UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS - RIO CLARO 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Gerson Felipe da Costa Filho 

Biodegradação de Óleos Derivados do Petróleo e de 
Origem Vegetal Estimulada por Biossurfactantes em 

Meio Aquoso e Monitoramento de sua Toxicidade 

Rio Claro 
2011 

BACHARELADO EM ECOLOGIA 



 

GERSON FELIPE DA COSTA FILHO 

 

 

 

Biodegradação de Óleos Derivados do Petróleo e de Origem Vegetal 
Estimulada por Biossurfactantes em Meio Aquoso e Monitoramento de 

sua Toxicidade 
 
 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

                                                Orientador: Prof. Dr. Ederio Dino Bidoia 

                                               Co-orientador: M. Sc. Paulo Renato Matos Lopes 

                                               

 

 

 

 

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado 
ao Instituto de Biociências da Universidade 
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - 
Câmpus de Rio Claro, para obtenção do grau 
de Ecólogo 
 
 
 
 
 

 

Rio Claro 

2011 



 

Costa Filho, Gerson Felipe da 
      Biodegradação de óleos derivados do petróleo e de origem vegetal
estimulada por biossurfactantes em meio aquoso e monitoramento de sua
toxicidade / Gerson Felipe da Costa Filho. - Rio Claro : [s.n.], 2011
      64 f. : il., figs., gráfs., tabs.

      Trabalho de conclusão de curso (bacharelado - Ecologia) -
Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro
      Orientador: Ederio Dino Bidoia
      Co-Orientador: Paulo Renato Matos Lopes

      1. Biodegradação. 2. Biorremediação. 3. Bartha. 4. Respirometria. 5.
Óleo mineral. 6. Óleo semi-sintético. 7. Óleo de soja.  I. Título.

 
620.1122
C837b

Ficha Catalográfica elaborada pela STATI - Biblioteca da UNESP
Campus de Rio Claro/SP



Agradecimentos 

 

Ao Prof. Ederio Dino Bidoia pela confiança, paciência e ensinamentos que levarei por 

toda minha vida. 

À minha mãe, Vanda Lucia Dornelas, por ter acreditado incondicionalmente em mim 

desde o inicio, pelo amor que sempre me ofereceu e pelos conselhos que sem eles eu 

não seria nada do que sou hoje. Amo você. 

À minha irmã, Paula Felipe da Costa, pela ajuda nos momentos difíceis, por ser sempre 

minha grande parceira e por um milhão de outras coisas. 

Aos meus irmãos Pakito, Zeca e Terts que me ajudaram e me aturaram em TODOS os 

momentos. Vocês são mesmo especiais. 

Ao meu co-orientador Paulo Renato Matos Lopes pela grande ajuda ao longo desse 

projeto. 

Aos Técnicos do Laboratório, Lú, Fátima e Beto pela ajuda, ensinamentos e paciência 

ao longo do trabalho. 

Ao Programa de Formação de Recursos Humanos (PRH-05) da Agência Nacional do 

Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis, pela bolsa de estudos, por todo apoio 

financeiro e pelos cursos oferecidos. 

Às minhas queridas amigas Xeninha e Ticiane pelos conselhos, pela ajuda, incentivo, 

pelos cadernos, enfim, sem vocês eu nunca iria me formar. 

Aos grandes parceiros Caramelo, Dudu, Pantoja, Pagode, Bixano que são amigos para a 

vida. 

Às minhas grandes parceiras Laurinha e Mari, obrigado pelas caronas, baladas, 

almoços, enfim jamais me esquecerei de vocês. 

Aos meus veteranos pela melhor recepção que já tive e pela ajuda ao longo do curso. 

Aos meus Bixos que espero não ter atormentado muito. 

À República Madrugas pelo amor e receptividade com todos. Aprendi e irei aprender 

muito ainda nesta casa. 

À grande turma de Ecologia de 2007. Vocês são demais. 

E por fim um obrigado especial a minha namorada Carla Silva Oliveira pelo amor, 

carinho, compreensão, respeito que teve comigo ao longo deste trabalho e por toda 

minha vida. Amo você. 



 
 
 
 
 
 
 
 
 

 
 

 

________________________________________ 
 

Não há saber mais ou saber menos: Há saberes diferentes. 

(Paulo Freire) 
 

 

 
 

 

Sábio é aquele que conhece os limites da própria ignorância. 
(Sócrates) 

 

 
 

 

 
É triste pensar que a natureza fala e que o gênero humano não a 

ouve. 

(Victor Hugo) 
________________________________________ 



SUMÁRIO 

1 INTRODUÇÃO 7 

2 OBJETIVOS 11 

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 12 

3.1 Aspecto legislativo 12 

3.2 Água 12 

3.3 Solo e Micro-organismos 13 

3.4 Óleo lubrificante automotivo 15 

3.5 Óleo lubrificante automotivo usado 17 

3.6 Biodiesel 17 

3.7 Rerrefino 18 

3.8 Efeitos nocivos ao meio ambiente 19 

3.9 Efeitos nocivos à saúde humana 19 

3.10 Biodegradação 20 

3.11 Biorremediação microbiana 22 

3.12 Estudos sobre biorremediação de hidrocarbonetos 24 

3.13 Bioestimulação 27 

3.14 Respirometria 29 

3.15 Toxicidade 30 

4 MATERIAL E MÉTODOS 32 

4.1 Material 32 

4.1.1 Solo 32 

4.1.2 Tipos de óleos lubrificantes automotivos estudados 32 

4.1.3 Tipo de óleos vegetais usados 33 

4.1.4 Microrganismos 33 

4.1.5 Organismos-teste 33 

4.1.6 Respirômetro de Bartha e Pramer 33 

4.1.7 Reagentes utilizados no ensaio de respirométrico 34 

4.1.8 Meios de Cultura 36 

4.1.9 Equipamentos e vidraria 36 



6 

 

4.1.10 Inóculo do solo 37 

4.1.11 Inóculo de Bacillus subtilis 37 

4.1.12 Inóculo aquoso 37 

4.1.13 Quantificação do CO2 38 

4.1.14 Composição dos sistemas respirométricos 38 

4.1.15 Cálculo do CO2 produzido nos respirômetros 38 

4.1.16 Testes de Toxicidade 39 

4.1.17 Forma de análise de resultados 39 

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 41 

5.1 Biodegradação do óleo lubrificante automotivo mineral (novo e usado) e semi-sintético 

(novo e usado), Biodiesel puro (100%) e comercial (2% de biodiesel e 98% de diesel) e de óleos 

vegetal derivado da soja (novo e usado) em meio aquoso com ou sem adição de Bacillus subtilis 41 

5.1.1 Quantificação do CO2 acumulado nos ensaios respirometricos sem Bacillus subtilis ao 

longo dos 90 dias de tratamento. 41 

5.1.2 Quantificação do CO2 acumulado nos ensaios respirometricos com Bacillus subtilis ao 

longo dos 90 dias de tratamento. 42 

5.2 Toxicidade 45 

5.3 Início do tratamento 45 

5.3.1 Germinação com sementes de alface (Lactuca sativa) 45 

5.3.2 Germinação com sementes de rúcula 47 

5.3.3 Final do tratamento 49 

6 CONCLUSÃO 58 

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 60 

 



7 

 

1 INTRODUÇÃO 

O grande desenvolvimento industrial das últimas décadas vem introduzindo diversos poluentes 

ao meio ambiente, trazendo graves conseqüências pela contaminação do ar, do solo e da água. Entre 

estes contaminantes, encontra-se o petróleo, o qual é a principal fonte de combustível atual, e seu uso, 

produção, transporte e armazenamento apresentam-se como uma fonte em potencial de poluição 

(BATTERSBY, 2000). 

Atualmente, no mundo, são consumidos anualmente cerca de 42 milhões de toneladas de óleo 

refinado, gerando 22 milhões de toneladas de óleo usado, dos quais apenas um milhão é refinada 

novamente, ou seja, 4,5%. O Brasil consome anualmente cerca de 900.000 m³ de óleo lubrificante e gera 

de 250.000 a 300.000 m³ de óleo usado, das quais são novamente refinados em torno de 110.000 m³ e o 

restante geralmente é queimado ou despejado na natureza (LOPES, 2006). Da mesma forma, os óleos 

vegetais e biodiesel são descartados indiscriminadamente, acarretando danos consideráveis ao meio 

ambiente, agravando-se ainda mais em decorrência de seu crescente consumo. 

Os óleos em geral são fortes contaminantes ambientais, classificados como resíduos perigosos 

(Classe I) segundo a norma da ABNT por conterem metais e compostos altamente tóxicos. Segundo 

Atlas et al. (1991), pequenas quantidades de óleo são suficientes para trazer  danos consideráveis ao 

meio ambiente pois, somente um litro de óleo é capaz de acabar com o oxigênio de 1 milhão de litros 

d’água, ao formar, em um curto período de tempo, uma fina camada que bloqueia a passagem de ar e luz 

sobre a superfície de 1000 m², impedindo assim, a realização de fotossíntese e a respiração dos seres 

vivos ali presentes. 

Os microrganismos desempenham funções únicas e essenciais na manutenção dos ecossistemas 

da biosfera, sendo componentes de cadeias alimentares e de ciclos biogeoquímicos (SCHIMEL, 1995; 

MYERS, 1996), uma dessas funções é a biorremediação, que promove a degradação dos contaminantes, 

por meio da respiração microbiana (bactérias, fungos e leveduras), contribuindo para a manutenção do 

equilíbrio ecológico. Neste processo, são necessários três fatores: contato entre o microrganismo e a 

substância a ser degrada; condições ambientais favoráveis para que o microrganismo realize a 

degradação e; o microrganismo deve ser capaz de realizar a degradação ou transformação da substância 

(DOMINGUES, 2007). 

Existem inúmeras técnicas para descontaminar os ambientes, porém poucas são tão eficientes 

quanto à biorremediação, que emerge como uma técnica de baixo custo, menos agressiva e a mais 

adequada para manutenção do equilíbrio ecológico (ROSATO, 1997). Prince (1993) cita casos que 



8 

 

foram aplicadas técnicas de biorremediação e após um ano houve um redução de 90% da contaminação 

enquanto regiões não tratadas tiveram apenas 15% de redução dos contaminantes. 

No processo de biodegradação, há alguns procedimentos que auxiliam na melhora de sua 

eficiência. Dentro deste contexto encontra-se a bioestimulação, técnica que promove um enriquecimento 

do meio pela adição de nutrientes a fim de favorecer uma maior população de microrganismos, 

aumentando, conseqüentemente, a taxa de degradação. Os nutrientes mais usados são o nitrogênio (N) e 

o fósforo (P), pois estão ligados intimamente ao metabolismo microbiano (MORGAN e WATKINSON, 

1989). Os níveis desses compostos são estimados em razões de C/N (carbono e nitrogênio) e, desta 

forma, variam de acordo como composto a ser biodegradado. Portanto, antes da adição de nutrientes, é 

necessário realizar estudos para indicar qual a dosagem mais correta, visando o sucesso da 

biodegradação e sua realização em grande escala (MONTAGNOLLI, 2008). 

Outra técnica é o bioaumento ou bioaumentação, a ser aplicado nesse trabalho, a qual pode ser 

definida como a introdução de microrganismos selecionados para incrementar a população microbiana 

(MARIANO, 2006). Estes microrganismos são selecionados de acordo com sua especificidade 

metabólica, no caso degradação de hidrocarbonetos. 

Em certos ambientes, há um domínio de determinados tipos de microrganismos para 

degradação de derivados de petróleo. Em ambientes aquáticos, bactérias e leveduras parecem ser os 

agentes degradantes dominantes, enquanto que em ambientes terrestres fungos e bactérias detêm esse 

papel (BALBA et al., 1998). Além de degradarem os hidrocarbonetos, algumas bactérias possuem uma 

característica muito importante para a indústria, a capacidade de transformar certas substâncias em 

derivados de hidrocarbonetos, por exemplo, fenóis, carvão, lignina ou óleo cru (BICCA et al., 1999).  

As bactérias possuem uma enorme flexibilidade para a utilização de diferentes compostos como 

o carbono em seu metabolismo, por isso são fundamentais ao sucesso da biodegradação. Assim que 

ocorre a contaminação por hidrocarbonetos, na maioria dos ambientes, algumas comunidades de 

microrganismos já estão realizando a sua degradação. Sabe-se que este processo não é realizado por 

apenas uma espécie bacteriana e sim por um consórcio de microrganismos e, com isso, certas bactérias 

exigem a presença de outras, cuja atividade enzimática pode liberar certas substâncias no meio 

extracelular, como os biossurfactantes. Estes compostos facilitam a quebra das cadeias mais longas dos 

hidrocarbonetos, agindo como emulsificante que permite o catabolismo por outros táxons de dentro da 

comunidade (VASILEVA-TONKOVA e GALABOYA, 2002). Ao analisar esse comportamento de 

cooperação, podem ser utilizadas técnicas de isolamento para selecionar comunidades que degradem 

mais rapidamente o poluente, contribuindo para a maior eficiência do bioaumento. 



9 

 

Em experimentos de biodegradação, o método repirométrico de Bartha e Pramer encontra-se 

como uma boa alternativa (PAGGA, 1997), pois já está descrito e padronizado pela NT L6.350 da 

CETESB (1990). Esta metodologia consiste em determinar a taxa de CO2 liberado por microrganismos 

no processo de degradação de compostos orgânicos por análise química, utilizando respirômetros 

(BARTHA e PRAMER, 1965). Esta metodologia é capaz de produzir resultados rápidos, visando testes 

em grande escala e com diferentes tipos de hidrocarbonetos. Assim, considerando que há uma correlação 

entre a geração de CO2 e a biodegradação da matéria orgânica no solo (SIVIERO, 1990), é possível 

estudar a viabilidade de diferentes métodos de biorremediação, antes que sejam utilizados em escalas 

maiores (BALBA et al., 1998). 

Testes toxicológicos também se tratam de uma importante ferramenta no estudo de 

biorremediação. Essa avaliação toxicológica permite verificar, pela utilização de bioindicadores 

(organismos teste), se a transformação dos compostos inicialmente tóxicos a biota de fato reduziu o 

potencial sua toxicidade no ambiente contaminado (CETESB, 1990). Wang et al. (1990) revelaram que, 

no processo de biodegradação realizado por microrganismos, pode ocorrer uma diminuição na 

toxicidade ou uma transformação da substância inicial em outra mais tóxica. 

Aliados à biorremediação, os surfactantes constituem um grupo de compostos químicos 

extremamente importantes para a indústria por agirem como tensoativos. A maioria deles, porém, é de 

natureza química e apresenta alguma toxidez aos seres vivos. Com o crescimento da preocupação 

ambiental, combinado com novas legislações de controle do meio ambiente, há atualmente uma procura 

de surfactantes de origem biológica a partir de fontes renováveis e/ou resíduos agroindustriais como 

alternativas aos produtos existentes (NITSCHKE e PASTORE, 2002). Estes compostos de origem 

microbiana são denominados biossurfactantes. 

A limpeza de ambientes aquáticos e terrestres contaminados por petróleo, a remoção da borra 

oleosa de tanques de estocagem, a remoção de metais pesados de solos e córregos, assim como um 

aumento geral nos processos de recuperação de óleo de reservatórios (MEOR), são possíveis aplicações 

dos biossurfactantes (COLLA, 2003). 

Diversos organismos têm a capacidade de sintetizar surfactantes, como bactérias e leveduras, 

constituindo uma classe importante de compostos para a indústria (NITSCHKE e PASTORE, 2002). Os 

biossurfactantes são capazes de emulsificar o óleo, diminuindo assim o tamanho das suas gotas, o que 

propicia um aumento da superfície de contato com os microrganismos degradantes que reduz o tempo de 

degradação dessas substâncias. 



10 

 

Dentre estes microrganismos, o Bacillus subtilis destaca-se pela produção de surfactina a partir 

de diferentes fontes de carbono. Este biossurfactante, pertencente à classe de lipopeptídios e 

lipoproteínas, é capaz de emulsificar substratos hidrofóbicos (hidrocarbonetos), promovendo um maior 

contato entre os microrganismos e o óleo (BARROS et al., 2007). Assim, a utilização do B. subtilis 

favorece uma maior biodegradação. 

A maioria dos surfactantes comercializados é sintetizada quimicamente a partir de derivados de 

petróleo com uma produção de mais de 3 milhões de toneladas por ano (NITSCHKE e PASTORE, 

2002). Estes surfactantes sintéticos são utilizados em indústrias petroquímicas, cosmética, de higiene e 

limpeza, sendo que este utiliza a maior parte para a produção de detergentes (BARROS et al., 2007). 

Os biossurfactantes apresentam vantagens quando comparados aos surfactantes químicos, 

como: baixa toxicidade, maior biodegradabilidade, produção a partir de substratos renováveis, 

capacidade de modificação estrutural através da engenharia genética e estabilidade em diferentes valores 

de pH e temperatura (BARBOSA et al., 2007). 

Deste modo, ensaios de respirometria com auxilio de biossurfactantes e a avaliação de 

toxicidade são importantes para decidir qual o método mais eficiente a ser empregado na 

descontaminação de ambientes contaminados por vários tipos de óleos. 



11 

 

2 OBJETIVOS 

O presente trabalho tem por objetivo estudar a biodegradação de óleos derivados do petróleo 

(lubrificantes e combustível) e de origem vegetal em meio aquoso otimizada pela adição de Bacillus 

subitilis (bioaumento) e monitorar sua toxicidade antes e após a ação microbiana. Os óleos a serem 

analisados serão: automotivo mineral novo e usado, automotivo semi-sintético novo e usado, diesel 

comercial (2% de biodiesel), biodiesel 100% e vegetal novo e usado. 



12 

 

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 

3.1 Aspecto legislativo 

Os óleos lubrificantes se deterioram com o uso, perdendo sua função, devendo ser substituído. 

Estes são contaminantes perigosos e devem ter um destino adequado, evitando uma maior contaminação 

dos ambientes naturais. 

No Brasil, segundo a Resolução nº. 362/05 do CONAMA (Anexo nº. A), esses resíduos devem 

ser recolhidos para rerrefino junto com o óleo residual das embalagens, conhecido como óleo acabado. 

De acordo com o parágrafo único do Art. 7 desta resolução, o MMA (Ministério do Meio Ambiente) e o 

MME (Ministério de Minas e Energia) deverão estabelecer, ao menos anualmente, o percentual mínimo 

de coleta de óleo lubrificante usado ou contaminado, não inferior a 30%, em relação ao óleo lubrificante 

acabado comercializado. 

O rerrefino e a coleta são realizados por empresas cadastradas na Agência Nacional do Petróleo 

(ANP) e a mesma, na Portaria n.º 125 (Anexo B) ainda determina: (1) o estabelecimento que 

comercializa óleo lubrificante acabado no varejo, diretamente ao consumidor tem o dever de entregar 

um recipiente vazio ao consumidor, próprio para recolhimento do óleo usado ou contaminado, indicando 

o local onde o mesmo deverá ser entregue; (2) todos os produtores e importadores deverão promover 

campanhas publicitárias de esclarecimento à população sobre recolhimento, coleta e potenciais de risco 

causado pelo derramamento ou destino inadequado de óleo lubrificante usado ou contaminado. 

3.2 Água 

No processo produtivo de diversas substâncias ocorre a liberação de inúmeros resíduos e na sua 

maioria são descartados diretamente em ambientes aquáticos causando fortes impactos negativos na 

biota dos ecossistemas atingidos. 

Embora a água seja abundante no planeta, é importante salientar que a sua disponibilidade para 

o homem é pequena. A maior parte da água existente na Terra (97,5%) é salgada e inadequada ao uso, a 

água doce corresponde a pouco mais de 2,5% do volume total desse recurso, mas 69,5% dela 

apresentam-se congelada e 30,1% encontram-se no subsolo. Enfim, apenas uma pequena parcela da água 

existente (0,27%) se apresenta sob uma forma facilmente utilizável pelo homem, em rios e lagos.  

A contaminação das águas superficiais pelos derivados de petróleo gera um agravante maior 

devido à baixa compatibilidade às propriedades físicas do meio e do contaminante. Grande parte das 

substâncias que compõem os óleos lubrificantes automotivos apresenta propriedades apolares enquanto 



13 

 

os microrganismos têm maior interação com substratos polares devido à utilização da água como veículo 

e meio de sobrevivência. Consequentemente, em muitos tratamentos remediadores a utilização de 

surfactantes se fazem necessários. Eles permitem a emulsificação com o aprisionamento de oxigênio na 

emulsão e também a interação na interface microrganismos/substrato (MARIANO, 2006). 

3.3 Solo e Micro-organismos 

O solo é formado por três fases: líquida, gasosa e sólida. A fase líquida compreende a solução 

do solo, onde se encontram em suspensão elementos químicos e moléculas solúveis. A fase gasosa é 

composta pelos gases presentes na atmosfera, porém em diferentes proporções (MOREIRA, 2006). Estes 

gases circulam entre as partículas do solo os quais também são originários de processos bioquímicos, 

como a respiração (ZILLI et al., 2003). A fase sólida é formada por partículas minerais (areia, silte e 

argila), raízes de plantas, populações de organismos macros e microscópios com metabolismo ativo ou 

dormente, e materiais orgânicos em vários estágios de decomposição. 

A área superficial específica dos constituintes minerais e orgânicos do solo pode variar de 

menos de 0,01 m2 g-1 (areia e resíduos orgânicos) até mais de 800 m2 g-1 (óxidos de ferro), variam 

também, em capacidades de trocas catiônicas e sua porosidade é outro parâmetro importante relacionado 

não só ao conteúdo de água e gases no solo como também à disponibilidade de espaços para os macro e 

microrganismos (MOREIRA, 2006). Esta porosidade permite, também, uma maior permeabilidade do 

solo e de materiais de superfície. Quanto maior a permeabilidade mais fácil é a distribuição dos 

nutrientes e do receptor de elétrons em solos contaminados. Evidentemente, estas condições tendem a 

ampliar a extensão da contaminação (MARIANO, 2006). 

Os microrganismos ocupam em torno de 0,5% do espaço poroso do solo podendo aumentar em 

solos rizosféricos (MOREIRA, 2006). Poros com alguns micrômetros (2 a 6 µm) são adequados para a 

presença de bactérias, enquanto fungos necessitam de poros maiores como está mostrado na Figura 1 

(MOREIRA, 2006). 



14 

 

 
Figura 1 - Localização dos constituintes minerais, bactérias e fungos no solo (Fonte: MOREIRA, 2006). 

 

As bactérias são os microrganismos presentes em maior número no solo, mas também se pode 

encontrar fungos, protozoários e algas (METTING, 1993). Possuindo a maior diversidade enzimática 

encontrada na Terra, estes microrganismos mineralizam a matéria orgânica que pode resultar na 

formação de humos e compostos secundários. Em solos tropicais, as altas temperaturas facilitam este 

processo, sendo necessária uma reposição do carbono oxidado, para que o solo não perca a fertilidade 

(LYON e BUCKMAN, 1943).  Às baixas temperaturas diminuem-se a fluidez e a permeabilidade da 

membrana celular, que controla o transporte de nutrientes (e contaminantes) entre o meio exterior e o 

interior da célula microbiana. (USEPA, 1995). 

A biomassa microbiana do solo, com sua atividade avaliada pela evolução de CO2 in situ ou em 

laboratório, também tem sido utilizada como indicativo da condição ambiental. Os métodos de avaliação 

da biomassa microbiana do solo são bastante variados, mas, de forma geral, permitem a avaliação do 

pool de carbono e, também, de outros nutrientes contidos nos microrganismos. A razão entre o CO2 

evoluído e o pool de carbono da biomassa microbiana fornece o quociente metabólico (qCO2), que 

indica o estado metabólico dos microrganismos e pode ser utilizado como indicador de estresse ou 

estabilidade do ecossistema (DE-POLLI E GUERRA, 1997). 

Análises da biomassa microbiana fornecem apenas uma estimativa quantitativa da diversidade 

de microrganismos, não considerando sua composição, ou a estrutura das comunidades microbianas. 

Assim, compreende-se ser necessário agregar ao conhecimento da biomassa microbiana informações 

sobre seus aspectos qualitativos, de forma a permitir uma avaliação mais adequada da qualidade de um 

solo (ZILLI et al., 2003). 



15 

 

3.4  Óleo lubrificante automotivo 

Os óleos lubrificantes automotivos são substâncias utilizadas para lubrificar e aumentar a vida 

útil do motor. Os óleos lubrificantes básicos (principal constituinte do óleo lubrificante automotivo 

acabado), em função da fonte ou do processo pelo qual são produzidos, podem ser denominados, como 

(MMA, 2006): 

• Óleos lubrificantes básicos minerais – obtidos através da destilação e do refino do petróleo sendo 

classificados em parafínicos ou naftênicos, dependendo do tipo de hidrocarboneto 

predominante em sua composição; 

• Óleos lubrificantes básicos sintéticos – produzidos através de reações químicas, obtendo-se 

produtos com propriedades adequadas às funções lubrificantes; 

• Óleos lubrificantes compostos ou semi-sintéticos – constituídos pela mistura de dois ou mais 

tipos de óleos básicos. Em geral, os básicos sintéticos têm como vantagens sobre os básicos 

minerais, maior estabilidade térmica e à oxidação, melhor propriedade a baixas temperaturas e 

menor volatilidade. Em contrapartida, os básicos minerais são muito mais baratos do que os 

sintéticos. 

Atualmente, do total de óleo lubrificante comercializado, os sintéticos ainda abrangem uma 

pequena porcentagem de venda, pois o mercado é ainda dominado pelos óleos de base mineral (BASU et 

al., 1998 e WRIGHT et al., 1993).  

Dentre os componentes dos óleos lubrificantes encontram-se os hidrocarbonetos poliaromáticos 

os quais são identificados como carcinogênicos e, como os óleos minerais apresentam uma maior 

concentração na sua composição, também se tornam mais danosos quando expostos aos seres vivos, 

entre eles o homem (COTTON et al., 1977). 

Assim, de acordo com Wright (1992) tem-se uma clara vantagem do óleo sintético sobre o 

mineral, pois, durante sua fabricação, sua composição pode ser controlada e ele pode apresentar-se 

ausente de hidrocarbonetos poliaromáticos. Outra vantagem apresentada pelo autor é o desenvolvimento 

de novas tecnologias para o produto final, como uma maior biodegradabilidade, maior resistência a 

temperaturas elevadas e alto desempenho. 

Para Battersby (2000), como na maioria dos lubrificantes, é pouco prático identificar a 

composição química do óleo lubrificante automotivo. Seus componentes podem apresentar taxas de 

degradação diferentes e são poucos solúveis em água limitando a biodegradação pela baixa 

disponibilidade de material dissolvido (BRAGA et al., 2002; OTENIO, 2002). 

 



16 

 

Entretanto, para o óleo lubrificante podemos citar algumas de propriedades (MMA, 2006): 

• Viscosidade - dificuldade com que o óleo lubrificante automotivo escoa. Quanto mais viscoso for 

um lubrificante, mais difícil de escorrer, portanto, será maior a sua capacidade de manter-se 

entre duas peças móveis, fazendo a lubrificação das mesmas. A viscosidade dos lubrificantes 

não é constante, ela varia com a temperatura. Quando esta aumenta, a viscosidade diminui e o 

óleo lubrificante automotivo escoa com mais facilidade; 

• Índice de viscosidade - mede a variação da viscosidade com a temperatura; 

• Densidade - indica a massa de um volume de óleo lubrificante automotivo a uma determinada 

temperatura. Sua alteração pode indicar contaminação ou deterioração de um lubrificante. 

 

Várias são as classificações dos óleos lubrificantes automotivos (MMA, 2006; TAVARES, 

2006), sendo que as principais são: SAE, da Society of Automotive Engineers e API, da American 

Petroleum Institute. 

a) Classificação SAE: estabelecida pela Sociedade dos Engenheiros Automotivos dos Estados 

Unidos, classifica os óleos lubrificantes pela sua viscosidade, que é indicada por um número. 

Quanto maior este número, mais viscoso é o lubrificante. São divididos em três categorias: 

Óleos lubrificantes de Verão: SAE 20, 30, 40, 50, 60 

Óleos lubrificantes de Inverno: SAE 0W, 5W, 10W, 15W, 20W, 25W 

Óleos lubrificantes multiviscosos (inverno e verão): SAE 20W-40, 20W-50, 15W-50 

b) Classificação API: estabelecida pelo Instituto Americano de Petróleo. Ela é a mais aceita 

internacionalmente (Tabela 1) e estabelece uma codificação que, em geral, é constituída por 

duas letras. 

 

A primeira letra pode ser S ou C e representa a aplicação automotiva: S (Spark Ignition ou 

Service) refere-se a óleos lubrificantes para motores de veículos leves a gasolina ou álcool; C 

(Compression Ignition ou Commercial) refere-se a óleos lubrificantes para motores do ciclo DIESEL 

(veículos pesados). 

A segunda letra indica o desempenho do óleo lubrificante automotivo em relação ao tipo do 

motor. 

 

 



17 

 

Tabela 1 - Grupos de óleos lubrificantes básicos, segundo a API (Fonte: TAVARES, 2006) 

Grupo índice de viscosidade 
 

teor de 
saturados (%) 

 

teor de 
enxofre (%) 

 
1 80 < x < 120 < 90 > 0,03 
2 80 < x < 120 > Ou = 90 < ou = 0,03 
3 > ou =120 > ou = 90 < ou = 0,03 
4 todas as polialfaolefinas 
5 todos os óleos básico não incluídos nos Grupos 1 a 4 

3.5 Óleo lubrificante automotivo usado 

O óleo lubrificante usado ou contaminado se constitui, ao mesmo tempo, em resíduo perigoso 

tóxico (Classe 1, segundo a NBR 10004 da ABNT) e em matéria prima destinada ao setor industrial 

(TAVARES, 2006). 

Os óleos lubrificantes automotivos usados, segundo Tavares, 2006, contêm produtos resultantes 

da deterioração parcial dos óleos em uso, tais como compostos oxigenados (ácidos orgânicos e cetonas), 

compostos aromáticos polinucleares de viscosidade elevada, resinas e lacas. Além dos produtos de 

degradação do básico, afirma o autor, estão presentes no óleo usado os aditivos (fenóis, compostos de 

zinco, de cloro, de enxofre ou de fósforo) adicionados no processo de formulação de lubrificantes e que 

não foram consumidos, metais pesados de desgaste dos motores e das máquinas lubrificadas (chumbo, 

cromo, bário e cádmio) e contaminantes diversos. Sua queima indiscriminada, sem tratamento prévio de 

desmetalização, gera emissões significativas de óxidos metálicos, além de outros gases tóxicos, como a 

dioxina e óxidos de enxofre, finaliza o autor. 

3.6 Biodiesel 

O emprego de óleos vegetais como combustível é conhecido desde os primórdios do motor a 

diesel. Em 1900, em uma exposição em Paris, Rudolf Diesel mostrou ao público um motor (que leva o 

seu nome até hoje) funcionando com óleo de amendoim. 

As aplicações do diesel fóssil têm grande destaque nas áreas de transporte e de geração de 

energias térmica e elétrica. Quando submetido ao funcionamento de motores térmicos, o biodiesel 

apresenta um comportamento satisfatório e é visto como um excelente substituto do diesel convencional. 

Além disso, o fato de o biodiesel ser miscível ao diesel fóssil levou muitos países a testar misturas 

binárias de biodiesel/petrodiesel, formando o “ecodiesel” (PARENTE, 2003), que resultou na redução 

não apenas do consumo de combustível fóssil como também dos impactos ambientais por ele causados.  



18 

 

Entretanto, é importante lembrar que tais misturas não se caracterizam como sendo estritamente 

biodiesel, recebendo uma denominação de acordo com seu respectivo percentual de biodiesel. Assim, 

para uma mistura de 2 % de biodiesel em diesel de petróleo, a denominação é B2; para a mistura de 25 

%, B25, e assim por diante (BIOCOMBUSTÍVEIS, 2007).  

Os motores alimentados com o combustível híbrido têm, aproximadamente, o mesmo 

desempenho de quando são movidos a diesel de petróleo puro. Quando a adição do biodiesel é da ordem 

de 2 a 5 % (B2 e B5), observa-se uma melhoria no funcionamento das máquinas devido ao aumento da 

lubricidade. Porém, quando essa fração de biodiesel aumenta (B50, por exemplo) é notada uma pequena 

queda na potência. Isso ocorre porque alguns elementos químicos que contribuem com o poder 

calorífico do diesel fóssil não estão presentes no biodiesel e para compensar a perda de energia, é notada 

a necessidade de um ligeiro aumento de consumo (BIOCOMBUSTÍVEIS, 2007).  

Países como a Alemanha, França e Itália já possuem programas bem desenvolvidos para a 

produção e uso do biodiesel. O Brasil, que já apresenta experiência no ramo de biocombustíveis através 

do PROALCOOL, tem novamente a colaboração da empresa Petrobras no através do PNPB que visa 

contribuir para o sucesso do Programa Federal de Biodiesel aprovado em 2004 que autoriza, desde 2005, 

a comercialização de biodiesel misturado ao diesel fóssil. Em janeiro de 2008, a mistura de 2 % de 

biodiesel ao diesel convencional tornou-se obrigatória. Em julho de 2009, este percentual passou para 3 

%, sendo que o aumento deste percentual para 5 %, que era previsto para 2013, foi antecipado pelo 

governo federal e já se encontra no mercado nacional. 

3.7 Rerrefino 

O rerrefino é um processo industrial que transforma o óleo lubrificante automotivo usado em 

óleo lubrificante básico, principal matéria-prima na fabricação do óleo lubrificante acabado (MMA, 

2006). 

Dados relativos a 2004 revelaram que a coleta nesse ano foi de 240 milhões de litros, ou seja, 

em torno de 24,0% (MMA, 2006). Apesar de não atingido a determinação de 30% do volume total do 

óleo lubrificante acabado conforme recomenda a Resolução CONAMA 362/2005, nosso país tem muito 

a comemorar, pois a coleta de óleo lubrificante usado aumentou cerca de 300% nos últimos 26 anos 

(Figura 2), passando de 14 para 38 coletores segundo dados do ano de 2005 da ANP (TAVARES, 2006). 



19 

 

 
Figura 2 - Coleta de óleo lubrificante usado nos últimos 26 anos no Brasil (Fonte: TAVARES, 2006). 

3.8 Efeitos nocivos ao meio ambiente 

A melhor maneira do usuário de veículo automotivo evitar o desperdício e a poluição por óleo 

lubrificante automotivo é fazer a troca em local especializado e licenciado para este fim, onde o óleo 

lubrificante automotivo usado deve ser adequadamente recolhido e encaminhado para o destino 

adequado, conforme legislação ambiental vigente. 

O óleo lubrificante automotivo pode causar intoxicação na fauna aquática pela presença de 

compostos como o tolueno, o benzeno e o xileno, entre outros ou agir obstruindo fisicamente os tecidos, 

causando asfixia e danos subletais, por impregnar na pele, nas brânquias ou em outras partes vitais e 

acessórias, sendo outro risco comum o impedimento da realização de diversas funções metabólicas da 

fauna aquática, como respiração, alimentação, excreção, homeostase, localização e movimentação 

(como as nadadeiras de peixes), entre outras limitações (MMA, 2006). 

3.9 Efeitos nocivos à saúde humana 

Os compostos químicos existentes nos óleos lubrificantes usados, principalmente, os metais 

pesados, produzem efeitos diretos sobre a saúde humana e vários deles são cancerígenos. O contato e a 

exposição aos óleos lubrificantes provocam lesões na pele, segundo MMA, 2006, e o risco à saúde do 

trabalhador depende da relação homem-produto, que é minimizado quando as instruções de segurança 

são seguidas corretamente. Mecânicos e auxiliares que são expostos ao óleo lubrificante automotivo ou 

ao óleo lubrificante automotivo usado de cárter, devem evitar o contato prolongado na pele e a inalação 

de gases (MMA, 2006). 



20 

 

3.10 Biodegradação 

Um importante mecanismo de remoção de compostos químicos orgânicos (RÉGIS, 2000; 

KATAOKA, 2001; BUNDY et al., 2002 e INAZAKI, 2003) e inorgânicos (GARNHAM et al., 1992 e 

GUPTA et al., 2001 apud NAVARRETE, 2006) de ambientes naturais é a biodegradação.  Ela consiste 

na transformação destes compostos mediante a atividade metabólica dos microrganismos, resultando 

eventualmente na formação de gás carbônico e água (CRIVELARO, 2005).  

Estes microrganismos podem ser nativos, exógenos ou geneticamente modificados (CUNHA e 

LEITE, 2000). A biodegradação requer a interação de muitos grupos de microrganismos diferentes, tais 

como algas, bactérias e fungos (MELO e AZEVEDO, 1997), que trabalhem juntos ou sequencialmente 

na degradação dos compostos (RÉGIS, 2000). Entre os gêneros de algas e cianobactérias mais 

comumente observados como degradadores desses compostos, pode-se citar: Ocillatoria sp., Agmellum, 

Selenastrum e Clorella, entre os fungos: Cunninghamella e Phanerochaete (MELO e AZEVEDO, 1997) 

e entre as bactérias: Achromobacter, Acinetobacter, Aeromonas, Alcaligenes, Bacillus, Beijerinckia, 

Corynebacterium, Flavobacterium, Moraxella, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Vibrio e 

Xanthobacter (CERNIGLIA, 1984; MAHAFFEY et a.l., 1988; NARRO et al. 1992 e BARBIERI, 1994 

apud MELO e AZEVEDO, 1997).  

Em ambientes aquáticos e terrestres, os microrganismos são os principais agentes da 

biodegradação de moléculas, incluindo hidrocarbonetos, como por exemplo, petróleo sendo que 

bactérias e leveduras parecem ser os degradadores dominantes nos ecossistemas aquáticos, enquanto que 

fungos e bactérias são os principais degradadores em ambientes terrestres (BALBA et al., 1998). 

A biotransformação de um composto orgânico pode alterar a toxicidade, a forma e a mobilidade 

do composto original (RÉGIS, 2000). Quase todos os compostos orgânicos podem ser degradados 

biologicamente se houver condições físicas e químicas adequadas aos microrganismos (RÉGIS, 2000; 

SILVA, 1977 e INAZAKI, 2003). As condições para que a biodegradação ocorra são, basicamente, três: 

(1) o microrganismo deve estar próximo ao composto orgânico, (2) o composto orgânico deve estar 

disponível ao microrganismo e (3) o microrganismo deve ter a capacidade de participar em alguma parte 

do processo de biodegradação ou transformação retirando energia para si (RÉGIS, 2000). Para o 

cumprimento dessas condições aos compostos mais difíceis de serem biodegradados deve-se proceder a 

uma seleção de microrganismos adequados a metabolização do substrato sendo que em alguns casos é 

necessária a adição de substâncias que funcionem como pontes e direcionadoras do microrganismo ao 

substrato (BUNDY et a.l., 2002; OTENIO, 2002 e KATAOKA, 2001).  



21 

 

A utilização de hidrocarbonetos pelos microrganismos é altamente dependente da natureza 

química dos compostos existentes na mistura de derivados de petróleo e das condições ambientais. 

Entretanto, as condições ambientais de nível biótico e abiótico tais como temperatura, pH, concentração 

de nutrientes inorgânicos e metais, predatismo e parasitismo são difíceis de ser obtidos em testes 

laboratoriais (BENGTSSON e ZERHOUNI, 2003).  

Os fatores ambientais que afetam a velocidade de biodegradação são:  

• Teor de oxigênio - Em quase todos os casos, a presença de oxigênio é fundamental para a efetiva 

biodegradação do óleo, uma vez que as etapas iniciais do catabolismo envolvem a oxidação dos 

substratos por oxigenases. A decomposição anaeróbia de hidrocarbonetos do petróleo ocorre 

muito lentamente. Alguns compostos, como benzoato, hidrocarbonetos clorados, benzeno, 

tolueno, xileno, naftaleno e acenafteno são degradados na ausência de oxigênio (ATSDR, 1999; 

OUDOT, 1998 e ROSATO, 1997); 

• pH - O pH ideal para a biodegradação é próximo da neutralidade (6 a 8). Para a maioria das 

espécies, o pH ótimo é ligeiramente alcalino, ou seja, pouco maior que 7 (PEDROZO, 2002); 

• Teor de água - O teor de água do solo contaminado afeta a biodegradação dos óleos devido à 

dissolução dos componentes residuais, à ação dispersora da água e pelo fato de ser necessária 

para o metabolismo microbiano. Este teor também afeta a locomoção microbiana, a difusão do 

soluto, o suprimento do substrato e a remoção dos produtos do metabolismo. Os teores ótimos 

de umidade encontram-se entre 50 a 70% da capacidade retentora de água (CETESB, 1990);  

• Temperatura - Todas as transformações biológicas são afetadas pela temperatura. Em geral, 

conforme a temperatura se eleva, a atividade biológica tende a aumentar até a temperatura em 

que ocorre desnaturação enzimática. A temperatura também influencia a biodegradação pelo 

efeito na natureza física e química do petróleo, a qual ocorre numa faixa de temperatura 

relativamente grande, de 0 a 70ºC. Em geral, à baixa temperatura, a viscosidade do óleo 

aumenta, a volatilização dos hidrocarbonetos de cadeia curta é minimizada, assim como a 

atividade enzimática e a velocidade de biodegradação. 

A velocidade de biodegradação também é afetada pelo volume de produto liberado para o meio 

ambiente. A velocidade de biodegradação no solo é razoavelmente independente da concentração do 

óleo, quando o volume liberado para o meio representa 0,5 a 1% do volume de solo (EASTCOTT et al., 

1989 apud NAVARRETE, 2006). Entretanto, conforme as concentrações de óleo aumentam, a 

velocidade de degradação de primeira ordem diminui e a meia vida da biodegradação do óleo se eleva e, 



22 

 

finalmente, quando a concentração do óleo atinge condições de saturação no solo (30 a 50% de óleo), a 

biodegradação cessa (EASTCOTT et al., 1989 apud NAVARRETE, 2006).  

Metais pesados podem influenciar a biodegradação de substâncias orgânicas por alterar a 

atividade ou a população microbiana. Vários elementos, como o chumbo, cádmio, níquel, cromo, cobre 

e zinco, foram estudados demonstrando esta ação (FRANKENBERGER, 1992). 

Entretanto, vários metais são essenciais para as atividades microbianas, mas em concentrações 

excessivas podem causar toxicidade (BETTIOL e CAMARGO, 2000). Segundo Cardoso e Chasin 

(2001) os estudos realizados em áreas contaminadas com cádmio e outros metais constataram inibição 

quanto à mineralização do nitrogênio e fósforo e diminuição na diversidade de fungos. Os modelos 

estatísticos aplicados nesses estudos mostraram que dentre os metais estudados o cobre foi o que 

apresentou maior toxicidade com relação aos fenômenos descritos. 

3.11 Biorremediação microbiana 

Dentre as novas estratégias para atenuar o efeito ambiental causado pela poluição das águas por 

hidrocarbonetos derivados de petróleo a biorremediação, para Rosato (1997), emerge como a mais 

barata, menos agressiva e mais adequada para manutenção do equilíbrio ecológico. Esse destaque deve-

se ao fato de que a degradação dos resíduos no meio ambiente por microrganismos utiliza-se do próprio 

potencial de reação dessas substâncias, pois estes seres utilizam-se delas como sendo fonte de energia.  

A esta capacidade microbial de degradação, denominou-se biodegradação e, à técnica de 

utilização desta capacidade para remediação ambiental, chamou-se biorremediação. Moreira (2006) 

define, ainda, Biorremediação como estratégia ou processo que emprega microrganismos ou suas 

enzimas para destoxificar contaminantes no solo ou outros ambientes.  

As técnicas de biorremediação podem ser realizadas no local do derrame (in situ) ou fora deste 

(ex situ), envolvendo inúmeros procedimentos tais como: biorremediação passiva, bioventilação, 

“landfarming”, compostagem, bioaumentação (introdução de microrganismos especializados na 

degradação do poluente) e bioestimulação (introdução de substâncias que estimulem o crescimento 

microbiano), segundo Pereira e Lemos, 2004. Porém, é de suma importância usar certos critérios na 

opção por biorremediação, pois se deve levar em conta a complexidade do ambiente e a concentração e 

complexidade dos contaminantes (LANDIS e YU, 1995).  

Os microrganismos em sistemas hídricos geralmente vivem na interface óleo-água, de onde eles 

atacam as moléculas do óleo (BROCK e MADINGAN, 1991); e como demonstrado por Zobbel (1969), 



23 

 

a oxidação microbiana é maior quando as moléculas de hidrocarboneto estão em íntimo contato com a 

água, papel realizado por surfactantes.  

Os surfactantes realizam o processo de micelização quando em contato com água junto a um 

soluto apolar, como os hidrocarbonetos, pois as moléculas do surfactante procuram se arranjar de modo 

a minimizar a repulsão entre grupos hidrofóbicos e a água (ALLINGER et al., 1990). Os lubrificantes 

são formados, em sua maior parte, por compostos apolares e os microrganismos possuem maior 

interação com substratos polares devido à utilização da água como solvente e meio de sobrevivência. 

Desta maneira, o surfactante permite a emulsificação com o aprisionamento de oxigênio na emulsão e 

também a interação na interface microrganismos/substrato. No processo de micelização, as moléculas do 

surfactante agrupam-se em torno do óleo por suas extremidades apolares, enquanto suas extremidades 

polares interagem com a água (Figura 4).  

 
Figura 3 - Micelas formadas pelo surfactante em contato com um soluto apolar (óleo lubrificante) e um 

solvente polar (água). 

O emprego de culturas mistas acontece quando microrganismos e enzimas degradam de forma 

seqüencial produtos naturais ou xenobióticos recalcitrantes. As vantagens de utilização de cultivos 

mistos podem ser apresentadas sob vários aspectos: maior produtividade, maior estabilidade, maior 

número de combinações genéticas, e redução na demanda da engenharia genética (BHATNAGAR e 

FATHEPURES, 2000).  

Individualmente, os microrganismos podem apenas metabolizar pequenas porcentagens de 

hidrocarbonetos (BRITTON, 1984), mas consórcios de populações com ampla capacidade enzimática 

são capazes de decompor misturas complexas de hidrocarbonetos (AUSTIN et al., 1977; ATLAS, 1981, 

1995; LEAHY e COLWELL, 1990 e OUDOT e DUTRIEUX, 1989). 



24 

 

3.12 Estudos sobre biorremediação de hidrocarbonetos 

Lopes (2006) realizou um ensaio de respirometria de um meio aquoso contaminado por óleos 

lubrificantes automotivos do tipo mineral, sintético e usado na proporção 95:5 de meio e contaminante 

utilizando-se do Tween 80
® 

como surfactante. Após sucessivas quantificações de CO
2 

produzido em 

cada ensaio, observou-se que a taxa de CO
2 

produzida foi maior o ensaio contendo óleo lubrificante 

automotivo usado e o ensaio com o segundo maior nível de produção foi aquele que continha óleo 

lubrificante automotivo semi-sintético, seguido do ensaio contendo óleo lubrificante mineral e, por fim, 

o ensaio controle no qual continha apenas água destilada. O autor concluiu que o óleo usado possui uma 

maior eficiência de biodegradação em meio aquoso quando comparado aos demais tipos (acabados), ou 

seja, aqueles que ainda não foram devidamente utilizados no motor automobilístico.  

Crivelaro (2005) realizou um estudo de biodegradação, utilizando-se dos respirômetros de 

Bartha e Pramer, de resíduos provenientes das refinarias de petróleo (borra oleosa) e destilarias de 

fermentação etanólica (vinhaça) usadas de maneira associada. Os tratamentos foram constituídos de 

solo, borra oleosa nas concentrações 7 e 14% (m/m), e ajuste da umidade do solo com e sem presença de 

vinhaça.  

As maiores eficiências de biodegradação e incorporação de carbono no solo ocorreram nos 

tratamentos com vinhaça que provocou um aumento expressivo de microrganismos, principalmente 

fungo, visto que pode ter servido como fonte de nutrientes para os mesmos.  

Hencklein (2005) buscou a estabilização de solo de “landifarming”, utilizando o método 

respirométrico de Bartha e Pramer para verificar a fase em que se encontrava concluindo que o solo 

“landfarming” utilizado se encontrava estabilizado sendo, assim, a biodegradação ocorreu sem a adição 

de outros materiais. Quanto à toxicidade, o solo mostrou-se tóxico à planária (Girardia tigrina).  

Bengtsson e Zerhouni (2003) confirmaram que as principais razões para a lenta biodegradação 

de Hidrocarbonetos Aromáticos Policíclicos (PAH) no solo corresponde à ausência de um substrato para 

o crescimento dos microrganismos e a bioviabilidade do PAH no solo. Mostraram também que a adição 

de certos substratos de carbono como óleo de refinaria e a adição de água como solvente facilitam a 

biodegradação.  

Bundy et al. (2002) estudaram o efeito da adição de óleo diesel na microbiota e simularam a 

biorremediação da comunidade microbiológica em três diferentes tipos de solo. Os resultados indicaram 

que a contaminação por diesel não resultou no desenvolvimento de perfis semelhantes da comunidade 



25 

 

microbiológica concluindo, portanto, que há diferentes potenciais microbióticos para degradar 

hidrocarbonetos em diferentes tipos de solos.  

Otenio (2002) aplicou o processo eletrolítico no pré-tratamento de água, avaliando sua ação 

sobre microrganismos da água do Rio das Cinzas no Serviço Autônomo de Água e Esgoto (SAAE) de 

Bandeirantes, Paraná. Houve uma fase experimental aplicando a eletrólise sobre bactérias Legionella 

pneumophila simulando contaminações encontradas em águas de torres de resfriamento eliminando 90% 

da espécie. Esta fase foi ampliada com testes de biodegradação, onde a bactéria Pseudomona putida 

CCMI852 foi desenvolvida em meio líquido com componentes da gasolina Benzeno, Tolueno, e Xileno 

e suas misturas. O tratamento eletrolítico mostrou-se efetivo na eliminação de bactérias heterotróficas e 

deindicadores coliformes totais e fecais da água bruta do Rio das Cinzas, Bandeirantes, Paraná. A fase 

experimental mostrou que o processo eletrolítico é efetivo também sobre bactérias resistentes. Nos 

ensaios de biodegradação, confirmou-se a caracterização genotípica da bactéria que possibilita a 

biodegradação de Tolueno e Xileno e suas misturas e a não biodegradação de Benzeno. Com o trabalho, 

concluiu ainda, que a presença do Benzeno nas misturas inibe a ação da bactéria sobre o Tolueno e 

Xileno. 

Silva et al. (2002), analisaram a presença dos micropoluentes BTEX (Benzeno, Tolueno, 

Etileno e Xilenos) para avaliar a qualidade da água de poço de algumas residências do bairro Brisa Mar, 

Itajaí-RJ, após dois anos da ocorrência de um vazamento de gasolina do tanque de armazenamento de 

combustível. Foram estudados também os possíveis mecanismos de atenuação natural (biodegradação 

intrínseca) envolvendo aceptores de elétrons. Os resultados mostram que ainda havia vestígios de BTEX 

na água consumida pela população local e que a disponibilidade tanto de O
2 

e NO
3

- 
contribui para a 

biodegradação do BTEX, porém o nitrato pode causar doenças como metamoglobinemia e câncer. 

Kataoka (2001) investigou a degradação de resíduo proveniente de refinaria de petróleo 

denominado borra oleosa. O resíduo foi submetido à biodegradação utilizando-se microrganismos 

isolados de áreas que estavam sendo expostas a este tipo de material. O acompanhamento da 

biodegradação foi realizado mediante utilização do ensaio de respirometria e de cromatografia gasosa. 

Os dados obtidos com a evolução de CO
2 

nos respirômetros de Bartha indicaram que os resíduos podem 

ter importante aumento na taxa de biodegradação com a inoculação de microrganismos adequadamente 

selecionados.  

Cunha e Leite (2000) avaliaram a biodegradação de gasolina em microcosmos constituídos de 

solo. Os microrganismos capazes de crescer na presença de gasolina foram isolados do solo e vários 

sistemas de tratamento foram testados usando tanto as espécies isoladas quanto Pseudomonas pudita 



26 

 

obtida de coleção de cultura. O sistema de tratamento constituído somente da microflora autóctone 

apresentou valores médios de degradação de 50%. A associação de Pseudomonas alcaligenes, 

Burkholderia cepacia e a microflora indígena do solo mostraram percentuais significativos.  

Régis (2000) avaliou a biodegradação do efluente de uma indústria química produtora de 

antioxidante para borracha frente à eletrólise em diferentes tempos de exposição. Os resultados 

apontaram uma diminuição de toxicidade, do efluente bruto, com o tempo de 20 min ao Saccharomyces 

cerevisae. O autor concluiu que a eletrólise é um método eficaz no tratamento de efluentes acelerando a 

biodegradabilidade através da diminuição do tempo de adaptação e latência dos microrganismos ao 

efluente. 

Del’arco e França (1999) estudaram a biodegradação de óleo cru em sedimentos arenosos. Os 

autores viram que compostos com cadeias ramificadas são degradados mais lentamente do que os seus 

compostos análogos em cadeias retas. Além destes, compostos aromáticos também parecem ser mais 

recalcitrantes que seus semelhantes em cadeias cíclicas não-aromáticas. Os autores confirmam a idéia de 

que os componentes do petróleo apresentam diferentes suscetibilidades ao ataque microbiano. Este 

trabalho também mostra que a introdução de culturas mistas (obtidas a partir de "landfarming") no 

sedimento arenoso acrescido de óleo cru aumentou a biodegradação com relação aos tratamentos que 

continham somente organismos autóctones do resíduo (óleo cru). No mesmo estudo, mas com relação à 

utilização de culturas mistas de microrganismos para biodegradação, constataram uma redução de 42,9% 

da fração pesada do óleo em 28 dias quando fosfato e nitrogênio foram adicionados. Na presença apenas 

da flora nativa esse valor foi de 11,9%. O resultado demonstra a importância de utilização de culturas 

adaptadas para a maior eficiência de biodegradação dos poluentes e no processo de biorremediação.  

Siviero (1999) estudou a aplicação de várias taxas de areia fenólica em respirômetros de Bartha 

mantidos à temperatura de 28°C e avaliou a biodegradação deste resíduo. Durante o experimento, 

determinou-se UFC/mL de bactérias, fungos e actinomicetos adaptados ao fenol do solo presente nos 

respirômetros. Também foi quantificada a produção de CO
2 

devido à biodegradação dos compostos 

orgânicos incorporados na areia fenólica. A taxa de aplicação que corresponde a 18,6 mg de fenol/kg de 

solo foi a que apresentou maior eficiência de remoção do fenol, chegando à média de 89%. O 

pesquisador concluiu que o resíduo sólido denominado areia fenólica poderia ser disposto no solo, num 

sistema piloto de tratamento, em condições controladas, com acompanhamento dos fatores físico-

químicos, microbiológicos e toxicológicos.  

Ururahy et al. (1998) estudaram a viabilidade técnica do tratamento biológico de borra oleosa 

através de estímulo de microrganismos nativos, em escala de bancada. Tendo a borra oleosa como única 



27 

 

fonte de carbono e energia, tais populações de microrganismos foram capazes de crescer. Concentrações 

de 5% (v/v) e 10% (v/v) foram estudadas sendo observadas maiores densidades microbianas na primeira 

condição e inibição pelo substrato e/ou efeito tóxico na segunda. Comprovou-se com o experimento, a 

importância da aeração sobre a atividade microbiana, assim como sobre a biodegradação do resíduo. No 

procedimento de identificação houve predominância de bactérias do gênero Pseudomonas e de leveduras 

dos gêneros Candida e Rhodotorula.   

Segundo Rosato (1997), uma aplicação de 5% de hidrocarbonetos ao solo forneceu os melhores 

resultados de biodegradação para todas as classes de compostos. A adição de glicose e extrato de 

leveduras aumentou a biodegradação até 70%. Usando-se essas bactérias no solo, houve aumento da 

degradação durante 30 dias de 40% para 70%.  

Dibble e Bartha (1979) avaliaram e aperfeiçoaram os parâmetros ambientais do processo de 

landfarming. A biodegradação foi monitorada pela evolução de CO
2 

e análise periódica dos 

hidrocarbonetos residuais. A biodegradação ocorreu com maior eficiência na faixa de umidade de 30 a 

90%, pH de 7,5 a 7,8, temperatura superior a 20ºC, taxa de C:P de 800:1 sendo que a adição de 

micronutrientes não foi benéfica. Eles utilizaram várias concentrações para seus efluentes concluindo 

que a taxa de biodegradação máxima no solo foi alcançada com uma concentração ao redor de 5% e com 

capacidade de campo de 50 a 70%. Quanta ao pH, valores extremos inibem a maioria dos processos de 

degradação por microrganismos sendo que, fungos são menos afetados com valores de pH mais baixos 

do que bactérias. 

3.13  Bioestimulação 

O processo de bioestimulação consiste em introduzir nutrientes na forma de fertilizantes 

orgânicos ou inorgânicos em um sistema contaminado, o que causa o aumento na população de 

microrganismos nativos. Os microrganismos podem ou não ter como alvo os hidrocarbonetos como 

fonte de alimento. Contudo, os hidrocarbonetos são, supostamente, degradados mais rapidamente do que 

no processo de degradação natural, devido à elevação do número de microrganismos causado pelo 

aumento dos níveis de nutrientes (SARKAR et al. 2005 apud OLIVEIRA e LEMOS, 2005). Nitrogênio 

e fósforo são nutrientes mais utilizados nos processos de bioestimulação já que estimulam o crescimento 

das populações microbianas.  O nitrogênio está intimamente relacionado ao metabolismo dos 

microrganismos. Estudos realizados com fungos mostraram que para 100 unidades de carbono 

degradado são necessárias, em média, 3 a 4 unidades de nitrogênio (PEREIRA e LEMOS, 2004). 



28 

 

O acréscimo de fertilizantes em derrames de óleo tem encabeçado avanços na biodegradação 

(BRASSERES et al., 1993; OLIVIERI et al., 1976; PRINCE, 1993). A fase orgânica dos fertilizantes 

são gradualmente metabolizadas, liberando vagarosamente nitratos e fosfatos no meio, os quais se 

tornam gradualmente assimiláveis pelas bactérias (ATLAS e BARTHA, 1973; LADOUSSE e 

TRAMIER, 1991).  

Oliveira e Lemos (2005) estudaram as condições de biodegradação de um solo contaminado por 

petróleo utilizando fungos filamentosos e as técnicas de bioaumentação e bioestimulação. Os resultados 

mostraram que a adição das fontes de nitrogênio (extrato de levedura e uréia) nas proporções 100:10 

beneficiou o percentual de biodegradação em relação à amostra controle que não continha nitrogênio 

extra. Entretanto, o melhor resultado foi obtido com a utilização da uréia com nutriente. 

Coelho (2005) avaliou a eficiência do uso de suportes para fixação do fertilizante agrícola NPK 

a fim de obter melhor dissolução na água do mar durante o processo de biorremediação e, assim, 

otimizando o tempo de tratamento e a quantidade de fertilizante utilizada na aceleração da 

biodegradação dos principais componentes do petróleo. Os resultados mostraram que o uso do 

fertilizante NPK foi eficiente no processo de biorremediação. A evaporação do poluente foi responsável 

pela redução de 35% da massa de óleo derramada e aproximadamente 50% dos compostos foram 

reduzidos por biorremediação. 

Baptista et al. (2005) avaliaram a biodegradação do petróleo em solo argiloso durante 45 dias 

de ensaios. Os ensaios foram conduzidos em biorreatores aeróbios de leito fixo, com 300 g de solo 

contaminado à temperatura ambiente e com vazão de ar de 6L/h. As deficiências nutricionais foram 

corrigidas com 2,5% (p/p) de (NH4)2SO4 e com 0,035% (p/p) de KH2PO4. O monitoramento foi 

realizado em função da produção de CO2, da remoção da matéria orgânica, de óleos e graxas e de 

hidrocarbonetos totais de petróleo, além de bactérias heterotróficas totais e hidrocarbonoclásticas, no 

início e após 45 dias. Nos biorreatores onde houve maior crescimento de bactérias hidrocarbonoclásticas 

e maior produção de CO2, obtiveram-se os melhores percentuais de remoções de matéria orgânica 

(50%), óleos e graxas (37%) e hidrocarbonetos totais de petróleo. 

Trindade et al. (2005) observaram que altas concentrações de poluentes, mesmo em solos há 

muito tempo contaminados pelos mesmos, pode afetar a população microbiana inibindo o processo de 

biodegradação. Eles compararam a eficiência de biodegradação entre um solo recém contaminado e 

outro há quatro anos contaminado depois de aplicadas técnicas de bioestimulação e adição de 

populações microbianas convenientes (bioaumentação). Ambos solos foram contaminados com 5,4% de 



29 

 

hidrocarbonetos de petróleo totais (TPHs) obtendo melhores resultados no solo contaminado há quatro 

anos sujeito a bioestimulação e a bioaumentação. 

Pereira e Lemos (2004) estudaram as condições de biodegradação dos fungos filamentosos 

Aspergillus niger e Penicillium corylophilum avaliando o emprego de três fontes de nitrogênio bem 

como a capacidade de produção de surfactantes por ambos agentes biodegradadores. Os melhores 

resultados foram obtidos com a adição de uréia, a qual resultou numa eficiência de biodegradação de 

17,7% para o Aspergillus niger e 20,1% para Penicillium corylophilum. 

Estudos realizados por Gray et al. (2000) mostraram que o acréscimo de nutrientes como 

nitrogênio, fosfato, oxigênio e enxofre não limitam a remoção final dos hidrocarbonetos, e os resultados 

ainda mostram que a incapacidade de 75 a 85% das culturas ativas em degradar as maiores classes de 

hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) deve-se a indisponibilidade desses compostos aos 

microrganismos.  

LaDousse e Tramier (1991) conseguiram uma biodegradação de até 60% em tratamentos com 

fertilizantes quando comparados à taxa de 38% de biodegradação nas amostras que não sofreram adição 

de fertilizantes. 

3.14 Respirometria 

A respiração da comunidade microbiana do solo tem sido utilizada como indicador de atividade 

biológica em seu perfil, constituindo-se numa ferramenta importante para avaliar o potencial de 

biodegradação de compostos orgânicos nele dispostos. O ensaio de respirometria consiste na 

determinação da quantidade de CO
2 

gerado no processo de degradação da matéria orgânica. Considera-

se que há uma correlação entre a geração de CO
2 

e a biodegradação da matéria orgânica no solo 

(SIVIERO, 1999).  

A Norma Técnica L6.350 da CETESB (1990), considera que a medida de CO
2 

produzida nos 

respirômetros pode ser efetuada em sistemas de análise em fluxo continuo ou em sistemas fechados 

sendo os sistemas de fluxo contínuo constituídos por câmaras de incubação, por onde se faz passar um 

fluxo de ar isento de CO
2
, sendo o ar efluente borbulhado em solução alcalina para remover o CO

2 

produzido pela respiração dos microrganismos. O gás carbônico gerado seria então medido, por método 

químico. A utilização do respirômetro de Bartha tornou-se freqüente em pesquisas relacionadas 

principalmente com a degradação de lodos de esgoto no solo provenientes de estações de tratamento de 

esgoto doméstico e industrial (CASARINI et al., 1988; GUERRA, 2005 e NUVOLARI, 1996).  



30 

 

Bartha e Pramer (1965) realizaram ensaios utilizando frascos biométricos em um estudo 

comparativo para verificar a geração acumulada de CO
2 

durante 19 dias em frascos contendo 50 g de 

solo e 500 ppm das seguintes substâncias: ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D); glicose; azida e fenol. 

A mistura solo-fenol foi a que apresentou maior geração de 33 CO
2 

e a solo-azida a menor, concluindo-

se que a azida na concentração testada apresenta toxicidade aos microrganismos do solo. 

3.15 Toxicidade 

A toxicidade é uma propriedade inerente aos agentes químicos que produzem efeitos danosos a 

um organismo quando este é exposto, durante certo tempo, a determinadas concentrações (BERGMAN 

et al., 1986 apud NAVARRETE, 2006). Assim, a toxicidade de um agente é dada em função da sua 

concentração e da duração da exposição. Sob este aspecto, qualquer substância pode ser considerada 

potencialmente tóxica aos seres vivos (DUFFUS, 1983).  

A poluição do solo é causada principalmente por derramamentos acidentais e mau 

armazenamento de resíduos. A biorremediação é um método efetivo para diminuir a presença de 

compostos tóxicos no ambiente. Este método visa promover a degradação de compostos para produtos 

mais simples de ocorrência comum no ambiente, porém, durante o processo, produtos mais tóxicos 

podem ser gerados. A formação de compostos tóxicos e/ou mutagênicos durante o tratamento pode ser 

monitorada mediante avaliações da toxicidade (CETESB, 2006).  

Navarrete (2006) avaliou a capacidade de comunidades de algas alóctones na detoxicação do 

solo de landfarming de refinaria de petróleo. Amostras das misturas solo de landfarming: solo de 

cerrado bem como os respectivos extratos solubilizados foram submetidas, em intervalos de 45 dias após 

a inoculação algal, a avaliações toxicológicas empregando minhoca Eisenia foetida (Oligochaeta) e 

sementes de Eruca sativa (Crucífera) nas amostras de solo e Daphnia similis (Cladocera) e Girardia 

tigrina (Tricladida) nas amostras de extratos solubilizados.  

Inazaki et al. (2001) avaliaram a toxicidade do composto 1,2-diidro-2,2,4-trimetilquinoleina 

polimerizada, presente no efluente de uma indústria de produtos químicos. Foram testadas soluções 

preparadas com o composto, em diferentes concentrações (1;5;10;20;30 e 40 ppm), sendo que o grupo 

controle foi tratado com água potável. Para cada tratamento utilizou-se 3 placas de Petri, as quais 

continham papel de filtro, alem de cinqüenta sementes de Eruca sativa em estado dormente. As 

soluções-teste foram utilizadas para umedecer o papel de filtro, colocando-se inicialmente 1,5 mL de 

cada solução em cada placa de Petri. Após 24h adicionou-se 1 mL de cada concentração nas respectivas 

placas, para a manutenção da umidade. Ao final de 48 horas observou-se a taxa de germinação das 



31 

 

sementes. O grupo controle obteve taxa de germinação de 88,66%. As concentrações de 1 e 5 ppm não 

apresentaram diferença significativa, obtendo-se taxa de germinação de 86% e 84% respectivamente. A 

partir da concentração de 10 ppm houve inibição no processo de germinação (74,66%), sendo que na 

concentração de 40 ppm houve 6% de germinação. Os autores concluíram que o teste utilizando 

sementes de Eruca sativa é eficiente no monitoramento da toxicidade quando este composto está 

presente. 



32 

 

4 MATERIAL E MÉTODOS 

4.1 Material 

4.1.1 Solo 

O solo utilizado nos ensaios de biodegradação é do tipo arenoso com granulometria máxima de 

1,41 mm obtido em obras de construção civil da cidade de Rio Claro/SP. A escolha pelo tipo arenoso se 

deu já que esta é a característica das margens e rios e por sua propriedade mais favorável para o 

transporte de nutrientes e oxigenação. 

4.1.2 Tipos de óleos lubrificantes automotivos estudados 

Os óleos lubrificantes semi-sintético e mineral foram comprados no varejo em um posto de 

combustível localizado na cidade de Rio Claro-SP os quais seguem, abaixo, as especificações: 

a) Óleo Lubrificante Mineral: Texaco-Havoline- SAE 20W-50 (SJ); 

b) Óleo Lubrificante Semi-sintético: Texaco-Havoline – SAE 15W-40 (API SL/CF);  

c) Biodiesel comercial (2% de Biodiesel e 98% de diesel) da Petrobrás Distribuidora. 

Os óleos lubrificantes automotivos usados (semi-sintético e o mineral) foram obtidos em um 

centro de lubrificação na cidade de São Paulo, no bairro São Miguel Paulista em uma loja especializada 

chamada Carburatork, o óleo foi coletado quando os proprietários foram trocar o óleo dos seus carros e 

foi perguntado qual o óleo que eles utilizavam e os mesmos confirmaram um uso de óleo lubrificante 

semi-sintético e mineral em seus respectivos carros. O óleo usado foi proveniente de trocas de 

lubrificantes de automóveis. 

A Sociedade dos Engenheiros Automotivos (SAE) é quem classifica o grau de viscosidade dos 

lubrificantes aceitos pelas montadoras e pelos próprios fabricantes. De acordo com a instituição, os óleos 

lubrificantes são divididos em dois grupos: os de “verão”, cuja viscosidade é medida a altas 

temperaturas (SAE 20, SAE 30, SAE 40, SAE 50 e SAE 60); e os de “inverno” (winter, em inglês), 

identificados pela letra W com viscosidade medida a baixas temperaturas (SAE 0W, SAE 5W, 

SAE10W, SAE 15W, SAE 20W e SAE 25W) se comportam como óleos mais “finos” (como os de 

inverno) no momento da partida do motor, oferecendo assim boa lubrificação e menor resistência ao 

movimento das peças quando o conjunto está frio. Um exemplo é o SAE 10W/40 que, em baixas 

temperaturas, se comporta como um produto SAE 10W, facilitando a partida a frio. Em altas, se 



33 

 

comporta como um produto SAE 40, garantindo uma película lubrificante suficientemente espessa para 

proteção dos componentes. 

Comparando um óleo SAE 25W/40 com um SAE 25W/50, pode-se dizer que a baixas 

temperaturas (ou na partida a frio) eles têm a mesma fluidez, porém a altas temperaturas o óleo SAE 

20W/50 forma uma película mais grossa do que um lubrificante SAE 20W/40. 

4.1.3 Tipo de óleos vegetais usados 

Óleo de soja Liza Novo 

Óleo de soja Liza usado 

Biodiesel puro de soja da marca, Caramuru Alimentos S. A. 

4.1.4 Microrganismos 

Os microrganismos foram advindos do próprio solo onde se enterrava o inóculo base, 

localizado atrás do Departamento de Bioquímica e Microbiologia da UNESP - Rio Claro  (22° 05' e 22° 

40' S, 47° 30' e 47° 55' W). 

4.1.5 Organismos-teste 

Empregaram-se sementes de Eruca sativa (rúcula - Crucífera) e de Lactuva sativa (alface) 

como organismos-teste em bioensaios de toxicidade. 

4.1.6 Respirômetro de Bartha e Pramer 

A respiração da comunidade microbiana do solo tem sido utilizada como indicador da atividade 

biológica em seu perfil, constituindo-se uma ferramenta importante para avaliação do potencial de 

biodegradação de compostos orgânicos nele disposto. Em vista da baixa solubilidade em água de alguns 

lubrificantes, normalmente o método respirométrico, que pode medir tanto a evolução do CO2 quanto à 

de O2, é indicado (CETESB, 1990; BATTERSBY, 2000). Através das medidas de CO2 produzido 

durante o período de incubação (diferença entre a produção com resíduo e a do controle correspondente) 

é possível estimar, os tempos de indução para o início da biodegradação, a velocidade máxima e a fração 

de resíduo que foi degradado. (CETESB, 1990). 

A metodologia utilizada para acompanhar a biodegradação do óleo foi seguida conforme 

Norma Técnica L6350 (CETESB, 1990) a qual recomenda respirômetros padrão Bartha. A Figura 4, 

abaixo, ilustra o modelo utilizado: 



34 

 

 
Figura 4 - Esquema de um respirômetro de Bartha. A: Tampa da cânula. B: Cânula de diâmetro entre 1 

e 2 mm. C: Rolha de borracha. D: Braço lateral de diâmetro ~ 40 mm e altura ~ 100 mm. E: Solução de 

KOH. F: Solo. G: Frasco Erlenmeyer (250 mL). H: Válvula. I: Suporte com lã de vidro ou algodão. J: 

Filtro de ascarita de diâmetro ~ 15 mm e altura ~ 40 mm. 

4.1.7 Reagentes utilizados no ensaio de respirométrico 

4.1.7.1 Água isenta de CO2 

Transferiu-se para um béquer de 1000 mL a quantidade desejada de água destilada e levou-se 

ao bico de Bunsen sobre tela de amianto. Ferveu-se a água até a ebulição durante 30 minutos, 

evidenciando a redução da solubilidade dos gases no líquido. Transcorrido este período, esperou-se o 

resfriamento em recipiente com filtro de cal soldada para utilização da água na coleta de dados dos 

respirômetros. 

4.1.7.2 Solução de hidróxido de potássio (KOH - 0,2 M) 

Dissolveram-se 11,2 g de KOH em 1000 mL de água isenta de CO2. Guardou-se a solução em 

recipiente plástico, com filtro de ascarita. Padronizou-se, utilizando 100 mL de solução 0,200 N de 

ftalato ácido de potássio, com duas gotas de indicador vermelho de metila e calculou-se a normalidade 

real do KOH (NKOH), através da expressão: 

NKOH= 100 x 0,200, onde: 

                 V2 



35 

 

100 = volume em mL de ftalato ácido de potássio utilizado; 

0,200 = normalidade do ftalato de potássio; 

V2 = volume em mL de KOH gasto na viragem de vermelho para amarelo. 

4.1.7.3 Solução padrão de ftalato ácido de potássio (C6H4COOKCOOH - 0,2 M) 

Secou-se o ftalato ácido de potássio em estufa a 110-120ºC por 30 minutos e esfriou-se em 

dessecador até temperatura ambiente. Em seguida, foram pesados 40,86 g de ftalato e transferido a um 

balão volumétrico de 1000 mL. Completou-se o volume deste com água destilada isenta de CO2 e 

armazenou a solução em recipiente de vidro. 

4.1.7.4 Solução de ácido clorídrico (HCl - 0,1 M) 

Transferiu-se 8,5 mL de HCl concentrado para um balão volumétrico de 1000 mL e completou-

se o volume com água destilada. Padronizou-se contra 100 mL de solução de carbonato de sódio 0,1 M, 

usando-se 2 gotas de alaranjado de metila como indicador, e calculando-se a normalidade real do HCl.  

NHCl = 100 x 0,1, onde: 

                  V2 

100 = volume em mL de carbonato de sódio utilizado na titulação; 

0,1 = normalidade do carbonato de sódio; 

v2 = volume em mL de HCl gasto na viragem de amarelo para vermelho. 

4.1.7.5 Solução padrão de carbonato de sódio (Na2CO3 – 0,1 M) 

Secou-se o carbonato de sódio a 200ºC por uma hora e esfriou-o em dessecador até temperatura 

ambiente. Posteriormente, foram pesados 5,30 g de carbonato de sódio e transferido a um balão 

volumétrico de 100 mL. Completou-se o volume deste com água destilada isenta de CO2 e armazenou a 

solução em recipiente de vidro. 

 

4.1.7.6 Solução de cloreto de bário (BaCl2 - 0,1 M) 

Dissolveram-se 12,2 g de cloreto de bário e completou-se o volume para 1000 mL com água 

destilada isenta de CO2 e guardou-se em recipiente de plástico. 

4.1.7.7 Solução indicadora de fenolftaleína 

Dissolveram-se 0,2 g de fenolftaleína em 60 mL de etanol e completou-se com água destilada 

para 100 mL, sob agitação constante. A solução foi filtrada em algodão, quando houve formação de 

precipitado. 



36 

 

4.1.8 Meios de Cultura 

Os meios de cultura foram preparados de acordo com o Manual Difco Laboratories (1984): 

• Meio Plate Count Agar (PCA) 

Triptona ____________________ 5,0 g 

Extrato de levedura ___________ 2,5 g 

Glicose _____________________ 1,0 g 

Ágar _______________________ 15,0 g  

Água destilada _______________ 1000 mL 

• Meio Bushnell-Hass (BH) 

Sulfato de magnésio _____________0,2 g 

Cloreto de cálcio ________________0,02 g  

Fosfato de potássio monobásico ____1 g  

Fosfato dibásico _________________1 g   

Nitrato de amônia ________________1 g  

Cloreto férrico __________________0,05 g  

4.1.9 Equipamentos e vidraria 

Agitador magnético da marca Fisaton 

Balança semi-analítica da Gehaka modelo BG 440  

Balança analítica da Chyo modelo JK 200 

Frascos de Bartha 

Peneira de 1.41 mm da Elates 

Placas de Petri 

Contator de colônias da Tecnal modelo CP600 

Shaker da Catel 

Câmara de Germinação Tipo B.O.D. da Marconi modelo MA403  

Estufa da Nova Ética  

Suporte universal 

Dessecador 

 

 



37 

 

4.1.10 Inóculo do solo 

Na preparação do inóculo do solo foram misturados 100 mL de água destilada, 1 mL de Tween 

80® e 50 mL de uma mistura proporcional dos óleos utilizados (6,25 mL de cada tipo óleo). Assim, esta 

solução foi colocada em um saco plástico contendo 3 kg de areia homogeneizada e peneirada com 

peneiras de 1,41 mm da Élates (solo). Em seqüência, foram feitos pequenos furos no saco para permitir 

trocas gasosas e o fluxo de microrganismos do solo e do meio contaminado no interior do saco, que foi 

enterrado a uma profundidade aproximada de 20 centímetros. O material permaneceu no solo por 20 

dias, período no qual ocorre seleção de microrganismos especializados na degradação dos óleos em 

análise (LOPES e BIDOIA, 2010). 

4.1.11 Inóculo de Bacillus subtilis 

Para os ensaios respirométricos foi utilizado um inóculo de Bacillus subtilis disponível em 

culturas mantidas em meio de ágar nutriente (NA) a 10ºC. Os microrganismos presentes no meio serão 

reativados por 48 h e, posteriormente inoculados em 50 mL de meio BH (Tabela 2) por 48 h a 35ºC para 

crescimento. Após este período, a cultura de B. subtilis obtida será utilizada no preparo do “inóculo 

aquoso”. 

Tabela 2 – Componentes do meio BH (Bushnell-Hass) 

Componentes Concentração (g L-1) 

MgSO4 0,200 

CaCl2 0,020 

KH2PO4 1,000 

NH4NO3 1,000 

FeCl3 0,050 

K2HPO4 1,000 

4.1.12 Inóculo aquoso 

O meio liquido adicionado nos respirômetros foi denominado “inóculo aquoso”. Seu 

procedimento metodológico será adaptado de Lopes e Bidoia (2010). Em seu preparo, misturou-se 1 kg 

do inóculo do solo, 50 mL de inóculo de B. subtilis, 75 mL de Tween 80® e 1500 mL de água destilada. 

Esta solução foi muito bem homogeneizada e o meio líquido transferido para os frascos respirométricos 

foi obtido próximo a superfície da mistura. 



38 

 

4.1.13 Quantificação do CO2 

A quantificação do CO2 foi obtida pela titulação da solução de KOH do braço lateral com uma 

solução de HCl, utilizando-se de BaCl2 para precipitação de íons carbonato e fenolftaleína como solução 

indicadora. Os níveis de dióxido de carbono podem ser calculados e representados em função do tempo 

de incubação (BALBA et al.,1998). 

4.1.14 Composição dos sistemas respirométricos 

Foram realizados 8 sistemas respirométricos em duplicata, os quais apresentarão 99 mL de 

inóculo aquoso e 1 mL do óleo a ser estudado (Tabela 3). 

 

Tabela 3 – Composição dos sistemas respirométricos 

 Composto Abreviação Inóculo 

aquoso (mL) 

Composto 

(mL) 

Sistema 01 Óleo lubrificante semi-sintético novo SSN 99 1 

Sistema 02 Óleo lubrificante semi-sintético usado SSU 99 1 

Sistema 03 Óleo lubrificante mineral novo MN 99 1 

Sistema 04 Óleo lubrificante mineral usado M.U 99 1 

Sistema 05 Óleo diesel comercial (2% de 

biodiesel) 

B 2 99 1 

Sistema 06 Biodiesel 100% B 100 99 1 

Sistema 07 Óleo vegetal de soja novo VN 99 1 

Sistema 08 Óleo vegetal de soja usado VU 99 1 

 

Também, foi realizado o ensaio controle (C), formado por 99 mL do inóculo aquoso e 1 mL de 

água destilada. Assim, todos os respirômetros foram hermeticamente fechados e incubados a 28 oC. 

4.1.15 Cálculo do CO2 produzido nos respirômetros 

A quantificação de CO2 produzido nos respirômetros foi gerada a partir do volume gasto de 

HCl na titulação do KOH. A quantidade de CO2 gerada em cada respirômetro foi calculada em mg, pela 

seguinte equação: 

 GCO2 = (A-B) x 50 x fHCl x 0,044 , onde: 

GCO2 = geração de gás carbônico; 



39 

 

A = volume gasto de HCl 0,1 N gasto, em mL, na titulação do branco; 

B = volume de HCl 0,1 N gasto, em mL, na titulação da amostra; 

50 = fator para transformar equivalente em µmol de CO2; 

f(HCl) = fator do HCl 0,1 N; 

0,044 = fator para transformar µmol  em mg de CO2. 

O acúmulo de CO2 permite quantificar a biodegradação dos diferentes tipos de óleos. Com 

esses dados será possível evidenciar do acúmulo de CO2 pelo tempo de incubação, que permite 

determinar qual óleo será o mais biodegradável e quais as condições ideais para o processo. 

4.1.16 Testes de Toxicidade 

Os ensaios toxicológicos foram realizados no início e ao final do tratamento utilizando-se de 

sementes de rúcula (Eruca sativa) e sementes de alface (Lactuca sativa) e seu método foi adaptado de 

Guerra (2009). 

4.1.16.1 Teste de toxicidade com sementes de Eruca sativa (rúcula) e Lactuca sativa (alface) 

Foram utilizadas como sistema-teste duas espécies vegetais, Lactuca sativa (alface) e Eruca 

sativa (rúcula), onde foram testadas as soluções provenientes dos frascos de Bartha antes e após o 

tratamento de biorremediação. Os teste foram feitos em duplicatas contendo 50 sementes cada. As 

sementes serão distribuídas uniformemente em placa de Petri, sobre papel de filtro previamente 

esterilizado. A cada placa será adicionada 3,5 mL de solução testada, que serão acondicionadas em 

câmara climática (Incubadora de DBO) a 22 ± 1ºC, ao abrigo de luz. O controle negativo será composto 

por água mineral e controle positivo por ZnSO4 0,05 N. 

A contagem das sementes germinadas foi realizada em intervalos de 24 horas, e serão 

consideradas germinadas as sementes que apresentarem 2 mm de protusão da radícula. E cada semente 

germinada será removida após a contagem. 

Os teste toxicológicos foram realizados antes e após tratamento. 

4.1.17 Forma de análise de resultados 

Foram utilizados os softwares Microsoft Excel e Origin 6.0 para a formação de um banco de 

dados, a partir do qual serão realizadas análises descritivas por meio de gráficos e tabelas. 

Para os testes de toxicidade utilizou-se a fórmula de Abbott (NAKANO, 1981), com 

adaptações, que fornece a porcentagem da eficiência da germinação (%E). Abaixo segue a fórmula 

adaptada: 



40 

 

 %I = (C – T) / C x 100, onde: 

%I = porcentagem de inibição 

C = nº de sementes germinadas no controle 

T = nº de sementes germinadas no tratamento 



41 

 

5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 

5.1 Biodegradação do óleo lubrificante automotivo mineral (novo e usado) e semi-sintético (novo 

e usado), Biodiesel puro (100%) e comercial (2% de biodiesel e 98% de diesel) e de óleos 

vegetal derivado da soja (novo e usado) em meio aquoso com ou sem adição de Bacillus 

subtilis  

5.1.1 Quantificação do CO2 acumulado nos ensaios respirometricos sem Bacillus subtilis ao longo 

dos 90 dias de tratamento. 

A partir da Figura 5 e da Tabela 4 e da Tabela 5 pode-se observar a melhor biodegradação do 

óleo lubrificante automotivo mineral usado (MU), seguido pelo óleo lubrificante mineral novo (MN), 

seguido pelo óleo lubrificante semi-sintético usado (SSU) e logo em seguida pelo Biodiesel comercial 

(B 2%), seguido pelo óleo lubrificante semi-sintético novo (SSN), seguido pelo Biodiesel puro (B 

100%), seguido pelo óleo vegetal novo (VN) e depois pelo óleo vegetal usado (VU) e por fim, como 

esperado, o ensaio Controle obteve o menor acúmulo de CO2 . 

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98
0

50

100

150

200

250

300

350

400

CO
2 a

cu
m

ul
ad

o 
/ m

g

Tempo de incubação / dias

 Controle
 Veg. Usado
 veg. Novo
 B 100%
 SSN
 B 2%
 SSU
 Mineral Novo
 Mineral Usado

 
Figura 5 - Gás carbônico (CO2) acumulado quantificado em respirômetros de Bartha e Pramer sem o 

Inóculo de Bacillus Subtilis, em meio aquoso, durante 90 dias. 



42 

 

Tabela 4 – Quantificação de gás carbônico, em mg, resultante da respiração microbiana dos diferentes 

ensaios sem B. subtilis do experimento realizado ao longo de 90 dias 

Dia C-1 C-2 B100-1 B100-2 B2-1 B2-2 VN-1 VN-2 VU-1 VU-2 MN-1 MN-2 MU-1 MU-2 SSN-1 SSN-2 SSU-1 SSU-2 

7 10,3 9,68 7,04 9,24 7,48 11,22 9,46 8,14 9,24 8,58 30,36 20,9 33,44 32,56 29,92 33,44 23,1 27,5 

14 6,38 8,14 8,8 10,34 28,6 27,28 11,22 6,6 6,16 6,16 27,06 22,22 33,44 27,94 25,96 32,56 18,7 21,56 

21 5,06 6,82 10,78 10,56 12,54 25,74 4,4 5,5 5,94 12,32 27,5 17,82 28,16 25,96 20,9 23,1 23,54 28,82 

28 6,16 6,6 11,88 12,1 13,42 24,2 7,7 6,82 6,6 11,66 26,18 27,28 29,92 30,36 23,98 19,58 18,48 20,24 

42 6,6 5,94 9,24 14,3 15,62 19,36 9,46 12,1 6,38 6,6 24,2 27,28 30,8 31,68 24,42 19,58 12,32 17,16 

49 6,82 6,6 16,28 15,84 29,48 28,6 7,48 5,94 5,72 5,72 23,76 23,76 31,02 33,22 28,38 23,54 25,96 28,16 

56 7,48 7,04 15,62 16,5 27,28 27,72 8,14 6,38 6,16 6,82 20,68 22,44 34,76 34,98 18,26 8,8 24,2 29,26 

63 7,7 6,82 9,24 8,8 26,62 26,18 7,26 7,04 6,6 7,48 31,68 34,98 33,22 34,76 20,02 12,32 2,64 3,52 

70 7,92 7,26 7,26 7,92 31,24 32,56 9,46 10,56 9,9 7,92 27,28 30,14 39,6 43,12 22,44 15,62 35,42 38,94 

77 8,14 7,04 7,7 8,14 30,58 31,9 9,46 10,34 9,68 8,14 29,92 32,78 42,02 41,36 27,94 24,2 43,56 44,66 

84 7,92 7,26 7,7 7,48 29,48 31,02 9,24 10,34 9,68 8,14 23,76 25,52 37,62 37,62 22,22 18,04 35,86 38,5 

90 8,58 8,58 8,58 8,8 30,14 31,24 9,9 10,34 10,56 9,24 27,94 29,04 36,96 36,96 22,88 24,42 33,88 37,18 

 

Tabela 5 – Quantificação de gás carbônico acumulado, em mg, resultante da respiração microbiana dos 

diferentes ensaios Sem B. subtilis do experimento realizado ao longo de 90 dias 

Dias Controle B 100% B 2% VN VU MN M U SSN SSU 
7 10,01 8,14 9,35 8,8 8,91 25,63 33 31,68 25,3 
14 17,27 17,71 37,29 17,71 15,07 50,27 63,69 60,94 45,43 
21 23,21 28,38 56,43 22,66 24,2 72,93 90,75 82,94 71,61 
28 29,59 40,37 75,24 29,92 33,33 99,66 120,89 104,72 90,97 
42 35,86 52,14 92,73 40,7 39,82 125,4 152,13 126,72 105,71 
49 42,57 68,2 121,77 47,41 45,54 149,16 184,25 152,68 132,77 
56 49,83 84,26 149,27 54,67 52,03 170,72 219,12 166,21 159,5 
63 57,09 93,28 175,67 61,82 59,07 204,05 253,11 182,38 162,58 
70 64,68 100,87 207,57 71,83 67,98 232,76 294,47 201,41 199,76 
77 72,27 108,79 238,81 81,73 76,89 264,11 336,16 227,48 243,87 
84 79,86 116,38 269,06 91,52 85,8 288,75 373,78 247,61 281,05 
90 88,44 125,07 299,75 101,64 95,7 317,24 410,74 271,26 316,58 

 

5.1.2 Quantificação do CO2 acumulado nos ensaios respirometricos com Bacillus subtilis ao longo 

dos 90 dias de tratamento. 

A partir da Figura 6 e da Tabela 6 e da Tabela 7 pode-se observar a melhor biodegradação do 

óleo lubrificante automotivo semi-sintético usado (SSU), seguido pelo óleo lubrificante semi-sintético 

novo (SSN), seguido pelo óleo vegetal usado (VU) e logo em seguida pelo óleo lubrificante automotivo 

mineral novo (MN), seguido pelo óleo lubrificante automotivo mineral usado (MU), seguido pelo óleo 



43 

 

vegetal novo (VN), seguido pelo Biodiesel comercial (B2) e depois pelo Biodiesel puro (B100) e por 

fim, como esperado, o ensaio Controle obteve o menor acúmulo de CO2. 

 

0 7 14 21 28 35 42 49 56 63 70 77 84 91 98

0

50

100

150

200

250

300

350

400

CO
2 a

cu
m

ul
ad

o 
/ m

g

Tempo de incubação / dias

Com Bacillus subtilis
 Controle
 B 100
 B2
 Veg. novo
 Min. novo
 Veg. usado
 Min. usado
 Semi-sint. novo
 Semi-sint. usado

 
Figura 6 - Gás carbônico (CO2) acumulado quantificado em respirômetros de Bartha e Pramer sem o 

Inóculo de Bacillus Subtilis, em meio aquoso, durante 90 dias. 



44 

 

Tabela 6 – Quantificação de gás carbônico, em mg, resultante da respiração microbiana dos 

diferentes ensaios Com B. subtilis do experimento realizado ao longo de 90 dias 

 

Tabela 7 – Quantificação de gás carbônico acumulado, em mg, resultante da respiração microbiana dos 

diferentes ensaios Com B. subtilis do experimento realizado ao longo de 90 dias 

C B100 B2 VN VU MN M U SSN SSU 
30 27,17 21,56 12,76 24,53 27,06 14,63 20,79 22,44 

38,5 53,9 43,23 33 53,46 53,57 33 41,47 48,84 
56,7 75,24 65,34 57,42 77,11 79,31 55,22 69,52 75,13 
75,2 97,57 90,97 82,17 101,64 105,4 77,99 98,56 103,73 
94,5 118,25 116,4 114,29 126,61 138,6 112,86 129,58 132,88 
111 136,18 141,8 142,01 153,01 166,9 139,59 155,98 161,81 
129 156,09 167,6 172,81 181,28 193,5 164,12 186,67 189,53 
148 175,23 192 200,86 204,27 217,5 189,75 218,68 215,93 
170 194,81 217,8 223,96 233,75 242,9 221,65 250,91 248,27 
190 214,17 243,8 248,82 263,23 267,3 251,46 278,52 278,96 
211 228,58 269,6 274,01 290,95 291,7 280,39 301,29 309,43 
232 242,77 294,9 299,53 318,56 316,8 309,54 327,03 340,56 
         

 

Dia C1 C2 
B100-
1 

B100-
2 B2-1 B2-2 VN-1 VN2 VU-1 Vu-2 

MN-
1 

MN-
2 

M U-
1 

M U-
2 

SSN-
1 

SSN-
2 SSU-1 SSU-2 

7 18 18,92 26,4 27,94 20,68 22,44 12,76 12,76 22,66 26,4 27,06 27,06 12,76 16,5 21,34 20,24 20,68 24,2 

14 20,5 19,58 26,18 27,28 21,78 21,56 20,24 20,24 29,26 28,6 26,4 26,62 19,14 17,6 20,68 20,68 28,16 24,64 

21 18,7 17,6 20,9 21,78 22,44 21,78 24,64 24,2 23,54 23,76 24,86 26,62 22,44 22 26,4 29,7 28,82 23,76 

28 18,3 18,92 21,56 23,1 25,52 25,74 24,86 24,64 23,76 25,3 24,86 27,28 23,1 22,44 27,28 30,8 30,36 26,84 

42 19,4 19,14 20,24 21,12 25,08 25,74 31,68 32,56 24,64 25,3 31,24 35,2 35,2 34,54 34,32 27,72 28,16 30,14 

49 16,1 16,72 17,82 18,04 26,18 24,64 27,06 28,38 26,18 26,62 29,04 27,5 26,62 26,84 26,18 26,62 28,82 29,04 

56 17,8 18,48 20,02 19,8 25,52 26,18 33 28,6 27,94 28,6 28,38 24,86 25,96 23,1 31,02 30,36 27,5 27,94 

63 19,8 18,7 18,7 19,58 24,86 23,76 29,7 26,4 23,54 22,44 24,2 23,76 26,18 25,08 32,12 31,9 25,96 26,84 

70 21,8 21,12 20,46 18,7 26,18 25,52 23,76 22,44 30,14 28,82 25,74 25,08 31,24 32,56 33,44 31,02 31,68 33 

77 20,7 20,68 20,02 18,7 25,52 26,4 27,5 22,22 29,48 29,48 24,86 23,98 28,82 30,8 28,82 26,4 30,36 31,02 

84 20,7 20,02 13,64 15,18 25,96 25,74 27,72 22,66 28,16 27,28 25,08 23,76 27,5 30,36 23,32 22,22 29,92 31,02 

90 20,7 20,9 13,64 14,74 25,3 25,3 27,94 23,1 28,16 27,06 25,3 24,86 28,16 30,14 28,82 22,66 30,8 31,46 



45 

 

5.2 Toxicidade 

5.3 Início do tratamento 

5.3.1 Germinação com sementes de alface (Lactuca sativa) 

A Figura 7 e as Tabelas 8 e 9 ilustram os resultados dos testes de germinação de sementes de 

alface com  1mL, 2mL e 3 mL de concentração de cada hidrocarboneto, antes da realização do 

tratamento. 

 

Tabela 8 – Taxa de germinação em porcentagem das sementes alface antes do inicio do tratamento 

 
Taxa de germinação (%) 

1ml 2ml 3ml 
Controle 79 82 73 
ZnSO4 2 34 31 29 

B 100 79 65 57 
B2 66 61 48 
VN 72 69 64 
VU 78 60 61 
SSN 74 76 60 
SSU 69 55 52 
MN 72 64 49 
M.U 64 45 46 

 



46 

 

Tabela 9 – Número de sementes germinadas de alface nas 3 concentrações dos contaminantes, antes do 

tratamento 

  Número de sementes germinadas 
 1 mL 2 mL 3 mL 

  24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 
Controle 1 12 10 9 5 5 12 10 8 8 6 10 8 9 5 4 

 2 11 9 7 7 4 11 8 8 7 4 11 10 7 6 3 
ZnSO4 1 7 6 2 0 2 6 5 2 0 1 5 5 2 2 1 

 2 10 6 1 0 0 8 5 2 2 0 5 6 2 0 1 
B100 1 13 12 9 5 2 10 8 7 2 2 8 9 6 3 2 

 2 11 10 8 5 4 11 8 9 6 2 10 9 5 3 2 
B2 1 10 7 7 4 3 11 9 4 3 1 10 8 3 3 0 

 2 12 8 7 5 3 11 9 6 4 3 11 5 4 2 2 
VN 1 11 9 5 4 5 12 9 5 5 2 11 9 7 5 1 

 2 12 10 6 7 3 12 11 5 4 4 11 8 8 5 0 
VU 1 14 8 7 7 4 12 9 5 2 2 12 9 5 2 2 

 2 11 9 7 7 4 10 7 7 5 1 12 10 7 2 0 
SSN 1 11 9 8 5 5 12 11 9 4 4 11 7 5 5 2 

 2 12 9 7 4 4 12 10 7 5 2 9 7 6 4 4 
SSU 1 9 8 7 7 3 10 7 6 3 3 8 8 7 5 2 

 2 10 8 7 5 5 8 7 5 3 3 10 5 5 2 0 
MN 1 12 10 7 5 3 9 9 6 6 3 8 7 7 3 1 

 2 10 7 7 5 6 11 9 5 3 3 11 7 3 1 1 
MU 1 9 7 7 5 3 8 8 4 2 2 8 7 5 2 3 

 2 10 9 7 4 3 9 7 3 1 1 8 7 2 2 2 

C ZnSO4 B 100 B 2 VN VU SSN SSU MN M.U
0

10

20

30

40

50

60

70

80

% 
de

 ge
rm

ina
çã

o

Contaminantes

 1 mL de [] do contaminante
 2 mL de [] do contaminante
 3 mL de [] do contaminante

 
Figura 7 - Porcentagem de sementes germinadas de alface em 1 mL, 2mL e 3mL de concentração dos 

contaminantes estudados. 



47 

 

5.3.2 Germinação com sementes de rúcula 

A Figura 8 e a Tabelas 10 e 11 ilustram os resultados dos testes de germinação de sementes de 

rúcula com  1 mL, 2 mL e 3 mL de concentração de cada hidrocarboneto, antes da realização do 

tratamento. 

 

Tabela 10 – Taxa de germinação em porcentagem das sementes de rúcula antes do inicio do tratamento 

 
Taxa de germinação (%) 

1ml 2ml 3ml 
Controle 72 64 49 
ZnSO4 2 11 10 9 

B 100 59 46 32 
B2 38 41 38 
VN 55 48 51 
VU 55 50 45 
SSN 52 46 30 
SSU 52 52 46 
MN 52 51 31 
M.U 43 31 28 

 



48 

 

Tabela 11 – Número de sementes germinadas de rúcula nas 3 concentrações dos contaminantes, antes 

do tratamento 

  Número de sementes germinadas 
  1 mL 2 mL 3 mL 
  24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 

Controle 1 11 9 9 5 3 10 7 7 6 2 11 7 3 4 1 
 2 12 8 7 6 2 9 9 6 5 3 9 6 4 2 2 

ZnSO4 1 3 2 2 0 1 1 2 1 1 0 1 2 2 0 0 
 2 4 0 2 1 1 1 1 3 0 0 1 0 2 1 0 

B100 1 8 9 5 7 1 7 5 6 3 3 5 4 4 1 1 
 2 9 8 9 2 1 7 7 4 2 2 7 6 2 2 0 

B2 1 9 6 3 3 1 8 7 4 3 0 6 6 5 3 0 
 2 6 5 1 2 2 7 5 5 2 0 7 4 5 0 2 

VN 1 10 6 4 3 3 9 8 5 2 2 9 8 5 2 2 
 2 8 9 6 4 2 8 5 5 3 1 9 7 7 2 0 

VU 1 11 8 6 3 3 9 7 4 4 1 9 5 5 0 1 
 2 7 7 5 3 2 7 8 6 2 2 7 6 7 4 1 

SSN 1 5 6 8 5 3 5 7 3 4 3 3 6 6 2 2 
 2 7 7 5 3 3 5 6 4 6 3 4 3 1 2 1 

SSU 1 8 5 5 2 2 7 8 5 2 1 6 8 5 2 1 
 2 9 6 7 4 4 10 8 7 4 0 8 6 3 0 1 

MN 1 9 8 5 3 3 7 8 6 3 2 6 6 3 1 0 
 2 7 7 4 5 1 7 5 5 5 3 5 3 4 3 0 

MU 1 7 4 5 2 2 4 6 3 2 0 5 5 5 1 0 
 2 11 5 5 2 0 8 7 0 1 0 5 2 3 1 0 

 



49 

 

C ZnSO4 B 100 B 2 VN VU SSN SSU MN M.U
0

10

20

30

40

50

60

70
%

 d
e 

ge
rm

in
aç

ão

Contaminantes

 1 mL de [] do contaminante
 2 mL de [] do contaminante
 3 mL de [] do contaminante

 
Figura 8 - Porcentagem de sementes germinadas de rúcula em 1 mL, 2 mL e 3 mL de concentração dos 

contaminantes estudados. 

5.3.3 Final do tratamento 

5.3.3.1  Germinação de sementes de alface 

5.3.3.1.1 Sem Bacillus subtilis 

A Figura 9 e a Tabela 12 e 13 ilustram os resultados dos testes de germinação de sementes de 

alface com  1 mL, 2 mL e 3 mL de concentração de cada hidrocarboneto, sem adição de B. subtilis, ao 

final do tratamento. 



50 

 

Tabela 12 – Taxa de germinação em porcentagem das sementes de alface ao final do tratamento sem 

Bacillus subtilis 

 
Taxa de germinação (%) 

1ml 2ml 3ml 
Controle 73 76 56 
ZnSO4 2 26 33 30 

B 100 91 69 64 
B2 70 62 51 
VN 78 74 71 
VU 83 67 62 
SSN 84 80 61 
SSU 79 59 59 
MN 77 66 52 
M.U 67 47 46 

 

Tabela 13 – Número de sementes germinadas de Alface nas 3 concentrações dos contaminantes ao final 

do tratamento (90 dias), sem adição do inóculo de Bacillus subtilis 

  Sem Bacillus subtilis 
  1 mL 2 mL 3 mL 
  24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 

Controle 1 10 11 9 5 5 8 9 9 8 6 8 7 5 4 4 
 2 11 7 6 4 5 10 9 8 4 5 6 8 6 5 3 

ZnSO4 1 8 5 2 0 2 7 4 2 0 1 5 5 3 2 0 
 2 11 7 0 0 1 9 6 2 1 1 6 7 2 0 0 

B100 1 14 13 11 6 3 11 10 7 3 2 9 9 5 5 3 
 2 12 11 10 7 4 12 8 8 5 3 11 10 6 3 3 

B2 1 11 8 7 4 2 11 10 5 4 1 10 8 5 2 1 
 2 13 9 8 6 2 12 11 6 2 0 11 6 3 3 2 

VN 1 11 10 5 6 5 13 8 7 5 2 13 11 7 2 3 
 2 14 11 7 7 2 14 10 6 6 3 12 10 9 3 1 

VU 1 15 9 7 8 3 13 10 6 3 2 10 9 4 3 2 
 2 12 10 8 6 5 11 10 7 2 3 11 11 6 4 2 

SSN 1 12 11 7 8 5 14 11 8 5 3 12 9 5 3 1 
 2 13 10 8 5 5 12 10 9 4 4 10 7 6 5 3 

SSU 1 10 9 7 8 4 11 8 6 4 3 9 8 6 4 3 
 2 11 8 10 6 6 9 7 5 4 2 10 6 5 5 3 

MN 1 13 11 6 5 4 11 9 6 4 2 10 8 5 3 1 
 2 10 8 9 5 6 12 10 5 4 3 11 6 5 2 1 

MU 1 10 8 7 5 2 9 8 4 3 1 9 6 5 4 1 
 2 11 9 8 3 4 10 6 2 2 2 8 5 3 3 2 



51 

 

C ZnSO4B 100 B 2 VN VU SSN SSU MN M.U
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90
%

 d
e 

ge
rm

in
aç

ão

Contaminantes

 1 mL de [] do contaminante
 1 mL de [] do contaminante
 1 mL de [] do contaminante

 
Figura 9 - Porcentagem de sementes germinadas de alface em 1 mL, 2 mL e 3 mL de concentração dos 

contaminantes estudados ao final do tratamento sem a adição do Inóculo de Bacillus subtilis. 

 

5.3.3.1.2 Com Bacillus subtilis 

A Figura 10 e as Tabelas 14 e 15 ilustram os resultados dos testes de germinação de sementes 

de alface com  1 mL, 2 mL e 3 mL de concentração de cada hidrocarboneto, com a adição de B. subtilis, 

ao final do tratamento. 



52 

 

Tabela 14 – Taxa de germinação em porcentagem das sementes de alface ao final do tratamento com 

adição do inoculo de Bacillus subtilis 

 
Taxa de germinação (%) 

1ml 2ml 3ml 
Controle 76 74 62 
ZnSO4 2 42 41 41 

B 100 92 67 71 
B2 73 68 62 
VN 88 86 79 
VU 89 84 71 
SSN 86 80 71 
SSU 86 72 62 
MN 87 74 71 
M.U 79 64 61 

 

Tabela 15 - Número de sementes germinadas de Alface nas 3 concentrações dos contaminantes, ao final 

do tratamento (90 dias) com a adição do inóculo de Bacillus subtilis. 

  Com Bacillus subtilis  
  1 mL 2 mL 3 mL 
  24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 

Controle 1 11 10 9 6 5 9 10 8 6 5 9 6 5 6 4 
 2 9 8 7 5 6 11 9 7 5 4 7 8 7 6 4 

ZnSO4 1 9 6 4 1 2 9 5 5 2 0 9 5 5 3 0 
 2 10 8 0 1 1 8 7 3 1 1 8 6 3 1 1 

B100 1 15 11 10 7 5 10 9 7 4 3 10 8 7 6 4 
 2 12 12 9 6 5 11 7 8 5 3 11 9 7 7 2 

B2 1 10 9 8 5 3 10 11 6 5 2 11 9 6 3 2 
 2 11 10 7 7 3 13 10 7 3 1 12 8 4 4 3 

VN 1 12 11 8 6 5 12 10 9 7 5 13 11 8 5 2 
 2 13 11 9 7 6 13 11 8 6 5 12 11 10 4 3 

VU 1 14 10 8 7 5 14 11 8 7 5 13 10 5 3 4 
 2 13 11 9 7 5 12 9 6 8 4 11 9 6 6 4 

SSN 1 13 11 9 5 7 14 10 5 6 5 12 10 6 5 2 
 2 14 9 8 4 6 15 12 5 3 5 11 8 7 6 4 

SSU 1 11 10 8 9 5 12 9 8 6 3 11 8 9 3 2 
 2 13 9 9 7 5 10 11 6 5 2 10 7 7 3 2 

MN 1 13 12 7 6 5 12 11 7 4 6 11 10 6 6 1 
 2 11 10 8 8 7 10 10 7 3 4 13 10 5 6 3 

MU 1 12 9 10 6 2 12 9 6 5 2 10 10 6 5 3 
 2 11 11 8 5 5 11 8 6 4 1 9 6 6 6 0 



53 

 

C ZnSO4 B 100 B 2 VN VU SSN SSU MN M.U
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%
 d

e 
ge

rm
in

aç
ão

Contaminantes

 1 mL de [] do contaminante
 2 mL de [] do contaminante
 3 mL de [] do contaminante

 
Figura 10 - Porcentagem de sementes germinadas de alface em 1 mL, 2 mL e 3 mL de concentração dos 

contaminantes estudados ao final do tratamento com a adição do Inóculo de Bacillus subtilis. 

 

5.3.3.2  Germinação de sementes de rúcula 

5.3.3.2.1 Sem Bacillus subtilis 

A Figura 11 e as Tabelas 16 e 17 ilustram os resultados dos testes de germinação de sementes 

de rucula com  1mL, 2mL e 3 mL de concentração de cada hidrocarboneto, sem adição de B. subtilis, ao 

final do tratamento. 



54 

 

Tabela 16 - Taxa de germinação em porcentagem das sementes de rúcula ao final do tratamento sem a 

adição do inóculo de Bacillus subtilis 

 
Taxa de germinação (%) 

1ml 2ml 3ml 
Controle 77 70 58 
ZnSO4 2 18 12 10 

B 100 68 59 33 
B2 48 45 34 
VN 60 52 44 
VU 63 58 48 
SSN 58 52 33 
SSU 59 58 49 
MN 60 57 35 
M.U 50 34 30 

Tabela 17 - Número de sementes germinadas de rúcula nas 3 concentrações dos contaminantes ao final 

do tratamento (90 dias), sem adição do inóculo de Bacillus subtilis 

  Sem Bacillus subtilis 
  1 mL 2 mL 3 mL 
  24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 

Controle 1 12 9 7 5 5 10 9 10 6 2 10 6 8 3 3 
 2 11 10 8 6 4 12 6 7 4 4 11 7 5 3 2 

ZnSO4 1 3 3 1 2 0 2 2 0 1 2 0 3 1 0 1 
 2 0 4 2 2 1 1 1 0 3 1 0 1 2 2 0 

B100 1 10 10 8 5 2 8 8 5 5 2 7 3 3 1 0 
 2 11 8 9 3 2 9 6 4 3 3 8 5 2 2 2 

B2 1 10 7 3 3 1 8 7 4 3 2 8 5 4 1 0 
 2 7 7 6 2 2 8 6 3 3 1 7 4 5 0 0 

VN 1 11 5 5 5 2 10 8 5 3 1 8 9 6 3 0 
 2 8 10 7 4 3 9 6 4 4 2 11 8 5 4 0 

VU 1 12 9 6 4 4 10 8 5 3 2 10 6 5 2 0 
 2 8 8 7 2 3 9 7 7 4 3 9 6 6 3 1 

SSN 1 5 7 9 5 4 6 8 4 4 5 3 6 8 2 2 
 2 8 7 6 3 4 6 6 5 5 3 3 4 2 3 0 

SSU 1 9 6 6 3 2 8 8 6 2 2 7 8 5 4 1 
 2 10 8 5 5 5 11 8 8 5 0 9 6 5 2 2 

MN 1 10 9 6 4 3 9 8 6 3 2 7 6 3 1 1 
 2 8 6 7 5 2 9 6 6 5 3 5 5 4 2 1 

MU 1 8 5 6 3 1 6 6 3 1 1 6 5 5 0 1 
 2 11 6 7 2 1 9 5 2 1 0 5 3 4 0 1 



55 

 

C ZnSO4B 100 B 2 VN VU SSN SSU MN M.U
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%
 d

e 
ge

rm
in

aç
ão

Contaminantes

 1 mL de [] do contaminante
 2 mL de [] do contaminante
 3 mL de [] do contaminante

 
Figura 11 - Porcentagem de sementes germinadas de rúcula em 1 mL, 2 mL e 3 mL de concentração 

dos contaminantes estudados ao final do tratamento sem a adição do Inóculo de Bacillus subtilis. 

5.3.3.2.2 Com Bacillus subtilis 

A Figura 12 e as Tabelas 18 e 19 ilustram os resultados dos testes de germinação de sementes 

de rúcula com 1 mL, 2 mL e 3 mL de concentração de cada hidrocarboneto, com a adição de B. subtilis, 

ao final do tratamento. 



56 

 

Tabela 18 - Taxa de germinação, em porcentagem, das sementes de rúcula ao final do tratamento com a 

adição do inóculo de Bacillus subtilis 

 
Taxa de germinação (%) 

1ml 2ml 3ml 
Controle 68 70 60 
ZnSO4 2 26 20 17 

B 100 76 58 48 
B2 53 48 38 
VN 69 56 51 
VU 67 53 48 
SSN 62 52 47 
SSU 61 44 51 
MN 57 53 43 
M.U 55 36 30 

 

Tabela 19 - Número de sementes germinadas de Rúcula nas 3 concentrações dos contaminantes, ao final 

do tratamento (90 dias) com a adição do inóculo de Bacillus subtilis. 

  com Bacillus subtilis 
  1 mL 2 mL 3 mL 
  24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 24 48 72 96 120 

Controle 1 10 11 8 4 4 11 7 11 6 4 10 7 6 3 3 
 2 10 8 6 5 2 9 10 6 3 3 11 9 4 4 3 

ZnSO4 1 5 3 2 0 1 3 3 1 1 0 4 2 2 0 0 
 2 7 4 2 2 0 5 4 1 1 1 2 5 1 1 0 

B100 1 13 9 10 5 1 10 9 6 2 1 7 8 4 4 2 
 2 11 10 9 6 2 12 7 6 4 1 10 7 5 2 0 

B2 1 9 6 5 2 1 9 8 3 3 0 8 7 4 1 1 
 2 11 7 5 5 2 10 8 5 2 0 9 5 2 1 0 

VN 1 10 9 4 4 3 11 6 5 2 1 11 9 5 1 0 
 2 13 11 8 6 1 12 8 8 3 0 9 9 6 1 0 

VU 1 14 8 6 6 3 11 9 4 2 2 11 8 2 0 1 
 2 10 9 5 3 3 11 7 4 3 0 12 7 6 1 0 

SSN 1 10 9 5 2 4 11 7 3 1 1 12 7 4 2 1 
 2 10 9 7 4 2 11 9 6 2 1 7 8 4 2 0 

SSU 1 8 8 5 5 2 9 8 4 4 0 11 7 5 3 1 
 2 10 9 9 2 3 9 5 4 1 0 12 7 3 2 0 

MN 1 11 10 5 2 2 10 8 5 2 1 7 7 3 1 1 
 2 8 7 7 3 2 9 8 2 6 2 9 5 4 4 2 

MU 1 9 8 4 4 4 6 7 4 1 1 7 5 2 3 0 
 2 9 9 5 2 1 8 5 1 3 0 5 4 2 0 2 



57 

 

 

C ZnSO4B 100 B 2 VN VU SSN SSU MN M.U
0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

%
 d

e 
ge

rm
in

aç
ão

Contaminantes

 1 mL de [] do contaminante
 2 mL de [] do contaminante
 3 mL de [] do contaminante

 
Figura 12: Porcentagem de sementes germinadas de rúcula em 1mL, 2mL e 3mL de concentração dos 

contaminantes estudados ao final do tratamento com a adição do Inóculo de Bacillus subtilis. 



58 

 

6 CONCLUSÃO 

A partir dos dados obtidos no estudo da biodegradação dos óleos, tanto no método de Bartha 

como por colorimetria, foi possível constatar quais óleos foram mais facilmente degradados.  

Os ensaios contendo o Controle, o Biodiesel puro, o óleo vegetal novo e o óleo vegetal usado 

obtiveram uma melhor biodegradabilidade com a adição do Inóculo de Bacillus subtilis enquanto o óleo 

lubrificante automotivo mineral usado e os óleos lubrificantes semi-sintético novo e usado obtiveram 

melhor biodegradabilidade sem a adição do Inóculo de Bacillus subtilis. Por fim, o biodiesel comercial e 

o óleo lubrificante mineral novo não apresentaram diferenças significativas da sua biodegradação. 

O estudo também permitiu verificar que, de fato, a biorremediação é um mecanismo válido para 

tratar ambientes afetados negativamente por poluentes. 

Com relação aos testes toxicológicos podemos concluir que a La