1 

 

UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

Faculdade de Odontologia de Araraquara 

 

 

 

 

 

LESLIE CRISTINE FIORI 

 

 

 

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO TRATAMENTO COM 

ALENDRONATO, A LONGO PRAZO, SOBRE A 

REPARAÇÃO DO TECIDO ÓSSEO EM DEFEITOS DE 

CALVÁRIAS. ESTUDO EM RATAS 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Araraquara 

2016



 

  

0 

 

UNESP – UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA 

“JÚLIO DE MESQUITA FILHO” 

Faculdade de Odontologia de Araraquara 

 

 

 

LESLIE CRISTINE FIORI 

 

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO TRATAMENTO COM 

ALENDRONATO, A LONGO PRAZO, SOBRE A 

REPARAÇÃO DO TECIDO ÓSSEO EM DEFEITOS DE 

CALVÁRIAS. ESTUDO EM RATAS 

 

 

 

 

Dissertaçãoapresentada ao Programa de Pós-Graduação 

em Odontologia – Área de Periodontia, da Faculdade de 

Odontologia de Araraquara, da Universidade Estadual 

Paulista para o título de Mestre em Odontologia. 

 

Orientadora: Profa. Dra. Silvana Regina Perez Orrico 

Co-Orientadoras:Prof. Dra. Ana Paula de Souza Faloni 

Dra. Marina Montosa Belluci 

 

 

 

Araraquara 

2016 

 



 

  

1 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Fiori, Leslie Cristine 

Avaliação do efeito do tratamento com alendronato, a longo prazo, 

sobre a reparação do tecido ósseo em defeitos de calvárias. Estudo em 

ratas / Leslie Cristine Fiori.--  Araraquara: [s.n.],  2016.  

               107f. ; 30 cm. 

 

Dissertação (Mestrado) – Universidade Estadual Paulista,           

Faculdade de Odontologia 

                 Orientador:  Profa. Dra. Silvana Regina Perez Orrico 

                 Co-orientador: Profa. Dra. Ana Paula de Souza Faloni 

 

1. Remodelação óssea 2. Crânio 3. Alendronato   I. Título  

 
Ficha   catalográfica  elaborada   pela  Bibliotecária Marley C. Chiusoli Montagnoli, CRB-8/5646  

Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação da Faculdade de Odontologia de Araraquara / UNESP 



 

  

2 

 

LESLIE CRISTINE FIORI 

 

AVALIAÇÃO DO EFEITO DO TRATAMENTO COM 

ALENDRONATO, A LONGO PRAZO, SOBRE A REPARAÇÃO DO 

TECIDO ÓSSEO EM DEFEITOS DE CALVÁRIAS. ESTUDO EM 

RATAS 

 

 

 

 

DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO GRAU DE MESTRE 

 

 

 

COMISSÃO JULGADORA 

 

 

 

Presidente e Orientadora: Profa. Dra.Silvana Regina Perez Orrico 

2º Examinador: Prof. Dr. José Eduardo Cezar Sampaio 

3º Examinador: Prof. Dr. Roberta Okamoto 

 

 

 

 

 

Araraquara, 31de agosto de 2016



 

  

3 

DADOS CURRICULARES 
 

LESLIE CRISTINE FIORI 

 

NASCIMENTO    22 de Junho de 1990, Porto Velho/RO 

 

FILIAÇÃO    Marília Lima Pimentel Cotinguiba 

Luis Eduardo Fiori 

      

  

2008/2012                                Curso de Graduação em Odontologia pela 

Faculdade de Odontologia de Araraquara – 

UNESP 

 

 

2014/2016 Curso de Pós-Graduação em Odontologia, 

área de concentração em Periodontia, nível 

de Mestrado, pela Faculdade de Odontologia 

de Araraquara – UNESP 

 

 

2015/2016 Especialização em Periodontia pela 

Faculdade de Odontologia de Araquara – 

FOAr - UNESP. 

 

 

 

 

 



 

  

4 

DEDICATÓRIA 

 

Dedico esse trabalho: 

 

 

 Aos meus pais, Marília e Luis, à minha avó Adir e ao meu avô Messias (in 

memorian) que são os meus maiores incentivadores e principais responsáveis por eu ter 

tido possibilidade de abraçar todas as maravilhosas oportunidades que a vida colocou em 

meu caminho. Sem vocês, a realização desse trabalho jamais seria possível! 

 

 

 Ao meu grande amor, amigo e parceiro de caminhada, meu marido João, que me 

apoia incondicionalmente e me incentiva e motiva sempre, e que não me deixou desistir 

nos momentos de decepção e desânimo que vivi durante a realização desse trabalho! 

 

 

 Aos meus irmãos Leonardo, Andrey, Victória e Giovanna, e  

às irmãs de coração Laura e Flora, por serem sempre tão compreensívos e por aceitarem 

todas as vezes em que foi necessário fazer sacrifícios em prol da minha formação 

acadêmica.  

  

 

 

 

 



 

  

5 

AGRADECIMENTOS 

 

Agradeço primeiramente à Deus, por me proporcionar uma família maravilhosa 

e me proporcionar vivenciar oportunidades únicas em minha vida, e principalmente por 

jamais me abandonar nos meus momentos de pouca fé. 

 

Agradeço de forma muito especial aos meus primos Messias, Lourayne e 

Michely, aos sogros João e Marta e cunhados Lidiane e Leonardo, que também 

estiveram comigo e me apoiaram durante a realização dessa etapa em minha vida! 

 

Agradeço imensamente à minha querida orientadora Profª. Dra. Silvana Regina 

Perez Orrico, por me acolher desde o meu 4º ano de faculdade por me confiar a grande 

responsabilidade de realizar esse trabalho. Agradeço por toda a paciência, dedicação e 

por todos os ensinamentos que tive a oportunidade de adquirir ao longo de quase 5 anos 

em quem estivemos trabalhando juntas, que foram muito importantes para meu 

crescimento profissional e pessoal! 

 

Agradeço carinhosamente à minha co-orientadora Profª. Dra. Ana Paula de 

Souza Faloni, que encarou a tarefa (nada fácil) de me auxiliar nesse trabalho e que 

nunca mediu enforços para me ajudar, que sempre me encorajou e incentivou e me fez 

enxergar uma capacidade e força que nem eu sabia que tinha.Você foi uma das mais 

gratas surpresas que a minha passagem de quase 10 anos por Araraquara me 

proporcionou, como sempre digo a você, e que apareceu em minha vida no momento 

que mais precisei, e que se tornou mais que uma co-orientadora, uma amiga!  

 

Agradeço a minha co-orientadora Dra. Marina Montosa Belluci, por toda ajuda e 

contribuíção a esse trabalho! Obrigada por compartilhar seus conhecimentos e 

experiência comigo. 

 

Aos meus grandes amigos Bruno e Ulyanna, por me apoiarem, me incentivarem 

e por entenderem meus vários momentos de ausência durante essa jornada! 

 



 

  

6 

Agradeço com muito carinho as minhas queridas amigas de pós-graduação 

Sâmara, Mariana e Sabrina, que me ajudaram muito ao longo de todos esses anos de 

convivência. Vocês são muito especiais e foram muito importantes para mim ao longo 

desse período! 

 

Aos queridos colegas de pós-graduação Mário, Sâmia,Luana, Jonleno, Kahena, 

Romerito, Dayane, Mayara, Luis Carlos, Maurício,Andressa, Suzane, Fernanda Florian 

e Jackeline pela convivência sempre agradável em aula, laboratório ou biotério da 

FOAr! 

 

Aos professores de Periodontia da FOAr, Prof. Dr. José Eduardo Sampaio, Pro. 

Dr. Joni Cirelli, Profª. Dra. Adriana Marcantonio, Prof. Dr. Carlos Rossa, Profª Dra. 

Daniela Zandim e Prof. Dr. Elcio Marcantionio Junior pela convivência agradável e 

pelos valiosos ensinamentos fundamentais para minha formação profossional. 

 

Aos queridos funcionários do departamento de Diagnóstico e Cirurgia da FOAr 

Claudinha, Leandro, Isabela e Zezé pela ajuda e contribuição que sempre me 

proporcionaram durante essa minha jornada e pelo companheirismo e ótima convivência 

diária nos laboratórios e clíncas! 

 

A disponibilidade dos membros titulares da banca Prof. Dr. José Eduardo, Profª. 

Dra. Roberta Okamoto, e aos suplentes Prof. Dr. Joni Cirelli e Profª Dra. Ana Emília, e 

pela contribuição prestada a esse trabalho! 

 

A Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo 

apoio financeiro e institucional, ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento 

(CNPQ) e a Coordenação de Aperfeiçoamento Profissional de nível superior (CAPES). 

 

 

 

 

 

 



 

  

7 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

“Osucesso nasce do querer, da determinação e persistência em 

se chegar a um objetivo. Mesmo não atingindo o alvo, quem 

busca e vence obstáculos, no mínimo fará coisas admiráveis.” 

 

José de Alencar 



 

  

8 

Fiori LC. Avaliação do efeito do tratamento com alendronato, a longo prazo, sobre a 

reparação do tecido ósseo em defeitos de calvárias. Estudo em ratas [Dissertação de 

Mestrado]. Araraquara: Faculdade de Odontologia da UNESP; 2016. 

 

RESUMO  

Os bifosfonatos têm sido amplamente utilizados no tratamento de doenças relacionadas 

a distúrbios no metabolismo ósseo. Dentre os bifosfonatos mais potentes, o alendronato 

(ALD), possui grande potencial em inibir a reabsorção óssea. O objetivo deste estudo 

foi avaliar, in vivo, o efeito da administração de alendronato, a longo prazo, na 

reparação óssea em defeitos críticos confeccionados em calvárias de ratas. Para isto, 160 

ratas foram distribuídas aleatoriamente em 2 grupos que receberam, semanalmente, 

injeções subcutâneas de placebo [grupo controle (CTL)] e de alendronato [grupo 

alendronato (ALD)]. Após 120 dias do início do tratamento, foi confeccionado um 

defeito crítico na calvária de todos os animais e 10 animais de cada grupo foram 

sacrificados aos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 e 60 dias após a confecção do defeito. No dia 

do sacrifício foram coletadas amostras de urina e sangue e foram removidas as calvárias 

e os fêmures dos animais. Os fêmures foram avaliados quanto à densidade mineral 

óssea (BMD). Para a avaliação sistêmica do efeito do medicamento no metabolismo 

ósseo, foram investigados os níveis urinários de deoxipiridinolina (DPD) e os níveis 

séricos de propeptídeo amino terminal do procolágeno tipo I (P1NP), de telopeptídeo 

carboxiterminal do colágeno tipo I (CTX) e de osteocalcina por ensaio imunoenzimático 

(ELISA). Secções de calvárias submetidas ao processamento para inclusão em parafina 

foram empregados para: 1) imuno-histoquímica para detecção de RANKL (ligante do 

receptor de ativação do fator nuclear kß), osteoprotegerina (OPG), Catepsina K, 

RUNX2 (fator de transcrição 2 relacionado ao Runt), Osteopontina (OPN), iNOS (óxido 

nítrico sinstase induzível) e Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF); 2) 

coloração com Tricrômico de Goldner para análise da quantidade de tecido 

mineralizado e de matriz osteóide e fechamento do defeito; 3) avaliação da quantidade 

de osteoclastos TRAP+ (localização de células positivas para a enzima fosfatase ácida 

tartarato resistente-positivos) e 4) análise morfológica do tecido ósseo. Foram 

encontrados maiores valores de BMD para os animais no ALD em relação ao CTL. As 

concentrações de CTX e DPD foram maiores no grupo ALD, enquanto as concentrações 

de P1NP e osteocalcina foram menores no grupo ALD. Na análise imuno-histoquímica, 

verificou-se maiores expressões de catepsina K no ALD até os 15 dias, com inversão a 

partir dos 20 dias. A OPN apresentou menor imunomarcação nos períodos iniciais no 

ALD, havendo uma inversão aos 45 e 60 dias. O VEGF apresentou expressão 

significativamente maior no ALD aos 45 dias. O grupo ALD apresentou menor 

imunopositividade para o iNOS em todos os períodos, com diferença estatística até os 

25 dias, enquanto o RUNX2 apresentou valores significativamente menores no ALD até 

os 20 dias e aos 60 dias em relação ao CTL. O ALD apresentou menor expressão de 

RANKL e maior expressão de OPG, em relação ao CTL. Observou-se diminuição da 

quantidade de células TRAP+ ao longo dos períodos no CTL e ALD. Verificou-se 

menor quantidade de matriz osteóide no ALD. Aos 45 e 60 dias, no ALD, a distância 

entre as bordas do defeito foi menor em relação aos períodos iniciais. Na análise 

morfológica, observou-se um relativo atraso na remodelação óssea no ALD. Os 

resultados em conjunto, sugerem que o ALD pode tem um efeito prejudicial no 

processo de reparo de defeitos críticas em calvárias de ratas, a longo prazo. 

Palavras-chave: Remodelação óssea. Crânio. Alendronato  



 

  

9 

Fiori LC. Long-therm evaluation of the alendronate treatment effect on bone repair 

in calvarial deffects. A rat study [Dissertação de Mestrado]. Araraquara: Faculdade 

de Odontologia da UNESP; 2016. 

 

ABSTRACT 

The bisphosphonates have been widely used for the treatment of diseases related to osseous 

metabolism disturbances. Among the most powerful bisphosphonates, the alendronate (ALD) 

presents great potential to inhibit the osseous reabsorption. This aim of this study was to 

evaluate, in vivo, the effect of the administration of alendronate in the long run, in bone repair in 

critic defects produced in rats’ calvarias. For so, 160 rats were randomly distributed into 2 

groups which received, weekly, placebo subcutaneous injections [control group (CTL)] as well 

as alendronate injections [alendronate group (ALD)]. After 120 days from the beginning of 

treatment, a critic defect was produced in all animals and 10 animals from each group were 

sacrificed at 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 and 60 days after the defect production. On the day of 

sacrifice, urine and blood samples were collected and the calvarias and femurs were removed. 

The femurs were evaluated as for their bone mineral density (BMD). For the systemic 

evaluation of the medicine effect over the bone metabolism, the deoxypyridinoline urinary 

levels were investigated (DPD) as well as the serum levels of amino-terminal procollagen 

propetide of type 1 (P1NP), of carboxy-terminal telopeptide of collagen type I (CTX) and of 

osteocalcin by means of enzyme-linked immunosorbent essay (ELISA). Parts of calvarias 

undergone processing for inclusion in paraffin were employed to: 1) immuno-histochemistry for 

detection of RANKL (receptor activator of nuclear factor kß ligand), osteoprotegerin (OPG), 

Cathepsin K, RUNX2 (transcription factor 2 related to Runt), Osteopontin (OPN), iNOS 

(inducible nitric oxide synthase) and Vascular Endothelial Growing Factor (VEGF); 2) 

coloration with Goldner’s Trichrome for analyzing the  quantity of mineralized tissue and of 

osteoid matrix and defect closing; 3) evaluation of quantity of osteoclasts TRAP+ (positive cells 

localization for the acid phosphatase enzyme positive-resistant tartrate) and 4) morphologic 

analysis of the osseous tissue. Higher values of BMD were found for the animals in the ALD in 

relation to CTL. The concentration of CTX and DPD were higher in group ALD, while the 

concentration of P1NP and osteocalcin were smaller in group ALD. In the immuno-

histochemicalanalysis, it was verified higher expressions of cathepsin K in ALD until the 15
th
 

day, with inversion starting from the 20
th
 day. The OPN presented smaller immunolabeling in 

the initial periods in the ALD, and there was an inversion on the 45
th
 and 60

th
 days. The VEGF, 

presented expression meaningfully higher in the ALD on the 45
th
 day. The group ALD 

presented lesser immunopositivity for the iNOS in all the periods, with difference estatistical till 

the 25
th
 day, while the RUNX2 presented values meaningfully smaller in the ALD till the 20

th
 

day and 60
th
 day in relation to CTL. The ALD presented smaller expression of RANKL and 

higher expression of OPG, in relation to CTL. It was observed reduction of quantity of TRAP+ 

cells along the periods in the CTL and ALD. It was verified smaller quantity of osteoid matrix 

in the ALD. On the 45
th
 and 60

th
 days, in the ALD, the distance between the borders of the 

defect was smaller in relation to initial periods. In the morphological analysis, it was observed a 

relative delay in the bone remodeling in the ALD. The results, as a whole, suggest that the ALD 

may present a damning effect in the repair processing of critic defects in rats’ calvarias, in the 

long term. 

 

Keywords: Bone remodeling. Skull. Alendronate 



 

  

10 

LISTA DE ABREVIATURAS 

ALD: alendronato 

AppCL2P: análogo não hidrolisável do ATP 

Apppl: adenosina metil-trifosfato 

ATP: adenosina tri-fosfato 

BFs: bifosfonatos 

CTL: controle 

CTX: telopeptídeo carboxiterminal do colágeno tipo I 

DPD: Deoxipiridinolina 

FPPS: farnesil difosfato sintase 

GGPP: geranilgeraniol difosfato 

GTPases: proteínas ligantes ao GTP 

iNOS: óxido nítrico sintase induzível 

IPP: isopentil pirofosfato 

N: átomo de nitrogênio 

OH: grupo hidroxila 

OCN: osteocalcina 

OPG: osteoprotegerina 

OPN: osteopontina 

P-C-P: núcleo químico fosfato-carbono-fosfato 



 

  

11 

P-O-P: núcleo químico fosfato-oxigênio-fosfato 

P1NP: telopeptídeo aminoterminal do colágeno tipo I 

RANK: receptor de ativação do fator nuclear kß 

RANKL: ligante do receptor de ativação do fator nuclear kß 

RUNX2: fator de transcrição 2 relacionado ao Runt 

TRAP: fosfatase ácida resistente ao tartarato 

VEGF: fator de crescimento endotelial vascular 

ZOL: zoledronato 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

12 

 

 

SUMÁRIO 

 

1 INTRODUÇÃO........................................................................................................13 

2 REVISÃO DA LITERATURA...............................................................................17 

3 OBJETIVO...............................................................................................................31 

4 MATERIAL E MÉTODO.......................................................................................32 

5 RESULTADO...........................................................................................................42 

6 DISCUSSÃO.............................................................................................................78 

7 CONCLUSÃO..........................................................................................................88 

REFERÊNCIAS..........................................................................................................89 

ANEXO........................................................................................................................107 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

13 

 

1 INTRODUÇÃO 

 

O osso é um tecido conjuntivo especializado dinâmico que é constantemente 

reabsorvido e neoformado de acordo com eventos fisiológicos
124, 129

. Esse processo, no qual o 

osso antigo é constantemente substituído por osso novo, é chamado de remodelação óssea, 

sendo esse evento regulado por uma variedade de mecanismos bioquímicos e mecânicos e 

caracterizado pelas ações coordenadas de osteoclastos e osteoblastos
55

. Os ciclos de 

remodelação óssea dependem de múltiplas linhas de comunicação de células de linhagem 

osteoclástica e osteoblástica em seus vários estágios, e através dessa complexa via, o osso é 

capaz de responder adequadamente aos estímulos inflamatórios, mecânicos e hormonais 

promovendo uma estrutura adequada à função humana
124

. Além disso, o equilíbrio entre 

formação e reabsorção é responsável também pela manutenção da massa óssea.  

Alterações na remodelação óssea estão associadas com algumas doenças como 

osteoporose, doença de Paget, mieloma múltiplo e metástases ósseas. Diversas drogas têm 

sido utilizadas para tratamento dessas condições e dentre elas encontram-se os bifosfonatos, 

empregados ao longo dos últimos 40 anos
111

.  

Os bifosfonatos são substâncias análogas ao pirofosfato, mas caracterizados por 

possuírem em sua cadeia principal um grupo fosfato-carbono-fosfato (P-C-P), que se ligam 

fortemente à hidroxiapatita e são resistentes à hidrólise
46, 107

. Existem duas classes de BFS, os 

não nitrogenados e os nitrogenados. 

Os BFs nitrogenados (possuem nitrogênio em sua composição) são considerados mais 

potentes, e diminuem a reabsorção óssea por meio da inibição da enzima farnesil difosfato 

sintase (FPPS), que é responsável pela ligação de algumas proteínas à membrana celular 

(prenilação), sendo este um evento importante para as células exercerem suas funções. Em 

relação aos osteoclastos, a não ocorrência da prenilação reduz sua atividade conduzindo à 

apoptose
49

. 

Dentre os BFs mais potentes está o alendronato, que por seu grande potencial em 

inibir a reabsorção óssea e aumentar a densidade mineral óssea, é a droga de primeira escolha 

para tratamento da osteoporose pós-menopausa, uma doença associada à deficiência de 



 

  

14 

estrogênio. Seu uso está associado também a uma diminuição no risco de fraturas vertebrais 

em mulheres com osteoporose
14

.  

Os BFs, por terem grande afinidade com o tecido ósseo, são incorporados pelos 

cristais de hidroxiapatita, permanecendo ligados à porção mineral. Durante o processo de 

reabsorção óssea, o microambiente torna-se ácido fazendo com que o BF se dissocie da 

superfície mineral óssea e seja fagocitado pelos osteoclastos, levando-os à apoptose
74, 108

.  

Outra célula fundamental no processo de remodelação óssea, o osteoblasto, pode 

sofrer influência dos BFs e podendo, sob certas circunstâncias, atuar no aumento da formação 

óssea
45

. Estudo, in vitro, que avaliou o efeito do ALD sobre a osteoblastogênese, constatou 

que há um efeito anabólico dessa droga em relação à diferenciação de células-tronco em 

osteoblastos
40

, enquanto outro estudo demonstrou que os BFs levaram ao aumentono 

desenvolvimento de osteoblastos a partir de células progenitoras isoladas da medula óssea
75

. 

Além disso, a aplicação local de ALD, em um modelo de reimplante dental, demonstrou a 

estimulação da proliferação e diferenciação de osteoblastos
69

. Por outro lado, estudo sugeriu 

que parte da ação de inibição dos osteoclastos pelos BFs é mediada por osteoblastos
114

. Foi 

sugerido que o efeito antireabsortivo dos BFs, mediado por osteoblastos, está relacionado à 

via RANKL/OPG. O ligante do receptor de ativação do fator nuclear kß (RANKL) representa 

um fator derivado de osteoblastos essencial para ativação e fomação de osteoclastos, enquanto 

a osteoprotegerina (OPG), também secretada pelos osteoblastos, atua como um antagonista do 

RANKL, bloqueando seu efeito e agindo na prevenção da reabsorção óssea
97

. O mecanismo 

de ação pelo qual os BFs atuam nessa via ainda não está bem esclarecido, porém foi 

demonstrado que com o uso desses medicamentos, há uma diminuição na expressão de 

mRNA do RANKL,  sugerindo assim que a influência dos BFs na osteoclastogênese pode ser 

parcialmente atribuída a inibição de liberação de fatores de diferenciação de osteoclastos por 

células estromais ou pelos osteoblastos
77

. Por outro lado, foi observado em um estudo in vitro 

com células humanas osteoblásticas primárias (hOB), que o principal efeito dos bisfosfonatos  

nesse sistema RANKL/OPG, é atuar no aumento da produção de OPG
136

. 

Outro efeito dos BFs que tem sido estudado é sobre a angiogênese. Foi observado, in 

vitro, que a droga leva a uma inibição da função vascular endotelial, por meio da redução da 

proliferação e indução de apoptose de células endoteliais
47

. Também in vitro, foi demonstrado 

que o ácido zoledrônico inibiu a proliferação de células endoteliais e dos fatores de 



 

  

15 

crescimento endotelial vascular (VEGF) e fibroblástico básico (bFGF), em cultura de células 

humanas
139

. 

Em função do crescente e amplo uso desses medicamentos, surgiu a necessidade de se 

observar o efeito dos BFs sobre o tecido ósseo no processo de reparo frente a diferentes 

procedimentos. Existem controvérsias, por exemplo, quanto ao efeito da droga em sítios de 

extração em animais. Tem sido demosntrado que os BFs podem ter uma influência negativa 

sobre o metabolismo ósseo, promovendo um atraso no início do reparo ósseo em sítios de 

extração em animais submetidos a tratamento com ALD
3, 58

. Por outro lado, estudos 

demonstraram que a administração em curto prazo não impediu a formação óssea após 

extração dentária e que a droga tem o potencial de melhorar o preenchimento ósseo nos sítios 

de extração
128

, além do fato que o ALD parece promover a cicatrização de alvéolos em ratas 

com deficiência de estrogênio
63

.  

Quando o efeito do ALD foi avaliado em relação à osseointegração de implantes, 

estudos em animais demonstraram que o medicamento foi efetivo no aumento da densidade 

óssea ao redor dos implantes
51

, na otimização do processo de osseointegração
134

, na 

manutenção da área de contato osso/implante com padrão semelhante ao controle
37, 135

 e no 

aumento do torque necessário para remoção dos implantes
52, 94

. Porém, apesar do ALD e 

outros BFS favorecerem a osseointegração de implantes orais, alguns estudos relataram casos 

de osteonecrose dos maxilares após procedimentos orais invasivos, como extração dentária
61, 

82, 86
, e instalação de implantes em pacientes em uso desses medicamentos

2, 71, 72
. O 

mecanismo pelo qual os BFs podem levar ao processo de osteonecrose ainda não foi 

completamente esclarecido. Uma das hipóteses é a de que a profunda inibição da função dos 

osteoclastos pode também provocar a estagnação da remodelação óssea, sendo que 

microdanos provenientes de injúrias (por exemplo, extração dentária) não poderiam ser 

reparados, resultando em necrose óssea
110

.   

O uso dos bisfosfonatos sobre o processo de ósseo, ainda precisa ser melhor 

investigado.  Um estudo que avaliou o efeito do zoledronato no processo de cicatrização óssea 

em fíbulas de coelhos constatou que o medicamento não impediu a cicatrização, porém seu 

efeito foi caracterizado por estimulação da produção de osso primário e provável inibição da 

remodelação, levando à retenção de osso trabecular
84

. A avaliação in vivo do efeito do 

YM529, um BF nitrogenado, no reparo de defeito confeccionado em osso cortical, 

demonstrou que o medicamento pode ter atuado em duas vias: estimulando o 



 

  

16 

desenvolvimento de células osteogênicas da medula no início da regeneração óssea e uma 

ação inibitória sobre a diferenciação terminal dos osteoblastos nos períodos finais da 

remodelação (nesse caso, levando a um atraso na cicatrização do osso lamelar) 
91

. Um estudo 

mais recente demonstrou que a terapia com ALD, tanto local quanto sistêmica, melhorou a 

formação óssea em modelo de defeito em calvária de ratos, e sugeriu que a inibição da 

atividade de osteoclastos levou a um aumento na taxa de aposição óssea
130

.  Foi constatado 

ainda, em um modelo de ferida em calvárias de ratos, que o tratamento com etidronato 

(HEBP) acelera o precesso de fechamento da ferida, aumenta a formação de osteoide e tecido 

mineralizado no compartimento ósseo da ferida, promove a diferenciação de osteoblastos, 

porém reduz a proliferação e migração de mais células precursoras osteogênicas primitivas
28

. 

Porém, como visto, são escassos os estudos que avaliaram mecanismos e células 

envolvidas no processo de reparo de feridas em relação ao tratamento com alendronato, 

especificamente. 

Considerando-se o fato da crescente utilização dessa classe de medicamentos, entende-

se que novos estudos são necessários para elucidar os mecanismos de ação e efeitos dos BFs 

no tecido ósseo buscando otimizar o tempo de emprego da medicação bem como minimizar 

efeitos colaterais sobre esse tecido. 

 

 

 

  

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

17 

2 REVISÃO DA LITERATURA 

 

O processo de remodelação óssea permite que o osso tenha a capacidade de 

autoreparação e de adaptação diante das forças que incidem sobre ele, sendo que em 

condições fisiológicas há um equilíbrio entre neoformação e reabsorção. Porém, alterações 

nos parâmetros que regulam esse processo de remodelação resultam em doenças como 

osteoporose, doença de Paget e osteogênese imperfeita. (Datta et al.
31

, 2008).  

A osteoporose é uma doença osteometabólica caracterizada pela diminuição da massa 

óssea esquelética e pelo aumento da fragilidade óssea, ambos os efeitos resultantes do 

desequilíbrio entre formação e reabsorção do tecido ósseo. Essa patologia óssea acomete 

geralmente mulheres na pós-menopausa, em função da diminuição nos níveis de estrogênio. 

Com a deficiência estrogênica há aumento na taxa de remodelação óssea, porém o 

desequilíbrio entre formação e reabsorção ocorre pela diminuição do tempo de vida dos 

osteoblastos e aumento no tempo de vida dos osteoclastos, devido ao atraso na ocorrência de 

apoptose (Manolagas
78

, 2000). Além disso, há aumento na formação de osteoclastos (Faloni, 

Cerri
43

, 2007). Por outro lado,a ocorrência da osteoporose também está associada ao aumento 

em idade dos indivíduos e a fatores de risco como uso de glucocorticóides, tabagismo e 

alcoolismo (Rachner et al.
104

, 2011; Manolagas,Jilka
79

, 1995; Harada, Rodan
56

, 2003). Sabe-

se que com o avanço da idade, há uma diminuição da osteoblastogênese acompanhada de 

aumento na adipogênese, o que pode explicar a diminuição da formação óssea e a ocorrência 

de osteopenia associadas ao envelhecimento (Manolagas
78

, 2000). Cerca de 40% das mulheres 

brancas que se encontram no período pós-menopausa desenvolvem a osteoporose, a qual 

predispõe ao aumento no risco de fraturas ósseas, principalmente em sítios como coluna 

vertebral, quadril e pulso. Há estimativas que, com o envelhecimento, a taxa de fraturas na 

população norte-americana possa chegar a 48% nos próximos 25 anos (O’Connor
96

, 2016; 

Rachner et al.
104

, 2011; Rosenthal et al.
109

, 2014). 

Dentre os principais tipos de tratamentos estabelecidos para a osteoporose, podemos 

destacar a terapia de reposição hormonal com estrógeno e os bifosfonatos (BFs) (de Villiers et 

al.
32

 2013). Atualmente, a terapia com BFs tem sido a primeira escolha no tratamento da 

osteoporose, pois são drogas que apresentam resultados favoráveis em relação ao aumento na 

densidade mineral óssea e à redução no risco de fraturas ósseas (Hegde et al.
57

, 2015; Cosman 

et al.
25

, 2014; Giro et al.
51

, 2008; Black et al.
12

, 2000).  



 

  

18 

Bifosfonatos 

Os bifosfonatos (BFs) são análogos do ácido pirofosfórico, que é uma substância 

endógena encontrada no organismo humano na forma de pirofosfato. Essa substância, que 

pode ser encontrada em fluidos como urina e plasma, tem um papel na regulação do 

metabolismo ósseo por ter afinidade de ligação aos cristais de hidroxiapatita. Porém, por 

sofrer rápida hidrólise enzimática, principalmente se administrada por via oral, seu uso como 

agente terapêutico é restrito (Fernandes et al.
44

, 2005; Papapoulos
98

, 2008; Schibler et al.
118

, 

1968).  

Portanto, a procura por uma opção terapêutica com função análoga ao pirofosfato, com 

ação mais prolongada sobre o metabolismo ósseo, levou ao desenvolvimento dos BFs, 

substâncias que, além de resistirem à hidrolise, têm ação mais potente e possuem maior 

afinidade de ligação à hidroxiapatita (Papapoulos
98

, 2008; Nancollas et al.
93

, 2005). Além 

disso, essas drogas apresentam baixa absorção no trato gastrointestinal e são excretadas 

rapidamente pelos rins. Essas diferenças ocorrem pelo fato dos BFs possuírem em sua cadeia 

principal um carbono central (P-C-P), ao invés do oxigênio presente no pirofosfato (P-O-P) 

(Weinerman, Usera
138

, 2015). 

Atualmente, os bifosfonatos têm sido utilizados não somente como tratamento para 

osteoporose, mas também em outras patologias como doença de Paget, mieloma múltiplo 

(Drake et al.
35

, 2008), prevenção de metástases ósseas (Strobl et al.
126

, 2015) e como 

adjuvantes a outros tratamentos, nos casos de neoplasias com metástases ósseas (Tolia et 

al.
132

, 2014). A principal ação desses medicamentos é a inibição da reabsorção óssea agindo, 

principalmente, sobre o osteoclasto, inibindo sua diferenciação, recrutamento para a superfície 

óssea e atividade, além de induzir a apoptose dessas células (Rodan, Fleisch
107

, 1996; Xu et 

al.
140

, 2013). Por outro lado, estudos relataram que os BFs têm efeito também nos osteoblastos 

e osteócitos (Bellido, Plotkin
9
, 2011; Chaplet et al.

20
, 2004; Komatsu et al.

69
,  2013).  

A afinidade de ligação ao tecido ósseo, o mecanismo de ação e a potência desses 

fármacos variam de acordo com a ligação que ocorre nas cadeias laterais (R1 e R2, 

respectivamente), que se ligam ao carbono central presente na molécula dos bifosfonatos. 

Assim, podem-se dividir os BFs em duas classes: nitrogenados e não-nitrogenados (Russell et 

al.
112

, 1999). 

 



 

  

19 

Bifosfonatos não-nitrogenados 

São considerados bifosfonatos pouco potentes, pois não possuem um nitrogênio em 

seu radical R2. Os BFs pertencentes a essa classe se comportam como análogos dos 

pirofosfatos inorgânicos e são metabolicamente incorporados como análogos ATP (adenosina 

tri-fosfato). Esses análogos são não hidrolisáveis, tóxicos e do tipo AppCL2P (análogo não 

hidrolisável do ATP), sendo que o acúmulo desses metabólitos no meio intracelular interfere 

no metabolismo do ATP e leva à apoptose dos osteoclastos. Os principais representantes 

dessa classe são o etidronato e o clodronato (Frith et al.
48

, 1997;Russell
111

, 2011). 

 

Bifosfonatos nitrogenados 

Pertencem à essa classe os BFs mais potentes, possuindo, usualmente, em seu radical 

R1 um grupo hidroxila (OH) e no radical R2 uma molécula de nitrogênio (N), que pode estar 

ligada a uma cadeia lateral de múltiplos carbonos ou a um grupo heterocíclico (Das, 

Crockett
30

, 2013). Essa classe de medicamentos também leva à apoptose de osteoclastos, 

porém através de mecanismos diferentes aos dos BFs não-nitrogenados. Os BFs nitrogenados 

inibem a atividade da enzima farnesil difosfato sintase (FPPS), que é uma enzima reguladora 

da via do mevalonato e conhecida por seu papel na biossíntese do colesterol e outros 

esteróides (Papapoulos
98

, 2008). Além disso, essa via é responsável pela síntese de proteínas 

(como farnesil e geranilgeraniol difosfato – GGPP) que são essenciais para a prenilação e 

correta localização subcelular de proteínas, incluindo pequenas GTPases como Ras, Rab, Rho 

e Rac, que desempenham um papel central nos processos que regulam a função dos 

osteoclastos (Drake, Cremers
36

, 2010; Das, Crockett
30

, 2013), como morfologia celular, 

arranjo do citoesqueleto, regulação do movimento de vesículas citoplasmáticas necessárias 

para a função osteoclástica e apoptose (Russell
111

, 2011). Em adição, a inibição da FPPS leva 

a um acúmulo de isopentil pirofosfato (IPP), que resulta na produção de adenosina metil- 

trifosfato (Apppl) que, por sua vez, induz à apoptose dos osteoclastos (Monkkonen et al.
88

, 

2006).  

Esses fármacos, por serem mais potentes em relação aos BFs não-nitrogenados, são 

mais utilizados para tratamento de osteoporose, mieloma, doença de Paget, metástases ósseas 

e outras doenças que envolvem fragilidade óssea (Giger et al
49

, 2013). Os principais 



 

  

20 

representantes dessa classe são o alendronato, ácido zoledrônico (ou zoledronato) e 

risedronato (Russell
113

, 2008). 

Alendronato 

O alendronato (ALD) é um BF nitrogenado potente que possui grande afinidade de 

ligação à hidroxiapatita e tem sido indicado como terapia de primeira escolha para o 

tratamento da osteoporose, assim como em outras condições como doença de Paget e 

osteogênese imperfeita (Russell
113

, 2008). O alendronato é rapidamente adsorvido à superfície 

óssea e capturado pelos osteoclastos durante o processo de reabsorção óssea, atuando como 

um inibidor específico da FPPS, considerada a mólecula alvo da ação do ALD (Bergstrom et 

al.
10

, 2000). Essa classe de BF tem sido associada ao aumento da densidade mineral óssea e 

redução no risco de fraturas, em pacientes portadores de osteoporose (Das, Crockett
30

, 2013). 

Em avaliação por meta-análise de Cranney et al.
26

, (2002) pôde confirmar que o tratamento 

com ALD reduz o risco relativo de ocorrência de fraturas vertebrais e não vertebrais, além de 

demonstrar que o medicamento, em doses de 10mg ou superiores, possui um efeito potente no 

aumento da densidade mineral óssea em pacientes com tal condição. De acordo com Peters et 

al.
100

 (2001), a FDA (Food and Drug Administration), recomenda as seguintes doses de ALD 

para tratamento de osteoporose: 1 comprimido de 5mg (1x/dia) ou 1 comprimido de 35mg 

(1x/semana), para prevenção, e 1 comprimido de 10mg (1x/dia) ou 70mg (1x/semana), para 

tratamento.  

 

Bifosfonatoss x Remodelação óssea 

O osso é um tecido conjuntivo mineralizado que é constantemente submetido a um 

processo de remodelação, no qual o osso antigo é reabsorvido pelos osteoclastos e um novo 

osso é formado pelos osteoblastos. Porém, esse é um complexo processo, regulado por uma 

variedade de células e de fatores biomecânicos (Datta et al.
31

,2008; Hadjidakis, Andorulakis
55

, 

2006), que pode variar de indivíduo para indivíduo. Em condições fisiológicas, o processo de 

remodelação está em constante equilíbrio. Entretanto, alterações nos parâmetros que regulam 

esse processo podem levar a modificações no metabolismo ósseo e resultar em doenças como, 

por exemplo, a osteoporose (Datta et al.
31

, 2015). Dessa forma, é importante o estudo dos 

fatores que podem interferir, tanto de forma prejudicial quanto de forma benéfica, no processo 



 

  

21 

de remodelação óssea. Nesse contexto, os bifosfonatos têm sido alvo de diversos estudos, pois 

se caracterizam como uma substância que tem influência sobre o metabolismo ósseo. 

Os BFs possuem mais afinidade ao tecido ósseo do que a qualquer outro tecido, sendo 

que essa preferência pelas superfícies mineralizadas os deixa em estreito contato com os 

osteoclastos (Russell
111

, 2011). Durante o processo de reabsorção óssea, os BFs ligados à 

superfície mineralizada são liberados no ambiente ácido, nas lacunas de reabsorção dos 

osteoclastos, os quais capturam então grandes quantidades da substância. Sabe-se que a 

principal ação dos BFs, em relação à remodelação óssea, é justamente sobre os osteoclastos, 

principalmente maduros, promovendo um efeito tóxico sobre essas células. Esse efeito resulta 

em alterações na morfologia celular, no citoesqueleto, na diferenciação, no recrutamento e na 

capacidade de reabsorção, podendo levar também à apoptose dessas céulas (Papapoulos
98

, 

2008, Russell
111

, 2011).  

No estudo de van Beek et al.
133

 (2003) foi verificado, em ratos, que células precursoras 

de osteoclastos, localizadas na superfície óssea, eram alvo dos BFs, os quais agiam inibindo a 

diferenciação dessas células em osteoclastos. Além disso, verificaram que esses 

medicamentos não tinham ação sobre células osteogênicas e que seu efeito ocorria pela 

inibição da prenilação de proteínas mediada pelo GGPP (geranilgeraniol difosfato) e não pela 

FPPS.  

Em outro estudo foi verificado, in vitro, que o efeito do tratamento com altas doses de 

zoledronato (ZOL) levou à redução do número de osteoclastos e osteoblastos por área, bem 

como diminuição dos níveis séricos de marcadores de atividade dessas células (Pozzi et al
102

, 

2009).  

 O ligante do receptor de ativação do fator nuclear kß (RANKL) é uma proteína da 

superfamília de receptores do fator de necrose tumoral (TNF) que, quando ligada ao seu 

receptor (RANK), é responsável pela diferenciação e ativação de células precursoras em 

osteoclastos maduros e pela inibição de sua apoptose (Kwan et al.
70

, 2004). Por outro lado, a 

osteoprotegerina (OPG), que é uma proteína também pertencente à família do TNF, pode 

ligar-se ao RANKL, impedindo assim a sua atividade, atuando como uma molécula inibidora 

da reabsorção óssea (Simonet et al.
114

, 1997; Boyce, Xing
15

, 2008).  

Alguns estudos demonstraram o efeito dos bifosfonatos sobre a tríade 

RANK/RANKL/OPG. Em estudo in vitro, foi demonstrado que o ácido zoledrônico, um 



 

  

22 

potente BF, pode inibir a reabsorção óssea por meio da redução da expressão transmembrana 

de RANKL e do aumento da secreção de OPG, em células semelhantes a osteoblastos (Pan et 

al.
97

, 2004). Tal efeito, da redução da expressão de RANKL, também foi verificado no 

processo alveolar da maxila de ratos tratados com alendronato, confirmando esse mecanismo 

da droga para a diminuição da reabsorção óssea (Bradaschia et al.
16

, 2013).  

Por outro lado, no estudo de Kim et al.
66

 (2002), embora tenha havido inibição da 

formação de osteoclastos e da reabsorção óssea em meio de cultura celular, o tratamento com 

pamidronato e alendronato não alterou a expressão gênica de RANKL e OPG.  

O efeito dos BFs sobre osteoclastos foi avaliado em estudo in vitro, no qual células 

RAW (células derivadas da linhagem de monócitos/macrófagos de murinos) diferenciaram-se 

em células semelhantes a osteoclastos (osteoclast-like cells) na presença de RANKL. Os 

resultados sugeriram um efeito inibitório dos BFs sobre a diferenciação dessas células e uma 

indução de sua apoptose, bem como prejuízo da capacidade de reabsorção (Abe et al.
1
, 2012). 

Martins et al.
81

 (2015) mostraram que baixas concentrações de ALD inibem a 

osteoclastogênese e diminuem a atividade de osteoclastos maduros, sem causar danos aos seus 

precursores. 

Outra célula importante no processo de remodelação óssea é o osteoblasto. Originária 

de células tronco mesenquimais, é responsável pela produção dos componentes da matriz 

óssea (Hadjidakis, Androulakis
55

, 2006). O papel dos osteoblastos na remodelação óssea está 

associado não somente à sua capacidade de síntese de tecido ósseo, mas também pelo fato de 

estimular a completa diferenciação dos osteoclastos, por meio da expressão de RANKL em 

células osteoblásticas estromais, e por secretar OPG (Boyce, Xing
15

, 2008).  

Com o avanço da idade, há uma redução do número de osteoblastos, sendo esses 

substituídos por adipócitos (Ali et al.
5
, 2005). Dessa forma, é importante a compreensão do 

efeito que os BFs podem exercer sobre essas células.  

Um estudo que avaliou o efeito do ALD sobre o estresse mecânico no osso maxilar, 

em modelo de doença de Paget juvenil em ratos, concluiu que o ALD, além de inibir a 

atividade osteoclástica, também teve efeito sobre os osteoblastos, inibindo sua atividade, tanto 

local quando sistêmica (Shoji et al.
121

, 2010). Essa ação inibitória nos dois tipos de células 

também foi encontrada em estudo com ZOL (Pozzi et al
102

, 2009).  



 

  

23 

Porém, outros estudos obtiveram resultados diferentes. No estudo de Lindtner et al.
75

 

(2014) foi constatado que o ALD e o ZOL aumentaram a diferenciação de osteoblastos a 

partir de células estromais da medula óssea de mulheres com osteoporose, ou seja, que esses 

bifosfonatos apresentaram um efeito osteoanabólico sobre a osteoporose. Da mesma forma, 

estudos com alendronato (Duque, Rivas
40

, 2007; Komatsu et al.
69

,2013) e com Pamidronato e 

Zoledronato (Reinholz et al.
105

, 2000), constataram que esses bifosfonatos favoreceram a 

formação óssea por meio de estímulos à proliferação, diferenciação e atividade de 

osteoblastos. Além disso, Viereck et al.
136

, (2002) demonstraram que os BFs têm efeito direto 

sobre os osteoblastos, promovendo aumento da secreção de OPG.  

A divergência entre esses resultados pode ser explicada pelas diferenças nas 

metodologias, tipos de BFs usados, duração do tratamento e, principalmente, pela diferença 

na concentração desses BFs. O efeito da concentração do medicamento sobre os osteoblastos 

pode ser visto nos estudos de Marolt et al.
80

 (2012) e Koch et al.
68

 (2010). No estudo de 

Marolt, em que foram utilizadas diferentes concentrações de pamidronato (10
-10

 a 10
-4 

M), in 

vitro, em linhagem de células semelhantes a osteoblastos primárias de humanos, foi 

observado que as maiores concentrações desse BF (10
-4

) apresentaram significativa 

capacidade de inibir a proliferação celular, diminuir a viabilidade e induzir a apoptose dessas 

células, quando comparadas a concentrações menores. Em contraste, no estudo de Koch, os 

BFs nitrogenados, ZOL e ibandronato, na mais alta dose testada (5x10
-5) 

aumentaram a 

expressão gênica de marcadores relacionados à diferenciação de osteoblastos, quanto 

comparados ao grupo controle. Entretanto, outro estudo com ZOL observou que altas doses 

do BF (maiores que 10
-7

) têm uma ação inibitória sobre o metabolismo e a proliferação de 

osteoblastos, enquanto na concentração de 10
-7

 houve aumento da proliferação dessas células 

(Corrado et al.
24

, 2010).  

Quando ocorre o aprisionamento de osteoblastos em lacunas da matriz óssea, estas 

células passam a ser denominadas osteócitos, sendo sua presença fundamental para a 

manutenção da homeostase óssea (Manolagas
78

, 2000). Logo, a ação dos BFs sobre essas 

células também tem sido alvo de estudos, os quais sugerem que esses medicamentos podem 

prevenir a apoptose de osteócitos e osteoblastos (Ploktin et al.
101

, 1999; Bellido, Plotkin
9
, 

2011). 

Em estudo empregando modelo de osteoporose em ovinos, foi constatado que a 

deficiência de estrógeno leva a um aumento no nível de apoptose de osteócitos e acúmulo de 



 

  

24 

microinjúrias. Porém, o tratamento com acido zoledrônico reduziu significativamente esses 

níveis de apoptose e, embora tenha promovido um aumento do acúmulo de microinjúrias, as 

fissuras produzidas foram menores quando comparado aos grupos sem tratamento (Orlaith 

Brennan et al.
17

, 2011).  

Em relação à angiogênese, Wood et al.
139

 (2002) demonstraram, in vitro, o efeito do 

ácido zoledrônico levando à inibição do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), do 

fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF) e da proliferação de células endoteliais. O 

estudo de Misso et al.
87

(2012) também constatou o efeito anti angiogênico do ácido 

zoledrônico, tendo sido verificado que o zoledronato inibiu a viabilidade e o crescimento de 

células endoteliais do cordão umbilical de humanos.  

Em pacientes com câncer e metástase óssea, doses baixas e intermitentes de ácido 

zoledrônico resultaram em diminuição dos níveis séricos de fator de VEGF, após o início da 

terapia (Santini et al.
116

, 2007).  

Em outro estudo, mulheres em fase pós-menopausa foram divididas em 2 grupos: 

Controle (cálcio e vitamina D) e Tratado (cálcio e vitamina D + 70mg/semana de ALD). 

Amostras de sangues foram coletadas nos 2 grupos no início do estudo e nos períodos de 3, 6 

e 12 meses, para detecção dos fatores pró-angiogênicos VEGF e ANG-1 (angiopoietina-1). 

No grupo tratado houve diminuição significativa da concentração de VEGF no período de 12 

meses, comparado ao inicial, e diminuição não significativa de ANG-1. O percentual 

combinado de VEGF e ANG-1 em 6 e 12 meses foi menor no grupo tratado em relação ao 

controle. Ainda nesse estudo, foram realizadas análises in vitro, nas quais foram testadas 

diferentes concentrações de ALD E ZOL (variando de 10
-12

 a 10
-6

) em linhagens de células 

osteoblásticas e osteocíticas. Foi verificado que concentrações mais altas de ALD e ZOL 

promoveram diminuição na produção de VEGF em linhagens de células osteoblásticas, sendo 

o efeito anti-angiogênico do ZOL mais pronunciado que do ALD. Porém, esses BFs não 

alteraram a produção de VEGF em linhagem de células osteocíticas (Ishtiaq et al.
62

, 2015). 

A avaliação de marcadores sistêmicos de reabsorção óssea também tem sido alvo de 

estudos relacionados aos BFs. O telopeptídeo carboxiterminal do colágeno tipo I (CTX), o 

telopeptídeo aminoterminal do colágeno tipo I (NTX) e a deoxipiridinolina (DPD) são 

produtos da degradação do colágeno que são liberados na circulação e na urina, sendo 

considerados importantes marcadores de reabsorção óssea (Seibel
119

, 2005).  



 

  

25 

Em estudo no qual o ALD foi administrado em ratas ovariectomizadas, foi constatado 

que esse medicamento levou a uma diminuição dos níveis de deoxipiridinolina (DPD) e 

osteocalcina no grupo tratado, quando comparado ao grupo controle (Da Paz et al.
29

, 2001). 

Grey et al.
54

 (2009) também verificaram que a administração de zoledronato diminuiu os 

níveis de marcadores de reabsorção (CTX e NTX) e de formação óssea (osteocalcina e P1NP 

- Propeptídeo amino terminal do procolágeno tipo I).  

Em avaliação com mulheres em período pós-menopausa, portadoras de osteoporose e 

submetidas ao tratamento com 35mg/semana de risedronato, foi verificado que os níveis 

urinários de CTX e DPD foram significativamente menores em todos os períodos avaliados 

(1, 3 e 6 meses após o início do tratamento) quando comparados aos níveis das amostras 

coletadas no início do tratamento. Por outro lado, os níveis séricos de osteocalcina foram 

significativamente menores apenas nos períodos de 3 e 6 meses (Karadag-Saygi et al.
64

, 

2011). 

Quanto à interrupção do tratamento com ALD, em mulheres portadoras de 

osteoporose, foi observado um aumento nos níveis séricos de CTX e P1NP nos períodos de 3, 

6, 9 e 12 meses após interrupção da droga (Silva et al.
122

, 2011). 

Embora ainda não estejam completamente elucidadas as vias e os mecanismos pelos 

quais os bifosfonatos agem sobre o metabolismo ósseo, a ação desses medicamentos sobre o 

processo de remodelação e reparo ósseo, como um todo, tem sido confirmada.  

O efeito do ALD sobre o reparo do tecido ósseo foi demonstrado em estudo em ratos, 

nos quais foi administrado 1 mg/kg de alendronato previamente (2 dias antes) à extração 

dentária e a cada 4 dias até o sacrifício (3, 7, 10 e 14 dias após procedimento cirúrgico). 

Foram realizadas análises morfométrica (micro-CT), morfológica com hematoxilina e eosina, 

além da detecção da enzima TRAP (Fosfatase ácida resistente ao tartarato) – marcador de 

osteoclastos. Foi observado um rápido aumento na quantidade de células TRAP+ no 3º dia, 

seguido de uma queda nos períodos seguintes, para ambos os grupos. Inicialmente foi 

verificado, para o grupo tratado, menor volume de osso neoformado (7 dias) em relação ao 

grupo controle; porém, nos períodos de 14 e 28 dias, esse volume foi maior no grupo que 

recebeu o medicamento em relação ao grupo controle. Tal achado demonstrou que o BF 

promoveu um atraso no início da reparação do tecido ósseo (Hikita et al
58

, 2009).  



 

  

26 

Esse efeito também foi observado no estudo de Aguire et al.
3
 (2010), em que ratas 

foram submetidas a tratamento com ALD (15 e 150  µg kg
-1

) por 4 semanas antes da extração 

do 1º molar inferior, sendo o medicamento mantido até o dia do sacrifício (10, 21, 35 e 70 

dias). Foi observado, nas duas doses testadas, por meio de análise histomorfométrica, que 

houve diminuição transitória na vascularização e no volume de tecido ósseo no período de 10 

dias; porém, nos períodos seguintes o sítio de extração foi progressivamente preenchido, de 

forma semelhante nos animais tratados e controle. Houve ainda um atraso na reabsorção do 

osso interdental nos sítios de extração dos animais tratados com ALD, no período de 10 dias. 

Dessa forma, os autores concluíram que o ALD promoveu um atraso no reparo ósseo nos 

estágios iniciais, após a realização das extrações. 

Em contraste, um estudo que avaliou o efeito do ALD sobre o reparo ósseo em ratas 

ovarectomizadas (OVX), constatou que a droga favoreceu o processo de reparo. Os animais 

receberam o tratamento com ALD (1 mg/kg/dia) durante 1 semana após a extração do 1º 

molar superior esquerdo. Análises de microCT foram realizadas no início do estudo e em 2, 4 

e 6 semanas pós extração. Foi observada maior densidade óssea no período de 4 semanas no 

grupo recebeu o tratamento com ALD comparado ao grupo controle (OVX + solução saliva). 

Embora não tenha havido diferença significativa em relação à perda de altura da crista 

alveolar, o grupo OVX-ALD mostrou uma tendência a apresentar menor reabsorção óssea ao 

longo dos períodos. Os autores concluíram que o ALD teve efeito positivo em um modelo de 

reparo ósseo associado à deficiência estrogênica (Jee et al.
63

, 2010). 

Resultado similar foi obtido no estudo de Tanoue et al.
128

 (2015), no qual os autores 

verificaram que a administração de 100µg/kg/dia ALD, a curto prazo (3, 5, 7, 10 e 21 dias), 

após a extração do 1º molar superior teve o potencial de promover aumento da formação 

óssea, podendo ter um impacto positivo sobre o reparo em sítios de extração dentária.  

Em estudo que teve como objetivo avaliar o efeito do ALD sobre o reparo em sítios de 

extração, 15 ratas receberam injeções subcutâneas de alendronato (2,5mg/kg/dia) durante 14 

dias antes da realização da extração do 2º molar inferior, sendo a medicação mantida por 7, 14 

e 21 dias após a realização do procedimento cirúrgico. O grupo controle recebeu injeção 

salina nos mesmos períodos. As análises, histológica e histomorfométrica, revelaram que, em 

todos os períodos, os animais que receberam o tratamento com ALD apresentaram menores 

níveis de osso neoformado na região apical ao sítio de extração, quando comparados ao grupo 

controle. A presença de osteoclastos, avaliada por meio de análise histoquímica para TRAP, 



 

  

27 

revelou que o grupo controle em todos os períodos apresentou maior expressão de células 

TRAP+, enquanto no grupo tratado além da menor expressão, as células estavam em apoptose 

ou em estágio latente, evitando que ocorresse a reabsorção da crista alveolar após a extração. 

Em relação à análise imunohistoquímica, foi observado aos 7 dias, que o grupo controle 

apresentou mais vasos sanguíneos em relação ao grupo alendronato, sendo que nos outros 

períodos os grupos apresentaram imunomarcações semelhantes. Já em relação à 

imunomarcação para duas proteínas da matriz óssea – OPN (osteopontina) e BSP 

(sialoproteína óssea) – estas foram semelhantes para ambos os grupos em todos os períodos 

(Yamamoto-Silva et al.
141

, 2013). 

No estudo de Kim et al.
65

(2011), os animais tiveram os primeiros molares superiores 

extraídos, sendo que em uma hemimaxila foi realizada a instalação de implante, 

imediatamente após a extração do dente. Os animais receberam aplicação sistêmica de ALD 

(5 mg/kg, 3x /semana), durante 4 semanas previamente à realização dos procedimentos 

cirúrgicos e até o momento do sacrifício (3, 7, 14 e 28 dias após cirurgia). Foram realizadas 

análises histológicas (H&E, Tricrômico de Masson), histoquímica (TRAP), 

imunohistoquímica (Colágeno tipo I – COL I) e mensuração do contato osso/implante. Nos 

sítios de extração não foram encontradas diferenças entre os grupos ALD e controle, em 

relação à neoformação óssea, enquanto nos sítios que receberam o implantes houve percentual 

significativamente maior de área óssea no período de 14 dias para o grupo ALD. Em ambos 

os sítios avaliados, não houve diferença entre os grupos quanto à quantidade de osteoclastos, 

porém foi observada maior quantidade de lacunas vazias no grupo ALD. Houve expressão de 

COL I para ambos os grupos no período de 7 dias, nos sítios de extração. Não houve diferença 

no contato osso/implante entre o grupo ALD e controle. Os resultados demonstraram que o 

ALD prejudicou a função dos osteoclastos, porém não prejudicou a função dos osteoblastos 

nos sítios avaliados. 

O efeito positivo dos bisfosfonatos no reparo de defeitos ósseos foi observado por P. 

D’Aoust et al.
28

(2000). Nesse estudo, foram realizados defeitos (aproximadamente 0.8 mm) 

nos lados direito e esquerdo do osso parietal de ratos. Após a cirurgia, os animais foram 

submetidos a tratamento com injeções de etidronato (HEBP - 1-hidroxietilideno-1,1-

biofosfonato), 15 mg/kg/dia, ou de solução salina (controle). Os animais foram sacrificados 

após 1 e 2 semanas. Na avaliação morfométrica foi verificado que os grupos tratados 

apresentaram maior percentual de fechamento da ferida em relação ao grupo controle, sendo a 



 

  

28 

maioria do defeito preenchido por matriz osteóide. Na análise imunohistoquímica foi 

observado aumento da expressão de osteopontina (OPN), sugerindo aumento na diferenciação 

dos osteoblastos.  

O efeito negativo dos bifosfonatos sobre o processo de reparo foi observado no estudo 

de Toker et al.
131

(2012). Foram realizados defeitos críticos no lado direito das calvárias de 

ratos, os quais foram preenchidos com enxerto ósseo sintético somente (grupo MBCP); 

enxerto embebido em solução de 1 mg/mL de ALD por 5 minutos (grupo MBCP + ALD 

local); e enxerto associado ao alendronato sistêmico (MBCP + ALD sistêmico/0,01 

mg/kg/dia). Os animais foram sacrificados após 8 semanas, sendo realizadas análises 

histológica e histomorfométrica. Foi detectado número significativamente maior de lacunas de 

reabsorção, de osteoclastos e de osteoblastos nos grupos que receberam o enxerto + ALD 

sistêmico. Quanto à área média de osso novo, não foram encontradas diferenças significativas 

entre os grupos que receberam o enxerto. Nesse estudo, a administração sistêmica ou 

aplicação local de alendronato não favoreceu a regeneração óssea associada ao enxerto. 

Em outro estudo realizado pelo mesmo grupo acima citado, foram seguidos os 

mesmos protocolos de divisão dos grupos, dosagem e tempo de aplicação do ALD, sacrifício 

e de análises, porém foi empregado enxerto autógeno (obtido do lado esquerdo das 

respectivas calvárias). Nesse segundo estudo, tanto os animais que receberam enxerto ósseo 

autógeno + ALD local, quanto o grupo que recebeu enxerto ósseo autógeno + ALD sistêmico, 

apresentaram quantidade significativamente maior de osso neoformado, comparado ao grupo 

controle. O número de osteoblastos e a área total de osso também foi significativamente maior 

no grupo enxerto + ALD local quando comparado ao grupo controle. Dessa forma, foi 

possível verificar que o ALD foi capaz de promover aumento da formação óssea quando 

associado a enxertos autógenos, em modelo de defeito ósseo em calvárias (Toker et a.
130

, 

2012). 

Akyol et al.
4
 (2015) avaliaram o efeito da associação irrigação com ALD/aplicação de 

laser de baixa potência sobre o reparo de defeitos ósseos em ratos. Foram confeccionados 

defeitos nas epífises distais dos ratos e, no transcirúrgico, foi realizada a irrigação com ALD e 

subseqüente aplicação do laser na região do defeito. Foi concluído que essa associação levou 

a uma melhora na formação óssea, promovendo assim um efeito benéfico sobre o reparo 

ósseo.  



 

  

29 

Já no estudo Wang et al.
137

 (2016), foi desenvolvido um conjugado de microesferas de 

PGLA (ácido láctico co-glicólico) com ALD. Os ratos foram divididos em 3 grupos: PLGA 

10mg, PLGA-ALD 5mg e PLGA-ALD 10 mg. Foram confeccionados defeitos nos fêmures 

esquerdos, os quais foram preenchidos seguindo o descrito para cada grupo, enquanto os 

fêmures direitos foram usados como controle. Os animais foram sacrificados 6 semanas após 

a cirurgia. A forma máxima e energia de absorção foram maiores para o PLGA-ALD 10mg, 

comparado ao PLGA, melhorando assim as propriedades mecânicas do osso. Na análise de 

microtomografia computadorizada (micro-CT) foi verificado que os grupos PLGA-ALD 5 e 

10mg apresentaram volume de osso trabecular duas vezes maior que o PLGA. A análise 

histológica demonstrou que o PLGA-ALD acelerou a formação de fibras colágenas durante a 

formação óssea. Por fim, foi detectado maior imunomarcação de BMP-2 (proteína 

morfogenética óssea-2) – marcador relacionado à diferenciação de células mesenquimais em 

osteoblastos – no osso trabecular em ambos os grupos PLGA-ALD em comparação ao grupo 

PLGA. Assim, os autores concluíram que esse conjugado pode melhorar o processo de reparo 

e a qualidade do tecido ósseo. 

        Em um estudo com coelhos, foram confeccionados defeitos de 5 mm nas calvárias, os 

quais foram preenchidos com um disco composto de PLGA + pamidronato. Os animais foram 

sacrificados após 1, 2, 4, 6 e 8 semanas. Por meio de análises radiográfica e histológica, foi 

observado que o medicamento diminuiu a formação óssea e que essa formação foi mais lenta. 

Além disso, de um modo geral, houve menor formação de estruturas vasculares nos grupos 

tratados com pamidronato. Assim, os autores concluíram que o pamidronato teve efeito 

inibitório sobre o reparo ósseo (Choi et al.
22

, 2007). 

O efeito dos bifosfonatos na osseointegração também tem sido alvo de diversos 

estudos.  

Huja et al.
59

 (2011) realizaram extrações em cães e instalaram mini-implantes na 

maxila e mandíbula. Os autores observaram que a administração de 0,1 mg/kg/mês de ácido 

zoledrônico (ZA), durante 4 meses, promoveu uma supressão do turnover ósseo na região 

adjacente ao mini-implante e nos sítios de extração. 

Estudos que avaliaram o efeito do alendronato na osseointegração de implantes em 

modelo de deficiência de estrógeno constataram que animais submetidos ao tratamento com 

ALD apresentaram os maiores valores de torque de remoção dos implantes, provavelmente 



 

  

30 

em função do aumento da massa óssea que esse medicamento promove (Giro et al.
52

, 

2007;Narai, Nagahata
94

, 2003).  

Da mesma maneira, Viera-Negron et al.
135

 (2008), por meio de análises histológicas e 

radiográficas, constataram que a administração subcutânea de 5 mg/kg de ALD, 3x/semana, 

promoveu aumento na densidade óssea ao redor dos implantes e melhora na osseointegração.  

Um estudo também realizado com ratas, em modelo de deficiência estrogênica, no 

qual foi avaliado o efeito do ALD, por longo período, após a ossseointegração de implantes, 

foi observado que o medicamento é efetivo na prevenção de perda de massa óssea ao redor 

desses implantes e em aumentar a densidade óssea, especialmente no osso esponjoso (Giro et 

al.
51

, 2008). Porém, embora esse efeito benéfico seja confirmado, a taxa de aposição mineral e 

de marcadores relacionados à remodelação óssea (OCN e DPD) foram significativamente 

diminuídos pelo ALD, o que pode sugerir um comprometimento na qualidade desse tecido 

(Giro et al.
50

, 2011).   

Verzola et al.
134

 (2015), avaliou o efeito do tratamento com 1 mg/kg/semana de ALD, 

a longo prazo (120 dias), em ratas que receberam implantes nas tíbias. Os animais foram 

sacrificados aos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 e 60 após instalação dos implantes. Os autores 

verificaram que o tratamento com ALD acelerou a osseointegração, aumentou a densidade 

óssea e promoveu maior resistência à fratura e tenacidade nos fêmures, porém não melhorou a 

propriedade de deformação elástica do tecido.  

Embora diversos estudos comprovem a ação dos BFs sobre o metabolismo do tecido 

ósseo, diante da crescente utilização desses medicamentos por uma grande parcela da 

população, é necessário um maior entendimento das vias e dos mecanismos pelos quais esses 

medicamentos agem, especialmente a longo prazo. Esse entendimento é importante para que 

se consiga ajustar dose e duração do tratamento, visando potencializar os efeitos benéficos e 

diminuir os efeitos colaterais. Deste modo, o objetivo do presente estudo foi avaliar a 

dinâmica do reparo de defeitos críticos confeccionados em calotas de ratas adultas tratadas 

com ALD. 



 

  

31 

3 OBJETIVO 

 

 

 

O objetivo desse estudo foi avaliar, em calvárias de ratas, a influência da 

administração de alendronato, a longo prazo, sobre o processo de reparação óssea. Foi 

analisado ainda, o impacto sistêmico do medicamento sobra densidade mineral óssea e 

sobre os marcadores de remodelação óssea. 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

32 

4MATERIAL E MÉTODO 

 

Animais 

Para esse estudo foram utilizadas 160 ratas Wistar com três meses de idade, pesando 

entre 200 e 250g. Os animais foram mantidos em gaiolas de propileno (Movart, Ribeirão 

Preto), em grupos de cinco, sendo alimentados com ração sólida padrão para animais de 

laboratório e água ad libitum. A temperatura foi controlada em 25°C e a umidade em 55%, 

sendo o tempo de exposição ao claro de 12 horas e 30 minutos e, ao escuro, de 11 horas e 30 

minutos. 

Este estudo foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação 

Animal da Faculdade de Odontologia de Araraquara-UNESP (Proc.nº16/2010) (ANEXO). 

 

Desenho do estudo 

Os animais foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos experimentais: grupo 

controle (CTL, n=80) e grupo alendronato (ALD, n=80). Os animais do grupo ALD 

receberam administração subcutânea de alendronato, na concentração de 1mg/Kg/semana
23, 58

 

(diluído em água destilada), enquanto os animais do grupo CTL receberam administração 

subcutânea de placebo (solução salina estéril) uma vez por semana, até o período pós-

cirúrgico. Após 120 dias de tratamento, os animais de ambos os grupos foram submetidos à 

confecção de um defeito crítico na calvária. Dez animais de cada grupo foram sacrificados, 

por aprofundamento da anestesia, nos dias 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45 e 60 dias após confecção 

do defeito. No dia do sacrifício foram coletadas amostras de sangue e urina. O peso dos 

animais foi controlado semanalmente durante todo o experimento para o ajuste da dose da 

medicação. A Figura 1 mostra o desenho experimental do estudo. 

 

 

 

 



 

  

33 

Figura 1 - Desenho experimental do estudo 

 

Fonte: Autoria própria 

 

Cirurgia para confecção de defeitos críticos na calvária 

Os animais foram anestesiados por uma combinação de cloridrato de ketamina 

(Ketamina Agener – Agener União), na concentração de 0,08ml/100g, e cloridrato de xilazina 

2% (Rompum - Bayer), na concentração de 0,04ml/100g de massa corpórea. Posteriormente, 

foi realizada a tricotomia da região superior do crânio do animal, seguida de antissepsia com 

gaze estéril embebida em solução de iodopovidona. Uma incisão em forma de ferradura foi 

realizada na porção central, com o objetivo de permitir acesso cirúrgico à calvária. Em 

seguida, os tecidos foram divulsionados para exposição do tecido ósseo. 

Foram confeccionados defeitos ósseos circulares, com 6 milímetros de diâmetro, na 

porção mediana da calvária. A remoção total do tecido ósseo foi realizada com uma fresa 

trefina (Neodent, Brasil) sob constante irrigação, iniciando imediatamente após o vértice da 

sutura posterior craniana do animal. Após a confecção do defeito, as bordas da ferida foram 

suturadas em planos, sendo empregado fio reabsorvível (Vicryl 5-0 – Johnson & Johnson) 

para o plano profundo enquanto para o plano superficial foi empregado fio de seda (Seda 4-0 

– Johnson & Johnson).  

No pós-operatório os animais receberam penicilina associada à estreptomicina 

(Multibiótico Veterinário®; Vital Farma Ltda) na dosagem 0,1 ml/kg de peso, em dose única, 

e corticóide intramuscular na dosagem de 5mg/kg de (Cort-Trat®; A Química, Santa Marina 

S.A.), por três dias consecutivos. 



 

  

34 

Sacrifício dos animais 

Os animais foram sacrificados nos períodos experimentais acima descritos, por 

aprofundamento da anestesia, tendo sido removidas as calvárias e o fêmur esquerdo. Os 

espécimes foram fixados em formaldeído tamponado 4%, durante 24 horas. 

 

Densitometria Óssea 

A análise da densidade mineral óssea (BMD) foi realizada por Dual-energy X-ray 

Absorptiometry (DXA), em 10 fêmures esquerdos de cada grupo e para cada período de 

avaliação, para a constatação do efeito sistêmico do medicamento. Para isso foi utilizado um 

densitômetro (Discovery-A SN: 80999; Hologic Inc, Bedford, USA), empregando-se um 

software fornecido pelo fabricante do aparelho, para pequenos animais, no modo “High 

Resolution”. Para calibração do aparelho, foi realizado um teste previamente à leitura das 

amostras, o qual consiste em medir a densidade de um bloco padrão (“phantom”) composto 

por três camadas sintéticas, de constituição semelhante ao osso, com área e conteúdo mineral 

conhecido. A precisão da DXA, na determinação da BMD, foi avaliada pela mensuração do 

coeficiente de variação, expresso como uma porcentagem da média. Para tanto, cinco medidas 

consecutivas, de uma mesma amostra, foram realizadas na região de interesse, obtendo-se 

neste estudo um coeficiente de variação de 1,8%. A delimitação das regiões analisadas foi 

realizada com auxílio de ferramentas existentes no programa do aparelho, selecionando 

sempre o mesmo espaço a fim de padronizar as medidas de todas as sub-regiões. Foram 

efetuadas medidas de BMD global e de sub-regiões do fêmur (Figura 2). 

 

 

 

 

 

 



 

  

35 

Figura 2 - Imagem obtida do fêmur por DXA. Delimitação global e de sub-regiões para 

análise. 

 

Fonte: Autoria própria 

 

Avaliação da concentração de marcadores de reabsorção e formação óssea 

  Um dia antes do sacrifício os animais foram colocados em gaiolas metabólicas para 

coleta de urina de 24 horas e, no dia do sacrifício, por meio da punção da artéria caudal, foram 

coletadas amostras de sangue (1,5ml). As amostras de sangue foram submetidas à 

centrifugação a 1800 RPM, durante 15 minutos a 4ºC, para separação do soro. 

A avaliação da concentração dos níveis urinários de Deoxipiridinolina (DPD; 

MicroVue – Bone Health, Quidel – San Diego, USA), corrigida pela depuração da creatinina 

urinária de 24 horas (Nm.DPD/nMCr), e a avaliação da concentração dos níveis séricos do 

Telopeptídeo carboxiterminal do colágeno tipo I - CTX-I (RatLaps® ; Immunodiagnostic 

Systems Inc, Boldon – United Kingdom), Propeptídeo amino terminal do procolágeno tipo I  - 

P1NP (Rat/Mouse; Immunodiagnostic Systems Inc, Boldon – United Kingdom) e 

Osteocalcina (Rat-MID®; Immunodiagnostic Systems Inc, Boldon – United Kingdom) foram 

realizadas por meio de ensaio imunoenzimático ELISA. Para cada reação, foram seguidas as 

instruções específicas dos fabricantes dos kits comerciais. 

 

R1: Epífise proximal 

R2: Epífise distal 

R3: Diáfase 

 



 

  

36 

Preparação dos cortes descalcificados de tecido ósseo  

Após a fixação em formaldeído tamponado 4% por 24 horas, cinco espécimes de 

calvária relativos a cada grupo, em cada período de avaliação, foram lavados em água 

corrente e descalcificados em solução de EDTA 10% (pH 6.9) por 60 dias, à temperatura 

ambiente, com troca da solução em dias alternados. As calvárias foram então reduzidas, ou 

seja, foram cortadas no sentido transversal, resultando assim em duas amostras para cada 

animal. Essas amostras foram submetidas à desidratação com banhos sucessivos de etanol em 

graduações crescentes, diafanização com xilol, infiltração em parafina líquida a 60°C e, 

finalmente, inclusão em parafina.  

Para cada bloco foram obtidos cortes semi-seriados de 4 µm de espessura, os quais 

foram montados em lâminas silanizadas (Perfecta, São Paulo - SP), contendo três 

cortes/lâmina, totalizando aproximadamente 20 lâminas. A desparafinização foi realizada por 

meio de três incubações (5, 3 e 3 minutos) em xilol, seguidas por uma incubação de três 

minutos em etanol absoluto. Em seguida, foi realizada a reidratação gradual por meio de 

imersão dos cortes em soluções decrescentes em concentração de etanol (95%, 90% e 70%) e 

água destilada (duas lavagens de três minutos cada). 

 

Imuno-histoquímica 

Para a imunolocalização das células positivas para os receptores RUNX2, OPN, 

OPG, Catepsina K, RANKL, INOS e VEGF (Abcam, USA) os cortes foram submetidos a um 

processo de recuperação antigênica. Para os anticorpos OPN, RUNX2 e INOS o processo de 

recuperação antigênica foi realizado com uma solução de tris-EDTA com pH 9.0, por 20 

minutos a 96°C. Já para VEGF, OPG, Cathepsina K e RANK L, a recuperação antigênica foi 

realizada em solução de citrato com pH 6.0, por 20 min a 96°C. Após o processo de 

recuperação antigênica foram realizadas três lavagens consecutivas em água destilada, de três 

minutos cada, sendo os cortes incubados em uma solução de peróxido de hidrogênio 3% (para 

inibição da peroxidase endógena) por 30 minutos, sem luz e à temperatura ambiente. Foram 

realizadas novamente três lavagens sucessivas em água destilada, seguida da incubação com 

Protein Block Serum Free (Dako, North América) por 30 minutos para todos os anticorpos, 

com exceção da Catepsina K, no qual o tempo de Protein Block Serum Free foi de uma hora. 

Essas incubações foram realizadas em temperatura ambiente para inibição de reações 



 

  

37 

inespecíficas. Após sucessivas lavagens em água destilada, o anticorpo primário foi incubado, 

em uma concentração específica para cada anticorpo, durante 12 a 14 horas, a 4°C, em câmara 

úmida. Finalizado o período de incubação do anticorpo primário os cortes foram submetidos 

novamente a três lavagens sucessivas em água destilada, sendo então incubados com uma 

gota do anticorpo secundário biotinilado do kit de detecção universal (LSAB+System – HRP, 

Dako, North America), durante 30 minutos. 

A detecção e localização da expressão do receptor, para cada marcador, 

foideterminada pelo complexo avidina-biotina-peroxidase. Assim, após incubação do 

anticorpo secundário e sucessivas lavagens, os cortes foram incubados em uma solução de 

estreptavidina conjugada com peroxidase (LSAB+System – HRP, Dako, North America) por 

30 minutos. A revelação da coloração foi realizada por meio da utilização da 

diaminobenzidina (Liquid DAB + Substratechromogen System, Dako, North America) com 

tempos variando entre 10 e 40 segundos, dependendo do anticorpo. Subsequentemente, os 

cortes foram contra-corados com hematoxilina de Carazzi, desidratados e selados com 

lamínula para permitir a análise em microscopia óptica. 

Foram obtidas imagens de três regiões selecionadas nas calvárias (lados direito e 

esquerdo e região central do defeito), com auxílio de um microscópio de luz Leica DM2500 

(Leica Microsystems, Germany), utilizando o programa LAS - Leica Application Suite V3 

(Leica Microsystemns, Germany). Cada imagem foi realizada com objetiva de 10x, resultando 

em um aumento final de 100x. As regiões foram selecionadas tendo como parâmetros os 

limites direito e esquerdo das calvárias (Figura 3). 

Para a análise qualitativa ordinal das imunomarcações, para todos os anticorpos 

avaliados, foram atribuídos os seguintes escores: negativo (-), positivo (+), superpositivo (++) 

ou hiperpositivo (+++). Para realização da análise estatística, os escores foram convertidos em 

percentuais: 0%, 20% (10 a 30%), 60% (50 a 70%) e 90% (80 a 100%)
34, 42, 103

. A atribuição 

dos escores foi realizada por um único examinador, experiente e previamente calibrado. 

 

 

 

 



 

  

38 

Figura 3 – Fotomicrografia ilustrativa das regiões de interesse para análise de Imuno-

histoquímica. Barras: 100 µm. 

 

Fonte: Autoria própria 

 

Avaliação da área de tecido ósseo mineralizado e matriz osteóidee da distância linear 

entre as bordas do defeito 

Para análise da quantidade de tecido ósseo mineralizado e de matriz osteóide, bem 

como para avaliação do grau de fechamento do defeito, as lâminas foram coradas com 

Tricrômico de Goldner. Para essa coloração foram utilizados cortes descalcificados da 

calvária (4µm de espessura), os quais foram submetidos ao processo de deparafinização e 

reidratação, sendo posteriormente incubados em solução de fluido de Bouin, por uma hora, a 

56°C. Após o período de incubação, os cortes foram lavados em água corrente por três 

minutos e então enxaguados em água destilada, seguida da incubação com hematoxilina de 

Weigert por 10 minutos, em temperatura ambiente. As amostras foram então lavadas em água 

corrente por 10 minutos e enxaguadas três vezes em água destilada. Em seguida, foram 

incubadas em fucsina ácida de Ponceau, por cinco minutos, em temperatura ambiente. Após o 

período de incubação, as amostras foram lavadas em ácido acético 1% durante cinco minutos 

e incubadas em solução de PhosphomolybdicAcid-Orange G por dois minutos. Em seguida, 

foram enxaguadas novamente em ácido acético 1%, por 30 segundos, e incubadas em solução 

de Light Green por cinco minutos. Após esse período, as amostras foram lavadas em ácido 

acético 1% por cinco minutos e submetidas ao processo de desidratação, sendo então 

finalizadas por processo histológico de rotina.  

Foram obtidas imagens de duas regiões selecionadas nas calvárias, lado direito e 

esquerdo do defeito, com auxílio do microscópio de luz Leica DM2500 (Leica Microsystems, 

Germany), utilizando o programa LAS - Leica Application Suite V3 (Leica Microsystemns, 



 

  

39 

Germany), com objetiva de 10x (Figura 4). As imagens foram analisadas pelo software 

analisador de imagem Image J (1.42q – National Institute of Health – USA), sendo 

considerada como 100% a área de tecido ósseo total. A partir da área total, foram mensuradas 

as áreas com coloração vermelha, representando tecido ósseo maduro, e com coloração verde, 

representando matriz osteóide. Os resultados de tecido ósseo maduro e matriz osteóide foram 

apresentados como um percentual da área total mensurada. 

Figura 4 – Fotomicrografia ilustrativa de cortes corados com Tricrômico de Goldner para 

mensuração da área de osso maduro e matriz osteóide. Aumento final de 100x. Lado esquerdo 

(A)  Lado direito (B). Barras: 100µm. 

 

Fonte: Autoria própria 

Para avaliação do grau de fechamento do defeito, foram obtidas imagens de toda 

extensão do defeito com o Estereomicroscópio MZ-6 (Leica Microsystems, Germany), em 

objetiva de 2,5mm (Figura 5). Essas imagens foram analisadas com auxílio do mesmo 

software citado acima, sendo realizadas medidas lineares da distância entre as bordas do 

defeito. 

Figura 5 – Fotomicrografia ilustrativa de corte corado com Tricrômico de Goldner para 

mensuração da extensão linear entre as bordas do defeito.  Aumento de 2,5x. Barra: 1,0mm. 

F

onte: Autoria própria 



 

  

40 

Avaliação do número de células TRAP+ (Fosfatase ácida resistente ao tartarato-

positivas) 

Foi realizada também a avaliação da quantidade de osteoclastos na calvária, por meio 

da contagem de células TRAP positivas (TRAP+). Para isso, os cortes (4µm de espessura) 

foram submetidos à coloração específica para osteoclastos (TRAP). As amostras foram 

submetidas ao processo de deparafinização e reidratação, sendo posteriormente incubadas em 

0.1M Tris HCl, por 30 minutos, a 37
o
C. Foi então preparada a solução contendo PVA, MgCl2, 

NaNO2 e KNa tartarato, sendo essa solução pipetada sobre as amostras, as quais foram 

incubadas por mais duas horas a 37
o
C. As amostras foram lavadas duas vezes em água MiliQ 

na temperatura de 70
o
C para encerrar a reação. Após a coloração de TRAP, foi realizada a 

coloração com hematoxilina de Carazzi, sendo então finalizada por processamento histológico 

de rotina. Foram selecionadas duas regiões do defeito, uma do lado esquerdo e outra do lado 

direito, com auxílio do microscópio de luz (Leica DM2500, Leica Microsystems, Germany) 

em objetiva de 20x. Primeiramente foi realizada a mensuração da área total de tecido ósseo. 

Em seguida, foi realizada a contagem de osteoclastos, sendo consideradas para isso apenas as 

células com coloração vermelha, contendo três ou mais núcleos. O número de osteoclastos foi 

avaliado em relação à área de tecido ósseo.  

 

Análise morfológica  

 Para essa análise, cortes semi-seriados de 4 µm de espessura foram corados com 

Hematoxilina & Eosina (H/E). As lâminas foram submetidas a duas incubações seguidas em 

xilol (três minutos cada), seguidas de incubações subsequentes de álcool/xilol, álcool 

absoluto, álcool 90% e álcool 70% (três minutos cada). Em seguida, foi realizada uma 

lavagem de três minutos em água destilada. Após a lavagem, os cortes foram corados com 

Hematoxilina, durante 90 segundos. Após esse período as lâminas foram lavadas em água 

corrente por sete minutos, sendo então realizada a coloração com Eosina durante 10 segundos. 

Após esse período foram realizadas três lavagens rápidas, sendo as lâminas incubadas em 

álcool 95% (quatro minutos), seguida de duas incubações em álcool absoluto (quatro minutos 

cada). Em seguida, foi realizada incubação em álcool/xilol (três minutos), seguida de duas 

incubações em xilol (três minutos cada). Após a última incubação em xilol, as lâminas foram 

seladas com lamínulas para permitir a análise por microscopia óptica. Para isso, foram obtidas 



 

  

41 

imagens das regiões de interesse, utilizando-se um microscópio de luz Leica DM2500 (Leica 

Microsystems, Germany) empregando o programa LAS - Leica Application Suite V3 (Leica 

Microsystemns, Germany). A avaliação morfológica foi realizada por meio de análise 

descritiva dos diferentes aspectos teciduais observados nos diferentes períodos para cada 

grupo (CTL e ALD). Os seguintes aspectos foram observados: normalidade do tecido ósseo, 

presença de células mononucleadas (polimorfonucleares, linfócitos, plasmócitos e 

macrófagos), lacunas de osteócitos vazias, presença de osteoclastos (células multinucleadas 

contendo três ou mais núcleos) e osteoblastos. 

Análise estatística 

A avaliação da normalidade dos dados foi realizada por meio do teste de Shapiro-

Wilk. Na análise intergrupos dos dados paramétricos (Densitometria óssea e Avaliação dos 

marcadores de formação e perda óssea), dentro de cada período, foi empregado o teste t-não 

pareado. Para avaliação da evolução temporal desses dados, dentro de cada grupo 

(intragrupo), foi empregado o teste Anova complementado pelo teste post-hoc de Tukey. Para 

análise intragrupos de dados não paramétricos (Imuno-histoquímica, área de tecido ósseo 

maduro e matriz osteóide, fechamento do defeito e células TRAP+/área) foi utilizado o teste 

de Kruskal-Wallis complementado pelo teste post-hoc de Dunn, enquanto para análise 

intergrupos foi empregado o teste de Mann–Whitney. O software GraphPadPrism 5 (San 

Diego, CA, USA) foi utilizado para execução das análises estatísticas. Todos os testes foram 

aplicados com nível de significância de 5% (p<0.05). 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

42 

5 RESULTADO 

 

Peso dos animais 

 Em relação ao peso dos animais, não foi verificada influência da aplicação do 

alendronato, não havendo diferença significativa entre os grupos durante e ao final do 

tratamento (Figura 6). 

Figura 6 - Peso dos animais no dia do sacrifício para ambos os grupos: controle (CTL) 

e alendronato (ALD). Valores expressos em média e desvio padrão. 

 

p>0,05 - Anova com teste post-hoc de Tukey 

Fonte: Autoria própria 

 

Densitometria óssea 

Na análise dos dados referentes à densitometria óssea global e das sub-regiões 

do fêmur (R1-epífise proximal; R2-epífise distal; R3-diáfise), foram observados valores 

de densidade mineral óssea (BMD) significativamente superiores para o grupo 

alendronato (ALD) quando comparado ao grupo controle (CTL), em cada período. 

 A análise da epífise proximal demonstrou que o ALD apresentou maiores 

valores de BMD nos períodos de 5, 30 e 45 dias (p<0.01) em relação ao CTL. A análise 

intragrupo, levando-se, portanto, em consideração a evolução temporal, demonstrou que 



 

  

43 

o CTL não apresentou alterações estatisticamente significantes na região de epífise 

proximal. Já no ALD, houve um aumento estatisticamente significante da BMD nos 

períodos de 30 (p<0.001), 45 (p<0.01) e 60 dias (p<0.05) em relação ao período de 15 

dias (Tabela 1).  

Na epífise distal, o ALD apresentou maiores valores de BMD nos períodos de 5 

(p<0.001), 10 (p<0.01), 20 (p<0.05), 25 (p<0.001), 30 (p<0.001), 45 (p<0.001), e 60 

dias (p<0.001) em comparação ao grupo CTL. Na avaliação intragrupo, para o CTL foi 

verificado um aumento significante da BMD no período de 30 dias em relação ao 

período de 5 dias (p<0.05), enquanto no ALD foram verificados maiores valores de 

BMD nos períodos de 10 (p<0.05), 30 (p<0.001), 45 (p<0.01) e 60 dias (p<0.001) em 

relação ao período de 15 dias (Tabela 2). 

Com relação à diáfise foram verificados, para o ALD, maiores valores de BMD 

nos períodos de 20 (p<0.01), 30 (p<0.01), 45 (p<0.01) e 60 dias (p<0.01) em relação ao 

CTL. Na avaliação intragrupo, para o CTL foram verificados valores significativamente 

maiores de BMD no período de 5 dias em comparação aos demais períodos (p<0.05), 

enquanto para o ALD os períodos de 10 e 15 dias demonstraram os menores, embora 

com diferença significante apenas quando comparados aos períodos de 5 (p<0.05) e 20 

dias (p<0.01) (Tabela 3). 

Na avaliação da BMD global foram constatados valores significativamente 

maiores para o ALD nos períodos de 5 (p<0.001), 10 (p<0.05), 20 (p<0.001), 25 

(p<0.05), 30 (p<0.001), 45 (p<0.001), e 60 dias (p<0.001) em relação ao CTL. A 

avaliação intragrupo demonstrou que o CTL não apresentou variações estatisticamente 

significantes ao longo do tempo. Por outro lado, o ALD apresentou valores 

significativamente menores no período de 15 dias, havendo posteriormente um aumento 

significante (Tabela 4). 

 

 

 

 

 



 

  

44 

Tabela 1 - Análise da densidade mineral óssea (BMD) nas regiões de epífise proximal para os grupos CTL e ALD, nos diferentes períodos de 

avaliação. Valores expressos em média e desvio padrão. 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 

 



 

  

45 

 

Tabela 2 - Análise da densidade mineral óssea (BMD) nas regiões de epífise distal para os grupos CTL e ALD, nos diferentes períodos de 

avaliação. Valores expressos em média e desvio padrão. 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 



 

  

46 

Tabela 3 - Análise da densidade mineral óssea (BMD) nas regiões de diáfise para os grupos CTL e ALD, nos diferentes períodos de avaliação. 

Valores expressos em média e desvio padrão. 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 



 

  

47 

Tabela 4 - Análise da densidade mineral óssea (BMD) Global para os grupos CTL e ALD, nos diferentes períodos de avaliação. Valores 

expressos em média e desvio padrão. 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 



 

  

48 

Concentração de marcadores de remodelação óssea 

 

CTX (Telopeptídeo carboxiterminal do colágeno tipo I) 

 Na comparação entre os grupos quanto aos níveis séricos de CTX, foram 

verificadas concentrações significativamente maiores do marcador para o grupo 

controle nos períodos de 45 (0<0,001) e 60 dias (p<0,05) (Figura 7). 

 

Figura 7 - Comparação entre grupos controle (CTL) e alendronato (ALD) quanto aos 

níveis séricos de CTX. Valores expressos em média e desvio padrão.  

 

 

                          *p<0,05; ***p<0,001 – Teste t-não pareado 

Fonte: Autoria própria 

  

              Na análise intragrupo foi verificado que, para o CTL, o período de 60 dias 

apresentou os maiores valores de CTX sendo, entretanto, apenas estatisticamente 

diferente em relação aos períodos de 5 e 25 dias. No ALD, os maiores valores foram 

observados aos 10, 15, 25 e 30 dias, sendo esses valores significativamente maiores em 

relação ao período de 45 dias (Figura 8). 

 

 

 



 

  

49 

Figura 8 - Concentração sérica de CTX para os grupos CTL e ALD, nos diferentes 

períodos de avaliação. Valores expressos em média e desvio-padrão.  

 

 

 

Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significantes entre períodos 

para cada grupo. p<0,05 – Anova com teste post-hoc de Tukey 

Fonte: Autoria própria 

 

 

DPD (Deoxipiridinolina) 

Em relação à análise entre os grupos quanto à concentração dos níveis urinários 

de DPD, foi observado que, de um modo geral, o CTL apresentou maiores 

concentrações, porém com valores estatisticamente significantes apenas nos períodos de 

20 (p<0,01) e 45 dias (p<0,01) (Figura 9). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

50 

Figura 9 - Comparação entre os grupos CTL e ALD quanto aos níveis de DPD, 

corrigidos pela concentração urinária de creatinina de 24 horas, nas amostras obtidas no 

dia do sacrifício. Valores expressos em média e desvio-padrão.  

 

 

 

 

                                   **p<0,01 - Teste t-não pareado 

Fonte: Autoria própria 

 

Na análise intragrupo, não foram verificadas diferenças estatisticamente 

significantes ao longo dos períodos, tanto para o CTL quanto para o ALD (Figura 10). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

51 

Figura 10 - Concentração urinária de DPD, corrigida pela concentração urinária de 

creatinina de 24 horas, para grupos CTL e ALD, nos diferentes períodos de avaliação. 

Valores expressos em média e desvio-padrão.  

 

 

 

p>0,05 – Anova 

Fonte: Autoria própria 

 

Osteocalcina 

Na análise entre os grupos quanto aos níveis séricos de osteocalcina, foi 

observado que, de um modo geral, o CTL apresentou valores maiores de concentração 

do marcador que o ALD, com diferença significante para os períodos de 10 (p<0,05), 20 

(p<0,05), 45 (0,001) e 60 dias (p<0,01) (Figura 11). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

52 

Figura 11 - Comparação entre os grupos CTL e ALD quanto aos níveis séricos de 

osteocalcina. Valores expressos em média e desvio-padrão.  

 

 

 

 

                            *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001 - Teste t-não pareado 

Fonte: Autoria própria 

 

 

Com relação à análise intragrupo, não foram verificadas diferenças 

estatisticamente significantes para o CTL. Para o ALD, foram verificados valores 

maiores de osteocalcina nos períodos de 5, 15 e 25 dias, com diferença estatisticamente 

significante em relações aos períodos de 45 e 60 dias (Figura 12). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

53 

Figura 12 - Concentração sérica de osteocalcina para grupos CTL e ALD, nos 

diferentes períodos de avaliação. Valores expressos em média e desvio-padrão.  

 

 

 

Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significantes entre períodos.  

p<0,05 - Anova com teste post-hoc de Tukey 

Fonte: Autoria própria 

 

P1NP (Propeptídeo amino terminal do procolágeno tipo I) 

Na avaliação entre os grupos quanto ao marcador P1NP, foram observados 

maiores valores para o CTL, com diferença estatisticamente significante, em relação ao 

grupo ALD, nos períodos de 5 (p<0,05), 15 (p<0,01), 30 (0,01) e 60 dias (p<0,05) 

(Figura 13). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

54 

Figura 13 - Comparação entre os grupos CTL e ALD quanto aos níveis séricos de 

P1NP. Valores expressos em média e desvio-padrão.  

 

 

                              *p<0,05; **p<0,01 - Teste t-não pareado 

Fonte: Autoria própria 

 

 

Não foram observadas diferenças nas concentrações de P1NP ao longo dos 

períodos para o ALD. No CTL, as maiores concentrações de P1NP foram verificadas no 

período de 15 dias, sendo estatisticamente superior em relação aos demais períodos 

(Figura 14). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

55 

Figura 14 – Concentração sérica de P1NP para grupos CTL e ALD, nos diferentes 

períodos de avaliação. Valores expressos em média e desvio-padrão. 

 

 

Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significantes entre períodos.  

               p<0,05 - Anova com teste post-hoc de Tukey 

Fonte: Autoria própria 

 

 

Análise Imuno-histoquímica  

 

Na análise da expressão do anticorpo Catepsina K, nos grupos CTL e ALD foi 

observado que, até o período de 15 dias, houve maior expressão desse anticorpo para o 

grupo ALD, com diferença estatisticamente significante no período de 15 dias (p<0,05) 

em relação ao CTL. Porém, a partir do período de 20 dias, houve uma inversão desse 

quadro, com o grupo CTL apresentando maiores percentuais de imunomarcação em 

relação ao ALD, com diferença estatisticamente significante nos períodos de 20 

(p<0,001) e 45 dias (p<0,01). Na avaliação ao longo dos períodos foi verificado que, no 

grupo CTL, os maiores percentuais ocorreram aos 15 e 20 dias, enquanto no grupo 

ALD, os maiores percentuais ocorreram aos 15 dias (Figura 15A e 16). 

Em relação à comparação intergrupos da osteopontina (OPN), verificou-se que, 

de um modo geral, até os 30 dias houve maior imunomarcação desse anticorpo para o 

CLT, sendo esses valores significativamente maiores nos períodos de 5 (p<0,05), 10 



 

  

56 

(p<0,01) e 30 dias (p<0,05), em relação ao ALD. No entanto, nos períodos de 45 

(p<0,05) e 60 dias (p<0,05) dias houve uma inversão da situação, com valores 

significativamente maiores para o ALD em relação ao CTL. Na avaliação intragrupo, no 

grupo CTL, observou-se diminuição da expressão de OPN nos períodos de 45 e 60 dias 

em relação ao período de 30 dias. No grupo ALD, observou-se maior expressão de OPN 

aos 20 e 45 dias em relação aos 10 dias (Figura 15B e 17A). 

Para o Fator de Crescimento Endotelial Vascular (VEGF), a análise entre os 

grupos demonstrou que não houve diferença significante para a maioria dos períodos, 

sendo que somente aos 45 dias o grupo ALD apresentou valores estatisticamente 

superiores aos do CTL (p<0,05). Na análise intragrupo, constatou-se para o grupo CTL 

uma diminuição da imunomarcação aos 30 e 60 dias em relação aos 5 dias. Em relação 

ao grupo ALD, verificou-se menor imunomarcação de VEGF aos 10 e 20 dias em 

relação aos 5 dias (Figura 15C e 17B). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

57 

Figura 15 – Percentual de imunomarcação (%) para anticorpos Catepsina K (A), OPN 

(B) e VEGF (C). Valores expressos em média e desvio-padrão. 

 

 

 

Análise intragrupo (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 – Teste Kruskal-Wallis com teste 

post-hoc de Dunn). 

Análises entre os grupos (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001 - Teste de Mann-Whitney). 

Fonte: Autoria própria 



 

  

58 

Figura 16 – Fotomicrografias representativas da imunomarcação para o anticorpo Catepsina K para os grupos controle (CTL) e alendronato 

(ALD). Barras: 100μm. 

 

 

 

 

Fonte: Autoria própria 

 

 

 

 



 

  

59 

Figura 17 – Fotomicrografias representativas da imunomarcação para os anticorpos OPN (A) e VEGF (B) para os grupos controle (CTL) e 

alendronato (ALD). Barras: 100μm. 

 

Fonte: Autoria própria 



 

  

60 

Na análise entre os grupos para imunomarcação de iNOS, verificou-se maior 

expressão desse marcador no grupo CTL, em todos os períodos, em relação ao ALD, 

com valores estatisticamente superiores aos 5 (p<0,01), 10 (p<0,05), 15 (p<0,05), 20 

(p<0,01) e 25 dias (p<0,05). Em relação à análise intragrupo, não foram verificadas 

diferenças ao longo dos períodos tanto no grupo CTL quanto no ALD (Figura 18A e 

19A). 

Na análise entre os grupos para o anticorpo RUNX2, foram detectados menores 

percentuais de imunomarcação para o grupo ALD em relação ao CTL, sendo valores 

esses significativamente menores nos períodos de 5 (p<0,5), 10 (p<0,05), 15 (p<0,05), 

20 (p<0,05) e 60 dias (p<0,05). Na avaliação intragrupo, para o grupo ALD não foram 

observadas diferenças entre os períodos. Já para o grupo CTL, os maiores valores foram 

observados nos períodos de 5 e 15 dias, com diferença estatisticamente significante em 

relação aos períodos de 30 e 45 dias (Figura 18B e 19B). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

61 

Figura 18 – Percentual de imunomarcação (%) para anticorpos iNOS (A) e RUNX2 

(B). Valores expressos em média e desvio-padrão.  

 

 

Análise intragrupo (p>0,05, *p<0,05, **p<0,01 – Teste Kruskal-Wallis com teste post-hoc 

de Dun) 

Análises entre os grupos (*p<0,05, **p<0,01 - Teste de Mann-Whitney) 

Fonte: Autoria própria 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

62 

Figura 19 – Fotomicrografias representativas da imunomarcação para os anticorpos iNOS (A) e RUNX2 (B) para os grupos controle (CTL) e 

alendronato (ALD). Barras: 100μm. 

 

Fonte: Autoria própria 



 

  

63 

Quanto o anticorpo RANKL, pode-se verificar, de um modo geral, menor 

expressão no grupo ALD, sendo esses valores significativamente menores nos períodos 

de 10 (p<0,05) e 20 dias (p<0,05) em relação ao grupo controle. No entanto, no período 

de 45 dias (p<0,05), houve uma inversão, com valores significativamente maiores de 

RANKL para o grupo ALD. Na análise intragrupo, para o grupo CTL, os períodos de 15 

e 20 dias apresentaram maior expressão de RANKL em relação aos 5 dias. No grupo 

ALD, os períodos de 15 e 45 dias apresentaram valores significativamente maiores de 

RANKL em relação ao período de 5 dias (Figura 20A e 21A). 

Para o anticorpo OPG, na grande maioria dos períodos, o grupo ALD apresentou 

maior expressão desse marcador, porém com diferença estatisticamente significante 

apenas aos 15 dias (p<0,05) em comparação ao grupo CTL. Não foram observadas 

diferenças ao longo dos períodos para o grupo ALD. No grupo CTL, foi verificada 

expressão significativamente maior desse anticorpo aos 45 dias em relação aos 20 dias 

(Figura 20B e 21B). 

No que diz respeito à comparação entre os grupos quanto à proporção de 

imunomarcação entre os anticorpos RANKL e OPG (Razão RANKL:OPG), foram 

verificados maiores valores da razão para o grupo CTL na maioria dos períodos, sendo 

esses valores significativamente maiores nos períodos de 20 (p<0,05), 25 (p<0,05) e 60 

dias (p<0,05). Sugerindo assim, que houve maior tendência de reabsorção óssea no 

grupo CTL em relação ao grupo ALD. No entanto, aos 45 dias houve uma inversão do 

quadro, com o grupo ALD apresentando maiores valores da razão RANKL:OPG em 

relação ao CTL (Figuro 20C). 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

64 

Figura 20 – Percentual de imunomarcação (%) para anticorpos RANKL (A), OPG (B) 

e Razão RANKL:OPG (C). Valores expressos em média e desvio-padrão.  

 

 

 

 

Annálise intragrupo (*p<0,05 – Teste Kruskal-Wallis com teste post-hoc de Dun) 

Análises entre os grupos (*p<0,05 - Teste de Mann-Whitney). 

Fonte: Autoria própria 

 



 

  

65 

Figura 21 – Fotomicrografias representativas da imunomarcação para os anticorpos RANKL(A) e OPG(B) para os grupos controle (CTL) e 

alendronato (ALD). Barras: 100μm. 

 

Fonte: Autoria própria 



 

  

66 

Avaliação do número de células TRAP+ (Fosfatase ácida resistente ao tartarato-

positivas) 

 

Na análise entre os grupos quanto à quantidade de células TRAP+ por área de 

tecido ósseo, foi observado que, de um modo geral, o grupo CTL apresentou maior 

quantidade de células TRAP+ em relação ao ALD. Entretanto, não foram verificadas 

diferenças estatisticamente significantes (Figura 22 e 24). 

 

Figura 22 – Comparação entre os grupos CTL e ALD quanto ao número de células 

TRAP+ por área de tecido ósseo. Valores expressos em média e desvio padrão.  

 

 

                               p>0,05 – Teste de Mann-Whitney 

Fonte: Autoria própria 

 

Em relação à análise intragrupo, foi observada uma diminuição no número de 

células TRAP+ positivas ao longo dos períodos, tanto para grupo CTL quanto para 

grupo ALD. No grupo CTL os menores valores foram observados nos períodos de 30, 

45 e 60 dias. No grupo ALD, os menores valores foram observados nos períodos de 45 

e 60 dias (Figura 23 e 24). 

 

 

 

 

 



 

  

67 

Figura 23 – Número de células TRAP+ por área de tecido ósseo para grupos CTL e 

ALD, nos diferentes períodos de avaliação. Valores expressos em média e desvio-

padrão.  

 

 

 

 

              Letras diferentes representam diferenças estatisticamente significantes entre  

              períodos para cada grupo  

              p<0,05 - Teste de Kruskal-Wallis com teste post-hoc de Dunn 

Fonte: Autoria própria 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 



 

  

68 

Figura 24 – Fotomicrografias representativas da presença de células TRAP+ para os grupos controle (CTL) e alendronato (ALD). Barras: 

100μm. 

 

 

Fonte: Autoria própria 



 

  

69 

Avaliação da área de tecido ósseo mineralizado e matriz osteóide 

 

Na comparação entre os grupos CTL e ALD, quanto ao percentual de área de 

tecido ósseo mineralizado (osso maduro), não foram verificadas diferenças 

estatisticamente significantes (Figuras 25A e 27). Em relação ao percentual de área de 

matriz osteóide, de um modo geral, foram observados maiores valores para o grupo 

CTL, porém as diferenças não foram estatisticamente significantes (Figuras 25B e 27). 

 

Figura 25 – Comparação entre os grupos CTL e ALD quanto ao percentual (%) de área