R: Cristóvão Colombo, 2265 – Jd. Nazareth CEP: 15054-000 – FONE (017) 32212250 – FAX (017) 32212299 – S. J. Rio Preto – SP. FLAVIANA SALES CONCEIÇÃO EFEITO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEGUIDA DA MOAGEM EM MOINHO DE BOLAS SOBRE AS CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E FÍSICO-QUÍMICAS DO AMIDO DE MANDIOQUINHA-SALSA São José do Rio Preto 2012 FLAVIANA SALES CONCEIÇÃO EFEITO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEGUIDA DA MOAGEM EM MOINHO DE BOLAS SOBRE AS CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E FÍSICO-QUÍMICAS DO AMIDO DE MANDIOQUINHA-SALSA (ARRACACIA XANTHORRHIZA) Texto apresentado ao Instituto de Biociências. Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus São José do Rio Preto, para a defesa de Dissertação de Mestrado em Engenharia e Ciência de Alimentos: área de concentração Ciência e Tecnologia de Alimentos. Orientadora: Profª. Drª. Célia Maria Landi Franco São José do Rio Preto 2012 Conceição, Flaviana Sales Efeito da hidrólise enzimática seguida da moagem em moinho de bolas sobre as características estruturais e físico-químicas do amido de mandioquinha-salsa/ Flaviana Sales Conceição – São José do Rio Preto: [s.n], 2012. Orientador : Célia Maria Landi Franco Dissertação (Mestrado) – Universidades estadual Palista , Instituto de Biociências Letras e Ciências Exatas 1. Tecnologia de Alimentos. 2.Amido – Modificado. 3. Amido- características físico-químicas. 4. Amido mandioquinha-salsa. 5. Hidrólise enzimática. 6. Amido – Moagem. I. Franco, Célia Maria Landi. II. Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título CDU – 664.2 FLAVIANA SALES CONCEIÇÃO EFEITO DA HIDRÓLISE ENZIMÁTICA SEGUIDA DA MOAGEM EM MOINHO DE BOLAS SOBRE AS CARACTERÍSTICAS ESTRUTURAIS E FÍSICO- QUÍMICAS DO AMIDO DE MANDIOQUINHA-SALSA Dissertação apresentada para obtenção do título de Mestre em Engenharia e Ciência de Alimentos, área de Ciência e Tecnologia de Aliementos junto ao Programa de Pós- Graduação em Engenharia e Ciência de Alimentos do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de São José do Rio Preto. BANCA EXAMINADORA Profª. Drª.Célia Maria Landi Franco Professor Assistente Doutor UNESP – São José do Rio Preto Orientador Profª. Drª. Thais de Souza Rocha Professor Doutor Universidade de Estadual de Campinas - UNICAMP Prof. Dr.Ana Carolina Conti e Silva Professor Assistente Doutor UNESP – São José do Rio Preto São José do Rio Preto, 02 de Agosto de 2012 Dedico A minha filha Maria Vitória, aos meus pais, João e Beverlei que não mediram esforços para que eu estivesse aqui, ao Márcio meu esposo pelo apoio, afeto, carinho, paciência e amor. Obrigada Agradecimentos À Deus por me dar força para a realização deste trabalho. À Profa. Dra. Célia Maria Landi Franco, pela oportunidade, paciência e dedicação na orientação desse trabalho. Ao meu esposo Márcio pelo carinho, amor e dedicação em todos os momentos, te amo. Às colegas do Laboratório de Cereais, Raízes e Tubérculos, Denise, Thaís, Marina, Larissa, Jaqueline, Súelen, Verena, Rafaela e Florença, pela ajuda e amizade. Ao prof. Dr. Vanildo Luiz Del Bianchi. À minha filha que desde tão pequena dentro de mim me dá forças para superar as minhas dificuldades e mostrar que sou muito forte. Aos técnicos do Departamento de Engenharia de Alimentos, Alana, Ginaldo, Jesuíno, Luiz, Newton e Tânia. CNPQ – Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico, pela concessão da bolsa de mestrado e apoio financeiro à pesquisa. “ Tu te tornas eternamente responsável por aquilo que cativas” (Antoine de Saint-Exupéry) SUMÁRIO SUMÁRIO .............................................................................................................................................................. 7 LISTA DE FIGURAS .......................................................................................................................................... 9 LISTA DE TABELAS ........................................................................................................................................ 11 RESUMO ............................................................................................................................................................ 12 ABSTRACT ........................................................................................................................................................ 14 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................................................................ 16 2 OBJETIVO GERAL ........................................................................................................................................ 18 2.1 OBJETIVO ESPECÍFICOS .................................................................................................................................... 18 3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................................................................ 19 3.1 O AMIDO ........................................................................................................................................................ 19 3.2 PROPRIEDADES FUNCIONAIS DO AMIDO .............................................................................................. 21 3.3 AMIDO MODIFICADO ................................................................................................................................. 22 3.3.1 Amido Modificado por Enzima ..................................................................................................................... 23 3.3.1.1 Ação da enzima -amilase ......................................................................................................... 25 3.3.1.2 Ação da enzima amiloglucosidase ............................................................................................. 25 3.3.1.2 Efeito da ação sinérgica da - amilase e a amiloglucisidase .................................................... 26 3.4.1 Amido Modificado Fisicamente ..................................................................................................... 27 3.5 MANDIOQUINHA-SALSA .......................................................................................................................... 29 4 MATERIAL E MÉTODOS ............................................................................................................................. 31 4.1 MATERIAL ....................................................................................................................................................... 31 4.2 MÉTODOS ......................................................................................................................................................... 31 4.2.1 Isolamento dos Amidos ................................................................................................................................. 31 4.2.2 Composição Química ................................................................................................................................... 31 4.2.3 Hidrólise enzimática do amido ..................................................................................................................... 32 4.2.3.1 Atividade da enzima - amilase bacteriana ....................................................................................... 32 4.2.3.2 Atividade da enzima amiloglucosidase fúngica ................................................................................ 32 4.2.3.3 Hidrólise enzimática .............................................................................................................................. 33 4.2.4 Modificação física ........................................................................................................................................ 33 4.2.5 Forma e distribuição do tamanho dos grânulos de amido .......................................................................... 34 4.2.6 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ......................................................................................... 34 4.2.7 Ditribuição dos comprimentos de cadeias ramificadas da amilopectina ........................................... 34 4.2.7.1 Desramificação dos amdos .................................................................................................................. 34 4.2.7.2 Cromatografia de troca aniônica de alta eficiência com detecção de pulso amperométrico (HPAEC-PAD) ........................................................................................................................................... 35 4.2.8 Distribuição do tamanho molecular dos amidos .......................................................................................... 36 4.2.9 Afinidade com iodo e teor aparente de amilose ................................................................................... 37 4.2.10 Difração de raios-X .................................................................................................................................. 37 4.2.11 Propriedades térmicas ............................................................................................................................... 37 4.2.12Propriedades de pasta ................................................................................................................................ 38 4.2.13 Poder de inchamento e solubilidade .......................................................................................................... 39 4.3 ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................................................................................... 39 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO ...................................................................................................................... 40 5.1 ISOLAMENTO DOS AMIDOS ........................................................................................................................... 40 5.2 COMPOSIÇÃO QUÍMICA DO AMIDO NATIVO ...................................................................................................... 40 5.3 MODIFICAÇÃO ENZIMÁTICA .............................................................................................................................. 41 5.4 DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO DOS GRÂNULOS DE AMIDOS NATIVO E MODIFICADOS.......................................... 43 5.5 FORMA DOS GRÂNULOS DE AMIDOS NATIVO E MODIFICADOS ........................................................................... 46 5.6 DISTRIBUIÇÃO DO COMPRIMENTO DAS CADEIAS LATERAIS DA AMILOPECTINA ........................... 49 5.7 DISTRIBUIÇÃO DO TAMANHO MOLECULAR DOS AMIDOS ................................................................................. 51 5.8 AFINIDADE COM IODO E TEOR DE AMILOSE ...................................................................................... 53 5.9 DIFRAÇÃO DE RAIOS-X E CRISTALINIDADE RELATIVA .................................................................... 55 5.10 PROPRIEDADES TÉRMICAS DOS AMIDOS NATIVOS E MODIFICADOS .............................................................. 57 5.11 PROPRIEDADES DE PASTA ............................................................................................................................... 60 5.12 PODER DE INCHAMENTO (PI) E SOLUBILIDADE (SS) ....................................................................................... 62 6 CONCLUSÃO .................................................................................................................................................. 65 7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................................................................ 66 LISTA DE FIGURAS Figura 1 Estrutura química das cadeias de amido.(a) amilose, (b) amilopectina. Adaptado de Muralikrishna e Nirmala (2005). ......................................................................... 19 Figura 2 Representação esquemática das cadeias A e B da amilopectina. Adaptado de Tester; Karkalas, Qi (2004) ............................................................................................. 20 Figura 3 Representação esquemática da estrutura do grânulo de amido. Adaptado de Gallant, Bouchet e Baldwin (1997). .................................................................................. 21 Figura 4 Porcentagem de açúcar redutor produzido em função do tempo durante a hidrólise enzimática do amido de mandioquinha-salsa, em diferentes condições: A: 40 SKB/g de amido de -amilase bacteriana e 10 U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 36 h; B) 20 SKB/g de amido de -amilase e 5U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 12 h e C) 5 U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 12 h... ................................................................................................ 42 Figura 5 Micrografias dos grânulos de amido de mandioquinha-salsa observados em microscópio óptico sob luz normal: (a) nativo; (b) moído 1h; (c) moído 2h; (d) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase; (e) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 1h; (f) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 2h. ....................................................................... 47 Figura 6 Micrografias dos grânulos dos amido observados em microscópio eletrônico de varredura: (a) nativo; (b) moído 1h; (c) moído 2h; (d) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase; (e) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 1h; (f) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 2h ........ 48 Figura 7 Distribuição do comprimento de cadeias ramificadas das amilopectinas dos amidos nativo, moídos e hidrolisados e moídos.. ............................................................ 49 Figura 8 Perfil de eluição dos componentes dos amidos de mandioquinha-salsa (a) nativo; (b) moído por 2 h; (c) Hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e e (d) Hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 2 h. .................... 53 Figura 9 Difractogramas de raios-X dos amidos: A- MSN: nativo; MS1h: nativo moído 1h; MS2h: nativo moído 2h; B- MSH: hidrolisado; MSH1h: hidrolisado e moído 1h; MSH2h: hidrolisado e moído 2h. .................................................... 55 Figura 10 Perfíl endotérmico dos amidos nativos e modificados, determinados por DSC. ... 58 Figura 11 Perfil viscoamolográfico do (a) amido nativo( ); submetido a moagem por 1 h ( ); submetido a moagem por 2 h (*); hidrolisado (X).; ................................... 60 Figura 12 Poder de inchamento da mandioquinha-salsa em função da temperatura dos amidos de mandioquinha-salsa: nativo; moído 1hora; moído 2 horas . ... 63 Figura 13 Soubilidade em função da temperatura dos amidos de mandioquinha-salsa nativo; moído 1hora; moído 2 horas. ....................................................... 64 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composição Química1 de amido de mandioquinha-salsa (% em relação à matéria seca). .................................................................................................................... 40 Tabela 2 - Porcentagem de hidrólise, por diferença de peso dos amidos hidrolisados. ......... 43 Tabela 3 - Diâmetro menor e maior, diâmetro médio e distribuição dos grânulos de amido de mandioquinha-salsa nativos, hidrolisados e/ou moídos por 1 e 2 h. ....... 44 Tabela 4 - Distribuição do comprimento de cadeias ramificadas das amilopectinas dos amidos nativos e modificados.. ........................................................................................ 50 Tabela 5 - Afinidade por iodob e teores de amilosec aparente dos amidos nativo e modificados.. ....................................................................................................... 54 Tabela 6 - Cristalinidade relativa dos amidos de mandioquinha-salsa nativo e modificados.. ............................................................................................................................. 57 Tabela 7 - Propriedades térmicas dos amidos nativo e modificados ....................................... 59 Tabela 8 - Propriedades de Pasta dos amidos nativo e modificados. .................................... 61 RESUMO Amidos modificados são utilizados pela indústria de alimentos por apresentarem melhor comportamento que amidos nativos. Modificações visando a redução do diâmetro granular para a obtenção de grânulos de tamanho similar aos da molécula de gordura tem sido de grande interesse, pois este amido modificado pode ser usado como substituto de gordura em diversas formulações. Para isso, o pré-tratamento enzimático pode ser usado para fragilizar a estrutura granular do amido e facilitar um posterior tratamento físico como a moagem, obtendo grânulos com menor diâmetro. O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da hidrólise enzimática seguida de moagem em moinho de bolas sobre as características estruturais e físico-químicas do amido de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza). Amido isolado de raízes de mandioquinha-salsa foi hidrolisado com -amilase bacteriana e/ou amiloglucosidase fúngica, a 37 oC, em três diferentes condições: A: 40 SKB/g de -amilase e 10 U/g amiloglucosidase por 36 h; B: 20 SKB/g de -amilase e 5 U/g amiloglucosidase por 12 h; C: 5 U/g amiloglucosidase por 12 h. Após hidrólise os mesmos foram moídos por 1 e 2 h. Os amidos nativos e modificados foram analisados quanto à distribuição de tamanho de grânulos. Houve redução do diâmetro dos grânulos para todos os amidos tratados, mas a condição de hidrólise B foi a escolhida para a continuidade dos experimentos, por ter apresentado uma distribuição de tamanho de grânulos após moagem mais homogênea. Os amidos nativos e hidrolisados com 20 SKB/g de -amilase e 5 U/g amiloglucosidase por 12 h foram analisados quanto a forma dos grânulos, distribuição do comprimento das cadeias laterais da amilopectina, distribuição do tamanho molecular dos componentes do amido, teor de amilose, difração de raios-X, propriedades de pasta e térmicas, poder de inchamento e solubilidade. Os grânulos de amido nativo, analisados em microscópios óptico e eletrônico de varredura, mostraram formatos circulares com depressões e irregularidades. A moagem provocou fissuras na superfície granular e formação de aglomerados. Os resultados de distribuição do tamanho molecular dos componentes do amido e distribuição do comprimento das cadeias laterais da amilopectina indicaram que além do rompimento das pontes de hidrogênio pela moagem, pode ter ocorrido também o rompimento das ligações glicosídicas -(1-6) nas áreas mais amorfas dos grânulos. O padrão cristalino tipo B, obtido por difractometria de raios-X, não mudou, mas a cristalinidade relativa diminuiu para os amidos modificados. O amido hidrolisado e moído por 2 h apresentou a maior redução na sua crstalinidade relativa (~ 30 %). A moagem cuasou ligeiro aumento no teor de amilose do amido principalmente após pré-tratamento enzimático. As temperaturas de gelatinização aumentaram e a entalpia reduziu com o aumento do tempo de moagem, principalmente após o pré-tratamento enzimático. Os resultados sugerem que o tratamento enzimático debilitou a estrutura granular facilitando o rompimento das pontes de hidrogênio pela moagem, o que tornou o tratamento físico mais eficiente. Palavras chave: amido; mandioquinha-salsa; hidrólise enzimática; moagem. ABSTRACT Modified starches are used by food industry because they have better performance than native starches. Modifications in order to reduce granular diameter to obtain granules of similar size to those of fat molecules has been of great interest, for this modified starch can be used as a fat substitute in various formulations. For this purpose, a enzymatic pretreatment can be used to weaken the granular structure of starch and facilitate a subsequent physical treatment such as grinding. The objective of this study was to investigate the effect of enzymatic hydrolysis followed by milling in a ball mill on the structural and physicochemical characteristics of Peruvian carrot (Arracacia xanthorrhiza) starch. Starch isolated from roots of Peruvian Carrot was hydrolyzed with bacterial -amylase and fungal amyloglucosidase at 37 °C in three different conditions: A: 40 SKB/g of -amylase and 10 U/g amyloglucosidase for 36 h; B: 20 SKB/g of -amylase and 5 U/g amyloglucosidase for 12 h; C: 5 U/g amyloglucosidase for 12 h. After hydrolysis, the starches were ball milled for 1 and 2 h. The native and modified starches were analyzed for granular size distribution. There was reduction of the granular diameter for all modified starches, but the B condition of hydrolysis was choosen to continue the experiments because the starches modified in this condition displayed a more homogeneous granular size distribution after milling. The native and hydrolyzed with 20 SKB / g of -amylase and 5 U / g amyloglucosidase for 12 h starches were analyzed for granule shape, distribution of branch chain length of amylopectin, molecular size distribution of the starch components, apparent amylose content, X-ray diffraction, thermal and pasting properties, swelling power and solubility. The native starch granules, analyzed in optical microscope and scanning electron microscope, showed circular shapes with depressions and irregularities. The ball milling caused fissures on granular surface and agglomerate formation. The results of molecular size distribution of the starch components, and distribution of branch chain length of amylopectin indicated that besides hydrogen bonds broken by ball milling, the -(1-6) linkages present mainly in amorphous áreas of granules can also have been broken by milling. The crystalline pattern B-type, obtained by X-ray diffractometry, has not changed, but the relative crystallinity decreased for all modified starches. The hydrolyzed and 2 h milled starch displayed the highest reduction in the relative crystallinity (~ 30 %). Milling caused slight increase in the amylose, mainly after enzymatic pretreatment. The gelatinization temperatures increased, and enthalpy reduced with increasing milling time, mainly after the enzymatic pretreatment. The results suggest that enzymatic pretreatment makes the granular structure weaker facilitating the breaking of hydrogen bonds by ball milling what become the physical treatment more efficient. Keywords: starch; peruvian carrot; enzymatic hydrolysis; ball milling. 16 1 INTRODUÇÃO O amido é o principal responsável pelas propriedades tecnológicas de grande parte dos produtos processados, uma vez que contribui para diversas propriedades de textura em alimentos, possuindo aplicações industriais como espessante, estabilizante de colóides, agente gelificante e de volume, adesivo, retentor de água, dentre outros (SINGH et al., 2003). Este polímero é uma substância de reserva para a maioria das plantas superiores e pode ser utilizada na sua forma nativa ou modificada. Modificações químicas, físicas e enzimáticas dão origem a amidos com propriedades específicas (APLEVICZ; DEMIATE, 2007; ZAVAREZE et al., 2009). O tamanho e a forma dos grânulos de amido estão entre os fatores de importância na determinação de usos potenciais também nas indústrias alimentícias, devido à influência dessas características sobre as propriedades de processamento de alimentos em pó (LEONEL; GARCIA; REIS, 2004). O mercado vem preferindo amidos com grânulos de menor diâmetro para muitas aplicações industriais. Embora existam amidos que apresentem grânulos com diâmetro bem pequeno, eles são difíceis de isolar, devido aos custos envolvidos na sua produção, o que os tornam menos viáveis economicamente. Na literatura, vários métodos têm sido citados (SANGUAPONG et al.; 2003; WU MIAO, 2007; CAVALLINI; FRANCO, 2010), os quais utilizam a combinação da modificação enzimática ou ácida do amido com algum tratamento físico com a finalidade de reduzir o diâmetro médio dos grânulos de amido. Assim, pequenas partículas de amido têm sido obtidas por combinação de hidrólise enzimática e atrito mecânico (SANGUAPONG et al., 2003). Durante a hidrólise, os grânulos tornam-se mais frágeis e quando submetidos à moagem se quebram produzindo partículas de menor diâmetro (JANE, 1992; CASTRO, 2000). Sanguanpong et al. (2003) estudaram a modificação enzimática do amido de mandioca, seguida de moagem em moinho de bolas, e revelaram que o dano mecânico provoca uma transformação na estrutura dos grânulos, de ordenada para desordenada (amorfa) por meio da quebra das ligações intermoleculares. Segundo esses autores, as fraturas observadas em algumas partes quebradas dos grânulos de amido eram paralelas ao eixo de crescimento das cadeias de amilopectina, e os grânulos quebrados em pequenos fragmentos contribuíram com a região amorfa. 17 Na moagem em moinho de bolas, a ação mecânica sobre o amido nativo ou submetido a um pré-tratamento causa um aumento das áreas amorfas com consequente redução da área cristalina devido à quebra das pontes de hidrogênio no interior do grânulo (CAVALLINI; FRANCO, 2010). Este processo resulta em mudanças gradativas na estrutura molecular, estrutura cristalina, solubilidade em água, características térmicas e morfológicas dos amidos através da força mecânica produzida pelo atrito das bolas com os grânulos de amido (HUANG et al., 2007). O amido de mandioquinha-salsa apresenta grânulos de formato circulares e irregulares, além de grânulos frágeis e quebradiços. Segundo Rocha et al. (2011), este é um amido de fácil cozimento, apresentando baixa temperatura de gelatinização e alta viscosidade de pico, baixa tendência a retrogradação e sinérese, o que contribui para sua alta digestibilidade. Este trabalho teve como objetivo investigar o efeito da hidrólise enzimática seguida da moagem em moinho de bolas do amido de mandioquinha-salsa em suas propriedades estruturais e físico-químicas. 18 2 OBJETIVO GERAL Investigar o efeito da hidrólise enzimática com -amilase bacteriana e amiloglucosidase fúngica seguida da moagem em moinho de bolas sobre as características estruturais e físico-químicas do amido de mandioquinha-salsa. 2.1 Objetivos especificos Caracterizar o amido nativo de mandioquinha-salsa. Estudar o efeito da enzima -amilase e amiloglucosidase em diferentes condições de hidrólise sobre as características morfológicas e estruturais e físico-químicas do amido de mandioquinha-salsa. Estudar o efeito da hidrólise seguida da moagem em moinho de bola sobre as características morfológicas e estruturais e físico-químicas do amido de mandioquinha-salsa. 19 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1 O AMIDO O amido é um carboidrato de reserva das plantas superiores e oferece de 70 a 80% das calorias consumidas pelo homem. Está presente nas folhas verdes das plantas, raízes, tubérculos, grãos de cereais, sementes, castanhas e frutas sendo sintetizado nos amiloplastos na forma de grânulos com tamanhos que variam de 1 a 100 μm e em diversos formatos (WHISTLER, BeMILLER, 1997; MUKERJEA; SLOCUM; ROBYT, 2007). Este polímero é composto de dois polissacarídeos, a amilose de estrutura linear e a amilopectina de estrutura ramificada. A amilose (Figura 1a) é relativamente pequena em sua massa molecular (101-102 Kg/mol) e apresenta poucas ramificações, enquanto a amilopectina (Figura 2.1b) apresenta de 5 a 6 % de ramificações e alta massa molecular (104-106 Kg /mol) (YOO; JANE, 2002). Essas moléculas se interagem através de pontes de hidrogênio, pois estão associadas paralelamente, resultando no aparecimento de regiões cristalinas ou amorfas (FRANCO et al., 2001). (a) (b) Figura 1 Estrutura química das cadeias de amido.(a) amilose, (b) amilopectina. Adaptado de Muralikrishna e Nirmala (2005). 20 Os grânulos de amido são estruturas semicristalinas compostas dessas macromoléculas arranjadas na direção radial, associadas paralelamente formando pontes de hidrogênio, que resulta no aparecimento de regiões cristalinas e amorfas. Quando vistos sob luz polarizada os grânulos apresentam uma típica cruz de Malta devido a sua birrefringência resultante do alto grau de organização molecular (FRANCO et al., 2001). As regiões cristalinas, nos grânulos de amido, consistem de duplas hélices fortemente empacotadas, formadas pelas ramificações da amilopectina, enquanto que a região amorfa, menos ordenada, contém os pontos de ramificação das cadeias laterais da amilopectina e possivelmente alguma amilose (BUELON et al., 1998). Vários modelos têm sido propostos para a estrutura da amilopectina. No modelo cluster, proposto por French (1973) e Robin et al. (1974), as cadeias de amilopectina estão organizadas e são denominadas cadeias A e B. As cadeias A, mais externas, tem comprimento de 60 Å e DP ~ 15. Já as cadeias B podem se estender por dois ou mais “clusters” sendo que cada cadeia B, pode carregar duas ou três cadeias B ou A. A associação destas cadeias A e B na forma de cachos (cluster), formam a fração do grânulo resistente à hidrólise ácida. Neste modelo, a maioria das ligações (1 6) estariam localizadas nas áreas intercristalinas (amorfas) entre os clusters (Figura 2.2). Figura 2 Representação esquemática das cadeias da amilopectina A e B, no modelo de cluster. Adaptado de Tester; Karkalas, Qi (2004). Gallant, Bouchet e Baldwin (1997) sugeriram que as camadas cristalinas e amorfas da amilopectina são organizadas dentro de estruturas maiores esféricas denominadas bloquetes, com diâmetros que variam entre 20 a 500 nm, conforme sua origem botânica (Figura 2.3). Assim, a amilopectina estaria localizada no grânulo em regiões cristalinas e semicristalinas e, nesta última, os bloquetes seriam menores, e a cristalinidade da amilopectina seria reduzida, principalmente devido a seu maior envolvimento com a amilose. 21 Figura 3 Representação esquemática da estrutura do grânulo de amido. Adaptado de Gallant, Bouchet e Baldwin (1997). A exata localização da amilose no grânulo tem sido motivo de muitos estudos e três hipóteses mais prováveis tem sido levantadas, de acordo com Jane (2006). A amilose estaria concentrada nas regiões periféricas do grânulo onde estariam fortemente associadas às moléculas de amilopectina, e nas outras duas hipóteses a amilose estaria localizada tangencialmente a orientação radial da amilopectina o que diminuiria as interações helicoidais entre a amilose e amilopectina (BULÉON et al., 1998). 3.2 PROPRIEDADES FUNCIONAIS DO AMIDO Quando a suspensão de amido em água é aquecida, inicia-se um processo de modificação denominado gelatinização. À medida que o aquecimento prossegue, os grânulos hidratam e incham absorvendo mais água. Inicialmente a agua penetra nas áreas amorfas onde as pontes de hidrogênio são mais fracas e mais facilmente rompidas, e a estrutura granular se altera irreversivelmente. Se houver água suficiente, ocorre a perda da birrefringência e da 22 ordem cristalina do grânulo que acabam por se romper com consequente lixiviação da amilose (BILIADERIS, 1991; THOMAS E ATWELL, 1999; HOOVER, 2001; SINGH et al., 2003). A gelatinização e as propriedades de inchamento do amido são controladas parcialmente pela estrutura molecular da amilopectina, proporção de amilose/amilopectina, teor de fósforo e razão entre as regiões cristalinas e amorfas. A intensidade da perfeição cristalina é refletida na temperatura de gelatinização (TESTER, 1997; SINGH et al., 2003). A reassociação das moléculas gelatinizadas promove uma reordenação da estrutura do amido, devido a uma tendência de tais moléculas se unirem por pontes de hidrogênio, gerando partículas de maior tamanho que, por serem mais pesadas, precipitam. Sob certas condições, o amido gelatinizado sofre dextrinização e hidrólises parciais, porém em seguida, sofre polimerizações, tornando-se insolúvel em água fria e resistente à ação das amilases. Este fenômeno é freqüente em pastas de amido envelhecidas e é denominado por retrogradação (ATWELL et al., 1988). De acordo com Singh et al., (2003) o conteúdo de amilose é um dos fatores que influência a retrogradação do amido. Quanto maior o conteúdo de amilose maior a tendência a retrogradação. Outros fatores como a fonte botânica do amido, concentração, condições de aquecimento e resfriamento, pH e presença de solutos como lipídeos e açúcares também são determinantes nesse processo (LAJOLO; MENEZES, 2006). Estas mudanças que ocorrem durante a gelatinização e retrogradação (propriedades de pasta) são medidas principalmente por dois equipamentos como Viscoamilógrafo Brabender e o RVA (Rápido Viscoanalisador) (FRANCO et al., 2001). Além das propriedades de pasta, as propriedades térmicas, mensuradas em Calorímetro Exploratório de Varredura, fornecem informações sobre as transformações que ocorrem dentro do grânulo de amido durante o aquecimento e resfriamento na presença de água, como temperaturas de gelatinização, retrogradação e cristalização (YU; CHRISTIE, 2001) e ainda detecta o fluxo de calor, medindo a quebra das pontes de hidrogênio que estabilizam as duplas hélices (TESTER, 1997). 3.3 AMIDO MODIFICADO Na indústria de alimentos o amido possui as mais variadas aplicações. Além da forma nativa, o amido pode sofrer modificações que o molda de acordo com as características 23 tecnológicas, para conferir a funcionalidade desejável no desenvolvimento de novos produtos (CIACCO; CRUZ, 1982). Contudo, são inúmeras as razões para que o amido granular seja modificado como: diminuir a tendência de retrogradação, aumentar a estabilidade frente ao aquecimento e atrito mecânico, aumentar a estabilidade das pastas frente ao resfriamento e congelamento, aumentar transparência e adesividade, melhorar textura das pastas ou géis e a formação de filmes, adicionar grupamentos hidrofóbicos e introduzir poder emulsificante (BeMILLER, 1997; BORTOLO, 1998). Os amidos podem ser modificados por via química, física ou enzimática. As modificações químicas são as mais utilizadas devido a sua versatilidade, permitindo a obtenção de amidos com propriedades físico-químicas diferenciadas (DEMIATE, 2003). Os amidos modificados por processo físico possuem a vantagem de não serem limitados pela legislação quanto às quantidades utilizadas, sendo considerados como ingredientes, já os amidos modificados quimicamente devem ser mencionados como amido modificado (CEREDA; VILPOUX; DEMIATE, 2003). As modificações enzimáticas, além de serem um importante processo industrial para a produção de adoçantes, xaropes e outros produtos químicos (etanol, acetona, etc.) (LI et al., 2004), também podem ser utilizadas, como pré-tratamento do grânulo de amido com a finalidade de debilitar sua estrutura, para um posterior tratamento físico como a moagem (SANGUAPONG et al., 2003). Segundo Sanguanpong et al. (2003) o processo enzimático utilizando -amilase e amiloglucosidase no amido de mandioca apresentaram uma superfície esponjosa, com conchas em seu interior. A conseqüência do múltiplo ataque pelas enzimas é a degradação das regiões amorfas e cristalinas. Este enfraquecimento da estrutura granular proporcionado pelo pré-tratamento enzimático auxilia a redução de tamanho do grânulo após a moagem. 3.3.1 Amido Modificado por Enzima Os amidos modificados por enzima são produzidos pelo uso de basicamente cinco grupos enzimáticos. As endo e exoamilases agem primeiramente nas ligações -(1,4), ao passo que as enzimas desramificantes agem exclusivamente nas ligações -(1,6). Um quarto grupo é constituído pelas isomerases que agem nos xaropes de glucose para convertê-los em xarope de frutose. Já as ciclodextrinaglicosiltransferase degradam o amido pela catalização de 24 reações de despolimerização e de ciclização (GUZMÁN–MALDONADO; PAREDES- LÓPES, 1995). A taxa de hidrólise dos grânulos de amido está diretamente ligada à origem botânica do mesmo, assim como ao sistema enzimático utilizado, concentração, e ao tamanho dos grânulos. Amidos de superfície porosa, como é o caso dos grânulos de amido de milho, tendem a sofrer uma degradação mais rápida do que aqueles cuja superfície é lisa, como o de mandioca. Grânulos de menor diâmetro são mais suscetíveis às enzimas que aqueles de maior diâmetro (FRANCO; CIACCO, 1992; FRANCO; CIACCO; TAVARES, 1988, 1998). Estudos apontam que a suscetibilidade do grânulo de amido ao ataque enzimático está relacionada também a fatores como seu teor de amilose e de amilopectina. Além disso, alguns estudos mostram que grande parte dos grânulos de amido tem seu teor de amilose reduzido após o ataque enzimático, como observado por Cho et al. (2009) para amido de arroz e por Rocha, Carneiro e Franco (2010) para os amidos de mandioca, batata-doce, mandioquinha- salsa e batata. Já Absar et al. (2009), avaliando a suscetibilidade de amidos de batata contendo diferentes teores de fósforo à ação enzimática de -amilose e glucoamilase notaram que não houve influência da quantidade de amilose, mas que o maior teor de fósforo está relacionado à redução da ação enzimática nos grânulos. Oates (1997) sugeriu que uma maior taxa de hidrólise enzimática poderia ser obtida mantendo-se o amido nativo incubado a temperaturas próximas a 60°C. Shariffa et al. (2009) conduziram um estudo com amidos de batata-doce e tapioca, avaliando a suscetibilidade dos grânulos à hidrólise enzimática sob ação sinérgica de -amilase fúngica e amiloglucosidase e após o tratamento térmico (annealing), sempre abaixo da temperatura de gelatinização. Esses autores concluíram que a exposição dos grânulos a temperaturas mais elevadas (60°C), porém menores que a temperatura de gelatinização dos amidos, facilita a ação das enzimas e aumenta a taxa de hidrólise, possivelmente porque em temperaturas próximas as de gelatinização, a região amorfa do grânulo de amido sofre um inchamento irreversível, permitindo o maior ataque das enzimas. Durante o processo de hidrólise por enzimas, as regiões dos grânulos são degradadas de forma desigual, as áreas amorfas por serem menos organizadas são mais suscetíveis que as áreas cristalinas que oferece uma maior resistência à ação enzimática (OATES, 1997). Porém Colonna; Buléon; Lemane (1988) observaram que a -amilase pode atacar simultaneamente as áreas amorfas e cristalinas do amido granular, enquanto LAURO et al. (1999) 25 reportaram que em um estágio inicial da hidrólise de amido de cevada, ambas as áreas cristalinas e amorfas foram igualmente atacadas. 3.3.1.1 Ação da Enzima -amilase Pandey et al. (2005) definem -amilase (1,4- -glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.1.) como sendo uma endoenzima que quebra as ligações (1,4) dos polissacarídeos que possuem três ou mais unidades de D-glucose ligadas em -1,4. O ataque ocorre de forma não seletiva e, sobre vários pontos da cadeia simultaneamente, sendo que os primeiros produtos da hidrólise são sempre oligossacarídeos de 5 a 7 unidades de glicose. Isso representa um ataque preferencial sobre cada passo da estrutura helicoidal da amilose ou da dupla hélice da amilopectina (BRUCHMANN, 1980). A enzima forma com o substrato um complexo, independentemente da posição inicial do substrato. O complexo enzima substrato formado possui uma conformação ideal para a catalise. A ligação da direita esta mais fracamente associada à enzima que a da esquerda, por isso a ligação da direita se associa deixando o lugar desocupado. O fragmento da esquerda se rearranja para ocupar todo lugar da ligação, este processo produz um complexo enzima- substrato com geometria ideal para posterior catálise (HOOVER; ZHOU, 2003). Contudo, diversos fatores são responsáveis pela ação enzimática. Além da concentração, tempo e temperatura, a espécie botânica do substrato pode facilitar ou limitar a extensão da hidrolise. Por exemplo, amidos de tuberosas e raízes são hidrolisados por somente uma enzima purificada, já os amidos de cereais são completamente e rapidamente digeridos pelas enzimas (ROBERTSON et al., 2006). Estudos realizados por Tester, Qi e Karkalas (2006) observaram que amidos com alto teor de amilose são altamente resistentes à hidrólise por -amilase devido à ação desta enzima na fração amilose. 3.3.1.2 Ação da enzima amiloglucosidase Conhecida como glucoamilase, a amiloglucisidase é uma exoenzima produzindo D- glicose a partir da extremidade não redutora da cadeia do amido. Esta enzima é capaz de catalisar a hidrolise de ligações glicosídicas -1,4 e -1,6 (KIM, ROBYT, 1999; 26 NOROUZIAN et al., 2006), portanto é importante biocatalisador industrial utilizado na produção de xarope de glicose (NOROZIAN, et al., 2006; SHARIFFA, et al., 2009). A atuação da enzima amiloglucosidase fúngica ocorre por três domínios, um domínio do sítio de atividade, um domínio ligador glicosilado, e um domínio de quebra do amido. A presença do domínio de quebra do amido permite a enzima hidrolisar todo o grânulo de amido (KIMURA; ROBYT, 1996). A atividade específica da amiloglucosidade na clivagem de ligações glicosídicas -1,6 é apenas 0,2% da atividade específica na clivagem de ligações -1,4. A baixa taxa de clivagem de ligações -1,6 é um efeito adverso na cinética da enzima e na eficiência de sacarificação, e portanto diminui a sua velocidade de atuação (NOROUZIAN et al., 2006). A amiloglucosidase fúngica age sobre a amilose numa velocidade lenta quando comparada com o ataque à amilopectina, pois sendo uma exoenzima, só atua a partir da extremidade não-redutora e não penetra no interior da estrutura helicoidal da amilose. O grânulo de amido adsorve a amiloglucosidase da solução em diferentes proporções, dependendo do tipo de amido (KIM; ROBYT, 1999). Kim e Robyt (1999) estudando o amido de milho normal e ceroso observou que amidos que possuem poros em sua superfície são mais facilmente hidrolisados pelas amilases. Para esses autores, a penetração da amiloglucosidase fúngica no grânulo de amido produz buracos aumentando o tamanho dos poros na superfície do grânulo. 3.3.1.3 Efeito da ação sinérgica da - amilase e a amiloglucisidase Segundo Fellows (2006) e Pandey et al (2005), as enzimas -amilases e amiloglucosidases são amplamente empregadas industrialmente para a manufatura de diversos produtos. Devido a isso, muitos estudos vêm sendo realizados para a melhor compreensão deste sinergismo. Quando a amiloglucosidase age sozinha não há mudança no número de sítios do substrato até a amilose ou amilopectina serem digeridas aos seus últimos resíduos. No entanto quando as enzimas -amilase e amiloglucosidase agem em conjunto, a ação endo-catalítica aumenta o número de sítios do substrato para a ação da exo-enzima, permitindo um aumento na taxa de conversão. No estágio inicial da hidrólise, as ações catalíticas das enzimas podem 27 permitir à desintegração física da estrutura e consequentemente exporem novos sítios suscetíveis à ação de ambas as enzimas (ROBERTSON et al.,2006). Existem muitos trabalhos sobre o efeito sinergístico das duas enzimas incluindo amidos de mandioca e a própria mandioquinha-salsa (FRANCO; CIACCO; TAVARES, 1988; SANGUAPONG et al., 2003; ROCHA; CARNEIRO; FRANCO, 2010). A eficiência do uso destas duas enzimas foi observada em grânulos de amido de arroz, sagu e batata por Monna et al. (1989). Estes pesquisadores concluíram que esta combinação apresenta bons rendimentos na conversão do amido à glicose em todos os substratos. Matsubara et al. (2004) comparou a ação da -amilase e amiloglucosidase nos grânulos de amido de milho, e observou que os resíduos obtidos da hidrólise por -amilase resultam na formação de grandes buracos na superfície do grânulo de amido. Estudos realizados por Sanguanpong et al. (2003) observaram que a hidrólise enzimática pode ser utilizada como um pré-tratamento para fragilizar o grânulo de amido e promover a degradação das áreas amorfas e cristalinas do grânulo de amido. A hidrólise com -amilase e amiloglucosidase no amido de mandioca produziu grânulos com uma estrutura esponjosa e conchas em seu interior. Amilose e amilopectina foram sujeitos a ataques múltiplos pelas enzimas, sem qualquer alteração significativa na cristalinidade dos grânulos. 3.3.2 Amido Modificado Fisicamente Modificações físicas a fim de diminuir o tamanho do grânulo de amido e suas aplicações tais como substitutos de gordura, filmes plásticos, cosméticos e produtos farmacêuticos tem sido investigadas (JANE, et al. 1992). Grânulos de amidos com tamanho reduzido apresentam uma sensação cremosa na boca, característica apreciada em diversas formulações (MALINSKI; DANIEL; ZHANG; WHISTLER, 2003). A quebra mecânica do grânulo de amido por aplicação de uma força física pode ser efetiva na obtenção de grânulos de tamanho similar aos da micela de gordura, principalmente após um pré-tratamento para debilitar a estrutura granular, como a hidrólise enzimática ou ácida (JANE et al., 1992; NIEMANN; WHISTLER, 1992; SANGUANPONG et al.,2003). Quando o grânulo de amido é submetido a forças físicas, durante a moagem, acontecem consideráveis alterações na sua na estrutura molecular, estrutura cristalina, solubilidade em água, características térmicas e morfológicas (JANE et al. 1992; 28 MORRISON, TESTER, 1994; TAMAKI et al., 1998; SANGUANPONG et al, 2003; HUANG et al., 2007). Ocorre a efetiva destruição da estrutura granular, pela moagem, com a formação de um material amorfo, mesmo sem a adição de água e calor (KIM et al., 2001), e com formação de uma estrutura amorfa, uma maior quantidade de partículas de menor diâmetro é obtida (SANGUANPONG et al, 2003). A moagem pode ser conduzida em estado sólido, e a ação das bolas sobre os grânulos de amido não ocorre de forma homogênea. O resultado da ação da moagem é o rompimento das ligações glicosídicas, o que depende de diversos fatores, como, força de impacto, diâmetro do cilindro, quantidade de bolas e velocidade de rotação. Portanto, as mudanças nas regiões internas e externas no grânulo de amido são peculiares às condições de tratamento nele empregados (TAMAKI et al., 1998). Conforme Ren et al. (2010) o tratamento físico em moinho de bolas é divido em duas etapas. Na primeira etapa ocorrem as operações de cisalhamento, impacto e atrito entre a matriz de moagem e o amido, quebrando os grânulos em pequenos fragmentos, o que rompe as pontes de hidrogênio no grânulo, reduzindo e criando defeitos na região cristalina, incluindo mudanças na estrutura do grânulo de amido. Neste momento, as superfícies de alguns grânulos são espontaneamente ativadas, e são produzidos aglomerados, resultando em mudanças no tamanho das partículas maiores. Assim, grânulos pequenos são produzidos, e a distribuição do tamanho dos grânulos se torna mais ampla e uniforme. Na segunda etapa se estabelece um valor de granulação e os grânulos tornam-se mais resistentes e difíceis de quebrar. A quebra desses grânulos se torna impossível e somente transformações plásticas podem ocorrer. Os resultados encontrados por Huang et al. (2007, 2008) no estudo dos efeitos da moagem em moinho de bolas nas características físico-químicas e propriedades estruturais de amido de mandioca mostraram que o tratamento melhorou a solubilidade do amido em água fria, sendo que o aumento da solubilidade estava relacionado ao tempo de ativação. A degradação da estrutura cristalina resultante da ativação mecânica permitiu uma maior entrada de água no interior do grânulo. Os danos na estrutura cristalina do amido também foram observados pela redução da viscosidade aparente, pois a afinidade intramolecular no amido foi diminuída. Segundo Zhang, Zhao e Xiong (2010), à medida que o tempo de moagem aumentou, a forma e o tamanho dos grânulos de amido de arroz foram alterados como resultado da destruição da estrutura cristalina, pois ocorre uma decomposição da amilose e da amilopectina 29 do amido de arroz, causando um aumento da solubilidade, poder redutor e diminuição do “Blue Value”. De acordo com Ren et al. (2010), após a moagem do amido de mandioca, as camadas mais externas do grânulo foram removidas como se o grânulo fosse descascado, a estrutura cristalina de amido foi danificada, o grau de desordem aumentou e o grau de cristalinidade e a temperatura de fusão diminuíram. Portanto, ao contrário dos amidos nativos, o grânulo de amido moído absorve menos água e é facilmente gelatinizado por tratamento térmico, devido à quebra ou enfraquecimento das cadeias poliméricas. Assim quantidade de água disponível no sistema é aumentada quando o tamanho do grânulo de amido é reduzido, causando queda na temperatura de transição vítrea. Porém a moagem em moinho de bolas pode induzir à gelatinização sem aplicação de calor e água (CAVALLINI E FRANCO 2010 ;TAMAKI et al., 1998). A gelatinização a frio dos amidos danificados mecanicamente tem resultados muito similares à gelatinização causada por aquecimento (MORRISSON; TESTER; GIDLEY, 1994). Visando facilitar a quebra do grânulo em moinho de bolas o pré-tratamento enzimático vem sendo estudado, e um fator importante é o grau de hidrólise para a obtenção de um amido com propriedades de substituto de gordura (LUCCA; TEPPER, 1994; ZAMBRANO; CAMARGO, 1999). A ação da enzima debilita a estrutura granular produzindo grânulos frágeis e mais fáceis de serem quebrados por uma posterior ação mecânica Dessa forma a combinação da modificação enzimática com a moagem produz amidos com tamanhos de partículas pequenas entre 3 e 8 μm, diâmetro bem menor quando comparadas às partículas de um amido nativo entre 3-30 μm (SANGUANPONG et al, 2003). Sanguanpong et al. (2003) modificaram enzimaticamente amido de mandioca usando -amilase e amiloglucosidase antes da moagem em moinho de bolas. Esses autores observaram, após a hidrólise, a formação de grânulos de amido de menor diâmetro e de aparência esponjosa, os quais se mostraram frágeis e sofreram considerável fragmentação e deformação durante o processo físico, portanto, a ação das enzimas proporcionou um desordenamento da estrutura granular. Jane et al. (1992) e Niemann e Whister (1992) utilizando o pré-tratamento por ácido em amido de milho observaram a hidrólise produziu grânulos frágeis e que poderiam ser quebrados em pequenas partículas com o atrito mecânico. Estes autores observaram que as partículas cristalinas foram preservadas e o tamanho dos grânulos reduzidos a tamanhos de 2 μm. 30 3.4 MANDIOQUINHA-SALSA A mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza) é uma raiz originária dos Andes colombianos, tendo sido introduzida no Brasil por volta de 1900. É cultivada principalmente na região sudeste do Brasil, onde se adaptou às condições edafoclimáticas semelhantes àquelas da região de origem (CAMARA; SANTOS, 2002). Esta raiz, conhecida também como batata-baroa, batata-cenoura, cenoura-amarela, batata-fiusa, batata-tupinambá, batata-arracacha, batata-jujuba ou batata-suíça (CASALI; SEDYAMA, 1997), é um alimento de alto valor nutritivo, quando comparada com outras espécies amiláceas como a mandioca, batata, cará e batata doce. Caracteriza-se como um alimento essencialmente energético, apresentando 25 g de carboidratos, em média, por 100 g de raiz, além de constituir uma boa fonte de vitamina A e niacina, apresentando também consideráveis níveis de minerais, como cálcio, fósforo e ferro (PEREIRA,1995). O amido de mandioquinha-salsa apresenta baixa temperatura de gelatinização e alta viscosidade de pico, sendo muito suscetível ao atrito mecânico. Também possui baixa tendência à retrogradação e sinérese, o que contribui para sua alta digestibilidade. Trabalhos anteriores caracterizando este amido têm mostrado que o mesmo apresenta um padrão de difração de raios-X tipo-B e um teor de amilose aparente variando entre 17,8 a 21,7% dependendo da variedade (ROCHA; DEMIATE; FRANCO, 2008). O teor de amilose absoluto encontrado para este amido foi de 9,1%, enquanto a distribuição de comprimento de cadeia da amilopectina mostrou altas proporções de cadeias curtas (DP 6-12) e longas (DP > 37) (ROCHA et al., 2011). Os grânulos do amido de mandioquinha-salsa são arredondados e irregulares, com diâmetro variando de 7 a 23 m (SANTACRUZ et al., 2002). 31 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 Material Raízes frescas de mandioquinha-salsa (Arracacia xanthorrhiza) variedade Senador Amaral, obtidas na cidade de Tapiraí-SP e colhidas após 9 meses de plantio, foram utilizadas neste projeto. As enzimas puras -amilase bacteriana (A6380) e amiloglucosidase fúngica (A7420) foram adquiridas da Sigma Chemical CO., USA. Todos os outros reagentes utilizados foram puros para análise. 4.2 Métodos 4.2.1 Isolamento dos Amidos As raízes de mandioquinha-salsa foram lavadas, descascadas e lavadas novamente para retirada das impurezas. Em seguida, foram cortadas em cubos pequenos, os quais foram moídos com água na proporção de 1:1 (v:v) num liquidificador industrial de aço inox com capacidade para 4 litros, por 30 s e filtrados através de peneiras de 80 mesh (0,177 mm) e 150 mesh (0,105 mm) para separar as fibras do amido. O resíduo retido nessas peneiras foi removido e moído novamente com água, na mesma proporção por um período de 15 s para melhor retirada do amido. O amido recuperado das duas filtrações foi misturado e submetido a processo de decantação sob refrigeração por 12 h. Após este período, o líquido sobrenadante foi drenado por sifonação. O amido foi novamente suspenso em água destilada até que o sobrenadante estivesse límpido, recuperado por sifonação e seco em estufa com circulação de ar a 40ºC por 12 h. 4.2.2 Composição Química O amido de mandioquinha-salsa foi analisado, em triplicata, quanto ao teor de umidade, proteínas, lipídeos e cinzas de acordo com os métodos descritos nos Approved Methods of the American Association of Cereal Chemists (AACC 2000). O teor de fósforo 32 foi determinado pelo método espectrofotométrico de acordo com Smith e Caruso (1964). O teor de carboidratos totais foi determinado por diferença. 4.2.3 Hidrólise enzimática do amido 4.2.3.1 Atividade da enzima -amilase bacteriana A determinação da atividade em SKB da enzima -amilase bacteriana (A6380, Sigma Chemical CO, EUA) foi calculada baseado na medida do tempo requerido para hidrolisar o amido a um tamanho definido de dextrina de acordo com Sandsted , Kneen e Blish (1939). Este tamanho foi indicado pela cor do complexo dextrina-iodo em relação à cor de uma solução padrão constituída de 25,00 g de cloreto de cobalto hexahidratado, 3,84 g de dicromato de potássio em 100 mL de ácido clorídrico 0,01 N. Uma solução de iodo foi preparada diluindo num volume total de 500 mL de água destilada, 2 mL de solução estoque de I2-KI (5,5 g de I2 e 11 g de KI em 250 mL de água destilada) com 20 g de KI. Uma alíquota de 1 mL de solução de enzima (0,002 % m/v) foi adicionada à 20 mL de uma solução de amido solúvel 2 % (m/v) em tampão fosfato (0,05 M e pH 6,0). O volume foi completado para 30 mL de água destilada e a solução deixada em banho-maria a 40 C. A cada minuto uma alíquota de 1 mL da mistura de reação foi retirada e adicionada 5 mL da solução de iodo. Este procedimento foi repetido até a obtenção de uma coloração igual à da solução padrão. A atividade da -amilase em SKB foi calculada pela equação 1 descrita por Sandsted, Kneen e Blish (1939). Unidades em SKB = c x tg x t m (Equação 1) m = massa em gramas de amido; t = 60 min; g = gramas da enzima/mL; tc = tempo de incubação em min 4.2.3.2 Atividade da enzima amiloglucosidase fúngica A atividade da amiloglucosidase fúngica (A7420, Sigma Chemical CO., EUA) foi determinada segundo Ueda et al. (1980), com modificações. A uma alíquota de 2,5 mL de solução do amido solúvel (1 % m/v) foi adicionada 0,5 mL de tampão acetato (0,05 M e pH 33 4,5), 0,5 mL de água destilada e 0,5 mL de solução de enzima (0,002% m/v). Esta mistura foi incubada a 55 C por 10 min. Após este período, 1 mL de solução foi retirada e os açúcares redutores produzidos foram determinados pelo método de Somogyi (1945). Uma unidade de atividade (U) da amiloglucosidase fúngica foi definida como sendo aquela quantidade de enzima que produz 1 mg de glicose/mL da mistura de reação sob as condições descritas. 4.2.3.3 Hidrólise enzimática O amido nativo foi hidrolisado com -amilase bacteriana e amiloglucosidase fúngica segundo Franco e Ciacco (1992). Suspensões de amido (10 % m/v) em solução tampão fosfato 0,5 M, pH 5,5 foram incubadas a 37 C em três diferentes condições: A) 40 SKB/g de amido de -amilase bacteriana e 10 U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 36 h; B) 20 SKB/g de amido de -amilase e 5U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 12 h e C) 5 U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 12 h. Para evitar o crescimento microbiano, 1 mL de solução de azida de sódio (10 % m/v) foi adicionada às suspensões. As suspensões foram agitadas em shaker com agitação orbital (120 rpm) durante o período de incubação. A extensão da hidrólise foi determinada pela quantificação dos açúcares redutores presentes no sobrenadante (SOMOGYI, 1945) a cada 2 ou 4 h. Após o período final de incubação, a reação foi interrompida com etanol absoluto e acetona segundo Vieira e Sarmento (2008). Os resíduos foram secos em estufa com circulação forçada de ar a 38 C por 12 h e a porcentagem de hidrólise calculada através da equação 2: % Hidrolise = i fi m m - m (Equação 2) Onde: mi = massa de amido inicial em base seca; mf = massa de amido após a hidrólise em base seca. 4.2.4 Modificação física O amido nativo e os resíduos obtidos das hidrólises enzimáticas foram moídos em 34 moinho de bolas da marca Marconi modelo MA 500 durante 1 e 2 h na posição máxima (200 rpm). As esferas utilizadas apresentavam 17g cada e 20 mm de diâmetro sendo que 30 esferas foram necessárias para a moagem de 30 g de amido. 4.2.5 Forma e distribuição do tamanho dos grânulos de amido A distribuição de tamanho dos grânulos e forma dos amidos nativo e modificados foi determinada usando um Microscópio Ótico de Luz Olympos, acoplado a um sistema de análise de imagem “image-pró-plus” (média cybernetics), como descrito por Peroni, Rocha e Franco (2006). O parâmetro avaliado foi o diâmetro médio de cada grânulo ( m). Foram preparadas 3 lâminas para cada amostra e de cada lâmina foram tomadas medidas de 150 grânulos. 4.2.6 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) A microscopia eletrônica de varredura das amostras foi realizada através de um Microscópio Eletrônico de Varredura, modelo DSM 960 ZEISS - ”Digital Scanning Microscope". Uma pequena quantidade de amostra dos amidos nativo e modificados foi colocada sobre uma fita adesiva de carbono dupla face, aderida a um disco metálico que foi conduzido a um Metalizador, para aplicação de uma camada de ouro de 20 μm. As amostras assim preparadas foram observadas em MEV e imagens com aumento de 1000 x foram obtidas. 4.2.7 Distribuição dos comprimentos de cadeias ramificadas da amilopectina 4.2.7.1 Desramificação dos amidos Os amidos nativo e modificados foram desramificados com isoamilase (EC 3.2.1.68) de Pseudomonas sp. (Megazyme International Ireland Ltd., Wicklow, Irlanda) seguindo procedimento de Wong e Jane (1995) com modificações. Suspensões de 5 mL dos amidos em DMSO 90 % (10 mg/mL) foram agitadas em banho de água fervente por 30 min, e por mais 35 16 horas a temperatura ambiente. Etanol absoluto (20 mL) foi adicionado e o precipitado foi recuperado por centrifugação a 2000 g por 20 min. O precipitado foi suspenso em 4,5 mL de H2O e mantido em banho de água fervente por 15 min com agitação. Após resfriar, 0,5 mL de tampão acetato 0,1M , pH 3,5, 3 L de solução de isoamilase (Megazyme, 3 U ) e 6 L de solução de azida sódica 10 % (m/v) foram adicionados e a mistura foi mantida a 37 ºC por 24 h. Após este período, a mistura foi mantida em banho de água fervente por 15 min. Alíquotas de 0,5 mL foram diluídas em H2O deionizada ultra pura (18 M .cm) para 5 mL (concentração final de 1,0 mg/ml). Imediatamente antes da injeção no cromatógrafo as amostras foram filtradas em membranas de teflon de 0,22 m. 4.2.7.2 Cromatografia de troca aniônica de alta eficiência com detecção de pulso amperométrico (HPAEC-PAD) A distribuição do comprimento das cadeias ramificadas da amilopectina foi avaliada num sistema HPAEC-PAD (ICS 3000, Dionex Corporation, EUA) equipado com amostrador automático AS40 seguindo metodologia descrita por Campanha (2010). As amostras de 20 μL preparadas como descrito acima foram automaticamente injetadas num ‘loop’ de 50 L. A forma de onda empregada foi ‘standard quadruple’ com os seguintes pulsos de potenciais e durações: E1 = 0,10 V (t1 = 0,40 s); E2 = -2,00 V (t2 = 0,02 s); E3 = 0,60 V (t3 = 0,01 s); E4 = - 0,10 V (t4 = 0,06 s). Os eluentes foram preparados com água deionizada ultra pura (18 M .cm) e degaseificados com N2; o eluente A consistiu de 150 mM NaOH e o eluente B consistiu de 500 mM acetato de sódio em 150 mM NaOH. Os componentes lineares foram separados numa coluna CarboPac PA1 com gradiente de eluição (-2,3 a 0 min, 25 % B; 7 min, 40 % B; 12 min, 50 % B; 20 min, 60 % B; 50 min, 80 % B) a uma temperatura de 40 ºC e fluxo de 1,0 mL/min. Um guarda-coluna CarboPac PA1 foi instalado antes da coluna analítica. Padrões de DP 1 a 7 (Sigma Chemical CO., EUA) foram usados para a identificação dos picos. Os dados foram coletados utilizando-se o software Chromeleon, versão 6.8 (Dionex Corporation, EUA). As análises foram realizadas em duplicata. 36 4.2.8 Distribuição do tamanho molecular dos componentes dos amidos A distribuição de tamanho molecular dos componentes dos amidos nativo e tratados enzimática e/ou físicamente foi determinada por cromatografia de permeação em gel seguindo o procedimento descrito por Song e Jane (2000). Utilizou-se uma coluna Pharmacia Biotech de 70 cm de altura e 1,5 cm de diâmetro empacotada com gel Sepharose CL-2B conectada a uma bomba peristáltica para manter um fluxo constante de eluente de 0,5 mL/min. O eluente consistiu de NaCl (25 mM) e NaOH (1 mM) degaseificado a vácuo por no mínimo 4 h. As amostras dos amidos foram previamente preparadas adicionando-se 100 mg de amido em 10 mL de solução de dimetilsulfóxido (DMSO) 90 %. A mistura foi mantida em banho de água fervente com agitação por 1 h e posteriormente resfriada e mantida sob agitação a temperatura ambiente por 24 h. Uma alíquota de 3 mL desta solução foi misturada com 12 mL de etanol absoluto e centrifugada a 3100 x g por 30 min. O sobrenandante foi descartado e ao amido precipitado foram adicionados 10 mL de água deionizada quente e 1 mg de glicose anidra. A mistura foi novamente mantida em banho de água fervente por 30 min e resfriada a temperatura ambiente para ser aplicada na coluna. Uma alíquota de 5,0 mL (15 mg de amido e 0,5 mg de glicose anidra) foi aplicada à base da coluna e eluída de forma ascendente. Frações de 2,5 mL foram coletadas a cada 5 min e analisadas quanto ao teor de açúcares totais, usando o método de fenol sulfúrico (DUBOIS et al., 1956) modificado segundo procedimento descrito por Fox e Robyt (1991), para proporcionar leitura em microleitora de absorbância, e quanto ao blue value através de reação de coloração com iodo (JULIANO, 1971). 4.2.9 Afinidade com iodo e teor de amilose aparente Os amidos nativo e modificados foram previamente desengordurados conforme descrito por Franco et al. (2002), com modificações. Amostras de 0,5 g foram dispersas em 25 mL de DMSO 90%, colocadas sob agitação em banho de água fervente por 1 h e em seguida agitadas por mais 16 h a temperatura ambiente. Os amidos foram precipitados com aproximadamente 75 mL de etanol absoluto e recuperados por centrifugação a 4000 g por 10 min. Os amidos desengordurados foram secos em estufa com circulação forçada de ar a 38ºC por 24 h. As afinidades por iodo (AIs) dos amidos desengordurados foram determinadas usando 37 um autotitulador potenciométrico (716 DMS Titrino, Metrohm, Suíça). Os teores de amilose aparente foram determinados conforme descrito por Kasemsuwan et al. (1995). Todas as determinações foram realizadas, no mínimo, em triplicata. O teor de amilose aparente foi calculado segundo a equação 3: AMap=100× AIA 20% Equação (3) Onde: AMap = teor de amilose aparente AIA = afinidade por iodo do amido integral 20% = afinidade por iodo da amilose pura (TAKEDA; HIZUKURI, JULIANO 1987). 4.2.10 Difração de raios-X Amidos nativo e modificados foram armazenados por 10 dias a 25 C em um dessecador contendo uma solução de BaCl2 que mantinha uma umidade relativa (UR) de 90% de acordo com Rocha et al. (2011). Os padrões de difração de raios-X dos amidos nativo e modificados foram determinados, utilizando-se uma unidade RINT 2000, com radiação de Cu, linha K, L= 1,542 Å. A velocidade de varredura usada foi de 1o por min e as condições de uso foram de 50Kv e 100 mA. A cristalinidade relativa dos amidos foi quantitativamente estimada baseada na relação entre a área dos picos e área total seguindo método de Nara e Komiya (1983) utilizando o software Origin versão 7.5 (Microcal Inc., EUA). 4.2.11 Propriedades térmicas As propriedades térmicas dos amidos nativo e modificados foram determinadas utilizando um Calorímetro Diferencial de Varredura (DSC-Pyris 1, Perkin Elmer, EUA) de acordo com método descrito por Franco et al. (2002), com modificações. Amostras de 2 mg (b. s.) dos amidos foram pesadas em pequenos recipientes de alumínio, próprios para o equipamento. Água deionizada (6 L) foi adicionada e os recipientes foram selados em prensa universal (Perkin Elmer, EUA). Após selados, os recipientes foram mantidos por 2 h em 38 temperatura ambiente, e aquecidos a uma razão de 5 ºC/min de 25 a 100 ºC. Um recipiente de alumínio vazio foi utilizado como referência. As temperaturas de transição (inicial, de pico e final) e a variação de entalpia ( H) dos amidos nativos e retrogradados foram determinadas utilizando o software Pyris 1 (Perkin Elmer, EUA). Todas as análises foram realizadas em triplicata. 4. 2.12 Propriedades de Pasta As propriedades de pasta dos amidos nativo e modificados foram determinadas utilizando um Rápido Viscoanalisador (RVA-4, Newport Scientific, Austrália) de acordo com o procedimento descrito por Franco et al. (2002), com modificações. Suspensões de amido (10% p/p, num total de 27,5 g) foram colocadas em recipientes de alumínio próprios do equipamento, e estes acoplados ao RVA. No início da análise, o RVA foi mantido a 50ºC durante 1 min; após este tempo, aqueceu a uma razão de 6ºC/min até atingir 95ºC e permaneceu nesta temperatura por 5 min; então resfriou até 50ºC também a 6ºC/min e permaneceu nesta temperatura até o final da análise. São necessários 23 min para completar o experimento. Durante todo o experimento o RVA manteve as suspensões sob agitação a 160 rpm. O programa Termoclines for Windows, versão 2.2 (Newport Scientific, Austrália) foi utilizado para o processamento dos resultados. Todas as determinações foram realizadas em duplicata. 4.2.13 Poder de inchamento e solubilidade O poder de inchamento dos amidos de mandioquinha-salsa nativo e modificados foi determinado de acordo com método descrito por Schoch (1964), com modificações. Em um tubo de centrífuga, previamente pesado adicionou-se 0,2 g de amostra em base úmida; em seguida foi acrescentado exatamente 18 g de água destilada. A suspensão foi mantida a 60, 70, 80 e 90ºC durante 30 min sob leve agitação intermitente. Posteriormente, a suspensão foi centrifugada a 3000 g durante 15 min. Uma alíquota (5 mL) do sobrenadante, em duplicata, foi seca em estufa a 105 ºC até peso constante e o precipitado (gel) foi pesado. O poder de inchamento (PI) e a porcentagem de sólidos solúveis foram determinados conforme as equações 4 e 5, respectivamente. Todas as determinações foram realizadas em triplicata. 39 P.I = %soluvéis)-(100 x 100x (b.s) (g) Ma Mgel(g) (Equação 4) % solúveis = 400 x (b.s) (g) Ma Ms (Equação 5) Onde: Mgel = massa do sedimento (g) Ma = massa da amostra em base seca Ms = massa de sólido do sobrenadante (g) 4.3 Análise Estatística O delineamento experimental adotado para os experimentos foi o inteiramente casualizado, sendo os tratamentos compostos por duas ou três repetições. Os dados foram avaliados pelo emprego do programa Statistica for Windows (v. 7.0, Statsoft, Tulsa, OK) abrangendo a análise de comparação de médias e as análises de variância (ANOVA) e o teste de Tukey (p 0,05). 40 5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1 Isolamento do amido O amido de mandioquinha-salsa foi obtido como pó branco, sem nenhuma impureza aparente. O isolamento do amido de mandioquinha-salsa foi realizado a frio e assim alterações nas propriedades físico-químicas do mesmo foram minimizadas. 5.2 Composição química do amido nativo Segundo Franco et al. (2001) é importante que o amido apresente baixos teores de constituintes menores. Dentre as frações destes constituintes menores, as de lipídeos e fósforo são as mais importantes, pois influenciam nas propriedades funcionais dos amidos. A composição química do amido de mandioquinha-salsa está apresentada na Tabela 1. Tabela 1 - Composição química do amido de mandioquinha-salsa (% em relação à matéria seca). 1 Os valores representam a média de três determinações com o respectivo desvio-padrão apresentado entre parênteses; * Determinado por diferença. Segundo Buléon et al. (1998) os lipídeos são a fração mais importante associada aos grânulos de amido. Altos conteúdos são geralmente observados em amidos de cereais. Os lipídeos são os responsáveis pela fixação de cor, desenvolvimento de aromas e complexos. Nos amidos de tuberosas são encontrados em pequenas quantidades, tornando esses amidos mais neutros e menos sujeitos a formação de complexos (FRANCO et al., 2001). O teor de lípideos encontrado nesse trabalho para o amido de mandioquinha-salsa foi inferior aos obtidos por Rocha, Demiate e Franco (2008), Matsuguma et al. (2009) e Rocha, Carneiro e Franco (2010) que encontraram valores de 0,10, 0,42 e 0,13%, respectivamente. Constituintes % Carboidratos totais * 99,71 Lipídeos 0,06 (0,03) Proteínas 0,07(0,02) Cinzas 0,16(0,03) Fósforo 0,018 (0,003) 41 O fósforo pode ser encontrado nos amidos em três formas principais: monoéster fosfato, lisofosfolipídeos e fosfatos inorgânicos. Em tubérculos e raízes, o fósforo é encontrado principalmente na forma de monoéster fosfatos ligados covalentemente ao amido (HOOVER, 2001). O método para a determinação do teor de fósforo, usado neste trabalho, é baseado na destruição da matéria orgânica por incineração e pela conversão do fósforo presente na amostra para sua forma inorgânica fornecendo o teor de fósforo total (KASEMSUWAN; JANE, 1995). O amido de mandioquinha-salsa apresentou teor de fósforo de 0,018 %, valor próximo ao encontrado por Rocha, Demiate e Franco (2008) que observaram um teor de 0,017 % deste mineral. Algumas variações no teor de fósforo de amidos da mesma fonte botânica, no entanto, podem estar relacionadas às características ambientais durante o desenvolvimento da planta, pois o teor de fósforo é inversamente proporcional à temperatura de desenvolvimento da planta (TESTER, et al. 1997). O fósforo desempenha papel importante nas propriedades funcionais dos amidos. Por exemplo, o monoéster fosfato proporciona maior claridade de pasta, alta viscosidade, baixa temperatura de gelatinização e lenta taxa de retrogradação do amido (KASEMSUWAN; JANE, 1996), enquanto maiores quantidades de fosfolipídeos diminuem a claridade de pasta e a viscosidade (FRANCO; et al., 2001). Geralmente os amidos apresentam baixos teores de fósforo, com exceção do amido de batata pode exceder 0,09% Kasemsuwan e Jane (1996). 5.3 Modificação enzimática Segundo Bertof e Manelius (1992) apud Li et al.(2004), a ação das enzimas sob o amido granular ocorre em solução sobre um substrato no estado sólido. Assim, a área de superfície acessível à enzima e a eficiência de adsorção da mesma são elementos importantes e críticos para a cinética. As quantidades de açúcar redutor produzidas durante a hidrólise enzimática do amido de mandioquinha-salsa nas três diferentes condições de tratamento estão apresentadas na Figura 4. 42 Figura 4 Porcentagem de açúcar redutor produzido em função do tempo durante a hidrólise enzimática do amido de mandioquinha-salsa, em diferentes condições: A: 40 SKB/g de amido de - amilase bacteriana e 10 U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 36 h; B) 20 SKB/g de amido de -amilase e 5U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 12 h e C) 5 U/g de amido de amiloglocosidase fúngica por 12 h. A quantidade de açúcar redutor produzida aumentou progressivamente com o tempo de tratamento para as condições B e C, em função do menor tempo de hidrólise (Fig. 5.1). Para a condição A, foi possível observar, nas primeiras 8 h, uma taxa de hidrólise mais rápida, enquanto os tempos seguintes mostraram uma redução na taxa de hidrólise. Segundo Sanguanpong et al. (2003) a taxa mais rápida de hidrólise nas primeiras horas de incubação do amido com as enzimas é atribuída à degradação das regiões amorfas dos grânulos de amido, e um segundo período, mais lento, é atribuído à degradação da lamela cristalina do amido onde a acessibilidade da enzima é dificultada. Quando a porcentagem de hidrólise foi calculada por diferença de peso dos amidos nativos e hidrolisados, a condição A (40 SKB/g de -amilase e 10 U/g de amiloglucosidase) mostrou 35 % após 36 h de hidrólise (Tabela 5.2). Nas condições B (20SKB/g de -amilase e 5U/g de amiloglucosidase) e C (5U/g de amiloglucosidase) as porcentagens de hidrólise atingiram 10 e 2,7 %, respectivamente após 12 h de incubação. 0 5 10 15 20 25 0 6 12 18 24 30 36 Tempo (horas) g aç úc ar re du to r / 10 0 g am id o Condição A Condição B Condição C 43 Tabela 2 - Porcentagem de hidrólise, por diferença de peso dos amidos hidrolisados. *Condição de hidrólise Hidrólise por peso (%) A 35 B 10 C 2,7 *A: 40 SKB/g de -amilase e 10 U/g de amiloglucosidase, 36 h; B: 20 SKB/g de -amilase e 5U/g de amiloglucosidase, 12 h; C: 5U/g de amiloglucosidase, 12 h. Estes resultados mostram que a suscetibilidade enzimática do amido é função, além da fonte botânica do amido, da concentração de enzima, bem como do complexo enzimático utilizado. Viera e Sarmento (2008) observaram para o amido de mandioquinha-salsa uma porcentagem de hidrólise de 38 % após 24 h em um sistema enzimático de -amilase (100 SKB/g amido) e amiloglucosidase (50 U/g de amido). Segundo Franco e Ciacco (1987) a atuação das enzimas -amilase e amiloglocosidase em conjunto mostrou-se bem mais eficiente para os amidos de milho e mandioca que a ação das enzimas sozinhas. Os resultados obtidos por Rocha, Carneiro e Franco (2010), utilizando para o amido de mandioquinha-salsa tratado somente por -amilase por 48 h proporcionou uma porcentagem de hidrólise de 13,2%. 5.4 Distribuição do tamanho dos grânulos de amidos nativo e modificados A Tabela 3 apresenta os diâmetros maior e menor, a média da população e a distribuição dos grânulos de amido de mandioquinha-salsa antes e após hidrólise e/ou moagem. O amido de mandioquinha-salsa nativo apresentou diâmetro médio de 15,5 μm. Rocha, Demiate e Franco (2008) encontraram para este amido 14,7 μm, enquanto Viera (2004) observou tamanho médio de 17,3 μm. Estas pequenas diferenças observadas nos valores de diâmetro médio dos grânulos deste amido pelos diferentes autores podem ser atribuídas a diferentes metodologias usadas para se determinar a medida dos grânulos, mas também às diferentes idades, épocas de colheita e variedades da planta. 44 Tabela 3 – Diâmetro menor e maior, diâmetro médio e distribuição dos grânulos de amido de mandioquinha-salsa nativos, hidrolisados e/ou moídos por 1 e 2 h. Amido Tamanho global (menor e maior) (μm) Diâmetro médio (μm) Distribuição de tamanho* Diâmetro (μm) % Nativo 2,2 – 75,2 15,5(0,9) a < 5 – 10 19 10,1 – 20 48 > 20 33 Moído 1h 2,2 – 73,5 12,2(1,2) bc < 5 – 10 22 10,1 – 20 52 > 20 26 Moído 2h 2,2 - 73,2 10,6(1,0) cd < 5 – 10 25 10,1 – 20 54 > 20 21 Hidrolisado A 2,2 – 65,9 10,5 (1,0) cd < 5 – 10 26 10,1 – 20 52 > 20 22 Hidrolisado A moido 1h 2,2 – 66,9 9,6 (0,5)d < 5 – 10 30 10,1 – 20 56 > 20 14 Hidrolisado A moído 2h 2,2 – 65,3 8,6 (0,3)d < 5 – 10 28 10,1 – 20 49 > 20 23 Hidrolisado B 2,2 - 74,2 13,6(1,1)ab < 5 – 10 23 10,1 – 20 51 > 20 26 Hidrolisado B moído 1h 2,2 - 73,1 10,2(0,8)cd < 5 – 10 29 10,1 – 20 57 > 20 14 Hidrolisado B moído 2h 2,2 - 72,9 9,5(0,7)d < 5 – 10 30 10,1 – 20 60 > 20 10 Hidrolisado C 2,2 - 74,9 15,5 (0,7) a < 5 – 10 21 10,1 – 20 50 > 20 29 Hidrolisado C moído1h 2,2 - 73,8 10,8 (0,5) cd < 5 – 10 23 10,1 – 20 56 > 20 21 Hidrolisado C moído2h 2,2 - 73,5 9,3 (0,4)d < 5 – 10 25 10,1 – 20 60 45 > 20 15 Hidrolisado A: hidrólise com -amilase (40 SKB/g) e amiloglucosidase (10 U/g) por 36 h; Hidrolisado B: hidrólise com -amilase (20 SKB/g) e amiloglucosidase (5 U/g) por 12 h; Hidrolisado C: hidrólise com amiloglucosidase (5 U/g) por 12 h. * Considerando o diâmetro médio de cada grânulo a Valores seguidos pela mesma letra na mesma coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05) A moagem causou progressiva redução do diâmetro médio dos grânulos que atingiu 10,6 μm após 2 h de tratamento. Este resultado sugeriu que a aplicação de uma força mecânica sobre os grânulos intactos provocou a quebra dos mesmos, e os fragmentos obtidos foram contabilizados com os grânulos de menor diâmetro. Resultados semelhantes foram observados por Cavallini e Franco (2010) para amostras de amidos de mandioca submetidas à moagem em moinho de bola durante 1 h. A hidrólise provocou redução no diâmetro médio dos grânulos de 15,5 (amido nativo) para 10,5 μm (condição A) 13,6 μm (condição B) e não alterou o tamanho dos grânulos na condição C, sugerindo que a ação sinérgica das enzimas alfa-amilase e amiloglucosidase provocou uma erosão superficial dos grânulos de amido, o mesmo observado por Sanguapong et al. (2003) para o amido de mandioca. Rocha (2007) observou uma leve redução no diâmetro médio dos grânulos de 14,7 μm para 14,4 μm quando o amido de mandioquinha- salsa foi hidrolisado com 60 SKB/g de amido de -amilase e 1,5 unidades/g de amido de amiloglucosidase por 48 horas. A moagem por 1 h dos grânulos hidrolisados facilitou a quebra dos mesmos que apresentaram diâmetro médio de 10,6 μm, mas o aumento no tempo de moagem não alterou o diâmetro médio dos grânulos. Assim, os grânulos nativos moídos por 2 h apresentaram diâmetro médio igual àqueles hidrolisados nas condições B ou C e moídos por 1 ou 2 h. Mesmo na condição A, a redução no tamanho dos grânulos de amido após 2 h de moagem esteve muito próxima daquela das condições B e C. No entanto, pela análise da distribuição dos grânulos (Tabela 3), é possível observar que houve um aumento de 31 % de grânulos com tamanho entre 5 e 10 μm quando os mesmos foram moídos por 2 h, enquanto a hidrólise seguida da moagem por 1 e 2 h provocou um aumento de 52 e 57 %, respectivamente, na proporção de grânulos com esse diâmetro. Sanguanpong et al.(2003) observaram a redução no diâmetro médio dos grânulos de amido de mandioca após o tratamento enzimático com -amilase e amiloglucosidase e moagem. Após hidrólise a redução na quantidade de grânulos grandes e aumento considerável da quantidade de grânulos pequenos, se tornou ainda maior após o tratamento físico por 3 46 horas, evidenciando assim que o pré-tratamento enzimático é efetivo na redução do tamanho granular do amido. Neste trabalho a hidrólise enzimática foi utilizada como um pré-tratamento do amido antes da moagem em moinho de bola, visando fragilizar os grânulos de amido e garantir grânulos de menor diâmetro após moagem. Assim, a condição B, que apresentou uma porcentagem de hidrólise de 10% e provavelmente com apenas parte das áreas amorfas dos grânulos degradados pelas enzimas, foi então escolhida como o pré-tratamento do amido antes da moagem, uma vez que também proporcionou aumento considerável na porcentagem de distribuição dos grânulos com diâmetro entre 5 e 10 μm. 5.5 Forma dos grânulos de amidos nativo e modificados A Figura 5 mostra as micrografias dos grânulos de amido de mandioquinha-salsa, nativos, hidrolisados com -amilase e amiloglucosidase (condição B) submetidos ou não a moagem em moinho de bolas por 1 e 2 h, observados em microscópio óptico com luz normal. Os grânulos de amido nativo (Fig. 5 a) mostraram-se com formato arredondado e sem qualquer sinal de corrosão ou gelatinização. As imagens dos grânulos de amido de mandioquinha-salsa moídos (Fig. 5 c, d) não diferiram muito daquelas observadas para os grânulos de amido nativo, com exceção de um ou outro grânulo disforme no amido moído por 2 h, sugerindo gelatinização parcial do amido. Os grânulos submetidos à hidrólise enzimática antes (Fig. 5 d) e após moagem (Fig. 5 e, f) mostraram-se bastante corroídos indicando ação das enzimas sobre a superfície granular. Os grânulos hidrolisados e moídos por 1 ou 2 h mostraram-se bem mais fragmentados sugerindo que a moagem quebrou de forma mais intensa os grânulos hidrolisados do que os grânulos nativos, o que confirma os dados de distribuição de tamanho dos grânulos apresentados na Tabela 5. 47 Figura 5 Micrografias dos grânulos de amido de mandioquinha-salsa observados em microscópio óptico sob luz normal: (a) nativo; (b) moído 1h; (c) moído 2h; (d) hidrolisado com - amilase e amiloglucosidase; (e) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 1h; (f) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 2h; A Figura 6 mostra micrografias obtidas a partir do microscópio eletrônico de varredura (MEV) dos amidos nativo, hidrolisados com -amilase e amiloglucosidase (condição B) submetidos ou não a moagem em moinho de bolas por 1 e 2 h. O amido de mandioquinha-salsa nativo apresentou grânulos com formatos circulares e truncados, com depressões e irregularidades na superfície granular que se mostrou lisa (Figura 6a). Tais irregularidades também foram observadas por Rocha et al. (2011), Rocha, Demiate e Franco (2008) e Vieira e Sarmento (2008) para este amido. Foi possível observar, para os grânulos moídos por 1 h, o aparecimento de algumas fissuras na superfície granular. Para o amido submetido à moagem por 2 h observou-se grânulos mais inchados e alguns grudados uns nos outros sugerindo uma gelatinização parcial que pode ter ocorrido durante a moagem. Sanguanpong et al. (2003), durante a moagem de amido de mandioca em moinho de bolas também observaram grânulos grudados uns aos outros e sugeriram que o calor gerado pela transformação da energia mecânica em térmica durante a moagem, seria responsável pela formação de um “liquido derretido” altamente viscoso que atuaria como uma “cola” unindo os grânulos de amido. 48 Figura 6 Micrografias dos grânulos dos amidos observados em microscópio eletrônico de varredura: (a) nativo; (b) moído 1h; (c) moído 2h; (d) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase; (e) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 1h; (f) hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 2h; A ação enzimática provocou aparecimento de algumas depressões e fissuras na superfície dos grânulos de amido (Figura 6d). Após a moagem de 1 hora (Figura 6e) os grânulos hidrolisados mostraram-se mais truncados e a estrutura em camadas do grânulo de amido mais evidente. Na Figura 6f, os grânulos tratados e moídos por 2 horas mostraram uma maior proporção de grânulos de menor tamanho, confirmando os resultados de tamanho e distribuição. Segundo Rocha (2007) as fissuras e perfurações causadas pelas enzimas fragilizam o grânulo, pois as enzimas atacaram os grânulos provocando solubilização do seu interior e a partir da exo-corrosão da superfície granular ocorreu a solubilização da região externa aumentando a fragilidade e reduzindo o diâmetro do grânulo de amido respectivamente. 49 5.6 Distribuição do Comprimento das Cadeias Laterais da Amilopectina As distribuições normalizadas do comprimento de cadeias laterais da amilopectina dos amidos nativo e modificados estão apresentadas na Figura 5.4 e os resultados estão sumarizados na Tabela 5.4. Figura 7 Distribuição do comprimento de cadeias ramificadas das amilopectinas dos amidos nativo, moídos e hidrolisados e moídos. Todos os amidos estudados apresentaram distribuição bimodal em que dois picos foram observados (Figura 7). Para o amido nativo e amidos moídos o primeiro pico ocorreu no grau de polimerização DP 11, e o segundo no DP 41. No caso dos amidos hidrolisados, o primeiro pico ocorreu no DP 11 e o segundo entre DP 43 e 44 sugerindo que a hidrólise degradou mais as cadeias curtas e médias o que proporcionou uma maior proporção de cadeias ramificadas longas. O amido de mandioquinha-salsa, como já observado em trabalhos anteriores de Campanha (2010) e Rocha et al. (2011), apresentou um ombro acentuado entre os DPs 17 -21, sugerindo uma estrutura cristalina defeituosa conforme postulado por Jane et al. (1999) e Genkina et al. (2007). Segundo estes autores, o comprimento das cadeias de DP18 a 21 estaria entre 6,3-7,4 nm, considerando que o comprimento de cada unidade de glicose anidra seja de 0,35 nm. Esta faixa de comprimento se aproxima à da espessura da lamela cristalina da amilopectina, assim as cadeias de DP 18 a 21 representariam a extensão total da 50 lamela cristalina, e a razão entre o pico de distribuição e o ombro indicaria a proporção de cadeias curtas que resultam em defeitos cristalinos. As modificações a que o amido nativo foi submetido não foram capazes de eliminar esses defeitos na estrutura cristalina do amido. O comprimento médio de cadeia (DP) foi o mesmo para os amidos nativo (19,5) e submetido à moagem por 1hora (19,2) e por 2 horas (19,1). Resultado também observado por Rocha (2010) e Campanha (2010) para o amido nativo de mandioquinha-salsa. Com a moagem foi possível detectar uma pequena porcentagem de cadeias entre o DP 2-5 sugerindo que houve uma ligeira degradação das moléculas de amilopectina pela ação das bolas e da força do impacto que ocasiona o rompimento das ligações glicosídicas. Tabela 4 - Distribuição do comprimento de cadeias ramificadas das amilopectinas dos amidos nativos e modificados. Amostras de amido Comprimento de cadeia (%) DP Maior DP detectado DP 2-5 DP 6-12 DP 13-24 DP 25-36 DP 37 Nativo 0,0(0,0)e 32,7(0,7)a 44,0(0,0)a 12,1(0,3)a 11,2(0,3)a 19,5(0,2)a 75 Moído 1h 0,2(0,0)cd 33,7(0,3)a 43,9(0,1)a 11,6(0,2)a 10,6(0,3)a 19,2(0,1)a 73 Moído 2h 0,2(0,0)d 33,8(0,4)a 44,0(0,2)a 11,5(0,1)a 10,5(0,1) a 19,1(0,1)a 71 Hidrolisa do 0,3(0,0)b 32,8(0,1)a 43,9(0,0)a 11,8(0,1)a 11,2(0,0)a 19,5(0,0)a 75 Hidrolisa do moído 1h 0,3(0,0)bc 33,0(0,5)a 43,9(0,1)a 11,6(0,1)a 11,2(0,2)a 19,4(0,1)a 74 Hidrolisa do moído 2h 0,4(0,0)a 32,8(0,3)a 43,7(0,2)a 11,8(0,1)a 11,3(0,0)a 19,5(0,0)a 74 Hidrolisado: hidrólise com - amilase (20 SKB/g amido) e amiloglucosidase (5 U/g) por 12 h; DP: grau de polimerização Cada valor representa a média de duas determinações. a Valores seguidos pela mesma letra na mesma coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05). A moagem proporcionou para os amidos hidrolisados um leve aumento somente para (DP 2-5) para os amidos moídos por 2 horas, de 0,3 para 0,4 confirmando a degradação das moléculas de amilopectina, porém a distribuição se manteve mesmo após a hidrólise e a moagem. Entretanto, Cavallini e Franco (2010) não observaram degradação das moléculas de 51 amilopectina do amido de mandioca submetidos à moagem, mesmo após estes amidos terem sido hidrolisados com solução ácido-etanólica. Segundo Tamaki et al. (1997), a ação das bolas não é homogênea durante a moagem do amido. O rompimento das ligações glicosídicas é dependente da frequência da ação das bolas e da força do impacto que dependem do diâmetro do cilindro, quantidade de bolas e velocidade de rotação durante a moagem. 5.7 Distribuição do Tamanho Molecular dos Amidos As distribuições das massas moleculares dos componentes dos amidos nativo e modificados, determinadas por cromatografia de permeação em gel, estão apresentadas na Figura 8. O primeiro pico em todos os perfis cromatográficos, correspondeu à amilopectina, a qual possui grande massa molecular que não interage com o gel e eluiu no volume vazio da coluna. O segundo pico correspondeu à amilose e o terceiro, de menor intensidade representou a glicose, adicionada para indicar o final da eluição. O amido nativo de mandioquinha-salsa (Figura 8a) mostrou o pico de amilopectina eluindo no volume 65mL, enquanto o pico da amilose que mostrou-se mais disperso eluiu no volume 142,5mL. A moagem por 2 h provocou redução no pico da amilopectina enquanto houve um leve deslocamento do pico da amilose para esquerda, sugerindo que pode ter havido quebras nas moléculas de amilopectina que passaram a apresentar massa molecular intermediária e então eluíram em volumes intermediários entre amilopectina e amilose. As relações entre blue value e açúcares totais (BV/CHO), nos picos da amilopectina foram de 0,33 e 0,37 para o amido nativo e moído por 2 horas, respectivamente, indicando uma maior proporção de cadeias ramificadas longas (FRANCO et al., 2002) para o amido submetido a moagem. Huang et al. (2008) estudando o amido de milho e mandioca e Tamaki et al (1997) estudando o amido de batata também observaram degradação das ligações glicosídicas da amilopectina quando esses amidos foram submetidos à moagem em moinho de bolas. A hidrólise provocou uma leve redução no pico de amilopectina (Figura 8c) e o pico de amilose pouco definido e disperso. O aumento do material intermediário, moléculas de tamanho entre a amilose e amilopectina, sugere que as enzimas degradaram as moléculas de amilopectina em produtos de menor massa molecular. O pico da amilose apresentou uma leve 52 redução. Portanto, a degradação da amilopectina resultou em moléculas menores que puderam ser eluídas juntamente com a amilose. Já no amido hidrolisado moído observou-se uma redução no pico de amilopectina mais acentuado quando comparado ao amido submetido somente à moagem e o aparecimento de algum material intermediário resultado da degradação das moléculas de amilopectina, sugerindo assim que a hidrólise fragilizou o grânulo de amido tornando-o mais susceptível a ação física, entretanto Sanguanpong et al. (2003) não observaram nenhuma degradação macromolecular, indicando que o tratamento físico no amido de mandioca pré-hidrolisado por -amilase e amiloglucosidase degradou somente as pontes de hidrogênio e não as ligações glicosídicas. É provável que as condições de hidrólise e moagem sobre o amido de mandioquinha-salsa tenha debilitado tanto as pontes de hidrogênio quanto as ligações glicosídicas. Como, a distribuição de cadeias laterais da amilopectina praticamente não se alterou (Tabela 4), é provável que as ligações glicosídicas mais afetadas pelo tratamento tenham sido as ligações (1-6), as quais fazem parte das regiões mais amorfas dos grânulos e portanto menos resistentes a ácidos e enzimas. 53 Figura 8 Perfil de eluição dos amidos de mandioquinha-salsa (a) nativo; (b) moído por 2 h; (c) Hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e e (d) Hidrolisado com -amilase e amiloglucosidase e moído por 2 h. 5.8 Afinidade com Iodo e Teor de Amilose Os valores encontrados para o teor de amilose aparente dos amidos nativos e modificados estão apresentados na Tabela 5. O amido nativo de mandioquinha-salsa apresentou um teor de amilose aparente muito próximo ao encontrado por Rocha, et al. (2011) 20%, e inferior ao encontrado por Vieira e Sarmento (2008) de 17,2%. 54 Tabela 5 - Afinidade por iodo e teores de amilose aparente dos amidos nativo e modificados1. Amostras de amido Afinidade por iodo (%) Teor de amilose (%) Amido Aparente2 Nativo 4,08(0,11) ab 20,43 Moído 1h 4,37(0,09)a 21,87 Moído 2h 4,39(0,07)a 21,93 Hidrolisado 3,70(0,06)b 18,50 Hidrolisado moído 1h 3,99(0,19)ab 19,93 Hidrolisado moído 2h 3,92(0,07)b 19,61 Hidrolisado: hidrólise c/ -amilase (20 SKB/g amido) e amiloglucosidase (5 U/g amido) por 12 h 1 Valores seguidos pela mesma letra na mesma coluna não diferem significativamente pelo teste de Tukey (p<0,05). Cada valor representa a média de três determinações, com o respectivo desvio- padrão apresentado entre parênteses. 2 % amilose aparente = (AIA/0,20), onde AIA é a afinidade por iodo do amido. Apesar das afinidades com iodo dos amidos de mandioquinha-salsa nativo e moídos não terem apresentado diferença significativa (P 0,05), observou-se uma tendência a aumentar o que provocou um pequeno aumento no teor de amilose para os amidos moídos por 1 e 2 horas quando comparado ao amido nativo. Esses resultados também poderiam sugerir que o tratamento promoveu algum tipo de degradação nas moléculas de amilopectina, com a quebra das ligações (1 6), presentes principalmente nas áreas amorfas dos grânulos e, portanto mais suscetíveis às alterações provocadas pela moagem, formando assim, cadeias lineares capazes de complexar com iodo e confirmando assim os dados de distribuição de tamanho molecular observados em GPC. Huang et al. (2008), observaram a mesma degradação nas moléculas de amilopectina O teor de amilose aparente caiu para o amido hidrolisado, o mesmo observado por Rocha, Carneiro e Franco (2010) para os amidos submetidos à hidrólise enzimática de mandioca, batata-doce e mandioquinha-salsa, sugerindo que as enzimas atacaram preferencialmente as áreas amorfas. Entretanto Serrano e Franco (2005) não observaram diferença significativa nos terores de amilose de amido de mandioca tratado com -amilase bacteriana e o mesmo comportamento foi verificado por Franco e Ciacco (1992) quando trataram amidos de mandioca e milho com -amilase bacteriana e amiloglucosidase fúngica. Apesar de não haver diferença significativa entre as afinidades com iodo para os amidos hidrolisados e moídos, houve também nesse caso uma leve tendência de aumento no 55 teor de amilose com a moagem dos amidos, reforçando a hipótese de que o tratamento físico degradou as ligações glicosídicas (1 6) da amilopectina e que possivelmente as cadeias laterais longas da amilopectina foram liberadas e assim contabilizadas como amilose. Resultados semelhantes foram observados por Huang et al. (2007, 2008) para os amidos de milho e mandioca, moídos de 1 a 3 horas. 5.9 Difração de Raios-X e Cristalinidade Relativa A difração de raios-X pode detectar mudanças na cristalinidade dos grânulos de amido causadas por tratamentos físicos e/ou enzimáticos. Os difractogramas de raios-X dos amidos nativos e modificados de mandioquinha-salsa estão apresentados na Figura 9, enquanto a Tabela 6 apresenta as cristalinidades relativas (Crel) desses amidos. Figura 9 Difractogramas de raios-X dos amidos: A- MSN: nativo; MS1h: nativo moído 1h; MS2h: nativo moído 2h; B- MSH: hidrolisado; MSH1h: hidrolisado e moído 1h; MSH2h: hidrolisado e moído 2h; Independente dos tratamentos aplicados os amidos apresentaram difractogramas semelhantes com picos singletos bem definidos por volta 5,6º e 17º e um dubleto em 22º e 24º em 2 , caracterizando amidos de padrão cristalino tipo B (BÚLEON et al., 1998; THYS et al., 2008). Apesar da não alteração do padrão de difração de raios-X para os amidos submetidos aos diferentes tratamentos, houve uma expressiva redução na cristalinidade relativa dos 56 amidos modificados (Tabela 6). Os amidos submetidos apenas à moagem apresentaram uma redução de aproximadamente 21 % na cristalinidade relativa, independente do tempo de moagem, sugerindo que o tratamento provocou o rompimento das pontes de hidrogênio das áreas cristalinas dos grânulos reduzindo assim sua cristalinidade. Apesar de não haver diferença estatística, observou-se uma tendência na redução da cristalinidade com o aumento do tempo de moagem. O amido hidrolisado também apresentou uma substancial redução na cristalinidade relativa (24 %) quando comparado ao amido nativo. A hidrólise enzimática degrada inicialmente as regiões amorfas dos grânulos e era de se esperar que então a cristalinidade relativa tivesse aumentado, porém é possível que nas condições usadas neste experimento, a enzimas tenham atacado também as área