UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO” INSTITUTO DE QUÍMICA DE ARARAQUARA OTÁVIO AGUIAR DE SOUZA ABORDAGEM VERDE E MULTIVARIADA PARA EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE METABÓLITOS FENÓLICOS DE EUGENIA UNIFLORA L. UTILIZANDO SOLVENTES EUTÉTICOS NATURAIS PROFUNDOS (NADES) ARARAQUARA – SP 2020 OTÁVIO AGUIAR DE SOUZA ABORDAGEM VERDE E MULTIVARIADA PARA EXTRAÇÃO E ANÁLISE DE METABÓLITOS FENÓLICOS DE EUGENIA UNIFLORA L. UTILIZANDO SOLVENTES EUTÉTICOS NATURAIS PROFUNDOS (NADES) Dissertação de mestrado apresentada como requisito para a obtenção do grau de Mestre em Química pela Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – Instituto de Química de Araraquara. Orientador: Prof. Dr. Daniel Rinaldo ARARAQUARA - SP 2020 Bibliotecária Responsável: Ana Carolina Gonçalves Bet - CRB8/8315 FICHA CATALOGRÁFICA S719a Souza, Otávio Aguiar de Abordagem verde e multivariada para extração e análise de metabólitos fenólicos de Eugenia uniflora L. utilizando solventes eutéticos naturais profundos (NADES) / Otávio Aguiar de Souza. – Araraquara : [s.n.], 2020 120 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Daniel Rinaldo 1. Plantas medicinais. 2. Química verde. 3. Planejamento de experimentos. 4. Sustentabilidade. 5. Biodiversidade. I. Título. DADOS CURRICULARES Dados pessoais NOME: Otávio Aguiar de Souza Data de Nascimento: 15/07/1996 E-mail: otavio.aguiar.souza@gmail.com Formação Acadêmica: 2014- 2018: Licenciatura em Química (Faculdade de Ciências, Universidade Estadual Paulista – Campus Bauru) 2018-2020: Mestrado em Química (Instituto de Química de Araraquara, Universidade Estadual Paulista) Artigos publicados em periódicos indexados: SOUZA, O.A.; CARNEIRO, R.L.; VIEIRA, T.H.M.; FUNARI, C.S.; RINALDO, D. Fingerprinting Cynara scolymus L. (Artichoke) by means of a green statistically developed HPLC-PAD method. Food Analytical Methods (JCR 2019: 2,667), v.11, pp.1977-1985, 2018. ALARCON, R.; GAGLIERI, C.; SOUZA, O.A.; RINALDO, D.; BANNACH, G. Microwave-assisted syntheses of vegetable oil-based monomer: A cleaner, faster, and more energy efficient route. Journal of Polymers and the Environment (JCR 2019: 2,572) 28, pp.1265-1278, 2020. Artigos aceitos para publicação: BORGES, M.S., ZANATTA, A.C., SOUZA, O.A., PELISSARI, J.H., CAMARGO, J.G.S., CARNEIRO, R.L., FUNARI, C.S., BOLZANI, V.S., RINALDO, D. A green and sustainable method for monitoring the chemical composition of soybean: an alternative for quality control. Phytochemical Analysis (JCR 2019: 2,772). Artigos submetidos para periódicos indexados SOUZA, O.A., FURLANI, R.P., RAMALHÃO, V.G.S., BORGES, M.S., FUNARI, C.S., BOLZANI, V.S., RINALDO, D. Eco-friendly and inexpensive food grade bioethanol for Eugenia uniflora L. chromatographic fingerprinting: a trade-off between separation and sustainability. Phytochemistry Letters (JCR 2019: 1,459). Capítulos de livros submetidos: AGUIAR, O., RINALDO, D., PORTO, C.M., SAMBRANO, JR., MORGON, N.H., SOUZA, A.R. Computer simulation applied to structural analysis and experimental applications of natural deep eutectic solvents. In.: EMSS – Green Chemistry and Computational Chemistry as a valuable tool in the understanding and design of a new class of green solvents. Elsevier, 2020. Participação em eventos científicos: Resumos publicados em anais de congressos 1. ALARCON, R.T.; GAGLIERI, C.; SOUZA, O.A.; RINALDO, D.; BANNACH, G. Fast and green synthesis of maleinized vegetable oil by microwave irradiation. In: 42 Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, 2019, Joinville. Anais SBQ, 2019. 2. SOUZA, O.A.; BORGES, M. FUNARI, C.S.; CARNEIRO, R.L.; RINALDO, D. Green extraction and chromatographic fingerprint optimization towards the HPLC-PAD analysis of Cynara scolymus L. by means of a multivariate approach. In: The 70th Southeastern Regional Meeting of the American Chemical Society, 2018, Augusta, Georgia-USA. Abstracts, 2018, p.175-175. 3. SOUZA, OTÁVIO AGUIAR; FUNARI, CRISTIANO SOLEO; CARNEIRO, RENATO LAJARIM; RINALDO, DANIEL. Alternativa verde para fingerprinting cromatográfico das folhas de Cynara scolymus L. (Asteraceae). In: XIII Workshop de Plantas Medicinais de Botucatu: Em Busca de produtos naturais bioativos. Botucatu: FCA- Unesp, 2018, p.10-10. 4.SOUZA, O. A.; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L ; RINALDO, D. . Application of Doehlert Design for optimization of the chromatographic method for green fingerprinting of Cynara scolymus L. by HPLC-PAD. In: III Escola de Inverno de Quimiometria (EIQ 2017), 2017, Araraquara. Programação Científica e Livro de Resumos, 2017. 5. SOUZA, O. A.; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L ; RINALDO, D. . Desenvolvimento de método analítico verde para obtenção de fingerprinting metabólico das folhas de Cynara scolymus por CLAE-DAD utilizando quimiometria. In: XXIX Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2017, Bauru. Trabalhos Apresentados na 1ª Fase do XXIX CIC, 2017. 6. VIEIRA, T. H. M. ; SOUZA, O. A. ; RINALDO, D. . Metodologia ambientalmente amigável para clean-up das folhas de espinheira-santa (Maytenus ilicifolia) para análise por CLAE-DAD. In: 1ª fase do XXIX Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2017, Bauru. Trabalhos Apresentados na 1ª Fase do XXIX CIC, 2017. 7. SOUZA, O. A.; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L ; RINALDO, D. . Metodologia de superfície de resposta para obtenção do fingerprinting verde de alcachofra por CLAE- DAD. In: XI Semana da Química (Unesp Bauru) - Química e suas aplicações no mundo atual, 2017, Bauru. Livro de resumos, 2017. 8.VIEIRA, T. H. M. ; SOUZA, O. A. ; RINALDO, D. . Aplicação de princípios da química verde na extração em fase sólida (spe) dos analitos das folhas de Maytenus ilicifolia. In: XI Semana da Química (UNESP Bauru) - Química e suas aplicações no mundo atual, 2017, Bauru. Livro de resumos, 2017. 9. SOUZA, O. A.; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L ; RINALDO, D. ; VIEIRA, T. H. M. . Sustainable and heuristic approach for Cynara scolymus L. (Asteraceae) metabolic fingerprinting by RP-HPLC-PAD: a tradeoff between separation and greenness. In: 6th Brazilian Conference on Natural Products, 2017, Vitória (ES). Abstracts, 2017. 10. SOUZA, O. A.; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L ; RINALDO, D. . Important chromatographic parameters for obtaining the artichoke green chromatographic fingerprinting by HPLC-PAD with a sustainable clean-up procedure. In: 46th IUPAC World Chemistry Congress, 2017, São Paulo. Anais - IUPAC 2017(Technical Papers), 2017. 11.SOUZA, O. A.; RINALDO, D. ; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L . Influência de fatores cromatográficos na separação de metabólitos secundários de Cynara scolymus ('alcachofra') por CLAE 'verde'. In: XXVIII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2016, Bauru. Trabalhos Apresentados na 2ª Fase do XXVIII CIC, 2016. 12.SOUZA, O. A.; RINALDO, D. ; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L . Influência de fatores cromatográficos na separação de metabólitos secundários de Cynara scolymus ('alcachofra') por CLAE 'verde'. In: XXVIII Congresso de Iniciação Científica da UNESP, 2016, Bauru. Trabalhos Apresentados na 1ª Fase do XXVIII CIC, 2016. Resumos expandidos publicados em anais de congressos 1. SOUZA, O. A.; RINALDO, D. ; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L . Determinação de variáveis com efeitos importantes na separação de metabólitos secundários de Cynara scolymus (alcachofra) por CLAE-DAD, utilizando conceitos de química verde. In: 56° Congresso Brasileiro de Química, 2016, Belém. CD-ROM do 56° CBQ. Rio de Janeiro: ABQ, 2016. Apresentação oral em eventos nacionais 1. SOUZA, O. A.; RINALDO, D. ; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L . Determinação de variáveis com efeitos importantes na separação de metabólitos secundários de Cynara scolymus (alcachofra) por CLAE-DAD, utilizando conceitos de química verde. In: 56° Congresso Brasileiro de Química, 2016, Belém. CD-ROM do 56° CBQ. Rio de Janeiro: ABQ, 2016. Apresentação oral em eventos internacionais 1. SOUZA, O. A.; FUNARI, C.S ; CARNEIRO, R.L ; RINALDO, D. ; VIEIRA, T. H. M. . Sustainable and heuristic approach for Cynara scolymus L. (Asteraceae) metabolic fingerprinting by RP-HPLC-PAD: a tradeoff between separation and greenness. In: 6th Brazilian Conference on Natural Products, 2017, Vitória (ES). Abstracts, 2017. Organização de eventos 1.Membro da comissão organizadora da XI Semana da Química (Unesp Bauru) - Química e suas aplicações no mundo atual. 2017. Prêmios e títulos 2020: Aprovado em 2° lugar no processo seletivo para o doutorado no Programa de Pós-Graduação em Química no Instituto de Química, Unesp Araraquara . 2019: Melhor vídeo de divulgação científica do I Concurso de Vídeos do INCT - BioNat, Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia - Biodiversidade e Produtos Naturais. 2018: Painel premiado no XIII Workshop de Plantas Medicinais: em busca de produtos naturais bioativos, Instituto de Biociências, UNESP Botucatu. 2018: Prêmio Lavoisier - Maior coeficiente de rendimento acadêmico do curso de Licenciatura em Química no período de 2014 a 2018 (Unesp - Bauru), Conselho Regional de Química (CRQ) - IV Região. 2018: Aprovado em 2° lugar no processo seletivo para o mestrado no Programa de Pós-Graduação em Química no Instituto de Química, Unesp Araraquara. 2018: Menção Honrosa na 1ª Olimpíada Brasileira do Ensino Superior de Química (OBESQ) - 9ª classificação geral nacional, Associação Brasileira de Química (ABQ). 2018: Diploma de Honra ao Mérito para a modalidade Química Analítica (11ª classificação nacional), 1ª Olimpíada Brasileira do Ensino Superior de Química (OBESQ), Associação Brasileira de Química (ABQ). 2018: Diploma de Honra ao Mérito para a modalidade Química Geral (7ª classificação nacional), 1ª Olimpíada Brasileira do Ensino Superior de Química (OBESQ), Associação Brasileira de Química (ABQ). 2018:Diploma de Honra ao Mérito para a modalidade Físico-Química (11ª classificação nacional), 1ª Olimpíada Brasileira do Ensino Superior de Química (OBESQ), Associação Brasileira de Química (ABQ). 2018: Diploma de Honra ao Mérito para a modalidade Química Inorgânica (9ª classificação nacional), 1ª Olimpíada Brasileira do Ensino Superior de Química (OBESQ), Associação Brasileira de Química (ABQ). 2017: Menção honrosa para trabalho intitulado Metodologia de superfície de resposta para obtenção do fingerprinting verde de alcachofra por CLAE-DAD na XI Semana da Química, Faculdade de Ciências - Unesp (Bauru). 2017: Selected for oral presentation, 6th Brazilian Conference on Natural Products/XXXII RESEM. 2016: Trabalho selecionado para apresentação oral, 56° Congresso Brasileiro de Química. Outros 03-12/2014: Bolsista de Apoio Acadêmico e Extensão (BAAE I) no projeto “A importância da Química no estudo das plantas medicinais”, sob orientação do Prof.Dr. Daniel Rinaldo. 12/2015-12/2017: Bolsista de Iniciação Científica (FAPESP) no projeto “Desenvolvimento de métodos analíticos visando atender aos princípios da química verde para identificação dos princípios ativos de alcachofra por CLAE-DAD”, sob orientação do Prof. Dr. Daniel Rinaldo. 1° semestre de 2016: Monitoria voluntária na disciplina de Físico Química I para o curso de “Bacharelado em Física de Materiais”, sob orientação do Prof.Adj. Antônio Carlos Dias Ângelo, com carga horária de 104h. 08/2016 – 07/2017: Representante discente suplente no Conselho de Curso. 04/2017: Palestra no Colégio Criativo, Bauru: Curso Superior em Química. 01/2017 – 12/2017: Representante de classe junto ao Centro Acadêmico da Química (CAQUI) Marie Curie. 09/2017-07/2018 : Representante discente suplente no Conselho de Departamento de Química. 2° Semestre de 2018: Estágio de docência na disciplina ‘Química Orgânica II’, sob supervisão do Prof. Dr. Daniel Rinaldo (Carga horária total: 60 horas). 07/2018 – 10/2020: Bolsista de mestrado acadêmico (CNPq) Dedico essa dissertação à minha mãe, Iraci, ao Jefferson, ao Ytalo e a mim mesmo por não ter desistido mesmo diante de tantas dificuldades AGRADECIMENTOS Meus mais sinceros e eternos agradecimentos à minha mãe, que do seu jeito sempre apoiou meus passos, meus sonhos e minhas lutas. Sem sua ajuda esse título não existiria. E mesmo se existisse, não faria sentido nenhum se eu não pudesse compartilhar essa vitória com você. Obrigado pelo apoio nesses 24 anos. Te amo. Agradeço também aos meus amigos Thiago Henrick e Letícia Alves pelo apoio, suporte, pelos momentos compartilhados, risadas, conselhos, confidências, deboches… Vocês são muito importantes para mim. Amo vocês também. Agradeço ao meu amigo Bruno Felipe (dono da empresa Twitter) pelas conversas durante a madrugada enquanto eu na maioria das vezes estava estressado com alguma coisa da pós. Você ainda vai ser muito famoso. Agradeço aos guardinhas da UNESP cujos nomes desconheço mas que me acompanham durante anos quando eu preciso trabalhar fora do horário comercial no laboratório. Vocês são muito educados, simpáticos e engraçados. Me desculpem por não saber o nome de nenhum de vocês. Agradeço ao meu orientador Daniel Rinaldo que tem me acompanhado durante esses 7 anos, desde a iniciação científica. Eu te agradeço por absolutamente tudo Obrigado pelos conselhos, pela paciência, pelas broncas (que muitas vezes foram necessárias, confesso), mas principalmente por ter me dado autoestima, confiança, e por ter feito o possível para tirar o melhor de mim. Às vezes pensamos de maneira completamente diferente e é exatamente essa diversidade de pensamento que foi crucial para meu crescimento ao longo desses anos e para que eu pegasse gosto pela carreira científica. Obrigado pelos açaís de surpresa durante a tarde, pelas conversas a caminho de Araraquara, e por sempre tentar olhar os coisas por um ângulo otimista. Eu falho miseravelmente nisso, mas um dia eu chego lá. Muito obrigado por tudo mesmo. Independente do caminho que eu tome, parte do meu coração sempre vai pertencer ao GREENSEP. Vi esse laboratório ser construído, vi (e participei) das primeiras publicações, primeiros congressos…desejo toda prosperidade do mundo ao grupo que me introduziu à academia. Agradeço muito ao professor Cristiano Funari por todo o suporte e ajuda, mesmo que à distância, nas pesquisas desde a iniciação científica. Seus artigos são muito bem escritos, meticulosamente pensados…é tudo muito bem feito. Você é um modelo de cientista para mim. Agradeço aos professores de quimiometria Edenir Rodrigues Pereira Filho, Márcia Breitkreitz, Ronei Poppi (in memorian) e Renato Lajarim Carneiro por terem me introduzido na quimiometria. Vocês fizeram com que eu me “encontrasse” e praticamente impediram que eu abandonasse minha iniciação científica logo ali no início, quando tudo estava dando errado. Agradeço aos colegas de laboratório Maiara, Rafa, Isa Ferraz, Lucas Trentin pelas conversas, pelas risadas e pela troca de conhecimentos. Agradeço ao professor Alexandre Legendre por sempre me deixar informado a respeito de oportunidades envolvendo eventos científicos, iniciação científica e olimpíadas acadêmicas, além dos inestimáveis conselhos a respeito da carreira acadêmica. Também o agradeço por ter sido um excelente coordenador de curso e por ter tomado decisões que me beneficiaram e permitiram que meu caminho até aqui fosse menos penoso. Muito obrigado! Agradeço aos senhores João e Célia Legendre por muito gentilmente terem me hospedado em Araraquara enquanto eu cursava as disciplinas necessárias. Jamais me esquecerei da ajuda de vocês! Agradeço ao CNPq pela bolsa de estudos concedida (Processo n° 134790/2018-9). O presente trabalho foi realizado com apoio da Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – Brasil (CAPES) – Código de Financiamento 001. Meu mais sincero agradecimento a todos que apoiaram direta ou indiretame.nte este trabalho, que torcem por mim e que, talvez por esquecimento, não tenham sido incluídos aqui. RESUMO Eugenia uniflora L., conhecida como pitanga, é uma planta nativa do Brasil com uma série de propriedades terapêuticas em razão de seus metabólitos secundários constituintes. Para extração de compostos bioativos, estudos metabolômicos e análises cromatográficas envolvendo essa matriz complexa, historicamente têm sido empregados metodologias e solventes de eficiência questionável, elevado custo associado e impacto negativo para o meio ambiente e a saúde do analista. Considerando que isso representa um cenário anacrônico para o estudo e exploração racional da diversidade micromolecular presente em plantas terapêuticas, o presente trabalho propõe metodologias ambientalmente amigáveis e eficientes para extração e análise do metaboloma das folhas de pitanga. Uma perspectiva holística foi empregada, de modo que planejamentos experimentais robustos, respostas apropriadas que visam simultaneamente a eficiência analítica e ambiental (Green Chromatographic Fingerprinting e HPLC Environmental Assessment Tool), solventes considerados verdes (bioetanol e solventes eutéticos naturais profundos) e uma metodologia extratora consagrada por sua eficiência (irradiação por microondas) foram empregados como um contraponto aos processos dispendiosos e impactantes geralmente envolvidos no estudo dessa espécie. Desenvolveu-se um método cromatográfico empregando bioetanol como modificador orgânico (5,26% a 52,63% de bioetanol em 30 minutos), seguido por uma metodologia extratora otimizada (47 minutos de irradiação microondas a 800W, 39°C e 0,05:1 de razão entre o material vegetal e o solvente eutético natural profundo cloreto de colina: ácido lático na razão molar 1:3 contendo 20% de água em massa, empregado como meio extrator). Os métodos cromatográfico e de extração apresentaram maior eficiência e menor impacto ambiental em comparação com metodologias ou solventes de referência e podem mover instituições regulatórias, farmacopeias e o setor acadêmico e industrial a realmente empregarem metodologias de vanguarda no aspecto analítico e ambiental para exploração adequada da biodiversidade brasileira. Palavras-chave: Plantas medicinais, Química verde, Planejamento de experimentos, Sustentabilidade, Biodiversidade ABSTRACT Eugenia uniflora L., known as pitanga, is a plant native from Brazil with several therapeutic properties related to its secondary metabolites. For the extraction of bioactive compounds, metabolomic studies and chromatographic analyzes involving this complex matrix, methodologies and solvents of questionable efficiency, high associated cost and negative impact on the environment and the health of analysts have been historically used. Considering that this represents an anachronistic scenario for the study and rational exploitation of the micromolecular diversity present in therapeutic plants, the present work proposes environmentally friendly, and efficient methodologies for extracting and analyzing the metabolome of the pitanga leaves. A holistic perspective was used, so robust experimental designs, appropriate responses that aim simultaneously at the analytical and environmental efficiency (Green Chromatographic Fingerprinting and HPLC Environmental Assessment Tool), green solvents (bioethanol and natural deep eutectic solvents) and an established extractive methodology well-known by its efficiency (microwave irradiation) were used as a counterpoint to the expensive and impacting processes usually involved in the study of this species. A chromatographic method was developed using bioethanol as an organic modifier (5.26%-52.63% bioethanol in 30 minutes), followed by an optimized extraction methodology (47 minutes of microwave irradiation at 800W, 39 ° and 0.05 : 1 of ratio between the plant material and the natural deep eutectic solvent choline chloride: lactic acid in molar ratio 1: 3 containing 20% water by mass, used as an extraction medium). Chromatographic and extraction methods have shown greater efficiency and less environmental impact compared to reference methodologies or solvents and can move regulatory institutions, pharmacopoeias and the academic and industrial sector to really employ cutting-edge methodologies in analytical and environmental terms for proper exploitation of brazilian biodiversity. Keywords: Medicinal plants, Green Chemistry, Design of experiments, Sustainability, Biodiversity LISTA DE FIGURAS Figura 1: Pitangueira (Eugenia uniflora L.) ............................................................... 21 Figura 2: Maceração dinâmica das folhas de Eugenia uniflora em solução hidroalcoólica de EtOH/H2O 7:3 (v/v) ....................................................................... 35 Figura 3: Sistema CLAE empregado em todas as etapas do presente trabalho (Jasco, Japão) ......................................................................................................... 36 Figura 4: Método de integração de picos cromatográficos no software Chromnav (Jasco, Japão) ......................................................................................................... 37 Figura 5: Experimentos realizados no Planejamento Fatorial Fracionário 2v 5-1 para as colunas XBridge (cromatogramas em verde) e XSelect (cromatogramas em vermelho). Pontos centrais não foram representados;realizados apenas para mensuração do erro ................................................................................................. 46 Figura 6: Gráfico probabilidade normal com contrastes (principais) significativos representados .......................................................................................................... 47 Figura 7: Cromatogramas dos experimentos 1 a 8 do Planejamento Composto Central (CCD) .......................................................................................................... 50 Figura 8: Cromatogramas dos experimentos 9 a 14 do Planejamento Composto Central (CCD). Pontos centrais otimidos; realizados apenas para o cálculo dos erros ................................................................................................................................. 51 Figura 9: Superfícies de resposta para o modelo multivariado (Eq. 7) estimado pelo Planejamento Composto Central (CCD). (a) Desejabilidade Global (D) versus % inicial de EtOH (X1), % final de EtOH (X2), variável fixada: Temperatura (X3, °C,- 1,68179 ou 35°C); (b) Desejabilidade Global (D) versus % inicial de EtOH (X1), Temperatura (X3, °C), variável fixada: % final de EtOH (X2, -1,68179 ou 52,63%); (c) Desejabilidade Global (D) versus % final de EtOH (X2), Temperatura (X3, °C), variável fixada: % inicial de EtOH (X1, -1,68179 ou 5,26%) ..................................... 53 Figura 10: (a) Impressão digital cromatográfica do extrato hidroetanólico das folhas de E. uniflora em λ = 270 nm. Fase estacionária: XSelect, 150 × 4,6 mm. Fases móveis: H2O + 1% AcOH (A. v/v) e bioetanol (EtOH grau alimentício 95° GL, B) no seguinte gradiente linear: 5,26 –52,63% B em 30 min. Vazão: 0,6 mL min-1. Temperatura de análise: 35 °C; volume de injeção: 20 μL. Espectros UV dos picos cromatográficos majoritários e/ou de picos representativos das clases de metabólitos presentes ou principais marcadores (2, 4, 5 e 6) estão representados acima do cromatograma. 1-3, 5-7 são picos que se encaixam no critério para avaliar a robustez do método (Seção 1.3.6); 2 ácido gálico; 4 pico representativo para a classe metabólica dos taninos hidrolisáveis com unidades de ácido gálico; 5 ácido elágico; 6* quercitrina, pico representativo para a classe dos flavonois e pico de referência para validação (Seção 1.3.6). (b) Cromatograma obtido a partir da reprodução do método de referência de Assunção et al. (2017). Fase estacionária: Synergi Hydro-RP, 250 × 4,6 mm. Fases móveis: H2O (C) e MeCN (D) no seguinte gradiente: 2-5% D em 0-5 min, 5-20% D em 5-12 min, 20-25% D em 12-15 min, 25- 40% D em 15-18 min, 40-80% D em 18-25 min, 80-5% D em 25-28 min e 5-2% D em 28-30 min . Vazão: 1,0 mL min-1. Temperatura de análise: 25°C; Volume de injeção: 20 μL. ....................................................................................................................... 57 Figura 11: Programação do método ótimo desenvolvido no sistema CLAE (Jasco, Japão) ...................................................................................................................... 62 Figura 12: Estrutura de (a) ácido gálico; (b) quercitrina e (c) ácido elágico .............. 63 Figura 13: Cromatogramas relativos aos experimentos do Planejamento Fatorial Completo 23 para avaliação da robustez do método. Pontos centrais foram omitidos; realizados apenas para mensurar os erros .............................................................. 67 Figura 14: Pictogramas contendo os scores apresentados na métrica AGREE para (a) o método com bioetanol desenvolvido no presente trabalho e (b) o método de Assunção et al. (2017) ............................................................................................. 70 Figura 15: Equipamento empregado para síntese e extrações assistidas a microondas (Ethos Easy, Milestone Srl, Itália) ......................................................... 80 Figura 16: Solventes eutéticos naturais profundos (NADESs) preparados. (a) ‘MA: Sor 1:1’, (b) ‘MA: Glu: Fru 1:1:1’, (c) ‘LA: Suc 1:2’, (d) ‘ChCl: Glu 1:1’, (e) ‘ChCl: LA 1:3’ ........................................................................................................................... 87 Figura 17: Espectros na região do infravermelho (IV) dos solventes eutéticos naturais profundos sintetizados. (a) ‘MA: Sor 1:1’, em vermelho; (b) ‘MA: Glu: Fru 1:1:1’, em verde; (c) ‘LA: Suc 1:2’, em azul; (d) ‘ChCl: Glu 1:1’, em cinza; (e) ‘ChCl: LA 1:3”, em amarelo................................................................................................. 88 Figura 18: Estrutura dos componentes de partida dos NADESs preparados no presente trabalho ..................................................................................................... 90 Figura 19: Valores de (a) área total de picos (Vxs) e (b) número de picos obtidos ao se empregar os solventes eutéticos naturais profundos como meios extratores. Resultados indicados como valor médio ± desvio padrão (n=3) ............................... 92 Figura 20: Cromatogramas obtidos para as extrações realizadas com (a) ‘MA: Sor 1:1’, em vermelho; (b) ‘MA: Glu: Fru 1:1:1’, em verde; (c) ‘LA: Suc 1:2’, em azul; (d) ‘ChCl: Glu 1:1’, em cinza; (e) ‘ChCl: LA 1:3’, em amarelo. Para condições cromatográficas, vide Seção 2.3.6. .......................................................................... 95 Figura 21: Cromatogramas 1 a 8 do Planejamento Composto Central. Para condições cromatográficas, vide seção 2.3.6. Picos oriundos do tempo morto, da mistura eutética ou do bioetanol empregados como meio extrator e/ou componente de fase móvel (destacados com asterisco) foram desconsiderados. ........................ 98 Figura 22: Cromatogramas 9 a 14 do Planejamento Composto Central. Cromatogramas do ponto central foram omitidos; realizados apenas para cômputo dos erros. Para condições cromatográficas veja seção 2.3.6. Picos oriundos do tempo morto, da mistura eutética ou do bioetanol empregados como meio extrator e/ou componente de fase móvel (destacados com asterisco) foram desconsiderados. ................................................................................................................................. 99 Figura 23: Superfícies de resposta obtidas para o modelo polinomial (Eq. 11) estimado a partir do Planejamento Composto Central (CCD). (a) D versus tempo (min, X2), razão material vegetal/NADES (m/m, X1); temperatura fixada em -0,82420 (39°C, X3), (b) D versus temperatura (°C, X3), razão material vegetal/ NADES (m/m, X1); tempo fixado em 1,68179 (47 min, X2), (c) D versus temperatura (°C, X3), Tempo (min, X2); razão material vegetal/NADES (m/m, X1) fixada em 1,68179 (0,05:1, m/m). ............................................................................................................................... 103 Figura 24: Cromatogramas obtidos a partir das extrações assistidas a microondas nas condições ótimas determinadas pelo Planejamento Composto Central nas misturas extratoras (a) ChCl + LA 1:3 (+20% H2O m/m) e (b) EtOH/ H2O 7:3 (v/v). Picos oriundos da mistura eutética ou do bioetanol empregados como meio extrator e/ou componente de fase móvel (destacados com asterisco) foram desconsiderados ............................................................................................................................... 104 Figura 25: Rampa de aquecimento e método ótimo (fotografados pelo autor) para extração assistida a microondas no visor do equipamento empregado para extração ............................................................................................................................... 104 Figura 26: Scores obtidos na métrica AGREE para as metodologias extratoras envolvendo (a) ‘ChCl: LA 1:3’ e (b) EtOH/ H2O 7:3 (v/v) ........................................ 108 LISTA DE TABELAS Tabela 1: Valores codificados (e reais) das variáveis estudadas seguidas pelas respectivas respostas no Planejamento Fatorial Fracionário 2v 5-1 ............................ 45 Tabela 2: Valores codificados (e reais) das variáveis restudadas seguidas pelas respectivas respostas no Planejamento Composto Central (CCD)........................... 49 Tabela 3: Análise de Variância (ANOVA) para o modelo estimado (Eq. 7) através do Planejamento Composto Central (CCD) correlacionando os termos significativos com a Desejabilidade Global (D) ..................................................................................... 52 Tabela 4: Comparação da performance cromatográfica e ambiental do método proposto no presente trabalho com o método de referência de Assunção et al. (2017) previamente publicado para obtenção de fingerprinting metabólico de Eugenia uniflora L. em CLAE ................................................................................................. 61 Tabela 5: Compostos propostos para E. uniflora por LC–DAD-MS e dados de UV e MS correespondentes .............................................................................................. 63 Tabela 6: Valores codificados (e reais) para as variáveis independentes estudadas no Planejamento Fatorial Completo 23 e respostas correspondentes aos tempos de retenção relativos (em relação ao pico de referência 6, Fig. 10a e Fig. 13) .............. 66 Tabela 7: Parâmetros de entrada no software da métrica AGREE para cálculo do score referente ao método cromatográfico desenvolvido e o método de Assunção et al. (2017). ................................................................................................................. 69 Tabela 8: Diferentes combinações para a preparação dos NADESs ........................ 80 Tabela 9: Solventes eutéticos naturais profundos sintetizados (contendo 20% de H2O, m/m) e aspecto apresentado pelas misturas resultantes. Para condições de síntese vide Tab. 8. .................................................................................................. 86 Tabela 10: Área total e número de picos apresentados ao se empregar os solventes eutéticos sintetizados como meio extrator em extração assistida a microondas ...... 91 Tabela 11: Valores codificados (e reais) para as variáveis estudadas no Planejamento Composto Central (CCD) e respectivas respostas obtidas ................ 97 Tabela 12: Análise de Variância (ANOVA) para o modelo estimado (Eq. 11) através do Planejamento Composto Central (CCD) correlacionando os termos significativos com a Desejabilidade Global (D) ............................................................................ 100 Tabela 13: Comparação entre a capacidade extratora, impacto ambiental e performance holística do solvente eutético natural ‘ChCl + LA 1:3’ e a mistura de referência composta por EtOH e H2O na proporção 7:3 (v/v) ................................. 105 Tabela 14: Parâmetros de entrada no software da métrica AGREE para cálculo do score referente às extrações empregando como solvente ‘ChCl: LA 1:3’ e ‘EtOH/H2O 7:3 (v/v)’ ................................................................................................................. 107 file:///C:/Users/Otavio/Desktop/Versão%20final%20dissertação.docx%23_Toc55321037 file:///C:/Users/Otavio/Desktop/Versão%20final%20dissertação.docx%23_Toc55321037 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AcOH Ácido acético ANOVA Análise de Variância C18 Fase estacionária de fase reversa do tipo Octadecilsilano CCD Planejamento Composto Central CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência CLUE Cromatografia Líquida de Ultra Alta Eficiência DAD Detector por Arranjo de Diodos DES Deep Eutectic Solvent DoE Design of Experiments DPR Desvio Padrão Relativo EtOH Etanol GAC Green Analytical Chemistry GCFR Green Chromatographic Fingerprinting Response GCF Green Chromatographic Fingerprinting HPLC High Performance Liquid Chromatography IL Ionic liquid LTTM Low-Transition Temperature Mixture MAE Microwave-assisted extraction MeCN Acetonitrila MeOH Metanol MS Espectrometria de Massas mV Milivolt m/z Razão massa/carga NADES Natural Deep Eutectic Solvent PTFE Politetrafluoroetileno TFA Ácido trifluoroacético tR Tempo de retenção UV Ultravioleta Z Medida de afastamento da média populacional ʎ Comprimento de onda SUMÁRIO INTRODUÇÃO GERAL E REVISÃO ....................................................................... 21 Pitanga ................................................................................................................. 21 Solventes verdes .................................................................................................. 24 OBJETIVO GERAL ................................................................................................. 28 CAPÍTULO 1............................................................................................................ 29 1.1 INTRODUÇÃO E REVISÃO............................................................................... 30 1.2 OBJETIVOS ...................................................................................................... 33 1.3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 34 1.3.1 Produtos químicos e reagentes .................................................................... 34 1.3.2 Material vegetal............................................................................................ 34 1.3.3 Extração de metabólitos secundários de E. uniflora por maceração dinâmica ............................................................................................................................. 34 1.3.4 Instrumentação e análises CLAE ................................................................ 35 1.3.5 Triagem e otimização: Metodologia de Superfície de Resposta (RSM) ....... 37 1.3.6 Validação do método otimizado ................................................................... 42 1.3.7 Avaliação do impacto ambiental: AGREE .................................................... 42 1.3.8 Análises subsequentes por CLUE-DAD-MS ................................................. 43 1.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 44 1.4.1 Planejamento Fatorial Fracionário 2v 5-1: Escolha da melhor coluna cromatográfica e seleção das variáveis significativas ........................................... 44 1.4.2 Otimização: Planejamento Composto Central (CCD) ................................... 48 1.4.3 Comparação da performance e do impacto ambiental do método desenvolvido em relação a um método de referência da literatura ....................... 56 1.4.4 Aplicação do método desenvolvido para detecção dos principais classes de metabólitos secundários presentes nas folhas de E. uniflora ............................... 62 1.4.5 Validação do método cromatográfico ........................................................... 64 1.4.5.1 Precisão instrumental ................................................................................ 64 1.4.5.2 Repetibilidade ........................................................................................... 64 1.4.5.3 Precisão Intermediária .............................................................................. 65 1.4.5.4 Robustez ................................................................................................... 65 1.4.6 AGREE – Analytical GREEness .................................................................. 68 1.5 CONCLUSÃO .................................................................................................... 72 CAPÍTULO 2............................................................................................................ 73 2.1 INTRODUÇÃO E REVISÃO............................................................................... 74 2.2 OBJETIVOS ...................................................................................................... 78 2.3 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................. 79 2.3.1 Materiais ...................................................................................................... 79 2.3.2 Preparação dos solventes eutéticos naturais profundos (NADESs) ............. 79 2.3.3 Espectroscopia na região do infravermelho ................................................. 81 2.3.4. Extração assistida a microondas (MAE) do metaboloma de E. uniflora ....... 81 2.3.4.1 Triagem com diferentes NADESs .......................................................... 81 2.3.4.2 Otimização com o Planejamento Composto Central e Função de Desejabilidade Global ........................................................................................ 81 2.3.5 Preparação das amostras para injeção no sistema CLAE ........................... 83 2.3.6 Análises em CLAE ....................................................................................... 84 2.3.7 Comparação entre extração assistida a microondas desenvolvida e otimizada com NADES e metodologia extratora com solvente de referência ....................... 84 2.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO ......................................................................... 86 2.4.1 Aspecto dos solventes eutéticos naturais profundos (NADESs) preparados ............................................................................................................................. 86 2.4.2 Caracterização dos solventes eutéticos naturais profundos (NADESs): espectroscopia na região do infravermelho ........................................................... 87 2.4.3 Triagem: Avaliação da performance dos solventes eutéticos naturais profundos como solventes extratores do metaboloma de E. uniflora .................... 90 2.4.4 Otimização da extração através Planejamento Composto Central (CCD) e comparação com sistema solvente de referência ................................................. 96 2.4.5 AGREE: Analytical GREEness Calculator ................................................. 106 2.4.6 Princípios da Extração Verde aplicados ..................................................... 109 2.5 CONCLUSÃO .................................................................................................. 110 CONCLUSÃO GERAL .......................................................................................... 111 REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 111 21 INTRODUÇÃO GERAL E REVISÃO Pitanga Eugenia uniflora L. (Myrtaceae, Fig. 1), também conhecida como pitanga, é uma espécie vegetal nativa do Brasil. No entanto, sua versátil adaptabilidade a diferentes condições de solo e clima justificam sua presença em outros países da América do Sul, Central e do Norte, além da Europa e da Ásia. Seu fruto tem um sabor característico altamente apreciado com aplicações na indústria de alimentos para produção de suco e polpa congelada, por exemplo (CELLI, PEREIRA-NETTO, BETA., 2011; MALAMAN et al., 2011; MARTINEZ-CORREA et al., 2011; SILVA, 2006; BEZERRA et al., 2004; RUTZ et al., 2013; LIRA JUNIOR et al., 2007). Figura 1: Pitangueira (Eugenia uniflora L.) Fonte: Arquivo pessoal 22 Essa espécie pode ser utilizada como alternativa terapêutica na medicina popular considerando seu potencial farmacológico intrínseco (SCHAPOVAL et al., 1994). Especialmente, suas folhas apresentam atividades antioxidante (MARTINEZ- CORREA et al., 2011), anti-inflamatória (SCHAPOVAL et al., 1994), anti- hipertensiva (CONSOLINI, BALDINI, AMAT, 1999) e anti-hiperglicêmica (ARAI et al., 1999), entre outras. O amplo intervalo de atividades biológicas apresentado por essa espécie justifica sua identificação para potencial produção de fitoterápicos pelo Ministério da Saúde do Brasil (MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL, 2009). Tais atividades terapêuticas são relacionadas ao metaboloma presente em tais folhas (como taninos e flavonoides; LEE et al., 1997; RATTMANN et al., 2012) que pode ser derivado de interações entre fatores bióticos (como genes, proteínas, entre outros) e o ambiente (PILON et al., 2016; FIEHN, 2002; WOLFENDER et al., 2013; NICHOLSON e LINDON, 2008; YULIANA et al., 2011). Além disso, sua pronta disponibilidade evita gastos e impactos ambientais cumulativos no que tange à sua aquisição, além de garantir um maior controle sobre suas condições de armazenamento e conservação (GAŁUSZKA et al., 2012). Não obstante, sob uma perspectiva histórica, há trabalhos na literatura (como o trabalho de Bagetti et al., 2011) que envolvem a extração propriamente dita de compostos bioativos da pitanga com o emprego de solventes orgânicos voláteis, majoritariamente poluentes, inflamáveis e tóxicos para o experimentador e para o meio ambiente (MBOUS et al., 2017; VENTURA et al., 2017). Embora certos trabalhos (como o de Schapoval et al., 1994) empreguem meios extratores (seja na forma pura ou como componentes majoritários em soluções) solventes considerados ambientalmente amigáveis, suas vantagens do ponto de vista ecológico podem ser ofuscadas visto que os mesmos majoritariamente podem utilizar técnicas convencionais pouco versáteis (como maceração e percolação por exemplo), às quais exigem um elevado gasto de recursos – em termos de energia, tempo e volume de solventes - geram resíduos sólidos (como a extração em fase sólida) e possuem eficiência questionável (WANG, WELLER, 2006). A análise dos metabólitos secundários extraídos também é digna de nota: Nesse âmbito, em razão de sua versatilidade e eficácia, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) acoplada a detectores UV ou MS se destaca como técnica analítica. Em levantamento bibliográfico realizado na base de dados ISI Web of 23 Science entre 21 e 24 de fevereiro de 2019, constatou-se que 100% dos trabalhos envolvendo E. uniflora que empregam cromatografia líquida (LC) na determinação dos compostos bioativos empregam acetonitrila e metanol como fases móveis nos estudos. Embora tais solventes possuem propriedades físico-químicas desejáveis do ponto de vista cromatográfico, além de gerar resíduos de tratamento dispendioso, eles são tóxicos à vida aquática e aos humanos mesmo em grau analítico, principalmente aos analistas expostos a tais solventes em análises rotineiras envolvendo estudos metabolômicos e controle de qualidade. O cenário se torna ainda mais preocupante porque tais solventes podem ser utilizados de modo indiscriminado ou excessivo em tais trabalhos. Desse modo, o uso de solventes e técnicas extratoras em estudos envolvendo a pitanga, uma matriz vegetal de interesse terapêutico, é inconsistente para o progresso da Química de Produtos Naturais sob uma perspectiva holística, visto que seu campo de estudo - envolvendo essencialmente organismos como plantas e fungos, ecossistemas de modo geral e as relações bióticas e abióticas intrínsecas - pode ser potencialmente danificado pelos mesmos solventes tóxicos empregados em sua investigação. Adicionalmente, produtos químicos e metodologias ambientalmente danosas são incompatíveis com a Química Analítica Verde (Green Analytical Chemistry ou GAC, GAŁUSZKA, MIGASZEWSKI, NAMIEŚNIK, 2013; WELCH et al., 2010; GABER et al., 2011; KALJURAND e KOEL, 2011; HUTCHINSON et al., 2012,FRITZ, RUTH, KRAGL, 2009, FUNARI et al., 2014b). 24 Solventes verdes Além do uso de técnicas modernas eficientes e sustentáveis, o tópico de maior interesse da Química Analítica Verde nos dias atuais envolve desenvolver e aplicar solventes alternativos ambientalmente amigáveis, com base no fato de que os maiores gastos em sínteses e processos (considerando a execução dos processos em si, os dispêndios envolvidos em aquisição, bem como quantidade de resíduos gerados e sua disposição e tratamento adequados) estejam diretamente relacionados aos solventes tradicionais (ANASTAS & WARNER, 1998; ANASTAS & EGHBALI, 2010; GAŁUSZKA, MIGASZEWSKI, NAMIEŚNIK, 2013; TOBISZEWSKI, MECHLIŃSKA, NAMIEŚNIK, 2010). Em 2011, Choi et al. propuseram na literatura científica a existência de solventes completamente convenientes para os interesses da Química Analítica Verde, e oriundos da própria natureza: os solventes eutéticos naturais profundos, ou Natural Deep Eutectic Solvents (NADESs). O termo NADES, segundo os mesmos autores, refere-se a uma espécie de fase líquida ou mistura eutética formada por metabólitos primários (açúcares, álcoois, derivados de colina, ácidos orgânicos, entre outros), com estrutura supramolecular gerada a partir de ligações de hidrogênio entre os componentes de partida e presentes nas células de plantas. Tal fase líquida é descrita como um fluido separado da água e lipídios, e importante para o metabolismo celular nas espécies vegetais visto que desempenharia papéis como controle de composição de metabólitos secundários de polaridade reduzida nas células, biossíntese, germinação, resistência ao estresse salino e frio e seca intensos. Na literatura científica, as principais aplicações dos NADESs envolvem a extração de fenóis e flavonoides, evidenciando a potencialidade destes solventes na produção de extratos de plantas (ESPINO et al., 2016; ZHAO et al., 2015). Além disso, os NADES são considerados por Radoćšević et al. (2016) como ‘designer solvents’ devido às suas múltiplas possibilidades estruturais e o potencial para planejar suas propriedades físico-químicas para propósitos distintos. Nesse contexto, não é surpreendente que Paiva et al. (2014) considerem os NADES como ‘solventes do século 21’. Considerando que tais solventes inteligentes representam um tópico de pesquisa crescente e relativamente novo (além do fato de a sua definição ainda 25 representar uma novidade), informações confusas ou diferentes sobre eles podem ser encontradas na literatura e esse fenômeno é reconhecido por alguns autores (ESPINO et al., 2016; DURAND, LECOMTE,VILLENEUVE, 2016). Diferentes nomenclaturas como líquidos iônicos (ionic liquids, ou ILs), solventes eutéticos profundos (tradução livre de deep eutectic solvents, ou DES) e misturas de baixa temperatura de transição (tradução livre de Low-Transition Temperature Mixtures, ou LTTMs) podem ser utilizadas de modo indiscriminado (e às vezes, até mesmo equivocado) para se referirem aos NADESs, provavelmente porque tais classes de solventes podem compartilhar um mecanismo comum de formação (p.ex. podem ser formados pela combinação de componentes primários) e podem apresentar propriedades físico- químicas similares (como baixa temperatura de transição, volatilidade negligenciável, baixa pressão de vapor, etc; DURAND, LECOMTE,VILLENEUVE, 2016). Em partes tal fenômeno faz sentido visto que a terminologia ‘NADES’ é mais nova do que as terminologias ‘IL’ e ‘DES’: ILs and DESs foram introduzidos na literatura em 1914 (CHOI et al., 2011; PLECHKOVA e SEDDON, 2008) e 2002/2003 (ABBOTT et al., 2003), respectivamente. Também, existe uma relação entre fatores cientométricos como fator de impacto, número de citações de um dado manuscrito ou a carreira dos autores de um eventual trabalho pioneiro que envolva algum solvente particular no que tange à consolidação ou preferência de alguns desses termos em detrimento de outros entre a comunidade científica. Assim, até 2011 apenas as terminologias ‘IL’ e ‘DES’ eram disponíveis para denominar e classificar os NADES (que podem se encaixar em uma ou várias dessas nomenclaturas alternativas), além do fato de que a delimitação de uma fronteira de classificação entre alguns desses solventes não ser uma tarefa trivial e nem mesmo razoável em alguns casos (p.ex. diferenciar os ‘DESs’ de ‘NADESs’) considerando que as propriedades comuns entre eles; conduzindo alguns autores a classificar ‘ILs’, ‘DESs’ e ‘NADESs’ como subfamílias de LTTMs. Porém, tal confusão se torna um pouco problemática em alguns contextos considerando que algumas propriedades ou características de tais classes de solventes podem ser distintas, como reatividade, além do caráter sustentável dos (NA)DESs em comparação com os líquidos iônicos, por exemplo (PAIVA et al., 2014; DURAND, LECOMTE,VILLENEUVE, 2016). Portanto, em vários trabalhos presentes na literatura antes e após 2011 (alguns dos quais inclusive vigoram dentre os mais citados no que tange a levantamentos 26 bibliográficos envolvendo um nome de uma das classes de solventes supracitadas em específico) os NADESs têm sido classificados com nomes alternativos (DURAND, LECOMTE,VILLENEUVE, 2016; FRANCISCO, van den BRUINHORST, KROON, 2013; ZHANG et al., 2012; SMITH, ABBOTT, RYDER,2014). De acordo com Dai et al. (2013a), Espino et al. (2016) e Gomez et al. (2018) há quatro métodos para preparação dos NADESs: (1) heating and stirring (HS); (2) evaporação; (3) freeze-drying e (4) irradiação por microondas. As propriedades físico-químicas dos NADESs preparados são funções da viscosidade, condutividade, densidade e polaridade da mistura eutética. A flexibilidade de composição dos (NA)DESs tornou tais solventes uma ferramenta promissora em muitas áreas, dentre as quais pode-se citar a eletroquímica (ABBOTT et al., 2011), a nanotecnologia (WAGLE, ZHAO, BAKER, 2014) e a farmacologia (JELIŃSKI e CYSEWSKI, 2018). Também, uma das aplicações fundamentais de tais misturas são seu emprego como meios extratores sustentáveis (DAI et al., 2013b, WEI et al., 2015a). Ainda que bases de dados como a ISI Web of Science já reúnam uma série de artigos que empreguem NADES como meios extratores e enfatizem seu caráter mais verde em relação a solventes tradicionais, notam-se incoerências sistemáticas na aplicação de tais misturas como solventes verdes, as quais se contrapõem aos conceitos e princípios da Química Analítica Verde e, por consequência, às potenciais vantagens analíticas e ambientais dos NADES, como (i) emprego de técnicas que exijam um gasto elevado de tempo e energia, como o de Liu et al. (2018); (ii) diluição dos extratos de NADES com solventes orgânicos antes da injeção, a exemplo do trabalho de Nam et al. (2015), publicado na Green Chemistry; (iii) combinação de NADES com solventes com potencial risco para o meio ambiente e o analista, como em Ribeiro, Coelho e Marrucho (2013); (iv) recuperação de analitos de interesse de extratos de NADES e eluição com metanol, como em Abdul Hadi et al. (2015); e (V) análises subsequentes dos extratos de NADES em HPLC empregando acetonitrila e metanol, tóxicos e poluentes, como fases móveis. Tal problema, com exceção do trabalho de Funari et al. (2019), envolve quase a totalidade dos estudos envolvendo NADES que empregam CLAE como técnica de análise. A substituição de solventes tóxicos, poluentes e de preço elevado como acetonitrila e metanol - usualmente empregados em estudos metabolômicos ou análises controle de qualidade via CLAE - é prioritária, obviamente, do ponto de vista 27 ecológico e econômico. Do mesmo modo que os NADES se apresentam como substitutos promissores de solventes extratores tóxicos, poluentes e caros, o uso de fases móveis ecologicamente amigáveis é uma prática coerente com a Química Analítica Verde, com conceitos valorizados nos tempos atuais como bioeconomia – ou o uso de materiais renováveis como blocos construtores elementares de materiais, produtos quimicos e fonte de energia – e, por consequência, com os interesses de agências como a Organização das Nações Unidas, a exemplo da Agenda para Desenvolvimento Sustentável de 2030, uma espécie de plano de ação que incentiva fortemente a adoção de práticas inofensivas ao meio ambiente para o alcance macroestrutural e sólido de um equilíbrio social, ambiental e econômico em escala global (THE UNITED NATIONS, 2015; MCCORMICK & KAUTTO,2013). Nesse contexto, solventes como o bioetanol apresentam um elevado potencial como alternativa verde em razão de suas propriedades como biodegradabilidade, origem renovável, preço potencialmente inferior em relação aos solventes tradicionais e maior disponibilidade, além de oferecerem a possibilidade de análise sem a geração de resíduos tóxicos e serem aplicáveis por pequenos laboratórios, ou localidades ecologicamente sensíveis e países em desenvolvimento onde a conveniente disposição de resíduos é muito cara ou não é bem estabelecida (FUNARI et al., 2014b, FUNARI et al., 2016). Alguns trabalhos na literatura, como os de Funari et al. (2016) e Welch et al. (2015) admitem que o bioetanol possui eficiência cromatográfica comparável ou superior a de solventes tradicionais empregados em CLAE. Ainda que tal solvente e suas misturas apresentem maior viscosidade em relação à acetonitrila ou metanol, essa desvantagem pode ser anulada pelo emprego de estratégias multivariadas e por uma abordagem holística em sua aplicação. O uso dos NADES, uma nova geração de solventes como meios extratores, associado a técnicas modernas, comprovadamente eficazes e que garantam baixo consumo de energia e volume de solventes, como as extrações assistidas por micro- ondas (microwave assisted extraction, ou MAE, segundo WANG, DING e REN, 2016) e planejamentos fatoriais, além do uso de solventes alternativos como bioetanol nas análises em CLAE, indubitavelmente caracterizam um avanço para a Química dos Produtos Naturais – a qual muitas vezes emprega técnicas laboriosas, financeiramente dispendiosas e solventes tóxicos e igualmente caros - e são realmente coerentes com os conceitos e princípios da Química Analítica Verde. 28 OBJETIVO GERAL O presente trabalho tem como objetivo geral, sob uma perspectiva global, o desenvolvimento de metodologias inovadoras, ambientalmente amigáveis e robustas para controle de qualidade das folhas de Eugenia uniflora L. desde a extração até a análise dos seus constituintes, empregando solventes eutéticos naturais profundos como meios extratores, extração de compostos bioativos assistida por micro-ondas, análises cromatográficas utilizando bioetanol como fase móvel e Planejamentos Experimentais aliados a métricas apropriadas que garantam eficiência analítica, economia de tempo e recursos e baixo impacto ambiental. 29 CAPÍTULO 1 __________________________________________________________ 30 1.1 INTRODUÇÃO E REVISÃO A ampla diversidade metabólica presente em plantas medicinais e a possibilidade de interação sinérgica entre vários compostos bioativos no que tange ao seu papel nas propriedades terapêuticas globais de tais matrizes complexas tornam o desenvolvimento robusto de medicamentos à base de plantas uma tarefa complicada (TISTAERT, DEJAEGHER, VANDER HEYDEN, 2011; LIANG,XIE, CHAU, 2010, LI et al., 2010). Assim, nesse contexto, uma abordagem multicomponente deve ser aplicada para padronização e controle de qualidade de plantas com potencial farmacológico (e, por consequência, seus derivados) visando garantir segurança e eficiência. Como exemplo de abordagem multiparamétrica pode-se citar fingerprints cromatográficos representativos, sugeridos pela US Food and Drug Administration (FDA) e pela Organização Mundial da Saúde (World Health Organization, WHO; WOLFENDER et al., 2015; SOUZA et al., 2018; US FOOD AND DRUG ADMINISTRATION, 2004; ORGANIZAÇÃO MUNDIAL DA SAÚDE,1991). O desenvolvimento de métodos cromatográficos empregando Metodologia de Superfície de Resposta é útil para obtenção de fingerprints metabólicos de plantas. Em oposição à abordagem tradicional one variable at a time (OVAT), a Metodologia de Superficie de Resposta é uma abordagem multivariada que estuda os fatores de interesse de modo simultâneo, sistemático e imparcial empregando Planejamento de Experimentos (Design of Experiments, ou DoE), possibilitando identificar interações possíveis entre as mesmas, ajustar os dados experimentais a equações de regressão que descrevam a matriz ou sistema estudados, realizar previsões estatísticas e identificar condições analíticas ótimas através de superfícies de resposta. Adicionalmente, através da Metodologia de Superfície de Resposta é possível obter o máximo de informação com um número mínimo de experimentos, economizando tempo e recursos (LEARDI, 2009; MYERS, MONTGOMERY, COOK, 2016; PILON et al., 2016; MONTGOMERY, 2017; BREITKREITZ, JARDIM, BRUNS., 2009; SOUZA et al., 2018). A seleção de uma função-resposta apropriada também é importante para obter um fingerprint cromatográfico eficiente sobretudo se o desenvolvimento do método em si envolver propósitos sustentáveis. Assim, deve-se considerar simultaneamente 31 parâmetros de separação e ambientais nesse âmbito. Nesse contexto, é proveitoso saber que a métrica Green Chromatographic Fingerprinting Response (FUNARI et al., 2014a) foi proposta na literatura objetivando obter uma compensação entre separação e sustentabilidade. Tal métrica essencialmente visa maximizar o número de informação química por quantidade de solvente e energia gastos (FUNARI et al., 2014a). A seleção de um solvente alternativo ambientalmente amigável apropriado que apresente compatibilidade com a plataforma analítica empregada também é um ponto sensível que deve ser considerado. Dentre os solventes orgânicos altamente disponíveis, etanol (EtOH) é considerado o mais verde (NUTRIZIO et al., 2020) e portanto pode auxiliar pesquisadores a atingirem tais objetivos. Para um fingerprint cromatográfico verde, tal solvente é preferível diante dos frequentemente empregados porém potencialmente tóxicos acetonitrila (MeCN) e metanol (MeOH; PRAT, HAYLER, WELLS, 2014; PRAT et al., 2016; WELCH et al., 2010; PUBLIC HEALTH ENGLAND, 2015). Além disso, ele pode ser produzido a partir de recursos renováveis como cereais e cana de açúcar e é biodegradável, o que são características altamente desejáveis para um solvente considerado verde (CHEMAT, VIAN, CRAVOTTO, 2012; OLIVES, GONZÁLEZ-RUIZ, MARTÍN, 2017; ZABED et al., 2017; NUTRIZIO et al., 2020). Etanol e até mesmo bioetanol foram aplicados de modo bem-sucedido para desenvolvimento de impressões digitais cromatográficas de plantas e outras matrizes complexas naturais, como demonstrado previamente na literatura (FUNARI et al., 2014a; FUNARI et al., 2014b; FUNARI et al., 2016; SOUZA et al., 2018). As potenciais desvantagens no emprego de etanol em sistemas CLAE (como por exemplo a vicosidade relativamente alta de misturas de EtOH/H2O) foram superadas em tais trabalhos, conduzindo a separações cromatográficas satisfatórias e mais sustentáveis. As abordagens supracitadas possibilitam a aplicação de princípios da Química Analítica Verde (Green Analytical Chemistry, ou GAC; GAŁUSZKA MIGASZEWSKI, NAMIEŚNIK, 2013). Resumidamente, os 12 princípios da GAC estabelecem o seguinte: 1) Técnicas analíticas diretas devem ser empregadas para evitar tratamento de amostra; 2) As dimensões e quantidade das amostras devem ser minimizadas; 3) Medições in situ são prioritárias; 32 4) Deve ocorrer a integração entre processos e operações analíticas; 5) Métodos automatizados e miniaturizados têm preferência; 6) Deve-se evitar derivação; 7) Geração de resíduos deve ser muito reduzida e um manejo adequado dos mesmos deve ocorrer; 8) Métodos multianalito ou multiparamétricos são prioritários; 9) O gasto de energia deve ser o mínimo possível; 10) O uso de reagentes oriundos de fontes renováveis tem prioridade; 11) Reagentes tóxicos devem ser eliminados ou substituídos; 12) A segurança do analista deve ser maior. Assim, o objetivo geral desse capítulo é apresentar um método em CLAE-DAD globalmente otimizado, eficiente e sustentável para fingerprinting metabólico das folhas de E. uniflora. Para atingir esse objetivo, todo o processo foi guiado o tanto quanto possível pelos princípios e conceitos da GAC (GAŁUSZKA, MIGASZEWSKI, NAMIEŚNIK, 2013). Assim, abordagens mutivariadas e multianalito foram selecionadas, parâmetros de separação e sustentabilidade foram igualmente monitorados através de duas funções-resposta apropriadas e complementares entre si, bioetanol grau alimentício foi escolhido como modificador orgânico e um sistema CLAE convencional foi empregado para tornar o método desenvolvido compatível até mesmo com aparatos que não necessariamente correspondam ao estado-da-arte em termo de instrumentação. 33 1.2 OBJETIVOS • Desenvolver e otimizar um método de eluição ambientalmente amigável para fingerprinting metabólico das folhas de Eugenia uniflora L. empregando planejamento de experimentos e considerando simultaneamente aspectos ambientais e de separação; • Validar qualitativamente o método desenvolvido segundo recomendações internacionais; • Estabelecer comparações entre o método desenvolvido e um método de referência da literatura em termos de performance cromatográfica e impacto ambiental aplicando métricas apropriadas. 34 1.3 MATERIAIS E MÉTODOS 1.3.1 Produtos químicos e reagentes Ácido acético (grau analítico, Synth, Brasil), etanol (EtOH alimentício Agro Industrial Tarumã Ltda., Brasil), etanol (EtOH, grau HPLC, LiChrosolv, Merck KGaA, Alemanha), H2O ultrapurificada em sistema Milli-Q (Millipore, EUA) e acetonitrila (MeCN, LiChrosolv, Merck KGaA, Alemanha) foram empregados nesta etapa específica do trabalho. 1.3.2 Material vegetal Folhas de E. uniflora L. foram coletadas na Universidade Estadual Paulista (Unesp), na cidade de Bauru-SP, Brasil, em 23 de novembro de 2018, período da manhã (Cadastro/registro no SisGen n° A8E8E03; data do cadastro: 29/01/2020, 16:36:34; cadastro concluído). A identidade botânica do material vegetal foi autenticada no Departamento de Biologia da mesma universidade, e identificada pela Profa. Dra. Veridiana de Lara Weiser Bramante. O voucher foi depositado no Herbário UNBA da Faculdade de Ciências da Universidade Estadual Paulista (Unesp) na cidade de Bauru-SP sob o código de registro “Herbário UNBA 6067”. Após coletadas, as folhas foram secas a 40°C durante 10 dias em estufa de ar circulante (SPLabor, Brasil) e pulverizadas em triturador mecânico (LB Balanças, Brasil). O material resultante foi colocado em frasco âmbar e protegido da umidade e do calor. 1.3.3 Extração de metabólitos secundários de E. uniflora por maceração dinâmica Aproximadamente 100 mg das folhas secas e pulverizadas de E. unifora foram submetidas à maceração dinâmica a 200 rpm, por 2h (Heidolph, Alemanha) com 10 mL de solução de EtOH 95°GL grau alimentício/H2O [ (7,37:2,63 (v/v), correspondente a EtOH: H2O 7:3 (v/v) ]. A proporção de material vegetal:solução extratora foi de 1:10 m/v . O material vegetal com a solução extratora foram submetidos a banho ultrassônico a 40 kHz ( Ultronique, Eco-Sonics, Brasil) durante 30 min , com substituição da água do banho cada 10 minutos para evitar possível aquecimento. O sobrenadante foi centrifugado a 7200 rpm durante 2 35 min (BioPet Technologies, global Trade, Brasil). Finalmente, o extrato hidroetanólico de razão material vegetal/solução extratora 10 mg mL-1 foi filtrado através de um microfiltro de PTFE de 0,45 µm (SimplePure - Allcrom, Brasil). Com exceção da avaliação da precisão intermediária, 20 µL foram injetados no sistema CLAE em todas as etapas deste trabalho. A figura 2 é representativa do processo de extração. Figura 2: Maceração dinâmica das folhas de Eugenia uniflora em solução hidroalcoólica de EtOH/H2O 7:3 (v/v) Fonte: Fotografado pelo autor 1.3.4 Instrumentação e análises CLAE As análises cromatográficas foram realizadas em um sistema CLAE (Jasco, Japão, Fig. 3) com detector por arranjo de diodos (modelo MD-2010 plus), injetor automático (modelo AS-2055 plus) , bomba quaternária (modelo PU-2089 plus) e forno de coluna (modelo CO-2060 plus), bem como pré- aquecedor de 2 μL (Thermo Fischer Scientific, EUA) posicionado no forno de coluna e 36 acoplado à pré-coluna (4x3 mm, 5 µm; Phenomenex, EUA). Para a separação dos metabólitos, duas colunas de fases ligadas diferentes mas de mesma dimensão foram testadas: XSelect (fase ligada fenil-hexil), e XBridge (C18 polimérica) ambas com 150 × 4,6 mm, d.i. 5 μm (Waters, EUA). A aquisição e processamento de dados cromatográficos e espectrais foram realizados com o emprego do software ChromNAV (Jasco, Japão). Os experimentos foram monitorados a λ=270 nm. Sinais com área mínima de 100 mV·s (Fig. 4) foram considerados picos, uma vez que este valor é ligeiramente maior do que as áreas de algumas impurezas residuais da produção e armazenamento de bioetanol (etanol grau alimentício) identificadas no branco e porque este valor permitiu que espectros de UV fossem registrados para os compostos de interesse. Figura 3: Sistema CLAE empregado em todas as etapas do presente trabalho (Jasco, Japão) Fonte: Fotografado pelo autor O método estatisticamente otimizado empregou como fases móveis um sistema binário composto por H2O + 1% AcOH (v/v, A) e EtOH 95°GL (B). O equilíbrio da coluna foi atingido com 5,26% de B em 25 min em vazão de 1 mL min -1 (eluição isocrática com 10 volumes, considerando as recomendações do fabricante da coluna), seguido por gradiente linear de 5,26 - 52,63 % de B em 30 minutos, com vazão de 0,6 mL min -1 e 35°C de temperatura do forno da coluna. Antes de cada experimento, a coluna foi equilibrada com a porcentagem inicial de B do gradiente linear seguinte. Após cada corrida cromatográfica realizada neste trabalho, as colunas analíticas foram lavadas com um mínimo de 6 mL de B para que as corridas subsequentes não fossem afetadas por compostos menos polares eventualmente retidos na fase estacionária. Para posterior comparação em termos de separação e impacto ambiental, reproduziu-se com precisão em nosso laboratório o trabalho de 37 Assunção et al. (2017), um método reportado anteriormente na literatura para fingerprinting metabólico das folhas de E. uniflora e usado como trabalho de referência. Esse experimento em específico foi realizado a 25°C (temperatura ambiente, uma vez que a temperatura do forno da coluna no trabalho original não foi relatada) e usando uma coluna analítica C18 apropriada (Synergi Hydro-RP, 250 x 4,6 mm; 4 µm, Phenomenex, EUA). Figura 4: Método de integração de picos cromatográficos no software Chromnav (Jasco, Japão) 1.3.5 Triagem e otimização: Metodologia de Superfície de Resposta (RSM) Inicialmente, experimentos preliminares foram realizados para verificar a viabilidade do emprego de EtOH grau alimentício como componente do sistema solvente na fase móvel (em comparação com solventes de maior pureza, como EtOH HPLC) e para estabelecer os níveis de planejamentos experimentais subsequentes com base nos tempos de retenção do primeiro e último picos eluídos. Em seguida, a primeira etapa da investigação foi avaliar a relevância estatística de cinco variáveis cromatográficas por meio de um Planejamento Fatorial Fracionário 2v 5-1 , as quais são X1 (Porcentagem inicial de EtOH 95° GL), X2 (porcentagem final da EtOH 95° GL), X3 (Temperatura, °C), X4 (porcentagem de AcOH em A, v/v) e X5 (vazão da fase móvel, mL min-1) Após isso, os fatores importantes foram estudados com mais precisão (com níveis mais experimentais) por meio de um Planejamento Composto Central de Três Fatores (CCD), com o objetivo de estimar modelos de regressão que descrevessem 38 matematicamente as respostas investigadas em função das variáveis cromatográficas relevantes e, juntamente com uma superfície de resposta, possibilitassem encontrar uma condição empírica ideal (BARROS NETO, SCARMÍNIO, BRUNS, 2010; MYERS, MONTGOMERY, COOK, 2016; MONTGOMERY, 2017; PEREIRA-FILHO, 2015). O Planejamento Composto Central , por meio do método dos mínimos quadrados, permitiu inicialmente ajustar os dados a uma equação polinomial de segunda ordem, representada pela Eq. 1: 𝑌 = 𝑏0 + ∑ 𝑏𝑖𝑋𝑖 𝑛 𝑖=1 + ∑ 𝑏𝑖𝑖𝑋𝑖 2𝑛 𝑖=1 + ∑ ∑ 𝑏𝑖𝑗𝑋𝑖 𝑛 𝑗=𝑖+1 𝑋𝑗 𝑛−1 𝑖=1 (1) onde Y é a resposta prevista, b0 é o intercepto, bi é um coeficiente linear, bii é um coeficiente quadrático, bij é um coeficiente de interação e Xi e Xj estão relacionadas às variáveis independentes avaliadas e seus valores codificados (BARROS NETO, SCARMÍNIO, BRUNS, 2010; MYERS, MONTGOMERY, COOK, 2016; MONTGOMERY, 2017; PEREIRA-FILHO, 2015) . Após essa etapa, os termos não significativos foram eliminados e o modelo polinomial foi recalculado. Os experimentos foram conduzidos aleatoriamente visando evitar a inserção de erros sistemáticos nos resultados que tangem à otimização. Duas respostas que se encaixam nos objetivos ambientalmente amigáveis do trabalho foram estudadas. A primeira é a Green Chromatographic Fingerprinting Response (GCFR; FUNARI et al., 2014a) empregada com modificações, sendo denominada neste trabalho apenas como Green Chromatographic Fingerprinting (GCF , Eq. 2): 𝐺𝐶𝐹 = 𝑛2(𝐹𝑃 𝑀𝑃⁄ )(𝑛 𝑡𝑟𝑙⁄ ) (2) Onde o termo n é a quantidade total de picos do cromatograma, e trl, neste trabalho, é o tempo de retenção do último pico cromatográfico eluído - ao invés do tempo total da análise (t), conforme empregado na versão original da resposta (FUNARI et al., 2014a). FP e MP são o número de picos nas metades 39 do cromatograma com menos e mais picos, respectivamente (descontando o tempo morto t0 e considerando o comprimento do cromatograma de t0 a trl), e sua proporção indica o quão uniforme é a distribuição dos picos ao longo do cromatograma. Quanto maior o score GCF, maior a otimização cromatográfica global (de modo análogo à resposta original GCFR), em termos de qualidade de separação (FUNARI et al., 2014a). Apenas os picos de interesse (polaridade alta e média) detectados até 30 min foram considerados para o cálculo dos scores de GCF. O impacto ambiental dos experimentos individuais foi avaliado pela métrica HPLC-Environmental Assessment Tool (GABER et al., 2011, HPLC-EAT, Eq. 3), o melhor indicador disponível na literatura para medir com precisão o impacto dos métodos em CLAE considerando que o mesmo possibilita uma comparação robusta entre vários métodos cromatográficos. Tal métrica foi empregada para (1) quantificar o impacto ambiental global promovido pelas corridas cromatográficas realizadas no Planejamento Fatorial Fracionário e Planejamento Composto Central visando ranqueá-los em termos de sustentabilidade e (2) quantificar o impacto do método desenvolvido, em comparação com um método de referência também com fins de impressão digital cromatográfica. 𝐻𝑃𝐿𝐶 − 𝐸𝐴𝑇 = 𝑆1𝑚1 + 𝐻1𝑚1 + 𝐸1𝑚1 + 𝑆2𝑚2 + 𝐻2𝑚2 + 𝐸2𝑚2 + . . . + 𝑆𝑛𝑚𝑛 + 𝐻𝑛𝑚𝑛 + 𝐻𝑛𝑚𝑛 (3) Os termos S, H e E são parâmetros de segurança, saúde e meio ambiente, respectivamente, baseados em informações sobre os produtos químicos empregados nos experimentos oriundos de bancos de dados específicos. Tais termos são multiplicados pela massa m de cada um dos n solventes utilizados numa dada análise cromatográfica. Quanto menor for a pontuação HPLC-EAT, menor será o impacto ambiental do método cromatográfico. Neste trabalho, o score calculado considerou o condicionamento das colunas antes de cada gradiente, realizado empregando-se no modo isocrático a porcentagem inicial de solvente orgânico empregado no gradiente seguinte. Informações detalhadas sobre essas métricas são fornecidas por seus autores (GABER et al., 2011). 40 Inicialmente, para a escolha da melhor coluna analítica em termos de separação e seletividade, realizou-se um Planejamento Fatorial Fracionário. Nesta etapa, apenas a resposta GCF foi considerada para comparações entre o desempenho cromatográfico das colunas testadas, uma vez que os scores HPLC-EAT eram idênticos para ambas as colunas XBridge e XSelect (visto que os mesmos experimentos foram realizadas para ambas, em condições exatamente iguais). Depois de escolher a melhor coluna, considerando que o score HPLC-EAT em si não permite medir a separação cromatográfica e, de modo similar, GCF isoladamente não permite quantificar parâmetros de segurança, de saúde e de impacto ambiental, para análise simultânea e otimização de ambas as respostas foram empregadas funções de desejabilidade (DERRINGER e SUICH, 1980) para determinar inicialmente as variáveis importantes na etapa de triagem e para otimizar o fingerprinting metabólico com um Planejamento Composto Central. A partir de tal abordagem, valores de desejabilidade individuais (di) para cada uma das duas respostas estudadas apresentam valores entre 0 e 1, o que sugere condições de trabalho totalmente indesejáveis e desejáveis, respectivamente. Os valores de desejabilidade individuais para GCF (para o qual é importante obter pontuações altas) foram estimados com a Eq. 4 (DERRINGER e SUICH , 1980; PEREIRA-FILHO, 2015; NUNES et al., 2019): 𝑑(𝐺𝐶𝐹) = ( 𝑦−𝐿 𝑇−𝐿 ) 𝑠 𝑠𝑒 𝐿 ≤ 𝑦 ≤ 𝑇 (4) Onde d (GCF) é a desejabilidade individual para a resposta GCF, y é o valor da resposta, T é o valor alvo para GCF (ou, em nosso caso, o maior valor obtido em cada design experimental individual) e L é o menor valor aceitável (ou, no nosso caso, o menor valor obtido em cada design experimental; DERRINGER e SUICH , 1980; PEREIRA-FILHO, 2015; NUNES et al. , 2019). Os valores de desejabilidade individuais para a resposta de HPLC-EAT (para os quais é importante obter as pontuações mais baixas possíveis) foram calculados com a Eq. 5 (DERRINGER e SUICH , 1980; PEREIRA-FILHO, 2015; NUNES et al., 2019): 41 𝑑(𝐻𝑃𝐿𝐶−𝐸𝐴𝑇) = ( 𝑈−𝑦 𝑈−𝑇 ) 𝑠 𝑠𝑒 𝑇 ≤ 𝑦 ≤ 𝑈 (5) Onde d (HPLC-EAT) é a desejabilidade individual para a resposta HPLC-EAT, y é o valor da resposta, U é o valor mais alto aceitável para HPLC-EAT (ou, em nosso caso, o valor mais alto obtido em cada design experimental individual ) e T é o valor alvo (ou, no nosso caso, o menor valor obtido em cada planejamento experimental; DERRINGER e SUICH, 1980; PEREIRA-FILHO, 2015; NUNES et al., 2019). O coeficiente s nas Eqs. 4 e 5 permite controlar e ajustar subjetivamente a taxa de variação da função e foi estabelecido como 1 para ambas as respostas destinadas a ajustar e otimizar o método de impressão digital, considerando igualmente importantes a separação e a sustentabilidade. Os valores de desejabilidade individual para ambas as respostas foram combinados em um valor de desejabilidade global (D) por meio da média geométrica de ambos os valores de desejabilidade individuais GCF e HPLC-EAT para cada experimento, de acordo com a Eq. 6 (DERRINGER e SUICH , 1980; PEREIRA- FILHO, 2015; NUNES et al., 2019): 𝐷 = √𝑑(𝐺𝐶𝐹)𝑑(𝐻𝑃𝐿𝐶−𝐸𝐴𝑇) (6) D assume o valor zero se qualquer valor de desejabilidade individual assumir um valor inaceitável (DERRINGER e SUICH, 1980; PEREIRA-FILHO, 2015; NUNES et al., 2019). A determinação das variáveis significativas e do modelo empírico que descreve o domínio experimental estimado com o planejamento CCD em função de D em cada design experimental foi realizada no nível de confiança de 95% . Cálculos de análise de variância (ANOVA), probabilidade normal e gráficos de superfície de resposta foram realizados através dos softwares GNU Octave 4.2.1, Statistica 7 (Stat-Ease, Inc, EUA) e Excel 2013 (Microsoft, EUA). 42 1.3.6 Validação do método otimizado O método cromatográfico desenvolvido para as folhas de pitanga foi validado qualitativamente de acordo com as recomendações do International Conference for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH, 2005). Esta etapa foi realizada ao se estimar os parâmetros de precisão instrumental, repetibilidade e precisão intermediária por meio do desvio padrão relativo (DPR) para os mesmos em relação aos tempos de retenção relativos de picos superiores a 4% da área total do pico em todas as corridas cromatográficas (SOUZA et al., 2018; FUNARI et al., 2014a) em relação a um pico de referência com a maior intensidade no cromatograma (destacado com um asterisco, Fig. 10a). Além disso, a robustez do método cromatográfico também foi avaliada por meio de um Planejamento Fatorial Completo 23 com 4 pontos centrais. As variáveis testadas foram A (vazão, no intervalo de 0,59-0,61 mL min -1), B (Temperatura, no intervalo de 33-37°C) e C (% AcOH em H2O, no intervalo de 0,8-1,2%, v/v). Os nomes das variáveis foram alterados em relação a outros planejamentos empregados para otimização cromatográfica uma vez que as mesmas foram estudadas em intervalos diferentes neste caso. As respostas avaliadas também foram os tempos de retenção relativos dos picos cromatográficos superiores a 4% da área total do pico em em todos os experimentos realizados (no caso, picos 1, 2, 3, 5 e 7) em relação ao pico de referência 6, destacado com asterisco na Fig. 10a . No caso de nenhuma variável ser significativa (ou seja, as pequenas alterações não mostram influência nas respostas escolhidas), o método cromatográfico é considerado robusto (FERREIRA et al., 2017; CHRIST et al., 2014). Todas as corridas cromatográficas nesta etapa também foram realizadas em ordem aleatória. Os cálculos foram realizados a 95% de confiança. 1.3.7 Avaliação do impacto ambiental: AGREE Como alternativa à métrica HPLC-EAT, utilizou-se a métrica AGREE (Analytical GREenEss Metric, PENA-PEREIRA, WOJNOWSKI, TOBISZEWSKI, 2020) para se quantificar o impacto ambiental do método desenvolvido e para estabelecer 43 comparações com o método de referência de Assunção et al. (2017). A métrica foi selecionada porque representa o estado-da-arte na literatura e possibilita uma avaliação flexível, rápida, de fácil interpretação porém holística do impacto ambiental de processos. O critério de avaliação se baseia em critérios quantitativos baseados nos 12 princípios da Química Analítica Verde (para os quais podem ser atribuídos pesos pelo analista), os quais são transformados em uma escala que varia de 0 a 1. O resultado final é apresentado na forma de pictograma por um software livre disponibilizado no material suplementar da referência original. O pictograma indica um score final, a performance do processo em cada um dos critérios avaliados e eventuais pesos atribuídos pelo usuário (PENA-PEREIRA, WOJNOWSKI, TOBISZEWSKI, 2020). 1.3.8 Análises subsequentes por CLUE-DAD-MS As análises foram realizadas em um Cromatógrafo Líquido de Ultra-Alta Eficiência (Shimadzu Nexera UC, Kyoto, Japão), composto por um controlador (CBM 20-A), um degaseificador (DGU-20A), uma bomba ternária (Nexera X2 LC -30AD), um autoinjetor (Nexera X2 SIL-30AC), um compartimento termoestável para coluna (CTO- 20AC), um detector por arranjo de fotodiodos (SPD-M20A); quadrupolo ‘single’ com interface ESI (LC2020). O método em CLAE da subseção 1.3.4 foi transposto para CLUE-DAD-MS com o auxílio do software livre HPLC calculator v. 3.0 (GUILLARME, et al., 2008). As separações foram realizadas com uma coluna do tipo fenil-hexil de dimensões 150 x 2,10 mm, 1,7 μm (Acquity UPLC CSH, Waters, EUA). A vazão do sistema foi de 0,2 mL·min-1, a temperatura do forno foi mantida em 35 ºC (um aquecedor de pré-coluna de 0,10 mm de d.i. e 1 mL foi usado (Thermo Fisher, EUA) e o volume de injeção foi de 1 µL. A coluna foi equilibrada com 5 mL. As separações foram monitoradas a λ = 270 nm. Os espectros de massas foram obtidos durante a análise. Os espectros de massas foram obtidos nos modos de ionização positivo e negativo. As condições do espectrômetro de massa foram: fluxo de gás de nebulização, 1,5 L·min-1; fluxo de gás de secagem, 15 L·min-1; heat block temperature, 400 ° C e dissolution line temperature, 250°C. A voltagem do detector foi de 0,1 kV. O equipamento foi operado no intervalo de 100 a 1000 m/z (full-scan). 44 1.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO 1.4.1 Planejamento Fatorial Fracionário 2v 5-1: Escolha da melhor coluna cromatográfica e seleção das variáveis significativas Inicialmente, empregou-se um Planejamento Fatorial Fracionário com condições cromatográficas idênticas para cada uma das duas fases estacionárias sob comparação, i.e., XBridge (fase ligada polimérica) e XSelect (fase ligada fenil-hexil), ambas com as mesmas dimensões. Esse tipo de planejamento experimental foi selecionado considerando que o mesmo possibilita a triagem de variáveis com um número reduzido de experimentos em comparação com o Planejamento Fatorial Completo (MONTGOMERY, 2017), o que permite a economia de energia, tempo e reagentes e, portanto, exerce coerência com os princípios 7, 8 e 9 da Química Analítica Verde (GAŁUSZKA, MIGASZEWSKI, NAMIEŚNIK, 2013). Cromatogramas representativos dos experimetos realizados no Planejamento Fatorial Fracionário são apresentados na Fig. 5. De acordo com a Fig. 5, a coluna XSelect apresentou uma melhor performance de separação em quase todos os experimentos realizados (com exceção dos experimentos 3 e 14, vide Tab. 1 e Fig. 5) de acordo com os scores apresentados para a resposta GCF. Isso ocorreu porque provavelmente as unidades fenil-hexil presentes na coluna XSelect exerceram interações do tipo π-π com os aneis aromáticos dos metabólitos secundários (majoritariamente identificados como taninos hidrolisáveis e flavonoides, além dos marcadores ácido elágico e gálico, vide Seção 1.4.4), o que viabilizou retenções e/ou separações mais efetivas em relação à coluna XBridge, uma coluna de fase ligada polimérica. Dessa forma, a coluna XSelect foi selecionada para desenvolvimento e otimização do método cromatográfico para impressão digital metabólica das folhas de pitanga. 45 E x p . Fatores cromatográficos (variáveis independentes) Fases estacionárias X1 a X2 a X3 a X4 a X5 a,b XSelect (fenil-hexil) XBridge (polimérica) GCFc HPLC-EATd De GCFc Eq. Gr. Total 1 -1 (5,26%) -1 (52,63%) -1 (35°C) -1 (0%) +1 (1,0) 113,06 2,51 16,59 19,10 0,60 46,29 2 +1 (21,05%) -1 (52,63%) -1 (35°C) -1 (0%) -1 (0.6) 82,48 10,05 12,67 22,72 0,46 17,56 3 -1 (5,26%) +1 (100%) -1 (35°C) -1 (0%) -1 (0,6) 97,72 2,51 18,09 20,61 0,53 165,29 4 +1 (21,05%) +1 (100%) -1 (35°C) -1 (0%) +1 (1,0) 154,69 10,05 34,68 44,73 0,00 15,52 5 -1 (5,26%) -1 (52,63%) +1 (80°C) -1 (0%) -1 (0,6) 101,35 2,51 9,95 12,46 0,63 9,59 6 +1 (21,05%) -1 (52,63%) +1 (80°C) -1 (0%) +1 (1,0) 30,68 10,05 21,11 31,16 0,19 16,67 7 -1 (5,26%) +1 (100%) +1 (80°C) -1 (0%) +1 (1,0) 109,33 2,51 30,16 32,67 0,40 7,19 8 +1 (21,05%) +1 (100%) +1 (80°C) -1 (0%) -1 (0,6) 23,82 10,05 20,81 30,86 0,16 11,24 9 -1 (5,26%) -1 (52,63%) -1 (35°C) +1 (1%) -1 (0,6) 239,84 2,51 9,95 12,46 1,00 85,68 10 +1(21.05%) -1 (52.63%) -1 (35°C) +1 (1%) +1 (1,0) 58,96 10,05 21,11 31,16 0,30 8,96 11 -1 (5.26%) +1 (100%) -1 (35°C) +1 (1%) +1 (1,0) 158,35 2,51 30,16 32,67 0,49 94,70 12 +1(21.05%) +1 (100%) -1 (35°C) +1 (1%) -1 (0,6) 92,11 10,05 20,81 30,86 0,39 4,95 13 -1 (5,26%) -1 (52,63%) +1 (80°C) +1 (1%) +1 (1,0) 42,10 2,51 16,59 19,10 0,33 0,00 14 +1 (21,05%) -1 (52,63%) +1 (80°C) +1 (1%) -1 (0,6) 10,93 10,05 12,67 22,72 0,00 12,13 15 -1 (5,26%) +1 (100%) +1 (80°C) +1 (1%) -1 (0,6) 38,64 2,51 18,09 20,61 0,30 13,73 16 +1 (21,05%) +1 (100%) +1 (80°C) +1 (1%) +1 (1,0) 29,94 10,05 34,68 44,73 0,00 2,24 PCf 0 (13,16%) 0 (76,32%) 0 (57,5°C) 0 (0,5%) 0 (0,8) 84,12 ± 36,16 6,28 20,51 26,79 0,41 ±0,10 4,44 ±0,65 Tabela 1: Valores codificados (e reais) das variáveis estudadas seguidas pelas respectivas respostas no Planejamento Fatorial Fracionário 2v 5-1 a X1 (% inicial de B); X2 (% final de B); X3 (Temperatura, °C); X4 (% AcOH em A, v/v); X5 (Vazão, mL min-1).b 5=1234. c Green Chromatographic Fingerprinting (GCF), uma versão otimizada da função Green Chromatographic Fingerprinting Response (GCFR, Funari et al., 2014a), empregada com modificações. d Scores foramcalculadas considerando o equilíbrio das colunas empregando eluição isocrática com 10 volumes (no caso, 25 min de corrida na qual X1 do gradiente seguinte corresponde à porcentagem de B, e vazão de 1 mL min-1), como recomendado pelos fabricantes (score do equilíbrio, eq.), e gradientes lineares com tempo de 30 minutos (score do gradiente, gr.). Score total correspondente à soma dos scores do gradiente e do equilíbrio . Massa do EtOH calculada considerando a massa específica (ρ) a 25° C (0,785 g cm-3; LIDE,2006) e com valores ajustados (valores reais de multiplicados pelo fator de correção de 0,95 visto que B possui pureza 95° GL) e Desejabilidade global envolvendo os valores de desejabilidade individuais (baseados nos maiores e menores valores do design experimental) para GCF e so score (total) de HPLC-EAT para a coluna Xselect. f Pontos centrais. Resultados apresentados como média ± desvio padrão (n=3). 46 Figura 5: Experimentos realizados no Planejamento Fatorial Fracionário 2v 5-1 para as colunas XBridge (cromatogramas em verde) e XSelect (cromatogramas em vermelho). Pontos centrais não foram representados;realizados apenas para mensuração do erro 47 As variáveis mais estatisticamente significativas no que se refere à desejabilidade global envolvendo os scores para GCF e HPLC-EAT foram X1, X2 e X3 a 95% de confiança e conforme indicado em um gráfico de probabilidade normal (Fig. 6). Embora uma interação entre X3 e X4 tenha sido significativa de acordo com resultados da Análise de Variância (ANOVA), o contraste principal relativo à X4 não apresentou relevância; portanto, tal interação não foi indicada na Figura 6. X5 também não foi significativa; apesar de próxima de ser relevante, tal contraste pode assumir o valor zero considerando seu intervalo de confiança. Portanto, os fatores X4 e X5, não significativos, foram fixados nos níveis -1, i.e., 0% de ácido acético (AcOH) em A (v/v) and 0,6 mL min-1 de vazão, respectivamente (fixadas nos menores valores experimentais uma vez que ambas as variáveis supracitadas apresentaram contrastes negativos). Essa escolha reduz o gasto de reagentes e aplica o princípio 7 da Química Analítica Verde (GAŁUSZKA, MIGASZEWSKI, NAMIEŚNIK,2013). Figura 6: Gráfico probabilidade normal com contrastes (principais) significativos representados Um modelo polinomial preliminar foi estimado com os termos significativos elucidados a partir do Planejamento Fatorial Fracionário, e cálculos na ANOVA indicaram que o modelo possui um R2 (coeficiente de determinação) de 0,81. No entanto, esse tipo de planejamento apresenta um número reduzido de níveis experimentais e não torna possível a estimativa da eventual curvatura (quadrática) na 48 superfície de resposta obtida para tal modelo. Assim, o planejamento utilizado foi uma etapa inicial da investigação, empregada apenas para escolha da melhor coluna e identificação das variáveis significativas. 1.4.2 Otimização: Planejamento Composto Central (CCD) Após a identificação das variáveis mais significativas, um Planejamento Composto Central (Tab. 2) foi empregada para otimização global das condições cromatográficas. A partir dos experimentos do CCD, foi possível estimar modelos matemáticos que correlacionaram as variáveis independentes com a função de desejabilidade global (D) envolvendo os scores para GCF e HPLC-EAT (total). Inicialmente, um modelo preliminar considerando todos os termos possíveis de serem calculados foi estimado, a 95% de confiança. Após tal etapa, considerando que apenas os coeficientes b0 (intercepto), b1, b2 e b3 (coeficientes lineares) foram significativos, o modelo foi recalculado com a eliminação dos termos não relevantes, e o modelo resultante, a 95% de confiança (e envolvendo os valores para D sem aproximação das casas decimais) está representado pela Eq. 7. Cromatogramas representativos das condições cromatográficas exploradas no Planejamento Composto Central estão indicadas nas figuras 7 e 8. 𝐷 = 0.397(±0.073) − 0.223(±0.086)𝑋1 − 0.182(±0.086)𝑋2 − 0.101(±0.086)𝑋3 (7) De acordo com a Análise de Variância (ANOVA, Tab. 3) O modelo recalculado apresenta um R2 (coeficiente de determinação) de 0,79. Além disso , Testes F indicaram que a regressão é significativa, considerando que o valor de F experimental (MQR/MQr) de 18,95 é quase 6 vezes maior que o valor de F tabelado (F3,15,95%), correspondente a 3,29. O modelo não apresentou falta de ajuste uma vez que o valor de F calculado (MQFAj/MQEp) de 4,99 é menor que o valor de F tabelado (F11,4,95%) de 5,94. Isso sugere que o modelo pode ser empregado para realizar previsões da condição ótima. 49 Tabela 2: Valores codificados (e reais) das variáveis restudadas seguidas pelas respectivas respostas no Planejamento Composto Central (CCD) E x p . Fatores cromatográficos (variáveis independentes) Respostas X1 a X2 a X3 a,b GCFc HPLC-EATd De Equilíbrio Gradiente Total 1 -1 (8,46%) -1 (62,23%) -1 (42,09°C) 101,39 4,04 12,15 16,19 0,97 2 +1 (17,85%) -1 (62,23%) -1 (42,09°C) 51,76 8,52 13,76 22,29 0,44 3 -1 (8,46%) +1 (90,40%) -1 (42,09°C) 57,89 4,04 16,99 21,03 0,53 4 +1 (17,85%) +1 (90,40%) -1 (42,09°C) 84,14 8,52 18,61 27,13 0,00 5 -1 (8,46%) -1 (62,23%) +1 (62,91°C) 106,30 4,04 12,15 16,19 1,00 6 +1 (17,85%) -1 (62,23%) +1 (62,91°C) 9,76 8,52 13,76 22,29 0,07 7 -1 (8,46%) +1 (90,40%) +1 (62,91°C) 25,50 4,04 16,99 21,03 0,31 8 +1 (17,85%) +1 (90,40%) +1 (62,91°C) 21,63 8,52 18,61 27,13 0,00 9 -αf (5,26%) 0 (76,32%) 0 (52,5°C) 27,97 2,51 14,02 16,54 0,44 10 +αf (21,05%) 0 (76,32%) 0 (52,5°C) 8,80 10,05 16,74 26,79 0,00 11 0(13,16%) -αf (52,63%) 0 (52,5°C) 56,93 6,28 11,31 17,59 0,66 12 0(13,16%) +αf (100%) 0 (52,5°C) 27,25 6,28 19,45 25,73 0,16 13 0(13,16%) 0 (76,32%) -αf (35°C) 72,56 6,28 15,38 21,66 0,57 14 0(13,16%) 0 (76,32%) +αf (70°C) 10,28 6,28 15,38 21,66 0,09 PCf 0 (13,16%) 0 (76,32%) 0 (52,5°C) 51,34 ± 14,00 6,28 15,38 21,66 0,46±0,08 a X1 (% inicial de B); X2 ( % final de B); X3 (Temperatura, °C). b Nível máximo estudado para X3 reduzido para 70° C (vide experimento 14) em relação ao Planejamento Fatorial Fracionário (Tab.1) c Green Chromatographic Fingerprinting (GCF), uma versão otimizada da função Green Chromatographic Fingerprinting Response (GCFR, Funari et al., 2014a), empregada com modificações. dScores foramcalculadas considerando o equilíbrio das colunas empregando eluição isocrática com 10 volumes (no caso, 25 min de corrida na qual X1 do gradiente seguinte corresponde à porcentagem de B, e vazão de 1 mL min-1), como recomendado pelos fabricantes (score do equilíbrio, eq.), e gradientes lineares com tempo de 30 minutos (score do gradiente, gr.). Score total correspondente à soma dos scores do gradiente e do equilíbrio . Massa do EtOH calculada considerando a massa específica (ρ) a 25° C (0,785 g cm-3; LIDE,2006) e com valores ajustados (valores reais de multiplicados pelo fator de correção de 0,95 visto que B possui pureza 95° GL) e Desejabilidade global envolvendo os valores de desejabilidade individuais (baseados nos maiores e menores valores do design experimental) para GCF e so score (total) de HPLC-EAT para a coluna Xselect. f Pontos centrais. Resultados apresentados como média ± desvio padrão (n=5). 50 Figura 7: Cromatogramas dos experimentos 1 a 8 do Planejamento Composto Central (CCD) 51 Figura 8: Cromatogramas dos experimentos 9 a 14 do Planejamento Composto Central (CCD). Pontos centrais otimidos; realizados apenas para o cálculo dos erros 52 Tabela 3: Análise de Variância (ANOVA) para o modelo estimado (Eq. 7) através do Planejamento Composto Central (CCD) correlacionando os termos significativos com a Desejabilidade Global (D) Tabela ANOVA Testes F (95% de confiança) Fonte de variação GL MQ Fcalculado Ftabelado SQR 1,27 3 0,42 18,95 3,29 SQr 0,33 15 0,02 SQT 1,60 18 R2 0,79 EP 0,02 4 0,01 4,99 5,94 FAj 0,31 11 0,03 SQR, Soma Quadrática de Regressão; SQr, Soma Quadrática dos Resíduos; SQT, Soma Quadrática Total; R2, Coeficiente de Determinação; EP, Erro Puro; FAj, Falta de Ajuste; GL, Graus de Liberdade; MQ, Média Quadrática (com resultado aproximados com duas casas decimais) Superfícies de resposta foram plotadas a partir do modelo estimado e estão indicadas na Fig.9a-c. Os gráficos e a Equação 7 previram uma condição cromatográfica otimizada com X1, X2 e X3 nos menores níveis experimentais (ou, considerando os experimentos originais do CCD, o valor codificado de -1,68179 para essas variáveis, o que corresponde aos valores reais de 5,26% B para X1, 52,63% para X2 e 35°C para X3). Essa condição teoricamente forneceria o valor de 1,25 para o ótimo global da desejabilidade (D), obtido pela substituição do respectivo valor codificado para cada variável ou termo relevante no modelo recalculado (Eq. 7). 53 Figura 9: Superfícies de resposta para o modelo multivariado (Eq. 7) estimado pelo Planejamento Composto Central (CCD). (a) Desejabilidade Global (D) versus % inicial de EtOH (X1), % final de EtOH (X2), variável fixada: Temperatura (X3, °C,-1,68179 ou 35°C); (b) Desejabilidade Global (D) versus % inicial de EtOH (X1), Temperatura (X3, °C), variável fixada: % final de EtOH (X2, -1,68179 ou 52,63%); (c) Desejabilidade Global (D) versus % final de EtOH (X2), Temperatura (X3, °C), variável fixada: % inicial de EtOH (X1, -1,68179 ou 5,26%) 54 Essa condição cromatográfica (5,26-52,63% B em 30 min, a 35°C, 0% AcOH em A (v/v) e 0,6 mL min-1) inicialmente foi testada. Porém, notou-se que a ausência de ácido acetico na fase móvel reduziu a resolução dos picos. Então, uma vez que a variável X4 não foi significativa (no que se refere ao contraste principal, de primeira ordem), foi empregado um método empírico, de modo que a condição ótima supracitada foi testada porém com 1% AcOH na fase