RESSALVA Atendendo solicitação do(a) autor(a), o texto completo desta dissertação será disponibilizado somente a partir de 22/02/2021. Campus de Botucatu Instituto de Biociências PG-BGA UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “Julio de Mesquita Filho” INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU POTENCIAL TERAPÊUTICO DE CISTEÍNA SELENIZADA EM MODELO EXPERIMENTAL DE ESCLEROSE MÚLTIPLA JULIANA HELENA DOS SANTOS DE TOLEDO ORIENTADORA: ALEXANDRINA SARTORI COORIENTADORA: SOFIA FERNANDA GONÇALVES ZORZELLA PEZAVENTO Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia de microorganismos Alexandrina Sartori BOTUCATU – SP 2019 Campus de Botucatu Instituto de Biociências PG-BGA Agradecimentos À UNESP e aao Programa de Pós graduação de Biologia Geral pela oportunidade de desenvolver meu mestrado. Ao Instituto de Biociências e ao Departamento de Microbiologia e Imunologia por toda a ajuda no desenvolvimento deste trabalho. Aos professores, alunos e funcionários doDepartamento de Microbiologia e Imunologia pelo suporte acadêmico e técnico. À CAPES pela bolsa, que me permitiu desenvolver meu mestrado. À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio 2016/23318-8 e ao CNPQ pelo auxílio 307269/2017-5. À seção de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada pelo suporte técnico, em especial ao Davi Muller, sempre disposto a orientar sobre questões normativas da pós graduação. Aos laboratórios com que realizamos cooperações, pela boa vontade no auxílio com as metodologias que não puderam ser realizadas em nosso laboratório. À Biorigin, em nome de Carlos Alberto Ferreira de Oliveira pela parceria, auxílio e produtos que tornaram este trabalho possível. Aos animais que deram sua vida para que este trabalho fosse realizado, pois todo meu esforço não seria nada sem eles. À minha orientadora, Dra Alexandrina Sartori por toda orientação, confiança e dedicação. Muito obrigada por tudo. À minha coorientadora Sofia Zorzella-Pezavento por toda orientação, carinho, dedicação e amizade, sempre me guiando e me ensinando por todo este processo. Às meninas do laboratório de Vacinas e Imunomodulação, Patrícia Borim, Karen Pinke, Luiza Mimura, Larissa Ragozo, Thais Fraga-Silva, Marcelo Sanches, Evelyn de Oliveira, Larissa Lumi e Natália Muñoz por todo companheirismo e auxílio teórico e prático, indispensável para este trabalho. Ao Dr. Eduardo Bagagli, Dr. Luís Antonio Justulin Júnior e a Dra. Karen Henriette Pinke pela valiosa colaboração durante o exame de qualificação. Aos meus amigos do Programa de mestrado, por toda a amizade e parceria nas disciplinas durante o mestrado. Aos meus amigos por todo amor e paciência comigo durante todos estes anos. À Amanda Pacheco, Beatriz Kimura, Nathan Oliveira, Júlia Faustini e Francielle Rocha, por todo amor e apoio, por cuidarem de mim durante todo meu mestrado, perto ou longe. À minha família, por todo amor, carinho e por sempre me estimular a seguir meus sonhos. Aos meus avós, Vicente, Maria Rita e Alberto, que não estão mais entre nós, mas estão sempre em meu coração. À minha avó Erminda, que sempre me fez acreditar que eu poderia fazer qualquer coisa. À minha tia Maria Célia e meus primos Fabiola e Paulo Henrique, por todo amor e por sempre cuidarem de mim. Ao meu cunhado Alexandre por todo o amor, carinho e acolhida durante as viagens para congressos. À minha irmã Natália, por todo amor e carinho, que sempre me apoiou e por acreditar em mim mesmo quando eu não acreditei. Aos meus irmãos Paulo Henrique e Pedro por todo o amor. Ao meu pai Paulo, por todo amor e carinho, sempre me apoiando durante toda minha vida. A minha mãe Lúcia, por todo amor, carinho e apoio nas minhas decisões na minha vida. À Deus por todas as bênçãos que eu tenho na minha vida. Índice Resumo ......................................................................................................................................................... 8 Abstract ...................................................................................................................................................... 10 Introdução ................................................................................................................................................... 12 Racional ...................................................................................................................................................... 19 Objetivos .................................................................................................................................................... 22 Materiais e Métodos ................................................................................................................................... 24 Resultados .................................................................................................................................................. 34 Discussão .................................................................................................................................................... 49 Conclusão ................................................................................................................................................... 53 Referências ................................................................................................................................................. 55 Apêndices ................................................................................................................................................... 62 Resumo Resumo A esclerose múltipla (EM) é uma doença inflamatória crônica e desmielinizante do sistema nervoso central (SNC). A imunopatogênese da EM envolve linfócitos Th1, Th17 e Tc autorreativos e ativação de macrófagos e microglia, os quais liberam vários mediadores pró-inflamatórios e radicais livres. Não há cura para a EM e as terapias disponíveis desencadeiam efeitos colaterais. Neste contexto, testamos o potencial terapêutico da cisteína selenizada (CS), um produto em desenvolvimento pela empresa Biorigin, no controle da encefalomielite autoimune experimental (EAE). O potencial profilático/terapêutico foi testado por administração de CS durante 30 dias (14 dias antes seguido de 16 dias pós-indução da EAE) e o potencial terapêutico por administração da CS a partir de 1 ou 7 dias após a indução da doença. Os 3 procedimentos reduziram escore clínico e incidência da EAE. A estratégia profilática/terapêutica reduziu discretamente a expressão de componentes do inflamassoma NLRP3 e o percentual de macrófagos e microglia ativada no SNC. As duas estratégias terapêuticas determinaram redução significativa no escore clínico, no percentual de macrófagos e microglia ativada e na expressão de MHCII por estas células. A terapia com CS também reduziu a ativação do inflamassoma NLRP3 e a expressão de mRNA para iNOS e CX3CR1.A redução na percentagem de células dendríticas ativadas (DCs) (CD11b+MHCII+) e o aumento no percentual de DCs tolerogênicas (CD11b-CD103+) sugere o estabelecimento deum perfil regulador neste local. Nos linfonodos inguinais foi detectado um aumento discreto na expressão dos fatores de transcrição Foxp3, Tbet e GATA-3. Estes efeitos protetores foram concomitantes com níveis elevados de selênio no SNC. Ensaios de função renal e hepática sugerem que esta eficácia terapêutica não é acompanhada de efeitos colaterais. Para reforçar a possibilidade de translação dos resultados descritos no modelo para a doença humana, testamos a eficácia terapêutica da CS em camundongos SJL/J, os quais desenvolvem uma doença do tipo remitente- recorrente. O efeito foi similar ao descrito no modelo C57BL/6. Os resultados observados reforçam nossa hipótese de que este produto tem potencial para ser utilizado como terapia adjunta em pacientes com EM. Palavras-chave: encefalomielite autoimune experimental, selênio, cisteína selenizada, inflamassoma, microglia. Abstract Abstract Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory and demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Its immunopathogenesis is complex and involves the interplay of distinct autoreactive T lymphocyte subsets and innate immune cells. The persistent inflammation observed in MS patients is related to oxidative stress and inflammasome activation which have been recently implicated in both, demyelination and axonal damage processes. Since the development of new therapeutic procedures remains necessary, we evaluated the efficacy of an antioxidant product to control experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) development. The selenized cysteine (SC) is an organic selenium, developed by a Brazilian company (Biorigin). For prophylactic- therapeutic strategy, oral treatment with SC (45µg of selenium/dose) started 14 days before EAE induction and was daily extended until the acute phase of the disease. The precocious and delayed therapies have begun 1 or 7 days after MOG administration. The three therapeutic approaches reduced EAE incidence and clinical manifestations. Prophylactic-therapeutic strategy attenuated NLRP3 inflammasome activation and reduced the number of macrophages and activated microglia in the CNS. Precocious and delayed therapies were efficient in controlling EAE symptoms, reducing the percentage of macrophages and activated microglia and the MHCII expression. This protection was concomitant by less NLRP3 inflammasome activation and lower expression of mRNA for iNOS and CX3CR1. Reduction in the percentage of activated dendritic cells (DCs) (CD11b+MHCII+) and increase in the percentage of tolerogenic DCs (CD11b-CD103+) in the mesenteric lymph nodes suggest the presence of regulatory condition. Oral SC administration also slightly increase the expression of transcriptional factors Foxp3, Tbet and GATA-3 in inguinal lymph nodes. As elevated levels of selenium were determined in the CNS, we believe that SC could act directly in the neuroinflammation control. Hepatic and renal enzymes evaluation suggest that this product is safe for use. To reinforce the possibility to translate this treatment to MS patients, we evaluated SC therapeutic efficacy in a relapsing-remitting EAE model. Indeed, SC efficiently controlled the clinical manifestations in SJL/J mice. Our results emphasize that this organic selenium source has the potential to be used as an adjuvant therapy for MS patients. Key-words: experimental autoimmune encephalomyelitis, selenium, selenized cysteine, inflammasome, microglia. 53 Conclusão Os resultados observados confirmam a eficácia protetora da CS na neuroinflamação que caracteriza a EM, reforçando nossa hipótese de que este produto tem potencial para ser utilizado como terapia adjunta em pacientes com esta doença. 54 Referências 55 Referências ABOURBEH, G. et al. Imaging Microglial/Macrophage Activation in Spinal Cords of Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Rats by Positron Emission Tomography Using the Mitochondrial 18 kDa Translocator Protein Radioligand [18F]DPA-714. Journal of Neuroscience, v. 32, n. 17, p. 5728–5736, 2012. Disponível em: . AEBI, H. Oxygen radicals in biological systems: Preface. Methods in Enzymology, v. 186, n. 1947, p. 121–126, 1984. AKIRA, S.; UEMATSU, S. 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