UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” FACULDADE DE MEDICINA Priscila Portugal dos Santos Influência da Suplementação da Ração com diferentes Doses de Vitamina D sobre a Proteína de Interação com a Tiorredoxina (TXNIP) no Coração e suas Vias de Sinalização Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientador: Prof. Titular Sergio Alberto Rupp de Paiva Coorientador: Prof. Adjunto Leonardo Antonio Mamede Zornoff Botucatu 2015 Priscila Portugal dos Santos Influência da Suplementação da Ração com diferentes Doses de Vitamina D sobre a Proteína de Interação com a Tiorredoxina (TXNIP) no Coração e suas Vias de Sinalização Tese apresentada à Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Câmpus de Botucatu, para obtenção do título de Doutora em Fisiopatologia em Clínica Médica. Orientador: Prof. Titular Sergio Alberto Rupp de Paiva Coorientador: Prof. Adjunto Leonardo Antonio Mamede Zornoff Botucatu 2015 Dedico este trabalho às pessoas mais importantes da minha vida, Aos meus pais Cássia e Osvaldo Por toda minha formação. Obrigada por terem me incentivado seguir este caminho e nunca desistir. Amor eterno! Aos meus irmãos Lucas e Carolina Por toda amizade carinho e apoio! Ao Ricardo Que faz com que meus dias sejam como sempre sonhei e a quem agradeço todo carinho e incentivo! Ao meu filho Tão amado e ansiosamente aguardado! A Deus, por minha vida, pela saúde, oportunidades e pelo convívio com pessoas sensacionais! Ao meu orientador Dr. Sergio Alberto Rupp de Paiva, pela oportunidade, pelo conhecimento e pelos preciosos ensinamentos, incentivo, carinho e por nunca deixar de acreditar que tudo iria dar certo. Ao meu co-orientador Dr. Leonardo Antônio Mamede Zornoff e aos professores do grupo de pesquisa Paula, Marcos, Bertha e Meliza pela disponibilidade, ensinamentos e pelas oportunidades que sempre me deram. À professora Dra. Ana Angélica por todo conhecimento, paciência e exemplo profissional. Às amigas de jornada Andréa, Bruna e Vanessa, que compartilharam das mesmas dificuldades e expectativas. Ao administrador do laboratório experimental José Carlos Georgete, e aos técnicos Mário, De Lalla,e José Aparecido, por toda ajuda e colaboração neste trabalho. À Jacira, Rafael, Juninho e Felipe por terem me acolhido como parte da família. Aos amigos do laboratório Adriana, Aline, Amanda, Ana Carolina, Camila Bonomo, Bruna, Camila Rosa, Danielle, Diego, Dijon, Fernanda, Loreta, Luana, Maria Tereza, Mariana, Miriane, Pamela, Paula, Paulinha e Regiane, Renan, Renata por todos os momentos juntos. À professora Dra. Rita de Cassia Tostes e aos alunos Thiago, Marcondes e Stêfany pela oportunidade de trabalharmos juntos e por toda colaboração. Ao Dr. Rodrigo Gibin por toda disponibilidade e contribuição. À todos os funcionário do Laboratório Experimental: Ângelo, Bardela, Camila, Cris, Danilinho, Diego, Eduardo, Elenize, Elisete, Fátima, Florian, Igor, Lucas, Márcia, Marta, Mara, Paula, Regina, Renata, Rogério, Sueli e Vitor por toda ajuda e amizade. A todos os funcionários do Departamento de Clínica Médica: Alexandre Luís Loureiro, Ana Maria Mengue, Bruno José Fajiolli, Elisangela Aparecida da Silva, Laura Andrade Câmara, Mario Augusto Dallaqua e Renato Borges Pereira, pela atenção e disponibilidade em todo auxílio requisitado. A todos os funcionários da Secretaria de Pós-Graduação: Andréa Paula Longo Devidé, Janete Aparecida Herculano Nunes Silva, Lílian Cristina Nadal Bianchi Nunes, Nathanael Pinheiro Salles e Regina Célia Spadin pela atenção e por todo auxílio. Aos Professores: Dr. Katashi Okoshi, Dra. Marina Politi Okoshi, Dr. Luiz Shiguero, Dra. Beatriz Bojikian Matsubara, Dr. Luis Cuadrado Martin e Dr. Antônio Carlos Cicogna pela colaboração profissional. Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico pelo suporte financeiro, viabilizando o desenvolvimento deste trabalho. A todas as pessoas que fizeram parte da minha vida, contribuindo para minha formação profissional e pessoal. Muito Obrigada! “ Triste não é mudar de ideia. Triste é não ter ideias para mudar”. Francis Bacon Resumo SANTOS, P. P. Influência da Suplementação da Ração com diferentes Doses de Vitamina D sobre a Proteína de Interação com a Tiorredoxina (TXNIP) no Coração e suas Vias de Sinalização. 2015. 108 f. Tese (Doutorado) – Faculdade de Medicina de Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2015. A deficiência de vitamina D (VitD) tem aumentado nos últimos anos, tornando-se um problema de saúde pública. Adicionalmente, a deficiência de VitD está associada com o aumento do risco de desenvolvimento de várias doenças crônicas, inclusive cardiovasculares. Esses fatores têm incentivado o uso indiscriminado dessa vitamina, sem conhecer ao certo as alterações decorrentes da suplementação de diferentes doses. Estudos têm mostrado que a VitD é importante para o desenvolvimento e funcionamento cardíaco, entretanto pode ter efeito cardiovascular prejudicial, mesmo em doses consideradas não tóxicas. A VitD atua nas células alvo ligando-se ao receptor de VitD (VDR). Adicionalmente, foi identificada a Proteína de Interação com a Tiorredoxina (TXNIP) cuja expressão é regulada positivamente pela VitD. Esta proteína participa da regulação de várias vias de sinalização celular (balanço redox, apoptose, inflamação, crescimento celular, metabolismo energético) que podem ser importantes para o processo de remodelação cardíaca. O objetivo deste estudo foi avaliar se suplementação em excesso, mas em doses não tóxicas, de VitD na ração por 2 meses resulta em alteração da expressão protéica TXNIP, remodelação cardíaca com aparecimento de estresse oxidativo, apoptose e alterações de mediadores inflamatórios e metabolismo energético, e se com o aumento do tempo de suplementação de VitD (por 4 meses) ocorre alterações na morfologia e função do coração. Para isso, foram realizados o Experimento 1: utilizados 64 ratos machos, alocados em 3 grupos - Controle (C, n=21) recebeu ração padrão; VD3 (n=22) e VD10 (n=21) receberam 3.000 e 10.000 UI de colecalciferol/kg de ração respectivamente, por 2 meses; e o Experimento 2: utilizados 46 ratos machos, alocados em 3 grupos: Controle (C-4, n=14) recebeu ração padrão; VD3-4 (n=16) e VD10-4 (n=14) receberam 3.000 e 10.000 UI de colecalciferol/kg de ração respectivamente, por 4 meses . Após 2 e 4 meses foi realizado o estudo ecocardiográfico e posteriormente os animais foram eutanasiados. O soro e o ventrículo esquerdo dos animais de 2 meses foram utilizados para análises bioquímicas. Para análise estatística foi realizado ANOVA de 1 via e pós teste de Tukey ou Kruskal Wallis e pós teste de Dunn. Para avaliar a resposta dose dependente foi utilizado teste de tendência. Para o experimento 1 a expressão protéica da TXNIP foi maior no grupo VD10 comparado ao C e seu aumento foi dose dependente, por outro lado a atividade da tiorredoxina foi menor no grupo VD10 comparado ao C, sendo sua diminuição dose dependente. Os animais suplementados com colecalciferol apresentaram aumento do estresse oxidativo, caracterizado pela diminuição da atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase e da glutationa peroxidase e aumento do hidroperóxido de lipídio. As alterações observadas para os marcadores de estresse oxidativo foram dose dependente. No entanto, não houve alteração na expressão protéica do fator nuclear eritróide-2 nem das enzimas reguladas por ele, glutationa peroxidase-1 e heme oxigenase-1. Para os marcadores de apoptose, houve aumento da expressão protéica caspase-3-clivada no grupo VD10 comparado ao VD3 e diminuição da expressão protéica da Bcl- 2 no grupo VD10 comparado ao C. A diminuição da Bcl-2 foi dose dependente. Os mediadores inflamatórios fator de necrose tumoral-α, interferon-γ, interleucina-10 e molécula de adesão intercelular-1 foram maiores no grupo VD10 comparado ao C. O aumento dos mediadores inflamatórios foi dose dependente. Com relação ao metabolismo energético cardíaco houve diminuição da β-oxidação de ácidos graxos, do ciclo do citrato e da cadeia respiratória mitocondrial. Por outro lado, houve aumento da via glicolítica e do metabolismo anaeróbio. Apesar de todas essas alterações metabólicas e moleculares, não houve mudança na morfologia, nem disfunção cardíaca, avaliada pelo ecocardiograma, nos animais suplementados por 2 meses. Entretanto, com o aumento do tempo de suplementação (suplementação de colecalciferol por 4 meses), houve hipertrofia cardíaca com aumento da espessura da parede posterior e da espessura relativa da parede posterior, de maneira dose dependente, e disfunção diastólica caracterizada por aumento dose dependente do diâmetro e do volume do átrio esquerdo, além de alteração do tempo de desaceleração da onda E. Além das alterações do lado esquerdo do coração, os animais suplementados com colecalciferol, apresentaram hipertrofia e disfunção do ventrículo direito. Assim, podemos concluir que a suplementação de VitD leva à remodelação cardíaca com aparecimento de estresse oxidativo, diminuição de marcadores anti-apoptóticos, aumento de mediadores inflamatórios e alteração do metabolismo energéticos cardíaco e que, com o aumento do tempo de suplementação, ocorre hipertrofia cardíaca e disfunção diastólica. As mudanças observadas nas proteínas TXNIP e Trx podem ser o mecanismo envolvido nessas alterações. Palavras-chave:vitamina D; proteína de interação com a tiorredoxina; remodelação cardíaca; estresse oxidativo; rato. Abstract SANTOS, P. P. Influence of Chow Supplementation with Different Vitamin D Doses on the Thioredoxin-interacting protein (TXNIP) in the heart and its signaling pathways. 2015. 108 f. Thesis (Doctoral) – Faculty of Medicine of Botucatu, Universidade Estadual Paulista, Botucatu, 2015. Vitamin D (VitD) deficiency has increased in recent years, becoming a public health problem. Additionally, VitD deficiency is associated with increased risk of chronic diseases developing, including cardiovascular diseases. These factors have encouraged the widespread use of this vitamin, without knowing well the alterations of different supplementation doses. Studies have shown that VitD is important for the cardiac development and function, however this vitamin can presented adverse cardiovascular effects, even at non-toxic doses. VitD acts in the target cells by binding to VitD receptor (VDR). Additionally, the thioredoxin-interacting protein (TXNIP) was identified and it expression is up-regulated by VitD. This protein acts in the regulation of signaling pathways (redox balance, apoptosis, inflammation, cell growth, metabolism energy) which can participate of the cardiac remodeling process. The aim of this study was to evaluate whether excess VitD supplementation, but in nontoxic doses, in the chow for 2 months results in change of TXNIP expression, cardiac remodeling with oxidative stress, apoptosis and alterations of inflammatory mediators and energy metabolism and whether, the supplementation increased time (for 4 months) leads to changes in cardiac structure and function. Experiment 1: 64 male rats was used and was divided into 3 groups - control (C, n = 21) received standard chow; VD3 (n = 22) and VD10 (n = 21) received 3,000 and 10,000 IU of cholecalciferol / kg of chow respectively, for 2 months; and Experiment 2: 46 male rats was used and was divided into 3 groups - control (C-4, n = 14) received standard chow; VD3-4 (n = 16) and VD10-4 (n = 14) received 3,000 and 10,000 IU of cholecalciferol / kg of chow respectively, for 4 months. After 2 and 4 months was performed echocardiography and after the animals were euthanized. The serum and the left ventricle of experiment 1 animals were used for biochemical analyzes. Statistical analysis was performed by one way ANOVA and Tukey post test or Kruskal-Wallis and Dunn post test. The dose dependent response was analyzed by trend test. For experiment 1 TXNIP protein expression was higher in VD10 group compared to the C and this increase was dose-dependent, on the other hand, the thioredoxin activity was lower in VD10 group compared to C. The thioredoxin activity decreased in dose-dependent manner. The animals supplemented with cholecalciferol showed increase of oxidative stress, characterized by decreased in antioxidants enzymes activity superoxide dismutase and glutathione peroxidase and increased lipid hydroperoxide. The changes observed for oxidative stress were dose-dependent. However, there was no change in the protein expression of nuclear factor-erythroid 2-related factor-2 (Nrf2) and of enzymes glutathione peroxidase 1 and heme oxygenase 1. For the apoptosis, was observed increase in the protein expression of cleaved caspase-3 in VD10 group compared to the VD3 group and was observed decrease in the protein expression of Bcl-2 in VD10 group compared to C. The decrease of Bcl-2 was dose-dependent. The inflammatory mediator tumor necrosis factor-α, interferon-γ, interleukin-10 and intercellular adhesion molecule-1 were higher in the VD10 group compared to C. The increase in the inflammatory mediators was dose- dependent. In relation to cardiac energy metabolism there was decreased the β-oxidation of fatty acids, citrate cycle and the mitochondrial respiratory chain. On the other hand, the glycolytic pathway and anaerobic metabolism was increased. Despite these metabolic and moleculars alterations, there was no change in the cardiac structure function, assessed by echocardiography, in the animals supplemented by two months. However, with supplementation increased time, (for 4 months), there was cardiac hypertrophy with dose-dependent increase in left ventricle wall thickness and relative wall thickness, and diastolic dysfunction characterized by increase of the diameter and volume of the left atrium, in dose-dependent manner, and E-wave deceleration time alteration. In addition to the changes in the left heart, animals supplemented with cholecalciferol, showed hypertrophy and dysfunction of the right ventricle. Thus, we concluded that Vit D supplementation leads to cardiac remodeling with oxidative stress, decreased anti-apoptotic factor, increased inflammatory mediators and cardiac energy metabolism alteration. The supplementation increased time resulted in cardiac hypertrophy and diastolic dysfunction. The changes observed in TXNIP and Trx proteins can be the mechanism involved in these changes. Keywords: vitamin D; thioredoxin-interacting protein; cardiac remodeling; oxidative stress; rat. Sumário 1. INTRODUÇÃO .................................................................................................................................. 20 2. HIPÓTESE .......................................................................................................................................... 24 3. OBJETIVOS ........................................................................................................................................ 26 4. MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................ 28 4.1 Delineamento Experimental .......................................................................................................... 28 4.2 Preparo das rações ........................................................................................................................... 28 4.3 Doses de vitamina D utilizadas ..................................................................................................... 29 4.4 Avaliação ecocardiográfica ............................................................................................................. 30 4.5 Coleta de material biológico........................................................................................................... 31 4.6 Determinação plasmática de 25 (OH) D3 .................................................................................... 31 4.7 Determinação sérica de Cálcio ...................................................................................................... 32 4.8 Determinação dos mediadores inflamatórios .............................................................................. 32 4.9 Determinação da atividade das enzimas do metabolismo energético e de marcadores do estresse oxidativo ................................................................................................................................... 33 4.10 Determinação da expressão protéica por Western Blot .......................................................... 35 4.11 Atividade de tiorredoxina e da tiorredoxina redutase .............................................................. 38 4.12 Análise estatística ........................................................................................................................... 39 5. RESULTADOS ................................................................................................................................... 41 5.1 Experimento 1 ................................................................................................................................. 41 5.1.1 Peso corporal, consumo diário de ração e de vitamina D, cálcio sérico e 25 (OH) D3 plasmático. .......................................................................................................................................... 41 5.1.2 Expressão protéica da TXNIP e da Trx e atividade da Trx e da TrxR. ........................... 45 5.1.3 Marcadores de estresse oxidativo. ......................................................................................... 50 5.1.4 Marcadores de apoptose e mediadores inflamatórios. ........................................................ 54 5.1.5 Metabolismo energético cardíaco .......................................................................................... 59 5.1.6 Variáveis ecocardiográficas de morfologia e função ........................................................... 65 5.1.7 Variáveis morfométricas ......................................................................................................... 68 5.2 Experimento 2 ................................................................................................................................. 70 5.2.1 Variáveis ecocardiográficas de morfologia e função do experimento 2 ......................... 70 5.2.2 Variáveis morfométricas ......................................................................................................... 79 6. DISCUSSÃO ........................................................................................................................................ 84 7. CONCLUSÕES .................................................................................................................................. 94 8. REFERÊNCIAS ................................................................................................................................. 96 Introdução 20 1. INTRODUÇÃO A vitamina D (VitD) é um composto lipossolúvel cuja função clássica é atuar sobre os ossos, intestino e rins regulando a homeostasia dos íons cálcio e fósforo (2). No entanto, atualmente sabe-se que essa vitamina atua sobre vários outros órgãos e tipos celulares (3-7), inclusive sobre o coração. (8, 9). A prevalência da deficiência de VitD tem aumentado nos últimos anos (1), tornando-se um problema de saúde pública. (10). É estimado que um bilhão de pessoas em todo mundo possuem insuficiência ou deficiência de VitD (1). A deficiência de VitD está associada com o aumento do risco de desenvolvimento de várias doenças crônicas, inclusive cardiovasculares (11- 18). Estudos clínicos mostraram que a hipovitaminose D está associada com o aparecimento de hipertensão (17, 19), insuficiência cardíaca (20) e doença arterial periférica (16). Além disso, estudo experimental mostrou que a deficiência causa hipertrofia, fibrose, disfunção cardíaca e alterações no metabolismo energético cardíaco (14). A alta frequência de hipovitaminose D na população e a associação de sua deficiência com o aparecimento de doenças crônicas têm incentivado pesquisadores a recomendar maior exposição solar, fortificação alimentar e suplementação medicamentosa de VitD, tanto para pessoas com maior risco como para população em geral (21-23). Entretanto, as alterações decorrentes da suplementação de diferentes doses de VitD ainda precisam ser melhor estudadas (24, 25), pois alguns trabalhos têm mostrado que esta vitamina pode ter efeito cardiovascular prejudicial, mesmo em doses consideradas não tóxicas (26-28). Estudos realizados com modelos de agressão como ratos urêmicos nefrectomizados e ratos infartados mostraram que a suplementação de VitD em doses não hipercalcêmicas levou ao desenvolvimento de hipertensão (28), alterações na aorta (28), hipertrofia ventricular esquerda (27, 28), disfunção cardíaca e alterações no metabolismo energético cardíaco (27). Além disso, estudo realizado em nosso laboratório com ratos saudáveis, sem nenhuma forma de agressão, mostrou que a suplementação de VitD em excesso, porém em doses consideradas não tóxicas para ratos, por dois meses, levou ao aumento da pressão arterial e a alterações na estrutura e função vascular, moduladas pela geração de espécies reativas e alteração na biodisponibilidade de óxido nítrico (26). Portanto, podemos observar que a VitD desempenha importante papel no desenvolvimento e funcionamento cardíaco. Entretanto, ela parece exercer uma curva "dose- resposta" bifásica na fisiopatologia cardiovascular, ou seja, tanto a deficiência como o excesso de VitD podem levar a alterações cardiovasculares que determinariam a remodelação cardíaca (24). Introdução 21 A remodelação cardíaca é desencadeada por alguma agressão ao coração que leva a alterações celulares, intersticiais e moleculares que vão ocorrendo de maneira progressiva. Com o tempo, essas alterações podem modificar a forma, a geometria e a massa cardíaca. Inicialmente, essas alterações morfológicas são importantes para a manutenção da função cardíaca. No entanto, cronicamente pode causar disfunção diastólica e/ou sistólica (29, 30). Entre as alterações celulares e moleculares que podem ocorrer no processo de remodelação cardíaca estão o estresse oxidativo, a inflamação, a apoptose, e alterações no metabolismo energético cardíaco, as quais podem progredir com hipertrofia e disfunção ventricular (27, 31, 32). A VitD existe em duas principais formas: a VitD2 (ergocalciferol) e a VitD3 (colecalciferol) (33). Tanto a VitD2 como a VitD3 podem ser adquiridas a partir da dieta, porém são poucos os alimentos que contêm quantidades substanciais destas vitaminas (34, 35). Sendo assim, fontes alimentares respondem por apenas 10 a 20% da VitD necessária para seres humanos, sendo o restante obtido pela síntese cutânea e/ou uso de suplementos (11). O ergocalciferol é produzido por plantas e leveduras a partir do ergosterol, após exposição à radiação ultravioleta B (11). O colecalciferol é formado na pele, de humanos e de outros mamíferos, a partir do 7-diidroxicolesterol, também sob exposição à radiação ultravioleta B. Após a síntese cutânea ou ingestão alimentar e medicamentosa, a VitD é metabolizada no fígado e nos rins formando seu metabólito mais ativo, o 1,25 diidroxivitamina D [1,25 (OH)2 D], também chamado de calcitriol (36). O calcitriol atua nas células alvo ligando-se ao receptor de vitamina D (VDR). O VDR é membro da superfamília de receptores nucleares para hormônios esteróides (2, 37) e age como fator de transcrição nuclear, sendo capaz de ligar-se diretamente a regiões específicas do DNA. O 1,25 (OH)2 D associado ao VDR se liga ao receptor rexinóide (RXR), formando heterodímeros. Este complexo liga-se a regiões reguladoras de genes-alvo, conhecidas como elementos resposta de VitD, e interagem com proteínas nucleares desencadeando a ativação ou a desativação de genes (38). Adicionalmente, há duas décadas, Chen and DeLuca (1994) (39), identificaram um gene (vitamin D-up-regulated (VDUP-1)) que é positivamente regulado pela VITD em células de linhagem promielocítica (HL-60). Desde então, o VDUP-1tem sido identificado em vários tecidos, incluindo o coração (40-43). Não se sabe ao certo como a VITD aumenta a expressão do VDUP-1. Welsh e colaboradores (2003) (44) propuseram que a expressão do VDUP-1 pode ser regulada pelo complexo 1,25 (OH)2 D-VDR. A proteína codificada pelo VDUP-1 é também conhecida como proteína ligante da tiorredoxina (TBP-2) ou mais atualmente, como proteína de interação com a tiorredoxina (TXNIP). Ela recebeu esses nomes, pois, dentre outras funções, foi identificada como regulador Introdução 22 negativo endógeno da proteína tiorredoxina (Trx) (45). A TXNIP liga-se ao centro catalítico da Trx reduzida, por meio de pontes dissulfeto, formando um complexo estável. Esta interação bloqueia a ligação da Trx com outros fatores, diminuindo sua atividade redutora (46). O sistema Trx consiste de duas enzimas oxidorredutases, a Trx e a Trx redutase (TrxR). A Trx catalisa reduções utilizando diferentes proteínas como substrato e tornando-se assim oxidada. A Trx oxidada é então reduzida pela TrxR, utilizando NADPH como doador de hidrogênio (47). Até o momento, três variantes distintas de Trx humana foram identificadas. A mais clássica é a Trx-1, localizada no citoplasma das células, e que em determinadas situações patológicas migra para o núcleo (48). Existem também a Trx-2, que está localizada nas mitocôndrias (49) e a Trx- Sp, que é uma variante muito expressa em espermatozóides (50). O sistema Trx é o maior sistema antioxidante do tipo tiol-dissulfeto oxidorredutase das células (51). Estudos têm mostrado que tanto a Trx como a TXNIP modulam diversas vias de sinalização por meio da interação direta com moléculas de sinalização intracelular e fatores de transcrição. Essas proteínas, por exemplo, participam da regulação de vias apoptóticas, inflamatórias, vias de hipertrofia e também modulam o metabolismo energético, tanto em cardiomiócitos como em outros tipos celulares (41, 51-55). Portanto, a suplementação em excesso de VitD poderia levar ao desequilíbrio da TXNIP e/ou do sistema Trx no coração, podendo resultar em remodelação cardíaca. Sendo assim, esse pode ser um dos mecanismos pelo qual o excesso de VitD causa efeitos deletérios ao coração. Hipótese 24 2. HIPÓTESE Com base nos dados apresentados acima, a hipótese do nosso trabalho é que a suplementação de vitamina D em excesso, mas em doses não tóxicas, leva à remodelação cardíaca com aparecimento de estresse oxidativo, apoptose, alteração dos mediadores inflamatórios e do metabolismo energético e que com o aumento do tempo de suplementação, ocorre alterações de morfologia e função cardíaca. Essas alterações são moduladas pela TXNIP e Trx. Objetivos 26 3. OBJETIVOS � Avaliar se suplementação em excesso, mas em doses não tóxicas, de vitamina D na ração por 2 meses resulta em alteração das proteínas TXNIP e Trx. � Avaliar se suplementação em excesso, mas em doses não tóxicas, de vitamina D na ração por 2 meses resulta em remodelação cardíaca com aparecimento de estresse oxidativo, apoptose e alterações de mediadores inflamatórios e metabolismo energético. � Avaliar se o aumento do tempo de suplementação (suplementação de vitamina D por 4 meses) leva a alterações na morfologia e função do coração. Material e Métodos 28 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Delineamento Experimental O protocolo experimental do presente trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética no Uso de Animal de nossa instituição, estando em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal. Foram realizados 2 experimentos: Experimento 1: foram utilizados 64 ratos Wistar machos pesando aproximadamente 200 g a 250 g acondicionados no Biotério da Unipex da Faculdade de Medicina – UNESP, Botucatu. Os animais foram distribuídos em 3 grupos: 1) Grupo controle (C) – formado por 21 animais que receberam a ração sem suplementação de colecalciferol ; 2) Grupo VD3 – formado por 22 animais que receberam suplementação de 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; 3) Grupo VD10 – formado por 21 animais que receberam suplementação de 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. Os animais receberam a suplementação de colecalciferol por período de dois meses. Após esse período, foram submetidos à avaliação ecocardiográfica e posteriormente à eutanásia e coleta de material biológico para realização das demais avaliações. Experimento 2: foram utilizados 46 ratos Wistar machos pesando aproximadamente 200 g a 250 g foram acondicionados no Biotério da Unipex da Faculdade de Medicina – UNESP, Botucatu. Os animais foram distribuídos novamente em 3 grupos: 1) Grupo controle (C-4) – formado por 14 animais que receberam a ração sem suplementação de colecalciferol; 2) Grupo VD3-4 – formado por 16 animais que receberam suplementação de 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; 3) Grupo VD10-4 – formado por 16 animais que receberam suplementação de 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. Os animais receberam a suplementação de colecalciferol por período de quatro meses. Após esse período, esses animais foram submetidos à avaliação ecocardiográfica e posteriormente à eutanásia e coleta de material biológico. Os animais foram expostos a ciclo claro-escuro de 12h, à temperatura ambiente de 22 ± 2ºC. Foram colocados em gaiolas individuais com livre acesso à água e a ingestão alimentar foi controlada diariamente. O peso corporal (PC) foi medido semanalmente. 4.2 Preparo das rações A ração utilizada para o grupo controle e para a fabricação das rações suplementadas com colecalciferol foi a ração comercial para ratos a base de cereais da Nuvilab® CR1 Nuvital Nutrientes S/A, Brazil. A composição aproximada por kg de ração era de 220g de proteína, 40g Material e Métodos 29 de gordura, 100g de mineral, 80g de fibra, e 1.800UI de VitD. Para o preparo da ração suplementada com colecalciferol, primeiramente o colecalciferol (Sigma-Aldrich, MO, USA) foi diluído em óleo de milho (10 ml/kg de ração), e posteriormente adicionado á ração triturada. Após, a ração foi misturada, peletizada e colocada para secar a temperatura ambiente. Após processo de secagem foi armazenada em freezer (-14°C). A ração para o grupo controle foi preparada da mesma forma, sendo adicionado apenas o óleo (10ml/Kg ração). Todos os animais receberam a mesma quantidade de ração. 4.3 Doses de vitamina D utilizadas Informações sobre as necessidades de VitD em ratos são limitadas. Recentemente, o Institute of Medicine realizou uma revisão para identificar as Dietary Reference Intakes (DRIs) para VitD para humanos. Na DRIs foi definida que da Necessidade Média Estimada para a VitD é de 400 UI/dia e que o Limite Superior Tolerável (valor acima do qual podem ocorrer efeitos deletérios) é de 4.000 UI/dia. O Nível Máximo de tolerância de Ingestão é dez vezes maior que a Necessidade Média Estimada (56). O National Research Council (NRC) recomenda a quantidade de 1.000UI de VitD por kg de ração para ratos (57). Entretanto, eles não definiram um Nível Máximo de tolerância de Ingestão para a VitD. Sendo assim, nós usamos a relação de 10 vezes a dose recomendada para ratos, para termos uma dose alta de VitD (10.000 UI/kg de ração). Além disso, usamos também uma dose intermediária (3.000 UI/kg de ração) entre a recomendada pelo (NRC) e a nossa dose alta. Shepard & DeLuca (1980) mostraram que ratos suplementados com doses acima de 1.000UI de VitD por dia (~ 30.000UI/kg de ração) apresentaram sinais de toxicidade, tais como: irritabilidade, diarreia, perda de apetite diminuição do ganho de peso. Além disso, os rins apresentaram manchas de cor branco-acinzentada, indicativas de calcificação (58). As doses usadas em nosso estudo foram 4,8 e 11,8 vezes maiores do que a dose recomendada para ratos, mas não atingiu a dose de 1.000UI/dia considerada tóxica por Shepard & DeLuca (1980) (58). Portanto, as doses usadas no presente estudo foram consideradas suplementação em excesso de VitD, porém doses não tóxicas Material e Métodos 30 4.4 Avaliação ecocardiográfica Após receberem as dietas durante dois e quatro meses, os ratos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (50 mg/kg) e cloridrato de xilidino (1mg/kg) via intramuscular. Em seguida foi feita raspagem da pelagem no tórax dos animais, que prontos foram posicionados em decúbito lateral esquerdo para a realização do ecocardiograma. O ecocardiógrafo utilizado foi o General Electric Medical System, modelo Vivid S6 (Tirat Carmel, Israel), equipado com transdutor eletrônico multifrequencial de 5,0-11,5 MHz. As estruturas cardíacas foram medidas em pelo menos cinco ciclos cardíacos consecutivos, obtendo-se a média aritmética em seguida (59). A imagem da cavidade ventricular esquerda e da espessura da parede posterior (EPP) foram obtidas posicionando-se o cursor do modo-M logo abaixo do plano da valva mitral, entre os músculos papilares. As imagens da aorta e do átrio esquerdo também foram obtidas na posição para-esternal eixo menor com cursor de modo-M passando pela valva aórtica. O diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo (DDVE) e a EPP foram medidos no momento correspondente ao seu diâmetro máximo. Já, o diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo (DSVE) foi medido no momento da excursão sistólica máxima de sua parede posterior. As medidas do diâmetro do átrio esquerdo (AE) e da aorta (Ao) foram realizadas, especificamente, no final da sístole e diástole ventricular. O diâmetro da via de saída do ventrículo esquerdo (VSVE) foi medido na posição paraesternal eixo maior, na sístole ventricular. Os fluxos diastólico transmitral e sistólico pela VSVE foram obtidos com o transdutor colocado nas posições apicais quatro a cinco câmaras, permitindo as medidas da onda E, onda A e velocidade máxima na VSVE. A freqüência cardíaca (FC) foi estimada pelo tempo entre dois batimentos cardíacos consecutivos. O tempo de relaxamento isovolumétrico (TRIV) medido corresponde ao tempo entre o final do fluxo sistólico pela VSVE e o início da fluxo diastólico transmitral. As outras variáveis foram derivadas das formulações descritas a seguir: � Espessura relativa da parede (ERPP) = (2 x EPP)/DDVE; � Fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FE) = (DDVE3 - DSVE3)/ DDVE3; � Porcentagem de encurtamento (Enc) = [(DDVE – DSVE)/ DDVE] x 100; � Volume sistólico (VS) = [VTI x π x (VSVE/2)2], sendo VTI a integral da velocidade/tempo do fluxo sistólico na VSVE; � Débito cardíaco (DC) = VS x FC; Material e Métodos 31 � Índice cardíaco (IC) = DC/PC. � Tempo de relaxamento isovolumétrico corrigido para a freqüência cardíaca (FC) (TRIV/R-R)= TRIV/√R-R, sendo que R-R= 60/FC. Foram realizadas também algumas medidas por Doppler tissular, tais como a velocidade máxima de deslocamento sistólico do anel mitral e tricúspide (onda S’), pico de velocidade de deslocamento diastólico inicial do anel mitral e tricúspide (E’) e pico de velocidade de deslocamento diastólico tardio do anel mitral e tricúspide (A’) (60, 61). Algumas variáveis ecocardiográficas foram normalizadas pelo peso corporal e pelo diâmetro da aorta. 4.5 Coleta de material biológico Após a realização do ecocardiograma, os animais foram eutanasiados com dose excessiva de pentobarbital sódico (50 mg/kg) e posteriormente decapitados. Foram então coletados o sangue (em tubo com e sem heparina) e o coração dos animais. O sangue foi centrifugado a 3.000 rpm por 20 minutos a 4°C. O soro e o plasma obtidos foram congelados a -80°C para posterior dosagem de cálcio, fósforo e 25 (OH) D3. O coração foi dissecado em átrios (A), ventrículo direito (VD) e ventrículo esquerdo (VE), todos foram pesados (dados morfométricos). O VE que foi seccionado em anéis, colocado em nitrogênio líquido e depois armazenado em freezer a -80°C para posteriores análises. 4.6 Determinação plasmática de 25 (OH) D3 As concentrações de 25 (OH) D3 no plasma foram analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). O aparelho empregado foi cromatógrafo Waters 2695, com detector Waters 2996-fotodiodo. A análise foi feita por coluna C18 de fase reversa para todas as amostras. A fase móvel foi composta por água e metanol (85:15, v/v). O comprimento do detector de onda ultravioleta (UV) será fixado em 265 nm e com fluxo de 0,5 ml/min. A extração de 25 (OH) D3 foi feita em alíquotas de 500 µl de plasma. O plasma foi colocado em tubo, adicionado 500 µl de metanol-isopropanol (90:10, v/v), e agitado em vórtex por 15 segundos. Em seguida, foi adicionado 1,5 ml de n-hexano, agitado em vórtex por 60 segundos e centrifugado a 3.000 rpm por 3 minutos, a 4°C. Foi coletado o sobrenadante, colocado em outro tubo e evaporado com fluxo de nitrogênio. As amostras foram redissolvidas em 125 µl de metanol. Foi injetado no HPLC 50 µl de amostra. Após corrida de 20 minutos, foi Material e Métodos 32 aguardado estabilização da coluna que foi lavada com metanol 100% para leitura de nova amostra (62). 4.7 Determinação sérica de Cálcio A dosagem de cálcio foi realizada por método colorimétrico. O cálcio foi dosado no soro por meio da reação com arsenazo III, em pH neutro, formando um complexo cuja intensidade da cor é proporcional à quantidade de cálcio na amostra (teste kit Laborlab, Laborlab Produtos para Laboratório, SP, Brasil). A cor obtida foi medida a 600-650 nm em espectrofotômetro. 4.8 Determinação dos mediadores inflamatórios A dosagem dos mediadores inflamatórios fator de necrose tumoral-α (TNF-α), interferon- γ (INF-γ), interleucina-10 (IL-10) e molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) foi realizada pelo método de ELISA sanduíche. Primeiramente foi realizada a extração da proteína do tecido cardíaco adicionando-se 1,5 ml de tampão de extração (50 mM de tampão fosfato de potássio pH=7,0; 0,3 M sucrose; 0,5 mM de DTT; 1 mM de EDTA pH=8,0; PMSF 0,3 mM; NaF 10 mM e inibidor de protease 1:100) à 60 mg de tecido cardíaco. As amostras foram homogeneizadas por 10 segundos, 2 vezes em aparelho Polytron (Ika Ultra TurraxTM T25 Basic, Wilmongton USA). O material foi então centrifugado por 20 minutos à 4º C e 12.000 rpm e o sobrenadante foi coletado. A quantidade de proteína do extrato foi determinada pelo método de Bradford (1976), utilizando curva de BSA Protein Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) como padrão (63). Após a extração de proteína, placas de 96 poços (Nunc) foram recobertas com solução contendo anticorpo purificado de captura anti-TNF-α, anti- INF-γ, anti-IL-10 ou anti-ICAM-1 (R&D Systems), diluídos em tampão PBS. As placas foram incubadas à temperatura ambiente durante uma noite. Após sucessivas lavagens com solução PBS – Tween 20 (0,05%) foi adicionada 300 µL da solução de bloqueio, constituída de PBS contendo 1% de albumina, com incubação por 2 horas, à temperatura ambiente. As placas novamente lavadas foram incubadas por 2 horas, à temperatura ambiente, com as amostras e com as respectivas curvas padrões, diluídas na base 2 em tampão PBS contendo 1% de albumina. Decorrido o tempo de incubação, as placas foram lavadas e incubadas com os anticorpos anti-TNF-α, anti- INF-γ, anti-IL-10 ou anti-ICAM-1 de rato biotinilados durante 2 horas, à temperatura ambiente. Posteriormente, as placas foram novamente incubadas com estreptoavidina diluído 1:200 em tampão PBS contendo Material e Métodos 33 1% de albumina, durante 20 minutos, à temperatura ambiente. As placasforam lavadas e reveladas com OPD (Sigma). A reação foi interrompida por adição de H2SO4 16% e a leitura realizada em 492 nm. 4.9 Determinação da atividade das enzimas do metabolismo energético e de marcadores do estresse oxidativo As enzimas do metabolismo energético e os marcadores de estresse oxidativo foram determinados por método colorimétrico. Primeiramente foi realizada a extração de proteína em amostras de 200 mg do ventrículo esquerdo, homogeneizadas em tampão fosfato de sódio (0,1M, pH 7,0) e centrifugadas a 10.000 rpm, durante 15 minutos a 4°C. O sobrenadante foi coletado e utilizado para a determinação da concentração de proteína total; da atividade das enzimas do metabolismo energético: lactato desidrogenase, fosfofrutoquinase, complexo piruvato desidrogenase, citrato sintase, 3-hidroxiacil Coenzima A desidrogenase; para atividade das enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, gluationa peroxidase e catalase; e para a concentração de hidroperóxido de lipídio. O pellet foi ressuspendido com tampão fosfato de sódio 0,1M contendo 250mM de sacarose e 2mM de EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético), e centrifugado a 10.000 rpm por 5 minutos a 4°C, para posterior determinação da atividade da succinato desidrogenase (complexo enzimático mitocondrial de cadeia respiratória II) e da ATP sintase (64). As leituras foram realizadas em leitor de microplaca (µQuant-MQX Bio-Tech Instruments, Inc., Winooski, VT, USA) com controle pelo software. Todos os reagentes utilizados foram de procedência da Sigma (St. Louis, USA). a) Determinação da atividade das enzimas do metabolismo energético � Lactato desidrogenase (LDH) A atividade da LDH foi determinada de acordo com metodologia proposta por Wilkinson (1965) (65) com a utilização do método UV otimizado, onde foi medido o consumo de NADH2, (nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato reduzido) que é proporcional à atividade da enzima presente na amostra. Material e Métodos 34 � Fosfofrutoquinase (PFK) A atividade da PFK foi determinada em meio contendo tampão TRIS-HCl (50mM; pH 8,0), MgCl2, gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase, aldolase, trifosfato isomerase, ATP e frutose -6- fosfato, com medidas da velocidade de oxidação do NADH2, segundo método descrito por Bass et al. (1969) (66). � Complexo piruvato desidrogenase (PDH) Na presença de tampão fosfato de potássio (50mM; pH 7,4) determinou-se a atividade da PDH em mistura reativa contendo NAD, tiamina pirofosfato, coenzima A, ditiotreitol, MgCL2, NBT (nitrobluetetrazóilico), piruvato de sódio e fenazina metasulfato, onde se mediu a conversão do piruvato em acetil-CoA através da velocidade da redução do NAD (66). � Citrato sintase A reação de condensação entre o grupamento acetil da molécula de acetil-CoA e oxaloacetado, reação catalisada pela citrato sintase, cuja atividade foi determinada napresença dos substratos acetil-CoA e oxaloacetato e DTNB (dithiobis-2-nitrobenzoato) em tampão fosfato Tris-HCl 50mM, pH 8,0 (66). � 3-hidroxiacil Coenzima A desidrogenase (OHADH) Foi determinada na presença de tampão Tris-HCl 0,1M, pH 7,0, EDTA, acetoacetil-CoA e NADH (66). � Succinato desidrogenase (complexo II). A atividade enzimática da succinato desidrogenase foi medida pelo método descrito por Fischer et al. (1985) (67) em meio com tampão fosfato de potássio (50mM; pH 7,4), contendo succinato de sódio, fenasina metassulfato e DPIP (diclorofenolindofenol), o qual teve absorbância, a 600nm, diminuída. � ATP sintase A atividade da ATP sintetase foi determinada em meio tamponado (Tris-HCl 50mM; pH 8,0, na presença de MgCl2, NADH, fosfoenolpiruvato, ATP, LDH e piruvato quinase (68). b) Determinação dos marcadores de estresse oxidativo Material e Métodos 35 � Atividade da superóxido dismutase (SOD) A atividade da SOD foi determinada monitorando a inibição da redução do nitroblutetrazólico (NBT) através de radicais superóxidos gerados em solução contendo NADH2 e fenazina metassulfato (69). � Atividade da glutationa peroxidase (GPx) Foi determinada a partir da oxidação do NADPH2 em meio a mistura reativa contendo tampão fosfato de sódio, glutationa reduzida, azida sódica, EDTA, glutationa redutase, a qual catalisa a redução da glutationa oxidada (70). � Atividade da Catalase (CAT) A atividade enzimática da catalase foi determinada em tampão fosfato pH 7,0, utilizando-se 15µL de amostra e peróxido de hidrogênio (30%). As leituras espectofotométricas foram realizadas a 240nm (71). � Concentração de hidroperóxido de lipídio (LH) O hidroperóxido de lipídio foi determinado na presença de sulfato ferroso amoniacal (Fe2 +) e alaranjado de xilenol, ácido sulfúrico e butilato de hidroxitolueno (BHT) em mistura de metanol 90% (72). 4.10 Determinação da expressão protéica por Western Blot Foi realizada a determinação da expressão da proteína de interação com a tiorredoxina (TXNIP); dos marcadores de estresse oxidativo: tiorredoxina-1 (Trx-1), fator nuclear eritróide-2 (Nrf-2), glutationa peroxidase-1 (GPx-1) e heme oxigenase-1 (HO-1); dos marcadores de apoptose: caspase-3 (formas: inativa, pró-caspase-3 e ativa, caspase-3-clivada) e Bcl-2; e dos marcadores de metabolismo energético: receptor ativado pelo proliferador de peroxissoma (PPAR-α) e coativador 1 alfa do PPAR-γ (PGC1-α) pela técnica Western Blot. a) Extração do lisado celular total Para determinação de todas as proteínas estudadas, exceto o Nrf-2, a extração de proteína foi realizada utilizando-se amostras de 100 mg do ventrículo esquerdo homogeneizadas com 1ml de tampão de extração contendo NaCl 100 mM, Triton X-100 1% (v/v), deoxicolato de sódio Material e Métodos 36 0,5% (w/v), SDS 0,1 % (w/v), glicerol 10% (v/v), Tris 10 mM (ph 7,4), EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, ortovanadato de sódio 1 mM, NaF 10 mM e inibidores de proteases (P2714, Sigma- Aldrich). As amostras foram homogeneizadas por 10 segundos, 2 vezes em aparelho Polytron (Ika Ultra TurraxTM T25 Basic, Wilmongton USA). A seguir, as amostras foram centrifugado por 20 minutos, a 12.000 rpm e a 4° C. O sobrenadante foi coletado e armazenadas em freezer a -80° C. A concentração de proteína total foi analisada pelo método de Bradford utilizando curva de BSA Protein Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) como padrão (63). b) Extração nuclear Amostras de 60 mg de ventrículo esquerdo foram homogeneizados com 500µl de tampão de extração (10mM HEPES, 1,5mM MgCl2, 10mM KCl, 0,5mM DTT, 0,05% NP40). As amostras foram homogeneizadas manualmente, com auxílio de bastão de vidro. Posteriormente, as amostras foram centrifugados a 3000 rpm, por 10 minutos a 4°C. O sobrenadante foi separado (fração citoplasmática) e o pellet ressuspendido com tampão (5mM HEPES, 1,5mM MgCl2, 0,2mM EDTA, 0,5mM DTT, 26% glicerol (v/v)) e NaCl. As amostras foram homogeneizadas por 10 segundos, 2 vezes em aparelho Polytron (Ika Ultra TurraxTM T25 Basic, Wilmongton USA). Após aguardar 30 minutos em gelo, as amostras foram novamente centrifugadas a 15.000 rpm, por 20 minutos 4°C e coletado o sobrenadante (fração nuclear), que foi utilizado para a quantificação do Nrf-2. A concentração de proteína total foi analisada pelo método de Bradford utilizando curva de BSA Protein Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) como padrão (63). c) Eletroforese em gel Após a quantificação da concentração de proteína, as amostras foram diluídas em tampão Laemmli (Tris - HCL240mM, SDS, 0,8%, glicerol 40%, azul debromofenol 0,02% e β- mercaptoetanol 200mM) e aquecidas a 100°C por 5 minutos. Posteriormente, as amostras (contendo 50 µg de proteína total) foram separadas por eletroforese utilizando sistema Mini- Protean 3 Electrophoresis Cell (Bio - Rad, Hercules, CA, USA). A corrida eletroforética foi realizada em gel bifásico, de empilhamento (Tris - HCL 240mM pH 6,7, poliacrilamida 40%, APS e Temed) e de resolução (Tris - HCL 240mM pH 8,9, poliacrilamida 40%, glicerol, APS e Temed) a 4° C. Material e Métodos 37 A concentração do gel de empilhamento utilizada foi de 5% e a concentração do gel de resolução variou de 10 a 15%, de acordo com o peso molecular da proteína determinada. No primeiro poço do gel foi aplicado um padrão de peso molecular, Kaleidoscope Prestained Standards (Bio - Rad, Hercules, CA, USA) e nos poços seguintes os grupos foram pipetados de maneira alternada. A corrida eletroforética foi efetuada a 30 min a 50 V e 2 horas a 120 V (Power Pac HC 3.0A, Bio - Rad, Hercules, CA, USA) com tampão de corrida (Tris 0,25M, glicina 192 mM e SDS 1%). d) Transferência e Bloqueio Após a corrida, as proteínas foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose em sistema Mini - Trans Blot (Bio - Rad, Hercules, CA, USA) utilizando-se tampão de transferência (Tris 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20% e SDS 0,1%). Os sítios inespecíficos de ligação do anticorpo primário à membrana foram bloqueados mediante incubação com solução de 5% de leite em pó desnatado, dissolvido em solução basal pH 8,0 (Tris 1M pH 8,0, NaCl 5M e detergente Tween 20) por 120 minutos à temperatura ambiente sob constante agitação. e) Incubação com os Anticorpos primário e secundário Após o bloqueio, as membranas foram incubadas com os anticorpos primários específicos para cada proteína analisada, diluídos em solução basal. As membranas permaneceram incubadas durante a noite à temperatura de 4°C, sob constante agitação. Após a incubação com o anticorpo primário, as membranas foram lavadas em solução basal pH 8,0 e incubadas com os anticorpos secundários específicos, diluídos também em solução basal. As membranas permaneceram incubadas por 1,5 horas, à temperatura ambiente, sob agitação constante. Posteriormente a membrana foi lavada em solução basal pH 8,0 e a imunodetecção foi realizada por meio do método de quimioluminescência utilizando o Kit SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate, Thermo Scientific, USA. As imagens foram fotografadas no analisador de imagens Carestream Molecular Imaging (Carestream Health, Inc, USA). A expressão de todas as proteínas analisadas foi normalizada pela expressão da proteína constitucional glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). A análise das imagens foi relaizada no programa de análise de imagens Image Pro–plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Os anticorpos primários utilizados foram os seguintes: Material e Métodos 38 � VDUP-1, mouse monoclonal IgG1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe, sc 271238). � Trx-1, rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe, sc 20146). � PGC-1, rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe, sc 13067). � PPAR-α, rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe, sc 9000). � Nrf-2, rabbit polyclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe, sc 722). � Heme Oxygenase 1, mouse monoclonal IgG1 (Abcam, Cambridge, MA, USA, 13248). � Glutathione Peroxidase 1, rabbit polyclonal IgG (Abcam, Cambridge, MA, USA, 22604). � Caspase 3, rabbit monoclonal IgG (Cell Signaling Technology, Inc, Beverly, MA, USA, 9664). � Bcl-2, rabbit monoclonal IgG (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe, sc 492). � GAPDH, mouse monoclonal IgG1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc, Europe, sc 32233). Os Anticorpos secundários utilizados froam os seguintes: � Goat anti-mouse IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology,Inc, Europe, sc 2005). � Goat anti-rabbit IgG-HRP (Santa Cruz Biotechnology,Inc, Europe, sc 2004). 4.11 Atividade de tiorredoxina e da tiorredoxina redutase A atividade da tiorredoxina e da tiorredoxina redutase foi realizada por meio de ensaio de redução de insulina (73, 74). Inicialmente, 60 mg do ventrículo esquerdo foi homogeneizado com 500µl de tampão de extração contendo 20nmol/l de Hepes (ph=7,9), 300 mmol/l NaCl, 100 mmol/l KCl, 10mmol/l de EDTA, 0,01% de Triton (v/v) e 1% de Inibidor de protease (v/v) (P2714, Sigma- Aldrich). As amostras foram homogeneizadas por 10 segundos, 2 vezes em aparelho Polytron (Ika Ultra TurraxTM T25 Basic, Wilmongton USA). A seguir, as amostras foram centrifugado por 20 minutos, a 12.000 rpm e a 4° C. A concentração de proteína total foi analisada pelo método de Bradford 51 utilizando curva de BSA Protein Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) como padrão (63). Para determinação da atividade da Trx, cada amostra, 50 ug de proteína total, em um volume de 8 ul, foi incubada com 2 ul de tampão de ativação (100 mM de Tris-HCl (pH = 7,5); 2 mM de EDTA; 1 mg/ml de BSA; e 2 mM de DTT) a 37 ° C durante 20 minutos. As amostras foram então misturadas com 110 ul da mistura de reação (100 mM de Tris-HCl (pH = 7,5); 2,0 mM de EDTA, 0,2 mM de NADPH; 1,0 ug Trx redutase; e 140 µM de insulina) e incubadas a 25 °C por 20 minutos. A absorbância foi medida a 340 nm, indicando a oxidação do NADPH em intervalos de 1 minuto, utilizando espectrofotômetro. Como controle, as amostras foram Material e Métodos 39 misturadas com a mistura de reação sem insulina. As medidas de absorbância na ausência de insulina foram subtraídas das medidas de absorbância na presença de insulina gerando o delta absorbância. Posteriormente, foi realizada a área sobre a curva do delta absorbância, para apresentação dos resultados. Para determinação da atividade da TrxR as amostras foram misturadas com 110 ul da mistura de reação (100 mM de Tris-HCl (pH = 7,5); 2,0 mM de EDTA, 0,2 mM de NADPH; 1µg/µl de Trx; e 1mg/ml de insulina) e incubadas a 25 °C por 20 minutos. A absorbância foi medida a 340 nm, indicando a oxidação do NADPH em intervalos de 1 minuto, utilizando espectrofotômetro. Como controle, as amostras foram misturadas com a mistura de reação semTrx. As medidas de absorbância na ausência de Trx foram subtraídas das medidas de absorbância na presença de Trx. A atividade foi calculada da diminuição na absorbância a 340nm, medido a cada 1 minuto, como sendo ∆ 340 x 2/6,22. Posteriormente, foi realizada a área sobre a curva do delta absorbância, para apresentação dos resultados. 4.12 Análise estatística Os valores obtidos são apresentados como média ± desvio padrão (para distribuição normal) ou mediana com percentil 25 e 75 (para distribuição não normal). Os resultados de cada variável foram submetidos à verificação da normalidade e de igualdade de variância. Quando esses requisitos foram atendidos as comparações entre os grupos foram feitas por análise de variância (ANOVA) de uma via, complementadas com o teste de Tukey. Quando um dos requisitos não foi atendido, foi utilizado o teste não paramétrico de Kruskal Wallis complementado com o teste de Dunn. Para avaliar a resposta dose dependente da suplementação de VitD foram utilizados testes de tendência. Quando as variáveis apresentaram distribuição normal, foi utilizado o teste Trend do Pacote estatístco GraphPad Prism. Quando as variáveis não apresentaram distribuição normal, foi realizada a Correlação de Spearman entre doses e variável analisada (75). Resultados 41 5. RESULTADOS 5.1 Experimento 1 5.1.1 Peso corporal, consumo diário de ração e de vitamina D, cálcio sérico e 25 (OH) D3 plasmático. Não houve diferença entre os grupos para o peso corporal final e o consumo diário de ração. O consumo diário de VitD foi maior no grupo VD3 comparado ao C e foi maior no grupo VD10 comparado aos outros grupos. O aumento no consumo diário de VitD foi dose dependente (figura 1). O 25 (OH) D3 plasmático foi maior no grupo suplementado com a maior dose de colecalciferol comparado ao C. O aumento do 25 (OH) D3 foi dose dependente (figura 2). Os valores de cálcio sérico foram maiores nos grupos suplementados quando comparados ao C e seu aumento foi dose dependente (figura 3) (tabela 1). Resultados 42 Tabela 1. Peso corporal, consumo diário de ração e de vitamina D, cálcio sérico e 25 (OH) D3 plasmático. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, números entre parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de coleclaciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de coleclaciferol/kg de ração. 25 (OH) D3: 25-hidroxicolecalciferol. P1: valor de p da ANOVA de 1 via ou Kruskal Wallis; P2: valor de p para teste de tendência. Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Variável C VD3 VD10 P1 P2 Peso Corporal (g) 422±26,8 (21) 429±35,6 (22) 421±31,7 (21) 0,646 0,923 Consumo diário de ração (g/day) 25,7±1,54 (21) 25,9±1,91 (22) 24,9±1,98 (21) 0,166 0,154 Consumo diário de vitamina D (UI/dia) 45,5 (44,8-48,1)a (21) 123 (118-128)b (22) 290 (283-310)c (22) <0,001 <0,001 25 (OH) D3 (ng/ml) 15,0 (13,2-20,7)a (5) 25,5 (19,0-40,5)ab (5) 36,9 (34,1-39,8)b (5) 0,016 <0,001 Cálcio sérico (mg/dl) 8,24±1,09a (9) 9,32±1,10b (12) 9,44±0,51b (11) 0,016 0,008 Resultados 43 Figura 1. Consumo diário de vitamina D. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1: < 0,001 (valor de p Kruskal Wallis); P2: < 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Figura 2. Concentração plasmática de 25 (OH) D3. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1 = 0,016 (valor de p Kruskal Wallis); P2: < 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 25 ( O H ) D 3 (n g/ m l) 0 10 20 30 40 50 60 70 C VD3 VD10 C on su m o di ár io d e vi ta m in a D ( U I/ di a) 0 50 100 150 200 250 300 350 ab b a a b c Resultados 44 Figura 3. Concentração sérica de cálcio. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1 = 0,016 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 = 0,008 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 C ál ci o sé ri co ( m g/ dl ) 0 6 7 8 9 10 11 12 a b b Resultados 45 5.1.2 Expressão protéica da TXNIP e da Trx e atividade da Trx e da TrxR. Como podemos observar na tabela 2, a expressão protéica da TXNIP foi maior no grupo suplementado com a maior dose de colecalciferol comparado aos outros grupos e seu aumento foi dose dependente (figura 4). A expressão da Trx não diferiu entre os grupos, entretanto ela apresentou uma diminuição dose dependente (figura 5). Adicionalmente, a atividade redutora da Trx foi menor no grupo VD10 comparado aos outros grupos e essa diminuição foi dose dependente (figura 6). A atividade da TrxR não foi diferente entre os grupos (tabela 2). Resultados 46 Tabela 2. Expressão protéica da TXNIP e da Trx e atividade da Trx e da TrxR. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, números entre parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. TXNIP: proteína de interação com a tiorredoxina; Trx: tiorredoxina; DO: densidade óptica; TrxR: tiorredoxina redutase. P1: valor de p da ANOVA de 1 via ou Kruskal Wallis; P2: valor de p para teste de tendência. Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Variável C VD3 VD10 P1 P2 TXNIP (unidade arbitrária) 0,16 (0,09-0,30)a (12) 0,18 (0,08-0,34)a (12) 0,74 (0,48-1,05)b (12) 0,002 <0,001 Trx (unidade arbitrária) 1,04±0,40 (12) 0,90±0,33 (12) 0,73±0,22 (11) 0,082 0,026 Atividade da Trx (DO 340 nm x minuto) 0,251±0,08a (10) 0,226±0,06a (10) 0,115±0,0b (10) <0,001 <0,001 Atividade da TrxR (mU/mg de proteína x minuto) 0,097 (0,096-0,098) (8) 0,097 (0,096-0,097) (9) 0,096 (0,085-0,098) (10) 0,383 0,117 Resultados 47 Figura 4. Expressão protéica da proteína de interação com a tiorredoxina. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol /kg de ração. P1 = 0,002 (valor de p Kruskal Wallis); P2: < 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 T X N IP ( u n id ad e ar b it rá ri a) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 a a b Resultados 48 Figura 5. Expressão protéica da tiorredoxina. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol /kg de ração. P1 = 0,082 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 =0,026 (valor de p para teste de tendência). C VD3 VD10 T rx ( u n id ad e ar b it rá ri a) 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 Resultados 49 Figura 6. Atividade da tiorredoxina. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol /kg de ração. P1 < 0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 < 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 A ti vi da de d a T rx (D O 3 40 n m x m in ut o) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 a a b Resultados 50 5.1.3 Marcadores de estresse oxidativo. Os dados relativos aos marcadores de estresse oxidativo estão apresentados na tabela 3. Como podemos observar, a atividade das enzimas antioxidantes SOD (figura 7) e GPx (figura 8) foram menores nos grupos suplementados com colecalciferol. Essa diminuição foi dose dependente. Para a atividade da enzima CAT não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. Os valores de LH foram maiores nos animais do grupo VD10 comparado aos outros grupos e o seu aumento foi dose dependente (figura 9). A expressão protéica do Nrf-2 e das proteínas antioxidantes HO-1 e GPx não apresentou diferença entre os grupos. Resultados 51 Tabela 3. Marcadores de estresse oxidativo. Variável C VD3 VD10 P1 P2 SOD (nmol/mg de proteína) 19,9 (18,6-24,5)a (8) 13,0 (11,8-14,0)b (8) 13,0 (11,8-14,2)b (8) <0,001 0,001 GPx (umol/g de tecido) 40,4±6,2a (8) 31,5±4,6b (8) 29,7±3,1b (8) <0,001 <0,001 CAT (µmol/g de tecido) 120,9±15,5 (8) 124,6±11,1 (8) 110,9±15,8 (8) 0,165 0,178 LH (nmol/g de tecido) 143,8±13,9a (8) 134,1±20,1a (8) 179,6±11,8b (8) <0,001 <0,001 NRF-2 (unidade arbitrária) 1,07 (0,72-1,68) (12) 0,91 (0,62-1,10) (11) 1,36 (1,06-1,87) (12) 0,192 0,279 HO-1 (unidade arbitrária) 0,97 (0,75-1,27) (12) 0,83 (0,71-1,02) (12) 1,00 (0,86-1,62) (12) 0,271 0,117 GPx (unidade arbitrária) 1,06±0,19 (12) 0,88±0,20 (12) 0,92±0,32 (12) 0,189 0,177 Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, números entre parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. SOD: superóxido dismutase; GPx: gluationa peroxidase; CAT: catalase; LH: hidroperóxido de lipídio; NRF-2: fator nuclear eritróide-2, HO-1: heme oxigenase-1. P1: valor de p da ANOVA de 1 via; P2: valor de p para teste de tendência. Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Resultados 52 Figura 7. Atividade da superóxido dismutase. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1 < 0,001 (valor de p Kruskal Wallis); P2 = 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Figura 8. Atividade da glutationa peroxidase. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1 <0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2< 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 SO D ( n m ol / m g d e p ro te ín a) 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 C VD3 VD10 G P x ( µµ µµ m ol / g d e te ci d o) 0 20 25 30 35 40 45 50 55 b a b a b b Resultados 53 Figura 9. Hidroperóxido de lipídio. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1 < 0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 < 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 L H ( n m ol / g de t ec id o) 0 100 125 150 175 200 a a b Resultados 54 5.1.4 Marcadores de apoptose e mediadores inflamatórios. Como podemos observar na tabela 4, a expressão protéica da pró-caspase-3 não foi diferente entre os grupos estudados. Por sua vez, a expressão protéica da caspase-3-clivada foi menor no grupo VD3 comparado ao VD10. A expressão protéica da Bcl-2 foi menor no grupo suplementado com a maior dose de colecalciferol comparado aos outros grupos. Essa diminuição foi dose dependente (figura 10). Para os marcadores inflamatórios os valores foram maiores no grupo VD10 comparado aos outros grupos, tanto para as citocinas inflamatórias, TNF-α (figura 11) e INF-γ (figura 12), como para a molécula de adesão ICAM-1 (figura 13) e citocina antiinflamatória IL-10 (figura 14). O aumento dos marcadores inflamatórios foi dose dependente (tabela 4). Resultados 55 Tabela 4. Marcadores de apoptose e mediadores inflamatórios. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, números entre parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. Pró-caspase-3: banda inativa; Caspase-3-clivada: banda ativa; TNF-α: fotar de necrose tumoral- α; INF-γ: interferon-γ; IL-10: interleucina-10; ICAM-1: molécula de adesão intercelular-1. P1: valor de p da ANOVA de 1 via; P2: valor de p para teste de tendência. Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Variável C VD3 VD10 P1 P2 Pró-caspase-3 (unidade arbitrária) 1,01 (0,84-1,19) (12) 0,99 (0,72-1,12) (12) 0,87 (0,56-1,22) (12) 0,697 0,339 Caspase-3-clivada (unidade arbitrária) 1,01±0,49ab (12) 0,84±0,48a (12) 1,54±0,56b (12) 0,023 0,060 Bcl-2 (unidade arbitrária) 1,02±0,16a (12) 0,88±0,22a (12) 0,74±0,32b (11) 0,027 0,008 TNF-α (pg/ mg proteína) 4,33±0,40a (6) 4,52±0,29a (7) 8,67±45b (7) <0,001 <0,001 INF-γ (pg/mg proteína) 7,61±0,66a (6) 7,75±0,56a (7) 15,0±0,86b (7) <0,001 <0,001 IL-10 (pg/mg proteína) 12,3±1,37a (6) 14,8±1,45a (7) 31,0±3,87b (7) <0,001 <0,001 ICAM-1(pg/mg proteína) 67,6±3,60a (6) 65,8±3,48a (7) 106±10,4 b (7) <0,001 <0,001 Resultados 56 Figura 10. Expressão protéica da Bcl-2. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1 = 0,027 (valor de ANOVA de 1 via); P2 = 0,008 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 B cl -2 ( un id ad e ar bi tr ár ia ) 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 a a b Resultados 57 Figura 11. Fator de necrose tumoral-α. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferl /kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1 < 0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2<0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Figura 12. Interferon-γ. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1<0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2<0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 T N F - αα αα ( p g/ m g p ro te ín a) 0 2 4 6 8 10 12 C VD3 VD10 IN F - γ (γ ( γ ( γ (p g/ m g d e p ro te ín a )) )) 0 4 6 8 10 12 14 16 18 20 a a b a a b Resultados 58 Figura 13. Molécula de adesão intercelular-1 C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1<0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2<0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Figura 14. Interleucina-10 C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1<0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2<0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 IC A M -1 ( p g/ m g de p ro te ín a) 0 60 80 100 120 140 160 C VD3 VD10 IL -1 0 (p g/ m g de p ro te ín a) 0 7 14 21 28 35 42 49 56 a a b a a b Resultados 59 5.1.5 Metabolismo energético cardíaco Os dados referentes aos marcadores do metabolismo energético cardíaco estão apresentados na tabela 5. A expressão protéica do PGC-1α foi menor no grupo VD10 comparado ao C. A diminuição na sua expressão protéica foi dose dependente (figura 15). Não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos para a expressão do PPARα. A atividade da enzima PFK (figura 16) e da ATP sintase apresentou diferença entre os grupos, porém o teste de comparações múltiplas de Tukey não conseguiu mostrar quais grupos eram diferentes entre si. A atividade da enzima PDH (figura 17) apresentou um aumento dose dependente. Para as enzimas CS (figura 18), Complexo II (figura 19) e OHADH (figura 20), a atividades foi menor no grupo VD10 comparado aos outros grupos e todas apresentaram uma diminuição dose dependente. A atividade da enzima LDH foi maior no grupo suplementado com a maior dose de colecalciferol, quando comparado aos outros grupos. O aumento na atividade da LDH foi dose dependente (figura 21). Resultados 60 Tabela 5. Metabolismo energético cardíaco. Dados expressos em média ± desvio padrão, números entre parênteses indicam o número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. PGC-1α: coativador-1α do receptor ativado por proliferadores de peroxissomaγ; PPARα: receptor ativado por proliferadores de peroxissomaα; PFK: fosfofrutoquinase; PDH: complexo piruvato desidrogenase; CS: citrato sintase; Complex II: complexo respiratório II (succinato desidrogenase); ATP sintase: Adenosine trifosfate sintase; OHADH: 3-hidroxiacil coenzyme A desidrogenase; LDH: lactato desidrogenase. P1: valor de p da ANOVA de 1 via; P2: valor de p para teste de tendência. Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Variável C VD3 VD10 P1 P2 PGC-1α (unidade arbritária) 1,03±0,18 a (12) 0,91±0,17 ab (12) 0,76±0,21 b (11) 0,006 0,002 PPARα (unidade arbritária) 1,06±0,40 (12) 0,87±0,44 (12) 0,95±0,50 (11) 0,593 0,562 PFK (nmol/g de tecido) 131±23,6 a (6) 123±34,8 a (6) 170±36,4 a (6) 0,048 0,053 PDH (nmol/g de tecido) 317±57,9 (6) 337±42,9 (6) 382±41,6 (6) 0,088 0,034 CS (umol/g de tecido) 39,7±3,22 a (8) 40,4±2,75 a (8) 34,5±4,02 b (8) 0,004 0,005 Complexo II (umol/mg de tecido) 6,36±0,90 a (6) 6,27±1,18 a (6) 3,40±0,67 b (6) <0,001 <0,001 ATP sintase (umol/mg de tecido) 45,4±2,96 a (6) 53,0±5,42 a (6) 44,6±8,04 a (6) 0,049 0,824 OHADH (nmol/mg de proteína) 69,9±10,8 a (8) 65,8±13,1 a (8) 34,4±5,14 b (8) <0,001 <0,001 LDH (nmol/mg de proteína) 220±18,1 a (8) 209±10,0 a (8) 256±9,60 b (8) <0,001 <0,001 Resultados 61 Figura 15. Expressão protéica do coativador-1α do receptor ativado por proliferadores de peroxissoma γ. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1= 0,006 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 = 0,002 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. P G C -1 α α α α (u ni d ad e ar b it rá ri a) 0.00 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 a ab b Resultados 62 Figura 16. Atividade da enzima fosfofrutoquinase. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1= 0,048 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 = 0,053 (valor de p para teste de tendência). Figura 17. Atividade do complexo piruvato desidrogenase. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1= 0,088 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 = 0,034 (valor de p para teste de tendência). C VD3 VD10 P F K ( n m ol / g d e te ci d o) 0 50 75 100 125 150 175 200 225 250 C VD3 VD10 P D H ( n m ol /g d e te ci d o) 0 250 300 350 400 450 a a a Resultados 63 Figura 18. Atividade da enzima citrato sintase. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1= 0,004 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 = 0,005 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Figura 19. Atividade do complexo respiratório II. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1< 0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 < 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 C S (u m ol /g d e te ci d o) 0 30 35 40 45 50 C VD3 VD10 C om pl ex o II ( u m ol /m g d e te ci do ) 0 2 3 4 5 6 7 8 9 a a b a a b Resultados 64 Figura 20. Atividade da enzima 3-hidroxiacil coenzyme A desidrogenase. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1< 0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 < 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Figura 21. Atividade do complexo respiratório II. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1< 0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 < 0,001 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C VD3 VD10 O H A D H ( n m ol / m g de p ro te ín a) 0 20 30 40 50 60 70 80 90 C VD3 VD10 L D H ( n m ol / m g de p ro te ín a) 0 180 200 220 240 260 280 a a b a a b Resultados 65 5.1.6 Variáveis ecocardiográficas de morfologia e função Os dados relativos às análises ecocardiográficas estão apresentados nas tabelas 6 e 7. Considerando os dados morfológicos, não houve diferença estatisticamente significante nas variáveis quando os 3 grupos foram comparados. Para as variáveis de função, apenas a frequência cardíaca foi maior no grupo VD10 comparado ao controle. As demais variáveis de função sistólica e diastólica não apresentaram diferença estatisticamente significante entre os grupos. Resultados 66 Tabela 6. Variáveis ecocardiográficas de morfologia do Experimento 1. Variável C (n=21) VD3 (n=22) VD10 (n=21) P1 P2 AE (mm) 4,19±0,50 4,26±0,65 4,01±0,52 0,346 0,323 AE/PC (mm/kg) 9,92±1,05 9,94±1,49 9,57±1,39 0,602 0,407 AE/AO 1,14 (1,07-1,22) 1,23 (1,09-1,36) 1,19 (1,13-1,22) 0,378 0,758 Área AE (cm2) 0,22±0,05 0,24±0,05 0,22±0,03 0,306 0,972 Área AE/PC (cm2/kg) 0,53±0,11 0,56±0,11 0,53±0,08 0,464 0,960 DDVE (mm) 7,22±0,52 7,30±0,58 7,31±0,47 0,837 0,581 DDVE/PC (mm/kg) 17,1±1,41 17,1±1,68 17,4±1,33 0,730 0,557 DSVE (mm) 3,00±0,65 3,11±0,58 3,12±0,52 0,764 0,507 EPP (mm) 1,35±0,16 1,41±0,24 1,44±0,19 0,366 0,163 ERPP 0,37 (0,35-0,40) 0,39 (0,35-0,44) 0,41 (0,37-0,43) 0,334 0,155 Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, n: número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol /kg de ração. AE: diâmetro do átrio esquerdo; PC: peso corporal; DDVE: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; DSVE: diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo; EPP: espessura da parede posteior; RPP: espessura relativa da parede posterior. P1: valor de p da ANOVA de 1 via ou Kruskal Wallis; P2: valor de p para teste de tendência. Resultados 67 Tabela 7. Variáveis ecocardiográficas de função do Experimento 1. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, n: números de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. FC: freqüência cardíaca; DC: débito cardíaco; IC: índice cardíaco; FE: fração de ejeção; Enc: porcentagem de encurtamento; TRIV: tempo de relaxamento isovolumétrico; TRIV/R-R: TRIV normalizado para a frequência cardíaca (TRIV dividido pela raiz quadrada do R-R); TDE: tempo de desaceleração da onda E. P1: valor de p da ANOVA de 1 via ou Kruskal Wallis; P2: valor de p para teste de tendência. Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Variável C (n=21) VD3 (n=22) VD10 (n=21) P1 P2 FC (bpm) 303 (284-333)a 292 (274-313)ab 282 (263-293)b 0,024 0,006 DC (ml/min) 76,9 (69,3-97,3) 76,5 (64,4-85,6) 82,0 (73,8-90,3) 0,463 0,549 IC (ml/min/g) 0,20±0,05 0,18±0,05 0,20±0,05 0,341 0,931 FE 0,92±0,04 0,92±0,03 0,92±0,04 0,949 0,750 Enc (%) 58,5±8,29 57,6±6,21 57,4±6,83 0,855 0,596 Onda E (cm/s) 84,0 (76,3-90,0) 84,0 (78,0-89,0) 84,0 (74,3-89,3) 0,953 0,824 Onda A (cm/s) 57,8±11,3 53,9±10,4 56,3±13,3 0,556 0,681 E/A 1,45 (1,31-1,59) 1,57 (1,39-1,68) 1,47 (1,22-1,80) 0,284 0,737 TRIV/R-R 49,7 (44,5-58,0) 51,0 (46,7-57,4) 52,4 (49,9-59,8) 0,514 0,252 TDE (ms) 50,1±7,57 49,8±5,65 49,8±6,29 0,988 0,887 Resultados 68 5.1.7 Variáveis morfométricas Os dados relativos às variáveis morfométricas estão apresentados na tabela 8. Como podemos observar não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos, para nenhuma das variáveis analisadas. . Resultados 69 Tabela 8. Variáveis morfométricas do Experimento 1 Dados expressos em média ± desvio padrão, n: números de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. PVE: peso do ventrículo esquerdo; PC: peso corporal; PVD: peso do ventrículo direito; PA: peso dos átrios. P1: valor de p da ANOVA de 1 via; P2: valor de p para teste de tendência. Variável C (n=21) VD3 (n=22) VD10 (n=21) P1 P2 PVE (mg) 838±80,8 823±85,4 843±90,9 0,743 0,846 PVE/PC (mg/g) 1,97±0,15 1,92±0,13 2,01± 0,19 0,160 0,435 PVD (mg) 223±36,0 231±36,3 231±35,4 0,733 0,499 PVD/PC (mg/g) 0,53±0,07 0,54±0,06 0,55±0,06 0,599 0,325 PA (mg) 35,5±12,5 43,2±13,3 40,6±14,2 0,188 0,235 PA/PC (mg/g) 0,084±0,029 0,101±0,033 0,097±0,034 0,230 0,215 Resultados 70 5.2 Experimento 2 5.2.1 Variáveis ecocardiográficas de morfologia e função do experimento 2 Como podemos observar na tabela 9, não houve diferença estatisticamente significante para o PC entre os grupos estudados. Com relação às variáveis ecocardiográficas de morfologia, houve maiores valores do AE (figura 22), tanto em valores absolutos como normalizado pelo Ao (figura 23) nos grupos suplementados com colecalciferol, quando comparados ao C-4. O aumento do AE e do AE/ Ao foi dose dependente. O AE normalizado pelo PC foi maior apenas no grupo VD3-4 comparado ao C-4. O vol AE em valores absolutos (figura 24) e normalizado pelo PC (figura 25) foi maior no grupo VD10-4 comparado ao C-4 e seu aumento foi dose dependente. Para a EPP (figura 26) e ERPP (figura 27), os valores foram maiores nos grupos suplementados com colecalciferol quando comparados ao C-4. O aumento de ambas as variáveis foi dose dependente. Para as demais variáveis de morfologia não houve diferença entre os grupos. Com relação às variáveis ecocardiográficas de função, apresentadas da tabela 10, não houve diferença estatisticamente significante para as variáveis de função sistólica FC, DC, IC, FE, Enc. Para as variáveis de função diastólica, o TDE apresentou menores valores no grupo VD10- 4 quando comparado ao VD3-4 (figura 28). A onda E tricúspide (figura 29) apresentou uma diminuição dose dependente. A razão entre as ondas E e A tricúspide foi menor no grupo VD10- 4 comparado ao C-4, sendo sua diminuição dose dependente (figura 30). Para as demais variáveis de função diastólica, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. A tabela 11 apresenta os dados ecocardiográficos avaliados por doppler tissular. A razão E/E’ tricúspide apresentou uma diminuição dose dependente. Para as demais variáveis de função, avaliadas pelo doppler tissular, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos. Resultados 71 Tabela 9. Variáveis ecocardiográficas de morfologia do Experimento 2. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, n: número de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol /kg de ração. AE: diâmetro do átrio esquerdo; PC: peso corporal; DDVE: diâmetro diastólico do ventrículo esquerdo; DSVE: diâmetro sistólico do ventrículo esquerdo; EPP: espessura da parede posteior; RPP: espessura relativa da parede posterior. P1: valor de p da ANOVA de 1 via ou Kruskal Wallis; P2: valor de p para teste de tendência. Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Variável C-4 (n=14) VD3-4 (n=16) VD10-4 (n=16) P1 P2 PC (g) 435 (388-466) 455 (410-467) 427 (405-447) 0,510 0,472 AE (mm) 3,80 (3,30-4,00)a 5,00 (4,40-5,20)b 4,45 (4,20-4,60)b <0,001 0,006 AE/PC (mm/kg) 8,90 (7,57-11,04)a 11.04 (9,57-12,30)b 10,30 (9,84-10,79)ab 0,023 0,053 AE/Ao 1,10±0,15a 1,36±0,20b 1,29±0,17b <0,001 0,004 Vol AE (cm3) 0,053 (0,057-0,060)a 0,067 (0,051-0,073)ab 0,073 (0,060-0,089)b 0,002 <0,001 Vol AE/PC (cm3/kg) 0,12 (0,11-0,14)a 0,14 (0,13-0,16)ab 0,18 (0,15-0,22)b 0,002 <0,001 DDVE (mm) 7,23±0,15 6,98±0,14 7,05±0,14 0,482 0,405 DDVE/PC (mm/kg) 16,8 (15,6-17,5) 15,8 (15,4-16,7) 16,5 (15,7-17,2) 0,241 0,902 DSVE (mm) 3,35 (3,10-3,60) 3,30 (3,20-3,60) 3,45 (3,10-4,00) 0,923 0,782 EPP (mm) 1,30 (1,30-1,50)a 1,80 (1,75-2,00)b 1,80 (1,65-1,80)b <0,001 <0,001 ERPP 0,39±0,001a 0,52±0,02b 0,50±0,02b <0,001 <0,001 Resultados 72 Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, n: números de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. FC: freqüência cardíaca; DC: débito cardíaco; IC: índice cardíaco; FE: fração de ejeção; Enc: porcentagem de encurtamento; TRIV: tempo de relaxamento isovolumétrico; TRIV/R-R: TRIV normalizado para a frequência cardíaca (TRIV dividido pela raiz quadrada do R-R); TDE: tempo de desaceleração da onda E mitral. P1: valor de p da ANOVA de 1 via ou Kruskal Wallis; P2: valor de p para teste de tendência. Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. * para o TRIV/R-R o número de animais por grupo é de: C-4=13; VD3-4=12; VD10-4=14. ** para o TDE o número de animais por grupo é de: C- 4=10; VD3-4=7; VD10-4=8. Tabela 10. Variáveis ecocardiográficas de função do Experimento 2. Variável C-4 (n=14) VD3-4 (n=16) VD10-4 (n=16) P1 P2 FC (bpm) 274±9,06 282±8,48 275±8,48 0,776 0,959 DC (ml/min) 94,6±5,88 97,7±5,50 97,5±5,50 0,934 0,757 IC (ml/min/g) 0,20 (0,19-0,26) 0,22 (0,20-0,25) 0,20 (0,18-0,29) 0,835 0,969 FE 0,90 (0,87-0,92) 0,89 (0,87-0,91) 0,88 (0,84-0,90) 0,465 0,219 Enc (%) 53,2 (49,3-56,3) 52,6 (49,3-55,0) 50,4 (46,2-53,9) 0,465 0,219 Onda E mitral (cm/s) 83,5 (79,0-89,0) 79,0 (76,0-85,5) 82,5 (68,5-88,0) 0,638 0,456 Onda A mitral (cm/s) 53,5 (45,0-60,0) 45,5 (41,0-52,0) 54,5 (45,5-57,5) 0,261 0,864 E/A mitral 1,59±0,100 1,69±0,094 1,490,094 0,440 0,525 TRIV/R-R* 57,3 (47,0-63,4) 57,6 (45,9-64,3) 63,2 (56,2-65,4) 0,388 0,224 TDE (ms)** 56,2±2,30ab 63,9±2,75a 50,8±2,57b 0,026 0,197 Onda E tricúspide (cm/s) 40,5 (29,0-48,0) 32,0 (29,5-37,5) 30,5 (25,0-36,5) 0,078 0,026 Onda A tricúspide (cm/s) 50,0±14,0 51,2±14,9 56,1±9,9 0,394 0,207 E/A tricúspide 0,67 (0,57-1,28)a 0,58 (0,52-0,71)ab 0,53 (0,47-0,60)b 0,028 0,006 Resultados 73 Tabela 11. Variáveis ecocardiográficas de função por doppler tissular do Experimento 2. Dados expressos em média ± desvio padrão ou mediana e percentil 25 e 75, n: números de animais em cada grupo. C: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. Onda A’ mitral: deslocamento diastólico tardio do anel mitral; Onda E’mitral: pico de velocidade de deslocamento diastólico inicial do anel mitral; Onda S’mitral: velocidade máxima de deslocamento sistólico do anel mitral; Onda A’tricúspide: deslocamento diastólico tardio do anel tricúspide; Onda E’tricúspide: pico de velocidade de deslocamento diastólico inicial do anel tricúspide; Onda S’tricúspide: velocidade máxima de deslocamento sistólico do anel tricúspide. P1: valor de p da ANOVA de 1 via ou Kruskal Wallis; P2: valor de p para teste de tendência. Variável C-4 (n=14) VD3-4 (n=16) VD10-4 (n=16) P1 P2 Onda A` mitral (cm/s) 4,5 (4,0-6,0) 5,0 (4,0-6,7) 5,2 (5,0-5,8) 0,420 0,204 Onda E` mitral (cm/s) 4,0 (4,0-5,0) 5,0 (4,0-5,4) 4,0 (3,8-4,9) 0,129 0,378 Onda S` mitral (cm/s) 5,52±1,11 5,36±0,72 5,11±0,64 0,408 0,188 Onda A` tricúspide (cm/s) 4,26±1,17 4,31±1,38 4,56±1,81 0,837 0,529 Onda E` tricúspide (cm/s) 4,00 (3,00-4,00) 4,00 (3,25-4,45) 4,05 (3,30-5,00) 0,698 0,415 Onda S` tricúspide (cm/s) 5,11±1,04 4,72±0,88 5,46±0,58 0,055 0,257 E’/A’ mitral 0,81 (0,75-1,33) 0,87 (0,69-1,49) 0,78 (0,65-0,86) 0,217 0,134 E’/A’tricúspide 0,90 (0,75-1,25) 0,64 (0,63-1,33) 0,78 (0,64-1,71) 0,941 0,917 E/E´ mitral 18,9±5,29 16,1±3,45 18,9±4,59 0,147 0,995 E/E´ tricúspide 10,6±3,33 8,8±3,13 8,0±2,62 0,071 0,025 Resultados 74 Figura 22. Diâmetro do átrio esquerdo. C-4: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3-4: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10-4: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1< 0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 = 0,006 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. Figura 23. Diâmetro do átrio esquerdo normalizado pelo diâmetro da aorta. C-4: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3-4: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10-4: grupo suplementado com 10.000UI de colecalciferol/kg de ração. P1< 0,001 (valor de p ANOVA de 1 via); P2 = 0,004 (valor de p para teste de tendência). Letras diferentes indicam diferença significante entre os grupos. C-4 VD3-4 VD10-4 A E / A o 0.00 0.75 0.90 1.05 1.20 1.35 1.50 1.65 1.80 C-4 VD3-4 VD10-4 A E ( m m ) 0.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 b b a a b b Resultados 75 Figura 24. Volume do átrio esquerdo. C-4: grupo controle, sem suplementação de colecalciferol; VD3-4: grupo suplementado com 3.000UI de colecalciferol/kg de ração; VD10-4: grupo suplementado com 10.000UI