD, ANWAAR, 2002; GATTI et al., 2004). Na fabricação do Parmesão, é conveniente empregar bactérias láticas starters hábeis em metabolizar completamente a lactose, antes que sejam substituídas pela microbiota não starter (DUDLEY; STEELE, 2005). O metabolismo heterofermentativo das bactérias sobre a lactose pode desencadear sabor rançoso e gosto amargo no queijo (FURTADO, 2005), e ainda, induzir à cristalização desse açúcar na matriz do queijo (AGARWAL et al., 2006). É imprescindível certificar o ponto da massa para submetê-la à prensagem. Essa avaliação, meramente subjetiva, é obtida a partir da compressão manual da massa. A firmeza e baixa adesividade dos grãos, aliados a rapidez de separação do soro são indícios valiosos para iniciar o processo de pré-prensagem. O peso usado para a pré-prensagem deve ser equivalente ao dobro do peso da massa, assegurando a temperatura adequada à coesão dos grãos, e ainda, impedir a formação de olhaduras mecânicas no queijo decorrentes da aeração. A prensagem, propriamente dita, confere o formato desejado ao queijo, expulsa a lactose residual e, contribui para a formação da casca (FURTADO, 1991). A salmoura inicial deve apresentar concentração de 17 % a 18 %, posteriormente, os queijos devem ser submetidos a salga em salmoura com teor de 25 % (FURTADO, 1991). A incorporação de sal afeta as interações protéicas, principalmente na matriz de caseína, induzindo à hidratação e expansão dessas moléculas (PASTORINO; HANSEN, McMAHON, 2003; FURTADO, 2005). A adequada absorção de sal durante a salga resulta em queijos com teores de sal entre 0,5 % a 2,5 % (FURTADO, 1991). O processo de salga é efetuado em câmaras frias sob temperaturas não superiores a 12 oC. Esta condição retarda a atividade enzimática de bactérias e fungos; todavia, é necessário efetuar o monitoramento físico-químico e microbiológico da salmoura, prevenindo a contaminação cruzada do queijo (MADIGAN; MARTINKO, PARKER, 2004). Bactérias patogênicas, tais como Staphylococcus aureus, são hábeis em manter seu metabolismo mesmo em soluções salinas concentradas em 25 %, permitindo sua proliferação no decorrer da estocagem e maturação (RAY, 2003). Esse fato é ainda mais preocupante, quando a temperatura é elevada, com intuito de acelerar a maturação dos queijos (AGARWAL et al., 2006). O queijo Parmesão pronto para comercialização deve apresentar atividade de água (Aw) aproximada de 0,917 (FURTADO, 1991). O microrganismo Staphyloccocus aureus 9 em temperaturas de 37 oC e Aw entre 0,870 e 0,900 é hábil em sintetizar toxinas termorresistentes (JAY, 2005), enquanto as culturas láticas possuem seu complexo enzimático potencializado em ambientes com atividade de água entre 0,930 a 0,960 (LEROY; VUYST, 2004). Coppola et al. (2000) verificaram decréscimo da atividade de água em Parmigiano-Reggiano durante 150 dias de maturação, com valores aproximados de 0,970 e 0,950 para os queijos maturados por 30 dias e 150 dias, respectivamente. A população de bactérias láticas termofílicas foi de 6,88 Log UFC.g-1 e 6,44 Log UFC.g-1, aos 30 e 150 dias de maturação, respectivamente. Furtado (2005) e McSweeney (2004) mencionam o desenvolvimento de pigmentos escuros no queijo Parmesão durante a estocagem. Este problema pode ser evitado pela adição de um bacilo galactose positiva, como o L. helveticus, na composição da cultura lática (TORRIANI; VESCOVO; SCOLARI, 1994). A habilidade que Lactobacillus helveticus possuem em sintetizar a enzima galactose-1-fosfato uridil transferase (KLEIN et al., 2001; TORINO et al., 2001) contribui para a oxidação completa da galactose, impedindo a formação de pigmentos escuros, as melanoidinas, no queijo Parmesão. 3.1 Microbiota oportunista como bioindicador da qualidade sanitária do queijo Os carboidratos, lipídios e proteínas distribuídos em queijos duros e semi-duros são fontes em potencial tanto à proliferação da microbiota lática quanto ao desenvolvimento de células microbianas oportunistas na matriz desses derivados lácteos (COPPOLA et al., 2000; ÖKSÜZTEPE; PATIR; ÇALICIO�LU, 2005; SALAÜN; MIETTON; GAUCHERON, 2005). A atividade enzimática de microrganismos deteriorantes e patogênicos tende a reduzir a vida-de-prateleira dos queijos e, ainda, acarretar sérios prejuízos sob o ponto de vista de saúde pública (JAY, 2005; RIEDEL, 2005; SILVA JR., 2005). O leite empregado na fabricação do Parmesão deve apresentar elevado grau de pureza química e microbiológica (MOURA et al., 1999). A presença de resíduos antimicrobianos pode inibir a reação glicolítica, etapa primordial à produção de queijos e de diversos derivados lácteos (MARILLEY; CASEY, 2004; FURTADO, 2005). Microrganismos saprofíticos, como Pseudomonas fluorescens, podem favorecer o aparecimento de gosto amargo e ranço no produto (MUNSCH-ALATOSSA; ALATOSSA, 2006). O complexo enzimático dessa espécie é constituído por lipases altamente ativas 10 (LERICHE, 2004, SKEIE, 2007), as quais são hábeis em hidrolisar os glóbulos de gordura (McSWEENEY; SOUZA, 2000). Na fabricação do Parmesão (FURTADO, 2005), Parmigiano-Reggiano (COPPOLA et al., 2000) e Reggianito Argentino (PEROTTI et al., 2004), a inserção de células microbianas indesejáveis, advindas da matéria-prima e/ou de falhas higiênicas durante o processamento, pode acarretar defeitos irreversíveis ao produto final. Nesses produtos, os metabólitos de enterobactérias (COPPOLA et al., 2000), como coliformes totais, e das bactérias do gênero Clostridium (McSWEENEY, 2004; SKEIE, 2007) impulsionam o estufamento precoce e tardio do queijo, respectivamente, induzindo a formação de olhaduras e trincas em toda sua extensão. O estufamento tardio é ainda mais evidente em queijos que apresentam baixo índice proteolítico (FURTADO, 2005). Nos queijos é comum a contagem de células microbianas para qualificar as condições higiênico-sanitárias do produto (RAY, 2003). Estes microrganismos são denominados bioindicadores de qualidade sanitária. De acordo com o Regulamento Técnico Geral para a Fixação dos Requisitos Microbiológicos de Queijos (BRASIL, 1996), para queijos de baixa umidade, as bactérias do grupo coliformes são empregadas como microrganismos indicadores, e os patôgenos Salmonella sp. e Staphylococcus coagulase positiva não podem estar presentes. O Parmesão maturado pronto para comercialização deve apresentar contagem máxima de 5x102 UFC.g-1 para coliformes termotolerantes, ausência de Salmonella sp em 25 gramas da amostra investigada e valor não superior a 103 UFC.g-1 para coliformes totais e S. coagulase positiva. A Resolução RDC no. 12, de 02 de janeiro de 2001, recomenda o mesmo parâmetro proposto no Regulamento Técnico Geral, exceto a análise de coliformes totais (BRASIL, 2001). Quando o queijo é fabricado seguindo as Boas Práticas de Fabricação, estes requisitos são facilmente atendidos. Em queijo Parmigiano-Reggiano, maturado por 150 dias não foi detectado coliformes termotolerantes em nenhum período de estocagem do produto (COPPOLA et al., 2000). Perotti et al. (2004) registraram valores inferiores a 102 UFC.g-1 para coliformes totais em Reggianito Argentino maturado por 180 dias. O monitoramento do aspecto sanitário é realizado, comumente, utilizando meios de culturas específicos, a partir de cultivos em profundidade e/ou superficial e em condições aeróbicas e anaeróbicas (SILVA et al., 2007). O diagnóstico associado à qualidade sanitária dos alimentos tem sido efetuado empregando também a tecnologia de substratos específicos que reduz o tempo de detecção desses bioindicadores e assegura a 11 confiabilidade da análise. Geralmente, esses métodos são classificados como cromogênicos, ou seja, a partir do parâmetro de cor é possível enumerar e/ou identificar células microbianas (JAY, 2005). A contagem de coliformes totais e Echerichia coli por métodos rápidos é realizada pela associação da atividade do complexo enzimático dos microrganismos e de um substrato específico (MADIGAN; MARTINKO; PARKER., 2004). A hidrólise do substrato �-D-galactopiranosídeo pela enzima orto-nitro-fenil-galacturonidase (ONPG) confere uma coloração de laranja a púrpura, indicando a presença de coliformes . Em contrapartida, a ação da enzima �-glucoronidase sobre o substrato 4-metilumbeliferil �-D- glucoronídeo (MUG) resulta numa coloração azul à colônia, revelando a incidência de E. coli. O processamento e a maturação de produtos fermentados contribuem para a inibição de patógenos e deteriorantes. No entanto, alguns microrganismos e/ou seus metabólitos permanecem ativos mesmo após o período de cura (LEROY; VUYST, 2004; LIN et al., 2006). É necessário o uso de matéria-prima de acordo com os padrões preconizados pela legislação vigente, para evitar problemas de saúde pública, como as doenças transmitidas por alimentos (DTA), uma vez que microrganismos hábeis em sintetizar toxinas, podem fazê-lo quando as contagens são superiores a 105 células viáveis (RIEDEL, 2005; SILVA JR., 2005). Ainda, a prática higiênica adequada durante a fabricação dos queijos impede o desenvolvimento de microrganismos deteriorantes e patogênicos, assim como a formação de subprodutos indesejáveis, como aminas bioativas (KOMPRDA et al., 2005, INNOCENTE et al., 2007), que apresentam risco toxicológico, uma vez que podem comprometer o sistema imunológico do consumidor. 3.2 Culturas láticas e sua aplicabilidade na indústria queijeira As culturas láticas adicionadas ao leite destinado à elaboração de queijos desempenham diferentes funções como diminuir o pH, facilitar a ação do coalho, auxiliar na expulsão do soro e atuar na maturação (McSWEENEY, 2004, LORTAL; CHAPOT- CHARTIER, 2005). Estas culturas podem ser classificadas como starters (Lactic Acid Bacteria - LAB) ou iniciadoras quando as bactérias são fermentadoras da lactose e não starters (Non Starter Lactic Acid Bacteria - NSLAB), como Leuconostoc e 12 Propionibacterium, que vão atuar sobre outros substratos, tais como o citrato (GIRAFFA, 2004). Na produção de queijos, o emprego de culturas autóctones, ou seja, culturas que se formam sob o controle de fatores tecnológicos em um determinado ambiente, sem sofrer a influência de microrganismos isolados de outras fontes (CANDIOTI et al., 2002; HÉBERT et al., 2000), assegura a biodiversidade natural da microbiota lática e ainda transfere ao produto características específicas da região. As bactérias da cultura lática são importantes na padronização da qualidade dos queijos, transmitindo características e propriedades específicas (FALLICO et al., 2006) e, ainda, são capazes de competir ou inibir a proliferação de patógenos e microrganismos oportunistas (OGUNBANWO; SANNI; ONILUDE, 2003, BROMBERG et al., 2004). Culturas autóctones de Lactobacillus helveticus autolíticos inibiram o desenvolvimento de Escherichia coli ATCC 25922, das quais 20% também apresentaram espectro de inibição frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 (BARROS, 2005). Na fabricação do queijo Parmesão utiliza-se cultura lática termofílica capaz de resistir ao cozimento da massa a uma temperatura de até 55 oC. Os principais gêneros que compõem a cultura são Lactobacillus e Streptococcus que apresentam crescimento ótimo na faixa de temperatura entre 37 oC a 45 oC (DI CAGNO et al., 2006). O L. helveticus é considerado um forte produtor de ácido, reduzindo o valor de pH até < 4,0 (PILLIDGE et al., 2002). A importância dessa característica em L. helveticus, somada à capacidade que essa espécie possui em acelerar a maturação de queijos (HANNON et al., 2003, BARROS et al., 2006, KENNY et al., 2006), resistir aos sais biliares (SHINODA et al., 2001), sintetizar bacteriocinas (BONADÈ et al., 2001), peptídeos bioativos (KILPI et al., 2007) e compostos aromáticos (KLEIN et al., 2001), sugerem aplicações potenciais para essa espécie, minimizando a dependência da importação de culturas láticas pelo Brasil (BARROS, 2005). Valence et al. (2000) e Hannon et al. (2003) avaliaram o emprego da autólise celular de bactérias láticas termofílicas como uma alternativa para acelerar a maturação em queijos. Barros (2005) observou dentre as culturas autóctones de L. helveticus estudadas, rápida lise celular, seguida da inibição da enzima β-galactosidase no tempo máximo de 24 horas, fato que pode assegurar o controle da produção de ácido lático, e ainda, acelerar a maturação em queijos. 13 O comportamento auxotrófico também é outro aspecto abordado por McSweeney (2004) como fator relevante à indústria queijeira. Madigan, Martinko, Parker (2004) explicam que esse caráter corresponde à resistência que as culturas possuem em atingir a fase logarítmica, também conhecida como reprodução bacteriana, na ausência de um nutriente específico. Geralmente, os microrganismos requerem a adição de aminoácidos para o seu metabolismo. Nos estágios finais da proteólise, à medida que as endopeptidases asseguram a homeostasia celular das espécies láticas, a partir da degradação de substratos na matriz protéica, concomitantemente, observa-se a formação de compostos responsáveis pelo sabor e aroma (KLEIN et al., 2001; LEROY; VUYST, 2004; McSWEENEY, 2004). 3.2.1 Mecanismo de ação da lactato desidrogenase (LDH) durante a lise de bactérias láticas A lise de culturas termofílicas, como aquela observada em Lactobacillus helveticus, é importante para a indústria de laticínios, pois pode acelerar a maturação de queijos. Esta lise celular é promovida pela ação das autolisinas que hidrolisam ligações específicas na parede de peptideoglicana (DEUTSCH et al., 2002, ROSSI et al., 2002; MADIGAN, MARTINKO, PARKER, 2004; WILKINSON; KILCAWLEY, 2005). A atividade das autolisinas favorece a liberação do complexo enzimático, constituído por proteinases (KENNY et al., 2003, KILPI et al., 2007) e peptidases (KENNY et al., 2006), presentes na região intracelular. Este sistema autolítico pode ser acionado naturalmente ou de forma induzida (KENNY et al., 2005; SCOLARI, VESCOVO, 2005). Valence et al. (2000), Hannon et al. (2003) e Kenny et al. (2006) consideram como culturas láticas autolíticas aquelas em que a lise celular se processa espontaneamente. A cultura lática autolisada é constituída por linhagens previamente submetidas ao tratamento com sais, choques térmicos e/ou pressurização (DEUTSCH et al., 2002; FENELON et al., 2000, LAW, 2001). Segundo Sánchez-Ponte (2003), as culturas láticas autolíticas e autolisadas aceleram a maturação em queijos, pois durante a lise celular, as enzimas intracelulares, tais como a �-galactosidase (MONTANARI et al., 2000) e lactato desidrogenase (KENNY et al., 2003, SHEEHAN et al., 2005, KENNY et al., 2006) são liberadas, podendo atuar mais rápido e facilmente sobre o substrato. Além disso, o uso de culturas autolíticas confere qualidade adicional ao produto, pois o tratamento térmico, a adição de sais e aplicação de altas 14 pressões para a obtenção de cultivos autolisados podem inativar biomoléculas responsáveis pelo sabor, aroma e conservação dos queijos (SÁNCHEZ-PONTE, 2003, STEPANIAK, 2004, NELSON; COX, 2007). A lactato desidrogenase atua de forma incisiva sobre o piruvato, induzindo sua redução a lactato. Nesta reação é observada a redução simultânea de NAD+ a NADH (MADIGAN; MARTINKO, PARKER, 2004; NELSON; COX, 2007). Diversas estratégias têm sido empregadas para identificar o instante da lise celular, bem como o perfil autolítico de culturas láticas, seja em meios de cultura específicos para os cultivos láticos (ROSSI, 2001, CIBIK; CHAPOT-CHARTIER, 2004, BARROS, 2005), bem como na matriz do queijo maturado (DEUTSCH et al., 2002, KENNY et al., 2005, SCOLARI; VESCOVO, 2005). Rossi (2001) monitorou o desenvolvimento de Lactobacillus helveticus autóctones em caldo De Man Rogosa Sharp (MRS) e a morte celular a partir de técnicas turbidimétricas e diagnóstico por imagens em microscopia eletrônica de transmissão (MET). Barros (2005) registrou o caráter autolítico elevado, intermediário e não autolítico em Lactobacillus helveticus autóctones isolados e identificados por Rossi (2001) a partir da liberação da β-galactosidase em caldo MRS. O monitoramento da liberação dos componentes intracelulares na matriz do queijo é o método mais eficiente para a avaliação da lise celular, principalmente quando é efetuado avaliando os ácidos desoxirribonucléico (DNA) e ribonucléico (RNA) a partir de técnicas biomoleculares. No entanto, no queijo essas moléculas são rapidamente degradadas dificultando a análise (LORTAL; CHAPOT-CHARTIER, 2005). Desta forma, a cinética de endoenzimas microbianas, como a lactato desidrogenase - LDH (EC 1.1.1.27) tem sido empregada, com êxito, como marcador de lise celular (HANNON et al., 2006). Bunthof et al. (2001), Deutsch et al. (2002), Pillidge et al. (2002), Kenny et al. (2005), Hannon et al. (2006) avaliaram a autólise a partir da redução do NAD+. O produto formado, NADH, é detectável no comprimento de onda 340 nm (densidade óptica - DO340nm), permitindo predizer a atividade da enzima LDH no meio. Cada unidade da enzima é equivalente a 1 μM de NADH liberado por minuto por mililitro da amostra (U.mL-1.min-1), na temperatura de 37 oC. De forma equivalente, a atividade da LDH pode ser expressa como unidade por mililitro da amostra (U.mL-1). Kenny et al. (2006) verificaram valores médios para a atividade da enzima LDH igual a 0,08 U.mL-1; 1,14 U.mL-1; 0,18 U.mL-1 e 0,84 U.mL-1, respectivamente, nos queijos Cheddar fabricados com 15 diferentes culturas (cultura pura de Lactococcus lactis 303 Chr. Hansen®, cultura mista de Lc. lactis com L. helveticus DPC 4571, Lactobacillus helveticus com L. helveticus DPC 5353 e Lactobacillus helveticus com L. helveticus DPC 5364), maturados por 180 dias. A combinação Lactobacillus helveticus com Lactobacillus helveticus DPC 4571 apresentou maior atividade autolítica, intensificando o sabor e aroma no queijo Cheddar durante a maturação. A cinética in situ da LDH permite predizer a velocidade das reações responsáveis pela maturação do queijo (PILLIDGE et al., 2002; KENNY et al., 2006). Todavia, para que este diagnóstico seja confiável é necessário que o pH seja favorável (SALÄUN, MIETTON, GAUCHERON, 2005). No caso do Parmesão, o pH deve estar entre 5,0 e 5,2 no final da maturação (PERRY, 2004), contribuindo para que a ação da LDH (SHEEHAN et al.; 2005), iniciada em temperaturas elevadas, seja mantida mesmo em temperatura reduzida. 3.3 Evolução dos componentes químicos no queijo Parmesão durante a estocagem A maturação promove o sabor e potencializa outras características sensoriais no queijo Parmesão, tais como odor, aroma, adstringência e friabilidade (BOZZETTI, 2000; GOVINDASAMY-LUCEY et al., 2004;). Todavia, devido ao elevado custo que este processo representa, é comum encontrá-lo no mercado brasileiro com período de maturação inferior a seis meses, que é o tempo mínimo estabelecido na legislação, e ainda, com valor comercial que restringe o seu consumo à população com alto poder aquisitivo. De acordo com Zambonelli et al. (2002), McSweeney (2004), no decorrer da maturação do queijo Parmesão e das suas variedades, há intensa atividade proteolítica e lipolítica, que podem ser monitoradas por métodos objetivos ou subjetivos. Métodos objetivos que utilizam análises químicas, cromatográficas (NOGUEIRA; LUBACHEVSKY; RANKIN, 2005), diagnóstico da microestrutura (LOPEZ; CAMIER; GASSI, 2007), eletroforese (SAINANI; VYAS; TONG, 2004), espectrofotometria (GAIASCHI et al., 2001), precipitação fracionada das proteínas (MADADLOU; KHOSROSHAHI; MOUSAVI, 2005, FALLICO et al., 2006), e métodos subjetivos, como a avaliação sensorial (SPADOTI; DORNELLAS; ROIG, 2005; CURI; BONASSI, 2007), têm sido empregados para determinar o grau de maturação em queijos (PEROTTI et al., 2004). 16 Na produção de um queijo de qualidade satisfatória, a cultura lática deve ter poder acidificante, aromatizante ou uma combinação desses fatores (HANNON et al., 2003). Klein et al. (2001) propõem a adição de Lactobacillus helveticus autolíticos para assegurar estas características, entretanto, as vias metabólicas remanescentes, utilizadas por esta espécie, ainda são desconhecidas. Linhagens de Lactobacillus helveticus ATCC 15807, quando inoculadas no leite, produziram elevados índices de precursores de sabor e aroma, tais como o diacetil, acetaldeído e compostos sulfurosos (TORINO et al., 2001). A aceleração da maturação em queijos suíços foi constatada por Valence et al. (2000) quando utilizaram L. helveticus autolítico na fabricação dessa variedade. Outras substâncias aromáticas, tais como 2-metil propanal, 2-metil butanal, 3-metil butanal, fenilacetaldeído, etil butanoato, etil hexanoato, etil octanoato, diacetil, 2- heptanona, 2-nonanona, dimetil trissulfito, metional, 2,6-dimetil pirazina, ácido butanóico, ácido hexanóico e ácido octanóico são comumente identificadas e quantificadas em queijo Parmigiano-Reggiano (QIAN; REINECCIUS, 2002; BELLESIA et al., 2003). A síntese desses voláteis na matriz do queijo potencializa as características de aroma e odor desse produto. Hannon et al. (2003) verificaram que em dois meses de maturação, amostras de queijos Cheddar fabricadas com L. helveticus DPC 4571 com intensa atividade autolítica apresentaram elevado índice proteolítico, resultando no desenvolvimento de sabor e aroma característicos. O avanço da proteólise em queijos pode ser mensurado a partir dos índices de extensão e profundidade da maturação (FURTADO, 1991). As proteinases e peptidases bacterianas atuam sobre as proteínas e peptídeos produzindo compostos de baixo peso molecular e aumentando o teor de nitrogênio solúvel em ácido tricloroacético - TCA 12% (FARKEY; FOX, 1990). A extensão da proteólise é caracterizada pela quantidade de substâncias nitrogenadas solúveis em pH 4,6 (NSpH4,6) acumuladas durante o processo e expressas como porcentagem do nitrogênio total, também conhecido como índice de extensão da maturação (IEM). O índice de profundidade da maturação (IPM) relaciona o teor de nitrogênio solúvel em ácido tricloroacético 12% (NSTCA12%) com o teor de nitrogênio total, tendo como compostos característicos: aminoácidos, oligopeptídeos e aminas, relacionados à atividade da cultura lática (WOLFSCHOON-POMBO, 1983; McSWEENEY, 2004; PEREIRA et al., 2008). 17 Fox, Law (1991) e Furtado (2005) afirmam que a liberação dos aminoácidos tirosina e triptofano é uma conseqüência da ação das enzimas do coalho e da cultura. A presença de anel benzênico na estrutura destes aminoácidos e sua capacidade de determinação espectrofotométrica tornam sua quantificação um método simples e eficiente na determinação do índice de proteólise em queijos (FOX; LAW, 1991, McSWEENEY, 2004). As quantidades do aminoácido tirosina, normalmente, apresentam a mesma tendência daqueles dos índices de extensão e profundidade da maturação em queijos (PEROTTI et al., 2004). A atividade proteolítica das culturas também pode ser avaliada quantificando os aminoácidos de peptídeos liberados empregando o ortoftaldeído (OPA), que reage com o β-mercaptoetanol e aminas primárias, formando um complexo fluorescente detectável em densidade óptica de 340nm - DO340nm (FOX, 1993). 3.3.1 Desenvolvimento do sabor e aroma lipolítico no queijo Parmesão A liberação de ácidos graxos durante a maturação dos queijos é promovida pela lipase natural do leite (STEPANIAK, 2004; FURTADO, 2005) e pela ação das lipases de bactérias láticas starters (GIRAFFA, 2004), como de Lactobacillus helveticus (McSWEENEY; SOUZA, 2000; COLLINS; McSWEENEY; WILKINSON, 2003). A especificidade da lipase de Lactobacillus helveticus pela posição sn-3 dos triglicerídeos influencia no desenvolvimento do sabor e aroma do queijo Parmesão, pois, geralmente, ácidos graxos de cadeia curta estão inseridos nessa posição. Embora a lipase de L. helveticus apresente baixa atividade, o longo tempo de maturação do queijo Parmesão permite à enzima atuar na posição sn-3 e promover a liberação de ácidos graxos esterificados (COLLINS; McSWEENEY; WILKINSON, 2003, McSWEENEY; 2004, STEPANIAK, 2004), que interferem no sabor do queijo (CANDIOTI et al., 2002). Fenster, Rankin, Steele (2003) verificaram que lipases e esterases produzidas por Lactobacillus helveticus CNRZ 32 desencadearam a produção do sabor e aroma em queijos Parmesão, uma vez que induzem a liberação de ácidos graxos. Estes atuam como precursores na formação de ésteres, tal como o diacetil, importante no desenvolvimento do sabor e aroma em queijos italianos, como o Parmesão e Grana Padano (QIAN; REINECCIUS, 2003). As lipases e esterases, geralmente, possuem pH ótimo entre 7,0 e 8,5 e temperatura ótima de 35 ºC (QIAN; REINECCIUS, 2003, FURTADO, 2005). 18 A presença dos ácidos graxos livres (AGL) palmítico e esteárico, em concentrações aproximadas de 6x102 mg.kg-1 e 2x102 mg.kg-1, respectivamente em queijo Reggianito Argentino, produzido com L. helveticus isolados de soro-fermento natural e maturado por 180 dias, foi observada por Perotti et al. (2004). Estes valores foram comparados àqueles presentes no queijo Parmesão, o qual apresentou valor aproximado de 1,5x103 mg.kg-1 para ácido palmítico e 5x102 mg.kg-1 para ácido esteárico. 3.4 Análise da microestrutura de queijos por diagnóstico de imagens De acordo com Lopez (2005), a funcionabilidade do queijo é influenciada pela concentração, tamanho e forma dos glóbulos de gordura, bem como pela estrutura destes no leite fluido. Os lipídios se apresentam no leite como uma emulsão, contudo, sua microestrutura nos produtos lácteos e, particularmente no queijo é pouco conhecida. Os glóbulos de gordura do leite podem ser alterados ou sofrer rupturas durante a fabricação dos queijos, em conseqüência aos tratamentos aplicados (YE et al., 2004; LOPEZ; CAMIER, GASSI, 2007). Algumas modificações ocorridas durante a maturação, tais como degradação protéica e desenvolvimento das culturas inseridas no queijo, são facilmente detectáveis a partir de análises rotineiras. Todavia, as mudanças nas interações entre proteínas e gorduras, requerem diagnósticos a partir da visualização microscópica. As eletromicrografias do queijo permitem avaliar a estrutura da gordura e suas interações com as proteínas no decorrer da vida de prateleira do queijo (YE et al., 2004), podendo ser identificados pontos de inserção dos lipídios (FRAU et al., 1997; PARKER et al., 1998). O emprego da microscopia fotônica, eletrônica de transmissão - MET (FRAU et al., 1997, PARKER et al., 1998) e eletrônica de varredura - MEV (MADADLOU; KHOSROSHAHI, MOUSAVI, 2005; FALLICO et al., 2006) têm sido adotadas como ferramenta adicional para avaliar a qualidade e/ou defeitos em queijos maturados (MAZEROLLES et al., 2001). Nos períodos que antecedem a atividade proteolítica, a matriz caseínica apresenta caráter elástico (LAWRENCE; GILLES; CREAMER, 1983), entretanto, no decorrer da maturação, a ação conjunta das proteases e peptidases confere à mesma uma característica mais rígida (McSWEENEY, 2004, FURTADO, 2005). Fallico et al. (2006), ao acompanharem as alterações da microestrutura do queijo duro Piacentinu Ennese maturado 19 por 4 e 6 meses, observaram microestrutura mais compacta, decorrente da redução gradual da umidade, causada pela evaporação na superfície do queijo. Na microestrutura obtida por MET em queijo Parmesão comercial foi possível visualizar a interação entre os glóbulos de gordura e as culturas láticas (BARROS et al., 2009). Esse tipo de arranjo foi, inicialmente, observado, em queijos Cheddar por Dean; Berridge; Mabbitt (1959). Laloy et al. (1996) observaram que as populações de cultura láctica eram de 30 a 100 % maiores e de 4 a 10 vezes maiores em queijos Cheddar com redução de 50 % de gordura e em queijos Cheddar integrais, respectivamente, quando comparados com queijos Cheddar sem gordura. Fenelon, O’Connor, Guinee (2000) observaram em queijos Cheddar com 33% (C33) e 6% (C6) de gordura, população de LAB iguais a 8,5 Log UFC.g-1 durante 100 dias de maturação. Houve redução na amostra C33 para 1,9 Log UFC.g-1 e 1,0 Log UFC.g-1 no período de 180 a 225 dias de maturação, respectivamente. A população inicial de NSLAB para ambas amostras foi de 2,8 Log UFC.g-1, com aumento significativo para 7,5 Log UFC.g-1 nas duas amostras. É comum detectar culturas láticas lisadas em queijos maturados por longos períodos, sendo visível a formação de debris, que se caracterizam pela formação de dobras na célula morta não absorvidas pela matriz do queijo (BARROS et al., 2009). O seccionamento, a desidratação e a fixação química das amostras para a análise de microestrutura são laboriosas e podem induzir ao surgimento de artefatos (LOPEZ; CAMIER, GASSI, 2007), desta forma é importante seguir, rigorosamente, as etapas de preparo das amostras a serem analisados. 3.5 Atributos sensoriais em queijos maturados De acordo com Zambonelli et al. (2002), os aspectos sensoriais dos alimentos fermentados podem ser divididos em pré-fermentativos, fermentativos e pós-fermentativos. O primeiro grupo refere-se aos atributos intrínsecos à matéria-prima, enquanto que na segunda categoria estão àqueles provenientes do desdobramento químico dos substratos, presentes no produto in natura. Por último, é possível identificar as características sensoriais desenvolvidas durante o período de maturação (LORTAL; CHAPOT- CHARTIER, 2005). Os queijos de massa dura como Parmesão e suas variedades Grana 20 Padano e Parmigiano-Reggiano são exemplos clássicos de produtos que carreiam as propriedades sensoriais pós-fermentativa (ZAMBONELLI et al., 2002). As propriedades sensoriais são determinantes na escolha do produto pelo consumidor, podendo ser avaliadas por métodos analíticos e afetivos (MACHADO et al., 2004; WHETSTINE; CADWALLADER; DRAKE, 2005). Os métodos analíticos requerem provadores treinados, enquanto as opiniões pessoais são características marcantes dos testes afetivos (CARVALHO et al., 2005). Os métodos descritivos, tais como perfil de sabor, perfil de textura e análise descritiva quantitativa (ADQ) são de grande utilidade na solução de diversos problemas associados ao controle de qualidade, estudos de vida de prateleira, desenvolvimento de novos produtos ou a interpretação das preferências dos consumidores (STONE; SIDEL, 1985, citados por VERRUMA-BERNARDI; DAMÁSIO, 2004). A aparência, textura e sabor são importantes parâmetros empregados na análise sensorial de queijos. Com o objetivo de estudar a análise sensorial de queijos, para uniformizar o treinamento dos provadores e padronizar a metodologia analítica para caracterização de propriedades sensoriais de queijos duros e semi-duros, Lavanchy et al. (1994) e Bérodier et al. (1997) elaboraram dois guias: A guide to the sensory evaluation of texture of hard and semi-hard cheeses e Guide to smell, aroma and taste evaluation of hard and semi-hard cheeses. Foram utilizados cinco queijos com denominação de origem controlada (Appellation d’Origine Contrôlée - AOC): Comte (França), Parmigiano- Reggiano e Fontina (Itália), Mahón (Espanha) e Appenzeller (Suíça). Posteriormente, Bozzetti (2000) elaborou uma ficha simplificada (Modelo Etana) contendo os atributos sensoriais dos dois guias (GIOMO, 2001). O Modelo Etana apresenta um diagrama contendo os 14 descritores em uma escala de 5 pontos. Os atributos analisados são: odor, aroma, doce, ácido, salgado, amargo, adstringente, picante, elasticidade, firmeza, friabilidade, adesividade, solubilidade e umidade (BOZZETTI, 2000). Segundo Penna; Hoffmann; Bozzetti (2002) esse modelo permite descrever qualquer tipo de queijo de forma simples e correlacioná-lo à preferência do potencial consumidor. 21 4. Considerações finais A qualidade do queijo Parmesão pronto para comercialização pode ser assegurada adotando os requisitos básicos de Boas Práticas de Fabricação, a tecnologia de fabricação empregada, e principalmente, pela seleção de culturas láticas termofílicas adequadas, que durante a maturação sejam hábeis em promover alterações desejáveis na textura e sabor e aroma do queijo. 5. Referências bibliográficas AGARWAL, S.; SHARMA, K.; SWANSON, B. G.; YÜKSEL, G. U.; CLARK, S. Nonstarter lactic acid bacteria biofilmes and calcium lactate crystals in Cheddar cheese. Journal of Dairy Science, Champaign, v. 89, n. 5, p. 1452-1466, 2006. BARROS, C. M. V.; CUNHA, C. R.; GALLINA, D. A.; VIOTTO, L. A.; VIOTTO, W. H. Efeito do uso de cultura adjunta (Lactobacillus helveticus) na proteólise, propriedades viscoelásticas e aceitação sensorial de queijo Prato light. Ciência e Tecnologia de Alimentos, Campinas, v. 26, n. 1, p. 11-18, 2006. BARROS, J. J. C. 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