EDITORES CHEFE Profº Me. João Victor Lucas Prof.° Dr. Wanderson Farias EDITOR EXECUTIVO Nathan Albano Valente AUTORES Estela de Oliveira Lima Larissa Silva Zambrana Moraes Rafael Guilen de Oliveira COLABORADORES Flávia Luísa Dias-Audibert PRODUÇÃO EDITORIAL Seven Eventos Acadêmicos e Editora Edição de arte Alan Ferreira de Moraes Bibliotecária Eliete Marques da Silva IMAGENS DE CAPA AdobeStok ÁREA DO CONHECIMENTO Ciências da saúde 2022 by Seven Editora Copyright © Seven Editora Copyright do Texto © 2022 Os Autores Copyright da Edição © 2022 Seven Editora O conteúdo do texto e seus dados em sua forma, correção e confiabilidade são de responsabilidade exclusiva da autora, inclusive não representam necessariamente a posição oficial da Seven Eventos Acadêmicos e Editora. Permitido o download da obra e o compartilhamento desde que sejam atribuídos créditos a autora, mas sem a possibilidade de alterá-la de nenhuma forma ou utilizá-la para fins comerciais. 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Adriana Barni Truccolo- Universidade Estadual do Rio Grande do Sul Prof. Msc. Marcos Garcia Costa Morais- Universidade Estadual da Paraíba Prof. Dra. Mônica Maria de Almeida Brainer - Instituto Federal Goiano Campus Ceres Prof. Me. Caio Vinicius Efigenio Formiga - Pontifícia Universidade Católica de Goiás Prof. Me. Egas José Armando - Universidade Eduardo Mondlane de Moçambique. Profª Drª. Ariane Fernandes da Conceição- Universidade Federal do Triângulo Mineiro Prof. Dr. Wanderson Santos de Farias - Universidad de Desarrollo Sustentable Profª Drª. Maria Gorete Valus -Universidade de Campinas Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP) (Câmara Brasileira do Livro, SP, Brasil) Eliete Marques da Silva - Bibliotecária - CRB-8/9380 Seven Evetos Academicos e Editora CNPJ: 43.789.355/0001-14 editora@sevenevents.com.br São José dos Pinhais/PR +55 (41) 9 9823-6892 mailto:editora@sevenevents.com.br DECLARAÇÃO DO (A) AUTOR(A) A autora desta obra DECLARA para os seguintes fins que: 1. 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SUMÁRIO RESUMO ...................................................................................................................................................................1 CAPÍTULO - 1 CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS 1 CÉLULAS-TRONCO ....................................................................................................................................................2 2 CARACTERÍSTICAS DAS CÉLULAS-TRONCO/ESTROMAIS MESENQUIMAIS ...................................................................................................................................................................5 2.1 PRINCIPAIS TECIDOS USADOS PARA COLETA DE MSC ...............................................................................................................................................................7 2.1.1 Medula óssea ..........................................................................................................................................................7 2.1.2 Tecido adiposo ..........................................................................................................................................................8 2.1.3 Cordão umbilical .........................................................................................................................................................9 2.1.4 Sangue Periférico .........................................................................................................................................................9 3 PROPRIEDADES .................................................................................................................................................................12 3.1 POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO .............................................................................................................................................................12 3.2 PROPRIEDADE IMUNOMODULATÓRIA .............................................................................................................................................................14 3.3 PROPRIEDADE PARÁCRIN .............................................................................................................................................................15 CAPÍTULO - 2 EXOSSOMOS 1 ORIGEM DOS EXOSSOMOS .................................................................................................................................................................17 1.1 EXOSSOMOS DERIVADOS DE MSCS .............................................................................................................................................................19 1.2 MEIO CONDICIONADO DERIVADO DAS MSCS (MSC-CM) .............................................................................................................................................................19 2 CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS VS EXOSSOMOS/MEIO CONDICIONADO .................................................................................................................................................................20 3 DESAFIOS DA UTILIZAÇÃO DOS EXOSSOMOS NA CLÍNICA .................................................................................................................................................................22 CAPÍTULO 3 - APLICABILIDADE DAS MSCS E EXOSSOMOS NA SAÚDE 1 POTENCIAL DAS CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS NA SAÚDE .................................................................................................................................................................24 1.1 APLICAÇÃO CLÍNICA .............................................................................................................................................................24 1.1.1 Uso de MSCs para engenharia tecidual de osso alveolar em pacientes com fissura labiopalatina ........................................................................................................................................................26 1.1.2 Efeito da transfusão de MSCs em pacientes com neuropatia periférica diabética ........................................................................................................................................................26 1.1.3 Transferência intracoronária de MSCs derivadas de geleia de Wharton (WJ-MSCs) em pacientes com infarto agudo do miocárdio ........................................................................................................................................................27 1.1.4 MSCs derivadas do tecido do cordão umbilical (UC) versus placebo para tratar a inflamação pulmonar aguda devido à COVID-19 ........................................................................................................................................................28 1.1.5 Avaliação da segurança e eficácia de MSCs alogênicas (AC607) para o tratamento de lesão renal em pacientes de cirurgia cardíaca ........................................................................................................................................................29 2 POTENCIAL DOS EXOSSOMOS NA SAÚDE .................................................................................................................................................................30 2.1 APLICAÇÃO CLÍNICA .............................................................................................................................................................31 2.1.1 iExossomos no tratamento de pacientes com câncer de pâncreas metastático com mutação KrasG12D ........................................................................................................................................................31 2.1.2 Papel de microRNAs no diagnóstico de pré-eclâmpsia ........................................................................................................................................................31 2.1.3 Estudo clínico piloto sobre inalação de exossomos de MSCs no tratamento de pneumonia grave por corona vírus ........................................................................................................................................................31 2.1.4 Avaliação de Segurança e Eficácia de MSC-Exos de Tecido Adiposo Alogênico em Pacientes com Doença de Alzheimer ........................................................................................................................................................32 3 ESTUDOS CLÍNICOS E CONSIDERAÇÕES .................................................................................................................................................................33 CAPÍTULO 4 BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE EXOSSOMOS DERIVADOS DE MSCS 1 BIOPROCESSOS .................................................................................................................................................................34 1.1 PROCESSOS UPSTREAM .............................................................................................................................................................34 1.1.1 Estratégias para aumentar a produção de exossomos ........................................................................................................................................................35 1.1.2 Estratégias de produção em larga escala de exossomos ........................................................................................................................................................37 1.1.3 Processos Downstream ........................................................................................................................................................40 1.1.4 Processos de purificação de exossomos ........................................................................................................................................................41 1.1.5 Processos de caracterização de exossomos ........................................................................................................................................................42 2 DESAFIOS DO ESCALONAMENTO DA PRODUÇÃO DE EXOSSOMOS .................................................................................................................................................................43 3 PRODUÇÃO DE EXOSSOMOS NO MERCADO INTERNACIONAL E NACIONAL .................................................................................................................................................................44 CAPÍTULO 5 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS ............................................................................................................................................................46-53 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AD-MSC - Células-tronco Mesenquimais derivadas do Tecido Adiposo ASC - Células-tronco Adultas BM-MSC - Células-tronco Mesenquimais derivadas da Medula Óssea BPF - Boas Práticas de Fabricação CLAE - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência ESC - Células-tronco Embrionárias EV - Vesícula Extracelular FBS - Soro Fetal Bovino HSC - Células-Tronco Hematopoiéticas IAC - Captura por Imunoafinidade iPSC - Células-tronco Pluripotentes Induzidas ISCT - Sociedade Internacional de Terapia Celular MSC - Células-Tronco Mesenquimais MSC-CM - Meio Condicionado derivado de Células-tronco Mesenquimais MWCO - Peso Molecular de Corte da Membrana PE - Pré-eclâmpsia PSC - Células-tronco Pluripotentes siRNA - RNA de interferência TGF – Filtração de Fluxo Tangencial TSC - Células-tronco Totipotentes UC-MSC - Células-tronco Mesenquimais derivadas do Cordão Umbilical WJ-MSC - Células-tronco Mesenquimais derivadas da Geleia de Wharton Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 2 1 CÉLULAS-TRONCO O termo “células-tronco” (do inglês, stem cells) é usado para denominar células indiferenciadas capazes de autorrenovação e diferenciação. Suas principais atuações podem envolver desde o desenvolvimento do embrião (embriogênese) até a regeneração tecidual (renovação e reparação de lesões teciduais) no organismo adulto. Essas células podem ser classificadas quanto a sua origem, sendo elas: células-tronco embrionárias (ESCs – do inglês, embryonic stem cells) e células-tronco adultas (ASCs – do inglês, adult stem cells); ou quanto a sua plasticidade, sendo elas: células-tronco totipotentes, pluripotentes ou multipotentes (BOHELER et al., 2002; WOBUS; BOHELER, 2005). O termo plasticidade indica a capacidade que a célula-tronco apresenta de se diferenciar em células de diferentes tecidos. Por exemplo, a célula-tronco totipotente é capaz de formar os anexos extraembrionários (placenta, âmnio e vesícula vitelina); enquanto as células-tronco pluripotentes não possuem essa capacidade, embora ambas possam se diferenciar nos demais tecidos do organismo. Logo as células-tronco totipotentes são mais “plásticas” que as células-tronco pluripotentes (ŁOS; SKUBIS; GHAVAMI, 2019), como é ilustrado na Figura 1. Figura 1: Plasticidade das Células-tronco. Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. As células-tronco provenientes do embrião são responsáveis pela formação do organismo como um todo. Dentre elas, é possível observar células-tronco totipotentes e pluripotentes (Figura 2). As células- tronco totipotentes (TSCs – do inglês, totipotent stem cells) estão presentes no primeiro estágio de Capítulo 1 CÉLULAS TRONCO MESENQUIMAIS Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 3 desenvolvimento do embrião, mais especificamente nos estágios de 2 a 8 células após a formação do zigoto (BAKER; PERA, 2018; WOBUS, 2001), e são responsáveis por dar origem a todas as células da estrutura primária do embrião, incluindo os folhetos embrionários (ectoderma, mesoderma e endoderma) e os anexos extraembrionários (BAKER; PERA, 2018; ŁOS; SKUBIS; GHAVAMI, 2019). Já as células-tronco pluripotentes (PSCs - do inglês, pluripotent stem cells), também conhecidas como células-tronco embrionárias, originam-se das TSC; são encontradas originalmente na massa celular interna do blastocisto e são capazes de se diferenciar nos três folhetos embrionários, os quais vão originar todos os demais tipos celulares do organismo (ŁOS; SKUBIS; GHAVAMI, 2019; OH; CHOO, 2011). Diferentemente das células totipotentes, as pluripotentes não são capazes de gerar um ser vivo completo, já que não são capazes de gerar os anexos extraembrionários, porém apresentam alta plasticidade e elevado potencial de diferenciação em todas as células especializadas do indivíduo adulto, quando em condições pré-definidas (BLANPAIN; FUCHS, 2014). Dentre as células pluripotentes, existem as células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs – do inglês, induced pluripotent stem cells), que são fruto dos avanços no conhecimento da engenharia genética. Essas células são obtidas a partir da reprogramação de uma célula especializada para que esta retorne ao seu estado indiferenciado, ou seja, estado em que apresenta expressão de genes próprios das células-tronco embrionárias, como também características e propriedades morfológicas (ANDRADE, 2015). Através dessa abordagem é possível obter células-tronco com características pluripotentes, típicas de células-tronco embrionárias sem haver a necessidade de manipular um embrião (Figura 2). Figura 2: Classificação das Células-tronco. Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. Quanto à origem das células-tronco, elas também podem ser classificadas como células-tronco adultas (Figura 2), as quais são encontradas em órgãos e tecidos completamente formados e funcionais, podendo ser observadas em qualquer fase da vida após o nascimento (pós-natal). Funcionam como uma reserva de células precursoras, envolvidas na manutenção e reparo tecidual ao longo da vida. Quanto à Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 4 manutenção tecidual, atuam principalmente em locais de constante reposição celular, como o epitélio intestinal, o qual demanda alta taxa de renovação celular. Podem ainda atuar na regeneração/reparo celular, como por exemplo no tecido epitelial no qual, ao haver uma lesão local, as células-tronco são utilizadas para reparo (BLANPAIN; FUCHS, 2014). Nesses dois processos, as células-tronco adultas se mantêm em uma quantidade basal no tecido (por meio da autorrenovação) até que fatores do meio (sinalização interna em resposta à demanda tecidual) induzam a sua diferenciação (BLANPAIN; FUCHS, 2014). Quanto à plasticidade, as células-tronco adultas são caracterizadas como multipotentes (Figuras 1 e 2), ou seja, são capazes de gerar um grupo limitado de tipos celulares (isto é, células derivadas do endoderma, ou do mesoderma ou do ectoderma). Por exemplo, os tipos celulares do ectoderma são os tecidos epidérmico e nervoso; em relação ao mesoderma, este dá origem a tecidos como músculos, ossos e os componentes do sangue; já o endoderma pode levar à formação de tecidos como fígado, pâncreas, trato gastrointestinal e pulmões (ŁOS; SKUBIS; GHAVAMI, 2019; OH; CHOO, 2011). Dentre as células-tronco multipotentes, as mais estudadas são as hematopoiéticas e mesenquimais (Figura 3). As células-tronco hematopoiéticas (HSCs – do inglês, hematopoietic stem cells) dão origem às células do sangue e apresentam duas classes de linhagem: a linfoide e mieloide (Figura 3a). A linhagem linfoide dá origem às células natural killer (NT), linfócitos T e B; enquanto a linhagem mieloide origina os granulócitos, monócitos, eritrócitos, megacariócitos e mastócitos (IWASAKI; AKASHI, 2007). Já as células-tronco mesenquimais (MSCs - do inglês, mesenchymal stem cells) dão origem a diferentes tecidos, dentre eles o tecido ósseo, o tecido adiposo, os condroblastos (células responsáveis pela formação da matriz de cartilagem), tecido muscular e vascular (Figura 3b) (OH; CHOO, 2011). Ambas as células-tronco são encontradas na medula óssea, no sangue periférico e cordão umbilical, porém as mesenquimais também podem ser encontradas no tecido adiposo (ZUK et al., 2002), disco intervertebral (MIZRAHI et al., 2013), tecido conjuntivo do músculo esquelético (JANKOWSKI; DEASY; HUARD, 2002), periósteo (NAKAHARA et al., 1990), entre outros. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 5 Figura 3: Classificação das Células-tronco Mesenquimais e Hematopoiéticas e suas respectivas linhagens celulares de diferenciação. Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. Estudos recentes investigam a hipótese de que as células-tronco mesenquimais estejam presentes em diversos órgãos e tecidos sob a forma de pericitos (células que revestem os vasos sanguíneos), os quais atuam como fonte de MSCs em resposta a lesão ou atuando na homeostase (YIANNI; SHARPE, 2019). Essa hipótese surgiu com um experimento comparativo entre as MSCs e os pericitos, avaliando seus sítios de origem (estudos in vivo) e seus respectivos marcadores celulares (CAPLAN, 2008). Observou-se que células com os respectivos marcadores das MSCs também expressavam marcadores de pericitos. O autor do experimento sugere que todas as MSCs sejam pericitos, mas que nem todos os pericitos sejam MSCs (CAPLAN, 2008). Supõe-se que, em resposta a uma lesão ou manutenção da homeostase, os pericitos se desprendam da parede do vaso sanguíneos e ajam como as células-tronco mesenquimais genuínas, podendo se proliferar e mover-se para a área da lesão, onde se diferenciem em células específicas do tecido para facilitar o reparo local (YIANNI; SHARPE, 2019). Essa é uma hipótese ainda em estudo, sendo que atualmente não há consenso na comunidade científica. 2 CARACTERÍSTICAS DAS CÉLULAS-TRONCO/ESTROMAIS MESENQUIMAIS Nas últimas décadas, células isoladas da medula óssea e de outros tecidos que apresentavam aderência ao plástico foram denominadas como células-tronco mesenquimais, porém observou-se que Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 6 diversos estudos pré-clínicos e clínicos não abordavam as propriedades correspondentes a célula-tronco dessa população celular não fracionada (HORWITZ et al., 2005). Ou seja, as propriedades biológicas dessa população não fracionada de células plástico-aderentes não atendiam aos critérios geralmente aceitos para a classificação como células-tronco, tornando o nome cientificamente impreciso (HORWITZ et al., 2005). A partir de então, O Comitê de Células-tronco Teciduais e Mesenquimais (“Mesenchymal and Tissue Stem Cell Committee”) da Sociedade Internacional de Terapia Celular – ISCT (“International Society for Cellular Therapy”) determinou que as células plástico-aderentes seriam denominadas como células estromais mesenquimais multipotentes (do inglês, multipotent mesenchymal stromal cells), enquanto o termo “células-tronco mesenquimais” deveria ser utilizado para aquelas células que apresentassem atividade de autorrenovação de longa duração e diferenciação em tipos celulares específicos in vivo (DOMINICI et al., 2006; HORWITZ et al., 2005). Essa é uma discussão em aberto e que não há consenso na comunidade científica. Devido a isso o acrônimo MSC vem sendo utilizado para referir-se aos termos: célula-tronco mesenquimal, célula estromal mesenquimal e célula estromal multipotente, dependendo da terminologia adotada pelo autor. Neste trabalho o acrônimo MSC referenciará ao termo Célula-Tronco Mesenquimal, visando facilitar o entendimento do leitor quanto aos tópicos abordados neste trabalho, e englobar as células com características referentes a células-tronco e com aquelas definidas pelo Comitê de Células-tronco Teciduais e Mesenquimais, descritas a seguir. O Comitê de Células-tronco Teciduais e Mesenquimais da ISCT determinou alguns parâmetros básicos para definir as MSCs humanas multipotentes, cujas características básicas incluem autorrenovação e diferenciação durante investigações laboratoriais e estudos pré-clínicos (DOMINICI et al., 2006), sendo eles (Figura 4): ● Plástico-aderente em condições de cultura padrão; ● ≥95% da população de MSCs deve expressar os marcadores: CD105, CD73 e CD90; ● Marcadores silenciados (expressão positiva ≤ 2%): CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD19α ou CD19, e HLA classe II; ● Diferenciação em osteoblastos, adipócitos ou condroblastos em condições de diferenciação in vitro padrão. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 7 Figura 4: Características das Células-tronco Mesenquimais Em condições tradicionais de cultivo celular (in vitro), as MSCs aderem à superfície plástica e emitem prolongamentos citoplasmáticos, conferindo-as formato fusiforme e/ou “estrelado”, característico deste tipo celular. (+) marcadores moleculares presentes; (-) marcadores moleculares silenciados. Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. 2.1 PRINCIPAIS TECIDOS USADOS PARA COLETA DE MSC As MSCs originárias de diferentes tecidos divergem devido ao distinto microambiente de cada tecido onde se alojam. Cada uma destas células está condicionada ao microambiente de origem, o que as torna diferentes umas das outras quanto à capacidade própria de diferenciação (CAPLAN, 2019). Diante dessas diferenças, serão abordadas as principais fontes de MSCs e particularidades dos principais tecidos estudados. 2.1.1 Medula óssea A primeira fonte descrita de células-tronco mesenquimais é a medula óssea, composta por células hematopoiéticas e estromais, dentre as quais uma pequena porção (~0.001%-0.01%) é representada pelas MSCs - denominadas BM-MSCs (do inglês, bone marrow derived mesenchymal stem cells) (GARA et al., 2017; MCDANIEL et al., 2017). Dependendo da finalidade do uso das BM-MSCs, elas podem ser coletadas da crista ilíaca ou do osso trabecular. Para fins terapêuticos, as BM-MSCs são coletadas principalmente a partir da crista ilíaca conforme protocolo padronizado (LENNON; CAPLAN, 2006). Podem ainda ser coletadas a partir do osso trabecular (tecido esponjoso mais leve, revestido por uma camada exterior rígida conhecida como osso compacto), o que acontece principalmente durante procedimentos ortopédicos cirúrgicos, como substituição do quadril por prótese (OREFFO et al., 1999). Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 8 2.1.2 Tecido adiposo As MSCs podem ainda ser obtidas a partir do tecido adiposo, quando são também denominadas células-tronco mesenquimais de tecido adiposo (AD-MSCs). Nesse caso, podem ser coletadas a partir de biópsia de um fragmento de tecido adiposo adulto (60–70 g de tecido) (Figura 5) ou extraídas pelo procedimento de lipoaspiração (200 mL gordura extraída) (KERN et al., 2006; KOCAOEMER et al., 2007). As AD-MSCs são similares morfológica e imunofenotipicamente às MSCs derivadas de medula óssea, porém apresentam maior capacidade de formar unidades formadoras de colônias do tipo fibroblastos (do inglês, Colony Forming Unit Fibroblast-like - CFU-Fs) (KERN et al., 2006). Sendo assim, o tecido adiposo é uma fonte atraente de MSCs para medicina regenerativa quando comparado à medula óssea, pois as AD- MSCs são relativamente fáceis de obter, possuem baixo risco para os doadores e apresentam maior rendimento, com maior número de MSCs por mL, sendo que a taxa de sucesso de isolamento é 40 vezes mais elevada (CCB, 2021; MIZUNO; HYAKUSOKU, 2003). Figura 5: Ilustração da coleta de amostras de tecido adiposo para isolamento de MSCs As AD-MSCs podem ser isoladas a partir de amostras do tecido adiposo tanto de roedores (A), localizado na região abdominal e inguinal (delimitada pela linha pontilhada), como também de humanos (B) submetidos à abdominoplastia para remoção do excesso de pele e gordura do abdômen. Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 9 2.1.3 Cordão umbilical Além da medula óssea e tecido adiposo, outra fonte de MSCs é o cordão umbilical, seja o sangue do cordão ou a Geleia de Wharton. O método de coleta a partir do sangue já está bem estabelecido, o que contribui para a criação de bancos de estocagem, facilitando a obtenção de MSCs para fins terapêuticos (GARA et al., 2017). A obtenção das MSCs e eficácia de coleta depende do método aplicado, da qualidade dos insumos utilizados e das características do paciente. Para que esse procedimento seja bem-sucedido (eficiência superior a 60%), é necessário, por exemplo, que a coleta de MSCs seja realizada em até 15 horas após o parto e com um volume de pelo menos 33 mL do sangue do cordão. O rendimento mínimo para uma coleta de sucesso deve apresentar pelo menos 1x108 células e sem sinais de coagulação ou hemólise das amostras (BIEBACK, 2004). Esses parâmetros são necessários, já que a eficácia do isolamento das MSCs pode variar também de acordo com a idade materna, consumo de álcool e cigarro, método de parto (natural ou cesárea), tempo de gestação, tamanho da placenta e do cordão umbilical. O método de coleta a partir da Geleia de Wharton (matriz do cordão umbilical) é uma alternativa à coleta a partir do sangue, devido aos diversos fatores descritos acima que podem influenciar na obtenção das MSCs (WANG et al., 2004). Esse método envolve a obtenção do cordão e o seu transporte até o laboratório em condições assépticas. Em laboratório, o material é processado para que o isolamento e proliferação das células aderentes seja realizado e as células obtidas sigam para o armazenamento (criopreservação a -196°C) e utilização futura (WANG et al., 2004). Vale ressaltar que o processo de armazenamento de MSC é o mesmo utilizado, quando as células-tronco mesenquimais são obtidas da medula óssea e do tecido adiposo. 2.1.4 Sangue Periférico Ainda é possível encontrar MSCs no sangue periférico, embora em baixas quantidades (menos de 0.5% das células presentes no sangue). Essa quantidade aumenta sob o estímulo de fatores de crescimento, fazendo com que as MSCs presentes na medula óssea e nas reservas de pericitos sejam liberadas (INSTITUTO HOC, 2021). Para aumentar o rendimento da coleta a partir do sangue periférico, realiza-se o procedimento de mobilização, em que essas células-tronco migram para o sangue periférico. Nesse procedimento são usadas citocinas recombinantes, sendo elas Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos (do inglês, Granulocyte Colony-Stimulating Factor - G-CSF) ou Fator Estimulador de Colônia de Granulócitos / Macrófagos (do inglês, Granulocyte/Macrophage Colony-Stimulating Factor - GM-CSF), associadas ou não a quimioterápicos (INSTITUTO HOC, 2021; KASSIS et al., 2006). A mobilização leva ao aumento de aproximadamente 4 vezes na quantidade de MSCs disponíveis para coleta, o que pode contribuir com a escolha do método a depender das condições do paciente (RIPA et al., 2007). Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 10 3 PROPRIEDADES 3.1 POTENCIAL DE DIFERENCIAÇÃO Como proposto pelo Comitê de Células-tronco Teciduais e Mesenquimais do ISCT, as células- tronco mesenquimais devem ser capazes de se diferenciar pelo menos em adipócitos, osteoblastos e condroblastos em condições padrão in vitro (DOMINICI et al., 2006). Atualmente existem diversos protocolos que podem ser aplicados, dependendo da fonte de coleta das MSCs e do tipo celular diferenciado desejado. A seguir serão brevemente descritas as condições necessárias do protocolo mais estudado, para que cada diferenciação ocorra. Essas informações estão resumidas na Figura 6. Figura 6: Processo de diferenciação das MSCs Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. A diferenciação osteogênica ocorre a partir da incubação de uma cultura em monocamada de MSCs com os componentes: β-glicerol-fosfato, ácido ascórbico-2-fosfato, dexametasona e soro fetal bovino. Após diferenciação, as células devem apresentar morfologia característica de osteoblastos e altos níveis de fosfatase alcalina e cálcio (Figura 7). Um dos métodos de validação a ser usado é a coloração de Von Kossa, em que a cultura é submetida a uma solução de nitrato de prata e luz para quantificar a deposição de cálcio da cultura (BARRY; MURPHY, 2004). Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 11 Figura 7: Diferenciação osteogênica Diferenciação osteogênica in vitro de células-tronco/estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano, isoladas por meio de técnicas de digestão enzimática (A) e dissociação mecânica (B), com matriz óssea corada com Alizarin Red S. Fonte: Adaptado de Fuoco et al., 2020. Já para diferenciação adipogênica, a monocamada de MSCs é incubada com isobutilmetilxantina para formar adipócitos com vacúolos lipídicos. O método de validação a ser usado é a visualização dos vacúolos lipídicos dentro dos adipócitos (Figura 8), que pode ser viabilizada através da coloração com Oil red, uma técnica que usa óleo solúvel em gordura para corar lipídios e gordura em secções congeladas (BARRY; MURPHY, 2004). Figura 8: Diferenciação adipogênica Diferenciação adipogênica in vitro de células-tronco/estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano, isoladas por meio de técnicas de digestão enzimática (A) e dissociação mecânica (B), com vacúolos lipídicos no interior citoplasmático corados com Oil red O. Fonte: Adaptado de Fuoco et al., 2020. Por fim, a diferenciação condrogênica é estimulada inicialmente com uma cultura tridimensional no meio livre de soro e suplementado com fator de crescimento-𝛽 (BARRY; MURPHY, 2004). Durante esse processo, as MSCs começam a produzir camadas de matriz de cartilagem preenchidas com Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 12 glicosaminoglicanos (Figura 9). O método de validação usado consiste na visualização desse componente da matriz de cartilagem através de um corante policromático, que pode ser o indicador azul de toluidina, responsável por identificar os glicosaminoglicanos (BARRY; MURPHY, 2004). Figura 9: Diferenciação condrogênica Diferenciação condrogênica in vitro de células-tronco/estromais mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano, isoladas por meio de técnicas de digestão enzimática (A) e dissociação mecânica (B), com a síntese de proteoglicanos corada com Alcian Blue. Fonte: Adaptado de Fuoco et al., 2020. 3.2 PROPRIEDADE IMUNOMODULATÓRIA As MSCs são caracterizadas pela baixa expressão do complexo principal de histocompatibilidade (MHC) classe II e pela ausência de moléculas CD80 e CD86 (moléculas coestimuladoras que auxiliam na sinalização de apresentação de antígeno pelo MHC II). Tais características conferem “invisibilidade” imunológica, pois o sistema imunológico é incapaz de detectar essas células como não-próprias, o que as torna imunoprivilegiadas (GHANNAM et al., 2010; KEAN et al., 2013). Figura 10: Efeitos imunomodulatórios das MSCs Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 13 Além de serem imunoprivilegiadas, as MSCs apresentam a capacidade de imunomodulação por meio de diferentes processos, como: (i) inibição da maturação e proliferação linfocítica; (ii) redução da produção de citocinas; (iii) imunorregulação das células dendríticas, e (iv) inibição da ativação dos linfócitos T citotóxicos (Figura 10) (GHANNAM et al., 2010; KEAN et al., 2013). Além disso, as células- tronco mesenquimais dificultam a proliferação de células T ativadas, prolongam a sobrevida de células T em estado quiescente, e induzem expansão das células T regulatórias. Tal modulação dos linfócitos T é mediada via fatores parácrinos, como a produção de TGF- β, bem como também através do contato célula- célula (GHANNAM et al., 2010; KEAN et al., 2013). Os plasmócitos também são afetados pelas MSCs, as quais suprimem a diferenciação terminal de células B em células produtoras de anticorpos, interferindo negativamente na capacidade de produzi-los, sejam IgM ou IgG (Figura 10). Além dos linfócitos T e B, as MSCs também inibem a expansão e ativação de células NK, reduzindo sua atividade citolítica, porém os mecanismos exatos que levam a esse efeito ainda são pouco conhecidos (GHANNAM et al., 2010; KEAN et al., 2013). Portanto, observa-se que as células-tronco mesenquimais suprimem a ativação do sistema imunológico a partir da regulação das células linfocíticas e também do sistema imune inato (SCHEPERS; FIBBE, 2016). A partir dessa observação, conclui-se que a imunomodulação pode ser uma característica vantajosa para a aplicação terapêutica das MSCs, principalmente quando estas são de origem alogênica, o que reduz as chances de rejeição e intensifica o potencial terapêutico (PATEL; BARTLETT; ICHIM, 2015). Embora a imunomodulação possa ser estabelecida pelo contato célula-célula, a via parácrina é a mais descrita será abordada em mais detalhes a seguir. 3.3 PROPRIEDADE PARÁCRINA Pesquisas recentes têm mostrado que a capacidade de imunomodulação e também de regeneração do tecido pelas MSCs está ligada à liberação de diversos fatores, através de sua ação parácrina (PHINNEY; SENSEBÉ, 2013). Esses fatores são transportados ao local de dano através de vesículas extracelulares, sejam elas microvesículas ou exossomos (HELDRING et al., 2015; MENDT; REZVANI; SHPALL, 2019). Dentre os fatores secretados, podem ser citados: componentes da matriz extracelular, proteínas, enzimas, fatores de crescimento, citocinas, quimiocinas, entre outros (KUPCOVA SKALNIKOVA, 2013). Tais moléculas sinalizadoras são responsáveis pela inibição da apoptose, indução de proliferação, prevenção de fibrose excessiva dos tecidos, estimulação do processo de angiogênese e imunomodulação (AGGARWAL; PITTENGER, 2005; CANTINIEAUX et al., 2013; DJOUAD et al., 2007; MAGGINI et al., 2010; PATEL et al., 2010; TANG et al., 2005; ZANOTTI et al., 2016). A ação parácrina das vesículas produzidas pelas MSCs promove estímulos direcionados às células do microambiente tecidual e, caso haja alguma lesão tecidual, esses estímulos auxiliam também na recuperação do tecido (Figura 11). Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Células Tronco Mesenquimais 14 Figura 11: Efeito Parácrino das MSCs Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. Particularmente, os exossomos representam as vesículas extracelulares que participam de forma mais significativa na comunicação intercelular das MSCs, transportando diversas moléculas como proteínas, mRNAs e microRNAs até as células alvo (BAGNO et al., 2018; BÖRGER et al., 2017; HELDRING et al., 2015; WANG et al., 2017; YANG et al., 2018). Sendo assim, os exossomos derivados das MSCs representam uma alternativa para aplicação clínica de fatores terapêuticos livre de células, o que corresponde a uma das principais vantagens do seu uso como potencial ferramenta terapêutica. Uma descrição detalhada de sua origem, características e funcionalidade será abordada no próximo capítulo, juntamente com os principais pontos positivos de sua utilização para aplicação terapêutica. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Exossomos 15 1 ORIGEM DOS EXOSSOMOS As vesículas extracelulares (EVs – do inglês, “extracellular vesicles”) (Figura 12a) consistem em vesículas revestidas por membrana que são secretadas pelas células e são responsáveis pela comunicação intercelular por meio de transferência de diferentes moléculas bioativas, sejam elas lipídios, proteínas e RNAs (Figura 12b). Elas são subdivididas em duas categorias: ectossomos e exossomos (KALLURI; LEBLEU, 2020; LÖTVALL et al., 2014). Os ectossomos (Figura 12a) consistem em vesículas derivadas de brotamento da membrana plasmática e podem variar em diâmetro, desde ~50 nm até 1 µm (KALLURI; LEBLEU, 2020). Já os exossomos têm origem endossomal e seu diâmetro pode variar de ~40 nm até 160 nm. São formados a partir do processo de endocitose, que gera os endossomos iniciais localizados no citosol (Figura 12a). Esses endossomos amadurecem, tornam-se endossomos tardios e posteriormente apresentam-se como corpos multivesiculares, os quais são liberados da célula após a sua fusão com a membrana plasmática (HYENNE et al., 2015; KALLURI; LEBLEU, 2020). Depois da sua liberação no ambiente extracelular, eles são direcionados a células do microambiente ou são transportados para locais distantes através dos fluidos biológicos, atuando como mensageiros e participando de diversos processos fisiológicos e patológicos (YIN; WANG; ZHAO, 2019). Os exossomos são constantemente produzidos e liberados por diferentes tipos celulares, sendo que essa produção já está bem estabelecida para alguns, como: reticulócitos, linfócitos B e T, plaquetas, mastócitos, células epiteliais intestinais, células dendríticas, células neoplásicas e células imunes do sistema nervoso (micróglia e neurônios) (FÉVRIER; RAPOSO, 2004; NIKFARJAM et al., 2020; POTOLICCHIO et al., 2005). Capítulo 2 EXOSSOMOS Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Exossomos 16 Figura 12: Origem dos ectossomos e exossomos Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. A produção de exossomos depende da biologia da célula de origem e do seu microambiente, já que a sua produção está vinculada ao estado da célula e à demanda do meio externo; sendo assim, os exossomos variam quanto ao seu tamanho, conteúdo interno, receptores de superfície celular, funcionalidade e origem celular. A heterogeneidade dos exossomos dificulta a padronização de métodos de identificação e purificação devido às variáveis citadas acima (MATHIEU et al., 2019; VAN NIEL; D’ANGELO; RAPOSO, 2018). De acordo com uma declaração de posição realizada em 2014 pela Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares (do inglês, “International Society for Extracelular Vesicles”), não há marcadores específicos de vesículas extracelulares que possam ser utilizados como padrões básicos, dificultando a implementação de um único método de identificação padrão (LÖTVALL et al., 2014). Atualmente, a morfologia e o tamanho são usados para discriminar as diferentes classes de EVs, sendo que os procedimentos já estabelecidos são: ultracentrifugação, separação por gradiente de densidade, cromatografia, captura por imunoafinidade (IAC) e precipitação baseada em polímero. O método mais eficaz para isolar exossomos é a IAC, que se baseia em anticorpos imobilizados capazes de reconhecer Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Exossomos 17 proteínas específicas de membrana, dependendo do tipo celular estudado. No entanto, pode haver situações em que não haja anticorpos adequados para identificação; em tais casos, o uso da separação baseada na densidade é o mais indicado para o isolamento dos exossomos (GREENING et al., 2015; LÖTVALL et al., 2014). 1.1 EXOSSOMOS DERIVADOS DE MSCS Dentre as células que produzem exossomos, as MSCs representam um grupo celular com características peculiares e cujos exossomos têm sido intensamente avaliados quanto à potencial aplicabilidade. Exossomos derivados de MSCs atuam por meio de transferência horizontal de lipídeos funcionais, mRNAs, miRNAs e proteínas, agindo em diversos processos nas células-alvo, desde modulação de expressão gênica a diversas vias de sinalização e metabolismo (PASHOUTAN SARVAR; SHAMSASENJAN; AKBARZADEHLALEH, 2016; TOMASONI et al., 2013). Estudos envolvendo a administração sistêmica de exossomos derivados de MSCs, via injeção intravenosa, têm mostrado que essas EVs apresentam capacidade de homing, ou seja, se deslocam do local administrado até sítios de lesão (GRANGE et al., 2014). Após testes in vivo de administração de exossomos para fins terapêuticos, sua biodistribuição tem se mostrado um processo dinâmico com rápida fase de distribuição para fígado, baço e pulmões (aproximadamente 30 minutos após a administração), seguida por uma fase de eliminação via processamento hepático e renal (remoção de EVs) em 1-6 horas após a administração (LAI et al., 2014). Além da administração sistêmica, a administração intranasal também tem sido avaliada para, por exemplo, lesões de sistema nervoso central como isquemia cerebral. Comparando as vias intravenosa e intranasal, esta última tem apresentado melhor biodistribuição no cérebro, levando a um acúmulo de exossomos maior no local do cérebro afetado (BETZER et al., 2017). Considerando os efeitos terapêuticos, estudos pré-clínicos com exossomos derivados de MSCs têm confirmado sua ação benéfica frente a diversas doenças e lesões, como, por exemplo: infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, lesão cerebral hipóxico-isquêmica perinatal e isquemia do membro posterior (OPHELDERS et al., 2016; TENG et al., 2015; XIN et al., 2013). Outros estudos mostraram também a indução da reepitelização em feridas cutâneas, regeneração muscular e potencial ação neuro-protetora (BONAFEDE et al., 2016; NAKAMURA et al., 2015; ZHANG et al., 2015). 1.2 MEIO CONDICIONADO DERIVADO DAS MSCS (MSC-CM) Uma das fontes de obtenção dos exossomos de células tronco mesenquimais, seja para fins terapêuticos ou de pesquisa, pode ser o meio condicionado, isto é, o meio de cultura celular em que as MSCs são cultivadas. O MSC-CM contém citocinas, fatores de crescimento, biomoléculas, exossomos e demais vesículas liberadas pela célula no meio de cultura (SAGARADZE et al., 2019). A maioria dos laboratórios isola os exossomos derivados das MSCs a partir do meio condicionado via ultracentrifugação e os caracterizam com base nas suas respectivas proteínas de membrana e conteúdo interno (PHINNEY; Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Exossomos 18 PITTENGER, 2017). Atualmente, estudos estão desenvolvendo novos métodos de isolamento e identificação que sejam mais precisos e padronizados. Entretanto, os exossomos isolados não são os únicos que têm apresentado resultados promissores, sendo que o meio condicionado não fracionado também tem demonstrado efeitos benéficos quando aplicado tanto em modelos animais, quanto em estudos clínicos, como, por exemplo para terapêutica de esclerose múltipla, artrite inflamatória e lesão da medula espinal (CANTINIEAUX et al., 2013; DAHBOUR et al., 2017; KAY et al., 2017). Diante disso, é importante estabelecer parâmetros comparativos para avaliar a melhor estratégia terapêutica, seja com base em terapia celular ou em produtos biológicos derivados de cultura celular. 2 CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS vs EXOSSOMOS/MEIO CONDICIONADO Nesta seção, as estratégias terapêuticas de aplicação de células-tronco mesenquimais e de aplicação de exossomos/meio condicionado serão comparadas de acordo com as variáveis descritas no Quadro 1. Quadro 1 - Variáveis usadas para comparação de estratégias terapêuticas: Variáveis Estratégia terapêutica Dose Células-tronco mesenquimais vs Exossomos/Meio condicionado Número de aplicações Tempo de ação Via de administração Probabilidade de mutações Efeitos adversos Fonte: Próprio autor. Todas as variáveis associadas à estratégia terapêutica dependem do tipo de doença/lesão, estado do paciente, urgência de tratamento, entre outras. As MSCs podem ser aplicadas em menor número de doses ao paciente, devido a sua ação duradoura, já que essas células se alojam no tecido e lá produzem os exossomos ricos em fatores que vão atuar de acordo com a demanda tecidual. Entretanto, a quantidade de MSCs que atinge o tecido alvo tende a ser menor que a dose administrada, já que ao longo da rede vascular as células podem ser retidas em diferentes órgãos. Sendo assim, é possível que a administração de MSCs não atinja o tecido alvo com a concentração celular adequada e necessária para o reparo tecidual, diferentemente dos exossomos purificados, os quais podem ser utilizados em doses concentradas para potencializar sua ação. Dessa forma, a ação terapêutica dos exossomos pode apresentar maior efetividade a curto-prazo, quando comparados às MSCs (GOMZIKOVA; RIZVANOV, 2017; PHINNEY; PITTENGER, 2017). Como observado acima, o tempo de ação pode ser influenciado pela dose do insumo terapêutico, mas também pode variar de acordo com a via de administração, ou seja, uma injeção direta no local lesionado pode levar à ação mais rápida e assertiva do que a via endovenosa. Porém, em se tratando de injeção direta, outros fatores devem ser levantados, como os procedimentos cirúrgicos para acessar o tecido lesionado, que acabam sendo muito invasivos para o paciente (HERBERTS; KWA; HERMSEN, 2011). A via endovenosa é menos invasiva que a injeção direta, mas a dose administrada é diluída pelo corpo Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Exossomos 19 humano, no sentido de que a concentração de MSCs ou exossomos que alcança o tecido lesionado é menor que a dose total administrada. Outro fator importante em relação ao tempo de ação e eficácia do tratamento é o tamanho dos exossomos, já que são pequenas vesículas e circulam facilmente no organismo humano. As MSCs apresentam dimensões muito maiores comparadas aos exossomos, o que dificulta sua circulação e muitas não vão além da primeira passagem pelo leito capilar, ficando retidas geralmente nos pulmões (ÖZTÜRK et al., 2021; PHINNEY; PITTENGER, 2017). Outro ponto importante a ser considerado é que os exossomos derivados de MSCs são passíveis de aplicação como terapia cell-free, alternativa à terapia celular baseada em MSCs. Os exossomos são facilmente produzidos em laboratório (comparado à produção de MSCs), apresentam mínima probabilidade de levar mutações às células receptoras e consequentemente induzir a formação de tumores. Diferentemente dos exossomos, as MSCs possuem a probabilidade de apresentar mutações a nível de DNA em decorrência das muitas passagens in vitro. Tais alterações podem não ser detectadas pelos protocolos de controle de qualidade e, caso as células portadoras sejam utilizadas in vivo, há chances de desenvolvimento de tumores, a depender da mutação (GOMZIKOVA; RIZVANOV, 2017; ÖZTÜRK et al., 2021; PHINNEY; PITTENGER, 2017). Um dos pontos positivos na proposta de aplicação dos exossomos está na menor propensão a gerar efeitos adversos, como pode acontecer em situações de aplicação das MSCs (HERBERTS; KWA; HERMSEN, 2011). Como exemplos de efeitos adversos que podem ser evitados tem-se a embolia pulmonar e o infarto (YIN; WANG; ZHAO, 2019). Ambos os eventos adversos foram observados entre membros de uma mesma família que tomaram várias injeções via intravenosa de AD-MSCs autólogas, conforme descrito por Jung e colaboradores (2013). Os pacientes, pai e filho, receberam o mesmo tratamento para diferentes doenças, sendo elas: osteoartrite de joelho (3 tratamentos com injeções de AD-MSCs) e hérnia de disco cervical (5 tratamentos com injeções de AD-MSCs), respectivamente (JUNG et al., 2013). Diante desses fatos, a administração de células pode apresentar sérios efeitos adversos, portanto é válido estabelecer estudos comparativos entre terapias celulares e terapias cell-free, cujo risco teórico de causar embolia ou infarto é menor. Mesmo diante das características mencionadas, ainda é difícil chegar a conclusões a respeito de estratégias definitivas sobre efetividade e potência quanto ao uso de MSCs ou exossomos, que apresentem a máxima eficácia com o mínimo de efeitos adversos. Fazem-se necessários mais estudos com controles apropriados, dosagem comparável, avaliação dos diferentes desfechos da doença, variações na frequência e tempo de administração de cada dose, e efeitos adversos reduzidos, o que torna a aplicação de exossomos em larga escala e seu uso como alternativa terapêutica um desafio atual, mas com potencial para aplicação futura (GOMZIKOVA; RIZVANOV, 2017; HERBERTS; KWA; HERMSEN, 2011; PHINNEY; PITTENGER, 2017). Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Exossomos 20 3 DESAFIOS DA UTILIZAÇÃO DOS EXOSSOMOS NA CLÍNICA Os exossomos apresentam-se como alternativas terapêuticas promissoras, mas, apesar dos benefícios de sua aplicação na medicina regenerativa, ainda há alguns desafios que devem ser elucidados a fim de se obter uma aplicação clínica bem-sucedida (JAFARI et al., 2020; KICHENBRAND et al., 2019; TAYLOR; SHAH, 2015), sendo eles: a) protocolos de controle de qualidade e padronização de bioprocessos das terapias baseadas em exossomos e MSC-CM; b) heterogeneidade dos exossomos e fatores contidos nas MSC-CM; c) produção em larga escala de exossomos, obtendo a quantidade mínima necessária para aplicação clínica. A heterogeneidade é um importante fator a ser considerado, já que os métodos de extração de vesículas extracelulares possuem taxa de recuperação e eficiência distintas, dificultado a obtenção de uma fração pura de exossomos isolados. Além disso, os exossomos de uma única célula podem variar entre si quanto à composição interna, em diferentes parâmetros de cultura e estágio de crescimento. Assim, a realização de métodos de purificação é prejudicada e, consequentemente, a padronização de metodologias escalonáveis também o são (KALLURI; LEBLEU, 2020; WILLIS; KOUREMBANAS; MITSIALIS, 2017). Outro desafio quanto à aplicação terapêutica é a interação dos exossomos com o microambiente tumoral. Estudos vêm demonstrando que exossomos liberados de células leucêmicas reprogramam as MSCs do paciente para promover e reforçar o desenvolvimento do nicho tumoral (microambiente das células leucêmicas) (PHINNEY; PITTENGER, 2017). Outros estudos têm mostrado que exossomos derivados de MSCs de pacientes com mieloma múltiplo podem expressar níveis mais elevados de citocinas oncogênicas em comparação com aqueles de pacientes normais, promovendo o crescimento de células tumorais in vivo e a comunicação das células cancerosas com o microambiente (ROCCARO et al., 2013). Os fatos mencionados acima demonstram a dificuldade de se aplicar terapias com exossomos derivados de MSC autólogas em casos de pacientes com câncer, o que reforça a necessidade de testes prévios e comparativos entre diferentes alternativas terapêuticas. Embora haja dados pré-clínicos que evidenciem os benefícios da terapia baseada em exossomos derivados de MSCs, ainda há grande demanda por estudos quanto às condições de cultura celular padrão e protocolos ideais de produção, purificação e armazenamento de exossomos. Além disso, também é necessário determinar a dose e a via de administração ideais, bem como o procedimento padrão de administração a fim de avaliar a eficácia desse novo tipo de terapia cell-free (NIKFARJAM et al., 2020; SQUILLARO; PELUSO; GALDERISI, 2016). Diante dessa demanda, no capítulo seguinte serão abordados alguns estudos clínicos completos e em desenvolvimento com aplicação de exossomos e MSC- CM como terapias cell-free, mas também de MSCs como terapia celular. A partir desses e de estudos Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Exossomos 21 futuros, será possível estabelecer melhores estratégias terapêuticas e delinear a melhor abordagem, seja com base em células MSCs ou em exossomos/meio condicionado. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 22 1 POTENCIAL DAS CÉLULAS-TRONCO MESENQUIMAIS NA SAÚDE Nos últimos anos, as propriedades das células-tronco mesenquimais (MSCs) têm mostrado um grande potencial terapêutico para diversas doenças e lesões. Tal potencial resulta de características como: i) diferenciação em várias linhagens celulares, ii) produção de fatores tróficos cruciais para a sobrevivência e proliferação celular, iii) modulação da resposta imune, e iv) migração para o local exato da lesão (homing) (SQUILLARO; PELUSO; GALDERISI, 2016). Existem atualmente diversos ensaios clínicos que avaliam a aplicação terapêutica de MSCs, os quais podem ser consultados no banco de dados ClinicalTrials.gov, sob a responsabilidade do National Institute of Health (NIH), agência norte-americana de pesquisa biomédica. Com base nesse banco de dados, a seguir serão abordados alguns estudos clínicos envolvendo células-tronco mesenquimais. 1.1 APLICAÇÃO CLÍNICA O Quadro 2 traz as informações resumidas dos ensaios clínicos atuais envolvendo a aplicação de células-tronco mesenquimais como alternativas terapêuticas. Todos os estudos citados serão descritos em maiores detalhes em seguida. Capítulo 3 APLICABILIDADE DAS MSCs E EXOSSOMOS NA SAÚDE Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 23 Quadro 2 - Estudos Clínicos envolvendo células-tronco mesenquimais. TÍTULO DO ESTUDO DOENÇA ESTRATÉGIA FASE NCT* Uso de MSCs para engenharia tecidual de osso alveolar em pacientes com fissura labiopalatina Fissura labial e fenda palatina MSCs da polpa dentária decídua associadas a biomaterial de colágeno e hidroxiapatita Finalizado NCT01932164 Efeito da transfusão de MSCs em pacientes com neuropatia periférica diabética. Neuropatia Periférica Diabética MSCs autólogas da medula óssea Finalizado NCT02387749 Transferência intracoronária de MSCs derivadas de geléia de Wharton em pacientes com infarto agudo do miocárdio Infarto agudo do miocárdio Células-tronco mesenquimais derivadas de geléia de Wharton umbilical Fase 2 NCT01291329 MSCs derivadas do tecido do cordão umbilical (UC) versus placebo para tratar a inflamação pulmonar aguda devido a COVID-19 COVID-19 Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido do cordão umbilical Fase 1 NCT04490486 Avaliação da segurança e eficácia de MSCs alogênicas (AC607) para o tratamento de lesão renal em pacientes de cirurgia cardíaca Lesão Renal Aguda AC607 (MSCs alogênicas) Finalizado NCT01602328 *Número de Identificação do ensaio clínico no banco de dados ClinicalTrials.gov. Fonte: Adaptado de ClinicalTrials.gov. Acesso em: 24 abr. 2021. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 24 1.1.1 Uso de MSCs para engenharia tecidual de osso alveolar em pacientes com fissura labiopalatina Atualmente, a reconstrução do esqueleto craniofacial em pacientes com fissura labiopalatina é realizada através de três cirurgias ao longo dos primeiros anos do paciente (até os 8-12 anos). A cirurgia final corresponde à implementação de autoenxerto ósseo, que consiste em retirar um fragmento ósseo do próprio paciente de uma localização específica (por exemplo, crista ilíaca, costelas, crânio) para inseri-lo no local lesionado. Como consequência do processo cirúrgico, a região doadora de tecido ósseo pode apresentar deformidade e incapacidade física, o quem se torna um grande desafio para a cirurgia plástica reconstrutiva. Com o advento da bioengenharia tecidual, entretanto, a osteogênese induzida pelo uso de células-tronco mesenquimais associadas a biomateriais tornou-se uma solução potencial para eliminar a morbidade na região doadora, a escassez de osso doador e consequentemente reduzir os custos de permanência do paciente em centro cirúrgico (TANIKAWA et al., 2020; TRIAL.GOV, 2016). O objetivo deste estudo foi realizar a engenharia do tecido ósseo para reconstruir o defeito ósseo alveolar em pacientes com fissura labiopalatina. Para tal, utilizaram-se MSCs autólogas de polpa dentária decídua associadas a biomaterial de colágeno e hidroxiapatita (Geistlich Bio-Oss®) por meio de métodos prospectivos qualitativos e análise quantitativa da neoformação óssea. O Bio-Oss collagen® (Geistlich Biomaterials AG, Wolhusen, Alemanha) é um osso esponjoso bovino (xenoenxerto) desproteinizado, que se assemelha ao osso humano com propriedades osteocondutoras e osteoindutivas inerentes. Sua estrutura é formada por hidroxiapatita, a qual é composta de um sistema de poros interconectados que facilitam a aderência celular e o crescimento vascular. Este xenoexerto contém 10% de colágeno, tornando o biomaterial mais moldável e com maior facilidade de manuseio (TANIKAWA et al., 2020; WONG; RABIE, 2010). As MSCs autólogas foram depositadas sobre o biomaterial, e a estrutura combinada foi aplicada em pacientes com fissura labiopalatina. O estudo teve início em maio de 2013 e término em dezembro de 2015. Neste estudo, o resultado dos pacientes tratados com células-tronco foi comparado com resultados prévios de pacientes que foram tratados com rhBMP-2 (grupo1) e autoenxerto (grupo 2). O rhBMP-2 é um fator de crescimento administrado em pacientes com lesão óssea, como tratamento alternativo ao autoenxerto. Todos os pacientes tratados com células-tronco apresentaram mineralização óssea >75% e pequenas quantidades de hidroxiapatita ainda presentes ao longo dos 12 meses de acompanhamento. Quanto a morbidade, pacientes tratados com MSCs não tiveram complicações cirúrgicas, enquanto 37,5% dos pacientes do grupo 1 apresentaram complicações pós-operatórias e 87,5% do grupo 2 apresentam reclamações de dor na segunda semana. Durante 5 anos, os pacientes tratados com MSCs foram monitorados e, até o momento, não detectaram complicações ou riscos associados a esta nova terapia (TANIKAWA et al., 2020). 1.1.2 Efeito da transfusão de MSCs em pacientes com neuropatia periférica diabética Em se tratando de diabetes mellitus, uma consequência debilitante da doença é a neuropatia diabética, a qual representa a complicação mais comum. A hiperglicemia induz a redução na produção de Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 25 fatores de crescimento angiogênicos e neurotróficos, que são necessários para a função normal dos neurônios, células gliais e manutenção da estrutura vascular. O tratamento atual se concentra em um controle glicêmico rígido, o que pode reduzir os fatores de risco de dano neuronal e controle da dor associada à neuropatia diabética, porém, até o momento, não há nenhum tratamento definitivo para reverter a mesma (RIAD, 2015). As MSCs são agentes terapêuticos particularmente atraentes devido a sua capacidade de autorrenovarão, diferenciação e secreção de fatores capazes de estimular a neovascularização e regeneração neural. A natureza aderente das MSCs as torna fáceis de expandir em cultura, tornando-se candidatas atraentes para uso em terapia celular. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos da transfusão de MSCs em pacientes diabéticos com neuropatia periférica diabética (RIAD, 2015). O estudo teve início em maio de 2014 e término em dezembro de 2016. De acordo com os resultados apresentados na plataforma, observou-se que, após 90 dias da administração intravenosa das MSCs, houve aumento da concentração dos fatores FGF-β e VEGF, que apresentam ação angiogênica e neurotrófica. Esse aumento sugere que as MSCs estão liberando esses fatores através de sua ação parácrina. Além disso, observou-se melhoria da condição diabética, como redução do nível de glicose e de hemácias glicadas no sangue, diminuição em necessidades de insulina e melhoria do estado geral, sem efeitos adversos graves ao longo dos 3 meses de estudo. 1.1.3 Transferência intracoronária de MSCs derivadas de geleia de Wharton (WJ-MSCs) em pacientes com infarto agudo do miocárdio O infarto agudo do miocárdio caracteriza-se pela oclusão de uma artéria coronária epicárdica que leva a uma situação clínica de extrema gravidade e com risco de vida. As WJ-MSCs do cordão umbilical humano originam-se do mesoderma no 13º dia do desenvolvimento do embrião e apresentam uma combinação da maioria dos marcadores de células-tronco MSCs e ESCs durante o cultivo celular nas primeiras passagens, mas mantêm a característica de multipotência (GAO et al., 2015). Tal característica contribuiu para a observação do potencial de diferenciação em cardiomiócitos que as WJ-MSCs apresentam, tanto in vitro quanto in vivo. Além disso, essas células não levantam questões éticas, apresentam plasticidade multipotente, e são imunoprivilegiadas (GAO et al., 2015). Diante de todas essas características, o objetivo deste estudo foi investigar a segurança e eficácia da transferência de WJ-MSCs humanas via intracoronariana em pacientes com infarto agudo do miocárdio (NAVY GENERAL HOSPITAL, 2011). O estudo teve início em fevereiro de 2011 e término em julho de 2012, e os resultados foram publicados na revista BMC Medicine Medical Journal. Durante o acompanhamento de 18 meses, dois grupos foram avaliados. O primeiro recebeu tratamento com as WJ-MSCs e o segundo recebeu placebo. As taxas de efeitos adversos e testes laboratoriais, incluindo índices tumorais, imunológicos e hematológicos, não foram diferentes entre os dois grupos, mostrando segurança do método empregado com Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 26 WJ-MSCs. Além disso, a infusão intracoronariana de WJ-MSCs apresentou-se eficaz em pacientes com infarto agudo do miocárdio, fornecendo terapia clinicamente relevante dentro de uma janela de tempo favorável (GAO et al., 2015). Os resultados apresentados mostram que a infusão de WJ-MSCs é relativamente segura por pelo menos até 18 meses. Este estudo, portanto, incentiva ensaios clínicos adicionais para determinar se WJ-MSCs podem servir como uma nova alternativa para terapia baseada em células-tronco voltada para doenças cardíacas (GAO et al., 2015). 1.1.4 MSCs derivadas do tecido do cordão umbilical (UC) versus placebo para tratar a inflamação pulmonar aguda devido à COVID-19 A doença do coronavírus 2019 (COVID-19) é uma doença altamente transmissível na comunidade. A principal causa clínica que leva à morte é a tempestade de citocinas no pulmão que leva à inflamação exacerbada e à síndrome respiratória aguda grave. De acordo com estudos experimentais, as MSCs podem reduzir significativamente a inflamação pulmonar e o comprometimento patológico de diferentes tipos de lesão pulmonar. O objetivo deste estudo é demonstrar a segurança e potencial eficácia de células-tronco mesenquimais derivadas de tecido do cordão umbilical (UC-MSCs) administradas por via intravenosa em pacientes com inflamação pulmonar aguda causada pela COVID-19 com sintomas moderadamente graves. O estudo foi cadastrado na plataforma ClinicalTrials.gov, porém ainda não se iniciou o recrutamento. Estima-se que o estudo inicie em setembro de 2021 e termine em junho de 2024 (HARE, 2020). 1.1.5 Avaliação da segurança e eficácia de MSCs alogênicas (AC607) para o tratamento de lesão renal em pacientes de cirurgia cardíaca A lesão renal aguda é uma das principais complicações da cirurgia cardíaca, por isso alguns estudos pré-clínicos testaram a aplicação de BM-MSCs em pacientes com esse tipo de lesão e observaram efeitos benéficos (SWAMINATHAN et al., 2018). Diante desses dados, o presente estudo teve como objetivo avaliar a segurança e eficácia da aplicação de MSCs alogênicas (AC607) em paciente de cirurgia cardíaca com lesão renal aguda pós-operatória precoce (INC., 2014). O estudo teve início em maio de 2012 e término em agosto de 2014. Esperava-se que os pacientes que receberam esse tratamento tivessem um aumento na recuperação funcional renal após cirurgia cardíaca, porém não houve diferença no tempo de recuperação renal, na taxa de diálise, na mortalidade em 30 dias ou nos eventos adversos (SWAMINATHAN et al., 2018). Esses resultados contrastam com aqueles apresentados pelos estudos pré-clínicos e levantam questões relacionadas à sua utilidade clínica quanto a recuperação da lesão renal aguda no contexto de cirurgia cardíaca. Embora a maioria dos estudos indiquem resultados promissores, é imprescindível que todos os testes sejam realizados, com todos os parâmetros bem definidos para que a segurança, eficácia e viabilidade da proposta terapêutica sejam garantidos. Esse último estudo é um indicativo de que, para a lesão renal após cirurgia cardíaca, a terapia celular com MSCs talvez não seja a melhor alternativa, contribuindo para que novas abordagens sejam elaboradas e apresentem melhores resultados. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 27 2 POTENCIAL DOS EXOSSOMOS NA SAÚDE Os exossomos representam vesículas promissoras como sistemas de liberação de biomoléculas, conforme demonstrado anteriormente. Em estudos pré-clínicos, os exossomos se mostraram seguros e passíveis de escalonamento, como potencial farmacêutico (MENDT; REZVANI; SHPALL, 2019). Existem atualmente diversos ensaios clínicos avaliando a aplicação de exossomos derivados de MSCs, bem como analisando seu uso para “delivery” de fármacos, relatados no ClinicalTrials.gov. A seguir serão abordados alguns estudos clínicos envolvendo exossomos. 2.1 APLICAÇÃO CLÍNICA O Quadro 3 traz as informações resumidas dos ensaios clínicos atuais envolvendo a aplicação de exossomos como terapêuticos, além de sua potencial atuação como biomarcadores para fins de diagnóstico de doenças. Todos os estudos citados são descritos em maiores detalhes em seguida. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 28 Quadro 3 - Estudos Clínicos envolvendo exossomos. Título do Estudo Doença Estratégia Fase NCT* iExossomos no tratamento de pacientes com câncer de pâncreas metastático com mutação KrasG12D Câncer metastático pancreático com mutação KrasG12D iExossomos Fase 1 NCT03608631 Papel de microRNAs no diagnóstico de pré-eclâmpsia Pré-eclâmpsia Identificar a expressão de miRNAs 136, 494 e 495 em exossomos Finalizado NCT03562715 Estudo clínico piloto sobre inalação de exossomos de MSCs no tratamento de pneumonia grave por coronavírus COVID-19 Exossomos derivados de MSCs Fase 1 NCT04276987 Avaliação de Segurança e Eficácia de MSC-Exos de tecido Adiposo Alogênico em Pacientes com Doença de Alzheimer Doença de Alzheimer Exossomos derivados da AD-MSCs alogênicas Fase 1 e 2 NCT04388982 * Número de Identificação do ensaio clínico no banco de dados ClinicalTrials.gov Fonte: Adaptado de ClinicalTrials.gov. Acesso em: 24 abr. 2021. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 29 Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 2.1.1 iExossomos no tratamento de pacientes com câncer de pâncreas metastático com mutação KrasG12D O câncer de pâncreas mais comum é do tipo adenocarcinoma e pelo fato de ser de difícil detecção e ter comportamento agressivo, apresenta alta taxa de mortalidade, por conta do diagnóstico tardio (INCA, 2021). Mutações na GTPase KRAS com consequente ativação oncogênica são comumente encontradas em adenocarcinoma ductal pancreático, mas o silenciamento do gene oncogênico KRAS por manipulação genética in vivo tem inibido a progressão tumoral (KAMERKAR et al., 2017). As terapias a partir de RNAs de interferência (siRNA) vêm sendo aplicadas in vitro e in vivo, porém ainda são um desafio quanto ao uso de transportadores eficientes para aplicação clínica. Visto isso, este estudo de fase I pretende utilizar exossomos derivados de MSCs contendo siRNA KrasG12D (iExossomos), capazes de agir no gene oncogênico de interesse (ANDERSON, 2018). Os dois principais objetivos do estudo são determinar a dose máxima tolerada dos iExossomos e a toxicidade dose-limitante. É o estudo mais recente envolvendo exossomos, com início em janeiro de 2021, com previsão de término em março de 2022, e atualmente está na fase de recrutamento. 2.1.2 Papel de microRNAs no diagnóstico de pré-eclâmpsia A pré-eclâmpsia (PE) é uma das complicações mais ameaçadoras da gravidez. Até o momento atual, nenhuma terapia segura e eficaz, nem biomarcadores assertivos para a descoberta precoce da PE foram alcançados. Diversos estudos têm mostrado expressões alteradas de miRNAs em pacientes com PE na gravidez. Um deles demonstra que células MSCs de placenta de pacientes com PE apresentaram elevada expressão de miRNA-136, miRNA-494 e miRNA-495, associando-os a um ambiente favorável para a doença (LV et al., 2019). Diante dos dados observados, o objetivo do estudo foi identificar a expressão gênica dos miRNAs descritos acima em exossomos presentes no sangue periférico em comparação com aqueles presentes no meio condicionado das UC-MSCs em pacientes com PE, como marcadores valiosos para o prognóstico precoce de PE (MAURICE, 2018). O estudo teve início em novembro de 2016 e término em dezembro de 2017, e os resultados foram publicados na revista Archives of Biochemistry and Biophysics. Observou-se no estudo que pacientes com PE apresentaram níveis significativos de superexpressão dos miRNA-136, miRNA-494 e miRNA-495 em exossomos, tanto do sangue periférico quanto das UC-MSCs, em comparação com gestações normais. Nos exossomos presentes no sangue periférico de pacientes com PE, observou-se a superexpressão de 6.4 vezes do miRNA-136, 3.9 vezes do miRNA-494 e 2.1 vezes do miRNA-495. Já naqueles presentes nas UC-MSCs, observou-se a superexpressão de 3.25 vezes do miRNA-136, 5.3 vezes do miRNA-494 e 4.3 vezes do miRNA-495. A partir dos resultados apresentados, os autores sugerem que os miRNAs estudados podem ser usados como potenciais biomarcadores não invasivos para a detecção precoce de PE. Dessa forma, o trabalho indica que os exossomos podem ser utilizados não só como vesículas transportadoras, mas também como fonte de Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 30 Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde biomarcadores (MOTAWI et al., 2018). 2.1.3 Estudo clínico piloto sobre inalação de exossomos de MSCs no tratamento de pneumonia grave por corona vírus Conforme já mencionado anteriormente, a resposta imunológica exacerbada na infecção pelo SARS-CoV-2 representa uma característica da COVID-19 e pode levar à síndrome do desconforto respiratório agudo (SDRA). Esta provoca lesões pulmonares graves e consequentemente, pode levar à morte ou a uma longa reabilitação após a alta hospitalar (RUIJIN HOSPITAL, 2020a). De acordo com estudos experimentais, as células-tronco mesenquimais podem reduzir significativamente a inflamação pulmonar e o comprometimento patológico de diferentes tipos de lesão pulmonar. Espera-se, portanto, que os exossomos derivados de MSCs, quando inalados, tenham o mesmo efeito terapêutico sobre a pneumonia, reduzindo a inflamação e os danos ao tecido pulmonar e estimulando os processos regenerativos. Sendo assim, o objetivo deste estudo piloto foi explorar a segurança e eficiência da inalação de aerossol com exossomos derivados de AD-MSCs alogênicas em pacientes graves com pneumonia pelo novo coronavírus (RUIJIN HOSPITAL, 2020a). O estudo teve início em fevereiro de 2020 e término em julho de 2020. Os resultados foram submetidos na plataforma do ClinicalTrials.gov, porém não estão disponíveis para acesso. Embora não seja possível acessar os resultados até o presente momento, o trabalho vem apresentar alternativas de aplicação dos exossomos como estratégias terapêuticas, não só para doenças degenerativas por si só, mas também doenças infecciosas que podem levar a quadros de degeneração tecidual. Ou seja, existe um grande potencial de aplicação de exossomos na área médica, mas todas as propostas devem ser testadas previamente para garantir a segurança, eficácia e viabilidade. 2.1.4 Avaliação de Segurança e Eficácia de MSC-Exos de Tecido Adiposo Alogênico em Pacientes com Doença de Alzheimer Até o momento, não existem tratamentos eficazes para prevenir, conter ou reverter a doença de Alzheimer. Os exossomos derivados de MSCs estão envolvidos na comunicação célula-célula, sinalização celular, modulação do metabolismo a curtas ou longas distâncias no corpo, e podem influenciar as respostas teciduais a lesões, infecções e doenças degenerativas. O objetivo deste ensaio clínico é explorar a segurança e a eficácia dos exossomos derivados de AD-MCSs alogênicas no tratamento de demência leve a moderada devido à Doença de Alzheimer. O estudo teve início em julho de 2020 e tem previsão de término em abril de 2022. Atualmente o estudo ainda está no status de recrutamento de acordo com o ClinicalTrials.gov (RUIJIN HOSPITAL, 2020b). Embora ainda esteja na fase inicial, o estudo representa mais uma vertente que se abre para a aplicação terapêutica dos exossomos, trazendo esperança para doenças que, até então, não têm tratamento efetivo, como a própria doença de Alzheimer. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 31 Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Aplicabilidade das MSCs e exossomos na saúde 3 ESTUDOS CLÍNICOS E CONSIDERAÇÕES As MSCs e seus exossomos apresentam a capacidade de estimular a restauração da homeostase tecidual e permitem que as células dentro do tecido se recuperem, reparem e regenerem. Ambos possuem ação Imunomodulatória, angiogênica e anti- inflamatória, com grande potencial regenerativo do tecido lesionado (SQUILLARO; PELUSO; GALDERISI, 2016; YIN; WANG; ZHAO, 2019). Até o momento, descobertas pré-clínicas sobre a aplicação de MSCs e exossomos derivados de MSCs destacam o benefício de usá-los como tratamento em um amplo espectro de doenças e lesões. Existem numerosos estudos que investigam a eficiência das MSCs (terapia celular) e dos exossomos de MSC em testes clínicos. Quanto aos exossomos, eles ainda são encontrados em todos os fluidos biológicos e são secretados por diversos, senão todos os tipos celulares, tornando-se atraentes como alvos de biópsias líquidas, minimamente invasivas com o potencial para diagnóstico de diferentes doenças (KALLURI; LEBLEU, 2020). Embora a maioria dos ensaios clínicos esteja nas fases de recrutamento e ativa, alguns deles foram concluídos e seus resultados são aguardados com grande expectativa pela comunidade médico-científica. Ainda assim, um dos desafios que permanece é desvendar os mecanismos exatos de ação in vivo por trás das terapias com MSCs ou exossomos derivados de MSCs, como também sua biodistribuição, farmacocinética e farmacodinâmica (OH; CHOO, 2011; YIN; WANG; ZHAO, 2019). Outro desafio tão importante quanto é definir padrões e diretrizes quanto à pureza do produto administrado, dose ideal administrada, níveis de contaminação aceitáveis, controle de qualidade dos MSCs/exossomos isolados, armazenamento e preservação do produto, entre outros. A partir de novos dados adquiridos de estudos com foco nesses desafios, será possível desenvolver soluções médicas mais estratégicas (NIKFARJAM et al., 2020). Diante das potencialidades dos exossomos e das vantagens como armazenamento e segurança, do ponto de vista mutagênico, a implementação de bioprocessos voltados à produção dos exossomos é mais interessante para aplicação clínica do que as MSCs. Por isso, vamos abordar essa questão mais a fundo a seguir. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Bioprocessos para produção de exossomos derivados de MSCs 32 1 BIOPROCESSOS Uma das vertentes dentro da área da biotecnologia é o foco na produção em escala industrial, representada pelos bioprocessos, voltados a produzir moléculas e bioprodutos sintetizados por microrganismos e células animais, humanas e vegetais a um preço economicamente viável. Essa área engloba diversos conhecimentos distintos de diferentes áreas, sendo elas: física, química, bioquímica, biologia, engenharia, programação, entre outros (THOMS, 2021). O desenvolvimento de um novo bioproduto é classificado em 3 fases de processos: upstream, harvest (coleta do bioproduto) e downstream. Cada fase é caracterizada por suas respectivas operações unitárias (etapas individuais dos processos) (THOMS, 2021). A fase de upstream corresponde à preparação das matérias- primas, à cultura celular ou microbiológica em biorreator e à fabricação do produto de interesse. Já a fase de harvest corresponde ao processo de coleta do produto. E, por fim, a fase de dowsntream caracteriza-se por processos de purificação e processamento do produto, controle de qualidade e envase (LNBR, 2021; THOMS, 2021). Atualmente a produção de exossomos é realizada em escala laboratorial (nível bancada), com a finalidade de desenvolver pesquisas que sirvam como embasamento para aplicação futura do produto em questão. Nesse contexto, a produção de exossomos derivados de MSCs se baseia no cultivo e proliferação dessas células em garrafas ou placas específicas para o cultivo de células aderentes, durante o qual pode ser adicionado ao meio de cultura o soro fetal bovino (opcional), como um suplemento para otimizar o crescimento celular. Essas culturas são mantidas por um determinado número de horas ou dias, enquanto secretam exossomos. O meio de cultura, agora condicionado às MSCs, é coletado, decantado e processado. Na etapa de processamento, o produto intermediário passa por fases de isolamento, concentração, caracterização e purificação até a obtenção do produto final, ou seja, os exossomos purificados (WHITFORD; GUTERSTAM, 2019). Com o intuito de desenvolver uma plataforma economicamente viável para a produção em larga escala de exossomos, é essencial compreender as principais estratégias de processos, aplicados e em desenvolvimento, associados às Boas Práticas de Fabricação (BPF) nas fases de upstream e downstream para elaboração de um bioprocessos escalonável. 1.1 PROCESSOS UPSTREAM A fase de upstream envolve todas as etapas que antecedem a produção do material de interesse, Capítulo 4 BIOPROCESSOS PARA PRODUÇÃO DE EXOSSOMOS DERIVADOS DE MSCS Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Bioprocessos para produção de exossomos derivados de MSCs 33 até mesmo a própria produção (síntese e liberação dos exossomos no meio de cultura), englobando desde o preparo de matéria-prima e esterilização até a produção efetiva do produto. No caso da produção de exossomos, são necessários processos que aumentem as capacidades de produção das vesículas como também de cultivo das MSCs, além de definir a melhor plataforma de produção para os exossomos. A seguir, serão abordadas as principais estratégias aplicadas para superar os desafios dessa fase. 1.1.1 Estratégias para aumentar a produção de exossomos A primeira etapa para escalonar a produção de exossomos é o aumento na taxa de produção dessas vesículas pela célula cultivada. Alguns estudos têm mostrado que o meio condicionado pelas MSCs apresenta baixa taxa de exossomos, o que dificulta o escalonamento da produção. Buscando alternativas para intensificar a produção, novas propostas têm surgido. A primeira consiste na manipulação genética de rotas metabólicas. A partir dela é possível gerar biofábricas (células geneticamente modificadas) direcionadas à produção de uma molécula de interesse, tornando os microrganismos/células eficientes e capazes de apenas se desenvolver em um ambiente projetado, específico e controlado (THOMS, 2021). A manipulação genética, através da superexpressão ou sub-expressão induzida de genes-chave, por exemplo, pode induzir a alteração de diferentes processos celulares, o que pode resultar na intensificação de processos de biogênese, vias de reciclagem, ou até mesmo vias de secreção dos exossomos (Figura 13) (JAFARI et al., 2020). Tudo isso contribuindo para melhorar a fabricação do produto de interesse diretamente a partir da manipulação celular. Uma das estratégias estudadas nesse contexto é a manipulação genética do gene MYC em células-tronco mesenquimais, imortalizando a linhagem celular, o que mantém o desenvolvimento da cultura celular e a produção contínua de exossomos (CHEN et al., 2011). A segunda estratégia, que também pode contribuir para aumentar a produção, corresponde à manipulação de diferentes estímulos ambientais, sejam os níveis de oxigênio e pH, ou a própria composição do meio de cultura. Essas variáveis, quando controladas e manipuladas, podem promover o aumento da produção dos exossomos (Figura 13) (JAFARI et al., 2020). Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Bioprocessos para produção de exossomos derivados de MSCs 34 Figura 13: Técnicas para intensificar a produção de exossomos Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. Outro ponto importante é a definição do meio de cultura a ser utilizado. Atualmente dois meios estão sendo discutidos pelos pesquisadores, visando o escalonamento da produção de exossomos. O meio tradicionalmente utilizado é, em geral, enriquecido com soro fetal bovino – FBS (do inglês, fetal bovine serum), um aditivo rico em fatores de crescimento capazes de melhorar o cultivo celular. Porém, o FBS contém grande quantidade de exossomos endógenos, os quais devem ser removidos antes de seu acréscimo à cultura celular (SHELKE et al., 2014). Caso não sejam eliminados, essas “impurezas” podem estar presentes no produto final, dificultando a aplicação de processos de purificação que isolem apenas exossomos produzidos pelas células de interesse. Por essa razão, estão sendo adotados meios de cultura sem FBS (xeno-free), desde que conservem as características celulares e exossomais desejáveis para aplicação terapêutica (COLAO et al., 2018). Alguns testes vêm sendo realizados em relação ao efeito desses dois meios de cultivo na produção de exossomos por linhagens celulares. Analisando linhagens de neuroblastoma, observou-se que a produção de exossomos se mantém inalterada em ambos os meios em termos de características biofísicas e tamanho (LI et al., 2015). Porém, através de análises proteômicas, verificou-se que os exossomos derivados do meio xeno-free podem apresentar diferenças de alguns componentes em comparação com aqueles provenientes do cultivo com FBS (LI et al., 2015). Torna-se, portanto, necessário que novos estudos sejam realizados para encontrar as condições ideais de produção de exossomos, considerando a manipulação metabólica das células de origem, parâmetros de cultivo e componentes do meio. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Bioprocessos para produção de exossomos derivados de MSCs 35 1.1.2 Estratégias de produção em larga escala de exossomos As estratégias atuais de cultivo celular dependem da característica plástico aderente das MSCs, sendo assim, prioriza-se o desenvolvimento de plataformas que maximizem a área de superfície de cultura, podendo elas serem sistemas estáticos ou dinâmicos. O sistema estático corresponde à proliferação de MSCs em frascos do tipo T225, de superfície plana, enquanto o sistema dinâmico corresponde ao uso de biorreatores (COLAO et al., 2018). Neste tópico serão abordados alguns dos biorreatores promissores focados na produção de exossomos derivados de MSCs, sendo eles: biorreator de perfusão de fibra oca e biorreatores agitados com microtransportadores (CHEN et al., 2020b; WHITFORD; GUTERSTAM, 2019). Vale ressaltar, que independentemente da estratégia escolhida é necessário controlar a proliferação celular e os parâmetros de produção, de forma que as características fenotípicas e a produção de exossomos se mantenham constantes durante o processo de produção em larga escala. O biorreator de perfusão de fibra oca (do inglês, hollow fiber bioreactor) é um sistema de cultura celular tridimensional de perfusão contínua (Figura 14). Esse biorreator consiste em um cartucho contendo milhares de fibras ocas semipermeáveis dentro de um equipamento tubular com válvulas de entrada e saída. As fibras são dispostas em paralelo no equipamento e seladas em cada extremidade do cartucho para que o líquido inserido em uma extremidade flua necessariamente no interior das fibras. As células geralmente são cultivadas no espaço entre o envoltório do equipamento e as fibras (espaço extra-capilar); o meio de cultivo circula dentro das fibras ocas, sendo que as paredes semipermeáveis das fibras permitem a passagem de nutrientes, gases e produtos residuais, com consequente troca entre o meio e as células. Após a circulação do meio pelo cartucho, a bomba de troca gasosa induz sua oxigenação, e em seguida o meio oxigenado entra em circulação novamente (FIBER CELL SYSTEMS, 2018; GERLACH et al., 2012). Esse sistema de cultivo amplia a área superficial de adesão celular suportando grande número de células. Em um estudo de caso de produção contínua de exossomos derivados de HEK-293 em biorreator de fibra oca por 4 meses, com 3 coletas semanais de 20 mL cada, observou-se produção equivalente à obtida por 70 frascos T225. Sendo assim, o biorreator fornece um sistema otimizado para a produção de exossomos, comparado ao sistema estático utilizado a nível de bancada (WHITFORD; GUTERSTAM, 2019). Outro benefício dessa estratégia é a aplicação de FBS sem que haja contaminação do produto desejado por exossomos do soro. A fibra permite a passagem de fatores e nutrientes séricos que promovem o crescimento celular, porém retém os exossomos endógenos do soro no interior das fibras, evitando possível contaminação e processos de purificação mais elaborados (FIBER CELL SYSTEMS, 2018; WHITFORD; GUTERSTAM, 2019). Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Bioprocessos para produção de exossomos derivados de MSCs 36 Figura 14: Biorreator de perfusão de fibra oca Biorreator de perfusão de fibra oca. A: visão do corte transversal do biorreator; B: visão do corte longitudinal do biorreator; C: imagem ilustrativa modificada de FiberCell System1, com detalhes do biorreator e seus componentes. Fonte: Compilação do próprio autor1. Ilustração A e B: Flávia Luísa Dias-Audibert. Além do biorreator de fibra oca, outra estratégia para cultivo de MSCs baseia- se em biorreatores com microtransportadores (do inglês, Microcarries), os quais consistem em esferas de 100 – 300 mícrons usados como suporte para cultura de células aderentes em suspensão. Essas esferas podem ser produzidas a partir de polímeros sintéticos ou naturais e funcionam da seguinte forma: as células são imobilizadas em sua superfície e cultivadas em suspensão no meio de cultura sob agitação em biorreatores (CHEN et al., 2020a). Existem duas opções de biorreatores para esse tipo de cultivo celular, o biorreator de tanque agitado e o biorreator vertical com tecnologia de roda. O primeiro, de tanque agitado, representa um sistema dinâmico comumente utilizado para expansão escalonável de células-tronco mesenquimais; é capaz de promover homogeneização do meio de cultivo e das células aderidas aos microtransportadores por meio da agitação aplicada (Figura 15). Porém, devido a sua configuração, podem ocorrer altas taxas de cisalhamento 1 Montagem a partir da imagem coletada no canal da empresa Fiber Cell System In. via youtube.com. Disponível em: < https://www.youtube.com/watch?v=pi7LFH8m4XE>. Acesso em: 10 maio. 2021. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Bioprocessos para produção de exossomos derivados de MSCs 37 prejudiciais, o que dificulta o crescimento celular e gera impactos negativos na fisiologia celular (DE ALMEIDA FUZETA et al., 2020; PINTO et al., 2019). Figura 15: Biorreatores para Cultivo de Células Aderentes em Microtransportadores Fonte: Próprio autor. Ilustração: Flávia Luísa Dias-Audibert. Visando minimizar os problemas advindos do uso de biorreatores de tanque agitado, novos sistemas estão sendo desenvolvidos, dentre eles o biorreator vertical com tecnologia de roda (do inglês, Vertical-Wheel bioreactor) (Figura 15). Neste sistema, uma roda é disposta verticalmente no biorreator, a qual promove fluxos radial e axial, resultando em um fluxo final do meio de cultivo mais homogêneo com mínimos efeitos de cisalhamento, quando comparado ao biorreator de tanque agitado. Além do menor impacto sobre as células, a possibilidade de escalonar a produção para volumes industriais (100 mL – 500 L) representa um dos principais benefícios deste tipo de biorreator (DE ALMEIDA FUZETA et al., 2020). Recentemente, esse mesmo sistema de biorreator vertical com tecnologia de roda foi aplicado com sucesso para avaliar a proliferação de MSCs em estudo desenvolvido por De Souza Pinto, em 2019. O objetivo do estudo foi estabelecer um sistema de cultura de baixo custo para a produção de UC-MSCs e AD-MSCs utilizando o biorreator vertical de 100 mL durante 7 dias. Observou-se um aumento da expansão celular de 13 e 5.3 vezes, respectivamente (PINTO et al., 2019). Além deste, outro estudo realizado pelos mesmos autores avaliou a produção de EVs por MSCs utilizando o mesmo sistema de biorreator (100 mL) comparado ao sistema estático (frasco T225). A proliferação celular no biorreator apresentou um aumento de 5.7 ± 0.9 vezes na concentração de EVs no meio condicionado e 3.0 ± 0.5 vezes na produtividade das EVs, o que significa maior concentração celular no biorreator e maior secreção EVs por cada célula. De acordo com os autores, essa produção pode ser escalonada para sistemas de 3 L até 500 L (DE ALMEIDA FUZETA et al., 2020). Diante dos resultados observados, os dois sistemas de biorreatores, tanto de fibra oca quanto vertical com tecnologia de roda intensificam a produção, o primeiro para produção a nível de bancada, e o segundo para nível industrial. Sendo assim, representam estratégias interessantes disponíveis para escalonamento da produção e, no futuro, disponibilização de exossomos para aplicação clínica. Células tronco mesenquimais e exossomos: origem, aplicação e desafios - Bioprocessos para pr