UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA CAMPUS DE ARARAQUARA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA Estudo e desenvolvimento de sensores biomiméticos baseados em materiais carbonáceos modificados com ftalocianinacobalto (II) para detecção amperométrica de metribuzin EDUARDO CARNEIRO FIGUEIRA Dissertação de Mestrado 2012 EDUARDO CARNEIRO FIGUEIRA Estudo e desenvolvimento de sensores biomiméticos baseados em materiais carbonáceos modificados com ftalocianinacobalto (II) para detecção amperométrica de metribuzin Dissertação apresentada ao Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista, como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Química. Orientadora: Profa. Dra. Maria Del Pilar Taboada Sotomayor Araraquara 2012 FICHA CATALOGRÁFICA Figueira, Eduardo Carneiro F475e Estudo e desenvolvimento de sensores biomiméticos baseados em materiais carbonáceos modificados com ftalocianinacobalto (II) para detecção amperométrica de metribuzin / Eduardo Carneiro Figueira. – Araraquara : [s.n], 2012 91 f. : il. Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Química Orientador: Maria Del Pilar Taboada Sotomayor 1. Química analítica. 2. Sensores biomiméticos. 3. Eletrodos modificados. I. Título. Elaboração: Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação do Instituto de Química de Araraquara Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação DADOS CURRICULARES 1. DADOS PESSOAIS Nome: Eduardo Carneiro Figueira Nascimento: 01/02/1983 Nacionalidade: Brasileiro Naturalidade: Araraquara-SP Estado Civil: Casado Filiação: Felisberto Dias Figueira e Maria Aparecida Carneiro Figueira Endereço: Avenida José Nogueira Neves, 375, Bairro Vila Melhado, CEP: 14807-034, Araraquara/SP. 2. FORMAÇÃO ACADÊMICA 2.1 Graduação: Licenciatura em Química - Instituto de Química da UNESP- Araraquara. Período: 03/2005 a 12/2009 2.2 Pós-graduação: Mestrado em Química - Instituto de Química da UNESP-Araraquara. Período: 03/2010 a 03/2012 3. TRABALHOS APRESENTADOS EM EVENTOS CIENTÍFICOS - Figueira, E. C.; Wong, A.; Silva, A. C. M.; Silva, B. V. M.; Dutra, R. F.; Sotomayor, M. D. P. T.; Sensor amperométrico descartável à base de grafite modificado com CoPc para a detecção de metribuzin. 16ª Encontro Nacional de Química Analítica, Campo de Jordão, outubro de 2011. Apresentação oral. - Figueira, E. C.; Sotomayor, M. D. P. T.; “Desenvolvimento de Sistemas Biomiméticos para Análise do Agrotóxico Metribuzim”. XVIII – Simpósio Brasileiro de eletroquímica e eletroanalítica, Bento Gonçalves, Agosto de 2011 - Figueira, E. C.; Gomes, N.; Rocha, C. V.; Damasceno, I. Z.; Schiavetto, M.G.; Maruyama, J. A. Silva DA, C. S., Oliveira, O. M. M. F., Oliveira DE, L. A. A. Dissolução de cloreto de sódio em água: transposição do nível macroscópico para o microscópico. 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, maio de 2007. - Figueira, E. C.; Maruyama, J. A.; Silva DA, C. S.; Marques, R. N.; Oliveira, O. M. M. F.; Oliveira DE, L. A. A. Centro de ciências de Araraquara: uma importante relação na formação de mediadores e na formação inicial de professores de Química. XIII Encontro Nacional de Ensino de Química, Campinas, julho de 2006. 4. PARTICIPAÇÕES EM EVENTOS � XXXX Semana da Química, realizada no IQ/CAr, 2010. � V Evento de Educação em Química, realizada no IQ/CAr, 2007. � 30ª Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia/SP, maio de 2007 � XIII Encontro Nacional de Ensino de Química, Campinas/SP, 2006. � IV Evento de Educação em Química, realizada no IQ/CAr, 2006. � III Evento de Educação em Química, realizada no IQ/CAr, 2005. Eu Dedico este trabalho... Primeiramente a Deus por me amar incondicionalmente e por todas as bênçãos. Aos meus pais, que sempre me incentivaram, apoiaram, acreditaram e encorajaram a seguir em frente. Ao amor da minha vida, que me tornou uma pessoa melhor. Aos meus irmãos, que me apoiaram e incentivaram cada um da sua maneira. Aos demais da minha família e amigos que torceram pelo meu mestrado. A minha nova família que ganhei ao casar, por todo carinho e dedicação. AGRADECIMENTOS A Deus, por sua fidelidade e infinita misericórdia. A minha família, que sempre me incentivou, apoiou e acreditou em mim. Amo vocês! A minha esposa, pela dedicação, paciência, amizade, companheirismo, assessoria, apoio e principalmente pelo amor por mim. Amo você imensamente! A professora Maria Del Pilar, por ser uma mãe cientifica presente, compreensiva e amiga. Aos amigos de laboratório André, Ademar e Maricely, pela amizade e ajuda durante o trabalho. A professora Dra. Rosa Fireman Dutra e ao seu grupo de pesquisa, pela colaboração na confecção dos eletrodos impressos. A CAPES, pela bolsa concedida e ao CNPq (470419/2009-1) e à FAPESP (2011/12296-6) pelos auxílios financeiros recebidos para o desenvolvimento deste trabalho. Ao grupo de eletroanalítica, pela ajuda. A todos os funcionários do IQ. A todos, muito obrigado.. Eu poderia falar todas as línguas que são faladas na terra e até no céu, mas se não tivesse amor, as minhas palavras seriam como o som de um gongo ou como o barulho de um sino. Poderia ter o dom de anunciar mensagens de Deus, ter todo o conhecimento, entender todos os segredos e ter tanta fé, que eu poderia tirar as montanhas do seu lugar, mas, se não tivesse amor, eu nada seria. Poderia dar tudo que tenho e até mesmo entregar meu corpo para ser queimado, mas se eu não tivesse amor, isso não me adiantaria nada. 1 Coríntios 13,1-3 viii RESUMO O presente trabalho está baseado na construção de sensores biomiméticos para monitoramento sensível e seletivo do agrotóxico metribuzin (MTZ). Para isto, eletrodos à base de pasta de carbono e nanotubos de carbono foram modificados com diversos complexos potenciais catalisadores biomiméticos das enzimas P450, que são enzimas que catalisam um grande número de reações incluindo os agrotóxicos. O complexo que apresentou perfil biomimético e melhores resultados na determinação amperométrica do metribuzin foi à ftalocianinacobalto (II) [CoPc]. Quando construídos sensores à base de pasta de carbono modificada com CoPc, os melhores resultados foram obtidos usando 15% (m/m) de complexo na preparação da pasta e realizando as medidas em tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), aplicando potencial de -690 mV vs Ag|AgCl. Sob estas condições obteve-se uma faixa linear de resposta de 2,4 x 10-5 a 2,0 x 10-4 mol L-1, com uma boa sensibilidade e LOD e LOQ de 4,3 x 10-6 e 1,4 x 10-5 mol L-1, respectivamente. Estudos relacionados a elucidar a biomimeticidade do sensor, incluíram avaliação da influência da velocidade de varredura empregando voltametria cíclica, exploração do perfil hiperbólico da resposta do sensor e estudo de interferentes e de seletividade. A seguir, foi avaliada a influencia de nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) na preparação da pasta no intuito de tentar aumentar a detectabilidade do sensor modificado com ftalocianinacobalto (II). Entretanto, os resultados obtidos não foram àqueles esperados, devido principalmente, à grande quantidade de material aglutinante (Nujol® que é isolante) necessário para a obtenção da pasta. Assim, a seguir, foi realizada a avaliação de eletrodos impressos à base de grafite, contendo MWCNT a 0,3% e CoPc a 5%, 10% e 15% (m/m). Sob as condições de análises anteriormente otimizadas para a pasta de carbono, o eletrodo impresso que proporcionou melhores resultados foi aquele preparado com 5% de CoPc, obtendo- se uma faixa linear de resposta entre 2,4 x 10-5 a 1,7 x 10-4 mol L-1 e LOD e LOQ de 5,2 x 10-6 mol L-1 e 1,7 x 10-5 mol L-1, respectivamente. Os sensores preparados usando pasta de carbono modificada e eletrodo impresso modificado com CoPc foram aplicados na análise de amostras de águas de rio, e os resultados obtidos mostraram boa eficiência do sensor desenvolvido na quantificação do metribuzin. ix Desta forma, dos resultados aqui obtidos, pode-se concluir que os sensores construídos à base de materiais carbonáceos e CoPc, oferecem ferramentas promissoras de análise para determinação do agrotóxico metribuzin. Palavras-chave: Metribuzin, sensores biomiméticos, ftalocianinacobalto (II). x ABSTRACT This work is based on the construction of biomimetic sensors for monitoring sensitive and selective pesticide metribuzin (MTZ). For this, the base electrodes of carbon paste and carbon nanotubes have been modified with various complex catalysts potential biomimetic of P450 enzymes, which are enzymes that catalyze a large number of reactions including pesticides. The complex profile that showed better results in biomimetic and amperometric determination of metribuzin was the ftalocianinacobalto (II) [CoPc]. When constructed sensors based on a modified carbon paste CoPc with the best results were obtained using 15% (m/ m) complex in the preparation of the folder and making the measurements in Britton-Robinson buffer 0,08 mol L-1 (pH 2,0), by applying potential to -690 mV vs Ag | AgCl. Under these conditions gave a linear response range of 2.4 x 10-5 to 2.0 x 10-4 mol L-1, and with good sensitivity and LOQ and LOD of 4,3 x 10-6 and 1 , 4 x 10-5 mol L-1, respectively. Related studies to elucidate the biomimeticidade sensor, included evaluation of the influence of scan rate using cyclic voltammetry, exploitation of hyperbolic profile of the sensor response and the study of interferences and selectivity. Next, we evaluated the influence of carbon nanotubes multi-walled (MWCNT) in the preparation of the folder in order to try to increase the detectability of the sensor modified with ftalocianinacobalto (II). However, the results were not those expected, mainly due to the large amount of binder material (Nujol ® which is an insulator) necessary for obtaining the paste. Thus, the following evaluation was made electrodes printed based on graphite containing MWCNT CoPc 0,3% and 5%, 10% and 15% (m / m). Under the above conditions optimized for the analysis carbon paste, the printed electrode that provided the best results was that prepared with 5% CoPc, yielding a linear response range between 2,4 x 10-5 to 1,7 x 10-4 mol L-1 and LOD and LOQ of 5,2 x 10-6 mol L-1 and 1,7 x 10-5 mol L-1, respectively. The sensors prepared using carbon paste electrode modified and printed modified with CoPc were applied in the analysis of samples of river water, and the results showed good efficiency of the sensor developed for quantifying the metribuzin. Thus, the present results, it can be concluded that the sensors constructed based carbonaceous materials and CoPc offer a promising approach to analysis for determining the pesticide metribuzin. xi Keywords: metribuzin, biomimetic sensors, ftalocianinacobalto (II). xii LISTA DE FIGURAS Figura 1: Estrutura química do metribuzin.................................................. 25 Figura 2: Esquema do transporte de elétrons no fotossistema II da fotossíntese................................................................................. 26 Figura 3: Esquema de redução do metribuzin proposta por Ludvik et al.21 27 Figura 4: Distribuição das publicações sobre métodos para a determinação de metribuzin encontradas na literatura............... 29 Figura 5: Diferentes tipos de nanotubos de carbono50............................... 35 Figura 6: Estrutura da protohemina IX (protoporfirina de ferro IX) presente no sítio ativo de todas as enzimas P450...................... 38 Figura 7: Estrutura química do complexo ftalocianinacobalto (II) [CoPc].. 39 Figura 8: Fotografia de uma localidade do rio Jacaré-Guaçu que atravessa a região do município de Araraquara, e que foi usado para coleta de amostra..................................................... 43 Figura 9: Construção do eletrodo de pasta de carbono. (A) Pasta de carbono modificada. (B) Eletrodo adequado para montagem do sensor.......................................................................................... 44 Figura 10: Esquema de construção do sensor impresso à base de grafite contendo MWCNT e 5% (m/m) de CoPc. Os sensores de 4 mm de diâmetro (área superficial de 0,071 cm2) e 15 mm de comprimento68............................................................................. 46 xiii Figura 11: Representação do sistema de análise em batelada em (A) Esquema representativo e (B) Fotografia da aparelhagem usada........................................................................................... 48 Figura 12: Voltamogramas cíclicos para eletrodo de pasta de carbono sem modificar. Branco: Solução tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 50 mV s-1.................. 50 Figura 13: Voltamogramas cíclicos para sensor à base de pasta de carbono modificada com [CoPc]. Branco: Solução tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 50 mV s-1.................................................................... 51 Figura 14: Voltamogramas cíclicos para sensor à base de [CoPc] em diferentes concentrações de metribuzin. Branco: Solução tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura de 50 mV s-1................................................................ 52 Figura 15: Voltamograma cíclico para o sensor à base de pasta de carbono modificada com [CoPc]. Branco: Solução tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 5 mV s-1...................................................................... 53 Figura 16: Voltamograma cíclico para o sensor à base de pasta de carbono modificada com [CoPc] após borbulhar por 40 minutos nitrogênio em solução. Branco: Solução tampão Britton- Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 5 mV s-1................................................................................................ 54 Figura 17: (A) Voltamograma cíclico para o sensor à base de pasta de carbono modificada com ftalocianina sem centro metálico. Branco: Solução tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 50 mV s-1. (B) Volmamograma xiv cíclico para o mesmo eletrodo em tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 5 mV s-1..................................... 55 Figura 18: Voltamogramas cíclicos para o sensor em 4,8 x 10-5 mol L-1 de metribuzin e em diversas velocidades de varredura.................. 56 Figura 19: Figura 20: Variação da corrente de pico catódico (Δi vs �1/2) no sensor à base de pasta de carbono modificada com o complexo [CoPc]. contendo 4,8 x 10-5 mol L-1 de metribuzin................................... Variação da corrente de pico catódico normalizada (Δi v-1/2) vs �. Medidas realizadas em solução tampão BR 0,08 mol L-1, pH 2,0 contendo 4,8 x 10-5 mol L-1 de metribuzin.................................................................................... 57 58 Figura 21: Perfil de resposta apresentado pelo sensor proposto em função do tipo de tampão usado como eletrólito suporte nas análises amperométricas para determinação de metribuzin. Medidas realizadas em - 690 mV vs Ag|AgCl (KClsat)................. 59 Figura 22: Perfil de resposta apresentado pelo sensor proposto em função da concentração do tampão BR. Medidas realizadas em - 690 mV vs Ag|AgCl (KClsat)................................................. 59 Figura 23: Perfil de resposta do sensor nas condições otimizadas. Amperograma típico obtido para adições sucessivas de 2,4 x 10-5 mol L-1 de metribuzin............................................................ 61 Figura 24: Curva analítica construída com os resultados obtidos na amperometria da Figura 23......................................................... 62 Figura 25: Estruturas químicas do metribuzin e dos agrotóxicos avaliados no estudo da seletividade do sensor........................................... 65 xv Figura 26: Perfil hiperbólico do sensor à base de ftalocianinacobalto (II).... 66 Figura 27: Gráfico do duplo recíproco obtido com os dados da Figura 26... 67 Figura 28: Esquema do mecanismo proposto para a resposta do sensor... 68 Figura 29: Figura 30: Variação linear do potencial de redução (Ep) vs log�. Varreduras realizadas em solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), contendo 4,8 × 10−5 mol L−1 de MTZ............................... Voltamogramas cíclicos para sensor à base de pasta de carbono modificada com 15% [CoPc] (preto) e à base de pasta de carbono modificada com MWCNT e 15% [CoPc] (azul). Medidas realizadas em solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), �: 50 mV s-1. No gráfico inserido é mostrada uma ampliação do voltamograma em preto........................................ 70 71 Figura 31: Amperograma típico obtido com o sensor à base de MWCNT para adições sucessivas de 2,4 x 10-5 mol L-1 de metribuzin no potencial de -0,690 V.................................................................. 72 Figura 32: Curva analítica obtida através do amperograma do sensor mostrado na Figura 31.............................................................. 73 Figura 33: Figura 34: Voltamogramas cíclicos para eletrodo impresso sem modificar. Branco: Solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), �: 50 mV s-1................................................................................................ Voltamogramas cíclicos para eletrodo impresso com MWCNT/CoPc a 5% (m/m). Branco: Solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), �: 50 mV s-1...................................................... 74 75 Figura 35: Curva analítica do eletrodo impresso modificado com MWCNT e [CoPc] 5% (m/m). Medidas realizadas no potencial de -0,600 V....................................................................................... 75 xvi Figura 36: Figura 37: Voltamogramas cíclicos para eletrodo impresso com MWCNT/CoPc a 10% (m/m). Branco: Solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), �: 50 mV s-1........................................................ Curva analítica do eletrodo impresso modificado com MWCNT e [CoPc] 10% (m/m). Medidas realizadas no potencial de -0,600 V........................................................................................ 76 77 Figura 38: Figura 39 Voltamogramas cíclicos para eletrodo impresso com MWCNT/CoPc a 15% (m/m). Branco: Solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), �: 50 mV s-1........................................................ Curva analítica do eletrodo impresso modificado com MWCNT e [CoPc] 15% (m/m). Medidas realizadas no potencial de -0,600 V........................................................................................ 77 78 xvii LISTA DE TABELAS Tabela 1: Complexos analisados em estudos preliminares........................... 49 Tabela 2: Parâmetros avaliados na otimização do sensor biomimético para determinação de metribuzin........................................................... 60 Tabela 3: Características analíticas mostradas pelo sensor para determinação em sistema de batelada.......................................... 63 Tabela 4: Agrotóxicos analisados no estudo da seletividade........................ 64 Tabela 5 : Comparação das sensibilidades dos eletrodos impressos modificados com MWCNT em diferentes proporções de [CoPc]... 79 Tabela 6: Resultados obtidos com a modificação do eletrodo de pasta de carbono e eletrodo impresso......................................................... 80 Tabela 7: Dados obtidos na recuperação de metribuzin em amostras de águas de rios usando o sensor à base de pasta de carbono modificada com 15% (m/m) de [CoPc]........................................... 81 Tabela 8: Dados obtidos na recuperação de metribuzin em amostras de águas de rios usando eletrodo impresso modificado com MWCNT e 5% (m/m) [CoPc].......................................................... 82 xviii LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária BR – Britton - Robinson CE – Contra Eletrodo CG – Cromatografia Gasosa CL- Cromatografia Líquida CLAE – Cromatografia Líquida de alta eficiência CoPc – Ftalocianinacobalto (II) CNT – Carbon Nanotube EC – Electrochemical/Chemical EI – Eletrodo Impresso EPA – Environmental Protection Agency EPC – Eletrodo de Pasta de Carbono EQM – Eletrodo quimicamente modificado ER – Eletrodo de Referência ET – Eletrodo de Trabalho ipc – Corrente de pico catódico IUPAC – International Union of Pure and Applied Chemistry LMR – Limite máximo de resíduos LOD – Limite de Detecção LOQ – Limite de Quantificação MIP - Molecularly Imprinted Polymers MTZ – Metribuzin MWCNT – Multi-Walled Carbon Nanotubes PARA – Programa nacional de Monitoramento de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos sat – Saturado RSD – Desvio padrão médio relativo (Relative standard deviation) SWCNT – Single Walled Carbon Nanotubes UFPE – Universidade Federal de Pernambuco VC – Voltametria Cíclica xix Lista de Símbolos i - corrente elétrica V - Volts ��- velocidade de varredura μ - micro A – ampères t – tempo ºC – graus Celsius Ω - ohm � - desvio padrão xx SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO 1.1. Considerações gerais ............................................................................... 1.2. Agrotóxicos................................................................................................ 1.3. Metribuzin.................................................................................................. 1.4. Métodos de determinação de metribuzin................................................... 1.5. Técnicas eletroanalíticas.......................................................................... 1.5.1. Voltametria Cíclica (VC).................................................................. 1.5.2. Cronoamperometria........................................................................ 1.6. Eletrodos quimicamente modificados ..................................................... 1.6.1. Eletrodo de pasta de carbono (EPC).............................................. 1.6.2. Eletrodos impressos (EI)................................................................. 1.6.3. Nanotubos de carbono.................................................................... 1.7. Sensores eletroquímicos.......................................................................... 1.7.1. Sensores amperométricos.............................................................. 1.7.1.1. Sensores biomiméticos...................................................... 2. OBJETIVOS 2.1.Objetivo geral............................................................................................ 2.2.Objetivos específicos................................................................................ 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1.Instrumentação básica.............................................................................. 3.2.Reagentes e soluções............................................................................... 3.2.1.Preparo das soluções utilizadas............................................................ 3.3. Construção dos sensores........................................................................ 3.3.1.Sensor biomimético de pasta de carbono modificada...................... 3.3.2.Sensor biomimético modificado com nanotubo e ftalocianinacobalto (II)...................................................................... 3.3.3. Sensor biomimético impresso......................................................... 3.4. Medidas eletroquímicas........................................................................... 3.4.1. Sistema de análise em batelada para determinação de metribuzin....................................................................................... 22 22 23 25 28 30 30 30 31 32 33 34 36 37 38 40 40 40 41 41 41 42 43 43 45 45 47 47 xxi 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1. Sensor à base de pasta de carbono modificada [CoPc]............................ 4.1.1. Caracterização eletroquímica do sensor através de estudos voltamétricos.................................................................................... 4.1.2. Otimização da resposta do sensor................................................. 4.1.3. Perfil de resposta do sensor........................................................... 4.1.4. Estudo da seletividade.................................................................... 4.1.5. Verificação do caráter biomimético do sensor................................. 4.1.6. Proposta de mecanismo de resposta do sensor........................... 4.2. Sensor à base de pasta de carbono modificada com nanotubo de carbono e [CoPc]................................................................................ 4.3. Sensor impresso de grafite modificado com MWCNT e [CoPc].............. 4.4. Comparação de três sensores contruídos............................................... 4.5. Aplicação do sensor biomimético na análise de amostras ambientais (rios).......................................................................................................... 5. CONCLUSÕES 6. PROPOSTA DE TRABALHOS FUTUROS REFERÊNCIAS 49 49 49 58 61 64 66 67 70 74 79 81 83 84 85 22 1. INTRODUÇÃO 1.1. CONSIDERAÇÕES GERAIS Os ecossistemas naturais caracterizam-se pela alta diversidade de espécies vegetais e por uma grande variabilidade genética dentro de cada espécie, porém têm sido alterados seguidamente pelo homem, pois este vem usufruindo os recursos naturais sem levar em consideração todo o cuidado necessário com sua reposição ou preservação e, com isso, muitos recursos hídricos se encontram em situação precária, seja pela atividade agrícola ou por outras atividades antrópicas. Diversos exemplos poderiam ser citados, mas talvez o mais evidente seja o processo de produção de alimentos. A cada dia é necessário produzir-se mais para alimentar mais pessoas. O crescimento contínuo da população mundial e, conseqüentemente, o aumento da demanda por alimentos tem impulsionado o desenvolvimento de sistemas agrícolas cada vez mais eficientes. Neste sentido, o uso de agrotóxicos para o controle de pragas durante o cultivo e após a colheita tornou-se uma ferramenta essencial para garantir o crescimento e a qualidade da produção agrícola1-4. A utilização de agrotóxicos na agricultura vem obtendo cada vez mais destaque no cenário mundial. Atualmente existem mais de 800 compostos, pertencentes à cerca de 100 classes químicas diferentes, registrados como ingredientes ativos de produtos comercializados como agrotóxicos no mundo todo4-7. Contudo, a busca incessante da produtividade tem levado o homem a cometer alguns erros e exageros no manejo das culturas e a causar impactos ambientais, muitas vezes irreversíveis. De fato, na agricultura, a irrigação e o controle de pragas e doenças são práticas imprescindíveis para se obter uma produção rentável e de boa qualidade. Entretanto, o uso dessas técnicas pelos agricultores, muitas vezes de forma indiscriminada, vem provocando danos ambientais diversos, gastos desnecessários de grandes volumes de água, insucesso no controle de inimigos das culturas e comprometimento da qualidade ambiental e dos alimentos. Para a agricultura, agrotóxicos são e continuarão a ser ferramentas valiosas no controle de pragas e doenças das plantas cultivadas, porém o seu uso deve estar associado a uma análise de custo benefício social e ambiental mais 23 preciso e realístico, para que se possam minimizar os riscos e maximizar os benefícios dessa estratégia de controle de pragas, tanto para a sociedade quanto para o meio ambiente2,8-10. Para controlar a exposição humana aos resíduos de agrotóxicos presentes nos alimentos e assegurar a saúde pública, agências reguladoras de vários países têm criado programas de monitoramento de resíduos de agrotóxicos em alimentos11,12. No Brasil, que é detentor de um grande potencial agrícola e o maior mercado consumidor de agrotóxicos do mundo13, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA) criou, em 2001, o Programa Nacional de Monitoramento de Resíduos de Agrotóxicos em Alimentos (PARA)11-14 determinando assim que o limite máximo de resíduos (LMR) permitido para o analito alvo do trabalho é de 0,1 ppm. O programa PARA tem como objetivos principais, avaliar a segurança para o consumo do alimento tratado; detectar resíduos devido ao uso impróprio do agrotóxico ou de agrotóxicos de uso não autorizado para determinada cultura; proteger a credibilidade de exportadores perante seus clientes e melhorar ações contra o uso impróprio destes produtos14. 1.2. AGROTÓXICOS Os agrotóxicos estão dentre os compostos prioritários mais investigados nos produtos agrícolas, devido ao seu amplo uso e à sua toxicidade, dessa forma existem diversas definições para agrotóxicos, mas de acordo com a EMBRAPA (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária), são produtos e agentes químicos ou biológicos cuja finalidade é alterar a composição da flora e da fauna a fim de preserva-la da ação danosa de seres vivos considerados nocivos15. Os agrotóxicos podem ser classificados de acordo com sua estrutura química (grupo funcional) e com o tipo de pragas alvo, como por exemplo: Inseticidas, quando combatem as pragas, matando-as por contato e ingestão; Fungicidas, quando agem sobre os fungos impedindo a germinação, colonização ou erradicando o patógeno dos tecidos das plantas; Herbicidas, quando agem sobre as ervas daninhas seja pré-emergência como pós- emergência; Acaricidas, quando eliminam os acarinos; Nematicidas, quando 24 eliminam os nematóides do solo; Moluscidas, quando controlam lesmas; Raticidas, quando agem sobre os ratos; Bactericidas, quando controlam as bactérias. Na escolha do agrotóxico mais adequado deve-se considerar15: a) a incidência da doença ou praga; b) a formulação do produto; c) a possibilidade de se escolher um produto menos tóxico; d) se o uso de agrotóxico não trará desequilíbrio na cultura; e) qual o intervalo mínimo entre a aplicação e a colheita; f) se o agrotóxico é recomendado para aquela praga, doença ou erva daninha; g) no caso do uso de dois produtos se estes são compatíveis. Suas funções básicas na agricultura incluem a elevação da produção com aumento da produtividade, a melhoria da qualidade dos produtos e a redução do trabalho e dos gastos com energia. Sem dúvida esses objetivos foram alcançados nas últimas décadas. No entanto, o uso indiscriminado e pouco criterioso de agrotóxico trouxe e continua trazendo problemas muito sérios para o ambiente e para a saúde humana16. Há uma enorme preocupação também com os mananciais hídricos, tanto superficiais quanto subterrâneos, que estão expostos aos agrotóxicos aplicados em áreas agrícolas e não agrícolas, pois a presença desses agrotóxicos em águas subterrâneas pode apresentar problemas com relação à qualidade da água para consumo humano, visto que a tendência é de acúmulo das concentrações desses agrotóxicos ao longo dos anos. As principais vias de contaminação por agrotóxicos são: aplicação direta na água, lixiviação do solo de áreas contaminadas, contaminação de águas subterrâneas por percolação do solo, liberação de efluentes industriais, usos domésticos e despejos de materiais de descarte17. Diante desse contexto, é inquestionável a necessidade de se desenvolver métodos analíticos eficazes e adequados para monitorar resíduos de agrotóxicos em alimentos e água, que contemplem os limites máximos de resíduos (LMR) estabelecidos pelos órgãos competentes e que possam ser adaptados a medidas confiáveis e in situ. 25 1.3. METRIBUZIN O metribuzin, (4-amino-6-terbutil-3-metiltio-1,2,4-triazina-5(4H)-ona) cuja estrutura é mostrada na Figura 1, é um herbicida pertencente ao grupo das triazinonas e possui uma classificação toxicológica entre III e IV, dependendo da formulação utilizada, ou seja, não é muito tóxico18. O herbicida puro é um cristal incolor com ponto de fusão 125,5 ºC a 126,5 ºC. A solubilidade a 20 ºC é 1,05g/L na água, 820g/kg na acetona, 220g/kg no benzeno, 850g/kg no clorofórmio e 190g/kg em etanol. Figura 1: Estrutura química do metribuzin Este herbicida é usado em pré e pós plantio em pré emergência, bem como no plantio direto para o controle de ervas daninhas em culturas de soja e em pós plantio nas culturas de batata, cana-de-açúcar, café, aspargo, mandioca, tomate e trigo18. Sua forma de ação é por meio da inibição do transporte de elétrons no fotossistema II, inibindo assim a produção de energia para a realização da fotossíntese (figura 2), além de causar um acúmulo de elétrons no ponto de inibição (proteína QB), que por sua vez promove uma peroxidação dos lipídeos 19. N N N O NH2 SCH3 (CH3)3C 1 2 4 26 Figura 2: Esquema do transporte de elétrons no fotossistema II da fotossíntese. Fonte: elaborada pelo autor. No ambiente (solo e água) o metribuzin apresenta persistência (meia-vida) de 1 a 2 meses dependendo da textura do solo e das condições climáticas. Este herbicida é moderadamente adsorvido na maioria dos solos, apresenta alta afinidade com a matéria orgânica do solo e é adsorvido com menor intensidade nas argilas. A adsorção diminui com o aumento do pH. Além disso, é lixiviável em terrenos arenosos com baixo teor de matéria orgânica, possui potencial intermediário de lixiviação em solos de textura média, e é imóvel em solos pesados (alto teor de matéria orgânica)19. Uma explicação para os processos de redução dos pesticidas contendo o anel 1,2,4-triazina (Figura 1) é muito importante, pois tais processos estão diretamente envolvidos na degradação de pesticidas desta classe. Além disso, o melhor entendimento do processo de redução é essencial para o desenvolvimento de técnicas eletroanalíticas que possibilitem a análises destes pesticidas em diversos tipos de amostras20. Neste sentido, Ludvik et al.20, realizaram um estudo mecanístico da redução eletroquímica do herbicida metribuzin em solução 30% v/v de acetonitrila/água com 27 o eletrodo de gota pendente de mercúrio, utilizando a polarografia de corrente direta, a voltametria cíclica e a eletrólise a potencial controlado. Segundo os autores, o herbicida é reduzido em duas etapas envolvendo dois elétrons cada, como mostrado na Figura 3. N N N+ SCH3 NH2 O (CH3)3C H 16 + 2e- + H+ N N N SCH3 NH2 O (CH3)3C H H 2 3 + 2e- + H+ N N N SCH3 NH2 O (CH3)3C H H H H N+ N N SCH3 NH2 O (CH3)3C H H H Figura 3: Esquema de redução do metribuzin proposta por Ludvik et al.21 Na primeira etapa, a forma protonada da ligação azometina (1,6) é reduzida à amina correspondente e posteriormente, em um potencial mais negativo, a forma protonada da ligação azometina (2,3) é reduzida. Skopalová et al.21 avaliaram também o processo redução do metribuzin em eletrodo de mercúrio, bem como o estabelecimento de um procedimento voltamétrico de análise utilizando a polarografia de corrente direta, voltametria cíclica, de pulso diferencial e coulometria a potencial controlado em soluções aquosas com pH variável. Em meio ácido, o herbicida apresentou dois picos de redução (Ep1 = -0,45 V e Ep2 = -0,7 V vs Ag|AgCl,KClsat) com características de processo irreversível. A primeira etapa de redução (-0,45 V) foi utilizada para o desenvolvimento de uma metodologia analítica baseada em redissolução adsortiva 28 com voltametria de pulso diferencial (DPAdSV: differential pulse adsorptive stripping voltammetry) que ofereceu um limite de detecção de 0,27 µg L-1. A metodologia apresentou boa reprodutibilidade (2,53% para uma solução de metribuzin igual a 2 µg L-1) e foi empregada para a análise em amostras de águas de rio, com recuperações em torno de 97%. Contudo, nenhum estudo foi realizado para avaliar a seletividade do método proposto. Por outro lado, o emprego de eletrodo gotejante de mercúrio dificulta seu uso em relação a análises in situ, on line, ou mesmo ambientalmente seguras, uma vez que é conhecida a toxicidade deste metal. Assim torna-se necessário o desenvolvimento de métodos eletroanalíticos para determinação do metribuzin com o uso de outros tipos de eletrodos sólidos como alternativas ao mercúrio, e que adicionalmente sejam de construção simples, baixo custo, e analiticamente confiáveis. 1.4. MÉTODOS DE DETERMINAÇÃO DE METRIBUZIN Realizou-se um levantamento bibliográfico em fonte de consulta eletrônica (Scifinder Scholar®) utilizando as palavras chaves: metribuzin and determination or analysis no qual foram encontradas 640 publicações sobre métodos analíticos para a determinação deste agrotóxico no período compreendido de 1971 a 2010. Na Figura 4, tem-se a distribuição dessas publicações. 29 Figura 4: Distribuição das publicações sobre métodos para a determinação de metribuzin encontradas na literatura. Na literatura são encontrados inúmeros trabalhos para determinação de metribuzin em amostras de solo e água. Os principais métodos de análise são os cromatográficos, tais como a cromatografia gasosa (CG)22-24, cromatografia líquida (CL)25, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)26, CLAE acoplada à espectrometria de massas27, além da cromatografia eletrocinética micelar28 e cromatografia líquida com detecção amperométrica29. Entretanto, metodologias baseadas em métodos eletroanalíticos ainda são escassas, principalmente devido à falta de estudos em relação à redução do metribuzin em diversos tipos de eletrodos, além do mercúrio. 19 70 -19 75 19 75 -19 80 19 80 -19 85 19 85 -19 90 19 90 -19 95 19 95 -20 00 20 00 -20 05 20 05 -20 10 0 40 80 120 160 N úm er o de p ub lic aç õe s Anos 30 1.5. TÉCNICAS ELETROANALÍTICAS 1.5.1. Voltametria cíclica (VC) A voltametria cíclica (VC) é uma técnica usada para adquirir informações qualitativas sobre os processos eletroquímicos. A eficiência desta técnica resulta na sua habilidade de fornecer rapidamente informações sobre a termodinâmica do processo redox, da cinética de reações heterogêneas de transferência de elétrons e sobre reações químicas acopladas a processos adsortivos. Esta técnica é frequentemente o primeiro experimento utilizado em um estudo eletroquímico, pois oferece rapidamente a localização do potencial redox da espécie eletroativa e avaliação conveniente do efeito do meio no processo redox. A voltametria cíclica consiste na varredura linear de potencial de um eletrodo de trabalho estacionário, utilizando uma variação de potencial de forma triangular, de maneira que a varredura se inicia em valor de potencial no qual nenhuma reação ocorre, seguindo até o potencial de inversão e retornando, geralmente ao ponto inicial30. 1.5.2. Amperometria Os cronométodos são métodos eletroanalíticos nos quais a magnitude de um sinal elétrico é medida em função do tempo. Os parâmetros elétricos medidos podem ser a corrente (como no caso da amperometria) no qual o processo é iniciado por um pulso de potencial ou potencial aplicado; ou pode ser o potencial (na cronopotenciometria), no qual o processo por sua vez é iniciado pela circulação de um fluxo de corrente no eletrodo de trabalho. A amperometria a potencial constante é a classe das medidas eletroanalíticas nas quais a corrente que flui através do eletrodo de trabalho é monitorada em função do tempo, a um potencial fixo no qual ocorre a reação redox do substrato de interesse. Em sistemas em que a espécie eletroativa encontra-se adsorvida na superfície do eletrodo, como no caso dos eletrodos quimicamente modificados, quando aplicado um potencial fixo, ocorre a redução ou a oxidação total do mediador, a corrente estabiliza eletroquimicamente a espécie (analito) a qual 31 se deseja determinar, observando-se uma variação de corrente devido ao processo catalítico. Se a corrente observada apresentar uma correlação linear com a concentração do analito, tal eletrodo modificado pode ser utilizado como sensor amperométrico31,32. E essa é a base teórica utilizada para o desenvolvimento deste trabalho. Por outro lado, métodos crono-eletroquímicos permitem o acoplamento de sensores a sistemas em fluxo, permitindo a automatização das análises, visando monitoramento on line e/ou em tempo real33. 1.6. ELETRODOS QUIMICAMENTE MODIFICADOS Na década de 70, Murray e colaboradores34 deram a denominação de eletrodo quimicamente modificado (EQM), àqueles eletrodos com espécies quimicamente ativas convenientemente imobilizadas na superfície desses dispositivos. O principal objetivo dessa modificação é alterar a reatividade e seletividade do eletrodo base, favorecendo assim, o desenvolvimento de sensores para vários fins e aplicações, desde catálise de reações orgânicas e inorgânicas35 até a transferência de elétrons em moléculas de interesse36. Para a preparação de um eletrodo quimicamente modificado (EQM), um aspecto importante é a escolha do material para o eletrodo base, sendo que este material deve apresentar características eletroquímicas apropriadas e também ser adequado para o método de imobilização selecionado. Os materiais mais utilizados para a modificação na superfície do eletrodo são ouro, platina, carbono vítreo, mercúrio na forma de filme, fibras de carbono e pasta de carbono37. No desenvolvimento de eletrodos quimicamente modificados, na busca por dispositivos altamente seletivos, é realizada a imobilização de um modificador químico ou biológico na superfície dos EQMs. Existem vários métodos de imobilização de materiais solúveis e insolúveis em eletrodos à base de materiais carbonáceos como pasta de carbono, grafite ou nanotubos de carbono, dentre os quais os mais comumente usados são a adsorção, a oclusão e a ligação covalente. 32 Brevemente, a técnica de adsorção é bastante empregada, dada sua simplicidade e eficiência em muitos casos, pois envolve a interação física do modificador e a superfície do eletrodo, sendo um processo simples e rápido, podendo ser aplicado em vários tipos de superfícies eletródicas, mas esta técnica possui a desvantagem de produzir EQM's com no máximo uma monocamada do modificador imobilizado, o que geralmente limita a faixa de resposta linear37. Por outro lado, a adsorção é um processo de equilíbrio, o que pode levar à ocorrência de dessorção do modificador para o meio durante sua utilização (conhecido como lixiviação), resultando na perda de reprodutibilidade e redução da vida útil do EQM preparado desta forma37. Na imobilização por ligação covalente, o modificador é fixado na superfície eletródica pela ligação química, oferecendo um método estável, através da manipulação da reatividade dos grupos funcionais existentes na superfície do eletrodo. É um método bastante estável em relação aos demais métodos, contudo requer maior tempo de reação, além de ser mais difícil de executar. Seu emprego é de especial interesse para a imobilização de enzimas, sendo amplamente empregado na obtenção de biossensores37,38. O método oclusão, utilizado principalmente na preparação de pastas de carbono modificadas, baseia-se na inclusão de um modificador dentro de uma matriz que servirá de suporte para a obtenção do EQM. 1.6.1. Eletrodo de pasta de carbono (EPC) Com o advento das técnicas eletroanalíticas, os sensores eletroquímicos ganharam novos espaços nas diversas áreas de pesquisas. Dessa forma, vários trabalhos vêm sendo publicados em revistas especializadas, em que os autores relatam diferentes tipos de eletrodos utilizados na quantificação de espécies eletroativas. Pode-se destacar entre eles os eletrodos de pasta de carbono (EPCs). O primeiro EPC foi desenvolvido por Adams39, com intuito de substituir o eletrodo gotejante de mercúrio. Seu objetivo era atingir potenciais mais positivos, nos quais o eletrodo de mercúrio não podia ser aplicado. Os primeiros trabalhos de 33 Adams visaram a caracterização do EPC, aplicando técnicas básicas em eletroquímica40. O emprego de sensores amperométricos à base de pasta de carbono tem demonstrado um aumento exponencial durante os últimos 40 anos, como consequência da aplicabilidade nos mais diversos meios, assim como a versatilidade na preparação da pasta, a qual pode ir desde a forma convencional pela mistura de pó de grafite e algum modificador seletivo (enzimas ou catalisadores redox), até dispositivos mais elaborados que usam polímeros molecularmente impressos (MIP)41 e nanotubos de carbono42. Pastas de carbono basicamente usam uma mistura de grafite em pó, modificador(es) e um aglutinante, que pode ser parafina43 ou óleo mineral43, e que tem a função de tornar a pasta estável em contato com soluções aquosas (eletrólito). O material aglutinante serve também para fixar a pasta ao eletrodo e preencher as cavidades entre as partículas de grafite. Uma das principais vantagens da pasta de carbono para a construção de sensores é que esses eletrodos possibilitam a modificação interna do material eletródico, diferentemente do que ocorre com os eletrodos sólidos convencionais, em que a modificação ocorre apenas na superfície. Deve-se ressaltar que quando construídos sensores à base de pasta de carbono, onde o modificador é imobilizado apenas por oclusão, o mesmo deverá ser insolúvel no eletrólito no qual serão realizadas as medidas eletroquímicas. O uso de pasta de carbono continua a ser atraente porque além da versatilidade oferecida para a preparação da pasta, esses sensores demonstram ter alta estabilidade química, elevada atividade eletrocatalítica e, baixas correntes capacitivas. 1.6.2. Eletrodos impressos (EI) A tecnologia de screen-printing, mais conhecida como silk-screen, tem sido empregada com grande sucesso na fabricação de eletrodos nesta última década. Ao mesmo tempo em que possibilita a produção em massa de eletrodos a um custo 34 extremamente baixo, é simples e pode ser praticada em qualquer laboratório, sendo apropriada para produção de eletrodos e sensores descartáveis44. O processo de confecção dos EIs é baseado na deposição de finos filmes condutores sobre substratos inertes. A impressão do filme é feita através de um molde em contato com o substrato, no qual o filme é depositado pela transferência do padrão do molde (Figura 10, página 46). Os substratos mais utilizados para confecção dos EIs são materiais de cerâmica e à base de plástico44. Os EIs podem ser facilmente modificados através da adição de materiais funcionais à tinta de impressão, tais como mediadores, moléculas biológicas, nanomateriais, etc., ou através da modificação direta da interface do sensor45. Entre as principais vantagens oferecidas pela tecnologia de EIs podem ser destacadas: a flexibilidade no design do sensor, escolha do material de impressão, portabilidade, fácil integração com circuitos eletrônicos, automação no processo, produção em massa e baixo custo46. Eletrodos impressos modificados podem ser facilmente elaborados uma vez que os inúmeros artifícios utilizados para modificação dos eletrodos de pasta de carbono também se adequam aos Eis47, fornecendo, desta forma, ferramentas altamente versáteis e promissoras para diversos tipos de aplicação. 1.6.3. Nanotubos de carbono Desde sua descoberta, em 199148, os nanotubos de carbono (CNTs) têm despertado um grande interesse de diferentes aplicações, devido às suas características próprias como propriedades eletrônicas, grande resistência mecânica e suas propriedades químicas49. Do ponto de vista estrutural, há dois tipos de CNTs que a maioria dos métodos de síntese produz: os nanotubos de carbono de parede simples (SWCNT) cuja sigla deriva do inglês Single-Walled Carbon Nanotubes, que podem ser considerados como uma única folha de grafeno enrolada sobre si mesma para formar um tubo cilíndrico e os nanotubos de carbono de parede múltipla (MWCNT), do inglês Multi-Walled Carbon Nanotubes, que compreendem um conjunto de três ou mais nanotubos concêntricos enrolados sobre si, como mostrados na Figura 5. 35 Figura 5: Diferentes tipos de nanotubos de carbono50. Entretanto, outros tipos de CNTs podem ser sintetizados devidos a variações das condições de síntese, esses CNTs são: nanotubos de carbono de paredes duplas, nanotubos de carbono alinhados, nanotubos de carbono em formato de cone, dentre outros50. Os nanotubos de carbono são usados em diferentes áreas tecnológicas, e um campo de aplicação bastante adequado é no de desenvolvimento de sensores eletroquímicos, seu uso radica principalmente no aproveitamento de suas propriedades atraentes como, grande área superficial, permitindo uma amplificação do sinal analítico; e na possibilidade de obter respostas eletrocatalíticas, a qual pode CNT – parede simples CNT – paredes duplas CNT – paredes múltiplas CNT – cone 36 ser atribuída ao fato dos CNTs possuírem um mecanismo de transporte de elétrons que pode variar desde o tipo de semicondutor até o tipo metálico50. Assim, este tipo de material se apresenta como uma alternativa adicional de modificador que pode ser aproveitada na construção de EQMs para obtenção de sensores altamente sensíveis. 1.7. SENSORES ELETROQUÍMICOS A utilização de sensores eletroquímicos para determinação de concentrações de substâncias e de outros parâmetros de interesse tem sido bastante referida na literatura científica. Desde que começaram a ser utilizados os sensores eletroquímicos têm permitido uma melhora nas execuções de análise que antes eram realizadas por métodos analíticos convencionais, diminuindo o tempo de preparação da amostra e a utilização de reagentes dispendiosos, permitindo a utilização de instrumentos analíticos de baixo custo. O fato de serem altamente sensíveis, seletivos, portáteis, de baixo custo e de simples utilização faz com que estes sensores tenham vantagens em relação à outras metodologias analíticas. Os sensores eletroquímicos oferecem numerosas aplicações em diagnósticos clínicos, monitoramento ambiental e análise alimentar, permitindo efetuar análises rápidas in situ, determinando diversas substâncias com propriedades diferentes em diferentes tipos de amostras51. Um sensor químico consiste em um elemento de transdução acoplado (intimamente ligado) a uma camada de reconhecimento química ou biológica. Esta camada interage com o analito, resultando em alterações químicas ou bioquímicas que são traduzidas pelo transdutor em sinais fisicamente mensuráveis, como geração de corrente elétrica, mudança de cor, variação de massa, etc52. A camada de reconhecimento tem um papel importante na resposta do sensor, dado que é responsável pela sua seletividade a um determinado analito ou um grupo de analitos, evitando interferências de outras substâncias53. A obtenção de informação analítica, que se pode traduzir, por exemplo, na obtenção da concentração de uma espécie ou mais, depende essencialmente da camada de reconhecimento em reconhecer a espécie de interesse, de forma seletiva. 37 Sensores eletroquímicos fazem parte de uma subclasse importante dos sensores químicos nos quais um eletrodo é utilizado como o elemento de transdução52, que dentre os vários transdutores existentes, se destaca pela sua facilidade de uso e de registro dos sinais que podem ser potenciométricos, amperométricos, voltamétricos, condutométricos e impedimétricos. Adicionalmente, deve ser considerado que as reações eletrolíticas nos sensores eletroquímicos são heterogêneas e tem lugar apenas na pequena região interfacial entre o eletrodo e a solução, região onde a distribuição de carga e concentração do analito diferem do restante da solução. 1.7.1. Sensores Amperométricos Os sensores amperométricos constituem-se em dispositivos mantidos em potencial fixo e que propiciam sinais de corrente faradáica proporcionais à concentração do analito, em função de processos eletródicos que ocorrem na interface eletrodo/solução. Adicionalmente, deve-se considerar que a corrente medida em experimentos amperométricos também possui um componente capacitivo, associado a mudanças da capacitância da dupla camada elétrica e que é função direta do potencial aplicado. O transporte de massa neste tipo de sensores ocorre preferencialmente por difusão, sendo a migração e a convecção minimizadas através de condições experimentais favoráveis. Esses dispositivos são normalmente operados por uma limitação da difusão, sendo a corrente gerada afetada pela velocidade com a qual o analito se difunde até a superfície do eletrodo31,54. Neste contexto, o uso de elementos de reconhecimento, que promovam processos catalíticos na presença do analito, permitirão a obtenção de correntes elevadas, e que ajudará a vencer a dependência da corrente obtida apenas pela quantidade de analito chegando à superfície do eletrodo através do processo difusional. 38 1.7.1.1. Sensores biomiméticos Sensores biomiméticos são uma nova estratégia experimental que tem sido usada para obter sensores amperométricos mais estáveis e duradouros, porém ainda seletivos como os biossensores enzimáticos convencionais. Estes dispositivos visam vencer as limitações dos biossensores enzimáticos tais como disponibilidade, custo e instabilidade das enzimas; assim como promover uma melhora na transferência eletrônica entre eletrodo/sítio ativo (complexo redox)/ substrato, uma vez que, nos sensores biomiméticos o “sítio ativo” encontra-se descoberto diferentemente do que acontece nas enzimas, onde o sítio ativo encontra-se rodeado pela densa camada de aminoácidos residuais55,56. Uma condição para mimetizar ou escolher uma enzima adequada para a construção de sensores biomiméticos é que a química da catálise da reação enzimática e a estrutura do sítio ativo da enzima sejam muito bem conhecidas, e neste sentido as enzimas P450, encaixam-se perfeitamente nestes requerimentos. Todas as enzimas P450 contêm um sítio ativo comum que é a protoporfirina de ferro IX (Figura 6), que é o grupo prostético encontrado em todas as enzimas citocrômio P450. O papel deste grupo hemino nas diferentes citocrômios P450, varia em função da natureza dos ligantes próximos ao grupo prostético e do substrato que será catalisado. Figura 6: Estrutura da protohemina IX (protoporfirina de ferro IX) presente no sítio ativo de todas as enzimas P450 N N COOH N N COOH Fe III 39 Compostos derivados das ftalocianinas e porfirinas de ferro, manganês e cobalto, têm sido satisfatoriamente empregados em meio aquoso na tentativa de mimetizar o sítio ativo das P450, porém somente nos últimos anos, nosso grupo de pesquisa têm desenvolvido sensores biomiméticos tomando como modelo esta enzima, resultando em sistema de análise úteis e com aplicações realmente promissoras51,57-62. Dentre os complexos que podem ser avaliados como possíveis catalisadores biomiméticos da P450, devido à semelhança com a protohemina IX, encontra-se a ftalocianinacobalto (II) [CoPc] (Figura 7), e conhecendo a potencialidade biomimética deste complexo62, a construção de sensores usando este composto redox, se torna viável para o desenvolvimento de uma técnica sensível e seletiva para determinação de metribuzin. Figura 7: Estrutura química do complexo ftalocianinacobalto (II) [CoPc] Embora seja conhecida a capacidade da CoPc para catalisar muitas reações de oxidação63-67 , ao nosso conhecimento, nenhum trabalho tem sido descrito na literatura explorando a região da redução para a detecção sensível e seletiva de algum agrotóxico, e é neste sentido que este trabalho mostra a viabilidade de uso deste complexo para a eletrocatálise redutiva do metribuzin. N N NN N N N N Co Objetivos 40 2. OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Este trabalho de mestrado visa o desenvolvimento de um sensor amperométrico à base de catalisadores biomiméticos da enzima P450, na determinação do herbicida metribuzin em amostras de interesse ambiental. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 2.2.1. Otimização dos parâmetros experimentais da metodologia desenvolvida; 2.2.2. Determinação das principais figuras de mérito da metodologia; 2.2.3. Aplicação do método para a determinação do herbicida metribuzin (MTZ) em água de rio. Parte Experimental 41 3. PARTE EXPERIMENTAL 3.1 INSTRUMENTAÇÃO BÁSICA As medidas de volume foram efetuadas com micropipetas Eppendorf® (10- 100 μL) e (100-1000 μL). A vidraria utilizada no preparo das soluções foi de grau A e as pesagens foram realizadas em balança analítica (Mettler-Toledo®) que possui calibração externa e tara automática, possibilitando pesagens rápidas e precisas. O pH das soluções tampão foi medido com pH-metro da Thermo Scientific® (Orion 3 Star pH, Benchtop – USA) empregando um eletrodo de vidro combinado. 3.2 REAGENTES E SOLUÇÕES Todos os reagentes empregados foram de grau analítico e usados tal como recebidos. Todas as soluções foram preparadas com água deionizada (resistividade ≥ 18 MΩ cm-1 a 25 ºC) obtida de um sistema de purificação Milli-Q (Direct-0,3). No desenvolvimento do trabalho foram utilizados os agrotóxicos metribuzin, clorpirifós, carbendazim, 2,4 D, carbofurano, hexazinona e diuron todos provenientes da Sigma-Aldrich®, também foram usados complexos ftalocianinacobre (II); ftalocianinacobalto (II) [CoPc]; 1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25– hexadecafluoro–29H–31H–ftalocianinacobalto; bis(piridil)ftalocianinaferrosa; ftalocianinacloradaférrica; 5,10,15,20-tetraquis-metoxifenilporfirinacobalto e 5,10,15,20-tetraquis-pentafluorofenilporfirinaferro; óleo mineral; grafite em pó e ácido bórico; todos provenientes da Sigma-Aldrich®; nanotubos de carbono de paredes múltiplas da Dropsens®; o dihidrogeno fosfato de potássio, o acetato de sódio, peróxido de hidrogênio, metanol, etanol, tetrahidrofurano, ácido sulfúrico, ácido acético e o hidróxido de sódio foram da Synth®; os tampões orgânicos tris(hidroxi-metil)aminometano (TRIS) e TRIZMA foram adquiridos da Merck®; ácido fosfórico foi adquirido pela Mallincrodt® e a acetonitrila da VETEC®. Parte Experimental 42 3.2.1 Preparo das soluções utilizadas a) Solução estoque do herbicida metribuzin: A solução estoque do analito foi preparada pela dissolução de 11 mg de metribuzin em 500 µL de acetonitrila, transferindo-se quantitativamente para balão volumétrico de 50,00 mL tendo seu volume completo com água deionizada. Obtendo uma solução de concentração de 1,0 x 10-3 mol L-1. b) Solução tampão: A solução tampão Britton-Robinson (BR) 0,08 mol L-1 foi preparada a partir do ácido acético, ácido bórico e ácido fosfórico. O valor do pH foi ajustado pela adição de uma solução de hidróxido de sódio 1,0 mol L-1. c) Solução dos possíveis compostos interferentes: Para o estudo da seletividade, uma massa adequada de cada um dos agrotóxicos avaliados foi pesada e dissolvida em 500 µL de acetonitrila, transferindo-se quantitativamente para um balão volumétrico de 50,00 mL tendo seu volume completo com água deionizada, obtendo assim a concentração padrão de 1,0 x 10-3 mol L-1 d) Obtenção e preparação das amostras ambientais (rios): As amostras de águas de três rios da região de Araraquara (Figura 8) foram coletadas e enriquecidas com metribuzin na concentração de 1,0 x 10-3 mol L-1 e a seguir analisadas pelo sensor proposto em sistema em batelada, para posterior cálculo da porcentagem de recuperação. Parte Experimental 43 Figura 8: Fotografia de uma localidade do rio Jacaré-Guaçu que atravessa a região do município de Araraquara, e que foi usado para coleta de amostra. 3.3. CONSTRUÇÃO DOS SENSORES 3.3.1 Sensor biomimético de pasta de carbono modificada Para a construção do sensor proposto e após terem sido testadas sete ftalocianinas e porfirinas metálicas, foi usado o complexo ftalocianinacobalto (II) [CoPc], na modificação da pasta de carbono, pois foi aquele que apresentou os melhores resultados. A preparação da pasta de carbono para determinação de metribuzin foi realizada misturando 85 mg de pó de grafite, 15 mg do complexo ftalocianinacobalto (II) e 1,00 mL de tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,0). O material foi cuidadosamente homogeneizado com uma espátula de aço inox, e a seguir deixado secar ao ambiente por um período de 24 horas para evaporação da fase líquida. Sobre o material seco, adicionou-se 60 μL do agente aglutinante, óleo mineral (Nujol®) para a obtenção da pasta de carbono e esta quando era usada, era armazenada a seco. Parte Experimental 44 A pasta de carbono modificada foi colocada na cavidade de um eletrodo composto de um tubo de vidro e um fio de platina incorporado nele, que está em contato com um disco de platina de 4 mm de diâmetro (0,126 cm2) e colocado à profundidade de 1 mm de uma das extremidades do tubo, deixando uma cavidade própria para a incorporação da pasta no eletrodo (Figura 9). Finalmente a superfície foi uniformizada com papel sulfite limpo, a fim de obter uma superfície homogênea. Figura 9: Construção do eletrodo de pasta de carbono. (A) Pasta de carbono modificada. (B) Eletrodo adequado para montagem do sensor. Adicionalmente, pastas de carbono não modificadas foram preparadas pela mistura de 100 mg de grafite em pó e misturados com 1,00 mL de tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,0). Após seco, foi adicionado 60 μL de Nujol®, para obtenção da pasta de carbono não modificada. Estas pastas serviram para realizar estudos comparativos. Cabe ressaltar que as pastas modificadas com os outros complexos metálicos foram preparadas de maneira análoga à pasta modificada com CoPc. (A) (B) Parte Experimental 45 3.3.2 Sensor biomimético modificado com nanotubo de carbono e ftalocianinacobalto (II) Com o intuito de melhorar a sensibilidade na detecção amperométrica do metribuzin, em relação à pasta de carbono modificada apenas com complexo, modificou-se a pasta de carbono também com nanotubos de carbono de paredes múltiplas (MWCNT) e modificador. Antes do preparo da pasta, para um melhor aproveitamento dos nanotubos de carbono, realizou-se a sua funcionalização para propiciar a abertura das pontas e defeitos na estrutura dos nanotubos, com a inserção covalente de grupos funcionais carboxilas (COOH) na superfície, aumentando a reatividade do NTC. O método de funcionalização consistiu em misturar 100 mg de nanotubos de carbono com 250 mL de uma solução concentrada sulfonítrica (3 H2SO4 : 1 HNO3). Essa mistura foi agitada por 12 h e posteriormente foi realizado o processo de lavagem dos nanotubos por filtração a vácuo, com água ultrapura e secagem na estufa a 70 ºC50. Após funcionalizar os nanotubos de carbono, com o grupo carboxila, a preparação da pasta foi realizada misturando 70 mg de MWCNT, 15 mg de grafite em pó, 15 mg do complexo ftalocianinacobalto (II) e 1,00 mL de tampão fosfato 0,1 mol L-1 (pH 7,0). O material foi cuidadosamente homogeneizado com uma espátula e a seguir deixado secar ao ambiente por um período de 24 horas para evaporação da fase líquida. Sobre o material seco, adicionou-se 150 µL de agente aglutinante, óleo mineral (Nujol®) para a formação da pasta de carbono. Observa-se que neste caso, devido à textura do CNT, a quantidade de agente aglutinante, que é também isolante, foi de 150% vezes maior, em relação á quantidade usada em 3.3.1. 3.3.3 Sensor biomimético impresso Estes sensores foram gentilmente cedidos pelo grupo de pesquisa LAPED (Laboratório de Pesquisa em Diagnósticos da UFPE) coordenado pela Profa. Dra. Rosa Fireman Dutra68 com quem se mantém uma estreita colaboração. Os eletrodos foram preparados misturando tinta de grafite, 0,3% (m/m) de MWCNT funcionalizados com grupo carboxila, e quantidades diferentes de CoPc, Parte Experimental 46 para estudos da influencia da quantidade de complexo no eletrodo. Sendo estas proporções de 5%, 10% ou 15% (m/m) de CoPc. Um esquema de preparação dos sensores impressos com área geométrica de 0,071 cm2 e 15 mm de comprimento total estão mostrados na Figura 10 a seguir: Figura 10: Esquema de construção do sensor impresso à base de grafite contendo MWCNT e 5% (m/m) de CoPc. Os sensores de 4 mm de diâmetro (área superficial de 0,071 cm2) e 15 mm de comprimento. Figura adaptada da referência68. Antes das análises foi efetuada a limpeza do eletrodo impresso empregando a técnica de voltametria cíclica, na qual, dez varreduras foram realizadas sob as seguintes condições: eletrólito de suporte KCl 0,1 mol L-1; velocidade de varredura 20 mV s-1; faixa de potencial de -0,2 V a +0,8 V. Para fins de comparação também foram testados EIs não modificados das mesmas características geométricas dos sensores impressos. 1. Impressão da tinta de carbono contendo a CoPc e os MWCNT 2. Secagem do tip em estufa a 60 oC por 20 min Molde Suporte de PET Parte Experimental 47 3.4 MEDIDAS ELETROQUÍMICAS Dentre as várias técnicas eletroanalíticas disponíveis, neste trabalho de mestrado utilizou-se a voltametria cíclica para caracterização do sensor proposto e a amperometria para efetuar as análises quantitativas do metribuzin. 3.4.1. Sistema de análise para determinação de metribuzin As medidas eletroquímicas, que foram realizadas em batelada, foram realizadas em um potenciostato da Palm-Sense®, usando uma célula eletroquímica convencional de 03 eletrodos, contendo um eletrodo de referência de Ag|AgCl(KClsat) comercial (Analion®), um fio de platina em forma de espiral como eletrodo auxiliar e o(s) eletrodo(s) de pasta de carbono e eletrodos impressos, modificados ou não, como eletrodo(s) de trabalho. Neste sistema de análise 10,00 mL de solução tampão (eletrólito) foram adicionados na cela eletroquímica e a seguir, volume conhecido de uma solução padrão de metribuzin, ou de amostra contendo o analito, era adicionado para realizar os experimentos eletroquímicos. Sendo que a corrente de redução resultante é relacionada com a concentração de analito na célula de medida. Antes da adição do analito o potenciostato era colocado em modo de espera (hold), a fim de realizar a homogeneização da solução. Após a adição do analito na célula eletroquímica a solução era agitada com ajuda de uma barra magnética acionada por um agitador. A seguir, o equipamento era colocado novamente em modo de medição (play) e a corrente gerada era registrada. A Figura 11 mostra uma representação esquemática (A) e uma fotografia do sistema de medida (B), usado neste trabalho de mestrado. Parte Experimental 48 (A) (B) Figura 11: Representação do sistema de análise em batelada em (A) Esquema representativo e (B) Fotografia da aparelhagem usada. Resultados e Discussão 49 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 SENSOR À BASE DE PASTA DE CARBONO MODIFICADA COM COMPLEXO [CoPc] 4.1.1 Caracterização eletroquímica do sensor através de estudos voltamétricos Inicialmente foram testados diversos complexos a fim de investigar qual deles apresentaria uma resposta analítica quantitativa e promissora na detecção de metribuzin. Entretanto, dos sete complexos avaliados, um sinal analítico somente foi obtido para a pasta de carbono modificada com ftalocianinacobalto (II) [CoPc] (Tabela 1), o qual já é reconhecido como catalisador biomimético da P450, em reações de eletro-oxidação62,63-67. Tabela 1: Complexos analisados em estudos preliminares Complexo analisado Sensibilidade ao analito Ftalocianinacobalto (II) SIM Ftalocianinacobre (II) n.d Bis(piridil)ftalocianinaferrosa n.d Ftalocianinacloradaférrica n.d 5,10,15,20-tetraquismetoxifenilporfirinacobalto (II) n.d 5,10,15,20-tetraquispentafluorofenilporfirinaferro (III) n.d 1,2,3,4,8,9,10,11,15,16,17,18,22,23,24,25- hexadecafluoro-29H-31H-ftalocianinacobalto (II) n.d n.d – não detectado. Resultados e Discussão 50 Para verificar se a modificação da pasta com o complexo ftalocianinacobalto (II) [CoPc], traria algum ganho em relação à pasta de carbono sem modificação na detecção de metribuzin, foram realizados estudos empregando a voltametria cíclica, cujos resultados são mostrados nas Figuras 12 e 13. Figura 12: Voltamogramas cíclicos para eletrodo de pasta de carbono sem modificar. Branco: Solução tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 50 mV s-1. Pode ser observado que na ausência do complexo (Figura 11) não há formação de nenhum pico, e que após adição do MTZ o perfil do voltamograma muda muito pouco, mostrando um pequeno aumento da corrente em potenciais a partir de +600 mV (com máximo em 720 mV, 1), no sentido da oxidação, e em potenciais negativos somente a partir de -670 mV (2), provavelmente devido ao processo redox na molécula de MTZ. Já quando usada a [CoPc] se observa, no voltamograma (na ausência de MTZ) um pico em -270 mV vs Ag|AgCl (2’) e um leve ombro em (1’), que podem corresponder à dupla CoPc3+/CoPc2+ no eletrodo. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -60 -30 0 30 2 i / �� A Potencial vs Ag|AgCl/ V Branco [MTZ]= 4,8x10-5mol L-1 1 Resultados e Discussão 51 Figura 13: Voltamogramas cíclicos para sensor à base de pasta de carbono modificada com [CoPc]. Branco: Solução tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 50 mV s-1. Na presença de metribuzin ocorre um aumento evidente da corrente catódica a partir de -210 mV vs Ag|AgCl. Analisando os pontos 1’’ e 2’’, quando comparados com os pontos 1 e 2 da Figura 12, observa-se uma diminuição na corrente anódica em 720 mV (para os pontos 1 e 1’’, respectivamente) de aproximadamente 40%, e o aparecimento de corrente catódica a partir de -210 mV que não existia no voltamograma da Figura 12, sugerindo que no sensor à base de CoPc, possa estar ocorrendo um processo de redução eletrocatalítico. Para verificar se ocorria um aumento regular e significativo na corrente catódica, que permitisse quantificar o metribuzin, a Figura 14 mostra os voltamogramas cíclicos obtidos em diferentes concentrações de analito. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -60 -30 0 30 2'' 1'' 2' i / � A Potencial vs Ag|AgCl / V Branco [MTZ]= 4,8X10-5mol L-1 1' Resultados e Discussão 52 Figura 14: Voltamogramas cíclicos para sensor à base de [CoPc] em diferentes concentrações de metribuzin. Branco: Solução tampão Britton-Robinson 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura de 50 mV s-1. Conforme a Figura 14, verifica-se que há sim, uma relação crescente entre a corrente catódica e a concentração de MTZ, o que viabiliza o uso deste sensor à base de CoPc para análise quantitativa deste analito. Visando obter informação sobre o possível mecanismo de resposta do sensor proposto, quando avaliado o processo de redução do metribuzin em diferentes velocidades de varredura, foi observado que em velocidades menores a 5 mV s-1 (Figura 15) apareciam três picos de redução nos potenciais de -185 mV (1), -460 mV (2) e -710 mV (3), na presença e na ausência do analito. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -60 -30 0 30 i / � A Potencial vs Ag|AgCl / V Branco [MTZ] = 4,8 x 10-5 mol L-1 [MTZ] = 9,1 x 10-5 mol L-1 [MTZ] = 1,3 x 10-4 mol L-1 Resultados e Discussão 53 Figura 15: Voltamograma cíclico para o sensor à base de pasta de carbono modificada com [CoPc]. Branco: Solução tampão BT 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 5 mV s-1. O pico 1 em -183 mV (Fig. 15), provavelmente corresponda ao pico 2’ da Figura 13 a -270 mV, e se apresenta em um potencial menos negativo por ter sido registrado a uma velocidade de varredura menor (� = 5 mV s-1). Este pico se manteve presente em todas as velocidades de varredura e por esta razão foi usado para obtenção dos gráficos do estudo correspondente à variação de �. Já os picos 2 e 3 poderiam ser correspondentes ao oxigênio dissolvido na solução de eletrólito, porém pelos resultados obtidos no gráfico da Figura 12 e por experimentos realizados em meio saturado com nitrogênio para o sensor modificado com [CoPc] (Figura 16) no qual os três picos novamente foram observados a � < 5 mV s-1, os picos 2 e 3 podem ser provavelmente explicados devido à redução dos nitrogênios disponíveis entre os anéis pirrólicos da molécula da [CoPc]. Esses grupos pirrólicos explicariam também o ganho na corrente de redução, principalmente no potencial correspondente ao último pico após adição do metribuzin, que também apresenta átomos de nitrogênio que podem ser reduzidos -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -30 -15 0 3 3 2 2 1 i / � A Potencial vs Ag|AgCl / V Branco [MTZ] = 9,1 x 10-5 mol L-1 Resultados e Discussão 54 nesse potencial, e que não ocorre com tanta intensidade na ausência do complexo (Figura 12), evidenciando a influência positiva da [CoPc] na pasta de carbono, para determinação de metribuzin. Figura 16: Voltamograma cíclico para o sensor à base de pasta de carbono modificada com [CoPc] após borbulhar por 40 minutos nitrogênio em solução. Branco: Solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), �� = 5 mV s-1. Desta forma, visando investigar a natureza destes picos, foi realizado um experimento modificando uma pasta de carbono com a ftalocianina sem centro metálico, e o resultado obtido é mostrado nas Figuras 17a e 17b. Pela Figura 17a, pode ser observado um comportamento análogo ao da pasta sem modificação (Figura 12) em � de 50 mV s-1, indicando que a redução do MTZ, ocorre apenas na presença do centro metálico de Co na ftalocianina, sendo este complexo o responsável pela corrente catódica observada na presença de metribuzin. -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -20 -10 0 10 3 2 1 i / � A Potencial vs Ag|AgCl / V Resultados e Discussão 55 Figura 17: (A) Voltamogramas cíclicos para eletrodo à base de pasta de carbono modificada com ftalocianina sem centro metálico. Branco: Solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 50 mV s-1. (B) Voltamograma cíclico para o mesmo eletrodo em tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), velocidade de varredura: 5 mV s-1. -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 -60 -40 -20 0 20 i / � A Potencial vs Ag|AgCl / V Branco [MTZ] = 4,8 x 10-5 mol L-1 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 -20 -10 0 10 3 i / � A Potencial vs Ag|AgCl / V 2 (A) (B) Resultados e Discussão 56 Por outro lado, em velocidades de varredura menores a 5 mV s-1, observam- se novamente dois picos em -460 mV (2) e -690 mV (3), em potenciais análogos aos observados nas Figuras 15 e 16, confirmando a hipótese de que esses picos correspondem à redução dos grupos pirrólicos da molécula de ftalocianina. Estes picos não são visualizados em velocidades de varredura maiores, provavelmente devido á limitação no transporte de carga na macromolécula. Com a finalidade de avaliar se a redução do MTZ é eletrocatalítica, tal como sugerem os gráficos das Figuras 13 a 15, foram realizados experimentos variando a velocidade de varredura da voltametria cíclica (Figura 18), e que permitiram avaliar as características eletroquímicas do sensor à base de CoPc. Figura 18: Voltamogramas cíclicos para o sensor em 4,8 x 10-5 mol L-1 de metribuzin e em diversas velocidades de varredura. Sabe-se que um sistema catalítico, no qual a corrente aumenta preferencialmente em um único sentido, seja anódico ou catódico; comporta-se como um sistema eletroquímico irreversível controlado por difusão69. Para verificar este fato, o processo de redução do metribuzin na superfície do sensor foi avaliado -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 -80 -60 -40 -20 0 20 i / � A Potencial vs Ag|AgCl / V 5 mV 10 mV 20 mV 30 mV 40 mV 50 mV 75 mV 100 mV 200 mV Resultados e Discussão 57 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45 0 3 6 9 �ip= -3,56(±0,20)+ 27,6(±0,7) �1/2 R=0,996 �i p/ � A �1/2 / V1/2 s-1/2 em diferentes velocidades de varredura, e os resultados obtidos são mostrados na Figura 19. Figura 19: Variação da corrente de pico catódico (Δi vs ��1/2) no sensor à base de pasta de carbono modificada com o complexo [CoPc]. Contendo 4,8 x 10-5 mol L-1 de metribuzin. Da Figura 19 pode-se observar que há uma dependência linear entre a corrente de pico catódica com a raiz quadrada da velocidade de varredura na faixa entre 25 e 200 mV s-1, indicando que a redução do metribuzin na superfície do sensor é controlada pela difusão dessa espécie para a superfície do eletrodo. Adicionalmente, quando plotado o gráfico da variação da corrente de pico normalizada pela raiz quadrada da velocidade de varredura de potencial (Δipc �-1/2) vs � (Figura 20) o perfil obtido sugere fortemente que o processo de redução do metribuzin é eletrocatalítico do tipo EC’ (electrochemical/chemical catalytic), os quais são caracterizados por apresentar uma etapa química acoplada ao processo eletroquímico70, este resultado será importante ao propor um mecanismo de resposta para este sensor. Resultados e Discussão 58 30 60 90 120 150 180 210 0,2 0,4 0,6 �i � -1 /2 / �A s 1/ 2 m V -1 � / mV s-1 Figura 20: Variação da corrente de pico catódico normalizada (Δi �-1/2) vs �. Medidas realizadas em solução tampão BR 0,08 mol L-1, pH 2,0 contendo 4,8 x 10-5 mol L-1 de metribuzin. Após verificar que o sensor apresenta uma resposta electrocatalítica para a redução do MTZ, a seguir foram realizados os experimentos necessários para otimizar a resposta analítica do sensor para este analito. 4.1.2. Otimização da resposta do sensor No estudo de otimização do sensor para metribuzin foi empregada a técnica eletroanalítica de amperometria, inicialmente em potenciais próximos a -700 mV correspondente ao pico 3 da Figura 15, onde foi observada maior diferença de corrente e conseqüentemente maior sensibilidade. Nestes estudos, almejou-se escolher os parâmetros que permitissem obter maior sensibilidade, estabilidade e seletividade das medidas. Para isto, parâmetros como natureza do tampão, pH e concentração do tampão; potencial aplicado e quantidade de complexo de ftalocininacobalto (II) na pasta de carbono, foram otimizados. Os melhores resultados foram obtidos em tampão Britton-Robinson (BR) na concentração de 0,08 mol L-1 (Figuras 21 e 22). Resultados e Discussão 59 Figura 21: Perfil de resposta apresentado pelo sensor proposto em função do tipo de tampão usado como eletrólito suporte nas análises amperométricas para determinação de metribuzin. Medidas realizadas em - 690 mV vs Ag|AgCl (KClsat). Figura 22: Perfil de resposta apresentado pelo sensor proposto em função da concentração do tampão. Medidas realizadas em - 690 mV vs Ag|AgCl (KClsat). BR Clark-Lubs Ftalato ácido de K Mcllavaine 0 5x104 1x105 Tampão S en si bi lid ad e / � A L m ol -1 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 4,0x104 8,0x104 1,2x105 1,6x105 S en si bi lid ad e / � A L m ol -1 [BR] / mol L-1 Resultados e Discussão 60 A Tabela 2 mostra todos os parâmetros avaliados na otimização do sensor biomimético para determinação de metribuzin. E como pode ser visto nessa tabela, o sensor preparado com pasta de carbono contendo 15 % (m/m) de complexo de cobalto, mostrou melhor desempenho em relação a sensibilidade e repetibilidade em solução tampão BR com concentração de 0,08 mol L-1 em pH 2,0 e potencial aplicado de –690 mV vs Ag|AgCl,KClsat. Desta forma, estas variáveis foram fixadas para a aplicação do sensor nas análises de metribuzin em batelada. Tabela 2: Parâmetros avaliados na otimização do sensor biomimético para determinação de metribuzin Parâmetros Avaliados Otimizado Quantidade de complexo na pasta / % (m/m) 7 10 15 20 --- --- 15 pH 2,0 3,5 4,5 6,0 7,0 8,5 2,0 Tampão Macllavaine Clark-Lubs Ftalato ácido de potássio BR TRIZMA Acetato BR [BR] / mol L-1 0,02 0,04 0,08 1,0 --- --- 0,08 Potencial vs Ag|AgCl / mV -940 -840 -790 -690 -450 -300 -690 Resultados e Discussão 61 4.1.3. Perfil de resposta do sensor Sob as condições otimizadas, o sensor apresentou um perfil amperométrico de resposta tal como mostrado na Figura 23, onde a curva analítica (Figura 24) é obtida a partir dos dados amperométricos, da variação de corrente após cada adição em relação ao branco. A otimização da pasta de carbono e dos parâmetros para realização das medidas amperométricas permitiu obter uma faixa linear para o metribuzin entre 2,4 x 10-5 mol L-1 e 2,0 x 10-4 mol L-1, com uma sensibilidade de 148.908 (± 1.485) µA L mol-1 e limites de detecção e quantificação de 4,3 x 10-6 mol L-1 e 1,4 x 10-5 mol L-1, respectivamente, os quais foram calculados conforme recomendado pela ANVISA71. O limite de detecção (LOD) foi calculado como três vezes o desvio padrão do coeficiente linear (a, obtido da média de três curvas analíticas) dividido pelo coeficiente angular médio dessas três curvas analíticas (b, sensibilidade média), 3x�a/b. Já o limite de quantificação (LOQ)71, foi calculado como 3,3 vezes o valor do LOD (10x�a/b). Figura 23: Perfil de resposta do sensor nas condições otimizadas. Amperograma típico obtido para adições sucessivas de 2,4 x 10-5 mol L-1 de metribuzin. 120 160 200 240 -50 -40 -30 -20 -10 2,44 x 10-5 mol L-1 i / � A tempo / s Resultados e Discussão 62 Figura 24: Curva analítica construída com os resultados obtidos na amperometria da Figura 23. A equação da reta que representa os dados da Figura 24 é mostrada na equação 1, cujo “R” foi de 0,999, para n=10. )1(1485908148190672 1 equaçãoLn]/mol[Metribuzi)(.),(,Δi/μA � � Na Tabela 3 são mostradas todas as características analíticas apresentadas pelo sensor, avaliado neste trabalho apenas em sistema em batelada. 0,0 5,0x10-5 1,0x10-4 1,5x10-4 2,0x10-4 0 5 10 15 20 25 30 35 40 �i / �A [MTZ] / mol L-1 Resultados e Discussão 63 Tabela 3: Características analíticas mostradas pelo sensor para determinação em sistema de batelada. Parâmetros / unidade Resposta Faixa Linear (μmol L-1) 2,4 x 10-5 - 2,0 x 10-4 Sensibilidade (μA Lmol-1) 148.908 Coeficiente de Correlação (n=10) 0,999 Limite de detecção (mol L-1) 4,3 x 10-6 (0,9 ppm) Limite de quantificação (mol L-1) 1,4 x 10-5 (3,0 ppm) Repetibilidade intra-dia (RSD, n=5 sensibilidades de curvas analíticas) 3,5% Repetibilidade inter-dia (RSD, n=5 sensibilidades de curvas analíticas) 4,5% Tempo de vida mantendo 95% sinal inicial 5 dias A repetibilidade da resposta do sensor biomimético pode ser verificada através dos valores obtidos para o desvio padrão médio relativo (RSD) da sensibilidade de cinco curvas analíticas registradas em dias diferentes (inter-dia) e no mesmo dia (intra-dia), respectivamente, os quais foram inferiores a 5%. O tempo de vida do eletrodo também foi avaliado em uso contínuo, sem troca de pasta e registando curvas analíticas em triplicata, sendo os resultados obtidos bastante aceitáveis, uma vez que ao ser preparado um lote de pasta de carbono modificada, ela pode ser facilmente substituída rapidamente durante várias vezes. Resultados e Discussão 64 4.1.4. Estudo da seletividade Para realizar este estudo de seletividade, a resposta amperométrica do sensor foi avaliada para seis agrotóxicos, com diversas estruturas e classificações, além do metribuzin (Figura 25), e observou-se que o sensor não apresentou resposta para nenhum dos seis compostos estudados, tal como mostrado na Tabela 4. Desta forma, este resultado sugere que o sensor à base de ftalocianinacobalto (II), é seletivo para metribuzin em relação a outros agrotóxicos, tal qual, é esperado para um dispositivo que visa mimetizar um biossensor enzimático, altamente seletivo. Tabela 4: Agrotóxicos analisados no estudo da seletividade. Agrotóxicos Sinal analítico Carbendazim n.d Carbofurano n.d Clorpirifós n.d Diuron n.d Hexazinona n.d Metribuzin SIM 2,4-D n.d n.d = não detectado Resultados e Discussão 65 Figura 25: Estruturas químicas do metribuzin e dos agrotóxicos avaliados no estudo da seletividade do sensor. Metribuzin N N N S t-Bu NH2 CH3 O Carbendazim Carbofurano N N H NH O O CH3 O CH3 CH3 ONH O NH2 Clorpirifós Diuron NCl Cl Cl O P O O S CH3 CH3 Cl Cl NH N CH3 CH3 O Hexazinona 2,4-D N N N O ON CH3 CH3 CH3 Cl Cl O O OH Resultados e Discussão 66 4.1.5. Verificação do caráter biomimético do sensor Visando verificar se o sensor proposto apresenta um comportamento similar aos sensores enzimáticos, o perfil de resposta foi avaliado até a região da saturação, obtendo-se o gráfico mostrado na Figura 26. Figura 26: Perfil hiperbólico do sensor à base de ftalocianinacobalto (II). Da Figura 26 pode ser verificado um perfil hiperbólico, tal como ocorre no caso dos biossensores enzimáticos, indicando que o complexo de cobalto na pasta de carbono segue uma cinética do tipo “Michaellis-Menten”72. Adicionalmente, ao plotar o gráfico de Linewaver-Burker ou do duplo recíproco (Figura 27), foi possível estimar a constante aparente de Michaellis- Menten72, a qual apresentou um valor de 7,4 x 10-5 mol L-1, que é um valor que indica uma forte afinidade72 do complexo biomimético de cobalto pelo “substrato” metribuzin. 0,0 4,0x10-5 8,0x10-5 1,2x10-4 1,6x10-4 2,0x10-4 10 15 20 25 �i / �A [MTZ] / mol L-1 ][)108,9(100,1 )6,1(9,35 64 MTZxx i �� �� Resultados e Discussão 67 Figura 27: Gráfico do duplo recíproco obtido com os dados da Figura 26. Com base nos resultados obtidos nas Figuras 13, 19 e 20 que sugerem que a redução do metribuzin é eletrocatalítica; com base nos resultados obtidos da seletividade do sensor para metribuzin (4.1.4); e com base nas Figuras 26 e 27 que sugerem que a resposta do sensor é hiperbólica e que existe uma alta afinidade entre o complexo de cobalto e o metribuzin; pode-se dizer que o sensor construído à base do complexo ftalocianinacobalto (II), trata-se de um sensor biomimético. 4.1.6. Proposta de mecanismo de resposta do sensor Visando a propor um mecanismo de resposta para o sensor à base de CoPc, com base nas evidencias experimentais até aqui mostradas, a Figura 28 mostra um esquema para a resposta do sensor para metribuzin. 0 10000 20000 30000 40000 0,04 0,06 0,08 0,10 0,12 -1/KMM �i -1 / �A -1 [MTZ]-1 / mol-1 L app Resultados e Discussão 68 Figura 28: Esquema do mecanismo proposto para a resposta do sensor. No mecanismo proposto da Figura 28, é mostrado o processo catalítico observado em potenciais > -270 mV (pico 2’ na Figura 13). Entretanto, acredita-se que uma redução direta do MTZ, nos potenciais abaixo de -450 mV (Figura 15, picos 2 e 3), também estejam contribuindo se considerar o mecanismo de redução do MTZ da Figura 3. Na Figura 28, inicialmente a reação química (chemical step) entre o MTZ oxidado e 2 moléculas de CoIIPc em meio ácido, promoverá a redução do MTZ e a oxidação da ftalocianina de cobalto. Na etapa eletroquímica acoplada à química, a redução da ftalocianina na superfície do eletrodo leva à obtenção da corrente observada em função da presença de metribuzin na cela de medida. Com a finalidade de estimar o número de elétrons no sistema, que permita sustentar o mecanismo proposto na Figura 28, foram usados os gráficos das Figuras 19 e 29, que permitiram calcular o número de elétrons através das equações de Andrieux-Savèant (equação 2)62,69 e de Randles–Sevcík (equação 3)62,70. )2(496.0 2/1 2/1 2/1 0 equação RT F DFACi Sp �� � � � �� Resultados e Discussão 69 Onde, CS é a concentração do MTZ (4,8 x 10-8 mol cm-3), D0 é o coeficiente de difusão do MTZ, F é a constante de Faraday, R = 8.31447 J mol-1 K-1, T = 298 K e A = 0,126 cm2. Usando a equação 2, o coeficiente de difusão do MTZ pode ser estimado usando o valor da inclinação da Figura 18 (Δi vs �1/2) multiplicado por 10-6, para transformar as unidades em ampères, e o fator 2/12/12/1 0 )(496.0 �RTFDFACS . Através deste cálculo foi possível calcular um coeficiente de difusão (D0) de 2,3 x 10-4 cm2 s-1, correspondente à difusão média do MTZ e de seu(s) produto(s) de redução, durante o processo catalítico. Assumindo que a redução eletrocatalítica do MTZ é um processo irreversível, a equação de Randles-Sevcík (3) pode ser usada para estimar o número de elétrons envolvidos. nesta equação 3, jp = ip/A = 219,05 x 10-6 A cm-2 V-1/2 s1/2, n é o número total de elétrons envolvidos na reação, α é o coeficiente de transferência eletrônica, na representa o número de elétrons envolvidos na etapa determinante da reação, D0 (cm2 s-1) é o coeficiente de difusão do MTZ e das espécies eletroativas, calculado anteriormente, CS (mol cm-3) é a concentração do MTZ e υ é a velocidade de varredura. Contudo, na equação 3, para estimar o valor de n, é necessário que primeiramente seja calculado o valor (1-α)na. Para isto, em um sistema catalítico ou irreversível, um cálculo aproximado deste fator está baseado na relação linear entre o potencial de pico (Ep) e o log� (Figura 29). A relação entre a inclinação da Figura 29 e o fator (1-α)na, (4) fornece um valor de 0,3786, o qual pode ser inserido na equação 3, para finalizar o cálculo de n. Após os cálculos necessários, e substituindo todos os valores na equação de Randles-Sevcík (3), foi possível calcular o número de elétrons envolvidos na eletrorredução catalítica do MTZ na superfície do sensor à base da CoPc, tendo sido obtido o valor de 1,63, o qual pode ser aproximado para 2 e-. )3(])1[()1099,2( 2/12/1 0 2/15 equaçãoCDnnxj Sap ���� )4( ])1[( 15.1078.0 equação Fn RT a�� � Resultados e Discussão 70 Figura 29: Variação linear do potencial de redução (Ep) vs log��. Varreduras realizadas em solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), contendo 4,8 × 10−5 mol L−1 de MTZ. 4.2 SENSOR À BASE DE PASTA DE CARBONO MODIFICADA COM NANOTUBO DE CARBONO E [COPC] No intuito de tentar aumentar a detectabilidade do sensor modificado com ftalocianinacobalto (II), foram inseridos nanotubos de carbono na preparação da pasta. Para verificar se a modificação da pasta com nanotubos de carbono (MWCNT) e complexo de cobalto [CoPc], traria algum ganho na detectabilidade do sensor em relação à pasta de carbono modificada apenas com ftalocianinacobalto (II) para detecção de metribuzin, foi registrada a voltametria cíclica para efeito de comparação, e os resultados obtidos são mostrados na Figura 30. -1,6 -1,2 -0,8 0,27 0,30 0,33 0,36 Ep= 0,417(±0,005)+ 0,078(±0,004)log� R=0,993 E p / V v s A g| A gC l log� Resultados e Discussão 71 Figura 30: Voltamograma cíclicos para sensor à base de pasta de carbono modificada com 15% [CoPc] (preto) e à base de pasta de carbono modificada com MWCNT e 15% [CoPc] (azul). Medidas realizadas em solução tampão BR 0,08 mol L-1 (pH 2,0), ��: 50 mV s-1. No gráfico inserido é mostrada uma ampliação do voltamograma em preto. Pode-se observar que a área do voltamograma da pasta contendo MWCNT e o complexo, é maior do que a do voltamograma correspondente à pasta de grafite e complexo. Esse resultado já era esperado devido ao aumento de corrente gerado pela maior área superficial do nanotubo de carbono. Entretanto, a excessiva quantidade de óleo mineral (Nujol®) necessária para obtenção da pasta, torna o material mais resistivo, tal como indicado pelo voltamograma da figura anterior. Apesar do resultado obtido, para verificar se ainda assim haveria algum aumento na sensibilidade do sensor, o mesmo foi avaliado sob as condições amperométricas otimizadas anteriormente para o sensor de pasta de carbono com [CoPc] e o perfil de resposta é mostrado na Figura 31 a seguir. -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 -2x10-5 -1x10-5 0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 -1x10-3 -5x10-4 0 5x10-4 i / A Potencial vs Ag|AgCl / V i / A Potencial vs Ag|AgCl/ V pasta de carbono + 15% (m/m) CoPc pasta de carbono + NTCMW + 15% (m/m) CoPc Resultados e Discussão 72 Figura 31: Amperograma típico obtido com o sensor à base de MWCNT para adições sucessivas de 2,4 x 10-5 mol L-1 de metribuzin no potencial de -0,690 V. Claramente pode-se observar um problema na difusão do analito em relação à pasta de carbono sem MWCNT, pelo perfil de “serra” mostrado na Figura 31 quando comparado com o perfil de resposta mostrado na Figura 23. Este perfil da Figura 31, novamente pode ser atribuído ao excesso de aglutinante (que é isolante) na preparação da pasta de grafite/MWCNT/complexo, que foi 150% maior daquele usado na pasta de carbono convencional. Com os dados obtidos pelas adições sucessivas, traçou-se a respectiva curva analítica, mostrada na Figura 32. 325 350 375 400 425 -30 -20 -10 0 2,4 x 10-5 mol L-1 i / � A tempo / s Quantificável a partir desta concentração Resultados e Discussão 73 Figura 32: Curva analítica obtida através do amperograma do sensor mostrado na Figura 31. A equação da reta que representa os dados da Figura 32 é mostrada na equação 5, que foi ajustada com um coeficiente linear de 0,998, para 5 pontos. )5(/][)1947(988.50)20,0(92,12/ 1 equaçãoLmolMetribuzinAi �� �� � Pelos resultados obtidos com o sensor usando MWCNT, e baseados na razão custo – beneficio, o sensor à base de pasta de carbono modificada com estes nanomateriais e [CoPc], não trouxe o ganho esperado na sensibilidade para determinação de MTZ, principalmente devido ao bloqueio na transferência eletrônica e na difusão do analito, ocasionado pelo excesso de material isolante aglutinante requerido para obtenção da pasta, sendo 150% a mais desse material em relação à pasta simples. Desta forma, procurou-se outra alternativa para imobilização dos MWCNT junto com o catalisador biomimético na tentativa de aumentar a detectabilidade do sensor para detecção sensível de MTZ, a qual será descrita no item a seguir. 4,0x10-5 8,0x10-5 1,2x10-4 1,6x10-4 15 18 21 �i / �A [MTZ] / mol L-1 Resultados e Discussão 74 4.3. SENSOR IMPRESSO DE GRAFITE MODIFICADO COM MWCNT E [CoPc] Para verificar se a modificação do eletrodo impresso com nanotubo de carbono e complexo de cobalto [CoPc], aumentaria a sensibilidade analítica para detecção de metribuzin, em relação ao eletrodo impresso (EI) não modificado e às pastas de carbono modificadas com fta