UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL ESTUDOS DE VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Chrysoperla externa HAGEN, 1861 (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa Bióloga 2013 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA - UNESP CÂMPUS DE JABOTICABAL ESTUDOS DE VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Chrysoperla externa HAGEN, 1861 (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa Orientador: Prof. Dr. Sergio Antonio De Bortoli Coorientadora: Profa. Dra. Adriana Coletto Morales Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Entomologia Agrícola) 2013 Barbosa, Nara Cristina Chiarini Pena B238e Estudos de variabilidade genética em populações de Chrysoperla externa Hagen, 1861 (Neuroptera: Chrysopidae) do estado de São Paulo, Brasil / Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa. – – Jaboticabal, 2013 vi, 75 f. : il. ; 29 cm Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2013 Orientador: Sergio Antonio De Bortoli Coorientadora: Adriana Coletto Morales Banca examinadora: Odair Aparecido Fernandes, Vera Nisaka Solferini Bibliografia 1. ISSR. 2. COI. 3. Crisopídeos. 4. Vegetação nativa. 5. Agroecossistema. 6. Controle biológico. I. Título. II. Jaboticabal- Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias. CDU 595.74 Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal. DADOS CURRICULARES DA AUTORA Nara Cristina Chiarini Pena Barbosa, nascida em Alfenas - MG em 29 de janeiro de 1988. Graduada em Ciências Biológicas (Bacharelado), ênfase em Ciências Ambientais, pela Universidade Federal de Alfenas (UNIFAL-MG), em 30 de janeiro de 2011. Foi voluntária/bolsista do Programa de Educação Tutorial (PET – Biologia) da mesma instituição, no período de janeiro de 2009 a dezembro de 2010. Durante a graduação, foi estagiária no Laboratório de Biologia Molecular Aplicada à Biodiversidade, sob orientação da Profa. Dra. Tereza Cristina Orlando. Em março de 2011, ingressou no curso de Mestrado do programa de pós-graduação em Agronomia (Entomologia Agrícola), na Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” (UNESP/FCAV), no qual permaneceu até junho de 2013, sendo bolsista da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) no período de março de 2011 a fevereiro de 2013. Tudo aquilo que o homem ignora não existe para ele. Por isso o universo de cada um, se resume ao tamanho de seu saber. Albert Einstein Dedico à minha família, por ser minha base e, de modo especial, ao Professor Sérgio de Freitas, que sempre se fará presente por meio de seus ensinamentos e enquanto houver alguém buscando responder “O que? Por quê? Para que?”... até mesmo para as coisas mais simples... AGRADECIMENTOS Ao Prof. Sérgio de Freitas, que de um modo todo particular, sempre me encorajou e me ensinou a enxergar a vida com os olhos de um “cientista”. Palavras nunca serão suficientes para descrever minha admiração e explicar sua falta, não apenas como orientador, mas também como amigo. À Profa. Adriana Coletto Morales, por tornar possível a realização deste trabalho, me orientando, ensinando e me incentivando a buscar sempre o melhor. Ao Prof. Sergio Antonio De Bortoli, por todo apoio e compreensão. À Profa. Janete Apparecida Desidério e ao Prof. Manoel Victor Franco Lemos, por cederem o Laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada, para a realização das eletroforeses. Ao Programa de pós-graduação em Agronomia (Entomologia Agrícola) e à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – FCAV/UNESP, pela oportunidade e por toda a estrutura disponibilizada para a realização desde trabalho. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão da bolsa e à Fundação de Amparo à Pesquisa de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio financeiro em parte do projeto. Agradeço ainda a Deus, por me dar serenidade e discernimento para escolher o melhor caminho sempre. Aos meus pais, Honorato e Maria do Carmo, por todo o amor dispensado a mim e por nunca medirem esforços para que eu alcançasse meus objetivos. Aos meus irmãos, José Henrique, Márcia Cristina e José Renato e minha cunhada Aline, por todo o apoio, conselhos e incentivo. Aos meus avós (aqui ou não mais entre nós), pelos exemplos, orações e desejos de que eu vencesse mais essa etapa. Aos colegas e amigos do Laboratório de Biossistemática, Biologia e Ecologia Molecular de Neurópteros: André Maurício Múscari, Francisco José Sosa Duque, Amália Torrezan Lopes, Éllen Carbognin, Patrícia Forli Schwartz Freire, Caleb Califre Martins, Mariah Valente Baggio e aos “agregados” Luciana Bedore e Antônio Rovere, pela amizade e por fazerem os momentos, não só no laboratório, tão agradáveis e inesquecíveis. Aos eternos amigos: Josiane de Fátima Lourenço, Gabriela Meireles, Josiane Ferreira Pires, Denise Helena Moreira, Natalia Ingrid Oliveira da Silva, Marina Acero Angotti, Liliane Gonçalves Vila Nova, Luiz Carlos Barbosa, Vinícius Pereira Silva e Jader Augusto Costa Pereira, que mesmo à distância sempre permaneceram ao meu lado, me apoiando, aconselhando ou simplesmente torcendo por mim. A todos os colegas do mestrado, em especial à Letícia Henrique de Azevedo, pela amizade e por todos os “desesperos” compartilhados e à Maria Flora de Almeida Tango, André Luís Martins e Fabiana Freitas por todas as conversas e companhia durante esses anos. Aos funcionários da FCAV/UNESP e a todos que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho e que eu não tenha citado, por mero esquecimento. i SUMÁRIO Página RESUMO ................................................................................................................ ABSTRACT ............................................................................................................. LISTA DE TABELAS ............................................................................................... LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... CAPÍTULO 1 - CONSIDERAÇÕES GERAIS .......................................................... Introdução ............................................................................................................ Revisão de Literatura ........................................................................................... Posição sistemática, distribuição geográfica e utilização de Chrysoperla externa no controle biológico .................................................................................. Variação genética e estrutura populacional .................................................... Fontes de variação ..................................................................................... Fatores que alteram as frequências gênicas ............................................. Marcadores moleculares ................................................................................. Referências .......................................................................................................... CAPÍTULO 2 - VARIABILIDADE GENÉTICA COMPARADA EM POPULAÇÕES DE Chrysoperla externa (HAGEN, 1861) (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) ....... Resumo ................................................................................................................ Introdução ............................................................................................................ Material e Métodos ............................................................................................... Municípios amostrados ................................................................................... Extração do DNA total ..................................................................................... ISSR-PCR ....................................................................................................... Escolha dos “primers” e amplificação ........................................................ Análise dos dados ...................................................................................... COI .................................................................................................................. Amplificação e sequenciamento ................................................................ Análise dos dados ...................................................................................... Resultados e Discussão ....................................................................................... ISSR-PCR ....................................................................................................... iii iv v vi 1 1 2 2 4 4 5 7 8 19 19 19 21 21 22 22 22 23 24 24 25 25 25 ii Página COI .................................................................................................................. Referências .......................................................................................................... CAPÍTULO 3 - EVIDÊNCIA DE ESTRUTURA GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Chrysoperla externa (HAGEN, 1861) (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) ....... Resumo ................................................................................................................ Introdução ............................................................................................................ Material e Métodos ............................................................................................... Áreas amostradas e coleta ............................................................................. Criação em laboratório .................................................................................... Extração do DNA total ..................................................................................... Escolha dos “primers” e amplificação ............................................................. Análise dos dados ........................................................................................... Resultados ........................................................................................................... Discussão ............................................................................................................. Referências .......................................................................................................... CAPÍTULO 4 – CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................... 31 37 43 43 43 45 45 45 46 47 48 49 65 69 75 iii ESTUDOS DE VARIABILIDADE GENÉTICA EM POPULAÇÕES DE Chrysoperla externa HAGEN, 1861 (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) DO ESTADO DE SÃO PAULO, BRASIL RESUMO – A família Chrysopidae é considerada a maior da ordem Neuroptera, sendo constituída por predadores generalistas que se alimentam de diversas espécies consideradas pragas agrícolas. A espécie Chrysoperla externa encontra-se tanto em ambientes de vegetação nativa quanto em áreas de cultivo agrícola e possui várias características que a tornam um potencial agente de controle biológico. Entretanto, a capacidade de uma espécie se adaptar à ambientes exóticos, como agroecossistemas, está relacionada à sua variabilidade genética. Assim, os objetivos desse trabalho foram investigar e comparar a variabilidade genética de C. externa em populações estabelecidas no estado de São Paulo, em áreas de vegetação nativa e agroecossistemas, bem como analisar os efeitos da deriva genética e do gargalo populacional sobre essas populações. Foram utilizadas 13 populações coletadas em agroecossistemas, três em áreas nativas e uma linhagem mantida em laboratório sob forte endogamia. Para todas as populações, foram utilizados marcadores moleculares ISSR e para as populações coletadas em agroecossistemas, empregou-se também o gene mitocondrial COI. Altos níveis de variabilidade genética foram observados em todas as populações, o que configura uma característica da espécie. A correlação entre as distâncias genética e geográfica foi baixa, havendo grande compartilhamento de haplótipos entre todas as populações de agroecossistemas. Para essas populações, o gene mitocondrial COI indicou ausência de estrutura genética, enquanto para o marcador ISSR esta pôde ser observada, indicando que as populações estabelecidas em agroecossistema formavam uma única unidade populacional que vem se diferenciando. Quando todas as populações foram analisadas em conjunto, houve a discriminação em três grupos: nativo, agroecossistemas e laboratório, evidenciando a existência de estrutura genética. As populações nativas apresentaram um número de locus polimórficos superior às demais, entretanto os grupos não diferiram significativamente em relação aos índices de diversidade genética, o que indica isolamento recente entre as populações. Do mesmo modo, a geração parental apresentou maior polimorfismo quando comparada à F2, porém com índices de diversidade não significativos. Dessa forma, o maior polimorfismo associado às áreas de vegetação nativa sugere perda de alelos nos agroecossistemas, decorrente de gargalo populacional e efeito fundador, entretanto o rápido crescimento populacional nas áreas agrícolas pode ter contribuído para a manutenção da heterozigosidade nessas populações. Foi observado baixo fluxo gênico entre os ambientes nativos e a matriz. Assim, podemos concluir que a elevada variabilidade genética de C. externa pode contribuir para a sua utilização como agente de controle biológico e que a preservação de áreas nativas próximas aos agroecossistemas, bem como de corredores que liguem os remanescentes é de grande importância, a fim de impedir que os efeitos da deriva, sobre a variabilidade genética, afetem a adaptabilidade dos espécimes nas áreas agrícolas. Palavras-chave: Agroecossistema, COI, controle biológico, crisopídeos, ISSR, vegetação nativa iv STUDIES OF GENETIC VARIABILITY IN POPULATION OF Chrysoperla externa HAGEN, 1861 (NEUROPTERA: CHRYSOPIDAE) OF THE STATE OF SÃO PAULO, BRAZIL ABSTRACT – The family Chrysopidae comprises the highest number of species in the order Neuroptera, consists of generalist predators that feed on several agricultural pest species. The species Chrysoperla externa is found in native vegetation and agricultural crops and has several features that make it a potential biological control agent. However, the ability of a species to adapt to exotic environments, such as agroecosystems, is related to the genetic variability. The aims of this study were to investigate and compare the genetic variability of C. externa in established populations in the state of São Paulo, in areas of native vegetation and agroecosystems, as well as to analyze the effects of genetic drift and bottleneck on these populations. We used 13 populations collected in agroecosystems, three in native areas and one lineage maintained in the laboratory under strong inbreeding. ISSR molecular markers were used for all populations, but for the populations collected in agroecosystems we used also the mitochondrial COI gene. High levels of genetic variability were observed in all populations, which is one characteristic of the specie. The correlation between genetic and geographic distances was low and a large number of haplotypes was shared among all populations of agroecosystems. For populations of agroecosystems, the mitochondrial COI gene showed no genetic structure, whereas the ISSR marker demonstrated genetic structure, indicating that the established populations in agroecosystems formed a single population unit, which has been under differentiation. When all populations were analyzed together, there was discrimination in three groups: native, agroecosystems and laboratory, showing the existence of genetic structure. The native populations showed a number of polymorphic loci superior to others, but the groups did not differ significantly with respect to the indices of genetic diversity, which indicates recent isolation between populations. Similarly, the parent generation has higher polymorphism compared to F2, but with no significant diversity index. Thus, the higher polymorphism associated with native vegetation suggests loss of alleles in agroecosystems due to bottleneck and founder effect, however the rapid population growth in the agricultural areas may have contributed to the maintenance of heterozygosity in these populations. Was observed low gene flow between native environments and matrix. Thus, we conclude that the high genetic variability of C. externa can contribute to its use as a biological control agent. Also, the preservation of natural areas close to agroecosystems and corridors linking remnant forest is of great importance to prevent the effects of drift on genetic variability and affect the adaptability of specimens in agricultural areas. Keywords: Agroecosystem, COI, biological control, green lacewings, ISSR, native vegetation v LISTA DE TABELAS Página CAPÍTULO 2 Tabela 1. Municípios amostrados, coordenadas geográficas, número de espécimes analisados e número de identificação, tipo de cultura nos pontos e data de coleta. ......................................................................................................... Tabela 2. Temperatura de anelamento específica por “primer” ISSR e sequência de nucleotídeos ....................................................................................................... Tabela 3. Índices de diversidade genética dentro das populações de C. externa .. Tabela 4. Área e tipo de vegetação natural encontrada nos municípios amostrados ............................................................................................................. Tabela 5. Análise da variância molecular para as populações de C. externa para os diferentes “primers” ISSR ................................................................................... Tabela 6. Distância genética entre as populações de C. externa baseada nos marcadores ISSR e distância geográfica entre os municípios ................................ Tabela 7. Lista de haplótipos do mtDNA (COI) de C. externa ................................ Tabela 8. Medidas de variabilidade das populações de C. externa ........................ Tabela 9. Distância genética entre as populações de C. externa baseada no mtDNA COI e distância geográfica entre os municípios ......................................... CAPÍTULO 3 Tabela 1. Municípios amostrados, coordenadas geográficas, tipo de vegetação nos pontos amostrados, data de coleta, número de indivíduos analisados e número de identificação ........................................................................................ Tabela 2. Temperatura de anelamento específica por “primer” ISSR e sequência de nucleotídeos ....................................................................................................... Tabela 3. Índices de diversidade nas populações de C. externa ............................ Tabela 4. Análise da variância molecular para as populações de C. externa e índices de fixação ................................................................................................... Tabela 5. Distância genética entre as populações de C. externa e distância geográfica entre os municípios ............................................................................... Tabela 6. Análise de Clados Aninhados ................................................................. Tabela 7. Testes de neutralidade para as populações de C. externa ..................... 21 23 27 28 29 30 31 32 34 48 48 51 52 53 54 65 vi LISTA DE FIGURAS Página CAPÍTULO 2 Figura 1. Mapa dos municípios amostrados no estado de São Paulo .................... Figura 2. Exemplo de bandas de ISSR em gel de agarose 2% .............................. Figura 3. “Mismatch Distribution” para as populações de C. externa ..................... Figura 4. Rede haplotípica aninhada, para sequências de COI de C. externa ....... CAPÍTULO 3 Figura 1. Mapa dos municípios amostrados no estado de São Paulo .................... Figura 2. Exemplo de bandas de ISSR em gel de agarose 2% .............................. Figura 3. Rede baseada nos padrões de bandeamento obtidos pelo “primer” UBC 809 .................................................................................................................. Figura 4. Rede baseada nos padrões de bandeamento obtidos pelo “primer” UBC 849 .................................................................................................................. Figura 5. Rede baseada nos padrões de bandeamento obtidos pelo “primer” UBC 856 .................................................................................................................. Figura 6. Rede baseada nos padrões de bandeamento obtidos pelo “primer” UBC 836 .................................................................................................................. Figura 7. Rede baseada nos padrões de bandeamento obtidos pelo “primer” UBC 820 .................................................................................................................. Figura 8. Rede baseada nos padrões de bandeamento obtidos pelo “primer” UBC 891 .................................................................................................................. Figura 9. Rede baseada nos padrões de bandeamento obtidos pelo “primer” UBC 880 .................................................................................................................. Figura 10. Rede baseada nos padrões de bandeamento obtidos pelo “primer” UBC 889 .................................................................................................................. 22 26 33 35 46 50 57 58 59 60 61 62 63 64 1 CAPÍTULO 1 - Considerações gerais Introdução A família Chrysopidae é composta por insetos pertencentes à ordem Neuroptera e possui mais de 1.200 espécies descritas (FREITAS; PENNY, 2001). Crisopídeos são holometábolos e apresentam hábito alimentar distintos, sendo as larvas predadoras generalistas e os adultos predadores ou consumidores de pólen e néctar. Estão associados a várias culturas, alimentando-se de pulgões, cochonilhas, mosca-branca, além de ovos e lagartas de diversos lepidópteros (FREITAS, 2001). Dentre os crisopídeos, Chrysoperla externa (Hagen, 1861) é considerada uma das espécies mais comum das Américas (BROOKS, 1994), possui alta capacidade de predação e reprodução e é multiplicada com sucesso em laboratório (FREITAS, 2001), fazendo desta, um potencial agente de controle biológico (ALBUQUERQUE; TAUBER; TAUBER, 1994). Entretanto, é essencial que os indivíduos criados em laboratório sobrevivam e sejam eficientes no controle de pragas, uma vez que em áreas agrícolas os espécimes são expostos às condições distintas ou adversas do novo ambiente. Desse modo, a fim de evitar danos ambientais e econômicos, os estudos genéticos populacionais se tornam extremamente importantes, uma vez que a capacidade de suportar as pressões ambientais está diretamente associada com a variabilidade genética da espécie (BAKER; LOXDALE; EDWARDS, 2003; HUFBAUER; RODERICK, 2005). A perda de variabilidade é um dos problemas associados à introdução de espécimes em ambientes exóticos e à manutenção em condições estáveis em laboratório (MACKAUER, 1976). As variações genéticas observadas nas espécies são geradas por meio de mutações ou por recombinação, enquanto processos como deriva genética, seleção e fluxo gênico podem alterar a frequência dos alelos nas populações, levando à diferenciação entre elas. Assim, informações históricas valiosas sobre o comportamento genético das populações frente à redução e isolamento de áreas nativas, podem ser obtidas em estudos genéticos. Diferentes métodos podem ser utilizados para se realizar estudos genéticos populacionais, entre eles a análise do DNA nuclear ou mitocondrial. A técnica PCR- 2 ISSR é um dos métodos que tem sido amplamente utilizada em estudos de variabilidade genética e estrutura populacional de insetos (BORBA et al., 2005; ROUEX et al., 2007; SOUZA et al., 2008; KEHLMAIER; ASSMANN, 2010; TAYLOR; DOWNIE; PATERSON, 2011). Os marcadores moleculares ISSR ('Inter Simple Sequence Repeat') são formados essencialmente por sequências de DNA não codificante, entre as regiões microssatélites, de modo que é gerado um grande número de bandas potencialmente polimórficas (REDDY; SARLA; SIDDIQ, 2002). Do mesmo modo, a região da Citocromo Oxidase, subunidade I (COI), tem sido utilizada em estudos de variabilidade genética, estrutura populacional, filogenia e identificação de insetos (SMITH-CALDAS et al., 2001; WINTERTON; FREITAS, 2006; ASOKAN et al., 2007; VELONA et al., 2011). O DNA mitocondrial apresenta algumas particularidades que favorecem sua utilização, entre elas, o fato de estar presente em grande quantidade nas células e de ser purificado e amplificado mais facilmente que o DNA nuclear (LOXDALE; LUSHAI, 1998). Assim, os objetivos desse trabalho foram investigar e comparar a variabilidade genética de populações de C. externa estabelecidas no estado de São Paulo, por meio de marcadores moleculares ISSR e do gene mitocondrial COI, bem como analisar os efeitos da deriva genética e do gargalo populacional sobre essas populações. Revisão de Literatura Posição sistemática, distribuição geográfica e utilização de Chrysoperla externa no controle biológico A família Chrysopidae é considerada a maior da ordem Neuroptera, compreendendo mais de 1.200 espécies distribuídas em cerca de 80 gêneros e subgêneros (FREITAS, 2002). Esta família se divide nas subfamílias Apochrysinae, Chrysopinae e Nothochrysinae, sendo que Chrysopinae apresenta o maior número de espécies, as quais estão distribuídas em quatro tribos: Ankylopterigini, Belonopterigini, Chrysopini e Leucochrysini. A tribo Chrysopini possui trinta gêneros e sete subgêneros (BROOKS; BARNARD, 1990), entre eles o gênero Chrysoperla 3 Steinmann, 1964. Este é um dos gêneros mais estudados e apresenta 36 espécies descritas, das quais apenas quatro ocorrem no Brasil: Chrysoperla defreitasi Brooks, 1994, Chrysoperla externa (Hagen, 1861), Chrysoperla genanigra Freitas, 2003 e Chrysoperla raimundoi Freitas e Penny, 2001. Os crisopídeos possuem ampla distribuição geográfica, não tendo sido registrados apenas na Antártica (BROOKS; BARNARD, 1990). A espécie C. externa é considerada uma das mais comuns das Américas, já tendo sido observada desde o sul dos EUA até a Argentina (BROOKS, 1994). No Brasil essa espécie ocorre em todas as regiões, sendo observada tanto em agroecossistemas como em ambientes naturais. Adams e Penny (1985) registraram sua presença nos estados do Amazonas, Rio de Janeiro, Rondônia, Roraima, Santa Catarina e Rio Grande do Sul. Foi ainda encontrada nos estados do Paraná (CARDOSO et al., 2003; QUEIROZ et al., 2009; CARNEIRO et al., 2010), Goiás (SILVA et al., 1995), Mato Grosso (SCOMPARIN, 1997), Bahia (RIBEIRO et al., 2009), Paraíba (SILVA et al., 2007), Pernambuco (BARBOSA et al., 2005), Rio Grande do Norte (BEZERRA et al., 2010), Minas Gerais (ADAMS; PENNY, 1985; KUMAGAI, 2002; SILVA et al., 2006; SOUZA; COSTA; LOUZADA, 2008; COSTA; SOUZA; FREITAS, 2010), São Paulo (ADAMS; PENNY, 1985; BELORTE; RAMIRO; FARIA, 2004; RAMIRO; FARIA, 2006; QUEIROZ et al., 2009) e no Distrito Federal (MEDEIROS, 2009). A espécie C. externa é considerada um potencial agente de controle biológico em programas de manejo em toda América Central e do Sul (ALBUQUERQUE; TAUBER; TAUBER, 1994), devido à sua alta capacidade de predação e potencial reprodutivo e sua ampla distribuição geográfica, bem como pelo fato de ser facilmente multiplicada em laboratório, demandando poucos esforços, uma vez que os adultos não necessitam de presas (FREITAS, 2001). Além disso, não são afetados por alguns inseticidas, de modo que podem ser utilizados em sistemas de Manejo Integrado de Pragas (MIP) (GODOY et al., 2004; MOURA et al., 2009; CASTILHOS et al., 2011). Os adultos se alimentam de pólen, néctar e “honeydew”, enquanto as larvas são predadoras generalistas e se alimentam de diversos insetos considerados pragas agrícolas (FREITAS, 2001). Em condições de laboratório, pôde-se observar o elevado consumo de Bemisia tabaci (Gennadius, 1889) (ADRIANO et al., 2010), 4 Schizaphis graminum (Rondani, 1852) (FIGUEIRA; LARA; CRUZ, 2002), Hyadaphis foeniculi (Passerini, 1860) (LIRA; BATISTA, 2006), larvas de Alabama argillacea (Hübner, 1822) (SILVA; CARVALHO; SOUZA, 2002), Leucoptera coffeella (Guérin- Mènéville e Perrottet, 1842) (ECOLE et al., 2002) e Phyllocnistis citrella Stainton, 1856 (RIBEIRO et al., 2007), Parlatoria cinerea Doane e Hadden, 1909 (GRAVENA; YAMAMOTO; FERNANDES, 1993), Planococcus citri (Risso, 1813) (BEZERRA et al., 2006), entre outras. Estudos em casa de vegetação têm sido realizados a fim de verificar a eficiência de predação de C. externa em cultivos protegidos. Nestas condições, Auad et al. (2007) observaram a redução de 40% a 50% de ninfas de Bemisia tabaci biótipo B em tomateiro. Do mesmo modo, Costa (2011) observou que a liberação, seja de ovos ou larvas de C. externa, é eficiente no controle de Aphis gossypii Glover, 1877 em cultivo protegido de pepino, sendo relatada a redução de 100% das ninfas em até 72 horas, quando na proporção predador/presa de 1:4. Em campo, encontram-se associados a diversas culturas, como algodão (SILVA et al., 1995; BARROS et al., 2006; RAMIRO; FARIA, 2006; SILVA et al., 2007), café (RIBEIRO, 2005; SILVA et al., 2006), citros (SOUZA; CARVALHO, 2002), manga (BARBOSA et al., 2005; RIBEIRO et al., 2009) e soja (BELORTE; RAMIRO; FARIA, 2004; CARNEIRO et al., 2010), onde muitas vezes é considerado o predador mais abundante. Variação genética e estrutura populacional Fontes de variação Dentro de uma mesma espécie, os indivíduos podem apresentar sequências variantes de DNA, denominadas haplótipos, e os polimorfismos genéticos podem ser gerados por meio de mutações ou por recombinação. Mutações são definidas como alterações no material genético e podem afetar apenas a sequência ou também a organização, regulação ou função de um gene (HOY, 2003). As sequências são alteradas por inserções e deleções de nucleotídeos, inversão de segmentos de DNA ou por mutações pontuais, ou seja, pela substituição de um nucleotídeo. Esta substituição é dita uma transição quando ocorre entre bases nitrogenadas da 5 mesma classe (purina por purina ou pirimidina por pirimidina) e uma transversão quando a substituição se dá entre bases de classes diferentes (purina por pirimidina e vice-versa), sendo as transições mais frequentes (KIMURA, 1980). Quando ocorrem em regiões intergênicas, as mutações geralmente são silenciosas, pois não afetam a sequência de aminoácidos; entretanto, em regiões gênicas também pode haver mutações silenciosas devido à degeneração do código genético. As mutações podem ocorrer por erros na replicação do DNA ou ser induzidas por agentes químicos ou físicos e podem ocorrer espontaneamente em cada divisão celular, na proporção de uma vez a cada 108 pares de base (HOY, 2003). As variações no material genético de uma espécie também são geradas por recombinação, a qual pode ocorrer na reprodução sexuada e na formação de gametas. Por meio da reprodução sexuada é possível unir gametas com conteúdo genético diferentes, resultando na formação de uma prole geneticamente distinta dos parentais. Já na formação dos gametas dois processos podem atuar no aumento da variabilidade, a segregação independente dos cromossomos não homólogos e a recombinação dos cromossomos homólogos. Dessa forma, os cromossomos são separados aleatoriamente durante a meiose, podendo formar gametas constituídos tanto de cromossomos herdados do pai quanto da mãe, bem como de cromossomos que possuam segmentos de ambos, devido ao “crossing- over”, processo no qual os cromossomos homólogos, pareados durante a meiose, podem trocar segmentos, gerando novas combinações (JANSSEENS, 1909). Em insetos, existem ainda vários tipos de elementos transponíveis (TE), segmentos de DNA que podem se mover de uma região à outra no cromossomo, muitas vezes carregando consigo genes próximos. Frequentemente estão presentes em múltiplas cópias e correspondem à grande parte do DNA repetitivo dos insetos, podendo alterar as sequências de DNA de diferentes formas (FUTUYMA, 2005; PALOMEQUE; LORITE, 2008). Fatores que alteram as frequências gênicas Para que ocorra diferenciação genética entre as populações, é necessário que haja variação entre os indivíduos, entretanto não é preciso que ocorram novas 6 mutações ou recombinações, de modo que alguns processos, como a deriva genética, a seleção e o fluxo gênico, podem levar a diferenciação genética, pois alteram a frequência dos alelos nas populações (RIDLEY, 2006). A deriva genética aleatória corresponde à flutuação, ao acaso, na frequência de alelos ou haplótipos (WRIGHT, 1929). Assim, a variação dentro das populações é reduzida e as diferenças entre elas podem aumentar, quando alelos são fixados ou perdidos (KING; JUKES, 1969). Diferentemente da seleção, a deriva genética não é adaptativa, de modo que alelos que não representam incremento adaptativo podem ser fixados, enquanto alelos com maior valor adaptativo são perdidos (WRIGTH, 1982). Os efeitos da deriva genética são mais intensos sobre populações pequenas, especialmente quando a população sofre uma redução abrupta em seu tamanho efetivo, conhecido com gargalo populacional (WRIGHT, 1929; KOMAI; EMURA, 1955). Quando uma nova população é formada a partir de poucos indivíduos, a deriva genética é descrita como efeito fundador (MAYR, 1963), resultando em redução da variabilidade em locus neutros (NEI; MARUYAMA; CHAKRABORTY, 1975). A seleção natural, por sua vez, pode ser definida como qualquer diferença consistente no “fitness” entre espécimes fenotipicamente distintos, de modo que alelos que confiram maior sucesso na sobrevivência e reprodução têm suas frequências aumentadas gradualmente a cada geração, tornando a população mais apta a sobreviver e se reproduzir no ambiente (FISHER, 1999). A seleção natural pode favorecer tanto os fenótipos intermediários, ou seja, os heterozigotos, quanto os fenótipos extremos, homozigotos, levando à fixação de alelos e consequentemente à perda da variabilidade (RUEFFLER et al., 2006). Por outro lado, o fluxo gênico é considerado uma força homogeneizadora, pois consiste na troca de alelos entre as populações, mantendo semelhantes tanto a composição genética quanto a frequência alélica (MAYR, 1970; SLATKIN, 1987). Quando não há fluxo gênico ou este é limitado, as populações tendem a se diferenciar devido aos eventos de mutação, deriva genética e/ou seleção, sendo o agrupamento de populações diferenciadas conhecido como estrutura populacional (SLATKIN, 1987). O baixo fluxo gênico entre as populações pode estar associado à 7 falta de conectividade entre elas. Características da paisagem podem favorecer ou dificultar o movimento de insetos, de modo que, em ambientes fragmentados, o tipo e a qualidade da matriz influenciam na taxa de migração e fluxo gênico (HUNTER, 2002). Marcadores moleculares Estudos genéticos populacionais podem ser realizados por diferentes métodos, com análises de proteínas, RNA ou DNA, seja nuclear ou mitocondrial. Análises diretas do DNA são mais sensíveis às variações genéticas e fornecem informações sobre estrutura genética, efeito fundador, fluxo gênico, gargalo populacional e endogamia (RODERICK, 1996; BOHONAK, 1999; HOY, 2003). Entre os marcadores que permitem a análise do DNA nuclear estão os marcadores moleculares ISSR (“Inter Simple Sequence Repeat”). O DNA de insetos apresenta uma elevada quantidade de sequências repetitivas, entre elas as regiões microssatélites ou SSRs (“Simple Sequence Repeat”), que são segmentos de DNA ricos em sequências A+T ou G+C que se repetem em tandem (LOXDALE; LUSHAI, 1998). A técnica PCR-ISSR baseia-se na amplificação de sequências de DNA não codificante, entre as regiões microssatélites, onde as mutações são conservadas. As repetições microssatélites com di-, tri-, tetra- ou penta-nucleotideos são utilizadas como “primers”, sendo amplificada a região entre dois microssatélites idênticos e com orientação oposta nas fitas de DNA molde (REDDY; SARLA; SIDDIQ, 2002). Um grande número de bandas potencialmente polimórficas é gerado e por serem consideradas dominantes, ou seja, amplificadas mesmo com apenas uma cópia alélica, alguns erros podem ser cometidos na interpretação (ROUX et al., 2007). Por exemplo, sua ausência pode significar uma ou mais divergências com o “primer” ou ainda um rearranjo no cromossomo enquanto a presença de bandas de mesmo tamanho podem não corresponder a bandas similares, sendo a variabilidade subestimada. Entretanto, esta técnica apresenta a vantagem de não ser necessário um conhecimento prévio a respeito das sequências, além de ser um método simples e com alta reprodutibilidade (WOLFE; LISTON, 1998). Tem sido amplamente utilizada em estudos de variabilidade genética e estrutura populacional para 8 diferentes ordens de insetos (REDDY; NAGARAJU; ABRAHAM, 1999; LUQUE et al., 2002; BORBA et al., 2005; HUNDSDOERFER; KITCHINGB; WINK, 2005; HUNDSDOERFER; WINK, 2005, ROUEX et al., 2007; SOUZA et al., 2008; KEHLMAIER; ASSMANN, 2010; HELMI; KHAFAGA; EL-FATIH, 2011; TAYLOR; DOWNIE; PATERSON 2011). O DNA mitocondrial (mtDNA) também representa uma importante fonte para estudos populacionais, devido às suas características particulares, como a herança materna e a ausência de recombinação, além da grande quantidade presente nas células (LOXDALE; LUSHAI, 1998). É formado por uma molécula circular e pequena, que codifica menos de 40 genes. Destes, cerca de metade codificam RNA ribossomal e transportador, destinados a síntese de proteínas da própria mitocôndria e os demais codificam proteínas utilizadas no transporte de elétrons ou na fosforilação oxidativa (GRAZIEWICZ; LONGLEY; COPELAND, 2006). Dentre o complexo de genes que codificam essas proteínas transmembrana, destaca-se a região da Citocromo Oxidase, subunidade I (COI). Essa é uma das regiões que acumulam as mutações mais rapidamente, devido à presença reduzida de mecanismos de reparo (GRAZIEWICZ; LONGLEY; COPELAND, 2006). Além disso, a região do gene COI apresenta a vantagem desta ser obtida por meio de iniciadores universais conservados (SMITH-CALDAS et al., 2001). É amplamente utilizada em estudos de variabilidade genética, estrutura populacional, filogenia, filogeografia e identificação de diversas espécies de insetos, sendo algumas pesquisas realizadas com neurópteros (CLARK; MEINKE; FOSTER, 2001; SMITH- CALDAS et al., 2001; FINN et al., 2006; WINTERTON; FREITAS, 2006; ASOKAN et al., 2007; VANDERGAST et al., 2007; STÅHLS; SAVOLAINEN, 2008; BOEHME et al., 2010; MORALES; FREITAS, 2010; WILSON et al., 2010; VELONÀ et al., 2011; NIE et al., 2012; HENRY et al., 2012; MORALES; LAVAGNINI; FREITAS, 2013; SOLE et al., 2013). Referências ADAMS, P. A.; PENNY, N. D. Neuroptera of the Amazon Basin. Part 11a. Introduction and Chrysopini. Acta Amazonica, Manaus, v. 15, n. 3-4, p. 413-479, 1985. 9 ADRIANO, E.; TOSCANO, L. C.; SCHLICK, E. C.; MARUYAMA, W. I.; SANTOS, F. L. Desenvolvimento e capacidade de consumo de Chrysoperla externa (Hagen, 1861) alimentada com ninfas de mosca-branca criadas em hortaliças. 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Morales1,2 1 Departamento de Fitossanidade, Universidade Estadual Paulista ‘Júlio de Mesquita Filho’, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n, 14884-900 - Jaboticabal, SP. barbosa.naracristina@gmail.com 2 Departamento de Biologia Aplicada à Agropecuária, Universidade Estadual Paulista ‘Júlio de Mesquita Filho’, Via de Acesso Prof. Paulo Donato Castellane s/n, 14884-900 - Jaboticabal, SP. dri_morales@fcav.unesp.br 3 in memorian RESUMO - Crisopídeos são predadores generalistas e a espécie Chrysoperla externa apresenta grande potencial para a utilização no controle biológico de pragas agrícolas devido a sua alta capacidade de predação e reprodução e ao fato de ser multiplicada com êxito em laboratório. A fim de maximizar o sucesso do controle biológico e evitar danos ambientais e econômicos, tornam-se extremamente importantes os estudos genéticos populacionais. Dessa forma, este estudo utilizou um marcador molecular nuclear (ISSR) e um mitocondrial (COI) para estimar a variabilidade genética de 13 populações do estado de São Paulo, Brasil, bem como a relação genética entre elas. Para ambos os marcadores foram observados altos níveis de diversidade genética. Houve grande compartilhamento de haplótipos e a correlação com a distribuição geográfica das populações foi ausente ou baixa, indicando que estas formavam uma única unidade populacional, que tem se diferenciado após sua expansão. Palavras-chave : COI, controle biológico, crisopídeo, distância genética, ISSR Introdução A família Chrysopidae é composta por cerca de 1.200 espécies distribuídas em 80 gêneros (FREITAS; PENNY, 2001). As fases, larval e adulta, apresentam hábito alimentar distinto, sendo que os adultos consomem pólen, néctar e “honeydew”, enquanto as larvas são predadoras generalistas e se alimentam de diversos insetos considerados pragas agrícolas, como pulgões, cochonilhas, mosca- branca, bem como ovos e lagartas de lepidópteros (FREITAS, 2001). Os crisopídeos possuem ampla distribuição geográfica, não tendo sido registrados apenas na Antártica (BROOKS; BARNARD, 1990). O gênero Chrysoperla Steinmann, 1964 é um dos mais estudados e possui 36 espécies descritas, das quais apenas quatro ocorrem no Brasil (FREITAS 2003) - Chrysoperla 20 defreitasi Brooks, 1994; Chrysoperla raimundoi Freitas e Penny, 2001; Chrysoperla genanigra Freitas, 2003 e Chrysoperla externa (Hagen, 1861). A última é considerada uma das espécies mais comum das Américas e pode ser encontrada desde o sul dos EUA até a Argentina (BROOKS, 1994). No Brasil já foi observada tanto em ambiente natural quanto em agroecossistemas em todo território nacional, com especial destaque para o estado de São Paulo (ADAMS; PENNY, 1985; BELORTE; RAMIRO; FARIA, 2004; RAMIRO; FARIA, 2006; QUEIROZ et al., 2009). Associado a essa ampla distribuição geográfica e alta capacidade de predação, o elevado potencial reprodutivo e o sucesso na multiplicação em laboratório fazem de C. externa um possível agente para a utilização no controle biológico (FREITAS, 2001). Entretanto, é essencial que os indivíduos criados em laboratório sobrevivam e sejam eficientes no controle de pragas. Dessa forma, estudos genéticos populacionais são extremamente importantes, pois a variabilidade genética de uma espécie está diretamente associada com sua capacidade de suportar as condições diferentes ou adversas quando inserida em novos ambientes, de modo que conhecê-la pode auxiliar no sucesso do controle biológico, evitando danos econômicos e ambientais (BAKER; LOXDALE; EDWARDS, 2003; HUFBAUER; RODERICK, 2005). A variabilidade genética e a estrutura populacional podem ser obtidas através de marcadores moleculares, tanto no DNA nuclear quanto no DNA mitocondrial (mtDNA). Os marcadores moleculares ISSR (“Inter Simple Sequence Repeat”) tem sido amplamente utilizados em estudos de variabilidade genética (BORBA et al., 2005; SOUZA et al., 2008; KEHLMAIER; ASSMANN, 2010; TAYLOR; DOWNIE; PATERSON, 2011) uma vez que permitem a verificação de diferenças genéticas contidas em todo o genoma. Do mesmo modo, a região da Citocromo Oxidase, subunidade I (COI), é utilizada em diversos estudos populacionais de variabilidade genética, filogenia e ainda identificação de diversas espécies de insetos (CLARK; MEINKE; FOSTER, 2001; SMITH-CALDAS et al., 2001; WINTERTON; FREITAS, 2006; ASOKAN et al., 2007; VELONÀ et al., 2011). O objetivo deste trabalho foi investigar e comparar a variabilidade genética de Chrysoperla externa, por meio dos marcadores moleculares ISSR e do gene mitocondrial COI, em populações estabelecidas em agroecossistemas no estado de 21 São Paulo, bem como identificar os marcadores ISSR mais eficazes para esta espécie, uma vez que não há relatos de estudos com neurópteros. Material e Métodos Municípios amostrados - Os espécimes de Chrysoperla externa foram coletados, com auxílio de rede entomológica, no período de julho de 2006 a maio de 2008, totalizando 95 indivíduos. Foram amostradas áreas de cultivos perenes, abrangendo 13 municípios do estado de São Paulo (Tabela 1). Tabela 1. Municípios amostrados e respectivas coordenadas geográficas, número de indivíduos analisados (n), número de identificação dos espécimes (“voucher”), tipo de cultura nos pontos amostrados e data de coleta. Municípios Coordenadas geográficas* n “voucher” Cultura Data de coleta Latitude Longitude Águas da Prata1 -21:56:13 -46:43:01 08 143-146, 885-888 café VIII. 07 Andradina -20:53:45 -51:22:44 08 75-78, 875-878 pastagem VIII.06 Barretos1 -20:33:25 -48:34:04 07 123-125, 892, 895-897 citros VIII.06 - XI.06 Brotas -22:17:02 -48:07:37 08 898-905 eucalipto XII.07-V.08 Cafelândia2 -21:48:10 -49:36:36 08 79, 81, 82, 1017-1021 citros XI.06-XII.06 Conchal1 -22:19:48 -47:10:22 07 91-94, 908, 909, 913 citros X.06 Itápolis1,2 -21:35:45 -48:48:46 08 147-150, 1063-1066 citros VIII.06-XI.06 Luiz Antônio1 -21:33:18 -47:42:14 08 103-106, 921-924 citros I.07 Monte Aprazível -20:46:22 -49:42:50 08 99-102, 927-930 citros II.05 - VII.07 Presidente Prudente3 -22:07:33 -51:23:20 08 787, 788, 791, 792, 794-797 café/eucalipto VIII.06-III.07 Rifaina -20:04:51 -47:25:15 02 987, 988 café XI.07 São Carlos2 -22:01:04 -47:53:27 07 1119-1124, 1126 citros X.06 Sarutaiá -23:16:22 -49:28:48 08 968-975 citros VII.06 * Fonte: Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística – IBGE (2011). 1 ”Vouchers” 144, 123, 895, 94, 147 e 104 foram analisados apenas para ISSR. 2 Sequências 1017-1021, 1063-1066, 1119-1126 obtidas em Lavagnini (2011). 3 Sequências obtidas em Morales, Lavagnini e Freitas (2013). Os espécimes foram identificados com base nas características da morfologia externa (BROOKS; BARNARD, 1990), armazenados em álcool absoluto e mantidos em freezer no Laboratório de Biologia Molecular (LBM) do Departamento de Fitossanidade, FCAV. A distância, em linha reta, entre os municípios amostrados foi calculada por meio do aplicativo “Google Earth” versão 7.0.1.8244 (GOOGLE, 2012) e um mapa (Figura 1) foi confeccionado com o programa “GPS Track Maker©” versão 13.8 (JUNIOR, 2012). 22 Figura 1. (A) Municípios amostrados no estado de São Paulo. (B) Mapa político do Brasil, com destaque para o estado de São Paulo. Extração do DNA total - O DNA total foi extraído a partir do tórax dos insetos, sendo as demais partes (cabeça, asas e abdômen) armazenadas em álcool absoluto e mantidas em freezer no LBM, recebendo um número próprio de identificação (Tabela 1). O processo de extração foi realizado com auxílio de “Wizard® Genomic DNA Purification Kit” (Promega), seguindo-se o protocolo fornecido pelo fabricante. As amostras de DNA obtidas, com numeração correspondente, foram armazenadas no mesmo laboratório. ISSR-PCR Escolha dos “primers” e amplificação - Os “primers” ISSR utilizados pertencem ao conjunto 9 da “University of British Columbia” (UBC Set#9), formado por 100 iniciadores. Para realizar os testes de amplificação, estes foram primeiramente agrupados de acordo com a semelhança das sequências e a temperatura de desnaturação do “primer” (Tm). Foram então definidas as temperaturas de anelamento (Ta), sendo estabelecido um intervalo de temperatura que abrangia desde a maior Tm até 5 °C abaixo da menor Tm contida em cada grupo de “primer”. Os testes de amplificação foram efetuados com três espécimes de diferentes localidades, escolhidos aleatoriamente. Foram então selecionados oito “primers” que 23 geraram bandas polimórficas (Tabela 2) e realizados novos testes de padronização, a fim de adequar a concentração dos componentes da PCR e a temperatura de anelamento. As reações de PCR foram realizadas em termociclador “Mastercycler®” (“Eppendorf”) em um volume final de 25 µL, sendo 5 µL de 5X “Green GoTaq® Flexi Buffer” (Promega), 1 mM de MgCl2, 0,2 mM de cada dNTP, 0,2 µM de “primer”, 1 u de “GoTaq® DNA Polimerase” (Promega) e 2 µL de DNA total (~ 30 ng). Foram utilizadas as condições de amplificação descritas por Souza et al. (2008), com adaptações: desnaturação inicial à 94 °C por 5 min, seguida por 35 ciclos de 45 s à 94 °C, 45 s para cada uma das temperaturas contidas num intervalo específico por “primer” (Tabela 2), 1 min e 50 s à 72 °C e uma etapa de extensão final de 72 °C por 7 min. Os produtos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%, corados com brometo de etídio (1 ng/mL) e visualizados em luz ultravioleta. As imagens foram registradas com o programa Gel Doc 2000 – “Gel Documentation System” (Bio-Rad). Tabela 2. Temperatura de anelamento específica por “primer” ISSR e sequência de nucleotídeos. “Primer” Sequência (5’ – 3’) Temperatura de anelamento (°C) UBC 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 44 - 46 - 48 - 50 - 52 UBC 820 GTG TGT GTG TGT GTG TC 47 - 49 - 51 - 53 - 55 - 57 UBC 836 AGA GAG AGA GAG AGA GYA 36 - 38 - 40 - 42 - 44 - 46 - 48 UBC 849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA 47 - 49 - 51 - 53 - 55 - 57 UBC 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 47 - 49 - 51 - 53 - 55 - 57 UBC 880 GGA GAG GAG AGG AGA 42 - 44 - 46 - 48 UBC 886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 36 - 38 - 40 - 42 - 44 - 46 - 48 UBC 891 HVH TGT GTG TGT GTG TG 44 - 46 - 48 - 50 - 52 Análise dos dados - Foi construída uma matriz binária de ausência (0) e presença (1) de bandas, uma vez que marcadores ISSR são classificados como dominantes. O tamanho das bandas foi estimado com base no marcador de peso molecular 1 kb, sendo consideradas as bandas de fácil visualização. Bandas menos intensas e de baixa reprodutibilidade foram descartadas da análise. O programa POPGENE versão 1.32 (YEH; YANG; BOYLE, 1999) foi utilizado para estimar o número de locus polimórficos (NLP); a porcentagem de locus polimórficos (P); o índice de diversidade genética de Shannon (I) (LEWONTIN, 1972); a diversidade genética total (HT), bem como dentro (HS) e entre as populações (DST); o coeficiente global de 24 diferenciação genética (GST), que expressa a proporção da variabilidade contida entre as populações e corresponde ao FST de Wright; e o número de migrantes (Nm). A heterozigosidade observada (HO), estimada com base na frequência de homozigotos recessivos (ausência da banda) e o índice de diversidade de Nei (1978) (He), o qual corresponde a heterozigosidade esperada corrigida para populações com baixo tamanho amostral (n < 50), foram obtidos por meio do programa TFPGA versão 1.3 (MILLER, 1997). Neste também foram calculadas a distância genética corrigida de Nei (1978) e a correlação entre esta e a distância geográfica em linha reta, por meio do teste de Mantel (1967). A Análise de Variância Molecular (AMOVA) foi obtida por meio do programa Arlequin versão 3.5.1.3 (EXCOFFIER; LISCHER, 2010). A fim de evitar que locus fossem excluídos da análise devido à ausência de dados para alguns indivíduos, a AMOVA foi realizada separadamente por “primer”. Dessa forma, os indivíduos que não apresentaram bandas para um determinado iniciador, foram excluídos apenas para esses locus, permanecendo no restante da análise. COI Amplificação e sequenciamento - O gene mitocondrial COI foi amplificado por meio da PCR, realizada em termociclador “Mastercycler®” (“Eppendorf”). A reação se deu em um volume final de 25 µL, sendo 12,5 µL de “GoTaq® Colorless Master Mix” (Promega), 0,4 µM dos “primers” C1-J-2183 (5’CAACATTTATTTTGATTTTTTGG3’) e TL2–N-3014 (5’TCCATTGCACTAATCTGCCATATTA3’) (SIMON et al., 1994) e 2,5 µL de DNA total (~ 40 ng). A amplificação ocorreu nas seguintes condições: desnaturação inicial à 94 °C por 2 min, seguida por 35 ciclos de 40 s à 94 °C, 50 s à 55 °C, 1 min à 72 °C e uma etapa de extensão final de 72 °C por 10 min. Os produtos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1% e corados com brometo de etídio (1 ng/mL) a fim de confirmar a amplificação. O material foi então purificado por meio do kit “Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System” (Promega), segundo o protocolo fornecido pelo fabricante. Os produtos foram sequenciados utilizando-se os mesmos “primers” e condições da amplificação. As reações se deram em sequenciador automático “ABI Prism 3100 Genetic Analyser”, por meio de 25 “Big DyeTM Terminator” versão 3.1 (“Perkin-Elmer Applied Biosystems”) e as sequências foram depositadas no banco de dados do LBM. Análise dos dados - As sequências foram lidas no programa Chromas Lite versão 2.01 (TECHNELYSIUM PTY LTD, 2005) e alinhadas no programa BioEdit versão 7.1.3.0 (HALL, 1999). Com o programa DnaSP versão 5.10.01 (LIBRADO; ROZAS, 2009) foram realizadas as análises descritivas, obtendo-se o número de sítios polimórficos (S) e de haplótipos (h), diversidade haplotípica (Hd), diversidade nucleotídica (π), número médio de diferenças nucleotídicas (k), o índice de fixação (FST) e o número de migrantes (Nm). A composição nucleotídica e a distância genética entre as populações foram obtidas através do programa MEGA versão 5.01 (TAMURA et al., 2011), sendo aplicada para a última, o modelo de correção Kimura- 2-parâmetros (K2P), o qual considera as transições mais frequentes que as transversões, fato observado no mtDNA (PAGE; HOLMES, 1998). Essa matriz de distância genética foi utilizada para a análise de correlação com a matriz de distâncias geográficas, por meio do teste de Mantel (1967) realizado com o programa TFPGA versão 1.3 (MILLER, 1997). A AMOVA foi obtida por meio do programa Arlequin versão 3.5.1.3 (EXCOFFIER; LISCHER, 2010). Os testes de neutralidade, D de Tajima (TAJIMA, 1989) e Fs de Fu (FU, 1997), e a “Mismatch Distribution” foram realizados com o programa DnaSP versão 5.10.01 (LIBRADO; ROZAS, 2009), a fim de determinar o comportamento populacional ao longo do tempo. Uma rede haplotípica foi construída com o programa TCS versão 1.12 (CLEMENT; POSADA; CRANDALL, 2000) e os clados aninhados segundo a metodologia de Templeton, Boerwinkle e Sing (1987). A correlação entre os clados aninhados e a localização geográfica dos haplótipos foi analisada por meio do programa GeoDis versão 2.6 (POSADA; CRANDALL; TEMPLETON, 2000), sendo os índices testados na chave de inferência filogenética (TEMPLETON, 2004) disponibilizada pelo mesmo programa (darwin.uvigo.es/software/geodis.html). Resultados e Discussão ISSR-PCR – Os oito “primers” escolhidos geraram, em conjunto, 134 fragmentos polimórficos sendo 17 obtidos com UBC 809; 21 com UBC 820; 15 com UBC 836 e 26 UBC 849; 22 com UBC 856; 16 com UBC 880 e UBC 891; 12 com UBC 886 (Figura 2). Figura 2. Exemplo de bandas de ISSR em gel de agarose 2%. A: marcador de peso molecular 1 kb. B: bandas amplificadas nas populações de C. externa para o “primer” UBC 809. Este resultado demonstra a alta capacidade de detecção de polimorfismo da técnica para esta espécie, como já observado para outras ordens de insetos (BORBA et al., 2005; SOUZA et al., 2008; VELU et al., 2008). Os índices de diversidade e polimorfismo foram gerados em relação ao número total de fragmentos, sendo apenas a AMOVA efetuada separadamente por “primer”. As populações apresentaram, em média, 34,39% de polimorfismo, variando de 10,45% a 65,67%. A heterozigosidade (Ho), estimada com base na frequência de homozigotos recessivos, variou de 0,0604 a 0,1646, com média de 0,0876. O índice de diversidade de Nei (He), o qual corresponde a heterozigosidade esperada corrigida para populações com baixo tamanho amostral, foi em média 0,0902, variando de 0,0710 a 0,1773. Já o índice de diversidade de Shannon (I) variou de 27 0,0882 a 0,2671 (Tabela 3). Para todos os parâmetros, os maiores valores absolutos foram observados no município de Brotas, seguido por altos índices em Barretos e São Carlos. Tabela 3. Índices de diversidade genética dentro das populações de C. externa. Municípios n NLP P (%) Ho He I Águas da Prata 08 31 23,13 0,0833 0,0930 0,1322 ± 0,2186 Andradina 08 55 41,04 0,0907 0,0989 0,1507 ± 0,2073 Barretos 07 44 32,84 0,0985 0,1117 0,1591 ± 0,2206 Brotas 08 88 65,67b 0,1646 0,1773 0,2671 ± 0,2280 Cafelândia 08 47 35,07 0,0814 0,0882 0,1338 ± 0,2051 Conchal 07 38 28,36 0,0766 0,0833 0,1222 ± 0,2106 Itápolis 08 35 26,12 0,0785 0,0853 0,1256 ± 0,2113 Luis Antônio 08 42 31,34 0,0662 0,0710 0,1118 ± 0,1840 Monte Aprazível 08 51 38,06 0,0811 0,0867 0,1362 ± 0,1974 Presidente Prudente 08 44 32,84 0,0858 0,0918 0,1374 ± 0,2170 Rifaina 02 14 10,45 0,0604 0,0805 0,0882 ± 0,2146 São Carlos 07 54 40,30 0,0974 0,1051 0,1591 ± 0,2173 Sarutaiá 08 41 30,60 0,0742 0,0799 0,1211 ± 0,2012 Média - 44,9 34,39 0,0876 0,0902 0,1418 ± 0,0583 n = número de espécimes analisados; NLP = Número de locus polimórficos; P = Porcentagem de locus polimórficos; Ho = Heterozigosidade observada; He = Índice de diversidade de Nei (1978); I = Índice de diversidade genética de Shannon (LEWONTIN, 1972). Dentre os municípios amostrados, Brotas, Barretos e São Carlos são os que apresentam a maior cobertura vegetal nativa, com 10.565,21 ha, 12.148,03 ha e 13.030,66 ha, respectivamente, distribuídos entre áreas de mata, capoeira, cerrado e vegetação de várzea (Tabela 4). No município de Brotas ainda encontram-se duas unidades de conservação, a Estação Ecológica São Carlos e parte da Estação Ecológica Itirapina. Dessa forma, a alta diversidade associada a estas regiões pode estar relacionada à presença de vegetação nativa, a qual deve constituir um reservatório de diversidade genética, como sugerido por Morales, Lavagnini e Freitas (2013). Os índices de diversidade mais baixos foram observados para o município de Rifaina, o que pode estar associado ao menor número de indivíduos amostrados nessa localidade, uma vez que ao se corrigir o baixo número amostral, a diversidade (He) aproximou-se da média. 28 Tabela 4. Área (ha) e tipo de vegetação natural encontrada nos municípios amostrados*. Município Mata Capoeira Cerrado Cerradão Campo cerrado Vegetação de várzea não classificada Vegetação natural total AP 1.091,86 1.899,54 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 2991,4 AN 601,15 1.313,32 121,91 0,00 0,00 215,89 39,54 2291,81 BA 1.380,08 2.141,12 1.277,48 2.022,18 0,00 5.268,27 58,9 12148,03 BR 3.101,84 3.037,78 646,91 2.949,19 0,00 750,65 78,84 10565,21 CA 5.487,10 914,97 203,09 304,28 0,00 1.246,20 6,21 8161,85 CO 288,93 124,64 0,00 0,00 0,00 12,47 23,46 449,5 IT 1.283,75 2.410,25 17,41 171,45 6,11 1.092,98 25,26 5007,21 LA 1.108,46 833,48 1.629,24 3.509,35 0,00 269,37 27,45 7377,35 MA 126,02 734,85 271,26 0,00 0,00 461,87 80,65 1674,65 PP 359,32 407,27 0,00 0,00 0,00 0,00 14,58 781,17 RI 30,28 1.148,08 899,17 0,00 0,00 284,4 1,26 2364,19 SC 1.773,13 4.344,70 2.737,38 2.685,75 0,00 1.463,32 26,38 13030,66 SA 877,74 785,02 0,00 0,00 0,00 12,62 0,00 1675,38 * Fonte: Instituto Florestal (2001) A diversidade genética total (HT) encontrada foi de 0,0925 ± 0,0132, sendo 0,0831 ± 0,0060 correspondente à diversidade genética dentro das populações (HS) e 0,0094 ± 0,0145 à diversidade genética entre as populações (DST). O coeficiente global de diferenciação genética (GST) foi de 0,1019, indicando um grau intermediário de diferenciação entre as populações, uma vez que valores inferiores a 0,05 representam baixos níveis de diferenciação genética e superiores a 0,151, alta diferenciação (YEH; CHONG; YANG, 1995). O número médio de migrantes (Nm) obtido foi de 4,4051 e, segundo McDermott e McDonald (1993), valores de Nm superiores a 1 já seriam suficientes para evitar que alelos seletivamente neutros sejam fixados em diferentes populações, de modo que hajam poucas diferenças entre as elas. Entretanto, a AMOVA apontou a presença de uma estrutura genética para sete dos oito “primers” analisados (Tabela 5), de modo que, em média, 56,53% da variabilidade está contida entre as populações enquanto 43,47% são observados dentro das mesmas. Este valor discorda com o obtido para diversidade genética (HS e DST), no qual a diversidade maior foi observada dentro das populações. Além disso, o nível de diferenciação (FST) médio entre as populações foi de 0,56, reforçando que as populações apresentam diferenças e estão estruturadas, uma vez que valores superiores a 0,25 indicam diferenciação genética muito grande (WRIGHT, 1978; HARTL; CLARK, 2010a). Dessa forma, pode-se inferir que o fluxo gênico esteja restrito a algumas populações, permitindo a diferenciação nas demais, como pode ser observado pela presença de bandas exclusivas para as populações 29 de Andradina (3), Brotas (6), Cafelândia (1), Luiz Antônio (1), Monte Aprazível (2), Presidente Prudente (2), São Carlos (1) e Sarutaiá (1). Tabela 5. Análise da variância molecular (AMOVA) para as populações de C. externa para os diferentes “primers”. “Primer” Porcentagem de variação entre populações (%) Porcentagem de variação dentro das populações (%) FST valor de p UBC 809 57,27 42,73 0,57274 0,00000 ± 0,00000 UBC 820 63,40 36,60 0,63396 0,00000 ± 0,00000 UBC 836 57,34 42,66 0,57337 0,00000 ± 0,00000 UBC 849 57,92 42,08 0,57924 0,00000 ± 0,00000 UBC 856 53,60 46,40 0,53598 0,00293 ± 0,00164 UBC 880 55,91 44,09 0,55913 0,00000 ± 0,00000 UBC 886 46,90 53,10 0,46896 0,48485 ± 0,01454 UBC 891 59,88 40,12 0,59882 0,00000 ± 0,00000 Média 56,53 43,47 0,56527 A distância genética entre as populações foi pequena, variando de 0,0047 (Cafelândia e Monte Aprazível) a 0,0625 (Águas da Prata e Rifaina) (Tabela 6). Valores de distância genética baixos também foram observados por Wells (1994) entre populações de outras espécies do gênero Chrysoperla, porém utilizando marcadores enzimáticos. Estes dados mostram que as populações apresentam grande similaridade genética, indicativo de curto período de isolamento entre elas ou à presença de fluxo gênico suficiente para homogeneizá-las (McDERMOTT; McDONALD, 1993). O teste de Mantel apontou uma discreta correlação positiva (r = 0,2421; P = 0,9230) entre as matrizes de distâncias genética e geográfica (Tabela 6), de modo que as populações tendem a ser mais distintas quando estão afastadas geograficamente e mais semelhantes entre municípios próximos como observado, por exemplo, entre Águas da Prata e Presidente Prudente, Andradina e Rifaina, Brotas e Conchal e entre Cafelândia e Itápolis. 30 Tabela 6. Distância genética entre as populações de C. externa baseada nos marcadores ISSR (diagonal inferior) e distância geográfica (km) entre os municípios (diagonal superior). AP AN BA BR CA CO IT LA MA PP RI SC SA AP 492,3 248,0 150,9 300,3 64,2 219,8 110,9 337,8 482,7 220,2 121,4 319,8 AN 0,0193 293,5 370,0 209,4 462,9 279,3 389,5 174,4 137,1 422,4 381,8 329,3 BA 0,0171 0,0320 198,4 175,3 247,1 120,8 145,7 120,9 338,3 130,3 177,5 316,2 BR 0,0190 0,0234 0,0055 162,8 98,3 103,2 91,6 234,8 335,6 254,9 38,5 176,6 CA 0,0201 0,0195 0,0091 0,0143 258,9 86,4 199,7 115,8 185,9 297,1 179,2 163,9 CO 0,0224 0,0337 0,0183 0,0192 0,0158 187,9 101,9 314,5 434,3 253,1 82,2 257,8 IT 0,0306 0,0316 0,0197 0,0144 0,0190 0,0172 114,8 132,1 272,0 221,7 105,7 197,2 LA 0,0233 0,0356 0,0347 0,0319 0,0305 0,0228 0,0179 225,7 386,0 166,1 53,6 264,1 MA 0,0261 0,0245 0,0069 0,0119 0,0047 0,0188 0,0181 0,0391 227,6 250,2 233,6 282,0 PP 0,0412 0,0422 0,0133 0,0194 0,0137 0,0244 0,0279 0,0426 0,0087 468,4 359,6 234,6 RI 0,0625 0,0453 0,0456 0,0352 0,0255 0,0421 0,0351 0,0506 0,0302 0,0393 220,8 413,8 SC 0,0238 0,0298 0,0252 0,0227 0,0226 0,0241 0,0265 0,0300 0,0291 0,0355 0,0173 214,6 SA 0,0152 0,0277 0,0251 0,0228 0,0214 0,0195 0,0206 0,0170 0,0248 0,0379 0,0243 0,0128 AP = Águas da Prata; AN = Andradina; BA = Barretos; BR = Brotas; CA = Cafelândia; CO = Conchal; IT = Itápolis; LA = Luís Antônio; MA = Monte Aprazível; PP = Presidente Prudente; RI = Rifaina; SC= São Carlos; SA = Sarutaiá. 31 COI – As 89 sequências, com 648 bp cada, apresentaram uma composição nucleotídica média de 44,3% de timina (T), 12,7% de citosina (C), 28,4% de adenina (A) e 14,5% de guanina (G), podendo-se notar uma maior porcentagem de A-T, como esperado para o DNA mitocondrial de insetos (HOY, 2003). Foram obtidos 24 sítios polimórficos (S), resultando em 22 haplótipos (h) (Tabela 7) e uma diversidade haplotípica (Hd) de 0,7886 (Tabela 8). Tabela 7. Lista de haplótipos do mtDNA (COI) de C. externa. Haplótipos “Voucher” 143 / 787 143, 787 145 145 146 146, 76, 876, 124, 125, 896, 898, 905, 81, 1019, 91, 92, 913, 148, 150, 924, 101, 929, 987, 988, 1119, 1123, 968, 970, 971 885 885, 877, 902, 1021, 149, 975 886 886, 75, 78, 875, 892, 897, 899, 904, 79, 82, 1017, 1018, 1020, 93, 1063, 1066, 103, 105, 106, 922, 923, 100, 102, 927, 928, 788, 791, 796, 1121, 1122, 972, 974 887 887, 878, 903, 797, 969, 973 888 888 77 77 900 900 901 901 908 908 909 909 1064 1064 1065 1065 921 921 99 99 930 930 792 792 794 794 795 795 1120 1120, 1124 1126 1126 Altos valores de diversidade haplotípica também foram observados por Morales e Freitas (2010) e por Morales, Lavagnini e Freitas (2013) em estudos com diferentes populações de C. externa, sendo 0,956 e 0,866, respectivamente. Morales, Lavagnini e Freitas (2013) observaram valores de diversidade haplotípica e nucleotídica superiores em regiões de vegetação nativa (Hd = 0,962 e π = 0,00861), quando comparadas à agroecossistemas (Hd = 0,866 e π = 0,00353). De modo semelhante, o município de Brotas, o qual possui uma ampla cobertura vegetal (INSTITUTO FLORESTAL, 2001), apresentou altos valores de diversidade 32 haplotípica, juntamente com os municípios de Águas da Prata e Presidente Prudente. Morales e Freitas (2010) e Morales, Lavagnini e Freitas (2013) observaram, respectivamente, 24 haplótipos em 40 indivíduos amostrados e 41 haplótipos em 122 indivíduos amostrados, notando-se que o aumento no número de haplótipos não é proporcional ao aumento da amostra. Assim, no presente estudo, o valor encontrado para o número de haplótipos, distribuídos nas populações, corrobora os estudos previamente realizados, de modo que o estado de São Paulo, representado pelos 22 haplótipos, exibe satisfatoriamente a variabilidade da espécie. O número médio de diferenças nucleotídicas (k = 1,837) e a diversidade nucleotídica média (π = 0,00283) (Tabela 8) foram baixos, o que significa que poucos sítios segregantes são responsáveis pela formação dos haplótipos. Tabela 8. Medidas de variabilidade das populações de C. externa. Municípios n S h Hd k π Águas da Prata 7 12 7 1,00000 3,80952 0,00588 Andradina 8 5 5 0,85714 1,71429 0,00265 Barretos 5 1 2 0,60000 0,60000 0,00093 Brotas 8 8 6 0,92857 2,32143 0,00358 Cafelândia 8 4 3 0,60714 1,28571 0,00198 Conchal 6 6 4 0,80000 2,20000 0,00340 Itápolis 7 6 5 0,90476 2,00000 0,00309 Luís Antônio 7 2 3 0,52381 0,57143 0,00088 Monte Aprazível 8 3 4 0,75000 0,92857 0,00143 Presidente Prudente 8 10 6 0,89286 3,00000 0,00463 Rifaina 2 0 1 0,00000 0,00000 0,00000 São Carlos 7 5 4 0,85714 2,47619 0,00382 Sarutaiá 8 5 4 0,82143 1,60714 0,00248 Média - 1,85 1,69 0,7886 1,837 0,00283 Total 89 24 22 - - - n = número de sequências analisadas; S = número de sítios polimórficos; h = número de haplótipos; Hd = diversidade haplotípica; k = número médio de diferenças nucleotídicas; π = diversidade nucleotídica. A distância genética entre as populações foi muito pequena e variou de 0,001 a 0,005 (Tabela 9), o que pode ser decorrente de fluxo gênico entre as mesmas (Nm = 28,07), o qual evita a fixação de alelos e consequente diferenciação das populações. Valores semelhantes de distância genética foram observados por Morales e Freitas (2010) para populações de C. externa do município de Jaboticabal, a qual variou de 0,002 a 0,006, sugerindo não haver uma diferenciação 33 entre as localidades. A grande similaridade genética também foi evidenciada pela distribuição dos haplótipos deste estudo, como pode ser observado na Tabela 7, mostrando que as populações compartilham haplótipos entre si. O teste de Mantel revelou uma discreta correlação positiva entre a distância genética e a distância geográfica (r = 0,1204; P = 0,7350), como pode ser observado, por exemplo, entre os municípios de Águas da Prata e Andradina, Conchal e Presidente Prudente, Brotas e Luís Antônio e Cafelândia e Itápolis (Tabela 9), de modo que populações próximas tendem a ser mais semelhantes geneticamente e vice-versa, resultado também encontrado para o outro marcador desse estudo. A AMOVA também mostra semelhança entre as populações, indicando que 52,35% da variabilidade está contida dentro das populações e 47,65% entre elas, associado ao valor não significativo de FST = 0,47647; p = 0,75855 ± 0,01387, o que indica a ausência de estrutura genética entre estas populações. Os valores observados para os testes de neutralidade D de Tajima e Fs de Fu foram -1,84328 (p < 0,05) e -15,093 (p = 0,000), respectivamente. Valores negativos indicam um excesso de alelos raros dentro da população e podem sugerir expansão populacional (RAMOS-ONSINS; ROZAS, 2002; HARTL; CLARK, 2010c). Entretanto, essa condição não foi confirmada pela “Mismatch Distribution”, a qual apresentou uma curva multimodal (Figura 3), indicando que as populações permaneceram estáveis ao longo do tempo (SLATKIN; HUDSON, 1991; ROGERS; HARPENDING, 1992; MOUSSET; DEROME; VEUILLE, 2004). Figura 3. “Mismatch Distribution” para as populações de C. externa. 34 Tabela 9. Distância genética (Nei 1978) entre as populações de C. externa baseada no mtDNA COI (diagonal inferior) e distância geográfica (km) entre os municípios (diagonal superior). AP AN BA BR CA CO IT LA MA PP RI SC SA AP 492,3 248,0 150,9 300,3 64,2 219,8 110,9 337,8 482,7 220,2 121,4 319,8 AN 0,004 293,5 370,0 209,4 462,9 279,3 389,5 174,4 137,1 422,4 381,8 329,3 BA 0,003 0,002 198,4 175,3 247,1 120,8 145,7 120,9 338,3 130,3 177,5 316,2 BR 0,005 0,003 0,002 162,8 98,3 103,2 91,6 234,8 335,6 254,9 38,5 176,6 CA 0,004 0,002 0,001 0,003 258,9 86,4 199,7 115,8 185,9 297,1 179,2 163,9 CO 0,004 0,003 0,002 0,003 0,003 187,9 101,9 314,5 434,3 253,1 82,2 257,8 IT 0,004 0,003 0,002 0,003 0,002 0,003 114,8 132,1 272,0 221,7 105,7 197,2 LA 0,004 0,002 0,001 0,002 0,001 0,002 0,002 225,7 386,0 166,1 53,6 264,1 MA 0,004 0,002 0,001 0,002 0,002 0,002 0,002 0,001 227,6 250,2 233,6 282,0 PP 0,005 0,003 0,003 0,004 0,003 0,004 0,004 0,003 0,003 468,4 359,6 234,6 RI 0,003 0,002 0,001 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,002 0,003 220,8 413,8 SC 0,005 0,003 0,003 0,004 0,003 0,004 0,004 0,003 0,003 0,004 0,002 214,6 SA 0,004 0,002 0,002 0,003 0,002 0,003 0,003 0,002 0,002 0,003 0,001 0,003 AP = Águas da Prata; AN = Andradina; BA = Barretos; BR = Brotas; CA = Cafelândia; CO = Conchal; IT = Itápolis; LA = Luís Antônio; MA = Monte Aprazível; PP = Presidente Prudente; RI = Rifaina; SC = São Carlos; SA = Sarutaiá. 35 Segundo Ramos-Onsins e Rozas (2002), os testes de neutralidade apresentam um suporte estatístico mais robusto que a “Mismatch Distribution”. Além disso, outros fatores evidenciam uma expansão populacional, como o valor rg – “raggedness statistic” (que mede a uniformidade da distribuição) e a conformação da rede haplotípica. O valor de rg obtido foi de 0,0619, o qual tende a apresentar-se baixo para o modelo de crescimento populacional (RAMOS-ONSINS; ROZAS, 2002). A rede haplotípica construída (Figura 4) apresenta o formato de estrela, confirmando a hipótese de expansão populacional, uma vez que indica a presença de vários haplótipos semelhantes, com baixa diversidade nucleotídica, sugerindo que a maior parte destes haplótipos surgiu recentemente (FERRERI; QU; HAN, 2011). Figura 4. Rede haplotípica aninhada, para sequências de mtDNA (COI) de C. externa. Cada linha sólida representa um passo mutacional e interliga dois haplótipos a uma probabilidade maior do que o nível de 95%. Pequenos círculos não nomeados correspondem à falta de haplótipos intermediários. 36 A análise dos clados aninhados (NCPA) não apresentou nenhum dos valores de Dc (distância do clado), Dn (distância do clado agrupado) e I-T (relação interior- extremidade) fornecidos pela análise, significativos. Dessa forma, não foi possível rejeitar a hipótese nula de não associação geográfica entre os haplótipos, fato que se observa na rede haplotípica (Figura 4), n qual tanto haplótipos mais ancestrais (centros 146 e 886) quanto os derivados (885 e 887), são compartilhados por várias populações. Este resultado não corrobora o encontrado para o teste de Mantel, que indicou uma discreta correlação positiva entre as distâncias genética e geográfica. Isto pode estar associado ao número de populações amostradas (< 25), uma vez que tamanhos populacionais pequenos podem levar a erros do tipo I para o teste de Mantel, ocorridos quando se rejeita a hipótese nula de não associação embora esta seja verdadeira (LOUZADA; BEARZOTI; CARVALHO, 2006) e ao fato da correlação ter sido obtida pela alta semelhança genética entre municípios próximos. Ambos os marcadores, ISSR e gene COI, mostraram uma elevada diversidade genética para C. externa, o que pode indicar uma alta capacidade adaptativa desses inimigos naturais em áreas de agroecossistemas, com